JP2008506092A - ペプチド安定化 - Google Patents

Abstract

本発明は、血清試料または血漿試料のような哺乳動物生物学的試料において、温度感受性ペプチド、すなわちガストリンおよびガストリン関連ペプチドを分解に対して安定化するためのＤＭＳＯの使用を対象とする。

Description

本発明は、一般的に、哺乳動物由来の血漿試料または血清試料のような生物学的試料中における、温度感受性被分析物、特に、ホルモンおよび酵素を含むタンパク質およびペプチドを分解に対して安定化する分野に関係する。

生物学的試料中、特に血清試料および血漿試料中の被分析物の分析に関連して経験する１つの問題は、いくつかのタンパク質およびペプチドの不安定性に関する。小さいペプチドは、特に、酵素による分解に感受性である。不安定性のために、試料を直ちに試験すること、または冷蔵室のような低温環境下で貯蔵することが必要となる。しかしながら、低温貯蔵下でさえ、安定性は不十分であることが多い。そのような試料を何日間も貯蔵すべきときは、それらをドライアイス中に包装するべきである。これは、当然ながら非常に不便である。

ガストリン−１７は、刺激下で胃洞のＧ細胞により分泌されるペプチドホルモンである。その刺激は、タンパク質の豊富な食事後のタンパク質の分解の結果である。また、胃の伸縮により、ガストリン、特にガストリン−１７の分泌がもたらされる。

ガストリンペプチドは、１個のプロガストリン分子から形成される。ほとんどのペプチドホルモンは、プロホルモンがタンパク質分解的切断および酵素修飾を受けることにより合成される。ガストリンプロセシングは、３個の範疇：プロガストリン、グリシン伸張型誘導体およびカルボキシ−アミド化ガストリンに分けられる。いくつかの異なるガストリンの生物学的活性型をヒト胃から単離することができ、それらのうち最も重要なものは、ガストリン−３４およびガストリン−１７である。さらに、最大の生物学的活性のガストリンであるガストリン−７１、ならびにガストリン−５２およびガストリン−１４が血漿から単離されている。ガストリン−１７は、最も強い塩酸刺激物である。ガストリン−１７は、非スルホン化型（ガストリンＩ）およびチロシンがスルホン化されたスルホン化型（ガストリンＩＩ）の２つの形態で存在する。これらの形態は両方とも、等しく有効である。ガストリン−１７の活性型は、ペプチドの末端アミノ酸であるフェニルアラニンが余分なアミド基を含む、アミド化ガストリン−１７である。非活性型は、いわゆるグリシン伸張型ガストリン−１７である。

様々な方法およびキットが、個体における胃粘膜の状態の決定において使用するために公知である。そのような測定に基づき、とりわけ、個体の胃癌発症の危険性を決定することが可能である。そのような方法の例が、例えば、下記の特許および特許出願：本出願人のＥＰ８０４７３７、ＥＰ９９０９９２、ＥＰ０２７１６１００およびＰＣＴ／ＦＩ０３／０００６５３に記載されている。

これらの方法において、通常、少なくとも下記の被分析物またはマーカー：ペプシノゲンＩ、ガストリン−１７およびヘリコバクター・ピロリ感染のマーカー、ならびにさらに、しばしばペプシノゲンＩＩが、個体由来の血清試料または血漿試料のような試料から決定される。

該決定および試料の取扱いに関連して、ガストリン−１７の不安定性は、それが試料中で急速に分解するという事実のために問題であることが立証されている。冷蔵条件下で３時間後には、血清試料中でのガストリン−１７濃度は明らかに減少し始め、そして１日後には、完全に分解された。このことは、何日間も室温でそれらの活性を保持するペプシノゲンＩおよびＩＩ、ならびに冷蔵条件下で少なくとも３日間生存するヘリコバクター・ピロリ抗体とは対照的である。

ガストリン−１７は、これまで、血清試料の凝固を氷浴上で行う、いわゆる冷試料として採取されている。数日間にもわたる試料の輸送または発送は、冷凍形態で行われている。

ガストリン型ペプチドだけでなく、ホルモンおよび酵素を含む多くの他のタンパク質およびペプチドでも同様に遭遇する不十分な安定性による問題のために、これらの感受性被分析物を安定化する方法の発見が試みられている。利用可能な実験方法のための十分な安定性に対する最小限の必要性は、室温または周囲温度の両方で、ならびに冷蔵温度で、すなわち約＋４℃から２５℃の範囲の温度で、少なくとも３日間の安定性である。

本発明に従い、現在、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が哺乳動物生物学的試料、特に血清試料または血漿試料においてタンパク質およびペプチド、特にガストリンおよびガストリン関連ペプチドの安定化に非常に有効であり、該タンパク質およびペプチドに対して周囲温度および冷蔵温度の両方で少なくとも３日間持続する安定化効果を提供することが発見された。

従って、本発明は、一方では、血清試料または血漿試料のような哺乳動物生物学的試料において分解または不活性化に対して、ガストリンおよびガストリン関連ペプチドを安定化するためのＤＭＳＯの使用に関する。他方では、本発明はまた、安定化量のＤＭＳＯを安定化されるべきペプチドを含む試料に添加する、血清試料または血漿試料のような哺乳動物生物学的試料において分解または不活性化に対して、そのようなペプチドを安定化するための方法に関する。

発明の詳しい説明
本発明により使用される安定化剤は、様々な産業、医薬および実験用途のために有名な有機溶媒、ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯである。ＤＭＳＯの分子量は７８．１であり、それは水と混合可能であり、１８．５℃の融点および１８９℃の沸点を有する。それは、製紙産業の副産物であり、木の結合物質であるリグニンから誘導される。

