JP2008301828A - チミジンキナーゼ変異体ならびにチミジンキナーゼ活性およびグアニル酸キナーゼ活性を有する融合タンパク質 - Google Patents

チミジンキナーゼ変異体ならびにチミジンキナーゼ活性およびグアニル酸キナーゼ活性を有する融合タンパク質 Download PDF

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Abstract

【課題】種々の適用（例えば、遺伝子治療）のために適切な増強された生物学的活性を有する新規チミジンキナーゼ変異体およびＴＫ融合タンパク質、そして、他の関連する利益を提供すること。
【解決手段】本発明は、１つ以上の変異を含むＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子を提供し、変異のうちの少なくとも１つは、非変異型チミジンキナーゼと比較して、チミジンキナーゼの生物学的活性を増大させるＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端の方向に位置するアミノ酸置換をコードする。そのような変異は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、チミジンキナーゼの生物学的活性を増大する、Ｑ基質結合ドメイン内にアミノ酸置換を含む。さらなる局面において、グアニル酸キナーゼの生物学的特性およびチミジンキナーゼの生物学的特性の両方を有する融合タンパク質が提供される。
【選択図】なし

Description

（技術分野）
本発明は、一般に、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅの変異酵素に関し、そしてより詳細には、チミジンキナーゼ変異体を利用する組成物および方法に関する。本発明はまた、グアニル酸キナーゼ活性およびチミジンキナーゼ活性の両方を有する融合タンパク質に関する。
（発明の背景）
多くの細菌性疾患は、一般に抗生物質を用いて容易に処置されるが、多くのウイルス性疾患、寄生虫性疾患、ガン性疾患、および遺伝的疾患についての有効な処置は、非常にわずかしか存在しない。例えば、ガンは、固形腫瘍の外科的切除によって処置され得る。にもかかわらず、固形腫瘍を有する患者の大多数はまた、一次腫瘍部位を越える微小転移巣を有する。手術のみで処置される場合、これらの患者のうちの約７０％は、ガンの再発を経験する。従って、ガンは、米国において総死亡数の５分の１を占め、そして第２位の死亡原因である。
現在、多くのガンはまた、手術に加えて、細胞傷害性化学療法薬物を含む治療剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチン、メトトレキサート、５−ＦＵなど）および／または放射線療法の組み合わせで処置される。しかし、このアプローチに関する１つの困難は、放射線療法剤および化学療法剤が、正常な組織に対して毒性であり、そして頻繁に、生命を脅かす副作用を生じることである。さらに、これらのアプローチは頻繁に、非常に高い不全／寛解率（９０％まで；ガンの型に依存する）を有する。
多くの他の方法は、ガン性細胞を排除するために個々自体の免疫系を支持または増大するために試みられている。例えば、ある科学者達は、腫瘍細胞を破壊する免疫系を刺激するために、アジュバントとして細菌性成分またはウイルス性成分を利用している。そのような薬剤は、動物腫瘍モデルにおけるアジュバントとして、および非特異的刺激剤として有用であるが、なお、ヒトにおいて一般に有効であると判明していない。
リンホカインもまた、免疫応答の生成において、特定の免疫細胞を刺激するか、またはそれに影響を及ぼすために、ガン（ならびに、ウイルス性疾患および寄生虫性疾患）の処置において利用されてきている。例えば、あるグループは、腫瘍細胞に対して細胞傷害性である大量の細胞を拡大および生成するために、末梢血細胞を刺激するために、リンホカインインターロイキン−２を利用した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：１４８５〜１４９２，１９８５）。
他のグループは、腫瘍細胞を特異的に標的化し、そして殺傷するために、特定のモノクローナル抗体または「マジック弾丸（ｍａｇｉｃ ｂｕｌｌｅｔ）」を使用する抗体媒介処置の使用を示唆している（Ｄｉｌｌｍａｎ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｏｌｄｈａｍ（編），Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）。しかし、１つ困難は、ほとんどのモノクローナル抗体はマウス由来であり、従って、マウス抗体に対する過敏症は、反復される治療後に特にその効力を限定し得ることである。共通の副作用は、発熱、発汗、および悪寒、皮膚発疹、関節炎、および神経麻痺を含む。
最近、有意な利益を得ている１つのアプローチは、遺伝子治療の使用であり、これは、遺伝子疾患だけではなく、同様にウイルス性疾患およびガン性疾患を処置するために利用されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０２８０５、ＥＰ０ ４１５，７３１、およびＷＯ９０／０７９３６を参照のこと）。簡便には、ウイルスに由来する特別に設計されたベクターを用いて、特定の遺伝情報を細胞に送達する。そのような遺伝情報は、それ自体で、損傷しているタンパク質または抗原の発現をブロックするために有用であり得（例えば、アンチセンス治療）、毒性であり、そして選択された細胞を殺傷するタンパク質をコードし得、細胞の免疫応答を支持する治療用タンパク質をコードし得、または不活性タンパク質もしくは非存在タンパク質の代わりとなるタンパク質をコードし得る。
そのような治療における使用が最近示唆されている１つのタンパク質は、１型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ−１）である。簡便には、チミジンキナーゼは、天然のヌクレオシド基質ならびにヌクレオシドアナログをリン酸化する再利用経路酵素である（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７１：２９７９〜２９８７，１９９０を参照のこと）。このタンパク質は、タンパク質を発現するレトロウイルスベクターを細胞に導入すること、続いてアシクロビルまたはガンシクロビルのようなヌクレオシドアナログの投与によって治療用に利用され得る。次いで、ＨＳＶＴＫ−１は、ヌクレオシドアナログをリン酸化し、宿主細胞を殺傷し得る毒性産物を作製する。従って、ＨＳＶＴＫを発現するレトロウイルスベクターの使用は、ガンの処置だけではなく、同様に他の疾患についても示唆されている。
国際公開第９１／０２８０５号パンフレット 欧州特許第０ ４１５，７３１号明細書 国際公開第９０／０７９３６号パンフレット Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：１４８５〜１４９２，１９８５ Ｄｉｌｌｍａｎ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｏｌｄｈａｍ（編），Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７１：２９７９〜２９８７，１９９０
本発明は、種々の適用（例えば、遺伝子治療）のために適切である増強された生物学的活性を有する新規なチミジンキナーゼ変異体およびＴＫ融合タンパク質を提供し、そしてさらに、他の関連する利益を提供する。
（発明の要旨）
手短に述べると、本発明は、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（ヘルペスウイルス科）のチミジンキナーゼ変異体を利用する組成物および方法を提供する。本発明の１つの局面において、１つ以上の変異を有する、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子が提供される。ここで、アミノ酸置換をコードする、少なくとも１つの変異がＱ基質結合ドメイン内に位置し、ここで、その変異は、そのチミジンキナーゼの生物学的活性を、非変異型チミジンキナーゼと比較して上昇させる。本発明の別の局面において、少なくとも３つの変異（この３つの変異のうち少なくとも２つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端に向って位置する（例えば、Ｎ末端に向って１、２、または３アミノ酸）アミノ酸置換である）、ならびに変異をしていないチミジンキナーゼと比較してチミジンキナーゼの生物学的活性を上昇させる、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端に向って位置する（例えば、Ｃ末端に向って４または５アミノ酸）少なくとも１つの変異を含む、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子が提供される。適切なＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素の代表例は、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、単純ヘルペスウイルス２型チミジンキナーゼ、水痘帯状ウイルスチミジンキナーゼ、およびマモセットヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス１型、仮性狂犬病ウイルス、ウマヘルペスウイルス１型、ウシヘルペスウイルス１型、シチメンチョウヘルペスウイルス、マレック病ウイルス、リスザルヘルペスウイルスおよびエプスタインバーウイルスのチミジンキナーゼを含む。別の実施態様では、このチミジンキナーゼは、霊長類ヘヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたは非霊長類ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（例えば、トリヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）であり得る。
広範な種々の変異が本発明の状況において意図される。例えば、アミノ酸置換のような、１つの実施態様では、変異はＱ基質結合ドメインおよびＮ末端に向ってこのドメインからさらに１１アミノ酸を含む領域内に生じ得る。
他の実施態様では、少なくとも１つの変異が、この「拡大」Ｑ基質結合ドメイン内またはＱ基質結合ドメイン内に生じ、そして少なくとも１つの変異がこれらの２つの領域の外側に存在する。例えば、１つ以上のさらなる変異がＤＲＨヌクレオチド結合ドメイン内に存在し得、これは、そのチミジンキナーゼの生物学的活性を、非変異型チミジンキナーゼと比較して上昇させる。例えば、グルタミン酸を、ＤＲＨヌクレオシド結合部位におけるアスパラギン酸と置換し得るか、またはヒスチジン残基を、ＤＲＨヌクレオシド結合部位におけるアルギニンと置換し得る。
さらに別の局面では、Ｑ基質結合ドメイン内（または、拡大Ｑ基質結合ドメイン内）に少なくとも１つの変異（例えば、アミノ酸置換）、ならびにＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端に向って（例えば、Ｃ末端に向って４、５または６アミノ酸）位置するアミノ酸置換である少なくとも１つの変異を含むＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子が、提供される。これは、非変異型チミジンキナーゼと比較してそのチミジンキナーゼの生物学的活性を上昇させる。
あるいは、さらなる変異は、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端に向って１〜７アミノ酸に位置する１つ以上のアミノ酸置換をコードし得る。例えば、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端に向って１位であるアミノ酸を、バリン、ロイシン、システインおよびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸と置換する。別の実施態様では、アミノ酸であるアラニンを、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端に向って７アミノ酸に存在するアミノ酸と置換する。他の実施態様では、このチミジンキナーゼ酵素は短縮され、そしてなお生物学的活性を保持する。
本発明のさらなる実施態様では、野生型チミジンキナーゼ酵素によるヌクレオシドアナログのリン酸化に対して少なくとも１倍の、ヌクレオシドアナログ（例えば、アシクロビルまたはガンシクロビル）をリン酸化し得るチミジンキナーゼ酵素をコードする、単離された核酸分子が提供される。他の実施態様では、チミジンキナーゼ酵素は、野生型チミジンキナーゼ酵素によるヌクレオシドアナログのリン酸化に対して少なくともｘ倍ヌクレオシドアナログをリン酸化し、ここで、ｘは、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、および５からなる群より選択される。さらに別の実施態様では、チミジンキナーゼ酵素は、ヌクレオシドアナログをリン酸化し得、ここで、
Figure 2008301828
 であり、そしてＴＫmＮＡpがチミジンキナーゼ変異体のヌクレオシドアナログのリン酸化速度であり、ＴＫmＴpは、チミジンキナーゼ変異体によるチミジンのリン酸化速度であり、ＴＫwtＮＡpは、非変異型チミジンキナーゼ酵素によるヌクレオシドアナログのリン酸化速度であり、ＴＫwtＴpは、非変異型チミジンキナーゼ酵素によるチミジンキナーゼ酵素のリン酸化速度であり、そしてｚは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、および５からなる群より選択される。適切なヌクレオシドアナログの代表例は、ガンシクロビル、アシクロビル、ファムシクロビル、ブシクロビル、ペンシクロビル、バルシクロビル、トリフロオロチミジン、１−［２−デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａＴ １−β−Ｄ−アラビノフラノキシルチミジン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ、ジデオキシシチジン、およびＡｒａＣを含む。
ヌクレオシドアナログのリン酸化の増加のための特に好ましい変異体チミジンキナーゼには、その酵素が１型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであるものが含まれる。
本発明の他の局面において、上述の核酸分子によってコードされる変異体チミジンキナーゼ酵素が、そのような分子を発現し得るベクターと同様に提供される。１つの局面において、本発明の核酸分子に作動可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターが提供される。好ましい局面において、そのベクターは、上述の核酸分子の発現を指向し得るウイルスベクターである。そのようなウイルスベクターの代表例は、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスベクター、パルボウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。別の局面では、１つ以上の変異（この変異の少なくとも１つは、非変異型チミジンキナーゼと比較して、チミジンキナーゼの生物学的活性を上昇させるアミノ酸置換をコードする）を含むウイルスチミジンキナーゼ酵素をコードする核酸分子の発現を指向し得るウイルスベクターが提供される。
広範な種々のプロモーターが本発明において利用され得、これには、例えば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ，ＲＳＶ ＬＴＲ、フレンドＭｕＬｖ ＬＴＲ，アデノウイルスプロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼプロモーター／エンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター、ヘルペスＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ遺伝子エンハンサー／プロモーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、サイトメガロウイルス前後期プロモーター（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｌａｔｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ならびに組織特異的プロモーター（例えば、チロシナーゼ関連プロモーター（ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２）、ＤＦ３エンハンサー、ＳＬＰＩプロモーター（分泌ロイコプロテアーゼインヒビター−これは多くの型のガンにおいて発現される）、ＴＲＳ（組織特異的調節配列）、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、脂肪細胞Ｐ２プロモーター、ＰＥＰＣＫプロモーター、ＣＥＡプロモーター、αフェトプロテインプロモーター、乳清酸性プロモーター（ｗｈｅｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、およびカゼインプロモーターが含まれる。関連する局面において、上述のベクターは、薬学的組成物として、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤とともに提供され得る。
本発明はさらに、チミジンキナーゼ部分およびグアニル酸キナーゼ部分を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。このような融合タンパク質は、チミジンキナーゼおよびグアニル酸キナーゼの両方の生物学的活性を有する。チミジンキナーゼ部分は、野生型チミジンキナーゼまたは本明細書に記載のチミジンキナーゼ変異体の１つに由来し得る。
さらなる局面において、チミジンキナーゼ変異体、チミジンキナーゼ融合タンパク質、または本明細書において記載したグアニル酸キナーゼ活性およびチミジンキナーゼ活性を有する融合タンパク質をコードする配列は、遺伝子治療の目的のために利用される所定のベクター内に含まれ得る。次いで、これらのベクターを含む細胞は、複製適合性のウイルスの形成またはそのベクターの宿主細胞への異所性組込みを妨害するために、ヌクレオシドアナログの投与によって殺傷され得る。このような組成物または方法は、遺伝子治療に対する「自殺ベクター」または「フェールセーフ」アプローチと称される。
本発明の他の局面では、上述のベクターの１つを有する宿主細胞が提供される。このような細胞の代表例は、ヒト細胞、イヌ細胞、サル細胞、ラット細胞およびマウス細胞を含む。
本発明の他の局面では、温血動物において病原因子を阻害するための方法が提供され、これは、その病原因子が阻害されるように温血動物に上記に記載のようなベクターを投与する工程を包含する。種々の実施態様では、このベクターは、インビボで、またはエキソビボで細胞に投与され得、これは次いで、動物に移植（または再移植）される。他の実施態様では、病原因子は、ウイルス、細菌、寄生動物、腫瘍細胞または自己反応性免疫細胞であり得る。
本発明の他の局面では、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ活性の活性を非侵襲的にモニターする（例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを用いた遺伝子治療の進行をモニターするために）ための方法が提供される。このような方法に従って、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを含むベクターを受けた被験体は、そのチミジンキナーゼについての基質である放射標識抗ウイルス薬物について（例えば、臨床用ガンマカメラまたは単一光子発光断層撮影による）スキャンされる。
本発明は、例えば、上記課題を解決するために、以下の手段を提供する：
