JP2008505913A - 新規化合物およびこれらの標的に関する組成物ならびに方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規化学化合物、それらの発見法、およびそれらの治療的用途に関する。特に本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体および関連化合物、ならびにプログラムされた細胞死、自己免疫、炎症および過増殖などの過程の誤調節に関連した多くの状態を処置するために、ベンゾジアゼピン誘導体および関連化合物を治療的物質として使用する方法を提供する。
多細胞生物は、細胞数の精密な制御を行っている。細胞増殖と細胞死の間の平衡は、このホメオスタシスを実現している。細胞死は、ネクローシスを介して、またはアポトーシスとして知られている細胞自死型を通して、ほぼ全ての種類の脊椎動物細胞において生じる。アポトーシスは、共通の遺伝的にプログラムされた死の機構に携わる、様々な細胞外および細胞内シグナルにより引き金を引かれる。
本発明は、多くの疾患および状態を処置する際の使用を見出し、ならびに研究、化合物スクリーニング、および診断の適用における使用を見出す新規化合物を提供する。また、本発明は、特定の生物反応を誘発する、これらの新規化合物の使用、ならびに公知の化合物の使用(例えば、特定の標的分子と結合し、および/または特定の細胞事象を生じさせる化合物)を提供する。このような化合物および使用を本出願の全体にわたって記述してあり、組成物および適用の多様なコレクションを表す。
式中、R1は、ナフタルアラニン;フェノール;1-ナフタレノール;2-ナフタレノール;
およびキノリン;から選択され、式中、R2は、
からなる群より選択され;ならびに、R1およびR2は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。
式中、R1は、H、アルキル、または置換されたアルキルから選択され;式中、R2は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、<10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、複素環から選択され;式中、R3は、H、アルキルまたは置換されたアルキルから選択され、かつ式中、多くても1つの置換基が、ヒドロキシル亜族であり;式中、R4は、
から選択され、式中、n=0〜5であり;ならびに、式中、R1、R2、R3、およびR4は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。
式中、R1は、H、アルキル、または置換されたアルキルから選択され;式中、R2は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、<10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、複素環から選択され;式中、R3はH、アルキル、または置換されたアルキルから選択され、かつ多くても1つの置換基が、ヒドロキシル亜族であり;式中、R4は、
から選択され、式中、n=0〜5であり;ならびに、式中、R1、R2、R3、およびR4は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。
式中、Rは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル-、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、<10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、および複素環から選択され;かつこのような組成物は、対象に投与される。
式中、Rは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル-、置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、同様のサイズの置換された脂肪族基、<10炭素からなる脂環式基、置換された脂環式基、アリール、および複素環から選択され;かつ組成物は、対象に投与される。
式中、R1は、ベンゼンよりも大きな疎水性芳香族基を含み;式中、R2は、フェノール性ヒドロキシル基を含み;ならびに、R1およびR2は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。さらなる態様において、細胞は、組成物が該細胞におけるスーパーオキシド・レベルを増大するか、または細胞ATPレベルを変化させるために、オリゴマイシン感受性付与タンパク質と結合するような条件下で組成物に曝露される。
式中、R1は、ナフタルアラニン;フェノール;1-ナフタレノール;2-ナフタレノール;
およびキノリンからなる群より選択され;式中、R2は、
からなる群より選択され:ならびに、式中、R1およびR2は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含む。
式中、R1は、ベンゼンよりも大きな疎水性芳香族基を含み;式中、R2は、フェノール性ヒドロキシル基を含み;式中、R1およびR2は、RまたはS鏡像異性形態およびラセミ混合物を含み;ならびに細胞は、組成物が細胞におけるスーパーオキシド・レベルを増大するか、または細胞のATPレベルを変化させるためにミトコンドリアのATP合成酵素複合体と結合するような条件下で組成物に曝露される。好ましい態様において、組成物は、オリゴマイシン感受性付与タンパク質と結合する。
式中、R1は、ナフタルアラニン;フェノール;1-ナフタレノール;2-ナフタレノール;
およびキノリンから選択され;式中、R2は、
からなる群より選択される。
式中、R1、R2、R3およびR4は、以下からなる群より選択される:水素;CH3;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R5は、OH;NO2;NR';OR'からなる群より選択され;式中、R'は、以下からなる群より選択され:直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R6は、以下からなる群より選択され:水素;NO2;Cl;F;Br;I;SR';およびNR'2、式中、R'は、上記R5のように定義され;式中、R7は、以下からなる群より選択され:水素;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖;ならびに、R8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり;式中、該ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含み、かつアリールまたは脂肪族環状基である。いくつかの態様において、R'は、化合物がその生物学的標的(例えば、ミトコンドリア)に到達するまで、R5の酸素をインビボでの代謝から保護する任意の官能基である。いくつかの態様において、R'保護基は、標的部位にて代謝されてR5をヒドロキシル基に変換する。
;式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され;水素;CH3;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖;式中、脂肪族鎖は、カルボン酸亜族で終結する;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R5は、OH;NO2;OR';からなる群より選択され、式中R'は、以下からなる群より選択され:直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖;式中、脂肪族鎖は、カルボン酸亜族で終結する;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R6は、以下からなる群より選択され:水素;NO2;Cl;F;Br;I;SR';およびNR'2;式中、R'は上記R5のように定義される;式中、R7は、水素;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され;ならびにR8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり;式中、ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含む。
