JP2008510453A - エピトープアナログ - Google Patents
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Abstract
Description
一つの実施形態では、本明細書中に開示の発明は、クラスIMHC制限T細胞エピトープに対応するペプチドのアナログ及びその生成方法に関する。これらのアナログは、MHC分子と直接相互作用する残基におけるアミノ酸置換を含むことができ、改善されているか、修飾されているか、又は有用な免疫特性を付与することができる。特に、腫瘍関連抗原SSX−2、NY−ESO−1、PRAME、PSMA、チロシナーゼ、及びメラン−A由来のエピトープアナログが同定されている。さらに、種々の置換が非標準残基であるノルロイシン及び/又はノルバリンを含むアナログ類を開示する。
本出願は、米国特許法第119条(e)項の下、「SSX−2ペプチドアナログ」と題される2004年6月17日に出願された米国特許仮出願番号60/581,001号及び「NY−ESOペプチドアナログ(NY-ESO PEPTIDE ANALOGS)」と題される2004年6月17日に出願された米国特許仮出願番号60/580,962号に対する優先権を主張する。(それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される)
主要組織適合複合体及びT細胞標的認識
T−リンパ球(T細胞)は、特定抗原シグナルに応答して機能する抗原特異的免疫細胞である。Bリンパ球及びそれらが産生する抗体も、また抗原特異的物体である。しかしながら、Bリンパ球と異なり、T細胞は、遊離型又は可溶型の抗原に応答しない。T細胞が抗原に応答するためには、抗原が主要組織適合複合体(MHC)として知られる提示複合体に結合することが必要である。
SSX−241-49アナログの実施の形態
実施の形態には、MHCクラスI制限T細胞エピトープのアナログSSX−241-49KASEKIFYV(配列番号1)、pAPCによってプロセッシングされてエピトープアナログを提示することができるこれらのアナログを含むポリペプチド、及びアナログを発現する核酸が含まれる。アナログは、野生型エピトープと比較して類似又は改善された免疫学的特性を有し得る。
、F、Phe(4−F)である;P9は、Vである;P10でのPΩは、I又はLである。
;又はFVSEKIFY{I又はNva}、又はK{V又はL}SEKIFYV;又は{F又はY}ASEKIFYV;又はFVSEKIFYIを有する。
P1が、S、F、K又はWであり、
P2が、L、I、V、Nle又はNvaであり、
P3がLであり、
P4が、M、L又はNであり、
P5がWであり、
P6が、I、A、L、V又はNであり、
P7がTであり、
P8が、Q、E、D又はTであり、
P9のPΩがC、V、I、L、A、Nva、Nle、V−NH2又はL−NH2である配列を有するが、配列がSLLMWITQ{C、V、I、L、A}、FVLMWITQA又はFILMWITQ{L、I}ではない単離ペプチドに関する。
P1がYであり、
P2が、L、V、I、Nle又はNvaであり、
P3がLであり、
P4が、M、L又はNであり、
P5がWであり、
P6が、I、A、L、V又はNであり、
P7がTであり、
P8が、Q、E、D又はTであり、
P9のPΩがV、I、L、Nva、Nle、V、V−NH2又はL−NH2である配列を有するが、配列がYVLMWITL又はYLLMWIT{I、L}ではない単離ペプチドに関する。
を有する単離十量体ペプチドに関する。
P0
が、X、XX又はXXXで、Xが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示し、
P1がK、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala又はD−Lysであり、
P2がA、L、V、I、M、D−Ala、Nal−2、Abu、Aib、Nle又はNvaであり、
P3がSであり、
P4がE、Q、Nle又はNvaであり、
P5がKであり、
P6がI、L、V、Nle又はNvaであり、
P7がFであり、
P8がY、F、Phe(4−F)であり、
P9のPΩがV、I、A、Nva、MeVal、Abu又はV−NH2であるか、或いはP9がVであり、
P10のPΩがI、L、V、Nle又はNvaであり、
PΩ+1がX、XX又はXXXで、Xが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示す配列を含むか、又はこの配列から実質的に構成され得、配列がKASEKIFYVではない。
K{L、V、M、I、D−Ala、D−Val、Nal−2、Aib、Abu、Nle又はNva}SEKIFYV、又は
{F、Phg、Y、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、O−メチル−Try又はβ−(3−ベンゾチエニル−Ala}ASEKIFYV、又は
{Y、F又はW}{V、M又はI}SEKIFYV、又は
{F又はW}LSEKIFYV、又は
K{A、V又はL}SEKIFYI、又は
K{L又はV}SEKIFYV−NH2、又は
FVSEKIFY{I、A、Nva、Abu又はMeVal}、又は
FVS{Q、Nle、Nva}KIFYV、又は
FYSEK{L、V、Nle又はNva}FYV、又は
FVSEKIF{F、Phe(4−F)}V、又は
KASEKIFYV{I、L}、又は
KVSEKIFYV{I、L、V又はNle}、又は
KLSEKIFYV{L、V、Nle又はNva}
を含むか、又はこの配列から実質的に構成され得る。
K{L、V、M、Abu、Nle又はNva}SEKIFYV、又は
{F又はPhg}ASEKIFYV、又は
YVSEKIFYV、又は
F{L、V又はI}SEKIFYV、又は
W{L又はI}SEKIFYV、又は
K{V又はL}SEKIFYI、又は
FVSEKIFY{I又はNVa}
を含むか、又はこの配列から実質的に構成され得る。
K{V又はL}SEKIFYV、又は
{F又はY}ASEKIFYV、又は
FVSEKIFYI、又は
KVSEKIFYV
を含むか、又はこの配列から実質的に構成されることができる。
SEKIFYVの解離の半減期と同程度か、又はそれよりも長くてもよい。単離ペプチドは、ペプチドKASEKIFYVに対する特異性によりT細胞に認識される。
P1がK、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala又はD−Lysであり、
P2がA、L、V、I、M、D−Ala、Nal−2、Abu、Aib、Nle又はNvaであり、
P3がSであり、
P4がE、Q、Nle又はNvaであり、
P5がKであり、
P6がI、L、V、Nle又はNvaであり、
P7がFであり、
P8がY、F、Phe(4−F)であり、
P9のPΩがV、I、A、Nva、MeVal又はAbuである配列であって、KASEKIFYVではない配列、
又は
P1がK、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala又はD−Lysであり、
P2がV、L、M、Abu、Nle又はNvaであり、
P3がSであり、
P4がE、Q、Nle又はNvaであり、
P5がKであり、
P6がI、L、V、Nle又はNvaであり、
P7がFであり、
P8がY、F、Phe(4−F)であり、
P9のPΩがV、I、A、Nva、MeVal、Abu又はV−NH2である配列、
又は
P1がK、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala又はD−Lysであり、
P2がA、L、V、M、Abu、Nle又はNvaであり、
P3がSであり、
P4がE、Q、Nle又はNvaであり、
P5がKであり、
P6がI、L、V、Nle又はNvaであり、
P7がFであり、
P8がY、F、Phe(4−F)であり、
P9がVであり、
P10のPΩがI又はLである配列、
又は
P1がK、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala又はD−Lysであり、
P2がVであり、
P3がSであり、
P4がE、Q、Nle又はNvaであり、
P5がKであり、
P6がI、L、V、Nle又はNvaであり、
P7がFであり、
P8がY、F、Phe(4−F)であり、
P9がVであり、
P10のPΩがI、L、V又はNleである配列、
又は
P1がK、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala又はD−Lysであり、
P2がLであり、
P3がSであり、
P4がE、Q、Nle又はNvaであり、
P5がKであり、
P6がI、L、V、Nle又はNvaであり、
P7がFであり、
P8がY、F、Phe(4−F)であり、
P9がVであり、
P10のPΩがI、L、V、Nle又はNvaである配列を含むか、又はこの配列から実質的に構成される単離ペプチドに関する。
P0がX、XX又はXXXで、Xが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示し、
P1がS、F、K、W又はYであり、
P2がL、I、V、Nle又はNvaであり、
P3がLであり、
P4がM、L又はNであり、
P5がWであり、
P6がI、A、L、V又はNであり、
P7がTであり、
P8がQ、E、D又はTであり、
P9のPΩがC、V、I、L、A、Nva、Nle、V−NH2又はL−NH2であり、
PΩ+1がX、XX又はXXXで、Xが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示する配列であって、SLLMWITQ{C、V、I、L、A}、FVLMWITQA、FILMWITQ{L、I}、YVLMWITL又はYLLMWIT{I、L}ではない配列、
P1がS、F、K又はWであり、
P2がL、I、V、Nle又はNvaであり、
P3がLであり、
P4がM、L又はNであり、
P5がWであり、
P6がI、A、L、V又はNであり、
P7がTであり、
P8がQ、E、D又はTであり、
P9のPΩがC、V、I、L、A、Nva、Nle、V−NH2又はL−NH2である配列であって、SLLMWITQ{C、V、I、L、A}、FVLMWITQA又はFILMWITQ{L、I}ではない配列、
又は
P1がYであり、
P2がL、V、I、Nle又はNvaであり、
P3がLであり、
P4がM、L又はNであり、
P5がWであり、
P6がI、A、L、V又はNであり、
P7がTであり、
P8がQ、E、D又はTであり、
P9のPΩがV、I、L、Nva、Nle、V、V−NH2又はL−NH2である配列で
あって、YVLMWITL又はYLLMWIT{I、L}ではない配列を含むか、又はこの配列から実質的に構成される単離ペプチドに関する。
ドは、例えば、約8〜14アミノ酸長、より好ましくは9〜10アミノ酸長を有することができる。
用いた免疫化及びペプチド認識をアッセイすることによって評価することができる。交差反応性を、ペプチドを用いた免疫化及びセグメント認識をアッセイすることによって評価することができる。
T細胞エピトープを含むペプチドは、通常、以下の複数の要因のうちの1つにより、免疫原又は免疫調節物質としては不十分である:最適薬物動態プロファイル、MHC分子への結合の制限(Konの減少及びKoffの増加)、正常な免疫レパートリーに存在するT細胞による内因性認識の減少(例えば、種々の耐性形態による)。ペプチドの免疫学的特性を向上させるために、配列が天然のエピトープと異なるペプチドのスクリーニング及び使用に関して種々のストラテジーが行われている。このようなアナログは、複素環式ペプチド及び代替ペプチドリガンド(APL)等の当該技術分野で種々の名称で知られている。このようなアナログの生成には、遺伝学的に標準的にコードされる残基由来のアミノ酸が最も頻繁に使用されている(例えば、Valmori, D. 他., J. Immunol. 160: 1750-1758, 1998を参照のこと)。非標準アミノ酸の使用は、典型的には、ペプチドの生化学的安定性を改善するための試みに関連している(例えば、Blanchet, J.-S. 他., J. Immunol. 167:5852-5861, 2001を参照のこと)。
1.TCRに対する交差反応性及び機能的結合力。
2.MHCクラスIへの結合に対する親和性及び安定性。
3.細胞毒性によって評価された免疫に対するin vivoでの効果。
4.IFN−γのex vivoでの産生によって評価された、免疫に対する
in vivoでの効果。
5.タンパク質分解に対する耐性の増大。
という制限を受ける。
用し得る。
ペプチド合成法又は所望のペプチドアナログをコードする核酸の発現を利用したペプチドの製造を含む、当業者に既知の任意の方法を使用してアナログを産生することができる。したがって、アナログが1つ又は複数の非標準アミノ酸を含む場合、アナログはペプチド産生法によって産生される可能性がより高い。アナログが1つ又は複数の標準アミノ酸による置換のみを含む場合、当業者に既知の任意の方法を使用して発現ベクターから上記アナログを発現することができる。あるいは、遺伝子治療法を使用して上記ペプチドを発現することができる。
アナログの有用性及び/又は活性を同定した。この方法では、有用な及び/又は改善されたアナログを同定することができる。有用であるには、アナログは、必ずしも同定アッセイで改善されていることが見出されなくてもよい。したがって、有用なペプチドは、耐性化された患者で有用であるか、又はタンパク質分解に耐性を示す等の他の特性を含む。改善されると、ペプチドの、TCRへの結合、MHC分子への結合が明確に改善され、免疫応答又は任意の他の生物活性が改善される。有用であるには、ペプチドは、マウス試験系を使用した場合に改善されないが、ヒト免疫系での相違により、ヒトで試験した場合に改善することができる。あるいは、有用性は、耐性化したヒトにおける耐性を破壊する可能性に起因する。あるいは、有用性は、改善されたアナログの改善を同定するためのさらなる置換に関する基盤としたペプチドを使用する能力に起因し得る。