（項目１）Ｑ基質結合ドメイン内に少なくとも１つの変異を含むＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子であって、ここで該変異は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、該チミジンキナーゼの生物学的活性を増大させる、核酸分子。
（項目２）少なくとも３つの変異を含むＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子であって、該変異のうちの少なくとも２つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向に１、２、または３アミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードし、そして該変異のうちの少なくとも１つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向に、４または５アミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードし、ここで、該変異は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、該チミジンキナーゼの生物学的活性を増大させる、核酸分子。
（項目３）項目１に記載の単離された核酸分子であって、ＤＲＨヌクレオシド結合部位内のアミノ酸置換である少なくとも１つの変異をさらに含む、核酸分子。
（項目４）項目１に記載の単離された核酸分子であって、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向に、４、５、または６アミノ酸に位置するアミノ酸置換である少なくとも１つの変異をさらに含む、核酸分子。
（項目５）項目１に記載のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子であって、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向に１〜７アミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードする少なくとも１つの変異をさらに含む、核酸分子。
（項目６）項目１〜５のいずれか１項に記載のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子であって、ここで該チミジンキナーゼは、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、および単純ヘルペスウイルス２型チミジンキナーゼからなる群から選択される、核酸分子。
（項目７）項目１または２に記載のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子であって、ここで該酵素は、短縮型であるか、またはインフレーム欠失を含む、核酸分子。
（項目８）項目１または２に記載のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子であって、ここで該チミジンキナーゼ酵素は、野性型チミジンキナーゼ酵素による前記ヌクレオシドアナログのリン酸化の少なくとも１倍でヌクレオシドアナログをリン酸化し得る、核酸分子。
（項目９）項目８に記載の単離された核酸分子であって、ここで該ヌクレオシドアナログは、ガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａＴ １−β−Ｄ−アラビノフラノキシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ、ジデオキシシチジン、およびＡｒａＣからなる群より選択される、核酸分子。
（項目１０）項目１または２に記載のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子であって、ここで該チミジンキナーゼ酵素は、ヌクレオシドアナログをリン酸化し得、そして以下：
Figure 2008301828
であり、
ここでＴＫ m ＮＡ p は、チミジンキナーゼ変異体によるヌクレオシドアナログのリン酸化の速度であり、ＴＫ m Ｔ p は、チミジンキナーゼ変異体によるチミジンのリン酸化の速度であり、ＴＫ wt ＮＡ p は、非変異型チミジンキナーゼ酵素によるヌクレオシドアナログのリン酸化の速度であり、ＴＫ wt Ｔ p は、非変異型チミジンキナーゼ酵素によるチミジンキナーゼ酵素のリン酸化の速度であり、そしてｚは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、および５からなる群より選択される、
核酸分子。
（項目１１）項目１０に記載の単離された核酸分子であって、ここで前記ヌクレオシドアナログは、ガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａＴ １−β−Ｄ−アラビノフラノキシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ、ジデオキシシチジン、およびＡｒａＣからなる群より選択される、核酸分子。
（項目１２）項目１〜１１のいずれか１項に記載の核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターを含む、発現ベクター。
（項目１３）項目１２に記載の発現ベクターであって、ここで前記プロモーターは、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス前後期プロモーターからなる群より選択される、ベクター。
（項目１４）前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、項目１３に記載の発現ベクター。
（項目１５）項目１４に記載の発現ベクターであって、ここで前記組織特異的プロモーターが、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、脂肪細胞Ｐ２プロモーター、ＰＥＰＣＫプロモーター、αフェトプロテインプロモーター、乳清酸性プロモーター、およびカゼインプロモーターからなる群より選択される、ベクター。
（項目１６）グアニル酸キナーゼ部分およびチミジンキナーゼ部分を含む融合タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、ここで該融合タンパク質は、グアニル酸キナーゼの生物学的活性およびチミジンキナーゼの生物学的活性を有し、ここで該チミジンキナーゼ部分は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、増加した生物学的活性を有するＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼまたは変異Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼのいずれかである、核酸分子。
（項目１７）前記グアニル酸キナーゼ部分および前記チミジンキナーゼ部分のうちの少なくとも１つが短縮型である、項目１６に記載の単離された核酸分子。
（項目１８）前記グアニル酸キナーゼ部分が哺乳動物グアニル酸キナーゼである、項目１６に記載の単離された核酸分子。
（項目１９）前記哺乳動物グアニル酸キナーゼ部分が、マウスグアニル酸キナーゼまたはヒトグアニル酸キナーゼである、項目１８に記載の単離された核酸分子。
（項目２０）項目１６に記載の単離された核酸分子であって、ここで前記変異チミジンキナーゼは、１つ以上の変異を含む酵素であり、該変異の少なくとも１つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向に位置するアミノ酸置換をコードする、核酸分子。
（項目２１）項目１６に記載の単離された核酸分子であって、ここで前記変異チミジンキナーゼは、１つ以上の変異を含む酵素であり、該変異の少なくとも１つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位内のアミノ酸置換である、核酸分子。
（項目２２）項目１６に記載の単離された核酸分子であって、ここで前記変異チミジンキナーゼは、少なくとも３つの変異を含む酵素であり、該変異の少なくとも２つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向に１、２、または３のアミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードし、そして該変異の少なくとも１つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向に４または５のアミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードする、核酸分子。
（項目２３）前記変異チミジンキナーゼが、Ｑ基質結合ドメイン中に少なくとも１つの変異を含む酵素である、項目２０に記載の単離された核酸分子。
（項目２４）前記チミジンキナーゼが、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼおよび単純ヘルペスウイルス２型チミジンキナーゼからなる群より選択される、項目１６に記載の単離された核酸分子。
（項目２５）項目１６に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目２６）前記核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターをさらに含む、項目２５に記載の発現ベクター。
（項目２７）項目１〜１１、および１６のいずれか１項に記載の核酸分子の発現を指向し得る、ウイルスベクター。
（項目２８）項目２７に記載のウイルスベクターであって、ここで該ベクターが、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターからなる群から選択される、ベクター。
（項目２９）項目２７に記載のベクターを有する、宿主細胞。
（項目３０）項目２９に記載の宿主細胞であって、ここで該細胞が、ヒト細胞、イヌ細胞、サル細胞、ラット細胞、およびマウス細胞からなる群から選択される、宿主細胞。
（項目３１）少なくとも３つの変異を含む単離されたＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、該変異のうちの少なくとも２つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向に１、２、または３アミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードし、そして該変異のうちの少なくとも１つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向に４または５アミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードし、ここで、該変異は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、該チミジンキナーゼの生物学的活性を増大させる、酵素。
（項目３２）Ｑ基質結合ドメイン中に少なくとも１つの変異を含む単離されたＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ここで該変異は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、該チミジンキナーゼの生物学的活性を増大する、酵素。
（項目３３）項目３２に記載の単離されたＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ＤＲＨヌクレオシド結合部位内のアミノ酸置換である少なくとも１つの変異をさらに含む、酵素。
（項目３４）項目３２に記載の単離されたＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向に４、５、または６アミノ酸に位置するアミノ酸置換である少なくとも１つの変異をさらに含む、酵素。
（項目３５）項目３２に記載の単離されたＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向に１〜７アミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードする少なくとも１つの変異をさらに含む、酵素。
（項目３６）項目３１〜３５のいずれか１項に記載の単離されたＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ここで該チミジンキナーゼは、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、および単純ヘルペスウイルス２型チミジンキナーゼからなる群より選択される、酵素。
（項目３７）項目３１または３２に記載の単離されたＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ここで該酵素は、短縮型であるか、またはインフレーム欠失を含む、酵素。
（項目３８）項目３１または３２に記載の単離されたＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ここで該チミジンキナーゼ酵素は、野性型チミジンキナーゼ酵素による前記ヌクレオシドアナログのリン酸化の少なくとも１倍でヌクレオシドアナログをリン酸化し得る、酵素。
（項目３９）項目３８に記載の単離されたＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ここで該ヌクレオシドアナログは、ガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａＴ １−β−Ｄ−アラビノフラノキシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ、ジデオキシシチジン、およびＡｒａＣからなる群より選択される、酵素。
（項目４０）項目３１または３２に記載のＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ここで該チミジンキナーゼ酵素は、ヌクレオシドアナログをリン酸化し得、そして以下：
Figure 2008301828
であり、
ここでＴＫ m ＮＡ p は、チミジンキナーゼ変異体によるヌクレオシドアナログのリン酸化の速度であり、ＴＫ m Ｔ p は、チミジンキナーゼ変異体によるチミジンのリン酸化の速度であり、ＴＫ wt ＮＡ p は、非変異型チミジンキナーゼ酵素によるヌクレオシドアナログのリン酸化の速度であり、ＴＫ wt Ｔ P は、非変異型チミジンキナーゼ酵素によるチミジンキナーゼ酵素のリン酸化の速度であり、そしてｚは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、および５からなる群より選択される、酵素。
（項目４１）項目４０に記載のＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素であって、ここで前記ヌクレオシドアナログは、ガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａＴ １−β−Ｄ−アラビノフラノキシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ、ジデオキシシチジン、およびＡｒａＣからなる群より選択される、酵素。
（項目４２）グアニル酸キナーゼ部分およびチミジンキナーゼ部分を含む融合タンパク質であって、ここで該融合タンパク質は、該グアニル酸キナーゼの生物学的活性および該チミジンキナーゼの生物学的活性を有し、ここで該チミジンキナーゼ部分は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、増加した生物学的活性を有するＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼまたは変異Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼのいずれかである、タンパク質。
（項目４３）前記グアニル酸キナーゼ部分および前記チミジンキナーゼ部分のうちの少なくとも１つが短縮型である、項目４２に記載の融合タンパク質。
（項目４４）前記グアニル酸キナーゼ部分が哺乳動物グアニル酸キナーゼである、項目４２に記載の融合タンパク質。
（項目４５）前記哺乳動物グアニル酸キナーゼ部分が、マウスグアニル酸キナーゼまたはヒトグアニル酸キナーゼである、項目４４に記載の融合タンパク質。
（項目４６）項目４２に記載の融合タンパク質であって、ここで前記変異チミジンキナーゼは、１つ以上の変異を含む酵素であり、該変異の少なくとも１つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向に位置するアミノ酸置換をコードする、タンパク質。
（項目４７）項目４２に記載の融合タンパク質であって、ここで前記変異チミジンキナーゼは、１つ以上の変異を含む酵素であり、該変異の少なくとも１つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位内のアミノ酸置換である、タンパク質。
（項目４８）項目４２に記載の融合タンパク質であって、ここで前記変異チミジンキナーゼは、少なくとも３つの変異を含む酵素であり、該変異の少なくとも２つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向に１、２、または３のアミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードし、そして該変異の少なくとも１つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向に４または５のアミノ酸に位置するアミノ酸置換をコードする、タンパク質。
（項目４９）前記変異チミジンキナーゼが、Ｑ基質結合ドメイン中に少なくとも１つの変異を含む酵素である、項目４６に記載の融合タンパク質。
（項目５０）前記チミジンキナーゼが、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼおよび単純ヘルペスウイルス２型チミジンキナーゼからなる群より選択される、項目４２に記載の融合タンパク質。
（項目５１）温血動物における病原性因子を阻害する方法であって、該病原性因子が阻害されるように、項目２７に記載のベクターを温血動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目５２）前記ベクターがインビボで投与される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）前記病原性因子が、ウイルス、細菌、および寄生虫からなる群より選択される、項目５１に記載の方法。
（項目５４）前記病原性因子が腫瘍細胞である、項目５１に記載の方法。
（項目５５）前記病原性因子が自己反応性免疫細胞である、項目５１に記載の方法。
（項目５６）ヌクレオシドアナログを投与する工程をさらに包含する、項目５１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）項目５６に記載の方法であって、ここで前記ヌクレオシドアナログは、ガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａＴ １−β−Ｄ−アラビノフラノキシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ、ジデオキシシチジン、およびＡｒａＣからなる群より選択される、方法。
（項目５８）項目２７に記載のベクター、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
（項目５９）薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤とともに、項目２９に記載の宿主細胞を含む、薬学的組成物。