;式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され:水素;CH3;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖;式中、脂肪族鎖は、カルボン酸亜族で終結する;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R5は、OH;NO2;OR'からなる群より選択され;式中R'は、以下からなる群より選択される:直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖;式中、脂肪族鎖は、カルボン酸亜族で終結する;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R6は、以下からなる群より選択され:水素;NO2;Cl;F;Br;I;SR';およびNR'2;式中、R'は、上記R5のように定義され;式中、R7は、水素;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され;ならびにR8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり;式中、ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含む。
本発明の理解を促進するために、多くの用語および語句を以下に定義する。
薬物の種類として、ベンゾジアゼピン化合物は、多くの疾患の処置に有効な医用薬剤であることが広範に試験されかつ報告されている。例えば、米国特許第4,076,823号、第4,110,337号、第4,495,101号、第4,751,223号および第5,776,946号は、各々その全体が本明細書に参照として組入れられているが、これらは、ある種のベンゾジアゼピン化合物が鎮痛薬および抗炎症薬として有効であることを開示している。同様に米国特許第5,324,726号および米国特許第5,597,915号は、各々その全体が本明細書に参照として組入れられているが、これらはある種のベンゾジアゼピン化合物が、コレシストキニンおよびガストリンのアンタゴニストであり、その結果ある種の胃腸障害の処置に有用であることを開示している。
本発明は、新規化学物質、これらの発見のための方法、およびこれらの治療用途を提供する。特に、本発明は、ベンゾジアゼピン誘導体および関連化合物、ならびにプログラム細胞死、自己免疫、炎症、および過剰増殖などの過程の不完全な制御に関連する多数の状態を処置する治療薬としてベンゾジアゼピン誘導体および関連化合物を使用する方法を提供する。
好ましい態様において、本発明は、化合物に対する細胞の曝露を介してアポトーシスを調節する。化合物の効果は、かなり多くの細胞変化を検出することによって測定することができる。細胞死は、本明細書および当技術分野において記述したようにアッセイしてもよい。好ましい態様において、細胞株は、適切な細胞培養条件下(例えば、ガス(CO2)、温度、および培地)で、指数増殖を達成する適切な期間、密度依存的な制約なく維持される。細胞数およびまたは生存度は、トリパンブルー排除法/血球計数、またはMTT色素変換アッセイ法などの標準的技術を使用して測定される。または、細胞をアポトーシスもしくは壊死の異常と関連する遺伝子または遺伝子産物の発現について解析してもよい。
式中、R1は、脂肪族またはアリールであり;R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-HC(=O)-R5、または水素結合形成に関与する部分であり、式中R5は、アリール、複素環、-R6-NH-C(=O)-R7、または-R6-C(=O)-NH-R7であり、式中、R6は、1〜6炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールまたは複素環式であり;ならびに、それぞれのR3およびR4は、独立して、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換されたアミノ、アシルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8炭素および1〜20水素を有する脂肪族基、アリール、またはヘテロアリールである。一部の好ましい態様において、式中、R3はヒドロキシ基である場合、R3を含む環上の1つまたは複数のさらなる位置に、インビボでの代謝からヒドロキシル基を保護する化学基(例えば、アルキル鎖)を含む。
いくつかの態様において、本発明の化合物および方法は、細胞増殖の減少を生じさせる。その他の態様において、本発明の化合物および方法は、細胞増殖の減少およびアポトーシスを生じさせる。例えば、本発明の開発の間に行った細胞培養細胞障害性アッセイ法では、本発明の化合物および方法により、長期間(例えば、3日)の培養後に細胞増殖を防げることを示した。
本発明の開発の間に、発現プロフィールを作製して処置細胞と未処置細胞とにおいて差動的に発現される遺伝子を同定した。このプロフィールは、本発明の化合物によって誘導される細胞の遺伝子発現フィンガープリントを提供する。このフィンガープリントにより、本発明の化合物に対する応答の際にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる遺伝子を同定し、薬物スクリーニングのための、および化合物の治療有効性のモニタリングのための診断マーカーであるこのような遺伝子を同定する。また、遺伝子は、本発明の化合物の効果を模倣するための、制御のための標的を提供する。Bz-423の存在下においてアップレギュレートされる遺伝子に関する発現解析からのデータを図4Aに示す。Bz-423の存在下においてダウンレギュレートされる遺伝子に関する発現解析からのデータを図4Bに示す。Bz-OMeの存在下においてアップレギュレートされる遺伝子に関する発現解析からのデータを図4Cに示す。Bz-OMeの存在下においてダウンレギュレートされる遺伝子に関する発現解析からのデータを図4Dに示す。
本発明の例示的化合物を下記に提供する。
またはその鏡像異性体を有し(式中、R1は、脂肪族またはアリールであり;R2は、脂肪族、アリール、-NH2、-NHC(=O)-R5、、または水素結合形成に参加する残基であり;ここでR5は、アリール、複素環、および-R6-NH-C(=O)-R7または-R6-C(=O)-NH-R7であり、ここでR6は、1〜6個の炭素の脂肪族リンカーであり、かつR7は、脂肪族、アリールまたは複素環であり、R3およびR4の各々は、独立して、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、アミノ、低級アルキル置換されたアミノ、アセチルアミノ、ヒドロキシアミノ、1〜8個の炭素および1〜20個の水素を有する脂肪族基、アリールまたは複素環である。);または、それらの薬学的に許容される塩、プロドラッグもしくは誘導体である。
式中、R1は、ナフタルアラニン;フェノール;1-ナフタレノール;2-ナフタレノール;
およびキノリンから選択される。
以下の式を含む組成物:
以下の式を含む組成物:
式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され:水素;CH3;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R5は、OH;NO2;NR';OR'からなる群より選択され;式中、R'は、以下からなる群より選択され:直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R6は、水素;NO2;Cl;F;Br;I;SR';およびNR'2からなる群より選択され;式中、R'は、上記R5のように定義され;式中、R7は、水素;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され;ならびに、R8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり;式中、ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含み、かつアリールまたは脂肪族は、環状基である。いくつかの態様において、R'は、化合物がその生物学的標的(例えば、ミトコンドリア)に到達するまで、インビボでR5の酸素を代謝から保護する任意の官能基である。いくつかの態様において、R'保護基は、標的部位にて代謝されて、R5をヒドロキシル基に変換する。
様々な考えられる医用薬剤および薬学的組成物の例示的態様を、以下に提供する。
本発明の化合物は、細胞死の調節不良、異常な細胞成長および過増殖に関連した様々な状態を処置する医用薬剤の調製において有用である。
本発明のいくつかの態様において、これらの組成物は、単独で投与される一方で、一部の別の態様においては、これらの組成物は、少なくとも1種の先に定義したような活性成分/物質(例えば、ベンゾジアゼピン誘導体)を、固形支持体と共に、あるいは1種または複数の薬学的に許容される担体および任意に他の治療的物質共に含有する薬学的製剤において存在することが好ましい。各担体は、その製剤の他の成分と相溶性があり、対象にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。
