JP2008516242A - アミノ末端およびカルボキシル末端の同時的配列分析 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図5
Description
本出願は、米国特許法119条に基づき、2004年10月8日に出願された米国特許仮出願第60/617,125号に対する優先権を主張する。なお、この出願の開示を参照することにより本出願に含める。
タンパクおよびペプチドの特定および特性解明は、現代生物学の重要部分となり、質量分析は、ペプチドおよびタンパクの分析に用いられるもっとも重要な技術の一つとなっている。近年、電子移動解離(ETD)と呼ばれる、ペプチドイオン解離の新しい手段が記載された(Syka, J.E.P.; Coon, J.J.; Schroeder, M.J.; Shabanowitz, J.; Hunt, D.F., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004, 101, 9528-9533; Coon, J.J.; Syka, J.E.P.; Schwartz, J.C.; Shabanowitz, J.; Hunt, D.F., International Journal of Mass Spectrometry 2004印刷中)。ETDでは、陰イオンは、リニアイオントラップ質量分析器において、多重的に陽子化されたペプチド/タンパクの陽イオンと反応させられる。その結果、陰イオンから電子がペプチドに移動する。電子の移動後、ペプチドは、電子捕獲解離(ECD)のたどる同じ経路を通じて解離する(Zubarev, R.A.; Kelleher, N.L.; McLafferty, F.W., Journal of the American Chemical Society 1998, 120, 3265-3266)。
a)翻訳後修飾(すなわち、リン酸化およびグリコシル化等)を有するペプチドは、ペプチド骨格ではなく、むしろ修飾物を失うことによって断片化する場合がよくある。このタイプのペプチドイオン先駆体では、約(20%-30%)という比較的僅かなパーセントからしか、解釈可能/探索可能な産物イオンスペクトルが得られない。この傾向は、ペプチド内のアミノ酸数が増加するにつれて若干減少する(修飾物損失の傾向が減少する)。
b)複数の塩基性アミノ酸残基(Lys、Arg、およびHis)を含み、従って、2つ以上の電荷を担持するペプチドも、ペプチド骨格に沿ってランダムに断片化することができず、従って、前述の技法(CAD)によって分析した場合、不完全な配列情報しかもたらさない。
c)40を超えるアミノ酸を含むペプチドも、ペプチド骨格に沿ってランダムに断片化することができない。これらもまた不完全な配列情報しかもたらさない。
本明細書で用いる用語「ハロゲン」または「ハロ」は、ブロモ、クロロ、フルオロ、およびイオドを含む。
前述したように、正の電子アフィニティ(EA)を持つ(発熱的に反応し、安定な、または一時的に安定なラジカル陰イオンを形成する)分子ならいずれも電子ドナーとして機能することが可能であり、従って、電子移動解離反応における試薬として使用される潜在能力を持つ。さらに我々はまた、多重荷電ペプチドと反応すると、電子を移動してETDを実行する偶数電子分子を形成するような、いくつかの化合物を特定した。従って、ラジカル陰イオンの形成は、ある陰イオンが電子移動性能を持つかどうかを決めるための唯一の基準ではない。我々の元々の研究は、いくつかの化合物、すなわち、FC-43(パーフルオロトリブチルアミン、PFTBA)、6フッ化イオウ(SF6)、パーフルオロ-1,3-ジメチルシクロヘキサン(PDCH)、ヘキサフルオロベンゼン(C6F6)から得られる陰イオンを利用した。この研究では、ETD型断片化が観察されたが、しかし主にプロトン移動反応が起こった。次に、我々は、ある選択されたペプチドイオンと反応する特定の陰イオン分子を単離する能力について研究を開始した。その時、我々は、前述の分子ではなく、バックグラウンドのイオンが、低レベルETD断片化を起していることを発見した。6フッ化イオウおよびPDCHの両方から陰イオンを単離したところ、これらの陰イオンのみがプロトン移動反応を誘発するが、検出できるほどのETDは観察されないことが明らかになった。
Xは、S、O、N、NH、CR5、およびCHR5から成るグループから選ばれ;
Yは、S、O、N、NH、CR6、およびCHR6から成るグループから選ばれ;
Wは、S、O、N、NH、CR7、およびCHR7から成るグループから選ばれ;