（項目６０）ベクターを受けた被験体における遺伝子治療の進行をモニタリングするための方法であって、該ベクターは、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素をコードする項目１または項目２のいずれかに記載の核酸分子および該チミジンキナーゼについての基質である放射標識した抗ウイルス性薬物を含み、該方法は、該放射標識された抗ウイルス性薬物の存在について該被験体を調べる工程を包含する、方法。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の発明の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。さらに、種々の参考文献が以下に示され、それらは、より詳細な特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）を記載し、そしてその全体が本明細書において参考として援用される。
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明の開示の前に、本明細書で以下に使用される特定の用語の定義をまず示すことは本発明の理解の助けとなり得る。
「ベクター」とは、変異体ｔｋ遺伝子ならびに任意の目的のさらなる配列もしくは遺伝子の発現を指向し得る集合体をいう。ベクターは、転写プロモーター／エンハンサーエレメント、ならびに転写されたときにｔｋ遺伝子および／または他の目的の遺伝子と作動可能に連結される別の配列を含まなければならない。ベクターは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）またはその２つの組合せ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）のいずれかから構成され得る。必要に応じて、ベクターは、ポリアデニル化配列、１つ以上の制限部位、ならびに１つ以上の選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）を含み得る。さらに、選択された宿主細胞および使用されるベクターに依存して、複製起点、さらなる核酸制限部位、エンハンサー、転写の誘導性を付与する配列および選択マーカーのような他の遺伝エレメントもまた、本明細書において記載されるベクターに取り込まれ得る。
「組織特異的プロモーター」とは、限定数の組織においてまたは単一の組織において遺伝子発現を制御する転写プロモーター／エンハンサーエレメントをいう。組織特異的プロモーターの代表例は、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、脂肪細胞Ｐ２プロモーター、ＰＥＰＣＫプロモーター、αフェトプロテインプロモーター、乳清酸性プロモーターおよびカゼインプロモーターを含む。
「チミジンキナーゼの生物学的活性」とは、そのチミジンキナーゼ酵素がヌクレオシド（例えば、ｄＴ）およびヌクレオシドアナログ（例えば、ガンシクロビル（９−｛［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシメチル｝グアノシン）、ファムシクロビル、ブシクロビル、ペンシクロビル、バルシクロビル、アシクロビル（９−［２−ヒドロキシ−エトキシ）メチル］グアノシン）、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル］、ａｒａ−Ａ（アデノシンアラビノシド、ビバラビン）、１−β−Ｄ−アラビノフラノキシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン（５−ヨード−２’−デオキシウリジン）、ＡＺＴ（３’アジド−３’チミジン）、ｄｄＣ（ジデオキシシチジン）、ＡＩＵ（５−ヨード−５’アミノ２’、５’−ジデオキシウリジン）、およびＡｒａＣ（シチジンアラビノシド））をリン酸化する能力をいう。本明細書において使用される場合、チミジンキナーゼ変異体は、活性のレベルまたは速度が、非変異型チミジンキナーゼに対して少なくとも「ｙ」倍（ここで、ｙは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、および５からなる群より選択される）上昇する場合「上昇した生物学的活性」を有するとみなされる。好ましい実施態様では、チミジンキナーゼ変異体は、以下の式：
Figure 2008301828
 である場合に上昇した生物学的活性を有するとみなされる。ここで、ＴＫmＮＡpがチミジンキナーゼ変異体のヌクレオシドアナログのリン酸化速度であり、ＴＫmＴpは、チミジンキナーゼ変異体によるチミジンのリン酸化速度であり、ＴＫwtＮＡpは、非変異型チミジンキナーゼ酵素によるヌクレオシドアナログのリン酸化速度であり、ＴＫwtＴpは、非変異型チミジンキナーゼによるチミジンキナーゼ酵素のリン酸化速度であり、そしてｚは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、および５からなる群より選択される。
「グアニル酸キナーゼの生物学的活性」とは、グアニル酸キナーゼ酵素がＡＴＰの末端リン酸基をＧＭＰもしくはｄＧＭＰのようなアクセプター分子への可逆性の転移を触媒する能力をいう。グアニル酸キナーゼ（ｇｍｋ）はまた、チミジンキナーゼによってリン酸化されたヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログをリン酸化し得る。チミジンキナーゼ基質の例は上記に記載する。
チミジンキナーゼおよびグアニル酸キナーゼがヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログをリン酸化する能力に加えて、用語「生物学的活性」はまた、タンパク質安定性（例えば、トリプシンのような酵素によるタンパク質加水分解酵素分解に対する耐性によって測定されるように）、および熱安定性（例えば、温度の上昇に際してヌクレオシドアナログのリン酸化の維持）のような、これらの酵素の他の生物学的活性をいうことが理解されるべきである。
「病原因子」とは、疾患状態を担う外来生物、または疾患状態を担う「変化した」細胞のいずれかをいう。病原性因子の代表例は、ウイルス、細菌および寄生生物のような外来生物、ならびに腫瘍細胞および自己反応性免疫細胞のような変化した細胞を含む。本明細書において利用される場合、病原因子は、その病原因子の増殖または拡散が遅延するかまたはその病原因子が破壊される場合に、「阻害」されるとみなされる。
上記に記したように、本発明は、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ変異体を利用する組成物および方法を提供する。手短には、本発明のチミジンキナーゼ変異体は、広範な種々のＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼから調製され得、これには、例えば、霊長類ヘルペスウイルスおよび非霊長類ヘルペスウイルス（例えば、トリヘルペスウイルス）の両方が含まれる。適切なヘルペスウイルスの代表例は、単純ヘルペスウイルス１型（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ８：５９４９−５９６４、１９８０）、単純ヘルペスウイルス２型（ＳｗａｉｎおよびＧａｌｌｏｗａｙ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：１０４５−１０５０、１９８３）、水痘帯状ウイルス（ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１７５９−１８１６、１９８６）、マモセットヘルペスウイルス（ＯｔｓｕｋａおよびＫｉｔ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３５：３１６−３３０、１９８４）、ネコヘルペスウイルス１型（Ｎｕｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３２４０−３２４９、１９８９）、仮性狂犬病ウイルス（ＫｉｔおよびＫｉｔ、米国特許第４，５１４，４９７号、１９８５）、ウマヘルペスウイルス１型（ＲｏｂｅｒｔｓｏｎおよびＷｈａｌｌｅｙ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１１３０３−１１３１７、１９８８）、ウシヘルペスウイルス１型（ＭｉｔｔａｌおよびＦｉｅｌｄ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：２９０１−２９１８、１９８９）、シチメンチョウヘルペスウイルス（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２８４７−２８５２、１９８９）、マレック病ウイルス（Ｓｃｏｔｔら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３０５５−３０６５、１９８９）、リスザルヘルペスウイルス（Ｈｏｎｅｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３００３−３０１３、１９８９）、およびエプスタインバールウイルス（Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１０：２０７−３１１、１９８４）を含む。
そのようなヘルペスウイルスは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような商業的供給源から容易に入手し得る。特定の上記のヘルペスウイルスの寄託物は、ＡＴＣＣから容易に入手し得、例えば：ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５３９（単純ヘルペス１型）；ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７３４およびＶＲ−５４０（単純ヘルペス２型）；ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５８６（水痘帯状ウイルス）；ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７８３（感染性喉頭気管炎）；ＡＴＣＣ番号ＶＲ−６２４、ＶＲ−９８７、ＶＲ−２１０３、ＶＲ−２００１、ＶＲ−２００２、ＶＲ−２１７５、ＶＲ−５８５（マレック病ウイルス）；ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５８４ＢおよびＶＲ−５８４Ｂ（シチメンチョウヘルペスウイルス）；ＡＴＣＣ番号ＶＲ−６３１およびＶＲ−８４２（ウシヘルペスウイルスＩ型）；ならびにＡＴＣＣ番号ＶＲ−２００３、ＶＲ−２２２９およびＶＲ−７００（ウマヘルペスウイルス１型）。ヘルペスウイルスはまた、天然に存在する供給源から（例えば、感染した動物から）、容易に単離および同定され得る。
任意の上記に引用したヘルペスウイルス（ならびにＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅの他のメンバー）は、本発明のチミジンキナーゼ変異体を調製するために容易に利用され得る。手短には、ヌクレオシド結合を担うと考えられる１つの一次領域が部位３および４の周囲の領域に見出される（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７１：２９７９−２９８７、１９９０）。これらの部位は、高度に保存された領域によって特徴付けられ、そしてモチーフＤＲＨ（部位３について）、およびＣ（Ｙ／Ｆ）Ｐ（部位４について）からなる。核酸の番号付けは、本明細書において利用されるように、ヘルペスウイルスごとに実質的に変化し得るので、ＤＲＨヌクレオチド結合部位に対する位置に対して参照がなされる。例えば、単純ヘルペスウイルス１型（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．８：５９４９−５９６４、１９８０）、この部位は、アミノ酸１６２，１６３および１６４において見い出され得る。他の代表的なヘルペスウイルスについてのＤＲＨヌクレオシド結合部位は：単純ヘルペスウイルス２型について１６３、１６４、および１６５；水痘帯状ウイルスについて１２９，１３０および１３１；マモセットヘルペスウイルスについて１３０、１３１および１３２；エプスタインバールウイルスについて１４８、１４９および１５０を含む。
これまでに配列決定されていないヘルペスウイルスについて、ＤＲＨヌクレオシド結合部位は、その酵素をコードする核酸配列を配列決定することによるか、またはその酵素自身をアミノ酸配列決定すること、続いて、他の公知のヘルペスウイルス配列に対してその配列を整列することによって容易に同定され得る（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，同上）。１より多いＤＲＨモチーフが同定される程度に、適切なモチーフが、例えば、結晶構造解析によって（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２：９１７−９１９、１９８８；Ｍｏｎｔｆｏｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９（３０）：６９６４−６９７７、１９９０；Ｈａｒｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４８−４５５、１９８７）、または架橋研究（Ｋｎｏｌｌら、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１２１：２５２−２６０、１９９２）によって容易に同定され得る。
次いで、選択したヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、そのチミジンキナーゼの生物学的活性を上昇させる１つ以上の変異を含むチミジンキナーゼ酵素をコードする核酸分子を構築するために、以下に記載されるように容易に単離および変異され得る。本明細書において利用される場合、「非変異型チミジンキナーゼ」とは、ＭｃＫｎｉｇｈｔら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：５９４９−５９６４、１９８０）によって記載されるようなネイティブまたは野生型のチミジンキナーゼをいうことが理解されるべきである。そのようなキナーゼの生物学的活性は、本明細書に記載される任意のアッセイ（例えば、ヌクレオシドアナログの取り込み速度の決定、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログのリン酸化速度の決定（実施例２〜４を参照のこと）を含む）を利用して容易に決定され得る。さらに、熱安定性（実施例２〜４を参照のこと）およびタンパク質安定性のような他の生物学的特性によって特徴付けられるチミジンキナーゼ変異体が容易に選択され得る。
広範な種々のチミジンキナーゼ変異体が本発明の範囲内として意図される。例えば、本発明の１つの実施態様において、１つ以上の変異（この少なくとも１つの変異はＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端に向って位置するアミノ酸置換をコードする）を含むＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子が提供される。手短には、ＤＲＨヌクレオシド結合部位のＮ末端に向って任意のアミノ酸位置が本明細書において提供される開示を考慮して別のアミノ酸と置換され得る。置換され得る代表的なアミノ酸（およびそれらの１文字シンボル）は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含む。
例えば、本発明の１つの実施態様では、少なくとも３つの変異（このうち少なくとも２つは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端に向って（例えば、Ｎ末端に向って１，２、または３アミノ酸））位置するアミノ酸置換、および非変異型チミジンキナーゼと比較してチミジンキナーゼの生物学的活性を上昇させる、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端に向って（例えば、Ｃ末端に向って４または５アミノ酸）位置する少なくとも１つの変異を含む、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼ酵素をコードする、単離された核酸分子が提供される。手短には、これらの位置のいずれかにおけるアミノ酸が本明細書に提供される開示を考慮して別のアミノ酸と置換され得る。置換され得る代表的なアミノ酸（およびそれらの１文字シンボル）は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含む。ＤＲＨ部位からＮ末端に向って少なくとも２つの変異、およびＤＲＨ部位からＣ末端に向って少なくとも１つの変異を有するＴＫ変異体に関しては、野生型配列のアミノ酸を置換し得る好ましいアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含む。
本発明の別の実施態様では、Ｑ基質結合ドメイン内に１つ以上のアミノ酸置換を有するか、またはＱ基質結合ドメインおよびＮ末端に向って位置するさらなる１１アミノ酸残基を含む拡大領域（「拡大したＱ基質結合ドメイン」）内に１つ以上のアミノ酸置換を有するかのいずれかのチミジンキナーゼ変異体をコードする核酸分子が提供される。置換され得る代表的なアミノ酸（およびそれらの１文字シンボル）は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）を含む。
別の実施態様では、Ｑ基質結合ドメイン内にまたは拡大されたＱ基質結合ドメイン内に１つ以上のアミノ酸置換、およびＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端に向って２〜６位に位置する、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有するチミジンキナーゼ変異体をコードする核酸分子が提供される。置換され得る代表的なアミノ酸は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含む。
別の実施態様では、Ｑ基質結合ドメイン内にまたは拡大Ｑ基質結合ドメイン内に１つ以上のアミノ酸置換、およびＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端に向って７位に位置する、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有するチミジンキナーゼ変異体をコードする核酸分子が提供される。置換され得る代表的なアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含む。
本発明の別の局面では、Ｑ基質結合ドメイン内にまたは拡大Ｑ基質結合ドメイン内に１つ以上のアミノ酸置換、およびＤｅｄｉｅｕら、国際公開番号ＷＯ９５／１４１０２（これは、本明細書において参考として援用される）によって記載されるような少なくとも１つのさらなる変異を有するチミジンキナーゼ変異体をコードする核酸分子が提供される。
本発明の別の局面において、このＱ基質結合ドメイン内、または拡大したＱ基質結合ドメイン内での１以上のアミノ酸の置換、およびＤＲＨヌクレオチド結合部位内の少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を有するチミジンキナーゼ変異体をコードする核酸分子が提供される。本発明の１つの実施態様において、このＤＲＨヌクレオチド結合部位におけるアスパラギン酸は、他のアミノ酸で置換され、例えば、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含む。本発明の別の実施態様において、このＤＲＨヌクレオチド結合部位におけるアルギニンは他のアミノ酸で置換され、例えばアラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含む。