クラスIMHC制限T細胞応答、及び特に抗原に対するエフェクター及び記憶CTL応答を誘導、同調、維持、調節及び増幅するために開示されたアナログを使用する有用な方法が、「CTL応答の誘導方法」と題される米国特許出願番号第09/380,534号及び同第09/776,232号、「MHCクラスI制限免疫応答の制御方法」と題される2003年6月17日に出願された米国仮出願番号第60/479,393号、「予防又は治療目的のための、MHCクラスI制限エピトープに対する免疫応答の誘導、増大及び持続法」と題される米国特許出願番号第10/871,707号(公開番号第20050079152号)及び2004年12月29日に出願された米国仮特許出願番号第60/640,402号に記載されている。アナログはさらに最適化されたアナログを得るための調査において使用することができる。多くのハウスキーピングエピトープは2002年4月4日に出願された米国出願番号第10/117,937号(公開番号第20030220239号A1)及び同第10/657,022号(同第2004−0180354号)並びに2003年9月5日に出願されたPCT出願番号第PCT/US2003/027706号(公開番号第WO04022709号A2)並びに2001年4月6日に出願された米国仮出願番号第60/282,211号、2001年11月7日に出願された同第60/337,017号、2002年3月7日に出願された同第60/363,210号、2002年9月5日に出願された同第60/409,123号で提供され、これらの各出願は、「エピトープ配列」と題されている。さらにアナログはこれらの出願に記載されている様々な態様のうちの任意のものに使用することができる。エピトープクラスタ
(アナログからなるか又はアナログを包含する)が、「エピトープクラスタ」と題され、2000年4月28日に出願された米国特許出願番号第09/561,571号に開示され、より完全に定義される。アナログを使用及び伝達する方法が、それぞれ「CTL応答を誘導する方法」と題される米国特許出願番号第09/380,534号及び同第09/776,232号(公開番号第20020007173号A1)及びPCT出願番号第PCTUS98/14289号(公開番号第WO9902183号A2)に記載される。このような免疫療法のための有益なエピトープ選択法が、「抗原提示細胞におけるエピトープ同期化」と題され、2000年4月28日に出願された米国特許出願番号第09/560,465号、2001年12月7日に出願された同第10/026,066号(公開番号第20030215425号A1)、2001年11月7日に出願された同第10/005,905号、「エピトープ発見法」と題される同第09/561,074号、「エピトープクラスタ」と題され、2000年4月28日に出願された同第09/561,571号、「癌のための抗血管新生製剤」と題され、2002年3月7日に出願された同第10/094,699号(公開番号第20030046714号A1)、「エピトープ配列」と題され、2002年4月4日に出願された出願番号第10/117,937号(公開番号第20030220239号A1)及びPCTUS02/11101号(公開番号第WO02081646号A2)、「エピトープ配列」と題され、2003年9月5日に出願された出願番号第10/657,022号及びPCT出願番号第PCT/US2003/027706号(公開番号第WO04022709号A2)に開示される。ワクチンプラスミドの全体の設計の態様は、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター」と題され、2000年4月28日に出願された米国特許出願番号第09/561,572号、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びこれらの設計法」と題され、2002年11月7日に出願された同第10/292,413号(公開番号第20030228634号A1)、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター」と題され、2002年8月20日に出願された同第10/225,568号(公開番号第20030138808号)及び2003年8月19日に出願されたPCT出願番号第PCT/US2003/026231号(公開番号第WO2004/018666号)、並びに「プラスミド増幅における望ましくない複製中間体の回避」と題される米国特許番号第6,709,844号に開示される。特定の癌に対する免疫応答を導く上で特に有益な特異抗原の組み合わせは、「様々なタイプの癌のためのワクチンにおける腫瘍関連抗原の組み合わせ」と題される、2003年6月17日に出願された米国仮特許出願番号第60/479,554号及び2004年6月17日に出願された米国特許出願番号第10/871,708号並びにPCT出願番号第PCT/US2004/019571号(公開番号第WO2004/112825号)に開示される。腫瘍血管新生に関連する抗原(例えば、PSMA、VEGFR2、Tie−2)は、「癌のための抗血管新生製剤」と題され、2002年3月7日に出願された米国特許出願番号第10/094,699号(公開番号第20030046714号A1)に開示されるように、癌性疾患に関してもまた有用である。標的を定めた生物反応修飾物質の投与による免疫応答の誘発、維持及び操作方法は、2004年12月29日に出願された米国仮出願番号第60/640,727号に開示される。CD4+細胞を介さずに免疫応答を誘導する方法は、2004年12月29日に出願された米国仮出願番号第60/640,821号で開示される。例示的な疾患、組織及び抗原並びに標的組織、標的細胞及び標的疾患に関するエピトープは、「CTL応答の誘導法」と題され、2001年2月2日に出願された米国出願番号第09/776,232号(公開番号第20020007173号)に記載される。例示的な方法は、「様々なタイプの癌の診断における腫瘍関連抗原の組み合わせ」と題され、2004年6月17日に出願された米国仮出願番号第60/580,969号及び2005年6月17日に出願された米国特許出願番号第_/_号(代理人整理番号:MANNK.050A)に見出される。方法及び組成物はまた、「様々なタイプの癌のための組成物における腫瘍関連抗原の組み合わせ」と題され、2004年12月29日に出願された米国仮出願番号第60/640,598号に開示される。免疫応答性を評価、モニタリングする診断法と、アナログの利用を
含む免疫化との統合は、「診断と治療法の統合による、積極的な免疫治療の有効性の改善」と題され、2004年6月17日に出願された米国仮特許出願第60/580,964号及び2005年6月17日に出願された米国特許出願番号第_/_号(代理人整理番号MANNK.040A)においてより完全に議論される。免疫原性ポリペプチドコードベクターは、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びこれらの設計法」と題され、2002年11月7日に出願された米国特許出願番号第10/292,413号(公開番号第20030228634号A1)並びに「癌細胞及び腫瘍間質で発現する主要なエピトープ及びそれに次ぐ主要なエピトープに対する多価免疫応答を誘導する方法及び組成物」と題され、(代理人整理番号 MANNK.053PR)、2005年6月17日に出願された米国仮出願番号第_/_,_号に開示される。さらに、重要な方法及び組成物を含む有用な開示は、「癌腫のための多価の同調−増幅免疫治療」と題され、2005年6月17日(代理人整理番号. MANNK.054PR)に出願された米国仮出願番号第_/_,_号に見出される。さらなる方法、組成物、ペプチド及びペプチドアナログは、「SSX−2ペプチドアナログ」及び「NY−ESOペプチドアナログ」と題され、2004年6月17日に出願された米国仮出願番号第60/581,001号及び同第60/580,962号にそれぞれ開示される。この段落で言及されるこれらの出願の全ては、これらが教示する全てに関して、全体が参照として本明細書中に援用される。さらなるアナログ、ペプチド及び方法が、2005年6月17日に出願され、「SSX−2ペプチドアナログ」と題される米国特許出願番号第_/_,_号(代理人整理番号:MANNK.038A)、「NY−ESO−1ペプチドアナログ」と題される米国特許出願番号第_/_,_号(代理人整理番号:MANNK.039A)、及び「エピトープアナログ」と題される米国特許出願番号第_/_,_号(代理人整理番号:MANNK.051A)に開示される。これらに制限はされないが、例としてこれらの参考文献は、これらがクラスIMHC制限エピトープ、そのアナログ、アナログの設計、エピトープ及びアナログの使用、エピトープの使用法及び作製法、並びにこれらの発現のための核酸ベクターの設計及び使用について教示する事柄に関して、参照によって援用される。
MHC制限様態においてT細胞によって認識される多くのエピトープを持つ抗原が存在し、これらに対する免疫応答の操作は、潜在的に治療性又は予防性を有する。本明細書中に記載されているMHC結合ペプチドのアナログを作製するための原則は、一般的にこれらの抗原及びそれらのエピトープのいずれかに適用可能である。本開示の具体的な焦点は、腫瘍関連抗原(TuAA)SSX−2、NY−ESO−1、PRAME、PSMA、チロシナーゼ、及びMelan−Aからのエピトープである。
及びSSX−2103-111(Wagner C他 Cancer Immunity 3:18, 2003))を用いて近年同定され、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に援用される。両方のエピトープのC末端は、in vitroでのプロテアソーム消化によって効率的に生成することができる。SSX−2陽性の患者の腫瘍浸潤リンパ節由来の単離HLA−A*0201/SSX−241-49多量体+CD8+T細胞が高い機能性結合力を示し、効果的にSSX−2陽性腫瘍を認識することができるが、自然発生的に起こる免疫応答は、腫瘍の増殖を停止するのに十分ではなく、それはおそらくこれらの免疫応答が疾患の進行のかなり遅い段階まで発現せず、活性化したT細胞が十分な数存在しないためである。さらに、米国特許番号第6,548,064号(これは、その全体が参照により本明細書に援用される)は、SSX−2エピトープのP2部位及びPΩ部位の両方で、T又はA残基を置換することを記載している。
する。PRAMEは、主として、限定された配列相同性を共有する仮想タンパク質から成るMAPEファミリーの成員である。TuAAとしてのPRAMEの実用性は、「腫瘍拒絶抗原前駆体DAGEをコードする単離核酸分子及びその使用」と題される米国特許番号第5,830,753号で教示され、これは、その全体が参照により本明細書に援用される。「T細胞ペプチドエピトープ及び該選択されたエピトープを組み込むワクチンの選択法及び製造法」と題される米国特許出願番号第10/181,499号(これは、その全体が参照により本明細書に援用される)は、in vitroでの免疫プロテアソームによる消化を利用して、PRAME425-433を含む多様で潜在的なエピトープを同定する。
上述のように、SSX−241-49への応答を含む、癌患者におけるSSX−2への自然な免疫応答は、癌を制御するのに効果的ではない可能性がある。さらに、野生型SSX−241-49は、その臨床的潜在性をさらに制限することができる適当な免疫原性ペプチドにすぎない。スーパーアゴニストアナログの使用によって誘導されるより強いSSX−2特異的な免疫応答は、SSX−2陽性腫瘍を有する患者に対して臨床的恩恵をもたらす。
アナログを選択することによるin vitroでの特異的な腫瘍反応性CTLの生成の増大」Valmori他, J Immunol. 1998,160(4):1750-8、これはその全体が参照により本明細書に援用される。元のエピトープが2部位において最適なアンカーアミノ酸残基を欠いているので、元のエピトープはHLA−A2分子と安定な複合体を形成することができなかった。修飾されたA27L Melan A26〜35ペプチドアナログは、HLA−A2分子に対する結合プロファイルが明らかに増大し、その野生型より大きな免疫原性を示している。このアナログで患者に免疫性を付与することにより、細胞表面に提示される野生型のエピトープを認識できる強いT細胞免疫応答を引き起こすことができる。同様の修飾を、GP100 209〜217(「HLA−A*0201結合残基で修飾されたメラノーマ抗原gp100由来のペプチドを有するメラノーマ反応性CTLの誘導の改善」Parkhurst他、J Immunol. 1996,157(6):2539-48、これは、その全体が参照により本明細書に援用される)、Her−2 369〜377(「MHC接触残基の変更によるHER−2/neuプロトオンコジーンの免疫優勢エピトープの免疫原性の改善」Vertuani他、J Immunol. 2004, 172(6):3501-8、これはその全体が参照により本明細書に援用される)のような他の多くの腫瘍関連エピトープを用いることで得ることに成功している。
vitroの両方でA2+及びSSX−2+腫瘍細胞系を効果的に溶解することができ、このアナログを使用して生じたCTLが、細胞表面に自然発生的に提示された野生型SSX−241−49エピトープを認識することができることを示している。野生型SSX−241−49エピトープと比較して、アナログは癌ワクチンの開発のより良い候補物質である。
のを助けることができる。様々なペプチドの実施形態は、MHCに対するより大きな親和性若しくはMHCとのより大きな結合安定性を有し、野生型エピトープを認識するT細胞からと同程度のサイトカイン製造を誘導するのに、より大きなサイトカイン製造を誘導するか又はより小さなペプチド濃度を必要とし、より免疫原性があり、野生型エピトープに対する交差反応性細胞溶解応答を誘導又は増幅することができ、或いは耐性を破壊することができるという1つ又は複数の改善された免疫学的特性を有する。