例えば、リポソーム封入、微粒子、マイクロカプセル、受容体媒介したエンドサイトーシスなどの、様々な送達システムが知られており、本発明の治療的物質(例えば、ベンゾジアゼピン誘導体)を投与するために使用することができる。送達法は、動脈内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、および経口経路を含むが、これらに限定されるわけではない。特定の態様において、本発明の薬学的組成物が処置が必要な領域に局所的に投与されることが望ましいことがあり;これは、例えば手術時の局所輸注、注射またはカテーテル法により達成されるが、これらに限定されない。
本発明は、本明細書において説明された化合物の1種または複数の追加の活性物質との同時投与に関連する方法も含む。実際、本発明の化合物を同時投与することにより、先行技術の療法および/または薬学的組成物を増強する方法を提供する段階は本発明の更なる局面である。同時投与法において、これらの物質は、これらの物質は、同時または逐次に投与することができる。ひとつの態様において、本明細書に説明された化合物は、他の活性物質の前に投与される。薬学的製剤および投与様式は、先に説明されたうちの任意のものであり得る。加えて、2種またはそれよりも多い同時投与された化学物質、生物学的物質または照射は、異なる様式または異なる処方で各々投与することができる。
本発明の好ましい態様において、本発明の化合物およびその他の潜在的に有用な化合物を、ミトコンドリアATP合成酵素複合体のオリゴマイシン感受性付与タンパク質(OSCP)部分に対するこれらの結合親和性についてスクリーニングする。特に好ましい態様において、化合物は、組換えOSCPタンパク質に対するこれらの結合親和性を測定することによって、本発明の方法に使用するために選択される。受容体に対する薬物およびその他の小分子の結合親和性を測定するための多数の適切なスクリーンが、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、結合親和性スクリーンは、インビトロ系で行われる。その他の態様において、これらのスクリーンは、インビボまたはエクスビボの系において行われる。いくつかの態様において、本発明の化合物の投与後のATPの細胞内レベルを定量化することにより、本方法の有効性の指標を提供する一方で、本発明の好ましい態様において、細胞内ATPまたはpHレベルの定量化は必要ではない。
A.一般的治療適用
特に好ましい態様において、本発明の組成物(例えば、ベンゾジアゼピン誘導体)は、冒された細胞または組織におけるミトコンドリアATP合成酵素(ミトコンドリアF0F1 ATPaseとも称する)複合体の活性を調整すること(例えば、阻害するか、または促進すること)によって、多数の状態の任意の1つまたは複数に罹患している患者に対して治療的恩典を提供する(例えば、細胞または組織における壊死および/またはアポトーシス過程の調節不全によって特徴付けられる疾患、ならびに異常な細胞増殖および/または過剰増殖などによって特徴付けられる疾患)。さらに好ましい態様において、本発明の組成物は、自己免疫性/慢性炎症性の状態(例えば、乾癬)を処置するために使用される。さらなる態様において、本発明の組成物は、欠陥のある(例えば、閉鎖された)血管を処置するために、狭窄療法と組み合わせて使用される。
自己免疫疾患および慢性炎症性障害は、機能障害性細胞の増殖制御および/または細胞のアポトーシス制御から生じることが多い。ミトコンドリアは、細胞のアポトーシスの制御および実行において重要な役割を果たす。ミトコンドリアの透過性移行孔(MPTP)は、内側と外側のミトコンドリアのメンブラン(membrandes)にわたる孔であり、プロアポトーシスの粒子の制御において機能する。一過性MPTP開口により、チトクロームcの放出およびミトコンドリアの膜間腔からのアポトーシス誘導因子を生じ、細胞のアポトーシスを生じる。
は、ANTを阻害する。
式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され:水素;CH3;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R5は、OH;NO2;NR';OR'からなる群より選択され;式中、R'は、以下からなる群より選択され:直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分(例えば、ニトロ、ニトリルなど)を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;式中、R6は、以下からなる群より選択され:水素;NO2;Cl;F;Br;I;SR';およびNR'2、式中、R'は、上記R5のように定義され;式中、R7は、水素;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され;ならびにR8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり;式中、該ベンゼンよりも大きなものは、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含み、かつアリールまたは脂肪族環状基である。いくつかの態様において、R'は、化合物がその生物学的標的(例えば、ミトコンドリア)に到達するまで、R5の酸素をインビボでの代謝から保護する任意の官能基である。いくつかの態様において、R'保護基は、標的部位にて代謝されてR5をヒドロキシル基に変換する。
肥厚する表皮の分断に付随して、表皮の有意な肥厚を引き起こす上皮過形成(例えば、過剰ケラチノサイト増殖)は、乾癬などの疾患の特色であり(例えば、Krueger GC, et al., (1984) J. Am. Acad. Dermatol. 11:937-947;Fry L. (1988), Brit. J. Dermatol. 119:445-461を参照されたい;それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、さらに生理学的条件下で(例えば、創傷治癒の間に)生じる。
本発明は、F1F0-ATPaseを標的化する化合物を提供する。加えて、本発明は、自己免疫疾患のための処置としてF1F0-ATPaseを標的化する化合物、および特に、低毒性である化合物を提供する。本発明は、F1F0-ATPaseを標的化する化合物を同定する方法をさらに提供する。加えて、本発明は、F1F0-ATPaseを標的化する化合物のための治療的適用を提供する。
本発明は、F1F0-ATPaseを阻害する化合物を提供する。いくつかの態様において、本化合物は、遊離のF1F0-ATPaseに結合せず、むしろF1F0-ATPase-基質複合体と結合する。本化合物は、高い基質濃度にて最大活性を、および低い基質濃度にて最小の活性(例えば、F1F0-ATPaseを阻害する)を示す。好ましい態様において、化合物は、F1F0-ATPaseのkcat/Km比を変化させない。本発明のF1F0-ATPase阻害剤の特性は、オリゴマイシンと対照的であり、急性的に有毒かつ致死的なF1F0-ATPase阻害剤である。オリゴマイシンは、非競合的阻害剤であり、遊離のF1F0-ATPaseおよびF1F0-ATPase-基質複合体と結合し、kcat/Km比を変化させる。
本発明は、自己免疫疾患を処置する際に有用な化合物を同定する(例えば、スクリーニングする)方法を提供する。本発明は、特定のタイプの化合物に限定されるわけではない。好ましい態様において、本発明の化合物は、薬学的組成物、小分子、抗体、大分子、合成分子、合成ポリペプチド、合成ポリヌクレオチド、合成核酸、アプタマー、ポリペプチド、核酸、およびポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されるわけではない。本発明は、自己免疫疾患を処置する際に有用な化合物を同定する特定の方法に限定されるわけではない。好ましい態様において、自己免疫疾患を処置する際に有用な化合物は、F1F0-ATPaseを阻害するために能力を有するが、kcat/Km比を変化させないものとして同定される。
本発明は、障害(例えば、神経変性疾患、アルツハイマー、虚血再灌流傷害、神経筋障害、非ホジキンリンパ腫、リンパ性白血病、皮膚のT細胞性白血病、自己免疫疾患、癌、固形腫瘍、リンパ腫、および白血病)を処置するための方法を提供する。本発明は、特定の処置の形態に限定されるわけではない。好ましい態様において、処置は、症候回復、症候予防、障害予防、および障害回復を含むが、これらに限定されるわけではない。本発明は、インビボ、インビトロ、および/またはエクスビボの設定範囲において適用できる自己免疫疾患を処置する方法を提供する。
下記実施例は、本発明のある好ましい態様を明らかにし、かつさらに例証するために提供されており、それらの範囲を限定するために構成されるものではない。