本発明の他の局面において、チミジンキナーゼ酵素の生物学的活性を増加させる２以上の変異を含むチミジンキナーゼ酵素をコードする核酸分子が提供される。ここでこの変異体はＱ基質結合ドメイン内、または拡大したＱ基質結合ドメイン内に１以上のアミノ酸置換を有し、そして１以上のアミノ酸置換はＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向の１、２、または３アミノ酸に位置し、そして／あるいは１以上のアミノ酸置換はＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向の４、５、または６アミノ酸に位置し、またはＣＹＰヌクレオシド結合部位からＮ末端方向の１、２、または３アミノ酸に位置する（図１４を参照のこと）。
本発明のさらに別の実施態様において、チミジンキナーゼ変異体は、Ｑ基質結合ドメイン内または拡大したＱ基質結合ドメイン内の１以上のアミノ酸置換を有することによって、および任意の他のアミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）およびバリン（Ｖ）を含む）で置換されたＤＲＨヌクレオシド結合部位でヒスチジンを有することよって特徴付けられる。
本発明の他の局面において、チミジンキナーゼ酵素の生物学的活性を増加する２以上の変異を含むチミジンキナーゼ酵素をコードする核酸分子が提供される。ここで、１以上のアミノ酸置換は、Ｑ基質結合ドメイン内、または拡大したＱ基質結合ドメイン内に位置し、そしてここで、少なくとも１つの変異はＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向の１〜１１位に位置するアミノ酸置換をコードする。これらのアミノ酸は、他のアミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含む）で置換され得る。
本発明の別の局面において、チミジンキナーゼ酵素の生物学的活性を増加する１以上の変異を含むチミジンキナーゼ酵素をコードする核酸分子が提供される。ここで１以上のアミノ酸置換は、Ｑ基質結合ドメイン内、または拡大したＱ基質結合ドメイン内に位置し、そしてここで少なくとも１つの変異は、ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向の１２〜「ｖ」位に位置するアミノ酸置換をコードし、ここで「ｖ」は１３より大きな任意の整数である（そして一般に２０２より小さい）。これらのアミノ酸は、容易に他のアミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含む）で置換され得る。
様々な局面において、本発明の核酸分子は数個のアミノ酸変異をコードし得る。例えば、１つの好ましい実施態様において、１、２、３、４、５、またはそれより多いアミノ酸置換、ならびにインフレーム欠失を有する変異をコードするチミジンキナーゼ変異体が提供される。このような変異体の例は、Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１Ｖ、Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１Ｃ、Ｐ１５５Ａ／Ｄ１６２Ｅ、Ｉ１６０Ｌ／Ｆ１６１Ｌ／Ａ１６８Ｖ／Ｌ１６９ＭおよびＦ１６１Ｌ／Ａ１６８Ｖ／Ｌ１６９Ｙ／Ｌ１７０Ｃを含む。
本明細書に記載したように、ＨＳＶ−１ ＴＫの部位３および４周辺の残基をコードするヌクレオチドの変異誘発はヌクレオシドプロドラッグに向けた動力学的なパラメーター（Ｋｍ）における改良へと導く。新規および異なる領域はアミノ酸残基１１２〜１３２内で存在するヌクレオシド結合に関係することが最近同定されている。ＨＳＶ−１ ＴＫの残基１１２〜１３２をコードする領域は３２Ｐ−アジド−ｄＵＭＰプローブを使用したフォトアフィニティー標識による基質（またはｄＴＭＰ）結合に関与した（Ｒｅｃｈｔｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：１３５−１４０、１９９６）。この最初の同定は、Ｘ線結晶学研究によって決定されたように、結合基質（チミジンまたはガンシクロビル）に対するこれらの残基の観察された近接によって支持された（Ｗｉｌｄら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６８：２８９−２９２、１９９５；Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：８７６−８８１、１９９５）。このグルタミン（「Ｑ」）残基は、広範な種々の供給源からのＴＫ酵素における有意な保存を示すので（例えば、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２９７９−２９８７、１９９０を参照のこと）、アミノ酸残基１１２〜１３２の領域は、「Ｑ基質結合ドメイン」として命名されている。
基質結合におけるその役割に起因して、この領域は、変異原誘発し、そして変化した基質特異性を有するクローンを選択するための優れた標的である。このような変異体は、特定のプロドラッグの存在下で自殺遺伝子治療の効力および特異性を改良する。さらに、これらの変異酵素は、細胞系譜剥離、再狭窄、相同性組換体の選択のために使用され得る。
従って、本発明は、Ｑ基質結合ドメイン内の少なくとも１つの変異を有するＴＫの形態をコードする核酸分子を含む。本発明はまた、Ｑ基質結合ドメイン内に少なくとも１つの変異を有する短縮型ＴＫ酵素をコードする核酸分子を含む。本発明はさらに、Ｑ基質結合ドメインの小領域（例えば、アミノ酸残基１２３〜１３２内）における少なくとも１つの改変、またはＱ基質ドメインおよびＮ末端方向の約１１のさらなるアミノ酸（例えば、アミノ酸残基１０１〜１３２内）を含む拡大された領域における少なくとも１つの変異を有する変異体ＴＫコード核酸分子を含む。例示のように、実施例１０は、ＨＳＶ−１ ＴＫのアミノ酸、１１２−１３２をコードする領域の変異誘発のための方法を記載する。この実施例で、アミノ酸残基１１２〜１３２内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１変異を含むＴＫ変異体が構築された。
Ｑ基質結合ドメインの同定（これは、ＤＲＨヌクレオシド結合部位とは異なる）は多くのチミジンキナーゼ変異の構築を可能にする。このようなＴＫ変異体は、Ｑ基質結合ドメインにおいて、以下の代表的なアミノ酸のいずれかでのアミノ酸置換を有する変異を含む：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン。機能的に、Ｑ基質結合ドメインにおける変化を有するＴＫ変異体は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、チミジンキナーゼの増加した生物学的活性によって特徴付けられる。
実施例１０は、ＨＳＶ−１ ＴＫ Ｑ基質結合ドメインの変異誘発を図示するが、本発明はまた、このドメインにおける変化を有する種々のチミジンキナーゼ変異体を含む。様々なＴＫ酵素におけるＱ基質結合ドメインの同定は、ＨＳＶ−１ ＴＫ配列でＴＫアミノ酸配列を整列化することにより達成され得る。例えば、Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２９７９−２９８７（１９９０）は、以下のＴＫ酵素のこのような整列化（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を提供した：ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、マーモセットヘルペスウイルス、水痘−帯状ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ウマ１型ヘルペスウイルス、ウシ１型ヘルペスウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、マレク病ウイルス、リスザルヘルペスウイルス、およびエプスタイン−バーウイルス。
あるいは、フォトアフィニティー標識は、Ｒｅｃｈｔｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：１３５−１４０（１９９６）（これは、参考として援用される）によって記載される方法を使用して、類似のＱ基質結合ドメインを同定するために使用され得る。さらに、Ｑ基質結合ドメインの同定は、標準の技術（例えば、Ｗｉｌｄら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６８：２８９−２９２、１９９５；Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：８７６−８８１、１９９５；Ｄｅ ＷｉｎｔｅｒおよびＨｅｒｄｅｗｉｊｎ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：４７２７−４７３７、１９９６を参照のこと）を使用する結晶構造分析によって立証され得る。要するに、周知の方法は、様々なチミミジンキナーゼにおける類似のＱ基質結合ドメインを同定するために使用され得る。Ｑ基質結合ドメインの変異についての好ましい供給源は、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅチミジンキナーゼである。
本発明はまた、上記のようにＤＲＨヌクレオシド結合部位と関連した少なくとも１つの変異に加えて、Ｑ基質結合ドメインにおける（または拡大したＱ基質結合ドメインにおける）変異を有するＴＫ変異体を提供する。例えば、本発明は、Ｑ基質結合部位における（または、拡大したＱ基質結合部位における）少なくとも１つのアミノ酸置換、（１）ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向に位置する少なくとも２つのアミノ酸置換（例えば、Ｎ末端方向の１、２または３つのアミノ酸）およびＤＲＨヌクレオシド結合部位からＣ末端方向に位置する少なくとも１つの変異（例えば、Ｃ末端方向に４または５アミノ酸）、（２）ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向の１〜７アミノ酸に位置する１以上のアミノ酸置換、（３）ＤＲＨヌクレオシド結合部位からＮ末端方向の２〜６位に位置するアミノ酸置換、および（４）ＤＲＨヌクレオシド結合部位内の１以上のアミノ酸置換を有するＴＫ変異体を意図する。再度、このようなＴＫ変異体は、非変異型チミジンキナーゼと比較して、チミジンキナーゼの増加した生物学的活性によって特徴付けられる。
上記のチミジンキナーゼ変異体は、本明細書中および実施例においてに以下に記載されるアッセイが与えられると、いずれも増加した生物学的活性について容易にスクリーニングされ得る。
（チミジンキナーゼ変異体の構築）
本発明のチミジンキナーゼ変異体は、広範な種々の技術を使用して構築され得る。例えば、変異は、ネイティブ配列のフラグメントに対する連結を可能にし得る制限部位に隣接した、変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座で導入され得る。連結後、生じた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する誘導体をコードする。
あるいは、オリゴヌクレオチド指向部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順は、要求された置換、欠失または挿入に従って改変された特定のコドンを有する改変された遺伝子を提供するために使用され得る。チミジンキナーゼ変異体の欠失または短縮誘導体はまた、所望の欠失に隣接した都合のよい制限エンドヌクレア−ゼ部位を利用して構築され得る。制限酵素による切断の後、突出部が埋められ得、そしてＤＮＡが再連結され得る。上で示した改変を作製する例示の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）によって開示される。
チミジンキナーゼ変異体はまた、強制ヌクレオチドミスインコーポレイション（例えば、ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ Ｇｅｎｅ ８８：１０７−１１１、１９９０）によって、または、ランダムに変異誘発したオリゴヌクレオチドの使用（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｏｍｅ ３：１１２−１１７，１９８９）によって、ＰＣＲ変異誘発、化学的変異誘発（ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ、ＰＮＡＳ ８３：３４０２−３４０６、１９８６）の技術を利用して構築される。チミジンキナーゼ変異体を構築するための好ましい方法は、この実施例において以下、さらに詳細に示される。
（ＨＳＶＴＫ ベクター）
本発明の文脈内で、用語「チミジンキナーゼ変異体」は、本明細書中に記載された特定のタンパク質（およびこれらのタンパク質をコードする核酸配列）だけでなく、生物学的活性を保持する１次タンパク質の様々な構造形態を含み得るその誘導体も含むことが理解されるべきである。例えば、チミジンキナーゼ変異体は、酸性または塩基性塩の形態で、あるいは中性の形態で存在し得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾され得る。さらに、様々な置換、欠失、または付加は、アミノ酸配列または核酸配列に対して行われ得、この正味の効果は、この変異体の増加した生物学的活性を保持するか、またはさらに増強することである。コードの縮重に起因して、例えば同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列におけるかなりの改変が存在し得る。
本明細書中で開示されるチミジンキナーゼ変異体の他の誘導体は、他のタンパク質またはポリペプチドとチミジンキナーゼ変異体の結合体を含む。これは、例えばＮ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得、これはチミジンキナーゼ変異体の精製または同定を容易にするために加えられ得る（米国特許第４，８５１，３４１号を参照のこと、またＨｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４、１９８８を参照のこと）。
本発明の１つの実施態様において、チミジンキナーゼ変異体の短縮型誘導体が提供される。例えば、部位特異的変異誘発は、チミジンキナーゼ変異体のＮ末端の４５アミノ酸を欠失するために容易に実施され得、これによってこの生物学的活性を保持する変異体の短縮型形態を構築する。
チミジンキナーゼ変異体の誘導体の発現のために構築されたヌクレオチド配列における変異は、コード配列のリーディングフレーム相（ｐｈａｓｅ）を保護するべきである。さらに、この変異は、好ましくは２次ｍＲＮＡ構造（例えば、ループまたはヘアピン（これは、レセプターｍＲＮＡの翻訳に悪影響を及ぼす））を生じさせるためにハイブリダイズし得る相補的領域を作製しない。このような誘導体は、上記の技術を含む広範な種々の技術を使用して容易に構築され得る。
上記のように、本発明は、適切な転写または翻訳調節エレメントと作動可能に連結されたチミジンキナーゼ変異体またはその誘導体をコードする合成またはｃＤＮＡ由来のいずれかの核酸分子を含む組換えベクターを提供する。適切な調節エレメントは、種々の供給源（例えば、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、昆虫、または植物遺伝子を含む）由来であり得る。適切な調節エレメントの選択は、選ばれた宿主細胞に依存し、当業者によって容易に達成され得る。調節エレメントの例には以下が挙げられる：転写プロモーターおよびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列。
上記のチミジンキナーゼ変異体のいずれかをコードする核酸分子は、広範な種々の原核生物および真核生物宿主細胞（細菌、哺乳動物、酵母または他の真菌、ウイルス、昆虫もしくは植物細胞を含む）によって容易に発現され得る。外来ＤＮＡを発現させるためにこのような細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３、１９７８；Ｍｕｒｒａｙら、米国特許第４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌｌら、米国特許第４，９３５，３４９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ａｘｅｌら、米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、米国特許第４，７６６，０７５号；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；植物細胞に関しては、ＣｚａｋｏおよびＭａｒｔｏｎ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１０６７−１０７１、１９９４；およびＰａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：３８７−３９２、１９９２を参照のこと）。
本発明を実施するのに適切な細菌宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の様々な種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種を含む。代表的な細菌宿主細胞の例はＤＨ５α（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含む。
細菌発現ベクターは、好ましくは宿主細胞において機能するプロモーター、１以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌の複製起点を含む。代表的プロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５、１９７８を参照のこと）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、１９９０）、ラムダプロモーター（Ｅｌｖｉｎら、Ｇｅｎｅ ８７：１２３−１２６、１９９０）、ｔｒｐプロモーター（ＮｉｃｈｏｌｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：１５５、１９８３）およびｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｇｅｎｅ ２０：２３１、１９８２）を含む。代表的な選択マーカーは、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子のような様々な抗生物質耐性マーカーを含む。宿主細胞を形質転換するのに適切な多くのプラスミドは、当該分野で周知であり、数ある中でｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２：９５、１９７７を参照のこと）、ｐＵＣプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９）（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−７７、１９８３、ならびにＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８、１９８２を参照のこと）ならびにｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）を含む。
本発明を行うために適切な酵母および真菌宿主細胞は、数ある中でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＰｉｃｈｉａまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の様々な種を含む。酵母および真菌に関する適切な発現ベクターは、数ある中で酵母についてはＹＣP５０（ＡＴＣＣ受託番号３７４１９）およびａｍｄＳクローニングベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１６９、１９８９）を含む。酵母の形質転換のためのプロトコールはまた、当業者に周知である。例えば、形質転換は、ＤＮＡを有する酵母スフェロプラストの調製によって（Ｈｉｎｎｅｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９、１９７８を参照のこと）、またはＬｉＣｌのようなアルカリ塩を使用した処理によって（Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３、１９８３を参照のこと）のいずれかで容易に達成され得る。真菌の形質転換はまた、Ｃｕｌｌｅｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：３６９、１９８７）によって記載されるようにポリエチレングリコールを使用して実施され得る。