実施形態は、配列KASEKIFYVの置換を含むSSX−241-49ペプチドに関する(図1参照)。さらなる実施形態では、アナログは一般的に配列KASEKIFYVYを有するSSX−241-50十量体ペプチドのアナログである。ペプチドを構成する残基又はアミノ酸は、N末端からC末端まで番号を付けたペプチド内の位置を示すために、P1−P9又はP1−P10として本明細書中に言及され、P1は九量体におけるN末端のリジンに対応し、P9はP1及びC末端のバリンに対応する。あるいは、残基は、これらが含まれる分子の主な活性を方向付ける。例えば、P2残基は、N末端の第1のアンカー分子として記載され、一方P9(又は十量体ではP10)は、第1のC末端のアンカーとして記載される。残基P4、P6及びP8は、最初にTCR相互作用に関係する。置換には、当業者に既知の標準アミノ酸及び非標準アミノ酸を含む任意のアミノ酸を使用することができる。多くの例示的なアミノ酸が本明細書中に開示されているが、本明細書中に開示される置換は、全ての推測される置換を含むリストを意味するものではなく、可能性のある置換の例示である。当業者は、本明細書中のアナログに使用するために購入又は化学的に製造される多くの他の非標準アミノ酸を、カタログ及び参照において見出すことができる。
N末端の第1/第2のアンカー(P1部位及びP2部位)、及びC末端第1のアンカー(P9部位)などにおいて、より良いHLA結合プロファイル及びより高い免疫応答を達成するためのペプチドアンカー残基の修飾により製造された。さらに、アンカー残基及びTCR接触残基における修飾を伴うペプチドが、自己抗原に対するT細胞耐性を回避するために製造され、これらの修飾には、N末端の第1の/第2のアンカー(P1部位及びP部位)及び第2のTCR認識部位(P4部位、P6部位及び/又はP8部位)での修飾、N末端の第1/第2のアンカー(P1部位及びP2部位)での修飾、並びにC末端の第1のアンカー(P9)及び第2のTCR認識部位(P4部位、P6部位及び/又はP8部位)での修飾が含まれた。さらに、十量体アナログが生成された。
基に置換する、P2残基における置換が挙げられる。さらなる実施形態では疎水性残基はまた、より巨大な側鎖を有することができる。さらなる実施形態では、P1の残基は、より疎水性の残基で置換することができる。さらなる実施形態では、P1及びP2残基の両方がより疎水性の残基で置換することができる。さらなる実施形態では、P1、P2及びP9の残基の少なくとも1つを置換することができる。さらなる実施形態では、P1、P2及びP9の残基の少なくとも2つを置換することができる。さらなる実施形態では、P1、P2、P9、P4、及びP6での残基の少なくとも2つを、TCR結合に関連する1つ又は複数の残基を含んで、置換することができる。
N末端の第1のアンカーは、ペプチドの第2のN末端アミノ酸であり、N末端に近接した第1のアンカーである。これは、最初にMHC分子との相互作用に関わり、置換が結合及び安定性の改善をもたらし得る。しかし、これはまた、TCR相互作用にも二次的に関わり得る。したがって、この部位の置換は、MHC分子との相互作用の改善並びにTCRとの相互作用の改善を伴うペプチドをもたらし得る。
N末端の第2のアンカーは、N末端の第1のアミノ酸である。この残基は、Lys41であり、HLA−A*0201分子との相互作用における第2のアンカー残基として定義される。しかし、これはまた、T細胞受容体との相互作用に或る程度関与する。したがって、この位置の修飾は、より免疫原性で、腫瘍ワクチンの開発により好適ないくつかのヘテロクリティックアナログを生成することができる。この位置でのリジンが一般的に好ましいと考えられるが、置換は特性の大きな改善を伴う。
一実施形態では、第1及び第2のアンカー残基の両方が置換され、HLA分子に対する結合親和性の改善をもたらした。さらなる実施形態では、2重の置換が、HLA分子に対する結合安定性が改善した。さらなる実施形態では、結合及び/又は安定性が改善されず、低減すらする場合もあったが、耐性化された個体による活性又は認識のような、分子の他の特性が改善された。
野生型ペプチドのC末端のValは、一般的に好ましいアンカー残基であり、最初にMHC分子との相互作用に関わる。しかし、どのアミノ酸が第1及び第2のN末端の修飾を伴うアナログを改善するかを同定するために、置換が行われた。これらのC末端の置換は、1つ又は複数のN末端の修飾なしでも使用することができる。
TCR部位は、一般的にP4、P6及びP8残基として認識され、TCRとの結合に関わる第1の残基である。しかし、他の残基も、程度低いものの相互作用に関わる。一実施形態では、TCR相互作用に最初に関わる1つ又は複数の部位を、相互作用を増大するために置換することができる。おそらく、これらの置換は、MHC分子との結合を妨げないヘテロクリティックアナログを生成することができ、野生型ペプチドの耐性問題を克服することができる。さらなる実施形態では、TCR置換の少なくとも1つは、P1、P2及び/又はP9部位での少なくとも1つの置換を含むことができる。さらなる実施形態では、P4、P6及びP8部位での任意の1つ又は複数の置換は極性アミノ酸である。さらなる実施形態では、置換はP8部位での芳香族アミノ酸である。さらなる実施形態では、置換はP6部位での巨大脂肪族側鎖を有するアミノ酸である。さらなる実施形態では、置換は相互作用を保つために大きな側鎖を有するアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、C末端の残基が遊離型カルボン酸の場所でアミドを含むように修飾することができる。したがって、例えば、ペプチドが9−mer(九量体)である場合、P9残基が修飾され得る。ペプチドが10−mer(十量体)である場合、P10
残基が修飾され得る。好ましくは、これは、血液、リンパ液及びCNSを含むが、これらに限定されない生体媒質中で安定性が増大したペプチド又はアナログをもたらす。好ましくは、ペプチドは他の必要な活性を維持し、ワクチン接種の使用に適したアナログをすなわちイムノゲンとしてもたらすことができる。
一般的なMHC結合ペプチドの長さは、約8〜約11のアミノ酸長で変化する。しかし、これまでに使用されたHLA−A*0201の多くは、9−mers(九量体)又は10−mers(十量体)である。したがって、一実施形態では、アナログは野生型の配列SSX−241-50のアナログである。しかし、野生型10−merが正確な結合モチーフを有さず、免疫学的活性を示さないので、10−merはP10部位におけるアミノ酸の置換並びに様々な野生型及びアナログの効果の同定によって作り出された(図1参照)。
図1A及び図1Bに関して、任意の残基もまた保存的アミノ酸で置換することができる。保存的置換は、効果を生み出すことのできる上記置換のいずれかと対になり得る。あるいは保存的置換は、一次的、二次的又は三次的なレベルでさえ、何らかの活性に関係しているとは考えられない残基で特異的である。このような残基には、P3、P5及びP7が挙げられる。アナログを生成するために、例えばP3部位のセリンをアラニン又はスレオニンで置換することができる。一般的には、このような保存的置換は、アナログの活性に有意な影響を与えないが、いくつかの実施形態では、これらはある特定の活性を増大又は低減する。
アナログの設計の多様な実施形態及び態様に関する多くの特性が、一般的に又はSSX−2エピトープに適用されるように、上記に開示されている。このような開示はまた、このエピトープ及びこれに続くエピトープに適用可能であるということを理解すべきである。簡潔にするために、このような開示を明確に再び述べることを最小限にとどめる。
ド、及びアナログを発現する核酸に関する。このアナログは、野生型のエピトープに比べて同程度又は改善された免疫学的特性を有する。
アナログは、一般的に配列SLLMWITQC(配列番号1)を有するNY−ESO−1157-165のアナログである。野生型のアミノ酸が好ましいか、好ましくないかの分析には、他のペプチドとMHC又はTCRの相互作用に関するこれまでの分析を使用した。例えば、C末端のシステインは、HLA分子との強い相互作用を生み出さないので、一般的には好ましくないアンカー残基であり、したがって、この残基を置換することは非常に好ましい。しかし、P1部位のセリンは一般的に好ましいにも関わらず、芳香族化合物を置換することにより、特性が改善されたペプチドを製造することができることが見出された。さらに、P2部位のロイシンは一般的にこのましいが、疎水性及び/又は巨大なアミノ酸の置換は特性が改善されたペプチドをもたらした。最初にTCRとの相互作用を伴う残基(P4、P6及びP8)は、P8においては、芳香族化合物が一般的に有益な特性を有するペプチドを製造した。
。以下の置換の例は、図13A〜図13Cに示される。
N末端の第1のアンカーは、ペプチドの第2のN末端アミノ酸であり、したがって、N末端に近接した第1のアンカーである。元のロイシン158は、NHC分子との結合に関して「好ましくない」とは考えられないが、置換により結合が改善されたペプチドを製造することができる。したがって、一実施形態では、野生型の配列中の元のLeu158は、同程度又はより疎水性のアミノ酸で置換される。標準アミノ酸及び非標準アミノ酸などの、利用可能であるか又は当業者に既知のものを含めた、任意の疎水性アミノ酸を利用することができる。さらなる実施形態では、元のLeu158は巨大な側鎖を有するより疎水性のアミノ酸で置換される。より疎水性のアミノ酸の例としては、Leu、Val、Ile、Met、α−アミノ酪酸、ノルロイシン及びノルバリンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ナフタール側鎖もまた置換される。好ましくは、置換によりHLA分子との結合及び安定性の改善がもたらされる。しかし、この残基は二次的又は三次的にTCR相互作用に関わり、置換はまたTCRによる認識の改善をもたらす。
N末端の第2のアンカーは、N末端の第1のアミノ酸すなわちP1である。この残基は多数の相互作用に関係する。Ser157の残基は、HLA−A*0201分子との相互作用における第2のアンカー残基として定義され、これはまた、T細胞受容体との相互作用に或る程度関与する。したがって、この部位の修飾は、より免疫原性であるとともに腫瘍ワクチンの開発により好適な、いくつかのヘテロクリティックアナログを生成する。したがって、置換は広範な質の改善をもたらし得る。
一実施形態では、第1及び第2のアンカー残基の両方が置換され、HLA分子に対する結合親和性の改善をもたらした。さらなる実施形態では、2重の置換が、HLA分子に対する結合の安定性が改善された。さらなる実施形態では、結合及び/又は安定性が改善されず、低減する場合もあったが、耐性化された個体による活性又は認識などの、分子の他の特性が改善された。
野生型ペプチドのC末端のシステインは一般的に好ましくないアンカー残基である。この残基は最初にMHC分子との相互作用に関わるので、MHC分子とのより強い相互作用をもたらす残基を置換することが好ましい。したがって、置換は、結合親和性及び安定性の改善を示し、いくつかの場合では、交差反応性の低減を伴うアナログをもたした。いくつかの実施形態では、C末端への置換は交差反応性を低減することなく、結合及び/又は安定性の改善を伴うペプチドをもたらす。しかし、別の実施形態では、C末端への置換は、同程度又は低減した交差反応性と共に、結合及び/又は安定性の改善を伴うペプチドをもたらす。この残基の置換は、ペプチドの改善をもたらすことがこれまでに示されているので、好ましくは、MHC分子との相互作用並びにTCRによる認識のような、他の相互作用が改善されたペプチドを製造することができる。したがって、いくつかの実施形態では、C末端の置換は少なくとも1つの他の置換と対になる。C末端へのアミノ酸置換の例
には、バリン、リジン、アラニン、及びイソロイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
TCRとの相互作用に関わる第1の残基は、一般的にP4残基、P6残基、及びP8残基として認識される。しかし、他の残基はまた、それほどではないにせよ相互作用を関わる。一実施形態では、相互作用の改善をもたらすために、TCR相互作用を最初に関わる1つ又は複数の部位が置換される。好ましくは、これらの置換は、MHC分子と結合することを妨げないが、野生型ペプチドの耐性問題を克服することができるヘテロクリティックアナログを生じることができる。一実施形態では、少なくとも1つのTCR置換は、P1部位、P2部位及び/又はP9部位での置換を少なくとも1つ含む。一実施形態では、ある程度の極性を有するアミノ酸を、P4、P6、及びP8で置換することができる。さらなる実施形態では、芳香族化合物であるアミノ酸をP8部位で置換することができる。
いくつかの実施形態では、C末端残基を、遊離型カルボン酸の変わりにアミドを含むように修飾することができる。したがって、例えば、ペプチドが9−mer(九量体)である場合、P9残基が修飾される。ペプチドが10−mer(十量体)である場合、P10残基が修飾される。好ましくは、これは血液、リンパ液、及びCNSを含むが、これらに限定されない生体媒質において、安定性が増大したペプチド又はアナログをもたらす。好ましくは、ペプチドは他の活性を維持し、ワクチン接種の使用に適したアナログ又はイムノゲンとしてもたらすことができる。
一般的なMHC結合ペプチドの長さは、約8〜約11のアミノ酸長である。しかし、これまでに使用されたHLA−A*0201の多くは、9−mers(九量体)又は10−mers(十量体)である。したがって、一実施形態では、アナログは野生型配列NY−ESO−1157-166の10−merである。しかし、野生型10−merが正確な結合モチーフを有さず、免疫学的活性を示さないので、10−merはP10部位でのアミノ酸の置換並びに様々な野生型及びアナログの効果の同定によって作り出された(図13A〜図13C参照)。一実施形態では、野生型のC末端で付加又は置換される残基は、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びアラニンから成る群から選択される。