Uは、S、O、N、NH、CR8、およびCHR8から成るグループから選ばれ;
Zは、S、O、N、NH、CR3、CHR3、および-CHR8CHR7-ら成るグループから選ばれ;
TおよびVは、S、O、N、NH、CR4、およびCHR4から成るグループから選ばれ;前式において、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、およびR8は、それぞれ独立に、H、C5-C6アリール、C5-C6ヘテロアリール、ハロ、CN、C1-C4アルキル、アミノ、およびヒドロキシから成るグループから選ばれ、あるいは、R1およびR8、および/またはR2およびR7は、その結合する原子と共にC5-C6アリール、C5-C6ヘテロアリール環を形成し、あるいは、R7およびR5、および/またはR6およびR8は、その結合する原子と共にC5-C6アリール、C5-C6ヘテロアリール環を形成し、あるいは、R2およびR3は、その結合する原子と共にC5-C6アリール、C5-C6ヘテロアリール環を形成する。
一つの実施態様によれば、これらの実験を実行するために使用される装置は、市販のシステムであって、二次元多極性イオントラップ、改変Finnigan LTQ(Thermo Electron Corp.)においてペプチドを断片化する改良法に必要な工程を実行するように改変されたものである。他の、市販の、または特注の部品を組み込んだ、別様の装置構成も使用が可能である。ESIソースからRF QLTまでのイオン経路成分に対する、イオン経路機構または印加電圧は変更しなかった。簡単に言うと、Finnigan LTQ二次元多極イオントラップは下記のように改変した。Finnigan MAT 4500イオンソースを収容するために、装置の後部真空フランジに、第5の差動ポンプ真空域を取り付けた。この領域は、2段階ターボ分子ポンプである、PfeifferモデルTMH230-160支援、Alcatel 2008A-回転羽根機械的ポンプの、高真空段階によって吸引される。Finnigan MAT 4500イオンソースから発するイオンを輸送するために、後部オクトポール#1および後部オクトポール#2と表示される、二つのRFオクトポール(8極電極)イオン・ガイドを用いた。この二つのRFオクトポールイオン・ガイドを隔てる平板レンズ(Rear Inter-Octopole Lens、後方オクトポール間レンズ)は、追加された真空段階、すなわち、真空域#5と、LTQ含有RFリニア4極イオントラップ、QLTとの間の、差動ポンプコンダクタンスの限界となる。後部オクトポール#1は、Finnigan LCQから直列に配置され、電気的に一単位として接続される、1対の、2インチ長電極アッセンブリ(r0= 0.108インチ)によって構成される。後部オクトポール#2は、単に単一のLCQオクトポール電極アッセンブリである。RF QLTアッセンブリは機械的には改変しなかった。しかしながら、前面レンズおよび後面レンズ電極の電気的接続は、これらのレンズに対して標準的エレクトロニクスによって供給されるDCバイアス電圧に対して、RF電圧の重畳を可能とするように改変した。
多重ペプチド陽イオンは、エレクトスプレイ・イオン化法(ESI)によって生成した。ペプチドを1 pmol/μLで含む、40%アセトニトリル水溶液(0.1%酢酸含有)を、SilicaTip(登録商標)融合シリカエミッター(30 μm先端、New Objective, Woburn、マサチューセッツ州、米国)に注入した。試験されたペプチドは、副腎皮質ホルモンの断片1-24(ATCTホルモン、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)、および当社合成のリン酸化ペプチドを含む。メタンバッファーガス(MG Industries, Malvern、ペンシルバニア州、米国)による陰性化学的イオン化を用い、SF6(MG Industries, Malvern、ペンシルバニア州、米国)、およびPDCH(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)の陰イオンを生成した。Finnigan LTQリニアイオントラップ質量分析器(ThermoElectron、サンホセ、カリフォルニア州、米国)を、Finnigan 4500化学的イオン化ソース(Finnigan, Sunnyvale、カリフォルニア州、米国)を受け容れるよう改良した。それは装置の後部、つまり工場仕様ナノスプレイ・ソース・ペプチドイオン生産とは反対側に取り付けた。走査事象の順序は、先駆体イオンの分離(リニア4極イオントラップ内で)、イオン/イオン反応のための陰イオン導入、および最後の産物イオンの質量分析を含み、より詳しくは、下記の通りである。