ベンゾジアゼピン化合物は、固相または可溶性相のどちらかのコンビナトリアル合成法に加え、良く確立された技術の個別の基本を用いて調製される。本明細書に参照として組入れられている、例えば、Boojamra, C.G. et al.,(1996);Bunin, B.A., et al.(1994);Stevens, S.Y. et al.,(1996);Gordon, E.M., et al.,(1994);ならびに米国特許第4,110,337号および第4,076,823号を参照されたい。例証のために、下記の一般的方法を提供する。
様々な1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン誘導体を非常に高い全体収率で調製するために改良された固相合成法が、文献において報告されている(例えば、BuninおよびEllman、J. Am. Chem. Soc.、114:10997-10998[1992]を参照されたい)。これらの改良された方法を用い、1,4-ベンゾジアゼピン-2-オンが、3種の個別の成分:2-アミノベンゾフェノン、α-アミノ酸、および(任意に)アルキル化剤から、固形支持体上で構築される。
1,4-ベンゾジアゼピン-2,5-ジオンの固相合成のための一般的方法は、C.J. Boojamraらの論文(J. Org. Chem.、62:1240-1256[1996])に詳細に報告されている。この方法は、本発明の化合物を調製するために使用される。
本発明のベンゾジアゼピンの多くは、立体中心がα-アミノ酸およびそのエステル出発材料により導入されるキラリティーのために、光学異性体として存在することは認められるはずである。前述の一般的手法は、α-アミノ酸またはエステル出発材料のキラリティーを保存する。多くの場合において、このように保存されたキラリティーが望ましい。しかしながら、α-アミノ酸またはエステル出発材料の望ましい光学異性体が入手できないかもしくは高価である場合、対応する光学異性体に分離されるラセミ混合物が作成され、望ましいベンゾジアゼピン鏡像異性体が単離される。
Bz-423は、前述のように合成した。FK506は、Fujisawa(大阪、日本)から入手した。N-ベンゾイルカルボニル-Val-Ala-Asp-フルオロメチルケトン(z-VAD)は、Enzyme Systems社(リバーモア、CA)から得た。ジヒドロエチジウム(DHE)および3,3'-ヨウ化ジヘキシルオキサカルボシアニン(DiOC6(3))は、Molecular Probes社(ユージーン、OR)から得た。FAM-VAD-fmkは、Intergen社(パーチェス、NJ)から得た。マンガン(III)meso-テトラキス(4-安息香酸)ポルフィリン(MnTBAP)は、Alexis Biochemicals社(サンディエゴ、CA)から購入した。ベンゾジアゼピンは、説明されたように合成した(B.A. Bunin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、91:4708-4712[1994]参照)。他の試薬は、Sigma社(セントルイス、MO)から得た。
雌NZB/Wマウス(Jackson Labs社、バーハーバー、ME)を、処理群および対照群に無作為に分配した。腹腔内注射により、対照マウスは、ビヒクル(50μL DMSO水溶液)を受取り、処理マウスは、ビヒクルに溶解したBz-423(60mg/kg)を与えられた。末梢血を、尾静脈から入手し、血清を調製した。脾および腎の試料は、10%緩衝化ホルマリンまたはOCT中の凍結のどちらかにより保存した。各動物からの追加の脾切片を、単独の細胞懸濁液の調製のために保存した。
初代脾細胞は、6ヵ月齢のマウスから、赤血球の等張溶解を伴う、脾の機械的破壊により得た。B細胞が豊富な画分を、CD4、CD8aおよびCD11b被覆されたマイクロビーズ(Miltenyi Biotec社、オーバーン、CA)による磁気セルソーターを用いる陰性選択により調製した。Ramos株は、ATCC(モナシス、GA)から購入した。細胞を、10%熱失活ウシ胎仔血清(FBS)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)およびL-グルタミン(290μg/ml)を添加したRPMI中で維持した。初代細胞のための培地は、2-メルカプトエタノール(50μM)も含有した。全てのインビボ試験は、0.5%DMSOおよび2%FBSで行った。インビトロ実験は、2%FBS含有培地において行った。有機化合物は、0.5%DMSO含有培地に溶解した。
ホルマリン固定した腎切片を、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色し、糸球体の免疫複合体の沈着を、FITC複合したヤギ抗マウスIgG(Southern Biotechnology社、バーミンガム、AL)で染色した凍結した組織を用いる直接免疫蛍光により検出した。切片を、腎炎およびIgG沈着について0〜4+スケールを用い盲検様式で解析した。リンパ系過形成の程度は、H&Eで染色した脾切片を用い、0〜4+スケールでスコア化した。B細胞を同定するために、切片を、ビオチン化した抗B220(Pharmingen社;1μg/mL)で、その後ストレプトアビジン-Alexa 594(Molecular Probes社;5μg/mL)で染色した。凍結した脾切片を、TUNEL陽性細胞について、インサイチュー細胞死検出キット(Roche社)を用いて分析し、0〜4+スケールを用いて評価した。
凍結した脾切片を、インサイチュー細胞死検出キット(Roche Molecular Biochemicals社、インディアナポリス、IN)を用いて分析した。切片は盲検により評価し、TUNEL陽性染色の量に基づいてスコアリングした(0〜4+)。B細胞は、ビオチン化された抗B220(Pharmingen社、サンディエゴ、CA;1μg/mL、1時間、22℃)で、引き続きストレプトアビジン-Alexa 594(Molecular Probes社、ユージーン、OR;5μg/mL、1時間、22℃)で染色することにより同定した。
表面マーカーを、蛍光複合した抗Thy 1.2(Pharmingen社、1μg/mL)および/または抗B220(Pharmingen社、1μg/mL)で検出した(15分間、4℃)。外膜ホスファチジルセリンを検出するために、細胞を、FITC複合したアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム(PI)と共に、製造業者(Roche Molecular Biochemicals社)の指示に従いインキュベーションした。フローサイトメトリーによるTUNEL陽性細胞の検出には、APO-BRDUキット(Pharmingen社)を使用した。スーパーオキシドおよびMPTは、細胞を10μMジヒドロエチジウムおよび2μM 3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド(DIOC6(3))(Molecular Probes社)と共に、30分間27℃でインキュベーションすることにより評価した。ヨウ化プロピジウムを用い、生存度およびDNA含量を決定した。試料は、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社、サンディエゴ、CA)で分析した。
Ramos細胞を、可溶性ヤギFab2抗ヒトIgM(Southern Biotechnology Associates社、1μg/ml)および/または精製した抗ヒトCD40(Pharmingen社、クローン5C3、2.5μg/ml)で活性化した。マウスB細胞を、培養ウェルに固定したアフィニティー精製したヤギ抗マウスIgM(ICN社、オーロラ、OH;20μg/ml)および/または可溶性精製した抗マウスCD40(Pharmingen社、クローンHM40-3、2.5μg/ml)で活性化した。LPSは10μg/mlで使用した。Bz-423は、刺激を加えた直後に、培養物へ添加した。インヒビターは、Bz-423の30分前に添加した。
統計解析を、SPSSソフトウェアパッケージを用いて行った。統計学的有意性は、Mann-Whitney U検定を用いて評価し、変量間の相関関係は、二元ANOVAにより評価した。報告した全てのp値は片側であり、データは平均±SEMで表わした。
細胞生存度は、ヨウ化プロピジウム(PI、1μg/mL)染色により評価した。PI蛍光は、FACScaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson社、サンディエゴ、CA)を用いて測定した。低二倍体DNAの測定は、DNA標識液(0.2%Tritonおよび10μg/mL RNAse Aを含有するPBS中のPI 50μg/mL)中で、細胞を4℃で一晩インキュベーションした後に行った。このデータは、総計(aggregate)以外は、CellQuestソフトウェアを用いて解析した。