図13A及び図13Cに関して、任意の残基もまた保存的アミノ酸で置換することができる。保存的置換は、効果を生み出すことのできる上記置換のいずれかと対になり得る。あるいは保存的置換は、一次的、二次的又は三次的なレベルでさえ、何らかの活性に関係しているとは考えられない残基で特異的である。このような残基には、P3、P5及び/又はP7が挙げられ得る。保存的置換は当業者に既知であるが、例えばP3部位のロイシンは、アナログを製造するためにアラニン又はスレオニンで置換される。一般的には、このような保存的置換は、アナログの活性に有意な影響を与えない。しかし、いくつかの実施形態では、これらはある特定の活性を増大又はある特定の活性を低減し得る。既知の相互作用のために、このような保存的置換が活性のいずれかへの有意な影響を有するであろうということは考えにくい。
アナログの設計の多様な実施形態及び態様に関する多くの特性が、一般的に又は特定のエピトープに適用されるように、上記に開示されている。このような開示はまた、このエピトープ及びこれに続くエピトープに適用可能であるということを理解すべきである。簡潔にするために、このような開示を明確に再び述べることを最小限にとどめる。
いくつかの実施形態では、PSMA288-297アナログは配列GLPSIPVHPIの置換を含む。以下の実施例2の表7に示されるように、結合モチーフのデータに関する参考資料は、P2アンカー残基が、A2.1制限エピトープの任意の部位における親和性に最も大きく寄与をすることを示している。この場合、P2部位のアミノ酸は、ロイシンが好ましい。PΩアンカー残基は、イソロイシンが好ましい。T2細胞アッセイシステム(図示せず)を使用したin vitroにおける結合の研究により、天然のペプチドは、一般的に、特にSSX−2及びNY−ESO−1に比べて優れた結合特性を有することが示されている。エピトープは、比較的低い濃度で有意な結合を示したが、これは、飽和状態に向かっての比較的緩やかな上昇と相関があった。野生型のエピトープは改善することができる。表7及び表8で示される分析は平均値であり、特定の配列における残基の挙動は、平均値からそれる。上記で検討されたSSX−2及びNY−ESO−1エピトープのNle及びNvaで得られた好ましい結果と一致しているので、Nle及びNvaはまた、PSMAエピトープのために上手く使用することができる。最終的には、エピトープに対するどのような耐性をも避けるのに役立つ代替物と相関がある場合、同様の結合特性であっても、ペプチドの免疫原性を効果的に増大することができる。トランスジェニックマウスモデルにおいて、天然のペプチドはエピトープに対する耐性を反映し得る程度の免疫原性(例えば、実施例35参照)しかなく、このエピトープが由来するPSMA領域がマウスとヒトPSMAとの間で同一である。
上記したように、このエピトープのP2部位における天然残基は、通常、遺伝的にコードされたアミノ酸の中で最適な残基であるが、他の好ましい疎水性残基又は巨大な疎水性残基の効果が、結合、耐性破壊及び交差反応性免疫の潜在的な改善のために研究された。例示的な置換には、Met、Ile、Gln、Val、Nva、Nle及びアミノ酪酸(Abu)が挙げられる。
N末端の第2のアンカーは、N末端の第1のアミノ酸である。天然のGlyがこの位置であることはわずかに好ましいにすぎない。様々な観察(例えば、表7及び表8参照)がエピトープを改善する潜在性を有するアミノ酸には、Ala、Ser、Abu及びサルコシン(Sar、つまりN−メチルグリシン)が挙げられることを示す。
この位置での天然のIleは一般的に好ましいが、最適な残基ではない。この位置での置換は結合を改善することができる。例示的な置換には、Val、Leu、Nva、及びNleが挙げられる。
最後から第2の部位(PΩ−1)は、第2のアンカー及びTCR相互作用部位の両方の役割を果たす。Ala、Leu、Ser及びThrの置換は、TCR相互作用へのこれらの最初の効果を有するが、これらはまた、結合の改善に寄与する。P3は、結合及び免疫原性の両方をもたらし得る別の位置である。この位置でのTrpの置換は、結合及び免疫原性の両方を改善する。
アナログの設計の多様な実施形態及び態様に関する多くの特性が、一般的に又は特定のエピトープに適用されるように、上記に開示されている。このような開示はまた、このエピトープ及びこれに続くエピトープに適用可能であるということを理解すべきである。簡潔にするために、このような開示を明確に再び述べることを最小限にとどめる。
いくつかの実施形態は、配列SLLQHLIGLの置換を含むPRAME425-433のアナログに関する。以下の実施例2の表7に示されるような、結合モチーフのデータに関する参考資料は、P2アンカー残基が、A2.1制限エピトープの任意の部位における親和性に最も大きく寄与することを示している。この場合、P2部位のアミノ酸は、ロイシンが好ましい。PΩアンカー残基は、ロイシンがこのましいが、以上に好ましいというわけではない。表7及び表8で示される分析は平均値であり、特定の配列における残基の挙動は、平均値からそれる、野生型のPΩ残基がその部位に必ずしも最も好ましいわけではない。他のエピトープのNle及びNvaで得られた好ましい結果と一致しているので、Nle及びNvaとこの配列を置換することで同程度の改善を得ることができる。最終的には、エピトープに対するどのような耐性をも避けるのに役立つ代替物と相関がある場合、同様の結合特性であっても、ペプチドの免疫原性を効果的に増大することができる。
開示されている。置換は、第1のアンカー部位P2及びPΩ(P9)、第2のアンカー部位P1及びPΩ−1(P8)で為された。置換はまた、TCR相互作用部位(第2のアンカー部位に加えて)P3及びP6で為された。選択された置換は、MHCクラスIペプチド複合体の結合及び/又は安定性、ペプチドの免疫学的特性を確定する鍵となる特性への影響を有する。さらに、T細胞レパートリーの検討から、また、天然エピトープに対する限定された免疫力に関与する仕組みを妨げるために、天然ペプチドを認識するT細胞受容体と相互作用するアナログの能力を維持する置換が、実用的価値となる。
[実施例1]
ペプチドは、標準的なFmoc固相化学を使用して、0.05〜0.1ミリモルスケールでSymphony多重ペプチド合成機(PTI technologies, MA)又はABI 433Aペプチド合成機(Applied Biosystems, Foster City, CA)のいずれかで合成した。C末端遊離酸ペプチドは、プレロードPEG−PS樹脂(Symphony)又はWang樹脂(ABI)を使用して合成した。C末端アミド化ペプチドは、Fmoc−PAL−PEG−PS樹脂上で合成した。樹脂はすべて、Applied Biosystems(Foster City, CA)から購入した。ペプチド合成で使用されるFmocアミノ酸は、Novabiochem(San Diego, CA)及びAnaSpec(San Jose, CA)から購入した。合成後切断は、標準的なプロトコルにより実施された。
C12カラム(Phenomenex, Torrance, CA)を使用した分析用HPLC(Varian又はShimazu)により確認された。
[実施例2]
抗原性が高くないペプチドの構造的修飾は、ペプチド−MHC結合、CTL認識及び/又は免疫原性を相当改善させることができる。効力が増強されたペプチドアナログを得るために野生型エピトープを修飾する方法に関する一般的なガイドラインが当該技術分野で既知である。よく知られている戦略は、対象となる特定のMHC分子への結合に関わる、いわゆるアンカー部位にある残基を最適化することである。HLA−A2の場合では、P2及びPΩ部位にある疎水性残基、特にP2にあるL及びM、並びにPΩにあるVに関する顕著な優位性が観察された(PΩは、エピトープのC末端残基を示す。HLA−A2に関しては、PΩはペプチドの長さに応じてP9又はP10である)。F、Y及びWのような芳香族残基でP1位置を置換することもまた好ましい。
[実施例3]
[実施例4〜21]
実施例3で生成されたアナログを、以下の実施例4〜21で、結合及び生物学的作用のような活性に関して試験した。
[実施例4]
HLA−A*0201に対するペプチドアナログ及び野生型エピトープの親和性は、T2細胞ベースアッセイ(Regner M, 他., Exp Clin Immunogenet. 1996; 13(1):30-5、これはその全体が参照により本明細書に援用される)を使用して評価した。
。一定の濃度のアナログと陰性対照(非MHC結合剤)の間のMFI(平均蛍光強度)の差異は、MHCとペプチドとの間の安定化複合体がどれだけT2細胞の表面上に提示されたかの関数である。したがって、ペプチドの限界濃度では、主としてKonの尺度であり、ペプチドの飽和レベルでは、Kon及びKoffの両方の尺度である。結合は、数学的に関連する2つの要因:最大半量結合(飽和に相当するシグナルの50%となるペプチド濃度)及び相対親和性(1/RA)により定量化された。相対親和性RAは、対照(野生型ペプチド)に対して正規化された結合、例えばペプチドアナログに対する対照の最大半量結合の比である。1/RA指数が大きいほど、且つ最大半量結合が小さいほど、アナログとMHC間の相互作用のKonは高い。これらの結合パラメータにより、野生型ペプチドに対して改善された53個のアナログが同定された。これらの改善された結合剤は、MHC及び/又はTCRとの相互作用に関与することが既知である部位を含む1個、2個、3個又は複数個の置換(標準及び/又は非標準アミノ酸を含む)を有する。しかしながら、MHC結合に対する全体的な影響は、修飾に依存していた。このようなペプチドアナログは、治療用組成物において、或いは治療用組成物をさらに派生させるための構造基盤として有用である。
[実施例5]
MHC上でのペプチド安定性(Koff)は通常、単に結合(Kon)から推察され得ない。さらに、結合とともに、MHCクラスI上でのペプチドの安定性は、T細胞の活性化が「シグナル1」(T細胞受容体とのMHCペプチド複合体相互作用)の持続期間に依存するため、このようなペプチドの免疫学的特性に関して重要であることがよく知られている。安定性アッセイに関して簡潔に述べると、TAPの発現が欠如し、その結果細胞表面上で安定なMHCクラスIを構築しないT2細胞を、MHCクラスIの最大注入(「飽和」)を達成することが既知の濃度のペプチド(対照又はアナログ)を用いて37℃で一晩パルス化して、十分に洗浄して、内因性タンパク質合成を阻止するエメチンの存在下で種々の間隔で追跡した。十分な洗浄後、MHCクラスI(A2対立遺伝子)を認識する、蛍光タグ付けした抗体で細胞を染色して、FacsScan分析器にかけた。一定の濃度のアナログと陰性対照(非MHC結合剤)の間のMFI(平均蛍光強度)間の差異は、MHCとペプチドとの間の安定化複合体がどれだけT2細胞の表面上に提示されたかの関数である。経時的なシグナルの減衰は、0時間での(追跡間隔の初めでの)結合に対する安定性指数50%として数学的に表された。
[実施例6]
ペプチドの免疫学的特性は、MHC分子への結合(Kon及びKoff)及びTCR(TCRとMHCペプチド複合体間の相互作用の親和性)の関数として記載される。第1のMHCアンカー残基への修飾は概して、MHC分子への結合に対する全体的な影響に関してかなりの程度の予測が可能である。
1.T細胞活性化を引き起こす影響(例えば、サイトカイン生産)を誘発ためのペプチドアナログの最小所要濃度
2.任意のアナログ濃度における最大(ピーク値)影響(例えば、サイトカイン生産)
3.活性化影響(例えば、サイトカイン濃度)のピーク値におけるアナログ濃度
[実施例7]
上記(実施例6、図2)の方法を適用して、野生型バージョンの天然SSX−241-49エピトープ(KASEKIFYV)において単一の置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した(図3)。ex vivoでIFN−γ生産を誘発するためのアナログの最小所要量と任意のアナログ濃度でのサイトカイン生産の最大量との間に強力な逆相関関係が見られた。
[実施例8]
上記(実施例6、図2)の方法を適用して、野生型バージョンでの野生型SSX−241-49エピトープにおいて2つの置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した(図4)。
少されるため、このようなペプチドは非常に有用である。
[実施例9]
上記(実施例6、図2)の方法適用して、野生型バージョンの天然SSX−241-49エピトープに対して3つ又はそれ以上の置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した(図5)。
[実施例10]
上記(実施例6、図2)の方法を適用して、一般的に知られているSSX−241-49ペプチドを包含する十量体のアナログのライブラリー全体を精査した(図6)。
[実施例11]
マウスの3つのグループ(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目にPBS25μl中SSX−241-49天然エピトープを発現するプラスミド25μg/各リンパ節で鼠径リンパ節へ直接的に接種することにより免疫化した。これに続いて、28日目及
び31日目に2回のさらなるペプチド追加免疫(同量)を行った。免疫化のスケジュールを図7に示す。追加免疫の1週後に、脾細胞をex vivoでSSX−241-49天然ペプチドで刺激して、様々なE:T比で51Cr標識化した標的細胞(T2細胞)を試験した(図8)。アナログA42Vは、追加免疫剤としてアナログA42L又は野生型ペプチド自体と比較して、天然ペプチドを発現する標的細胞に対してより高い応答を誘発することが結果により示された。これは、ex vivoでの実験により確定される結合及び安定性パラメータと相関した。
[実施例12]
マウスの8つのグループ(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目にPBS25μl中SSX−241-49天然エピトープを発現するプラスミド25μg/各リンパ節で鼠径リンパ節へ直接的に接種することにより免疫化した。これに続いて、図9に示されるように、陰性対照ペプチド(Melan A26−35「EAA」)、天然ペプチド又はアナログを使用して、28日目及び31日目に2つのさらなるペプチドの追加免疫(同量)を行った。