本発明を実施するための適切な哺乳動物細胞は、数ある中で以下を含む：ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ受託番号１５７３）およびＮＳ−１細胞。哺乳動物細胞における発現を指向するために適切な発現ベクターは、一般にプロモーター、ならびに他の転写および翻訳制御配列を含む。共通のプロモーターには、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルス Ｅ１ａ、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス前後期プロモーターを含む。
哺乳動物細胞のトランスフェクションためのプロトコールは、当業者に周知である。代表的な方法は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス、アデノウイルスおよびプロトプラスト融合媒介トランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）を含む。
チミジンキナーゼ変異体は、組換えチミジンキナーゼ変異体を発現させるために上記の宿主／ベクター系を培養することによって調製され得る。組換えによって生成されたチミジンキナーゼ変異体は、以下でより詳細に記載するようにさらに精製され得る。
上記のように、本発明はまた、上記の核酸分子の発現を指向するために適切な種々のウイルスおよび非ウイルスベクターの両方を提供する。本発明の１つの局面において、上記のようにチミジンキナーゼ変異体をコードする単離された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むウイルスベクターが提供される。広範な種々のプロモーターは、本発明の文脈内で利用され得、例えば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、フレンド ＭｕＬＶ ＬＴＲ、アデノウイルス プロモーター（Ｏｈｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−７８４、１９９４）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ プロモーター／エンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、ヘルペスＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ 遺伝子エンハンサー／プロモーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス前後期プロモーターを含む。本発明の特に好ましい実施態様において、このプロモーターは、組織特異的プロモーターである（例えば、ＷＯ ９１／０２８０５；ＥＰ０，４１５，７３１；およびＷＯ ９０／０７９３６を参照のこと）。適切な組織特異的プロモーターの代表的な例には、チロシナーゼ関連プロモーター（ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２、ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７、１９９３）、ＤＦ３エンハンサー（胸部細胞に関しては、Ｍａｎｏｍｅら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５４：５４０８−５４１３、１９９４を参照のこと）、ＳＬＰＩプロモーター（多くの型の癌腫で発現される分泌性ロイコプロテアーゼインヒビター、Ｇａｒｖｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：４６−５０、１９９４を参照のこと）、ＴＲＳ（組織特異的調節配列、ＤｙｎａｎおよびＴｊｉａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７７４−７７８、１９８５を参照のこと）、アルブミンおよびαフェトプロテインプロモーター（正常な肝細胞および形質転換された肝細胞にそれぞれ特異的）、癌胎児抗原プロモーター（胃腸管、肺、胸部および他の組織の形質転換細胞における使用に関して）、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（メラノサイトに関して）、神経芽腫における使用に関するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはニューロン特異的エノラーゼプロモーター、グリア線維芽腫に関する調節配列、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、ｃ−ｅｒｂ Ｂ−２プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＥＰＣＫプロモーター、乳清酸性プロモーター（胸部組織）、ならびにカゼインプロモーター（胸部組織）および脂肪細胞Ｐ２プロモーター（Ｒｏｓｓら、Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．１３１８−１３２４、１９９３；およびＬｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７４０−７４２、１９９３）が挙げられる。上記のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーター（上記のプロモーターおよびＨＩＶプロモーターのような他のものを含む）、肝炎、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ）、および細菌、真菌または寄生虫（例えば、マラリア性）特異的プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫に感染した特定の細胞または組織を標的化するために使用され得る。
本発明のチミジンキナーゼ変異体は、種々のウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター（例えば、Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳ ９０（２４）：１１４９８−５０２、１９９３；Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ ９１（１）：２１５−２１９、１９９４；Ｌｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９、１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４、１９９３；およびＺａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ ７５（２）：２０７−２１６、１９９３；ＷＯ ９４／２６９１４、ＷＯ ９３／９１９１）、アデノ随伴ウイルスベクター（Ｆｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ ９０（２２）：１０６１３−１０６１７、１９９３）、セムリキ森林ウイルスおよびシンドビスウイルスのようなアルファウイルス（ＨｅｒｔｚおよびＨｕａｎｇ、Ｊ．Ｖｉｒ．６６（２）：８５７−８６４、１９９２；ＲａｊｕおよびＨｕａｎｇ、Ｊ．Ｖｉｒ．６５（５）：２５０１−２５１０、１９９１；Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８、１９８９；米国特許第５，０９１，３０９号；ＷＯ ９２／１０５７８；ＷＯ ９５／０７９９４）；バキュロウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第４，７６９，３３１号、同４，８５９，５８７号、同５，２８８，６４１号、同５，３２８，６８８号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ ９４／１４９７１およびＷＯ ９５／０４１３９）、パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、ポックスウイルスベクター（Ｏｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２）：６５３−６６０、１９９３；ならびにＰａｎｉｃａｌｉおよびＰａｏｌｅｔｉｉ、ＰＮＡＳ ７９：４９２７−４９３１、１９８２）、カナリア痘ウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮＡＳ ８６：３１７−３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３、１９８９；米国特許第４，６０３，１１２号、同４，７６９，３３０号および同５，０１７，４８７号；ＷＯ ８９／０１９７３）；およびレトロウイルス（例えば、Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７９：７２９−７３５、１９９３；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８、１９９３；Ｔａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ ３３：４９３−５０３、１９９２；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７、１９９３；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：３８６０−３８６４、１９９３；米国特許第５，２１９，７４０号；ＥＰ ０，４１５，７３１；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９１／０２８５、ＷＯ ９４／０３６２２；ＷＯ ９３／２５６９８；ＷＯ ９３／２５２３４；ＷＯ ９３／１１２３０；ＷＯ ９３／１０２１８）を含む）から発現され得る。様々な実施態様において、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかは、以下に記載される方法および組成物において利用され得る。
ウイルスベクターに加えて、非ウイルスベクター系またはウイルスベクターの一部を含む系（例えば、これは転写、翻訳または細胞へのウイルスの侵入を制御する）は、本発明の核酸配列を送達するために利用され得る。このような系の代表的な例は種々の核酸に基づいた転写系（例えば、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターに基づいた、一般に、Ｌｉら、「Ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｎｕｄｅ Ｍｉｃｅ ｂｙ Ｄｉｒｅｃｔ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｇｅｎｅ」１７９頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｓｅｐｔ．２１−２５、１１９４；ＷＯ ９５／０７９９４を参照のこと）である。このようなベクター系は、本明細書中に記載のように投与され、そして調製され得る（例えば、リポソームにおいて、ポリカチオンと縮合されるか、またはリガンドと連結される）。
本発明のベクターは、上記のチミジンキナーゼ核酸分子に加えて広範な種々のさらなる核酸分子を含み得るかまたは発現し得る。例えば、ウイルスベクターは、リンホカイン、アンチセンス配列、毒素または「置換」タンパク質（例えば、アデノシンデアミナーゼ）を発現し得る。リンホカインの代表的な例には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インタフェロンおよび腫瘍壊死因子が挙げられる。アンチセンス配列の代表的な例はアンチセンスｍｙｃ、アンチセンスｐ５３、アンチセンスｒａｓ、ならびにＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶのようなウイルスの発現または産生をブロックするアンチセンス配列を含む。毒素の代表的な例には以下が挙げられる：レシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン（ｔｒｉｔｉｎ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌体外毒素Ａ。
本発明の好ましい実施態様において、チミジンキナーゼの生物学的活性を容易にするか、または増加するタンパク質をコードする１以上の遺伝子が本明細書中に記載のベクターと共に含まれ得、そしてそれによって発現され得る。例えば、本発明の１つの実施態様において、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ヘルペスＤＮＡポリメラーゼ）および／またはグアニル酸キナーゼ（Ｋｏｎｒａｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（３６）：２５６５２−２５６５５、１９９２；ＭｉｌｌｅｒおよびＭｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１５）：７２０４−７２０７、１９８０）をコードする核酸分子は、チミジンキナーゼ酵素（野生型または上記のようなチミジンキナーゼ変異体のいずれか）に加えて、１つまたはいくつかのいずれかの別のプロモーターから（例えば、複数の内部リボゾーム結合部位から）発現される。このような実施態様の代表的な例は、実施例７および１１で以下にさらに詳細に示される。ＤＮＡポリメラーゼまたはグアニル酸キナーゼをコードするある核酸分子が開示されるが、本発明はこれらに限定されないことを理解するはずである。実際、チミジンキナーゼ変異体に関する上記のように、ＤＮＡポリメラーゼまたはグアニル酸キナーゼ活性をコードする広範な種々の核酸分子（例えば、短縮された核酸分子またはコードされたアミノ酸配列に関して縮重である核酸分子）は、本発明の範囲に含まれると考えられる。
チミジンキナーゼ変異体はまた、非ヒトトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、イヌおよびブタ（Ｈａｍｍｅｒら、（Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０−６８３、１９８５）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４、１９８３）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２、１９８５）、ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ（Ｃｅｌｌ ４１：３４３−３４５、１９８５）ならびに米国特許第４，７３６，８６６号）において発現され得る。簡潔には、適切に配置した発現制御配列と共に、発現されるべき核酸分子を含む発現ユニットは、例えば、マイクロインジェクションによって受精卵の前核に導入される。注入されたＤＮＡの取り込みは、組織サンプル由来のＤＮＡのブロット分析によって検出される。導入されるＤＮＡは動物の子孫に譲られるように動物の生殖細胞系に取り込まれることが好ましい。組織特異的発現は、組織特異的プロモーターの使用を通して、または誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３、同書）（これは、導入遺伝子の調節された発現を可能にする）の使用を通して達成され得る。
（宿主細胞）
本発明のチミジンキナーゼをコードする上記の核酸分子（またはこれらの変異体を含みそして／もしくは発現するベクター）は、広範な種々の宿主細胞に容易に導入され得る。このような宿主細胞の代表的な例は、植物細胞、真核生物細胞および原核生物細胞が含まれる。好ましい実施態様において、この核酸分子は脊椎動物または温血動物由来の細胞（例えば、ヒト、マカク、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ラット、ハムスター、マウス、または魚類の細胞、あるいはその任意のハイブリッド）に導入される。
この核酸分子（またはベクター）は、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １４：７２５、１９７８）、リポフェクション；遺伝子銃（ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎ．７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、１９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５、１９８２）、レトロウイルス、アデノウイルスのプロトプラスト融合媒介トランスフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ、１９８７）を含む広範な種々の機構によって宿主細胞に導入され得る。
（グアニル酸キナーゼ−チミジンキナーゼ融合タンパク質の構築）
自殺遺伝子治療の正味の効力を改良するためのいくつかのアプローチが存在する。上記のように、１つのアプローチは、全身的に送達されたプロドラッグを細胞障害の化合物に効率的に変換する新規のＴＫ酵素を創出することである。別の戦略は、プロドラッグ活性化の核酸代謝経路における第２の工程を担う酵素（グアニル酸キナーゼをチミジンキナーゼと組み合わせて）コードする遺伝子を導入することによってプロドラッグのその毒性形態への後の代謝を容易にすることである。細胞のチミジンキナーゼとは異なり、ＨＳＶ ＴＫは初期のプロドラッグの一リン酸化状態へのリン酸化（例えば、ＧＣＶおよびＡＣＶ）を達成し得る。細胞のキナーゼはさらに、次いで、ヌクレオチドを新生ＤＮＡ鎖への挿入、後、ＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長を阻害し、そして引き続く細胞死へ導くトリホスフェートへとヌクレオチドをリン酸化する。プロドラッグ活性化経路における第２工程であるグアニル酸キナーゼ（ｇｍｋ）は、インビボで律速であると考えられる。実施例１１は、ｇｍｋ酵素およびＴＫ酵素両方を産生する哺乳動物発現ベクターの構築についての方法を例示する。
さらに別のアプローチにおいて、ｇｍｋおよびＴＫ酵素活性両方を発現する融合タンパク質は、構築され得、単一のプロモーターおよび単一のシストロン由来の２つの酵素機能の発現を提供する。このように、遺伝子治療のための融合タンパク質の使用は、２つのプロモーターに関する要求性を除去し、そしてプロモーター強度における相違に起因したプロドラッグ活性化における関連した減少を除外する。さらに、融合タンパク質はＡＡＶベクターのような外来ＤＮＡの大きな片に耐え得ない遺伝子治療ベクターに関して有利である。
実施例１２は２つのｇｍｋ−ＴＫ融合タンパク質の構築を記載する。例示のベクターは、ｇｍｋ遺伝子の３’末端に融合したＴＫ遺伝子を含むが、適切な融合タンパク質がＴＫ遺伝子の３’末端に融合したｇｍｋ遺伝子を有するベクターで調製され得る。実施例１２はまた、このような融合タンパク質がキナーゼ遺伝子の全アミノ酸配列を含む必要のないことを例示する。すなわち、短縮されたｇｍｋおよび／または短縮されたＴＫをコードする核酸分子は、本発明の融合タンパク質を発現するために使用され得る。しかし、このような短縮されたキナーゼは、上で規定されたように適切な生物学的活性を有さなければならない。短縮されたｇｍｋまたは短縮されたＴＫの生物学的活性は本明細書中に記載された酵素アッセイを使用して測定され得る。