細胞培養法において、ＤＭＳＯは、細胞を冷凍するとき、１０％溶液として日常的に用いられる。この適用において、ＤＭＳＯは、細胞がその細胞内での氷形成に非常に感受性であるため、浸透性ダメージを低減する保護剤として作用する。ＤＭＳＯは、細胞膜に急速に浸透し、その中の水を置換する。その結果、ＤＭＳＯはまた、皮膚にも急速に浸透し、そして低分子量成分などの、その中に溶解する成分を皮膚を通して容易に輸送し得る。このため、ＤＭＳＯは、薬剤分子の吸収および輸送を促進するアジュバントとして用いられる。ＤＭＳＯはまた、疼痛および腫脹の軽減、筋弛緩、抗炎症特性および静菌特性などを含む、多種多様な医薬用途を有することが報告されている。

本発明によれば、ＤＭＳＯは、冷蔵条件下で維持したときでさえ、生物学的試料中で、３日以内のような数日以内の期間で急速に分解されやすい、温度感受性ペプチド、すなわちガストリンおよびガストリン関連ペプチドの安定化のための使用が企図される。

ガストリン、ならびにコレシストキニンおよびセクレチンのようなガストリン関連ペプチドの安定化のため、特にガストリン−１７の安定化のために、本発明は特に有用である。本発明は、血清試料、血漿試料のような生物学的試料から、ガストリン−１７が、被分析物ペプシノゲンＩおよび所望によりペプシノゲンＩＩ、ならびにヘリコバクター・ピロリ・マーカーと共に測定される、方法での、例えば胃粘膜の状態をスクリーニングするための試験での使用に、特に適用可能である。

実験の過程において、かかる試料に添加されたＤＭＳＯが、分析するべき他のマーカーに悪影響を有することなく、ガストリンの安定化効果を発揮することが証明されている。

安定化効果を得るために用いられるＤＭＳＯの量は変化し得るが、典型的には、試験される試料から計算して１〜１０％（容量／容量）、特に約４〜６％（容量／容量）の程度である。

本発明の文脈中、哺乳動物生物学的試料における被分析物ペプチドに関連する“温度感受性”とは、該ペプチドが、特に、室温または周囲温度で急速に分解されやすいことを意味する。故に、本発明に従い安定化されるべき温度感受性被分析物は、室温または周囲温度で、典型的には約＋１８℃から２５℃の範囲の温度で、３日（７２時間）未満の貯蔵時間を有するものである。

本発明に従い、一定量のＤＳＭＯを安定化されるべき哺乳動物生物学的試料に添加し、上記の温度範囲で、前記被分析物ペプチドに少なくとも３日（少なくとも７２時間）の安定性を提供する。

血漿試料および血清試料中のガストリン−１７の安定性に関する調査の過程で行った実験は、ガストリン−１７が、室温でさえ少なくとも３日間、５％（容量／容量）ＤＭＳＯ／血清溶液または血漿溶液中で貯蔵されたことを示した。このことは、下記の表で示した試験結果から明らかである。

表１は、３個のＥＤＴＡ−血漿試料を、該試料に５％（容量／容量）ＤＭＳＯを添加してから３日間までのガストリン−１７の安定性について試験した試験結果を記載する。対照例は、ＤＭＳＯを添加していない。結果は、ＤＭＳＯを含まない試料と比較して、ＤＭＳＯを含む試料において、３日後のガストリン−１７の安定性が改善されたことを示す。

表２は、室温で、５個のＥＤＴＡ−血漿試料にＤＭＳＯを添加した安定化効果を示す。ＤＭＳＯの添加の効果を、ペプシノゲンＩ、ペプシノゲンＩＩ、ヘリコバクター・ピロリ抗体およびガストリン−１７で試験した。０日目および３日目での結果を示す。結果は、ＤＭＳＯの添加無しの試料から得られる結果と比較して、ペプシノゲンＩおよびＩＩ、ならびにヘリコバクター・ピロリ抗体の活性に対して実質的に影響はないが、ガストリン−１７の安定性に改善が観察されることを示す。

表３は、表２の試験に対応する試験であるが、試験される１０個の試料が、血漿試料ではなく血清試料である。結果は、５％（容量／容量）のＤＭＳＯを添加した試料における、ガストリン−１７の全体的に保持された活性を示す。結果はまた、ＤＭＳＯが、ペプシノゲンおよびヘリコバクター・ピロリ抗体の活性に悪影響を与えないことを示す。

表４は、被分析物が、Ｕ−ＩＮＴＰ（コラーゲンＩアミノ末端テロペプチド）であった、試料の安定性試験の結果を示す。表は、直後の結果（“immed.”）および安定化剤有りまたは無しで、室温で３日後の結果を示し、またパーセンテージでも示す。２つの並行試験を、各試料について行った。

Claims (7)

1. 哺乳動物生物学的試料において、ガストリンおよびガストリン関連ペプチドを分解に対して安定化するためのＤＭＳＯの使用。
2. 前記試料が血清試料または血漿試料である、請求項１に記載の使用。
3. ガストリン−１７の安定化のための、請求項１または２に記載の使用。
4. 安定化量のＤＭＳＯを該試料に添加する、哺乳動物生物学的試料においてガストリンおよびガストリン関連ペプチドを分解に対して安定化するための方法。
5. 前記試料が、血清試料または血漿試料である、請求項４に記載の方法。
6. ガストリン−１７の安定化のための、請求項４または５に記載の方法。
7. ガストリン−１７が、ペプシノゲンＩ、ペプシノゲンＩＩおよびヘリコバクター・ピロリ抗体からなる群から選択される１個またはそれ以上の被分析物を含む血清試料または血漿試料中で決定される、請求項６に記載の方法。