O2 -を検出するために、細胞を、DHE(10μM)と共に、30分間37℃でインキュベーションし、エチジウム蛍光を測定するフローサイトメトリーにより分析した。ミトコンドリア膜を隔てた電位(Ψm)のフロー分析は、細胞をDiOC6(3)(20nM)で37℃で15分間標識することにより行った。Ψm崩壊に関する陽性対照は、カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP、50μM)を用いて確立した。カスパーゼ活性化アッセイは、FAM-VAD-フルオロメチルケトンで行った。この基質の処理は、フローサイトメトリーで評価した。
Ramos細胞(250×106細胞/試料)を、Bz-423(10μM)またはビヒクルで1〜5時間処理した。細胞をペレット化し、緩衝液(68mMショ糖、220mMマンニトール、10mM HEPES-NaOH、pH7.4、10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、10μg/mLロイペプチン、10μg/mLアプロチニン、1mM PMSF)中に再懸濁させ、氷上で10分間インキュベーションし、ホモジナイズした。ホモジネートを、4℃で5分間(800g)2回遠心し、核およびデブリをペレット化し、ならびに4℃で15分間(16,000g)遠心し、ミトコンドリアをペレット化した。上清を濃縮し、12%SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、Hybond ECL膜(Amersham社、ピスカタウェイ、NJ)に転写した。ブロック後(5%乾燥ミルクおよび0.1%Tweenを含有するPBS)、この膜を、抗シトクロムcモノクローナル抗体(Pharmingen社、サンディエゴ、CA;2μg/mL)で、引き続き抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼで複合した二次抗体(Amersham社)でプロービングし、化学発光により検出した。
雄のLong Evansラットを一晩絶食し、断頭により屠殺した。肝試料を、氷冷した緩衝液A(250mMショ糖、10mM Tris、0.1mM EGTA、pH7.4)中でホモジナイズし、核および細胞デブリをペレット化した(10分間、830g、4℃)。ミトコンドリアを、遠心(10分間、15,OOOg、4℃)により収集し、上清をS15画分として収集した。ミトコンドリアペレットを、緩衝液B(250mMショ糖、10mM Tris、pH7.4)で3回洗浄し、緩衝液Bで20mg/mL〜30mg/mLになるよう再懸濁した。ミトコンドリアは、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸(DCFH-DA、1μM)を含有する緩衝液C(200mMショ糖、10mM Tris、pH7.4、1mM KH2PO4、10μM EGTA、2.5μMロテノン、5mMコハク酸)で希釈した(0.5mg/mL)。ステート3測定に関して、ADP(2mM)を緩衝液中に含有し、Bz-423添加の前に、ミトコンドリアを2分間チャージさせた(charge)。ステート4を誘導するために、オリゴマイシン(10μM)を、緩衝液Cに添加した。DCFHの2',7'-ジクロロフルオレセイン(DCF)への酸化を、37℃で、蛍光分光計(λex:503nm;λem:522nm)でモニタリングした。O2 -およびΔΨmに対する作用を検出するために、ミトコンドリアを、DHE(5μM)またはDIOC6(3)(20 nM)を含有する、ビヒクル、Bz-423、またはCCCPを伴う、緩衝液C中で、37℃で15分間インキュベーションし、アリコートを蛍光顕微鏡による分析のために取り出した。
脾細胞を、機械的破壊により調製し、赤血球を等張溶解により除去した。細胞を、蛍光複合した抗Thy 1.2(Pharmingen社;1μg/mL)および/または抗B220(Pharmingen社;1μg/mL)で、4℃で15分間染色した。外膜ホスファチジルセリンを検出するために、細胞を、FITC複合したアネキシンVおよびPI(Roche Molecular Biochemicals社、インディアナポリス、IN;1μg/mL)と共にインキュベーションした。
脾臓を、Bz-423またはビヒクルで処理した4ヵ月齢のNZB/Wマウスから摘出し、OCT中で凍結させた。ROS産生は、E.D. Kerverらにより説明されたように、3,3,9-ジアミノベンジジンマンガン(II)を用いて測定した(E.D. Kerver et al, Histochem. J.、29:229-237[1997]参照)。
抗DNAおよびIgG力価を、P.C. Swansonらにより説明されたように、ELISAにより決定した(P.C. Swanson et al, Biochemistry、35:1624-1633[1996]参照)。血清BUNは、ミシガン大学病院(University of Michigan Hospital)の臨床検査室で測定した。タンパク尿は、ChemStrip 6(Boehringer Mannheim社)を用いモニタリングした。
動物でのベンゾジアゼピン研究は、2001年8月23日に公表された米国特許公開第20010016583号に記述されており、その全体が本明細書に参照として組み入れられる。
Bz-423に関与する死滅機構を特徴付けるために、細胞内ROS、ΔΨm、チトクロームc放出、カスパーゼ活性化、およびDNA断片化を時間と共に測定した(示した結果は、B細胞に関するものであるが、多くの異なる細胞タイプにおける反応を特徴付ける)。Bz-423に対する曝露後に検出される最初の事象は、O2 -と特異的に反応する酸化還元感受性薬のジヒロエテジウム(DHE)で染色される細胞の画分の増大である。
初期O2 -は、その他の細胞事象に先行するため、このROSが調節の役割を有する可能性があった。非食作用細胞において、酸化還元酵素は、MRCと共に、ROSの主要供与源である。この反応に関する基礎を決定するために、これらの系の阻害剤をBz-423で誘導されるO2 -を調節する能力についてアッセイした。これらの試薬のうち、主にチトクロームcオキシダーゼに対して作用するNaN3(ミトコンドリアの呼吸鎖、MRCの複合体IV)、およびMRC複合体IIIのユビキノール-チトクロームcレダクターゼ成分によるO2 -の形成を遮断するミクロモル量のFK506だけが、Bz-423を調整した。これらの知見は、ミトコンドリアが、Bz-423で誘導されるO2 -の供与源であること、およびMRCの成分が応答に関与することを示唆した。FK506による阻害は、カルシニューリンまたはFK506-結合タンパク質のいずれかに対する結合によって生じ得るが、これらのタンパク質(それぞれ、ラパマイシン、およびシクロスポリンA)としっかりと結合する天然物は、Bz-423 O2 -応答を減少させなかった。
MRC複合体IおよびIIIは、ミトコンドリア内のROSの主要供与源である。上で提示した証拠は、Bz-423で誘導されるROSがミトコンドリアに由来することを示唆する。この仮説を試験するために、MRC機能をノックアウトして、生じる細胞をBz-423に対する応答の際のROSについて調べた。MRCの複合体I〜IVは、部分的にミトコンドリアDNA(mtDNA)によってコードされる。臭化エチジウムの存在下において長期間にわたって細胞を培養するとmtDNAが除去されることから、mtDNAでコードされるタンパク質は産生されず、MRCに沿った電子伝達は生じないことを示唆している(mtDNAおよび関連するタンパク質を欠いた細胞は、ρ0細胞と呼ばれることが多い)。臭化エチジウムは、ラモス細胞に有毒であるので、これらの実験は、Namalwa B細胞(別の成熟B細胞株)で行った。Namalwaρ0細胞をBz-423で処理してもROS応答を生じず、そのことはラモスおよびNamalwaρ+細胞においても観察された。
オリゴマイシン(ミトコンドリアのF1F0-ATPaseと結合するマクロライド天然物)は、状態3〜4移行を誘導し、Bz-423のようにO2 -を産生する。これらの類似性に基づくと、F1F0-ATPaseは、またBz-423のための分子標的であるかもしれない。この仮説を試験するために、亜ミトコンドリア粒子(SMP)におけるATPase活性に対するBz-423の効果を調べた。実際に、Bz-423は、ED 50 ca. 5μMで、ウシSMPのミトコンドリアのATPase活性を阻害した。
Bz-423の機構研究の初期群の一部のように、ビオチンが共有結合で付着したヘキシルアミノリンカーとNメチル基を置換することによって(この修飾では、Bz-423の活性を変化させなかった)、ビオチン化された類似体を合成した。この分子を、T7ファージの先端に融合タンパク質として発現されるヒト乳癌cDNA(Invitrogen)のディスプレイ・ライブラリーをプローブするために使用した。新たなFK506結合タンパク質を同定するために、KF506のビオチン化されたバージョンを使用して、Austinおよび同僚によって記述されたスクリーニング法に従って、ミトコンドリアのF1F0-ATPaseのOSCP成分をBz-423に対する結合タンパク質として同定した(図1)。