[実施例13]
マウスの8つのグループ(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目にPBS25μl中SSX−241-49天然エピトープを発現するプラスミド25μg/各リンパ節で鼠径リンパ節へ直接的に接種することにより免疫化した。これに続いて、図9に示されるように、陰性対照ペプチド(Melan A26−35「EAA」)、天然ペプチド又はアナログを使用して、28日目及び31日目に2つのさらなるペプチドの追加免疫(同量)を行った。
[実施例14]
表3に示される置換アナログを試験した場合、アナログは、野生型ペプチドエピトープと比較して結合及び安定性が改善したプロファイルを示した。しかしながら、各アナログに関する改善の規模は様々であり、A42Vの置換は、HLA−A*0201分子との結合親和性に関して最高の改善を示した。さらに、A42V−HLA−A*0201複合体の安定性は、野生型ペプチドとHLA−A*0201との間で形成される複合体よりも良好であり、T1/2は11.5時間から20時間まで延長した。42AのL、V及びMへの置換を伴うペプチドは、かなりの低濃度で野生型ペプチド特異的CTLのIFN−γ分泌を誘導することが可能であった。42AのIへの置換は、結合及び安定性が改善したプロファイルを有するアナログを生成した。P2部位にある残基もまた、ある程度までTCRとの相互作用に携わる。この観察はまた、野生型エピトープに比べて、HLA−A*0201との類似した結合親和性が類似した42AがAibに置換されたアナログによる結果によっても支持された。
[実施例15]
N末端の第2のアンカーは、N末端にある第1のアミノ酸である。したがって、一実施形態では、野生型配列で見出される元のLys43は、より疎水性且つ巨大なアミノ酸で置換される。標準アミノ酸及び非標準アミノ酸を含む当業者に利用可能なもの或いは当業者に既知であるものを包含する、任意のより疎水性且つ巨大なアミノ酸もまた使用することができる。より疎水性のアミノ酸の例としては、Phe、Tyr、Trp及びD−Lysが挙げられるが、これらに限定されない。
[実施例16]
N末端にある第1及び第2のアンカー残基両方が修飾される場合、一般的な傾向は、得られたアナログのHLA−A*0201分子との親和性及び安定性が改善されるが(表3)、但しほんのわずかに例外を伴う:(K41Y、A42V)、(K41Y、A42M)及び(K41(D−Lys)、A42V)。さらに、得られたアナログは、野生型ペプチド特異的CTLと非常に良好な交差反応性を有した。K41W置換をA42V又はA42Lと組み合わせることにより、結合/安定性プロファイルが改善され、これらのアナログはまた、野生型ペプチドと目的の交差反応性活性を有した。N末端の第1のアンカー及び
第2のアンカーの組合せ修飾は、より大きくペプチド構造及び立体構造を変化させた。
[実施例17]
野生型ペプチドのC末端のValは、好ましいアンカー残基であった。しかしながら、それを、1つのさらなる−CH2基を有するIleへ突然変異させた場合に、効果の改善が観察され、類似の改善が、ValをAbuに置換した場合でも観察された。他のアナログは、MHC分子との結合親和性及び安定性が改善したが、それらの交差反応性の結果は良好ではなかった。これらのアナログの結果により、ペプチドC末端アンカー残基がまた、T細胞の認識において重要な役割を果たすことが示された(表4)。
[実施例18]
第2のTCR結合アミノ酸残基の置換は好ましくは、MHC分子への結合を干渉しないが、自己抗原の耐性問題を克服するヘテロクリティックアナログを生成する。N末端の第1/第2のアンカー残基(K41F及びA42V)とTCR部位の置換を組み合わせることにより、結合親和性及び安定性が改善されたアナログが生成された(表6)。K41F、A42V、E44(Nva)/(Nle)突然変異体及びK41F、A42V、I46L/(Nva)/(Nle)突然変異体のようなこれらのアナログの幾つかは、より低濃度で野生型ペプチド特異的CTLのIFN−γ生産を誘導した。
[実施例19]
ペプチドの遊離型カルボン酸のC末端をアミドで置換することで、タンパク質分解に対する安定性を付与することにより生物培地においてペプチド安定性を改善させ、ペプチドに対するジペプチジルカルボキシペプチダーゼ耐性を付与した。しかしながら、得られたアナログの幾つかは、MHC分子との親和性、並びに免疫原性及び抗原性が低減した。興味深いことに、本出願で開示される3つのアナログ(表7)は、MHC分子との結合能力を失うが、SSX−241-49−NH2(A42V)は、野生型ペプチドの濃度と同様の濃度でIFN−γの分泌を誘導する能力により示されるように、野生型ペプチド特異的CTLとの反応性を保持した。しかしながら、SSX−241-49−NH2(A42L)は、より低濃度でIFN−γ生産を刺激することが可能であった。
[実施例20]
典型的なMHC結合ペプチドの長さは、八量体から11量体まで様々であり、ほとんどのHLA−A*0201結合ペプチドは、九量体又は十量体である。これまでの観察では、天然配列由来の九量体及び十量体はともに、同じMHCに関する結合モチーフを有することが見出されており、また同じN末端を有していた。プロテアソームプロセッシングの観点から、天然配列由来の九量体及び十量体は別個のエピトープであるが、それにもかかわらず抗原的に交差反応性であった。野生型エピトープSSX−241-49の場合、エピトープは九量体ペプチド及び十量体ペプチドであるSSX−241-50は、適切なMHC結合モチーフを欠き、免疫学的活性を示さなかった。したがって、野生型エピトープは、適切な結合モチーフを作ることができるアミノ酸を用いて十量体へ伸長された。表8に示すように、多くの十量体アナログが、HLA−A*0201分子とより低い結合親和性を有する一方で、アナログSSX−241-50(A42L、Y50L/V/Nle/Nva)は、HLA−A*0201分子に対する結合親和性をが改善された。特に、2つの十量体アナログ、A42L及びY50Nle/Nvaは、野生型ペプチドよりも低濃度で野生型ペプチドに対して免疫化されたT細胞からIFN−γ生産を誘導することが可能であった。
[実施例21]
アナログが野生型エピトープを上回った改善を示し得る一態様は、ヒト系における免疫原性の増大及び耐性破壊である。生殖細胞系の差異に起因しようと、陰性選択における差異に起因しようと、TCRレパートリーにおける差異は、変則的な結果を与える可能性を有する。このような問題に対処するために、アナログは、CTLを生成するためのHLA−A2+血液のin vitroでの免疫化で使用される。未処置のドナーでさえも使用するin vitroでの免疫化に関する手法は、当該技術分野で既知である(例えば、Stauss 他., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7871-7875, 1992、Salgaller 他. Cancer Res. 55:4972-4979, 1995、Tsai 他., J. Immunol. 158:1796-1802, 1997及びChung 他.,
J. Immunother. 22:279-287, 1999、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される)。
[実施例22〜30]
図13に列挙されるアナログは、以下の通り実施例22〜30で、結合及び生物学的影響のような活性に関して試験した。
[実施例22]
上記(実施例6)の方法を適用して、自然(又は野生型)バージョンでの野生型NY−ESO−1157-165エピトープにおいて単一の置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した(図13)。ex vivoでIFN−γ生産を誘発するためのアナログの最小必要量と任意のアナログ濃度でのサイトカイン生産の最大量との間に強力な逆相関関係が見られた。
誘導体化のための材料である。
[実施例23]
上記(実施例6)の方法を適用して、野生型NY−ESO−1157-165エピトープにおいて2つの置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した。2位及び9位での同時半保存的修飾は、アナログの明確な独自性に応じて、アナログの免疫特性に対して強い影響を有することが示された。L158IをC165V又はC165Lと組み合わせることにより、野生型ペプチドと比べて活性がさらに増大した。同様に、L158Vは、C165V又はC165Lアナログの活性を改善して、野生型ペプチドと比べて活性をさらに増大した。L158Vは、C165A又はC165Iアナログの活性を部分的に保持し、第1のアンカー残基の二重突然変異の興味深い影響を示した。同様に、L158Iは、C165Aアナログの活性を部分的に保持した。
上記(実施例6)の方法を適用して、野生型NY−ESO−1エピトープに対して複数の置換を有するアナログのライブラリー全体を精査した。
がTCRとの相互作用に関与するため、これらのアナログをin vivoでのT細胞耐性を破壊するのに有用な化合物としている。
7Tを含む三重突然変異体は、野生型ペプチドに対して、それぞれ活性が保持又は増大された。
[実施例25]
上記(実施例6)の方法を適用して、一般的に知られているNY−ESO−1157-165ペプチドを包含する十量体のアナログのライブラリー全体を精査した。十量体自体は、in vitroでの活性をかなり低減する一方で、166位でのL、又は157位でのY及び165位でのVと組み合わせた166位でのL、I、Nleのような、この位置での様々な置換は、活性を部分的に回復した。
[実施例26]
HLA−A*0201に対するペプチド類縁類体及び野生型Iプトープの親和性は、T2細胞ベースのアッセイ(その全体が参照により本明細書に援用されるRegner M, 他., Exp Clin Immunogenet. 1996; 13(1):30-5)により評価した。結合アッセイに関して簡潔に述べると、TAPの発現を欠き、その結果細胞表面上で安定なMHCクラスIを構築しないT2細胞を、種々の濃度のペプチド(対照又はアナログ)を用いて37℃で一晩パルス化して、十分に洗浄して、MHCクラスI(A2対立遺伝子)を認識する蛍光タグ付けした抗体で染色して、FacsScan分析器にかけた。A2を結合するペプチドは、細胞表面でのその存在を安定化する。一定の濃度のアナログと陰性対照(非MHC結合ペプチド)の間のMFI(平均蛍光強度)の差異は、MHCとペプチドとの間の安定化複合体がどれだけT2細胞の表面上に提示されるかの関数である。したがって、ペプチドの限界濃度では、主としてKonの尺度であり、ペプチドの飽和レベルでは、Kon及びKoffの両方の尺度である。図13では、結合は、数学的に関連する2つの要因:最大半量結合(飽和に相当するシグナルの50%となるペプチド濃度)及び対照(野生型ペプチド)に対して正規化された結合、即ちペプチドアナログに対する対照の最大半量結合の比である、相対親和性(1/RA)により定量化される。1/RA指数が大きいほど、且つ最大半量結合が小さいほど、アナログとMHC分子間の相互作用のKonは高い。図13では、このような結合パラメータが野生型ペプチドと比べて改善された39個のアナログが記載されている。このような改善された結合剤は、正確な/対となる修飾に依存するMHC結合に対する全体的な影響を伴って、MHC及び/又はTCRとの相互作用に関与することが既知である部位で、標準及び/又は非標準アミノ酸の1つ、2つ、3つ又は複数の置換を有する。このようなペプチドアナログは、治療用組成物において、或いは治療用組成物をさらに派生させるための構造基盤として有用である。
[実施例27]
8つのマウスのグループ(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に各リンパ節へPBS25μl中野生型NY−ESO−1157-165エピトープを発現するプラスミド25μgで鼠径リンパ節へ直接的に接種することにより免疫化した。これに続いて、
図14示すように、陰性対照ペプチド(HBVc)、野生型ペプチド又はアナログを使用して、28日目及び31日目に2回のペプチドの追加免疫(同量)を行った。
[実施例28]
in vivoにおいて野生型エピトープに対して得られる応答を評価するために、脾細胞を同腹子対照HHDマウスから単離して、20μg/mL又は1μg/mlの野生型ペプチドとともに2時間インキュベートした。続いて、これらの細胞をCFSEhi及びCFSEmed蛍光で染色して(それぞれ4.0μM又は1μM、15分間)、CFSElo蛍光(0.4μM)で染色した同等数の対照脾細胞とともに免疫化マウスの静脈内へ同時注入した。18時間後、標的細胞の特異的な排除は、誘発された動物から脾臓及びPBMCを取り出すこと、及びフローサイトメトリーによりCFSE蛍光を測定することにより測定された。ペプチド注入した脾細胞に対応する集合の相対的な減少は、対照(未注入)集合に対して算出され、特異的溶解率(%)として表した。図15Aは、陰性対照ペプチドを施したマウスにおけるin vivoでの細胞毒性の減少を示す。図15Bは、プラスミドで免疫化し、且つ野生型ペプチドで増幅させたマウスにおける細胞毒性の変動を示す。図15Cは、プラスミドで免疫化して、且つアナログL158Nva C165Vで増幅させたマウスにおけるほぼ一定した細胞毒性を示す。
[実施例29]
上述の免疫化プロトコル(実施例8)において、また、実施例9に記載する方法を使用して、限界量(1μM、図16A)又は上部最適量(20μM、図16B)の野生型ペプチドでコーティングした標的細胞に対するin vivoでの細胞毒性は、2段階に関してそれぞれプラスミド及びペプチドアナログを使用した、同調並びに増幅プロトコルに続いて評価した。平均特異的溶解率(%)+/−SEとして表される結果により、アナログL158V C165Nvaが最高の活性を誘導すること、並びにアナログL158V C165V、L158V C165Nva及びS157K L158V C165Vが、野生型ペプチド又はC165V突然変異体と同じ範囲で効果を示すことが示された。複数の置換はTCR結合部位を変更し得るため、このようなアナログは、自己エピトープに対する耐性を破壊する際に、野生型ペプチドよりも有用である。さらに、S157K三重突然変異体は、直接的な実用的意義を伴って、野生型ペプチド又は他のアナログの溶解性の低さを改善させることができる。