大気圧境界面のスキマー電極は、アース電位0ボルトに維持されるので、QLTに進入する陽イオンは、0ボルトにおいて本質的にゼロの運動エネルギーを持つ。従って、後面レンズ電極をアース電位に偏倚させることはDC軸電位を上昇させることになるので、バックグラウンドとの僅かな分散的衝突を経過した注入イオンは、反射されて装置の前部に戻される。注入イオンはさらに、ヘリウム原子(約3 mTorr)との、それら注入イオンの軸方向運動を効果的に抑圧する、数多くのモーメント減衰性衝突を経過し、このために、装置の中央部の、低バイアス電位によって形成される軸方向DCウェルの中に捕獲される。これらの衝突はまた、イオンの放射方向の運動をも抑圧するので、イオンは、RF4極電場の、強力な放射性集束作用の影響下に、緩和されて装置の中心軸の近傍に集まる。さらに運動的に励起されることがないならば、ヘリウムとの衝突によって、捕獲陽イオンの運動および内部エネルギーは、約1-2 ms以内に近熱レベルに低下する。衝突によって十分に緩和した捕獲イオンは、中心軸の約1.0 mm以内に閉じ込められる。
陽イオン注入の終了後、および「注入波形」電場印加の停止後数ミリ秒以内に、所望のm/z分解能および高い効率(前駆体イオンの最低損失)の下にイオン分離が実行されるようにRF4極捕獲電場の強度を増す。所望の前駆体m/zウィンドウの外部の陽イオンを全てQLTから共鳴的に排除するためには、比較的高い分解能の「波形」電場を印加する。通常、前駆体イオンの90%を超えるものが保持される。m/z分離の際、QLTの前部セクションおよび後部セクションのDCバイアス電位は、陽イオンを装置の中央セクションに閉じ込めるために、中央セクションに対して約+12ボルトに維持される。
前駆体m/z分離が完了した後、前部セクションのDCバイアス電位を、中央セクションの電位よりも1ボルト下げる。前面レンズのDCバイアスは、陽イオンの軸方向の閉じ込めを維持するために、中央セクションおよび前部セクションのバイアスよりも高く保たれる。数ミリ秒以内に、最初中央セクションにあった前駆体イオンは全て前部セクションに拡散し、ここで再び、ヘリウム原子との抑圧的衝突のために停滞させられる。
前駆体イオンが前部セクションに移動させられたならば、中央セクション、後部セクション、および後方レンズのDCバイアス電位は、「アース」電位より高く上昇させられる。NICIソースは0ボルトに偏倚され、これは、前部セクションを負のDCバイアス電圧に維持することになり、両者は、前駆体イオンの捕獲を続行し、装置の前部において、陰性イオンに対し軸方向の電位障壁を形成する。中央セクションのDCバイアスは、後部セクションのものよりもより正にされるので、陰イオンは、装置のこのセクションに蓄積する。この工程は、陰イオンが装置の後端から注入されること、および、定義により陰イオンは負に帯電しているので、DCバイアス電位は反対の符号を持つことを除き、工程1における陽イオンの注入と蓄積に相当する。
陰イオン注入終了後数ミリ秒以内に、前駆体の分離が、可能な最善のm/z分解能と効率で実現されるようにRF 4極捕獲電場の強度が調整されてもよい。前述したように、陰イオン分離「波形」は、所望の試薬陰イオンのものに近いm/z比を持たず、および/または、以前に選択された前駆体陽イオンのものに近いm/z比も持たない陰イオンを、共鳴的に排除しなければならない。従って、選択された前駆体m/zウィンドウのものにごく近いm/z比を持つ不要な陰イオンは排除されない。この設定は理想的ではない。しかしながら、この問題を回避するためには、QLTの設計および/またはQLTを駆動する電圧に対し実質的な変更が必要となる。現在の実施態様によれば、もっとも好ましくない陰イオンは、陽イオン-陰イオン反応の開始前にトラップから排除されることを保証する。
所望の捕獲前駆体陽イオンおよび試薬陰イオン集団が定着し、衝突的に緩和されたならば、QLTの、両方の端面レンズプレートに、二次RF電圧が印加される(我々の用語法では、放射方向の封じ込めを実現するためにQLT電極に印加されるRF電圧が、一次RF電圧である)。この二次RF電位の作用は、陽性および陰性両方のイオンを反発することである。いずれのm/zにおいても、この反発作用は、m/zに逆比例する反発電位としてモデル化され、文献では、擬似電位または実効電位と呼ばれている。QLTの同じ領域において陰イオンと陽イオン両方の同時的捕獲を実現し、それにより陽イオン−陰イオン反応を引き起こすために、捕獲セグメントと端面レンズに印加されるDCバイアス電圧は等しくされる(名目的には0.000ボルト)。端面レンズに印加される二次RF電圧によって定められる擬似電位によって、陽イオンおよび陰イオン両方についての、必要な軸方向の捕獲が実現される。