上に記述した化学的および生化学的な標的の同定および確証研究を補完するために、細胞全体のOSCPをノックアウトするための実験を行った。インビトロにて、ATPaseからOSCPを除去することにより、酵素の加水分解活性を変化させることなく合成酵素機能がなくなる。酵母では、OSCPノックアウトが致死ではなく;これらの細胞では、ATPの加水分解により、化学ポテンシャルがもたらされてΔΨmを補助し、これによりミトコンドリア統合性を維持する。酵母OSCPは、哺乳動物タンパク質に対する配列相同性が限られているので(〜30%)、これらの実験は、ヒト起源の細胞株において行った。
大部分の1,4-ベンゾジアゼピンと同様に、Bz-423は、ウシ血清アルブミン(BSA)に対して強く結合し、これにより、溶液中で遊離の薬物の有効濃度が減少してしまう。例えば、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を含む組織培地では、薬物のおよそ99%がBSAに結合する。したがって、細胞培養細胞障害アッセイ法は、BSAに対する結合を減少させて、遊離の[Bz-423]を増大するために、2%のFBSである培地中で行われる。これらの条件下では、用量反応曲線はかなり鋭く、その結果、Bz-423が部分的に有効なだけである限られた濃度範囲が存在する。いくつかのベンゾジアゼピンは、抗増殖特性を有することが公知であるので、<ED50濃度のBz-423の効果を慎重に解析し、アポトーシスを誘導することに加えて、Bz-423が培養において3d後に細胞増殖を防げたことが観察された。これらの低血清条件では、細胞障害性および抗増殖効果が重なり、それぞれの効果を独立して研究することが困難になる。しかしながら、[BSA]を増大すること、またはFBSを10%まで増大することによって、用量反応曲線は平らになり(および細胞障害性ED50が増大された)、Bz-423で誘導される細胞障害を増殖に対する効果と明らかに区別することができる。より少量の薬物(例えば、10〜15μM)では、Bz-423は、最小の細胞障害性を有したが、濃度>20μMでは、アポトーシスだけを観察した(死滅経路は、上に記述してあり、二峰性ROS応答を含み、10%のFBSを含む培地においても観察された)。また、より多量の薬物では増殖を遮断し得るが、これは増殖に対する効果を観察することができる前に、十分にアポトーシスを生じさせた。用量反応曲線は、10%のFBSを含む培地をシミュレートするために2%のFBSを含む培地にBSAを添加した実験と同様であり、抗細胞増殖および細胞障害は、血清のその他の成分による影響を受けなかったことが証明された。
Bz-423が細胞の増殖を遮断する機構をプローブするために、遺伝子プロファイリング実験を行った。タンパク質合成の阻害剤としてシクロヘキサミドを使用する研究において、Bz-423で誘導される細胞死は、新たなタンパク質合成に依存しないことが判明した。したがって、遺伝子発現の変化は、抗増殖機構にのみに関連している可能性が高かった。下流の効果ではなく、シグナル-応答カップリングに関与する変化を検出する可能性を増大するために、Bz-423で3h間処理した細胞のプロフィールを作った。これは、ROS早期最大値の直後であるが、ミトコンドリア透過性孔の開口を含むその他の細胞変化が生じる前に位置する。
RNAプロファイリング・データによって示唆されるように、ODC活性およびポリアミン代謝が、Bz-423による影響を受けるかどうかを決定するために、Bz-423で処理した細胞におけるODC活性を媒体対照と比較して直接測定した。これらの実験では、オルニチンのプトレシンへの変換を、3H-オルニチンを使用して定量化した。比較のために、対照細胞を媒体対照またはオルニチンデカルボキシラーゼの強力な阻害剤であるジフルオロメチルオルニチン(DFMO)(Bz-423のように、DFMOは、強力な抗増殖薬である)で処理した。図3に示したように、Bz-423で4h間の処理細胞は、用量依存的様式でODC活性を有意に減少し、これは、とりわけ、RNAプロファイリングによって示唆されたとおり、アンチザイム1の増大と一致している。ODC活性の減少は、同じ条件下で測定されるODCタンパク質レベルの減少に平行していた。
これらのBz-423の特性に基づいて、Bz-423誘導体の範囲を合成して、結合および活性のために重要なこの新規化合物の構造エレメントをプローブした。Nメチル基または塩素を水素で置換しても、培養における不死化されたラモスB細胞またはJurkat T細胞に対するリンホトキシン活性に対して、ほとんど効果を有さなかった。同様に、Bz-423の両方の鏡像異性体は、等効力であり、Bz-423とその分子標的との間の相互作用が二点結合を含むことを示す。これらのデータとは対照的に、ナフタルアラニンを除く(表1を参照されたい)。本発明は、特定の機構に限定されるというわけではなく、かつ機構の理解は、本発明を実施するために必要ではないが、それにも関わらず、部分またはフェノール性水酸基を水素と置換すると、全ての細胞傷害活性がなくなることが想定される(表1)。これらの観察に基づいて、C'3およびC'4位に対する変化を調査した。1-ナフトールを2-ナフトで置換しても、細胞殺害に対してほとんど効果を有さない。同様に、ナフチルアラニンを相当するサイズのその他の疎水基で置換しても、Bz-423の細胞障害特性に対してほとんど効果を有さなかった。対照的に、キノリン7〜9は、それぞれのBz-423よりも強力であった。本発明は、特定の機構に限定されるわけではなく、かつ機構の理解は、本発明を実施するために必要でないが、それにも関わらず、題目データは、Bz-423のための結合部位内の疎水性置換基に対する優先を示すことが想定される。より小さなC3置換基は、Bz-423よりもいくらか強力なだけであったが、酸素を含む芳香族基を有する化合物は、細胞傷害性が有意に少なかった。これらのデータは、明らかに、大きな疎水性芳香族置換基が、最適な活性のために有用なことを示す。
Bz-423は、前述したように合成し(Lattmann, E., et al., (2002) Drug Des Discov 18, 9-21を参照されたい;その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、ジメチルスルホキシド(DMSO)水溶液に20mg/mlで溶解した。DMSOは、全ての実験において0.5%(v/v)以下の終濃度で存在した。この研究に使用した他の全てのベンゾジアゼピンは、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から得た。RAは、Sigma-Aldrichから得た。レチノイドは、DMSOに20mg/mlに希釈して、凍結させて貯蔵した。使用時に、RA保存液を培地に希釈して、1.0μg/mlの終濃度にて使用した。細胞内シグナリング研究に使用した試薬には、EGF受容体の全体およびリン酸化された形態、ならびに全体およびリン酸化Erk 1/2に対する抗体を含んだ(Cell Signaling Technologies, Inc.;Bever1y, MAから得た)。β-チューブリンに対する抗体は、Santacruz Biotech (Santa Cruz, CA)から得た。その他の全ての化学試薬は、示したものを除き、Sigma-Aldrichから購入した。
太陽光線保護された臀部皮膚の複製した2mmの全層パンチ生検は、若年成人ボランティアから得た。このプロジェクトへのヒト対象の参加は、University of Michigan Institutional Review Boardにより承認され、全ての対象には、彼らが研究に参加する前に書面にしたインフォームドコンセントを提供した。生検直後に、組織をケラチノサイト基礎培地(KBM)(Cambrex Bioscience, Walkersville, MD)からなる培地に浸漬した。KBMは、低Ca2+であり、MCDB-153培地の血清なし修飾により、高密度ケラチノサイト増殖のために最適化される。最終Ca2+濃度を1.4mMにするために、CaCl2を補充した。氷上で研究室に輸送後、生検を250μlのCa2+を補ったKBMを、さらなる処理(例えば、RAおよび/またはBz-423)と共に、または伴わずに含む24穴・ディッシュ内でインキュベートした。培養は、95%の空気および5%のCO2の雰囲気において37℃にてインキュベートした。最小体積の培地中で組織を維持する以外に、厳密な気相液相界面を保証するために何もさらに行わなかった。一日おきに培地の交換および新鮮な処理をしながら8日間インキュベーションした。インキュベーション期間終了後、組織を10%の緩衝ホルマリン中で固定して、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色後、組織学的に調べた。それぞれの組織切片において5箇所の部位にて上皮の厚み測定を行って、平均した。未処理の、レチノイド曝露した、レチノイド・プラスBz-423を処理した生検のための平均厚さ値を決定した。器官培養手順は、過去に記述されている(例えば、Varani J, et al., (1993) Amer. J. Pathol. 142:189-198, 1993;Varani J, et al., (1994) J. Clin. Invest. 94:1747-1753を参照されたい;それぞれのその全体が本明細書に参照として組み入れられる)。