[実施例30]
上述の免疫化プロトコル(実施例27)において、また実施例28に記載する誘発後に、脾細胞を単離して、プールして、10μMの野生型ペプチドNY−ESO−1157-165で、それぞれ3日間及び6日間in vitroで刺激した。上清を回収して、IFN−γの濃度をELISAにより測定した。アナログL158Nva C165Vは、ex vivoでの刺激時に、より迅速に高レベルのIFN−γを生産するT細胞を誘導した(図17A)。S157F L158V C165V、L158V C165Nva、及びL158V C165Vのような他のアナログは、野生型ペプチドによるex vivoでの再刺激時にIFN−γを生産が増大するT細胞を誘導した(図17B)。一方、C165Vは、実施例27〜28に記載するプロトコルに続く、野生型ペプチドに比べて、T細胞のIFN−γを生産する能力の増大を誘導することはできなかった。
[実施例31]
プレースホルダーペプチドを注入したクラスIモノマーを含有する、アビジンコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、ペプチド結合、親和性及びオフ速度を評価した。モノマーコーティングされたプレートは、iTopiaエピトープディスカバリーシステムキット(Beckman Ciulter, Inc., San Diego, CA, USA)の一部として供給された。アッセイ緩衝液、抗MHC−FITC mAb及びβ2−ミクログロブリン並びに対照ペプチドもまたこのキットに供給された。
天然ペプチド及びアナログはまず、結合アッセイにより各MHC分子に対する結合能に関して評価された。このアッセイは、標準的な最適結合条件下における個々のペプチドのHLA分子に対する結合能を測定する。プレースホルダーペプチドを放出させて、プレートに結合したMHC重鎖のみを残して、モノマーコーティングされたプレートをまず取り剥がした。続いて、試験ペプチドを、抗MHC−FITC mAbとともに、最適なフォールディング条件下で導入した。プレートを21℃で18時間インキュベートした。抗MHC−FITC mAbは、リフォールディングされたMHC複合体へ優先的に結合する。したがって、各ペプチドから得られる蛍光強度は、MHC分子と複合体を形成するペプチドの能力に関連していた。各ペプチドの結合は、キット中に提供される陽性対照ペプチドとの比較で評価され、結果は、「結合%」と表した。天然ペプチドと比べて「より良好な結合剤」と同定されるアナログは続いて、親和性及びオフ速度アッセイで分析した。
親和性アッセイに関して、プレースホルダーペプチドの最初の取り剥がし後に、一定の対立遺伝子に関する各試験ペプチドの濃度を増大させ(10-4〜10-8Mの範囲)、一連のウェルへ添加して、上述の条件下でインキュベートした。プレートを蛍光光度計上で読み取った。S字形用量応答曲線が、Prismソフトウェアを使用して作成された。最大の50%を達成するのに要されるペプチドの量をED50値として記録した。
オフ速度アッセイに関して、21℃での18時間のインキュベーション後にプレートを洗浄して、過剰量のペプチドを除去した。続いて、プレートを対立遺伝子特異的モノマープレート上で37℃にてインキュベートした。プレートは、相対蛍光強度に関して複数の時点(0、0.5、1、1.5、2、4、6及び8時間)で測定した。ペプチドの50%がMHCモノマーから解離するのに要する時間をT1/2値(時間)として定義する。
iScoreは、iTopiaソフトウェア内に提供される多重パラメータ算出である。その値は、結合、親和性及び安定性のデータに基づいて算出された。
[実施例32]
HHDトランスジェニックマウス(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目にPSMA288-297ペプチド(各リンパ節に対して、pI:C12.5μgを加えてPBS25μl中25μg)で免疫化した。追加免疫の1週後に、脾細胞をex vivoで天然PSMA288-297ペプチドで刺激して、51Cr標識化したヒト腫瘍細胞(PSMA+A2+LnCap細胞、又は陰性対照としてMHCクラスIブロッキング抗体でコーティングしたLnCap細胞)に対して様々なE:T比で試験した。%特異的溶解率(平均値±SEM)として表した結果により、PSMA特異的T細胞は、免疫介在性誘発を可能にする様式で腫瘍細胞のMHCクラスI上でPSMAエピトープの提示を確認し、MHCク
ラスIの利用可能性に応じた様式で、ヒト腫瘍細胞を溶解させることが可能であることが示された(図18)。
[実施例33〜38]
図19及び図20に列挙されるアナログは、以下の通り実施例33〜38で、結合親和性及び安定性の改善、天然エピトープとの交差反応性並びに免疫原性のような様々な特性に関して試験した。
[実施例33]
実施例31に記載する手順を使用して、PSMA288-297及びアナログの結合特性を互いに比較して評価した(図19を参照)。結合に関する陽性対照は、melan−A26-35 A27Lであった。実質的に実施例6に記載されるように、天然エピトープとの交差反応性は、アナログペプチドを使用して、天然エピトープに特異的なT細胞系からのIFG−γ分泌を刺激することにより評価された。図19で示されるデータは、10μg/mlのアナログ(およそ10μM)で刺激することにより作成された。この濃度は概して、アナログに関して最大又はほぼ最大のIFN−γ生産をもたらし、したがって交差反応性を表すのに選択された。
[実施例34]
このエピトープにおける置換が結合親和性を大いに損なわないという上記に見られる傾向を、二重置換で検査して継続し(図20)、天然ペプチドと比較して結合親和性が類似しているか又は結合親和性が改善しているかを一様に示した。両方の第1のアンカー部位で置換を有するアナログの中でも、P2でのNva又はNle、PΩでのVal、P2でのVal及びPΩでのNvaを有するものが、結合安定性を改善し、前者2つは、IFN−γ生産を増大させた(第3のアナログに関してはデータが入手不可能であった)。PΩでのVal及びNva置換はまた、P1でのAla及びAbu置換と対にされた。これらのアナログは全て、単一のPΩ置換と比較して改善された強い結合安定性及びIFN−γ生産が改善しており、したがってP1置換をさらに改善させた。PΩ Nva置換はまた、P3Trp置換に、類似した交差反応性を回復させることが可能であった。
[実施例35]
P1、P2及びP3、P1、P2及びPΩ、P2、P3及びPΩ、並びにP1、P3及びPΩの三重置換を行った(図21)。全ての場合において、P1置換はAlaであり、P3置換はTrpであり、PΩ置換はVal又はNvaであった。上述のように、天然ペプチドに少なくとも類似した親和性が維持された。P1、P2、P3に関して、P2でのNva及びNleが、結合の安定性を改善させた。このP2 Nvaアナログは、同量のIFN−γを誘発したのに対して、Nleアナログは、かなりの増大を示した。
[実施例36]
HHDトランスジェニックマウスの群(n=8)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、pI:C12.5μgを加えたPBS25μl中のペプチド(天然エピトープPSMA288-297或いは第1又は第2のアンカー残基での置換を保有するアナログ)25μgで免疫化した。
[実施例37]
HHDトランスジェニックマウスの2つの群(n=8)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、PBS25μl中のPSMA288-297を発現するプラスミド25μgで免疫化した。これに続いて、天然ペプチド又はI297Vアナログのいずれかを用いて、28日目及び31日目に2回のペプチド追加免疫(25μg)を行った。
激した。インキュベーションの48時間後に、アッセイを展開して、PSMA228-297ペプチドを認識するサイトカイン生産T細胞の頻度を自動的に計数した。データは、50万個のレスポンダー細胞に対して正規化した特異的T細胞の頻度(三重反復実験の平均値±SD)として図23に表した。データにより、脾細胞の数/ウェルとは関係なく、天然エピトープ特異的T細胞の頻度が、I297Vアナログで免疫化したマウス群においてかなり高かったことが示された。
[実施例38]
HHDトランスジェニックマウス(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、PBS25μl中のPSMA288-297エピトープを発現するプラスミド25μgで免疫化した。これに続いて、アナログI297V用いて、28日目及び31日目に2回のペプチド追加免疫(同量)を行った。追加免疫の1週後に、脾細胞をex vivoで天然PSMA288-297ペプチドで刺激して、51Cr標識化したヒト腫瘍細胞(Lncap、A2+PSMA+、若しくは624.38A2+PSMA-又は対照624.28細胞A2-PSMA-)に対して様々なE:T比で試験した。得られた免疫性は、Lncapに対する細胞毒性を仲介する際に有効であった(図24)。
[実施例39]
HHDトランスジェニックマウス(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目にPRAME425-433ペプチド(各リンパ節に対して、pI:C12.5μgに加えてPBS25μl中25μg)で免疫化した。追加免疫の1週後に、脾細胞をex vivoで天然PRAME425-433ペプチドで刺激して、様々なE:T比で51Cr標識化したヒト腫瘍細胞(PRAME+A2+624.38メラノーマ細胞、又は陰性対照624.38細胞、A2発現が欠失)に対して試験した。%特異的溶解率(平均値±SEM)として表した結果により、PRAME特異的T細胞は、免疫介在性誘発を可能にする様式で、腫瘍細胞のMHCクラスI上でPRAME425-433エピトープの提示を確認し、ヒト腫瘍細胞を溶解させることが可能であることが示された(図25)。
[実施例40〜48]
図26〜28に列挙されるアナログは、以下の通り実施例40〜48で、親和性及び結合の安定性の改善、天然エピトープとの交差反応性並びに免疫原性のような様々な特性に関して試験した。実施例31に記載する手順を使用して、PRAME425-433及び69個のアナログのHLA−A*0201結合特性を互いに比較して評価した。結合に関する陽性対照は、melan−A26-35A27Lであった。観察されるアナログの親和性を%結合(陽性対照と比較して)及びED50として報告する。結合の安定性を解離の半減時間として報告する。天然エピトープとの交差反応性は、実質的に実施例6に記載されるように、アナログペプチドを使用して、天然エピトープに特異的なT細胞系からのIFG−γ分泌を刺激することにより評価された。図26〜28で示されるデータは、およそ0.3μMのアナログペプチドを用いて刺激することにより作成された。結果は、3つの別個の実験から収集されて、それぞれにおいて天然ペプチドにより誘発されるIFN−γの量に対して正規化された。場合によっては、報告される値は、2つの測定の平均値である。アスタリスク「*」は、IFN−γ生産がバックグラウンドと識別できなかったことを示す。
[実施例40]
Val、Met、Ile、Nle、Nva及びAbuの単一置換が、P2の第1のアンカー部位にあるLeuに対して行われた。これらのアナログは全て、天然ペプチドの20%以内の%結合を示した。ED50は、Met及びNvaアナログに関して確定した。前者は幾らか改善されたが、天然ペプチドに匹敵する親和性を有したのに対して、後者の親和性は約3倍低減されたが、依然としてPSMA288-287エピトープに匹敵していた。P2置換は全て、少なくとも天然ペプチドに類似した結合安定性を維持した。Met、Nle及びNvaアナログは、天然ペプチドの2倍以内のIFN−γ生産を誘発し、Valアナログは、いくらか少ないIFN−γ生産を誘発した。
[実施例41]
二重置換アナログは、上記の単一置換の様々な組合せを使用して、P1及びP2、P2及びPΩ、並びにP1及びPΩで行われた(図27A及び27B)。検査したP1−P2二重置換はいずれも、結合親和性又は安定性に対して根本的な変化をもたず、いずれもIFN−γアッセイにおいて有意な交差反応性を示さなかった。同様の傾向が、P2−PΩ二重置換アナログで見られるが、L426Nva L433Nleアナログは、結合特性が同様にいくらか改善されるとともに、IFN−γアッセイにおいて天然ペプチドとの交差反応性の有意なレベルを示す。最後に、P1−PΩ二重置換に関して、検査したアナログもまた、少なくとも同程度の結合特性を有する一般的な傾向があったが、交差反応性アッセイにおいてはIFN−γをほとんど誘発しなかった。この分類における例外は、結合安定性がいくらか改善され、有意な交差反応性を示したS425T L433Nleアナログ、並びに4倍以上低減されたED50、ほぼ2倍の解離の半減時間を有し、且つ天然ペプチドよりも多くのIFN−γを誘発したS425F L433Nleアナログであった。
[実施例42]
P1でPhe又はThr、P2でNva又はMet、並びにPΩでNleを有する4つの三重置換アナログを研究した。S425T L426M L433Nleアナログは同程度の親和性を有したのに対して、他の3つのアナログに関しては、親和性は改善された。P2 Nva置換を有するアナログはともに、結合安定性の増大及び有意なレベルの交差反応性を示した。図28を参照されたい。
[実施例43]
HHDトランスジェニックマウスの2つの群(n=8)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、PBS25μl中のPRAME425-433を発現するプラスミド(以下の実施例49に記載するpCTLR2)25μgで免疫化した。これに続いて28日目及び31日目に天然ペプチド又はPRAMEエピトープアナログL426Nva L433Nleによる2回のペプチド追加免疫(2.5μg)を行った。