陽イオン-陰イオン反応を終了するために、中央セクションのDCバイアス電圧を、末端セクションおよび端面レンズのDCバイアスに対して下げる。数ミリ秒以内に、全ての陽イオンはQLTの中央セクションに移動し、全ての陰イオンは末端セクションに移動する。次に、端面レンズプレートに印加されていた、軸方向捕獲RF電圧(二次RF電圧)が遮断され、陰イオンを開放する。診断目的のためには、多くの場合、未反応試薬陰イオンのm/zスペクトルを獲得することが有用である。このことは、前述のように中央セクションの相対的DCバイアスを下げる代わりに、上げることによって陽イオン-陰イオン反応を終息させることによって簡単に実現される。これによって、陰イオンは中央セクションに保持され、軸方向に陽イオンを引き込む。
[ポリペプチドの電子移動解離のための陰イオンの使用]
一つの実施態様によれば、FC-43(パーフルオロトリブチルアミン、PFTBA)、6フッ化イオウ(SF6)、パーフルオロ-1,3-ジメチルシクロヘキサン(PDCH)、ヘキサフルオロベンゼン(C6F6)、およびアントラセンを、NICI(陰性イオン化学的イオン化)ソースへ導入して、実験のための陰イオンを生成した。いずれの場合も、ソースにおいて生成された陰イオンは、標準的ペプチド前駆体イオンと反応させると、少なくともある程度のETD産物を生成した。電子衝突イオン化ソースを備えた質量分析器に使用される標準的m/z較正物質であるFC-43を、ソースに導入すると、前駆体からETD産物への変換効率は極めて低かったものの、小数のcおよびzイオンが生産された。続く実験で、前述の分子を、別々に、イオンソースに導入したところ、全てが、我々の標準的前駆体イオン、3重荷電12アミノ酸リン酸化ペプチドの、広範なcおよびz型断片を生成した。前駆体から、ETD産物への変換効率は、SF6およびPDCHの約0.1-1%から、C6F6の約0.5-5%、および、アントラセンおよび9,10ジフェニル-アントラセンの約5-20%の範囲に渡っていた。
[連続イオン/イオン反応]
前述のように、いくつかの陰イオンは、主にETD試薬として、またはPTR試薬として作用する。いずれかのカテゴリーの陰イオンに対して陽イオンを暴露することによって、これらのそれぞれ異なる反応を、別々に連続的に実行することが可能である。例えば、高度に荷電したペプチド前駆体(例えばz>4)を、ETD-誘発性陰イオンを用いて解離し、次いで、これらの試薬を除去し、第2の、PTR-誘発性陰イオンタイプを導入することが可能である。この第2反応の持続時間は、産物分子の荷電状態が調節的に低減されるように調整することが可能である。すなわち、+10前駆体ペプチドはETDによって解離され、+1から+9の範囲の電荷を持つ断片を生成する。もちろん、このように高度に荷電した産物の同位体ピークのm/z分解能は問題であり、従って、PTR反応期間は、このETD産物が、主に+1電荷状態に変換されるように調整される。最終的作用は、最初様々な荷電状態で生成されたETD断片を、より低い荷電状態に変換し、それによってスペクトルの解釈を単純化することである。この過程は、単一荷電ETD産物の同時的質量分析を可能とし、ポリペプチドのカルボキシルおよびアミノ末端のアミノ酸配列を同時に決定することを可能とする。
修正型リニアイオントラップ質量分析器を用いて、我々は、連続イオン/イオン反応による、高度に荷電したペプチドの直接的な探索を例示する。ここで、+7ACTHペプチド(SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVRVYP7+、配列番号4)(m/z 420)を先ず分離し、次に約75 msの間フルオランテンの陰イオンと反応させた(ETD)。この反応後に得られたスペクトルを図7に示す。ペプチドは多くの骨格結合において解離される。しかしながら、断片の多くは、この実験で用いた質量分析器の解像能力を超えた電荷を持つ(インセット図の、ドットでマークしたm/zを参照)。この問題を回避するため、我々は、連続イオン/イオン反応を導入した。この実験では、ETD反応、および過剰なフルオランテン陰イオン排除の後、得られた多重荷電産物イオンを、6フッ化イオウの偶数陰イオン(約200 ms)と反応させる。この第2反応(プロトン移動、PTR)は、産物スペクトルが、単一プロトン化断片イオンのみを含むよう単純化し、様々なcおよびz-型産物イオン信号を一つの荷電状態に集中させるように働く。最終結果は、前駆体ペプチドのアミノおよびカルボキシル末端配列の特徴を表す、単一荷電cおよびz-型断片イオンの均一なシリーズの生成である(リニアトラップは、2000という制限されたm/z範囲を持つ)。上段に表示される多重荷電断片の排除に注意されたい。