新生児の環状切除法によって得られた包皮組織を表皮ケラチノサイトおよび経皮線維芽細胞の供与源として使用した。このプロジェクトにおける包皮組織の使用は、University of Michigan Institutional Review Boardにより承認された。表皮ケラチノサイトは、以前に記述したとおり(例えば、Varani J, et al., (1994) J. Clin. Invest. 94:1747-1753を参照されたい;その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、包皮組織から単離した。初代および初期の継代細胞は、ケラチノサイト培養培地(KGM)(Cambrex Bioscience.)中で維持した。KGMは、KBMと同じ基本培地を含むが、mlあたり0.1ng EGF、mlあたり0.5μgインスリン、および0.4%のウシ下垂体抽出物を含む成長因子の混合物をさらに補ってある。同じ包皮組織から得られる線維芽細胞は、非須アミノ酸および10%のウシ胎児血清(DMEM-FBS)を補ったダルベッコ修飾最小基本培地を使用して、単層培養にて培養した。ケラチノサイトおよび線維芽細胞は、95%の空気および5%のCO2の雰囲気において37℃にて維持した。細胞をトリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)に曝露することによって二次培養して、継代2〜3にて使用した。
ケラチノサイトは、培地としてKGMを使用して24穴プレートにおいてウェルあたり5×10-4細胞で播種した。細胞が付着した後、図レジェンドに示したように、これらを洗浄し、次いで異なる濃度のBz-423またはその他のベンゾジアゼピンと共にKGM中でインキュベートした。増殖は、トリプシン/EDTAで細胞を遊離させ、粒子計数器を使用してこれらを数え上げることによって3日目に測定した(Coulter Electronics, Hialeah, FL)。1.4mM Ca2+を補ったKBMを培地として使用したこと以外は、線維芽細胞増殖研究は、同様に行った。
ケラチノサイトは、細胞培地としてKGMを使用して、6穴ディッシュのウェルにウェルあたり3×105でプレートにまいた。細胞を一晩付着させた。その翌日、これらを洗浄し、次いでEGF(10ng/ml)およびBz-423(0.5または1.0μg/ml)と共に、または伴わずにKBM中でインキュベートした。5または15分間のインキュベーション後、細胞を20mM Tris-HCl(pH 7.4)、2mMバナジウム酸ナトリウム、1.0mMフッ化ナトリウム、100mM NaCl、1%のNP-40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、25μg/mlのそれぞれのアプロチニン、ロイペプチン、およびペプスタチン、ならびに2mM EDTAおよびEGTAからなる1×細胞溶解緩衝液に溶解した。溶解は、4℃にて溶解緩衝液内で細胞をこすり、試料を超音波処理することによって行った。細胞可溶化物を氷上で30分間インキュベートし、次いで16000gにて15分間マイクロ遠心分離によって透明にした。上澄み液を収集して、BioRad DCタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を推定した(BioRad, Hercules, CA)。
2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセタート(DCFH-DA, Molecular Probes, Eugene, OR)は、それぞれの使用の前にDMSOに10mM保存液として調製した。DCFH-DA(100μM)を負荷した(30分、37℃)48ウェルプレート中で増殖している細胞を直接培地に添加して、洗浄し、次いで処理前に新鮮な培地中においた。示した処理の後、酸化された産物2',7'-ジクロロフルオレッセイン(DCF)の蛍光をFACSCalibur(BD Bioscience, San Diego, CA)を使用して、フローサイトメトリーによってモニターした。それぞれの試料について、10,000事象を記録し、データを解析して蛍光強度中央値を決定した。
器官培養においてインキュベートした健常ボランティア由来のヒト皮膚の2mmのパンチ生検は、正常皮膚の組織学的特色を8日間維持した(図5Aおよび5D)。同じ対象由来の複製生検をRA(1μg/ml、0.01%のDMSO媒体中の終濃度)を連続的に存在させて培養した場合、上皮過形成を発生した(図5Bおよび5E)。生検材料をRA(1μg/ml)およびBz-423(0.5μg/ml)の両方を含む培地において培養した場合、上皮の高い増殖応答が阻害された(図5Cおよび5F)。
処理の1時間以内に、Bz-423は、用量依存的な様式でリンパ球におけるROS産生を増大した。ケラチノサイトおよび線維芽細胞におけるBz-423に対する抗増殖応答が同様にROS産生に関与するかどうかを決定するために、Bz-423処理した細胞における細胞内ROSレベルを測定した。図6に示したように、平均細胞蛍光として評価されるROS応答は、250nM程度と低いBz-423の用量にて、両方の細胞タイプにおいて観察された。ROS応答は、両方の細胞タイプにおける用量依存的な様式で増大される。試験した全ての濃度にて、ケラチノサイトは、線維芽細胞よりも大きなROS応答を生じた(図6)。ROS産生を平均細胞蛍光ではなくベースライン以上の細胞の画分に関して評価したときも、同様の知見が得られた。本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、リンパ球における従来の知見と同様で、これらの結果は、Bz-423に対する曝露によりケラチノサイトおよび線維芽細胞におけるROSレベルの早期上昇を証明する。したがって、Bz-423の作用機序(以前にリンパ球において、ミトコンドリアROS産生標的に対する直接の結合に関与することが決定された)は、ケラチノサイト増殖および上皮性の過形成の減少に関与する。
MAPキナーゼ経路を介したEGF受容体活性化および下流のシグナリングは:i)ケラチノサイト増殖を誘導する刺激に応答して活性化され、およびii)上皮過形成の発生において役割を果たしているので、Bz-423処理したケラチノサイトでは、EGF受容体活性化およびMAPキナーゼ(Erk1/2)シグナリングに影響を及ぼすことと仮定された。この可能性を試験するために、EGF受容体の全体およびリン酸化された形態を、分裂促進因子刺激後に未処理の細胞およびBz-423処理した細胞で測定した。増殖因子を枯渇させたケラチノサイトをBz-423(0、0.5、または1.0μM)と共に10分間プレインキュベートし、次いでEGF(10ng/ml)で刺激した。EGF添加直前複製試験試料から調製した可溶化液を、EGF刺激後5分および15分に、A:全体およびリン酸化されたEGF受容体発現、ならびにB:全体およびリン酸化されたERK1/2発現について解析した。タンパク質の相対的レベルを走査濃度測定によって定量化した。全体またはリン酸化されたEGF受容体のレベルにおける相違は、検出されなかった。同様に、ケラチノサイトの分裂促進因子刺激前の、およびの直後のErk1/2のリン酸化状態をBz-423の有無において評価した。全体Erk1/2タンパク質において変化は観察されなかったが、EGFで誘導されるErk-リン酸化は、用量依存的な様式でBz-423によって減少した。本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、これらの結果は、ケラチノサイトにおけるBz-423の抗増殖作用が、Erk活性化が減少されることと関連するが、効果は、EGF受容体発現の下流を媒介することを示す。これらの知見は、Erk1/2自体を含む、活性化されたEGF受容体とErk1/2との間のシグナル伝達に関与する1つまたは複数のキナーゼ/ホスファターゼが、Bz-423によって(直接または間接的にROSを介して)調節されることを示す。