[実施例44]
HHDトランスジェニックマウスの2つの群(n=8)を上記実施例43に記載するように免疫化した。
HHDトランスジェニックマウスの7つの群(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、PBS25μl中のPRAME425-433を発現するプラスミドであるpCTLR2 25μgで免疫化した。これに続いて、28日目及び31日目に、天然ペプチド、陰性対照(EAAGIGILTVペプチド)或いは第1及び/又は第2のアンカー残基に突然変異を有するPRAME425-433エピトープアナログ(S425F、L426Nva L433Nle、S425T L433Nle及びS425T L426Nva L433Nle)による2回のペプチド追加免疫(2.5μg)を行った。
[実施例46]
HHDトランスジェニックマウスの3つの群(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、PBS25μl中のPRAME425-433を発現するプラスミドであるpCTLR2 25μgで免疫化した。これに続いて、28日目及び31日目に、PRAMEエピトープアナログL426Nva L433Nle及びS425T L426Nva L433Nle又は陰性対照ペプチドMelan A(EAAGIGILTV)により2回のペプチド追加免疫(2.5μg)を行った。
vivoでのサイトカイン生産、及びS425T L426Nva L433Nleに対する応答よりもL426Nva L433Nleに対するより高い応答がデータにより示された。
[実施例47]
HHDトランスジェニックマウス(n=4)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に鼠径リンパ節へ直接接種することにより、PBS25μl中のPRAME425-433を発現するプラスミドであるpCTLR2 25μgで免疫化した。これに続いて、28日目及び31日目に、アナログL426Nva L433Nleによる2回のペプチド追加免疫(2.5μg)を行った。追加免疫の1週後に、脾細胞をex vivoで天然ペプチドで刺激して、51Cr標識化したヒト腫瘍細胞(IFN−γで前処理したか、若しくは
前処理しないPRAME+624.38メラノーマ細胞、又は陰性対照624.38細胞、HLA−A2発現が欠失)に対して様々なE:T比で試験した。アナログL426Nva L433Nleは、A2を発現するヒト腫瘍細胞発現(624.38)に対する有意な細胞毒性を介在する免疫応答を誘発し、IFN−γによるそれらの前処理時にわずかに上昇された。対比して、A2−624.28細胞に対しては有意な活性は測定されなかった。図33を参照されたい。
[実施例48]
in vitroでの免疫化は、図34に提示した一般的なスキームに従って実施された。減少血単核細胞(PBMC)は、フィコール分離により健常なドナー(HLA−A*0201+)から得られた。新鮮なPBMC(2.5×106個)を、5ng/mlのPRAME425-433又はペプチドアナログとともにT細胞培養培地中で平板培養した。続いて、72及び96時間後に、20IU/mlのインターロイキン2を各ウェルへ添加して、さらなる添加ペプチド(5ng/ml)を7日目に添加した。培養物をさらに10日間インキュベートした後、エフェクター細胞を収集して、四量体染色に使用した。IVS PBMCをPRAME425-433四量体で標識化して、FACSCalibur(BD,San Jose,
CA)上で分析した。四分円を、無関係のHBV四量体及びSSX2四量体で染色した陰性対照に基づいて設定して、最低10,000ゲートのイベントを捕捉した。四量体陽性細胞は、リンパ球集合のパーセントとして表される。PRAME425-433特異的四量体は、天然ペプチドと比較した場合にペプチドアナログによるIVS後に有意に増強された。図35を参照のこと。これは、アナログが好適な免疫原になり得ることを実証している。
[実施例49]
pCTLR2は、PRAMEアミノ酸残基425〜433由来のHLA A2特異的CTLエピトープであるSLLQHLIGL、及びPRAMEのエピトープクラスター領域であるアミノ酸422〜509を有する1つのポリペプチドをコードする組換えDNAプラスミドワクチンである。プラスミド中の上記ポリペプチドに関するcDNA配列は、抗原提示細胞による取り込み時にポリペプチドに関するメッセンジャーの効率的な転写を可能にするサイトメガロウイルス(CMVp)由来のプロモーター/エンハンサー配列の制御下にある。コード配列の3’末端にあるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(BGHポリA)は、メッセンジャーのポリアデニル化に関するシグナルを提供して、その安定性並びに核から細胞質への移行を増大させる。核へのプラスミド運搬を促進するために、サルウイルス40由来の核移行配列(NIS)をプラスミド骨格へ挿入させている。免疫応答をさらに追加免疫するために、CpG免疫賦活モチーフの1つのコピーをプラスミドへ操作している。最後に、プラスミド中の2つの原核生物の遺伝的要素は、E.coliにおける増幅、カナマイシン耐性遺伝子(Kan R)及びpMB細菌複製起点に関与する(図36を参照)。
コードされるポリペプチドのアミノ酸配列(150アミノ酸残基長)を以下に付与する。
長い相補的オリゴヌクレオチドの組の段階的な連結は、「スティングオブビーズ」エピトープ遊離配列(アミノ酸90〜150)のアミノ酸残基をコードするcDNAの生成をもたらした。これらのcDNAは、PRAMEエピトープクラスター領域(アミノ酸1〜89)をコードするcDNAとのさらなる連結に使用することができる制限酵素のための適切な付着末端を保有し、これらは鋳型としてPRAMEをコードするcDNAに関してPCRを実施することにより増幅された。続いて、挿入片全体が、Afl IIとEcoR I部位との間でベクター骨格へ連結された。コード配列全体は、DNAシーケンシングにより確認された。
[実施例50]
H−2クラスI陰性のHLA−A2.1トランスジェニックHHDマウスを、病原体を含まない条件下で飼育して、HLA−A2.1制限ヒト腫瘍関連細胞毒性Tリンパ球(CTL)エピトープの免疫原性の評価に使用した。8〜12週齢の雌マウスを、in vivoでの細胞毒性研究のためのリンパ管内の免疫化及び脾細胞の単離に使用した。マウスを両側からの鼠径リンパ節注入により免疫化した。マウスは、イソフルオランの吸入により麻酔して、無菌条件下で手術を行った。手術の準備後に、鼠径ひだにおいて長さが0.5cmの切開を行い、鼠径リンパ節を露出させた。最大用量のプラスミドDNAワクチン又はペプチド25μl(25μg)を、0.5mLインスリンシリンジを使用してリンパ節へ直接注入した。滅菌6−0ナイロン皮膚縫合糸で創傷を閉じた。
[実施例51]
HHDトランスジェニックマウス(n=4/群)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に、PBS25μl中25μg/各リンパ節でmelan−A26-35A27エピトープアナログを発現するプラスミドpSEM(米国特許出願第10/292,413号(公開番号第20030228634号A1)(その全体が参照により援用される)でより完全に記載されている)で免疫化した。これに続いて、アナログA27L、27Nva又はA27L V35Nvaを用いて、28日目及び31日目に2回のさらなるペプチド追加免疫(同量)を行った。追加免疫の1週後に、脾細胞をex vivoで天然mela
n−A26-35ペプチドで刺激して、51Cr標識化したヒト腫瘍細胞(624.38細胞)に対して様々なE:T比で試験した。A27L又はA27Nvaアナログで追加免疫した後に得られる免疫性は、天然ペプチドEAAGIGILTVに匹敵し、且つより有効であった(図37)。プライミング用プラスミドは、A27Lアナログを発現するため、実験は上記ペプチドを支持する潜在的な傾向を有しており、その結果、A27Nvaアナログで得られる相当な細胞毒性は、プライミングが上記の同配列を利用した場合その効力より低く見積もられ得る。
[実施例52]
CD8+抗原特異的T細胞の測定には、クラスIのMHC/ペプチド複合体によるT細胞受容体(TCR)の同族認識を要する。これは、それぞれが特異的ペプチドに結合される4つのHLA MHCクラスI分子の複合体から構成され、且つ蛍光タンパク質と結合されたクラスIのMHC四量体を使用して実施することができる。したがって、四量体アッセイは、特定のMHC分子において複合体形成される所与のタンパク質に特異的な全T細胞集合の定量化を可能にする。さらに、結合は機能的経路に依存しないため、この集合は、機能的状態に関わらず、特異的CD8+T細胞すべてを包含する。免疫化動物におけるCTL応答は、HLA−A*0201 MART1(ELAGIGILTV)−PE MHC四量体(Beckman Coulter、T01008)又はチロシナーゼ369-377(YMDGTMSQV)特異的四量体試薬(HLA−A*0201チロシナーゼPE、Beckman Coulter)及びFITC結合ラット抗マウスCD8a(Ly−2)モノクローナル抗体(BD Biosciences)を用いて、密度遠心分離(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)後に減少血から単離した単核細胞を共染色することにより測定した。データは、BD FACS Caliburフローサイトメータを使用して収集し、cellquestソフトウェアを使用して、リンパ球集合をゲーティングすること及びCD8+CTL集合内の四量体+細胞の割合を算出することにより分析した。
[実施例53]
HHDトランスジェニックマウスの2つの群(n=8)を、0日目、3日目、14日目及び17日目にPBS25μl中チロシナーゼ369−377を発現するプラスミド25μg/各リンパ節を鼠径リンパ節へ直接接種することにより免疫化した。これに続いて、28日目及び31日目に、天然ペプチド又は377Nvaアナログによる2回のさらなるペプチド追加免疫(類似した量)を行った。10日後、チロシナーゼ369−377特異的四量体試薬(HLA−A*0201チロシナーゼ−PE、Beckman Coulter)を使用して、免疫応答をモニタリングした。個々のマウスを、眼窩洞後静脈を介して出血させて、2,000rpmで25分間、密度遠心分離(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)を使用してPBMCを単離した。PBMCは、CD8に対するマウス特異的抗体(BD Biosciences)及びチロシナーゼ四量体試薬で共染色して、特異的パーセントは、FACS caliberフローサイトメータ(BD)を使用して、フローサイトメトリーにより確定された。チロシナーゼ特異的CD8+細胞のパーセントは、アナログによる天然ペプチドの置換が、チロシナーゼ特異的サブセットの拡張を保存したことを示す。アナログがチロシナーゼ特異的T細胞の拡張を改善させることができることが傾向により示される(図38)。
[実施例54]
HHDトランスジェニックマウスの4つの群(n=6)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に、リンパ節1つ当たりPBS25μl中のチロシナーゼ369-377及びMelan−A26-35A27Lエピトープを発現するプラスミド(pSEM)25μgを鼠径
リンパ節へ直接接種することにより免疫化した。これに続いて、28日目及び31日目に、左鼠径リンパ節へのMelan−A26-35A27L並びに右鼠径リンパ節への第1及び/又は第2のアンカー残基での置換を保有するチロシナーゼ369-377アナログの2回のさらなるペプチド追加免疫(類似した量)を行った。対照として、プラスミドのみで免疫化したマウス又は未処置マウスを使用した。
Coulter)により評価した。
[実施例55]
HHDトランスジェニックマウス(n=4/群)を、0日目、3日目、14日目及び17日目に、リンパ節1つ当たりPBS25μl中のチロシナーゼ369-377エピトープを発現するプラスミド(pSEM)25μgを鼠径リンパ節へ直接接種することにより免疫化した(図40における一般的なプロトコルに従って)。これに続いて、天然ペプチド又は第1のアンカー残基P2及びPΩ(370及び377)での置換を保有するアナログを用いて、28日目及び31日目に2回のペプチド追加免疫(同量)を行った。追加免疫の1週後に、脾細胞をex vivoで天然チロシナーゼ369-377ペプチドで刺激して、51Cr標識化したヒト腫瘍細胞(624.38細胞)に対して様々なE:T比でアッセイした。天然ペプチド及びM370V V377Nvaアナログは、624.38細胞に対して強健な細胞毒性を発生させた(図41)。天然ペプチドでは細胞溶解性活性の幾らかの希釈が見られたのに対して、アナログでは全く見られず、実施例52における四量体の結果から得られるより大きな免疫原性の徴候を強化した。先行例と合わせると、この観察は、よりストリジェントなアッセイ(in vivoでの細胞毒性及び四量体染色)をより高感度アッセイ(in vitroでの刺激後のex vivoでの細胞毒性)を補完することの有用性を示しており、潜在的に有用なアナログを概要する。
Claims (90)
- P0が、X、XX又はXXXで、Xが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示し、
P1が、K、F、Y、W、Phg、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、MeTyr、β−(3−ベンゾチエニル)−Ala又はD−Lysであり、
P2が、A、L、V、I、M、D−Ala、Nal−2、Abu、Aib、Nle又はNvaであり、
P3がSであり、
P4が、E、Q、Nle又はNvaであり、
P5がKであり、
P6が、I、L、V、Nle又はNvaであり、
P7がFであり、
P8が、Y、F、Phe(4−F)であり、