[電子移動解離を促進するための、芳香族炭化水素の使用]
電子移動解離を促進する陰イオンについて調べた。これらの陰イオンの多くは、芳香族炭化水素と呼ばれるクラスの化合物に属する。我々の結果は、試験したほとんど全ての芳香族炭化水素が、多重荷電ペプチドと反応させると、電子移動解離を誘発する、ある程度の能力を持つことを示す。試験した陰イオンとしては、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン、2,2’ジピリジル、2,2’ビキノリン、9’アントラセンカルボニトリル、ジベンゾチオフェン、1,10’-フェナントロリン、およびアントラキノンが挙げられる。これらの芳香族炭化水素の全てが電子移動を促進するが、フルオランテンおよび2,2’ビキノリンの二つの作用が特に優れる。
本明細書に記載される方法は、連続イオン/イオン反応および、ベンチトップリニアイオントラップ質量分析器と結合するオンライン・クロマトグラフィーによって、大型ポリペプチドおよび全体タンパクの特性解明に使用することが可能である。本実施例では、溶出する多重プロトン化ペプチドおよびタンパクが先ず分離され、次に、比較的短時間(約10 ms, ETD)フルオランテンのラジカル陰イオンと反応させられる。この反応、および過剰なフルオランテン陰イオンの排出後、得られた産物イオンは、安息香酸の偶数電子陰イオンと反応させられる(約100 - 200 ms)。この第2の反応(PTR)は、スペクトルを単純化し、スペクトルの解釈を極めて容易なものとすること、および、各種cおよびz-型産物イオンを、主に単一荷電陽イオンに変換すること、という二つの働きをする。
装置の改変および操作 実験は全て、市販のRF 4極リニアイオントラップ(QLT)、Finnigan LTQ質量分析器(Thermo Electron Corp., サンホセ、カリフォルニア州、米国)で、改良型工場仕様ナノフロー・エレクトスプレイ・イオン化(ESI)ソース(クロマトグラフィー実験)、またはナノスプレイロボット(Advion Biosciences, Ithaca、ニューヨーク州、米国、吸入)のいずれかを装着したものによって実行した。LTQは、装置の後部に設置される、Finnigan 4500化学的イオン化ソースを受容するよう改変した(Thermo Electron Corp., サンホセ、カリフォルニア州、米国)(Syka, et al., (2004) P Natl Acad Sci USA 101, 9528-9533)。フルオランテンおよび安息香酸の両分子を気化してCIソースに送り込むためにバッチ流入口を用いた。CIソースにおいて電子ビームが両分子の陰イオンを生成した。装置制御ソフトウェア(ITCL)は、前駆体イオンの選択(分離幅4 m/z単位)および保存後、下記の順序を受け容れるように改変した。(1)陰イオン注入(約2 ms)、(2)フルオランテン陰イオン分離(m/z 202, 10 ms)、(3)陰イオンと前駆体陽イオンのイオン/イオン反応(約10 - 15 ms)、(4)過剰なフルオランテン陰イオンの除去およびETD産物の保存、(5)陰イオンの注入(約2 ms)、(6)m/z 202および他の、バックグラウンド陰イオン分子を除去するための選択的波形の印加(約5 ms)、(7)ETD産物イオンと精製安息香酸陰イオン(m/z 121)とのイオン/イオン反応(約100 - 150 ms)、(8)過剰な安息香酸陰イオンの除去と、産物イオンの質量分析。
連続イオン/イオン反応 +13荷電状態のユビキチン(8.5 kD, m/z 659, 76残基)と、フルオランテンのラジカル陰イオンとの15 ms反応は、図10Aに示す、タンデムマススペクトルを生成する。この比較的短い反応の後、数百の高度に荷電した、分解されない断片イオンが観察される。理論的には、これらの産物は、1-12の範囲の電荷(z)を持つ。ここで使用されるベンチトップ・イオントラップシステムは、z≦2のzを分解することが可能であることを想起されたい。約146種の可能な、一意のcおよびz-型断片が、多数の荷電状態の中に−多かれ少なかれ1000 m/z範囲に限局して−広がっている有様では、この時点でのスペクトルの解釈は単純に不可能である。