融合タンパク質を産生するための一般的な方法は当業者に周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、１６−１６〜１６−３７頁（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１９９５）を参照のこと。実施例１１は、ヒトおよびマウスｇｍｋクローンの両方を得るための方法を記載する（Ｂｒａｄｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６７３４−１６７４０、１９９６も参照のこと）。当業者は、標準の技術を使用して様々な供給源からのｇｍｋをコードする核酸分子を入手し得る。例えば、Ｋｏｎｒａｄ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５６５２−２５６５５（１９９２）はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのｇｍｋ配列の単離を記載し、Ｇａｉｄａｒｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３３５：８１−８４（１９９３）は、ウシグアニル酸キナーゼ配列を開示し、Ｚｓｃｈｏｃｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３：２６３−２６９（１９９３）は、ブタグアニル酸キナーゼ配列を提供し、そして、Ｅ．ｃｏｌｉグアニル酸キナーゼ配列はＧｅｎｔｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４３１６−１４３２１（１９９３）によって提供される。さらに、グアニル酸キナーゼ酵素をコードする核酸分子は、市販されている。例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ ｇｍｋは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ寄託番号６２３５９２）から入手し得る。適切なＴＫ遺伝子は既知のＴＫ遺伝子および本発明のＴＫ変異体の両方を含む。ＴＫ遺伝子の供給源、適切な発現ベクター、および適切な宿主細胞が上記される。
（抗体の調製）
本明細書中に記載のチミジンキナーゼ変異体、グアニル酸キナーゼタンパク質、または融合タンパク質に対する抗体は、本明細書中で提供され、開示を与えられると容易に調製され得る。本発明の文脈内で、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2）ならびにその部分を含むことが理解され、これは、様々な組換え方法によって調製され得る。抗体は、１０7Ｍ以上のＫaで結合する場合、チミジンキナーゼ変異体または融合タンパク質に対して反応的であることが理解される。当業者によって理解されるように、チミジンキナーゼ変異体または融合タンパク質のようなリガンドと結合するだけでなく、この変異体または融合タンパク質の生物学的活性をブロックするかまたは阻害する抗体が開発され得る。
簡潔には、ポリクローナル抗体は、様々な温血動物（例えば、ウマ、ウシ、様々な家禽、ウサギ、マウス、またはラット）から当業者によって用意に生成され得る。簡潔には、チミジンキナーゼ変異体（または、もしこのような抗体が所望される場合、グアニル酸キナーゼ酵素、または融合タンパク質）は、腹腔内注射、筋肉内注射、眼内注射、または皮下注射、フロイント完全または不完全アジュバントのようなアジュバントを通して動物を免疫化するために使用される。いくつかのブースター免疫の後、血清のサンプルが集められ、そしてチミジンキナーゼ変異体（またはグアニル酸キナーゼもしくは融合タンパク質）に対する反応性について試験される。特に、好ましいポリクローナル抗血清は、バックグラウンドより少なくとも３倍大きいこれらのアッセイの１つにシグナルを与える。一旦、動物の力価が、チミジンキナーゼ変異体、グアニル酸キナーゼ酵素、または融合タンパク質に対するその反応性に関してプラトーに達すると、より多量の抗血清は、毎週の放血によるか、または動物を全採血することによるいずれかで容易に入手され得る。
モノクローナル抗体はまた、従来の技術を使用して容易に生成し得る（米国特許第ＲＥ３２，０１１号、同４，９０２，６１４号、同４，５４３，４３９号、および４，４１１，９９３号、これらは本明細書中で参考として援用される；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｋｅｎｎｅｔｔ、ＭｃＫｅａｒｎ，およびＢｅｃｈｔｏｌ編、１９８０、ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８（これらはまた、本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと）。
簡潔には、１つの実施態様において、ラットまたはマウスのような被検動物は、上記のようなチミジンキナーゼ、グアニル酸キナーゼ酵素または融合タンパク質を注入される。このチミジンキナーゼ変異体、グアニル酸キナーゼ酵素または融合タンパク質は、生じた免疫応答を増加するためにフロイント完全または不完全アジュバントのようなアジュバントで混合され得る。最初の免疫後、１週と３週との間に、この動物は、別のブースター免疫で再免疫され得、そして上記のアッセイを使用して、チミジンキナーゼ変異体、グアニル酸キナーゼ酵素または融合タンパク質に対する反応性について試験され得る。一旦、この動物が変異体に対するその反応性においてプラトーになると、この動物を屠殺し、そして脾臓およびリンパ節のような多数のＢ細胞を含む器官が収穫される。
免疫化された動物から得られた細胞は、エスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のようなウイルスでのトランスフェクションによって免疫化され得る（ＧｌａｓｋｙおよびＲｅａｄｉｎｇ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ８（４）：３７７−３８９、１９８９）。あるいは、好ましい実施態様において、収穫された脾臓および／またはリンパ節細胞懸濁物は、モノクローナル抗体を分泌する「ハイブリドーマ」を生成するために適切なミエローマ細胞と融合される。適切なミエローマ株は、例えばＮＳ−１（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ １８）およびＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ １５８０）を含む。
この融合の後、この細胞は、適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ １６４０、またはＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）およびＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（すなわちＨｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ，もしくはＪＲＨ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＦＢＳ）のようなさらなる成分を含む培養プレートに置床され得る。さらに、この培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のような融合された脾臓およびミエローマ細胞の増殖を選択的に可能にする試薬を含むべきである。約７日後、生じた融合細胞またはハイブリドーマは、チミジンキナーゼ変異体、グアニル酸キナーゼ酵素または融合タンパク質に対して反応性である抗体の存在を決定するためにスクリーニングされ得る。広範な種々のアッセイを利用して、本発明のタンパク質に対して反応性の抗体の存在を決定し得、例えば、向流（ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ）免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオ免疫沈降、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降、阻害または競合アッセイおよびサンドイッチアッセイ（米国特許第４，３７６，１１０号および４，４８６，５３０号を参照のこと；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８もまた参照のこと）を含む。いくつかのクローン希釈および再アッセイの後、チミジンキナーゼ変異体（またはグアニル酸キナーゼ酵素もしくは融合タンパク質）に対して反応性の抗体を産生するハイブリドーマが単離され得る。
他の技術はまた、モノクローナル抗体を構築するために利用され得る（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．Ｈｕｓｅら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｒｉｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１、１２月 １９８９を参照のこと；Ｌ．Ｓａｓｔｒｙら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７２８−５７３２、８月 １９８９もまた参照のこと；Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９、１月 １９９０もまた参照のこと；これらの参考文献は、Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから利用可能な市販の系を記載し、これは組換え技術を通して抗体の産生を可能とする）。簡潔には、ｍＲＮＡはＢ細胞集団から単離され、そしてｋＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｈ）およびｋＩｍｍｕｎｏＺａｐ（Ｌ）ベクター中の重鎖および軽鎖イムノグロブリンｃＤＮＡ発現ライブラリーを生成するために利用される。これらのベクターは個々にスクリーニングされ得、または同時に発現されて、Ｆａｂフラグメントもしくは抗体を形成し得る（Ｈｕｓｅら、前記を参照のこと；Ｓａｓｔｒｙら、前記も参照のこと）。陽性プラークは、引き続いて非溶解プラスミドに転換され得、これはＥ．ｃｏｌｉからのモノクローナル抗体フラグメントの高レベルの発現を可能にする。
同様に、抗体の部分はまた、組換えＤＮＡ技術を利用して特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むように構築し得る。１つの実施態様において、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ由来の可変領域をコードする遺伝子は、この可変領域についてのヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成され得、または市販の供給源から購入され得る。Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）は、マウスおよびヒト可変領域（とりわけ、ＶHa、ＶHb、ＶHc、ＶHd、ＣH1、ＶLおよびＣL領域を含む）についてのプライマーを売っている。これらのプライマーは、重鎖および軽鎖可変領域を増幅するために利用され得、次いで、これらはＩｍｍｕｎｏＺＡＰTMＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰTMＬ（Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ）のようなベクターにそれぞれ挿入され得る。次いで、これらのベクターは、発現のためにＥ．ｃｏｌｉに導入され得る。これらの技術を利用して、ＶHおよびＶLドメインの融合を含む多量の単鎖タンパク質が産生され得る（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、１９８８を参照のこと）。さらに、このような技術は、抗体の結合特異性を変化することなく「ヒト」抗体に「マウス」抗体を変えるために利用され得る。
一旦、適切な抗体が得られると、それらは当業者に周知の多くの技術によって単離されまたは精製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８を参照のこと）。適切な技術は、ペプチドまたはタンパク質アフィニティーカラム、ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでの精製、あるいはこれらの技術の任意の組み合わせを含む。
（抗体の標識）
上記の抗チミジンキナーゼ、抗グアニル酸キナーゼまたは抗融合タンパク質抗体は、種々の分子（例えば、蛍光分子、毒素および放射性核種を含む）で標識され得る。蛍光分子の代表的な例には、フルオレセイン、フィコエリスリン、ローダミン、テキサスレッドおよびルシフェラーゼが挙げられる。毒素の代表的な例にはリシン、アビリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌体外毒素Ａが挙げられる。代表的な放射性核種の例には、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９、Ｐｂ−２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２およびＢｉ−２１２が挙げられる。さらに上記の抗体はまた、リガンド結合対の１つのパートナーで標識または結合体化され得る。代表的な例には、アビジン−ビオチンおよびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。
上で示した代表的な標識で、上で議論した抗チミジンキナーゼ、抗グアニル酸キナーゼまたは抗融合タンパク質抗体を結合体化または標識する方法は、当業者によって容易に達成され得る（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第４，７４４，９８１号を参照のこと；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第５，１０６，９５１号；Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、米国特許第４，０１８，８８４号；Ｍｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、米国特許第４，８９７，２５５号；およびＭｅｔａｌ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、米国特許第４，９８８，４９６号：Ｉｎｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３４巻、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ Ｂ、ＪａｋｏｂｙおよびＷｉｌｃｈｅｋ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３０頁、１９７４もまた参照のこと；ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ、「Ｔｈｅ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１−３２、１９８８もまた参照のこと）。
（薬学的組成物）
上記のように、本発明はまた、種々の薬学的組成物（または医薬）を提供し、これは薬学的にまたは生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と共に上記のチミジンキナーゼ変異体、グアニル酸キナーゼまたは融合タンパク質（例えば、核酸分子、ベクターまたはタンパク質のいずれか）の１つを含む。一般に、このようなキャリアーは、使用される用量および濃度でレシピエントに対して毒性はないべきである。通常、このような組成物の調製は、緩衝剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオンおよび他の安定化剤ならびに賦形剤を治療剤と合わせる工程を必要とする。中性に緩衝化された生理食塩水または非特異的血清アルブミンと混合された生理食塩水は例示的な適切な希釈剤である。
さらに、本発明の薬学的組成物は、様々な異なった経路（例えば、関節内に、頭蓋内に、皮内に、筋肉内に、眼内に、腹膜内に、鞘内に、静脈内に、皮下にまたは腫瘍に直接でさえ（例えば、定位の注射による）を含む）による投与のために調製され得る。さらに本発明の薬学的組成物は、このような薬学的組成物の使用に関する指示書を提供する包装材料と共に容器内に入れられ得る。一般に、このような指示書は、試薬濃度、および特定の実施態様においては、その薬学的組成物を再構成するために必要であり得る賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水もしくはＰＢＳ）の相対的な量を記載する具体的な表現を含む。
（方法）
本発明はまた、温血動物における病原因子を阻害するための方法を提供し、この病原因子が阻害されるように、上記のように温血動物にベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター、またはベクターを含むウイルス粒子）を投与する工程を含む。病原因子の代表的な例は、自己免疫細胞、腫瘍細胞、特定の遺伝子を発現しないか、または不適切に発現する細胞、および細菌、ウイルス、あるいは他の細胞内寄生虫で感染した細胞を含む。当業者に明らかなように、投与の量および頻度は、もちろん処置される適応性の性質および重度、所望の応答、患者の状態などのような因子に依存する。代表的には、この組成物は、種々の技術（例えば、関節内に、頭蓋内に、皮内に、筋肉内に、眼内に、腹膜内に、鞘内に、静脈内に、皮下にまたは腫瘍に直接でさえ（例えば、定位の注射による）含む）によって投与され得る。
本発明のある実施態様において、チミジンキナーゼ（および／またはグアニル酸キナーゼ）または上記の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかまたは発現するベクター、あるいはこの核酸分子自身でさえ種々の代替の技術によって投与され得、例えば、ポリ（Ｌ−リジン）ＤＮＡ複合体と結合体化したアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）の投与（Ｃｒｉｓｔａｎｏら、ＰＡＮＳ ９２１２２−９２１２６、１９９３）、殺傷したアデノウイルスと連結したＤＮＡ（Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１０）：６８６６−６８６９、１９９３；およびＣｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７−１５４、１９９２）、サイトフェクチン媒介導入（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ、Ｖｉｃａｌ、Ｃａｌｉｆ．）、直接ＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−８１８、１９９１）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７、１９８９）；リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７、１９８９）；リポソーム（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇら、Ｃｉｒｃ．８９（１）：１３−２１、１９９４；およびＷａｎｇら、ＰＮＡＳ ８４：７８５１−７８５５、１９８７）；微粒子銃（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ ８８：２７２６−２７３０、１９９１）；レトロトランスポゾン、トランスフェリン−ＤＮＡ複合体（Ｚｅｎｋｅ）および単独で（ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４、１９９３）、またはＰＥＧ−核酸複合体を利用するかのいずれかでの酵素をコードする核酸自身の直接送達を含む。