P9のPΩが、V、I、A、Nva、MeVal、Abu又はV−NH2であるか、又はP9はVであり、
P10のPΩが、I、L、V、Nle又はNvaであり、
PΩ+1が、X、XX又はXXXで、Xが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示すような配列から実質的に構成される単離ペプチドで、実質的にKASEKIFYVではない単離ペプチド。 - 下記配列:
K{L、V、M、I、D−Ala、D−Val、Nal−2、Aib、Abu、Nle又はNva}SEKIFYV、又は
{F、Phg、Y、Phe(4−F)、Phe(4−NO2)、O−メチル−Try又はβ−(3−ベンゾチエニル−Ala}ASEKIFYV、又は
{Y、F又はW}{V、M又はI}SEKIFYV、又は
{F又はW}LSEKIFYV、又は
K{A、V又はL}SEKIFYI、又は
K{L又はV}SEKIFYV−NH2、又は
FVSEKIFY{I、A、Nva、Abu又はMeVal}、又は
FVS{Q、Nle、Nva}KIFYV、又は
FVSEK{L、V、Nle又はNva}FYV、又は
FVSEKIF{F、Phe(4−F)}V、又は
KASEKIFYV{I、L}、又は
KVSEKIFYV{I、L、V又はNle}、又は
KLSEKIFYV{L、V、Nle又はNva}
から実質的に構成される、請求項1に記載の単離ペプチド。 - 下記配列:
K{L、V、M、Abu、Nle又はNva}SEKIFYV、又は
{F又はPhg}ASEKIFYV、又は
YVSEKIFYV、又は
F{L、V又はI}SEKIFYV、又は
W{L又はI}SEKIFYV、又は
K{V又はL}SEKIFYI、又は
FVSEKIFY{I又はNVa}
から実質的に構成される、請求項2に記載の単離ペプチド。 - 下記配列:
K{V又はL}SEKIFYV、又は
{F又はY}ASEKIFYV、又は
FVSEKIFYI、又は
KVSEKIFYV
から実質的に構成される、請求項3に記載の単離ペプチド。 - 配列KVSEKIFYVから実質的に構成される、請求項3に記載の単離ペプチド。
- クラスIMHCペプチドの結合溝に対して親和性を有する、請求項1に記載の単離ペプチド。
- 前記クラスIMHCがHLA−A2である、請求項6に記載の単離ペプチド。
- 前記ペプチドが請求項1に記載のペプチドの配列を有する、クラスIMHC/ペプチド複合体。
- クラスIMHC/SSX−241-49複合体を認識するTCRと交差反応性である、請求項8に記載のクラスIMHC/ペプチド複合体。
- 前記クラスIMHC/複合体は、HLA−A2/SSX−241-49複合体である、請求項9に記載のクラスIMHC/ペプチド複合体。
- 遊離配列と結合した請求項1に記載のペプチド配列を含むポリペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドを含む免疫原性組成物。
- 請求項11に記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
- 請求項11に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項1に記載のペプチドを発現するための核酸手段。
- 請求項14又は15に記載の核酸を含む免疫原性組成物。
- 請求項12に記載の組成物の節内投与を含む、CTL応答を誘導、維持又は増幅させる方法。
- 請求項12に記載の組成物と免疫増強剤の節内投与を含む、クラスIMHCに制限されるT細胞応答を同調させる方法。
- 請求項16に記載の組成物の節内投与を含む、CTL応答を誘導、維持又は同調させる方法。
- クラスIMHCの結合溝に対する親和性を持つKASEKIFYV配列において1〜3個の置換を含む単離ペプチドで、該クラスIMHCの結合溝に対してKASEKIFYV配列と同様又はより強い親和性を有するペプチド。
- 解離の半減期が、前記クラスIMHCの結合溝からのKASEKIFYV配列の解離の半減期と同様又はより長い、請求項20に記載の単離ペプチド。
- 前記ペプチドKASEKIFYVに対する特異性によりT細胞により認識される、請求
項20に記載の単離ペプチド。 - P0が、X、XX又はXXXで、Xが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示し、
P1が、S、F、K、W又はYであり、
P2が、L、I、V、Nle又はNvaであり、
P3がLであり、
P4が、M、L又はNであり、
P5がWであり、
P6が、I、A、L、V又はNであり、
P7がTであり、
P8が、Q、E、D又はTであり、
P9のPΩが、C、V、I、L、A、Nva、Nle、V−NH2又はL−NH2であり、
PΩ+1が、X、XX又はXXXで、Xが任意のアミノ酸又は非アミノ酸を示すような配列から実質的に構成される単離ペプチドで、配列SLLMWITQ{C、V、I、L、A}、FVLMWITQA、FILMWITQ{L、I}、YVLMWITL又はYLLMWIT{I、L}ではない単離ペプチド。 - 配列SILMWITQ{C、V、L、A}、YLLMWITQ{NVa、Nle}、F{L、V}LMWITQ{V、L、I}、Y{I、Nva、Nle}LMWITQV、YLLLWITQV又はTVLMWITQVから実質的に構成される、請求項23に記載の単離ペプチド。
- 配列{S、F}VLMWITQV、SLMWITQNva又はSNvaLMWITQVから実質的に構成される、請求項23に記載の単離ペプチド。
- 配列SNvaLMWITQVから実質的に構成される、請求項25に記載の単離ペプチド。
- 前記ペプチドがクラスIMHCペプチドの結合溝に対して親和性を有する、請求項23に記載の単離ペプチド。
- 前記MHCがHLA−A2である、請求項27に記載の単離ペプチド。
- 前記ペプチドが請求項23に記載の配列を有する、クラスIMHC/ペプチド複合体。
- クラスIMHC/NY−ESO−1157-165複合体を認識するTCRと交差反応性である、請求項29に記載のクラスIMHC/ペプチド複合体。
- 前記クラスIMHC/複合体は、HLA−A2/NY−ESO−1157-165複合体である、請求項30に記載のクラスIMHC/ペプチド複合体。
- 遊離配列と結合した請求項23に記載のペプチド配列を含むポリペプチド。
- 請求項23に記載のペプチドを含む免疫原性組成物。
- 請求項32に記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
- 請求項32に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項23に記載のペプチドを発現するための核酸手段。
- 請求項35又は36に記載の核酸を含む免疫原性組成物。
- 請求項33に記載の組成物の節内投与を含む、CTL応答を誘導、維持又は増幅させる方法。
- 請求項37に記載の組成物の節内投与を含む、CTL応答を誘導、維持又は増幅させる方法。
- 請求項37に記載の組成物の節内投与を含む、クラスIMHCに制限されるT細胞応答を同調させる方法。
- 請求項33に記載の組成物と免疫増強剤との節内投与を含む、クラスIMHCに制限されるT細胞応答を同調させる方法。
- 配列{S、Y}LLMWITQ{C、V}{L、I、Nle}を有する単離十量体ペプチド。
- クラスIMHCの結合溝に対する親和性を持つSLLMWITQC配列において1〜3個の置換を含む単離ペプチドで、該クラスIMHCの結合溝に対して、SLLMWITQCと同様又はより強い親和性を有するペプチド。
- 解離の半減期が、前記クラスIMHCの結合溝からのSLLMWITQCの解離の半減期と同様又はより長い、請求項43に記載の単離ペプチド。
- 前記ペプチドSLLMWITQCに対する特異性によりT細胞により認識される、請求項43に記載の単離ペプチド。
- MHCタンパク質のペプチド結合溝に対して親和性が知られているか、又は予測される標的関連抗原セグメントの配列と、少なくとも1つのアミノ酸の差異を含むアミノ酸配列を有するペプチドであって、少なくとも1つの差異が、前記セグメントのMHC結合モチーフアンカー部位にある残基をNle又はNva残基に置換したものであるようなアミノ酸配列を有するペプチド。
- 前記アンカー部位が第1のアンカー位置である、請求項46に記載のペプチド。
- 前記アンカー部位がP2である、請求項47に記載のペプチド。
- 前記アンカー部位がPΩである、請求項47に記載のペプチド。
- 前記アンカー部位が補助的なアンカー部位である、請求項46に記載のペプチド。
- 前記差異が、前記セグメントにおける疎水性残基のNle又はNva残基への置換を含む、請求項46に記載のペプチド。
- I、L又はVが、前記MHC結合モチーフアンカー部位において好ましい残基である、請求項46に記載のペプチド。
- 約8〜14アミノ酸長を有する、請求項46に記載のペプチド。
- 9〜10アミノ酸長を有する、請求項53に記載のペプチド。
- 前記MHCタンパク質がヒトMHCタンパク質である、請求項46に記載のペプチド。
- 前記MHCタンパク質がクラスIMHCタンパク質である、請求項46に記載のペプチド。
- 前記MHCタンパク質がHLA−A2、A3、A24、A30、A66、A68、A69、B7、B8、B15、B27、B35、B37、B38、B39、B40、B48、B51、B52、B53、B60、B61、B62、B63、B67、B70、B71、B75、B77、C4、Cw1、Cw3、Cw4、Cw6、Cw7及びCw10から成る群から選択されるタイプである、請求項56に記載のペプチド。
- 前記MHCタンパク質がHLA−A2及びA24から成る群から選択される、請求項57に記載のペプチド。
- 前記MHCがアンカー残基結合ポケットを有し、該ポケットは、HLA−A*0201のB−又はF−ポケットに相同的である、請求項46に記載のペプチド。
- 前記MHCに対する前記セグメントの結合特性に相当する特性と実質的に同じであるか、又はそれよりも良好である少なくとも1つの結合特性を有する、請求項46に記載のペプチド。
- 前記結合特性が前記セグメントの結合特性と比較して高い、請求項60に記載のペプチド。
- 前記結合特性が親和性である、請求項60に記載のペプチド。
- 前記結合特性が結合の安定性である、請求項60に記載のペプチド。
- 前記セグメントの免疫原性と実質的に同じであるか、又はそれよりも強い免疫原性を有する、請求項46に記載のペプチド。
- 前記免疫原性が増大された、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫原性が前記セグメントと交差反応性である免疫応答を誘起する、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫原性がCTL応答を誘起する、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫原性がMHC四量体アッセイを使用して評価される、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫原性がサイトカインアッセイを使用して評価される、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫原性が細胞毒性アッセイを使用して評価される、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫原性が前記ペプチドを認識する免疫応答を測定することにより評価される、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫原性が前記セグメントを認識する免疫応答を測定することにより評価される、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫原性がin vitroにおける免疫系を使用して評価される、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫系がヒト細胞を含む、請求項73に記載のペプチド。
- 前記免疫原性がin vivo免疫系を使用して評価される、請求項64に記載のペプチド。
- 前記免疫系がトランスジェニックマウスを含む、請求項75に記載のペプチド。
- 前記セグメントと免疫学的に交差反応性である、請求項46に記載のペプチド。
- 前記交差反応性が前記セグメントで免疫化し、前記ペプチドの認識をアッセイすることにより評価される、請求項77に記載のペプチド。
- 前記交差反応性が前記ペプチドを免疫化し、前記セグメントの認識をアッセイすることにより評価される、請求項77に記載のペプチド。
- 2つのアミノ酸の差異を含む、請求項46に記載のペプチド。
- 各アミノ酸の差異は独立してNle又はNva残基を含む、請求項80に記載のペプチド。
- 1つのアミノ酸の差異はNle又はNva残基を含まない、請求項80に記載のペプチド。
- 3つ又はそれ以上のアミノ酸の差異を含む、請求項46に記載のペプチド。
- 前記標的関連抗原が腫瘍関連抗原である、請求項46に記載のペプチド。
- 前記標的関連抗原は、病原体関連抗原である、請求項46に記載のペプチド。
- 請求項46に記載のペプチドを含む免疫原性組成物。
- 請求項67に記載の組成物を哺乳類へ投与することを含む免疫化方法。
- リンパ系へ直接投与することを含む、請求項43に記載の免疫化方法。
- T細胞エピトープアナログを作製する方法であって、
MHCタンパク質のペプチド結合溝に対して親和性を有することが知られているか、又は予測される標的関連抗原のセグメントのアミノ酸配列を提供すること、
MHC結合モチーフのアンカー部位に相当する配列の少なくとも1つのアミノ酸を、Nle又はNvaに置換すること、及び
前記置換された配列を含むペプチドを合成すること
を含む方法。 - MHC結合モチーフのアンカー部位に相当する少なくとも1つの本来の残基のNle又はNva残基による置換により、本来の天然エピトープペプチドと異なる、T細胞エピトープペプチドアナログ。
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