イオン-イオン化学 イオン/イオン反応の持続時間は重要なパラメータであるが、まだ最適化されないままである。例えば、上記の実験において、ETD反応期間は、多重電子移動事象を抑えるために低く留められる−連続的電子移動は、内部断片の生成をもたらす可能性があるからである。例えば、全体タンパク陽イオンに対する単一電子の移動後に生成されるc50断片は、その後電子を受け取って、分断し、2個の産物イオン、例えば、c25およびz'25を形成する可能性がある。もちろん、N-末端断片c25は、元の前駆体タンパクの文脈の中で依然として認識が可能であるが、一方、z'25は、元の前駆体のアミノ末端もカルボキシ末端も含まないので、様々な他の類似産物と一緒では、高まったノイズのように見える。化学的ノイズを増すことの外に、多重電子移動事象はまた、桁外れの量の、低いm/zのcおよびz-型断片イオンの生成を助長する可能性がある。
Claims (24)
- ポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端アミノ酸配列を決定する方法であって、
多重荷電陽イオン状態にある前記ポリペプチドをRF電場イオン含有装置に導入する工程;
気相電子移動試薬陰イオンを、前記イオン含有装置に導入する工程;
電子移動試薬陰イオン、またはその誘導体電子移動試薬イオンから、ポリペプチドへ向かう電子の移動を促進するために、前記導入された電子移動試薬陰イオン、またはその誘導体電子移動試薬イオンと、前記ポリペプチドを混合することによって、解離産物陽イオンを生成させる工程;
気相プロトン受容試薬陰イオンを前記イオン含有装置に導入する工程;および、
前記解離産物陽イオンから、前記プロトン受容試薬陰イオン、またはその誘導体プロトン受容試薬イオンへ向かうプロトンの移動を促進するために、前記導入されたプロトン受容試薬陰イオン、または、その誘導体プロトン受容試薬イオンと、解離産物陽イオンとを混合することによって、多重荷電解離産物陽イオン上の電荷を減少させる工程;
前記残存する荷電cおよびz-型断片を質量(m/z)分析する工程;および、
前記ポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端配列を決定する工程、を含み、
前記残存する荷電断片は、4またはそれより低い単位電荷を持つ断片から本質的に成る方法。 - 前記気相プロトン受容試薬陰イオンの導入の前に、前記電子移動試薬陰イオン、およびその誘導体電子移動試薬イオンを排除する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記ポリペプチドは、少なくとも5000ダルトンの質量を持つことを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記ポリペプチドは、少なくとも10,000ダルトンの質量を持つことを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記残存する荷電cおよびz-型断片が、3以下の単位電荷を持つ断片から本質的に成ることを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記残存する荷電cおよびz-型断片が、2以下の単位電荷を持つ断片から本質的に成ることを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記残存する荷電cおよびz-型断片イオンが、単一荷電断片から本質的に成ることを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記低い電荷を持つ断片を質量(m/z)分析する前記工程は、RFイオントラップ質量(m/z)分析器によって実行されることを特徴とする、請求項1から7のいずれか1項による方法。
- 前記RFイオントラップ質量(m/z)分析器は、3D RFイオントラップ分析器であることを特徴とする、請求項8の方法。
- 前記RFイオントラップ質量(m/z)分析器は、リニアイオントラップ分析器であることを特徴とする、請求項7の方法。