過去の研究では、上皮過形成(乾癬などの疾患において、ならびに局所的レチノイド療法の結果として生じる)が、EGF受容体のためのリガンドの皮内産生および自己分泌またはパラ分泌EGF受容体活性化を含むことを確信させる証拠が提供された(例えば、Gottlieb AB, et al., (1988) J. Exp. Med. 167:670-675;Elder JT, et al., (1989) Science 243:811-814;Piepkorn M, et al., (1998) J Invest Dermatol 111:715-721;Piepkorn M, et al., (2003) Arch Dermatol Res 27:27;Cook PW, et al., (1992) Cancer Res 52:3224-3227;Varani J, et al., (1998) Pathobiology 66:253-259を参照されたい;それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)。EGF受容体遮断の存在下では、生理学的ケラチノサイト増殖が続くため(例えば、Varani J, et al., (2001) J. Invest. Dermatol 117:1335-1341;Varani J, et al., (1998) Pathobiology 66:253-259を参照されたい;それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、また経皮機能は、EGF受容体活性にも依存的ではないため(例えば、Varani J, et al., (2001) J. Invest. Dermatol 117:1335-1341;Varani J, et al., (1998) Pathobiology 66:253-259;Tavakkol A, et al., (1999) Arch. Dermatol. Res. 291:643-651を参照されたい;それぞれ、その全体が本明細書に参照として組み入れられる)、EGF受容体活性化および付随する下流のシグナリング事象は、過形成性状態の療法のための標的を提供する。本発明は、特定の機構に限定されるわけではない。実際に、機構の理解は、本発明を実施するために必要ではない。それにも関わらず、本発明の経過の間に行われた実験は、Bz-423、新規ベンゾジアゼピン類似体、および関連化合物が線維芽細胞機能に対して有害効果を伴わずにヒト皮膚器官培養においてレチノイドで誘導される上皮過形成を阻害することを証明する。
Claims (22)
- a)高増殖性上皮細胞を伴う試料およびベンゾジアゼピン化合物を含む組成物を提供する工程;ならびに、
b)該組成物を該試料に適用する工程;
を含む高増殖性上皮細胞を調節する方法。 - 組成物を試料に適用する工程により、該試料中のErk1/2活性化が低下する、請求項1記載の方法。
- 組成物を試料に適用する工程により、該試料中のケラチノサイト増殖を阻害する、請求項1記載の方法。
- 組成物が局所的副腎皮質ステロイドをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 局所的副腎皮質ステロイドが、トリアムシノロンアセトニド0.1%クリームおよびジプロピオン酸ベタメタゾン0.05%クリームからなる群より選択される、請求項4記載の方法。
- 組成物がコールタール2〜10%をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 組成物がビタミンD-3類似体をさらに含む、請求項1記載の方法。
- ビタミンD-3類似体がカルシポトリエンである、請求項7記載の方法。
- 組成物が角質溶解薬をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 角質溶解薬がアントラリン0.1〜1%である、請求項9記載の方法。
- 組成物が局所的レチノイドをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 局所的レチノイドがトレチノインおよびタザロテンからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- 試料が生きた対象である、請求項1記載の方法
- 生きた対象が上皮過形成に罹患しているヒトである、請求項13記載の方法。
- 生きた対象が乾癬を有する、請求項14記載の方法。
- ベンゾジアゼピン化合物がBz-423である、請求項1記載の方法。
- ベンゾジアゼピン化合物がRおよびS鏡像異性形態、ならびにラセミ混合物を含む以下の式を含む、請求項1記載の方法;
式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され:
水素;CH3;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;
式中、R5は、OH;NO2;OR'からなる群より選択され;
式中、
R'は、以下からなる群より選択され:
直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;
式中、R6は、水素;NO2;Cl;F;Br;I;SR';およびNR'2からなる群より選択され;式中、R'は、上記R5のように定義され;
式中、R7は、水素;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され;ならびに、
式中、R8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり;式中、該ベンゼンよりも大きな基は、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含む。 - a)上皮過形成を調節するベンゾジアゼピン化合物;および、
b)以下の群よりから選択される薬剤:局所的な副腎皮質ステロイド、角質溶解薬、局所的レチノイド、コールタール2〜10%、およびビタミンD-3類似体;
を含む、薬学的組成物。 - ベンゾジアゼピン化合物がBz-423である、請求項18記載の薬学的組成物。
- ベンゾジアゼピン化合物がRおよびS鏡像異性形態、ならびにラセミ混合物を含む以下の式を含む、請求項18記載の薬学的組成物;
式中、R1、R2、R3、およびR4は、以下からなる群より選択され:
水素;CH3;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシ亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのエーテル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;
式中、R5は、OH;NO2;OR'からなる群より選択され;
式中、
R'は、以下からなる群より選択され:
直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも1つの炭素を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのヒドロキシル亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのチオール亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、アルデヒド亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのケトン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖であって、カルボン酸亜族で終結する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミド亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアシル基を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つの窒素含有部分を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのアミン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのハロゲン亜族を有する脂肪族鎖;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有し、かつ少なくとも1つのニトロニウム亜族を有する脂肪族鎖;
式中、R6は、水素;NO2;Cl;F;Br;I;SR';およびNR'2からなる群より選択され;式中、R'は、上記R5のように定義され;
式中、R7は、水素;直鎖状または分枝の、飽和または不飽和の、少なくとも2つの炭素を有する脂肪族鎖からなる群より選択され;ならびに、
式中、R8は、ベンゼンよりも大きな脂肪族環状基であり;式中、該ベンゼンよりも大きな基は、7つ以上の非水素原子を含む任意の化学基を含む。 - 薬学的組成物が上皮過形成を処置するために使用される、請求項18記載の薬学的組成物。
- 上皮過形成が乾癬によって生じる、請求項21記載の薬学的組成物。
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