本発明の１つの局面において、温血動物における腫瘍または癌を阻害するための方法が提供され、これは腫瘍または癌が阻害されるように上記のベクターの１つ（または本発明のチミジンキナーゼ変異体、グアニル酸キナーゼ酵素もしくは融合タンパク質をコードする核酸分子）を温血動物に投与する工程を含む。１つの実施態様において、選択された細胞は、温血動物から除去され得、１以上の上記のベクターが除去された細胞に導入され得、そしてこの細胞は同じまたは別の温血動物に再導入され得る。他の実施態様において、チミジンキナーゼ（もしくは本明細書に記載の変異体）またはグアニル酸キナーゼあるいは融合タンパク質をコードするベクターまたは核酸分子は別に投与または導入され得る。さらなる実施態様において、このような方法はさらに、ヌクレオシドアナログを投与する工程を含む。このようなヌクレオシドアナログの代表的な例にはガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａ−Ｔ １−β−Ｄ−アラビノフラノキシル チミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２、５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ（５−ヨード−５’アミノ ２’、５’−ジデオキシウリジン）、ジデオキシシチジンおよびＡｒａＣが挙げられる。簡潔には、このような方法を利用して、広範な種々の腫瘍（良性と悪性の両方）が処置され得る。このような腫瘍の代表的な例には、固形腫瘍（例えば、肺癌腫、腎臓細胞癌腫、胸部癌腫、直腸結腸癌腫および黒色腫、ならびに白血病およびリンパ腫のような広範性の癌が挙げられる。
本発明の他の局面において、種々の疾患を処置するための方法が提供され、ここで細胞のサブセットは、上記の核酸分子またはベクターを利用して「罹患した」または変化したとして特徴付けられる。このような疾患の代表的な例は、角質増殖症（乾癬）、前立腺肥大、甲状腺機能亢進症、広範な種々の内分泌障害、自己免疫疾患（あるサブセットのＴ細胞のような自己免疫反応性細胞に起因して）、アレルギー（例えば、アレルギー反応の原因であるＩｇＥ発現細胞の活性を調節することによって）、再狭窄（例えば、血管の内殖および／または詰まりの原因の細胞を殺傷することによって）、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）のような広範な列のウイルス疾患の、肝炎（ＨＶＣまたはＨＢＶ）、および細胞内寄生虫病が挙げられる。本発明の他の局面において、疾患とは伝統的に関連しない細胞の増殖を阻害するかまたは破壊するための方法が提供される。例えば、ある実施態様において、動物における体重減少を開始し、または毛包を破壊するために（脱毛試薬として）脂肪細胞を阻害または破壊するベクター（または核酸分子単独）を投与することが所望され得る。
なお他の局面において、チミジンキナーゼ変異体および／もしくはグアニレートキナーゼ、または融合タンパク質をコードする核酸分子を含有するか、または発現するベクター（あるいは核酸分子自体）は、細胞内での遺伝子の異常な発現を補正するために、または適切な発現について不全である特定の遺伝子を置換するために使用され得る。このような疾患の代表的な例には、アデノシンデアミナーゼ欠損、アルツハイマー病（例えば、Ｇｏａｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７０４，１９９１；Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：７５４，１９９５；Ｌｅｖｙ−Ｌａｂａｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：９７３，１９９５を参照のこと）、嚢胞性線維症、および、例えば、血友病のような疾患が挙げられる。
本発明の他の局面において、上記のチミジンキナーゼ変異体または融合タンパク質を、原核生物細胞、真核生物細胞、植物（ＣｚａｋｏおよびＭｏｒｔｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４：１０６７−１０７１，１９９４）、寄生体（例えば、トリパノソーマ）、またはウイルスにおいて、ネガティブ選択マーカー遺伝子（例えば、ＣｚａｋｏおよびＭａｒｔｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１０６７−１０７１，１９９４を参照のこと）として利用するための方法が提供される。あるいは、このような変異体は、相同組換えのための、条件によって致死的なマーカーとして利用され得る（Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２，１９８８）。代表的な例を、以下の実施例６にさらに詳細に示す。
本発明の他の局面において、チミジンキナーゼ変異体、およびチミジンキナーゼおよびグアニレートキナーゼ活性を有する融合タンパク質を使用する、遺伝子治療の非侵襲的なモニタリングのための方法が提供される。方法は、臨床的なγカメラを使用して、および放射標識したチミジンキナーゼ基質を用いる単一光子発光断層撮影法により、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子発現の非侵襲的な画像化のために開発されている（例えば、Ｔｊｕｖａｊｅｖら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：６１２６−６１３２，１９９５；Ｔｊｕｖａｊｅｖら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：４０８７−４０９５，１９９６）。基本的なアプローチは、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼによって選択的にリン酸化される標識された抗ウイルス薬物を投与し、そしてヒトの診断のための標準的なスキャニング法を使用して治療の進行をモニターすることである。ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ（例えば、ＩＶＦＲＵ）についての基質である適切な放射標識化抗ウイルス薬物は、当業者に周知である。例えば、ＨＳＶ−１ ＴＫについての放射標識したヌクレオシド基質を用いた画像化について考察する、Ｗｉｅｂｅら、Ｑ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４１：７９−８９（１９９７）（これは、参考として援用される）を参照のこと。チミジンキナーゼ活性を増強された本発明の変異体チミジンキナーゼおよび融合タンパク質は、このような非侵襲的なモニタリングの感度を増大する手段を提供する。
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のためではない。
（実施例１）
（２０％ランダムライブラリーを利用しての、コドン１６５〜１７５に変異を含有するＴＫ変異体の構築）
実施例１は、２０％ランダムライブラリーを利用する、コドン１６５〜１７５に変異を含有するＴＫ変異体の構築を記載する。この実施例において利用するストラテジーを示す模式的な概略を、図１に示す。
（Ａ．ＴＫ変異体の生成）
（１．オリゴヌクレオチドの生成）
野生型ｔｋ配列（配列番号２）を有する５２マーのオリゴヌクレオチド、およびｔｋ遺伝子のコドン１６５〜１７５（配列番号３）にわたる縮重ヌクレオチドを含む５６マー（図２３は、ＨＳＶＴＫ−１のオープンリーディングフレームにおけるヌクレオチドを開示する（配列番号１））（ここで、Ｎ＝８０％が野生型ヌクレオシド、および２０％が各位置での他の３つの混合物）を、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｐａｂｌｏ，ＣＡ）によって合成した。両方のオリゴマーは、それらの３’末端の１２塩基に沿って互いに相補的であった。
５’−ＴＧ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＣＧＧ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＧ ＡＴＣ ＧＣＣ ＡＴ−３’（配列番号２）
５’−ＡＴＧ ＡＧＧ ＴＡＣ ＣＧＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＡ ＴＧＧ ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＡ−３’（配列番号３）。
以下に記載するｐＫＴＰＤの構築のために、２つのさらなるオリゴヌクレオチドを、ホスホラミダイト化学を使用して、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成した。これらのオリゴヌクレオチドは以下であった：
５’−ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣ−３’（配列番号４）
５’−ＣＧＣ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＡＧ ＣＴ−３’（配列番号５）。
（２．ランダム配列含有ライブラリーの生成）
（ａ．ベクターｐＭＤＣおよびｐＭＣＣの構築）
キメラ型ベクターｐＭＤＣ（これは、不活化ＴＫ遺伝子産物を産生する）およびｐＭＣＣ（これは、野生型ＴＫを産生する）を、プラスミドｐＨＥＴＫ１およびｐＨＥＴＫ２から本質的に以下に記載するように生成した。簡単には、プラスミドｐＨＥＴＫ１およびｐＨＥＴＫ２（Ｗａｌｄｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１５７１−１１５７５，１９８３）は、ＨＳＶ−１ ｔｋ構造遺伝子を含有する発現ベクターであり、そしてｐＢＲ３２２の誘導体である。ｐＨＥＴＫ１およびｐＨＥＴＫ２の制限マップは、Ｗａｌｄｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１５７１−１１５７５，１９８３（これは、これらのプラスミドの構築を記載する）において見出され得る。プラスミドｐＨＥＴＫ２は、λＰLおよびλＰRプロモーター、ａｍｐＲ、およびｃ１８５７温度感受性リプレッサーを含有し、一方、ｐＨＥＴＫ１は、λＰLプロモーターを除く上記の全てを含有する。プラスミドｐＨＥＴＫ１およびｐＨＥＴＫ２は、Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓｕｍｍｅｒｓ（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）から入手した。
ｐＭＤＣおよびｐＭＣＣを構築するために、ｐＫＴＰＤと命名されたダミーベクターをＤｕｂｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１１７６０−１１７６７，１９９１によって記載されるように最初に構築した。簡単には、オリゴヌクレオチド配列番号４および５（各２０ｐｍｏｌ）をまず、リン酸化し、次いで、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するためにＫｐｎＩ適合性末端およびＳｓｔＩ適合性末端、ならびに内部ＸｈｏＩ部位にアニーリングした。さらに、ｐＨＥＴＫ２を、ＳｓｔＩおよびＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして大きなフラグメントをアガロースゲル電気泳動およびその後の電気溶出によって単離した。２ピコモルの大きなフラグメントを、６ｐｍｏｌの二本鎖オリゴヌクレオチドに連結した。得られた二本鎖の環状ＤＮＡ産物（「ｐＫＴＰＤ」と命名）を使用して、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＫＹ８９５細胞を形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＹ８９５は、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓｕｍｍｅｒｓ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）から入手したＴＫ欠損株（Ｋ１２ｔｄｋ-、Ｆ-、ｉｌｖ２７６）である。組換えプラスミドｐＫＴＰＤを含有するクローンを、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含有するＬＢプレート上で増殖する。組換えプラスミドＤＮＡの存在を、ＸｈｏＩ部位での切断によって確認した。チミジンキナーゼ選択培地においてｐＫＴＰＤがＥ．ｃｏｌｉ ＫＹ８９５の増殖を支持し得ないことは、それが機能的なチミジンキナーゼを産生しないことを示す。
次いで、ｐＨＥＴＫ１およびｐＫＴＰＤを利用して、新たなキメラ型ダミーベクターを構築し、ｐＭＤＣと命名した。簡単には、ＳｐｈＩおよびＰｖｕＩＩでのｐＨＥＴＫ１の消化において、２つのフラグメントに切断する。より大きいフラグメントは、ａｍｐＲ、ｃＩ８５７、λＰR配列、およびＢａｍＨＩからＳｐｈＩ部位までにおよぶｔｋ遺伝子の一部を含有している。より小さいフラグメントは、ＳｐｈＩからＰｖｕＩＩまでのｔｋ遺伝子の残りを含有する。同様に、同じ２つの酵素での消化の際に、ｐＫＴＰＤは、１つのより大きいフラグメントおよび１つのより小さいフラグメントに切断される。ｐＫＴＰＤのより小さいＳｐｈＩ／ＰｖｕＩＩフラグメントは、ｔｋ遺伝子のＫｐｎＩ部位およびＳａｃＩ部位の内部にダミー配列または不活化配列を含有する。ｐＨＥＴＫ１由来のより大きいフラグメントとｐＫＴＰＤのより小さいフラグメントとの連結により、キメラベクターｐＭＤＣを生成し、これは不活化ｔｋ遺伝子産物を産生する。
野生型ｔｋ遺伝子を含有する別のキメラ型ベクターｐＭＣＣを、同様に、ｐＨＥＴＫ１由来のより大きいフラグメントを、ｐＨＥＴＫ２のより小さいフラグメントに連結することにより構築した。上記のように、ＰＭＣＣは、活性化野生型ＴＫを産生する。
（ｂ．ライブラリーの生成）
２０％のランダムヌクレオチド配列を含有するライブラリーを、以下のように構築した。簡単には、野生型配列（配列番号２）を含有する５２マーのオリゴを、コドン１６５〜１７５におよぶ縮重配列（配列番号３）が含有される５６マーのオリゴにハイブリダイズした。
そのハイブリッドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで伸長させ、完全な二本鎖ＤＮＡ産物を生成した。このストラテジーを、配列番号３を含有する長いランダムヌクレオチドの合成を避けるために実行した。なぜなら、ベクター内のＫｐｎＩ部位およびＳａｃＩ部位（挿入部位）の位置が長いカセットを必要とするからである。次いで、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで生成した二本鎖ＤＮＡを、２つの合成プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応増幅に供した：第１のプライマー、ａ：５’−ＴＧＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＣ ＧＣＣ−３’（配列番号６）は、オリゴ配列番号２の５’末端の２１塩基配列に相当する。第２のプライマー、ｂ：５’−ＡＴＧ ＡＧＧ ＴＡＣ ＣＧ−３’（配列番号７）は、オリゴ配列番号３の５’末端の１１塩基配列に相当する。そのポリメラーゼ連鎖反応増幅反応は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０μＭの４つそれぞれのデオキシヌクレオシド３リン酸塩、２０ｐｍｏｌのプライマー「ａ」、４０ｐｍｏｌのプライマー「ｂ」、テンプレートとしての約１ｐｍｏｌの伸長した二本鎖オリゴヌクレオチド、ならびに２ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）を、１００μｌの最終反応容量中に含有していた。各混合物を鉱油で覆い、そして以下の温度サイクリングに３０回供した：９４℃を１分、３４℃を２分、および７２℃を７分。
低分子量の成分および過剰のプライマーを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０限外濾過ユニットで遠心分離することによってポリメラーゼ連鎖反応増幅産物から除去し、そしてその増幅したＤＮＡをＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化した。ランダム配列を含有するその消化した二本鎖オリゴヌクレオチドを、再び、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０ユニットによって精製し、そして１０μｌの容量中において１０：１のモル比で１ｍＭ ＡＴＰおよび１ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）の存在下でＫｐｎＩ／ＳａｃＩで消化したｐＭＤＣの大きなフラグメントに連結した。インキュベーションを１８時間、１４℃で行い、そしてその反応をフェノール−ＣＨＣｌ3抽出、その後のエタノール沈殿によって終結させた。
（ｃ．ＴＫ変異体の選択）
上記の沈殿物を乾燥させ、そして１０μｌの水に溶解し、そしてコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＫＹ８９５をエレクトロポレーションによって形質転換させるために使用した。１μｌの連結した産物を５０μｌのコンピテント細胞とともに混合し、そしてＧｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、２ＫＶ、２５μＦ、および４００オームでエレクトロポレーションした。このパルスの後、１ｍｌのＳＯＣ培地（２％ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4および２０ｍＭ グルコース）を添加し、その後３７℃で１．５時間、連続的に攪拌しながらインキュベートした。各形質転換溶液のアリコートを、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ寒天培地上に広げ、形質転換体の総数を決定した。活性なＴＫクローンについての選択を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、１０μｇ／ｍｌの５’フルオロデオキシウリジン、２μｇ／ｍｌのチミジン、２０μｇ／ｍｌのウリジン、２％ ＢＢＬペプトン、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％ グルコース、および０．８％Ｇｅｌ−Ｒｉｔｅ（Ｓｃｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｓｏｎ，ＣＡ）を含有するＴＫ選択培地上で行った（図１）。カルベニシリン培地上のコロニーを、３７℃で１４〜１６時間インキュベートし、一方、接種したＴＫ選択培地を、３７℃で２４時間インキュベートした。
カルベニシリン培地上で増殖した合計５３，０００の形質転換体から、１９０が、ＴＫ機能についてＥ．ｃｏｌｉ ＫＹ８９５を相補することが可能であった。
（実施例２）
（１００％ランダムライブラリーを利用する、コドン１６５〜１７５での変異を含有するＴＫ変異体の構築）
実施例２は、１００％ランダムライブラリーを使用しての、コドン１６５〜１７５に変異を含有するＴＫ変異体の構築を記載する。この実施例のために利用したストラテジーは、上記の実施例１において記載したものに類似する。
（Ａ．ＴＫ変異体の生成）
（１．オリゴヌクレオチドの生成）
野生型ｔｋ配列および５’末端のＫｐｎＩ部位を有する５２マーの、５’−ｄ（ＴＧ ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＣＧＧ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＧ ＡＴＣ ＧＣＣ ＡＴ）−３’（配列番号８）を、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｐａｂｌｏ，ＣＡ）によって合成した。さらに、ＨＳＶ−１のｔｋコドン１６５〜１７５に対応し、そして３’末端にＳａｃＩ部位を含有するランダムヌクレオチドを含有する５６マーである、５’−ｄ（ＡＴＧ ＡＧＧ ＴＡＣ ＣＧＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＡ ＴＧＧ ＣＧＡ ＴＣＧ ＡＡ）−３’（配列番号３）（ここで、Ｎ＝等モル濃度のＧ、Ａ、Ｔ、またはＣ）もまた合成した。そのオリゴヌクレオチドを、２０％の変性ポリアクリルアミドゲルを通しての電気泳動により、続いて逆相ミニカラム（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）上での精製によって分離した。