- 前記低い電荷を持つ断片を質量(m/z)分析する前記工程は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型(FTICR)質量(m/z)分析器によって行われることを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記低い電荷を持つ断片を質量(m/z)分析する前記工程は、飛行時間型質量(m/z)分析器によって実行されることを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記低い電荷を持つ断片を質量(m/z)分析する前記工程は、オービトラップ型質量(m/z)分析器によって実行されることを特徴とする、請求項1の方法。
- 未処理の前記ポリペプチドの分子量を質量分析によって決定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記アミノ末端およびカルボキシル末端のアミノ酸配列を用いてデータベース探索を実行し、前記ポリペプチドを特定することを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記ラジカル気相電子移動陰イオンは、多環式芳香族炭化水素、または多環式芳香族炭化水素置換体から生成されるラジカル気相陰イオンであることを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記気相電子移動陰イオンは、アントラセン、9,10ジフェニル-アントラセン、ナフタレン、フルオレン、フェナントレン、ピレン、フルオランテン、クリセン、トリフェニレン、ペリレン、アクリジン;2,2’ジピリジル;2,2’ビキノリン;9-アントラセンカルボニトリル;ジベンゾチオフェン;1,10’-フェナントロリン;9’アントラセンカルボニトリル;およびアントラキノンを含むグループから選ばれる、低い電子アフィニティー基質から生成されることを特徴とする、請求項16の方法。
- 前記プロトン受容試薬陰イオンは、カルボン酸、フェノール、およびアルコキシド含有化合物から成るグループから選ばれる化合物から誘導されることを特徴とする、請求項1の方法。
- 前記プロトン受容試薬陰イオンは、安息香酸、PDCH、SF6、およびPFTBAから成るグループから選ばれる化合物の陰イオンであることを特徴とする、請求項1の方法。
- 未処理の前記ポリペプチドは、該ポリペプチドが前記気相電子移動陰イオンと混合される前に、エレクトロスプレイ・イオン化法によってイオン化されることを特徴とする、請求項1の方法。
- 陰イオンは、前記RFリニア多極性イオントラップの直線軸に沿って注入されることを特徴とする、請求項10の方法。
- 前記電子移動産物陽イオンを前記リニアイオントラップ内に保持しながら、前記残存陰イオンを前記RFイオントラップから排出する工程;および、
前記気相プロトン受容試薬陰イオンを前記イオン含有装置に導入する前に、20%未満の従来型衝突活性化解離産物を生成する低エネルギー活性化を、前記電子移動産物イオンに対し実行する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1の方法。 - 前記低エネルギー活性化は、非共鳴域運動エネルギー励起を含むことを特徴とする、請求項22の方法。
- ポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端アミノ酸配列を決定する方法であって、
多重荷電陰イオン状態にある前記ポリペプチドをRF電場イオン含有装置に導入する工程;
気相電子移動試薬陽イオンを、前記イオン含有装置に導入する工程;
前記陰イオンから前記陽イオンへ向かう電子の移動を促進するために、ラジカル気相イオンとイオン化ポリペプチドを混合することによって、陰性電子移動解離産物イオンの生産を誘発する工程;
気相プロトンドナー試薬陽イオンを前記イオン含有装置に導入する工程;
プロトンドナー試薬陽イオン、またはその誘導体プロトンドナー試薬陽イオンから、前記解離産物陰イオンへ向かうプロトンの移動を促進するために、前記導入されたプロトンドナー試薬陽イオン、またはその誘導体プロトンドナー試薬陽イオンと、前記解離産物陰イオンとを混合することによって、多重荷電解離産物陽イオン上の電荷を減少させる工程;
前記残存する荷電cおよびz-型断片を質量(m/z)分析する工程;および、
前記ポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端配列を決定する工程、を含み、
前記残存する荷電断片は、4またはそれより低い単位電荷を持つ断片から本質的に成る方法。
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