（２．１００％ランダム配列を含むライブラリーの作製）
野生型ＨＳＶ−１ｔｋ配列に対応する５２マーを、ランダムヌクレオチドを含有する５６マーとハイブリダイズさせた。次いで、そのハイブリッドを、本質的に実施例１に記載するように、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで伸長させ、ＰＣＲ増幅し、そしてｐＭＤＣに連結させた。
（３．ＴＫ+変異体の選択）
機能的なＴＫ変異体を、本質的に以下に記載するように、ｄＴをリン酸化するその能力に基づいてＴＫ選択培地上でのコロニー形成によって同定した。簡単には、連結した産物を、ｔｋ-Ｅ．ｃｏｌｉ株ＫＹ８９５中へ導入した。形質転換体の総数を、１ｍＬあたり５０μｇのカルベニシリンを含有するＬＢ寒天上にプレートすることによって決定し、そして触媒的に活性なチミジンキナーゼを産生した形質転換体の数を、ＴＫ選択培地［２％ ＢＢＬペプトン、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％ グルコース、０．８％ Ｇｅｌ−Ｒｉｔｅ（Ｓｃｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｓｏｎ，ＣＡ）］、５０μｇ／１ｍＬカルベニシリン、１０μｇ／ｍＬのフルオロデオキシウリジン、２μｇ／ｍＬのｄＴ、および２０μｇ／ｍＬのウリジン上にプレートすることによって決定した。
２百万（２×１０6）の形質転換体を、１００％ランダムライブラリーからスクリーニングし、そのうち１５４０がＴＫ選択培地上でコロニーを形成した。
（Ｂ．ＡＺＴ感受性変異体の選択）
１００％ランダムライブラリー（ＴＫＩ）由来の６９０の変異体、および２０％縮重ライブラリー（ＴＫＦ）由来の１９０の変異体のサブセット（上記の実施例１に記載）を、増強されたＡＺＴのリン酸化を示す変異体を同定するためにＡＺＴを含有する培地上の二次ネガティブ選択に供した。このスクリーニングは、ｄＴと比較してＡＺＴをリン酸化する増強された能力を有する変異体が、ＡＺＴ選択培地上でコロニーを形成し得ないという前提に基づいている。特に、産物であるＡＺＴモノホスフェートは、宿主細胞の非特異的ヌクレオチドキナーゼによって、またはおそらく変異体ＴＫによってさらにリン酸化され、宿主ＤＮＡポリメラーゼによって細菌ＤＮＡ中に組み込まれ、ＤＮＡ合成を終了させ、その結果宿主染色体の複製を防止する。
簡単には、ＴＫ変異体を、まずＴＫ選択培地（１．０μｇ／ｍＬのｄＴ）上で個々のコロニーとして増殖させ、次いで、ＡＺＴ選択培地（０．０５μｇ／ｍＬのＡＺＴ、１．０μｇ／ｍＬのｄＴ）上にレプリカプレートした。ＡＺＴ選択培地における全ての他の成分は、ＴＫ選択培地と同一であった。ＡＺＴ選択培地上で増殖し得なかったＴＫ変異体を選択し、そしてＴＫ選択培地およびＡＺＴ選択培地の両方で別々に再試験した。
スクリーニングされた８８０の一次選択物のうち、わずか２つの変異体、ＴＫＦ１０５（２０％ライブラリーから）およびＴＫＩ２０８（１００％ライブラリーから）が、ＴＫ選択培地上で、野生型プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉの効率と類似する効率でコロニーを形成したが、ＡＺＴ選択培地上では形成しなかった（図２）。
ＴＫＦ１０５およびＴＫＩ２０８のヌクレオチドおよび推定のアミノ酸配列を、図３に示す。両方の変異体は、同じ位置に単一のアミノ酸置換を含有する：ＴＫＦ１０５においてＬｅｕ−１７０は、Ｉｌｅ変化しており、そしてＴＫＩ２０８においてはＶａｌに変化していた。他の置換は、２２０ヌクレオチドの周囲では観察されなかった。
ＴＫＦ１０５とＴＫＩ２０８との間の差異が、変異体プラスミドおよび野生型プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉにおけるＴＫの示差的発現に起因するのではないことを確認するために、ＴＫＩ２０８か、または野生型プラスミドのいずれかを含有する細胞からの抽出物のウェスタンブロットを比較した。免疫反応性染色タンパク質の量においても電気泳動移動度においても有意な差異は観察されなかった。また、タンパク質１ｍｇあたりのｄＴリン酸化の割合を決定し、そしてＴＫＩ２０８、ＴＫＦ１０５、および野生型プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉの抽出物において同様であることを見出した。
ＡＺＴ選択培地上でのこれらの２つの変異体の増殖の欠如が、ＡＺＴの増強されたリン酸化に起因することを示すために、以下の実験を行った。
（１．［3Ｈ］ＡＺＴ取り込みの割合）
まず、野生型プラスミドおよび変異体プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ中への［3Ｈ］ｄＴに対する［3Ｈ］ＡＺＴ取り込みの割合を決定した。これらの研究は、ＡＺＴ感受性変異体、ＴＫＦ１０５およびＴＫＩ２０８を保有するＥ．ｃｏｌｉが、野生型プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉに比較して、ｄＴ取り込みに対するＡＺＴの比において４倍の増加を示すことを示した。
（２．ＴＫのアフィニティー精製）
野生型ＴＫおよび変異体ＴＫの精製を、ｐ−アミノフェニルチミジン３’−ホスフェートに結合したＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのアフィニティークロマトグラフィーによって行った。簡単には、粗細菌抽出物を、７ｍＬのベッド容量のアフィニティーカラムに３回通した。次いで、そのカラムを、それぞれ３０ｍＬの緩衝液Ａ［０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／１０％グリセロール］、緩衝液Ｂ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／０．５Ｍ ＫＣｌ／５ｍＭ ＤＴＴ／１０％グリセロール）、および緩衝液Ａを用いて連続的に洗浄した。ＴＫを、緩衝液Ｃ（０．３Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４／５０ｍＭ ＫＣｌ／１０％グリセロール）中の０−６００μＭ ｄＴの６０ｍＬの直線勾配を使用して溶出した。活性な画分をプールし、そして各２リットルの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４／５ｍＭ ＤＴＴ／１０％ グリセロールを３回交換して透析した。最後の透析を除いて、全ての上記の緩衝液は、５０μｇ／ｍＬのアプロチニンおよび各２μｇ／ｍＬのペプスタチンおよびロイペプチンを含有していた。
（３．ＡＺＴリン酸化の速度論）
第２に、２つの変異体によるＡＺＴリン酸化の速度論を決定した。簡単には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ ＤＴＴ、１２ｍＭ ＫＣｌ、０．１８ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、５％グリセロール、０．０８μＣｉの［3Ｈ］ＡＺＴ（Ｓｉｇｍａ）、種々の濃度の非標識化ＡＺＴ（０〜４．０μＭ）、ならびに精製酵素（野生型およびＴＫＩ２０８についてそれぞれ４および１．２ユニット）を含有する１００μｌの最終容量において反応を行った。（１ユニットの酵素を、上記の条件下で１分間に１．０ｐｍｏｌのｄＴをリン酸化してＴＭＰにし得る量と規定する）。３４℃±１℃で１０分間インキュベートし、そして反応を１．０ｍＭの非標識ｄＴを添加し、そして氷上で冷却することによって停止させた。反応混合物の半分を、ＤＥＡＥセルロースディスク（２５ｍｍ）上にピペットし、蒸留水中に浸し（１分）、その後無水エタノールで４回洗浄した。ディスクに吸着した放射能の量を、シンチレーション分光学によって決定した。ＫmおよびＶmaxの値を、Ｃｌｅｌａｎｄ ＳＵＢＩＮプログラム（Ｃｌｅｌａｎｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ．６３：１０３−１３８，１９７９）を使用して決定した。ｋcatの値を、式Ｖmax＝ｋcat［Ｅ］0（ここで、［Ｅ］0＝総酵素濃度である）を使用して計算した。ｄＴのリン酸化を測定したＴＫアッセイを、０．３μＣｉ（［３Ｈ−メチル］ｄＴ：８７Ｃｉ／ｍｍｏｌ：Ａｍｅｒｓｈａｍ）、種々の濃度の非標識ｄＴ（０〜４．０μＭ）、ならびに１．１ユニットおよび０．５ユニットのＴＫ（それぞれ、野生型およびＴＫＩ２０８について）を使用して、最終容量５０μｌにおいて行った。反応混合物中の全ての他の成分およびインキュベーション条件は、ＡＺＴのリン酸化についての上記と同様であった。
以下の表Ｉに記載するように、ＡＺＴ感受性改変体ＴＫＩ２０８は、野生型のＫm（８．５μＭ）と比較してより低いＫm（４．４μＭ）を示した。２つの基質（ＡＺＴ対ｄＴ）間のｋcat／Ｋmを比較することによって、ＴＫＩ２０８が、ｄＴよりも２．３倍効率的に、ＡＺＴを選択的にリン酸化することを観察し得る。精製ＴＫＦ１０５ＴＫを用いた類似の予備実験は、野生型と比較して、ＡＺＴについてはより低いＫm（３．７μＭ）を示したが、ｋcat／Ｋmについては類似の値もまた示した。
Figure 2008301828
 （Ｃ．変異体ＴＫの熱安定性の分析）
変異体を、本質的に以下に記載されるように熱安定性について分析した。簡単には、２５μｇの各抽出液を、０．２８ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、２８μｇ／ｍＬのアプロチニン、２μｇ／ｍＬ（各々）のペプスタチンおよびロイペプチンを含有する０．３ｍＬの２８ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、４２℃で、０．５、１０、２０、３０、または４０分間、予備インキュベートした。各時点で、３０μｌ（２．５μｇ）のアリコートを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ ＤＴＴ、１２ｍＭ ＫＣｌ、０．１８ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、５％グリセロール、および１μＭ［3Ｈメチル］ｄＴ（６０×１０3ｄｐｍ／ｐｍｏｌ）を含有する５０μｌの総反応容量において残りのＴＫ活性についてアッセイした。インキュベーションを３４℃で１０分間行った。反応を、氷上で冷却することによって停止させ、そして２５μｌをＤＥＡＥセルロースディスク上にピペットした。ディスクについての洗浄およびアッセイ条件は、上記のＡＺＴアッセイについて記載したのと同様に行った。
ＴＫＦ２、ＴＫＦ５６、ＴＫＦ７５、ＴＫＦ４４６、および野生型ＴＫの画分化していない抽出物のアッセイ結果を、図４Ａ〜図４Ｄにおいて示す。変異体の１つであるＴＫＦ２は、他の変異体のいずれよりも、または野生型よりも４２℃において熱安定性であった。ＴＫＦ−２を除いて、全ての試験した変異体（野生型を含む）は、３４℃と比較して４２℃での予備インキュベーション後に、０．０５〜０．３０の残りの活性の比を有した：ＴＫＦ２は、０．７の比を有した。ＴＫＦ２は、３つのアミノ酸置換を含んでいた：Ｐｒｏ−１６５→Ｈｉｓ、Ａｌａ−１６７→Ｓｅｒ、およびＡｌａ−１７４→Ｖａｌ（図３）。ＴＫＦ７５は、Ａｌａ−１６７→Ｓｅｒ置換、ＴＫＦ５６は、Ａｌａ−１７４→Ｖａｌ、およびＴＫＩ ４４０は、Ｐｒｏ−１６５→Ａｌａ置換を含んでいた。Ａｌａ−１７４→Ｖａｌ、およびＡｌａ−１６７→Ｓｅｒ置換を有する変異体ＴＫＦ５６およびＴＫＦ７５の熱不安定性は、それぞれ野生型の熱不安定性と同様であった。両方とも、５分間の４２℃でのインキュベーション後に、それらの活性を８０％より多く損失した。Ｐｒｏ−１６５→Ａｌａを有するＴＫＦ４４０は、より安定であるが、トリプル変異体であるＴＫＦ２のように安定ではなかった。
２つの型の実験を、ＴＫＦ２の熱安定性を評価するために行った。まず、ＴＫＦ２由来のＴＫタンパク質およびＥ．ｃｏｉｉを保有する野生型プラスミドを、アフィニティークロマトグラフィーによって均一にまで精製し、そして上記のようにアッセイした。前述のように、活性の喪失は、４２℃での予備インキュベーション後に、ＴＫＦ２において、野生型においてよりも少なかった（図４Ｅ）。
第２に、ＴＫＦ２および野生型ＴＫ由来のｔｋ遺伝子を、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを有するベクター中に移入した。さらに詳細には、野生型およびＴＫＦ２プラスミド由来のｔｋ遺伝子の全長Ｂｇｌ ＩＩ−Ｐｖｕ Ｉフラグメントを単離し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクターのＳｐｅ Ｉ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に合成リンカーを使用してサブクローン化した。Ｔ３プロモーターを使用するインビトロでの転写を、Ｐｒｏｍｅｇａ転写系を用いて実行した。インビトロでの転写を、網状赤血球溶解物系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を供給者のプロトコルに従って用いて実行した。４２℃でのプレインキュベーションの関数としての、野生型およびＴＫＦ２ｔｋ遺伝子からのインビトロで合成されたタンパク質のＴＫ活性の損失を、図５に示す。ＴＫＦ２によりコードされるタンパク質は、４５分間のプレインキュベーション後に、その活性の１０％未満を損失した。対照的に、野生型遺伝子によりコードされるタンパク質は、その最初の活性の８０％より多くを損失した。インビトロで合成されたＴＫＦ２により示された熱安定性の程度は、元々のＴＫＦ２プラスミドを保有している粗抽出物の熱安定性と類似したかまたはそれより大きかった。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析のために、翻訳産物を［35Ｓ］メチオニンで標識した。
ＳＤＳ／ＰＡＧＥ後の標識タンパク質のオートラジオグラフを、図６に示す。矢印は、分子量スタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により判断した場合の、翻訳されたＴＫの予想されるサイズを示す。このオートラジオグラフから、翻訳産物が、二本のバンドとして移動することが明白である。これらのバンドのうち１本は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたＨＳＶ−１ ＴＫの報告されたサイズと一致する４３ｋＤａのタンパク質に相当する。第２のバンドは、ＨＳＶ−１ ＴＫのＴＫ活性を検出可能に変化させない、アミノ末端での３２残基のフラグメントのタンパク質分解に起因し得る。
（実施例３）
（２０％ランダムライブラリーを利用する、コドン１５５、および１６１〜１６５での変異を有するＴＫ変異体の構築および分析）
この実施例は、コドン１５５、および１６１〜１６５で変異誘発されたＴＫ変異体の構築および分析を記載する。本実施例で利用された細菌株および材料を、以下に示す。
細菌株・Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＹ８９５株（Ｆ-、ｔｄｋ-、１−ｉｌｖ）（Ｉｇａｒａｓｈｉら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５７：６４３〜６５４、１９６７）によって最初に記載された）を、チミジンキナーゼ活性について遺伝的相補性アッセイに使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２株（Ｆ’ｌａｃＩqΔ（ｌａｃＺ）Ｍ１５ ｐｒｏＡＢ／ｓｕｐＥ ｔｈｉΔ（ｌａｃ ｐｒｏＡＢ）Δ（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒk -ＭｃｒＢ-））（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を、全てのサブクローニング実験でレシピエントとして使用した。ヘルパーファージＶＣＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を、配列決定のための一本鎖ファージの生成に使用した。
材料。タンパク質合成の決定のためのＬ−［35Ｓ］メチオニン／システイン（比活性、１１４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および［メチル−3Ｈ］チミジン（比活性、８７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入した。他の放射性同位体［［側鎖−２−3Ｈ］アシクロビル（比活性、２８．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および［５−3Ｈ］−デオキシシチジン（比活性、２９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をＤｕ Ｐｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、そして［８−3Ｈ］ガンシクロビル（比活性、２２Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および［メチル−3Ｈ］−３’−アジド−３’デオキシチミジン（比活性、１４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、Ｍｏｒａｖｅｋ（Ｂｒｅａ、ＣＡ）から購入した。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から購入した。Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、ＮＥＢから購入したキャップアナログ7ｍ（５’）Ｇｐｐｐ（５’）Ｇ以外のインビトロ転写および翻訳試薬の供給源であった。配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応増幅に使用したオリゴヌクレオチドを、Ｏｐｅｒｏｎ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）より得た。他の化学物質は、指定されたものを除いてＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
（Ａ．ＴＫ変異体の作製）
（１．オリゴヌクレオチドの作製）
２つのオリゴヌクレオチドを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）によって合成した：ＭＢ１１０（７０マー） ５’−ＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡ ＣＡＴＧＣＣＣＣＧＣ ＣＣ［ＣＣＧ］ＧＣＣＣＴ ＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣ ［ＴＴＣＧＡＣＣＧＣＣ ＡＴＣＣＣ］ＡＴＣＧＣ ＣＧＣＣＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号９）、およびＭＢ１１１（３８マー）５’−ＡＴＧＡＧＧＴＡＣＣ ＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧ ＧＴＡＧＣＡＣＡＧＧ ＡＧＧＧＣＧＧＣ−３’（配列番号１０）。これらのオリゴヌクレオチドの中では、括弧の中のオリゴヌクレオチドは８０％は野生型ヌクレオチドとして、そして２０％は他の３つのヌクレオチドとして合成された。
ＭＢ１１０の５’末端では、Ｓａｃ Ｉ制限部位が、そしてＭＢ１１１の５’末端ではＫｐｎ Ｉ部位がある。これらの制限部位を、２番目の鎖の合成を生じた後の以降の工程で利用した。さらに、内部コントロールとして、Ｐｖｕ ＩＩ部位を、配列決定の前にランダムな配列挿入の確認を可能にするためにＭＢ１１１中に導入した（サイレントな変化）。各オリゴヌクレオチドの３’末端での１２ヌクレオチドは、２本鎖の互いのハイブリダイゼーションを可能にするために相補的である。各オリゴヌクレオチドを、２０％アクリルアミド−尿素ゲルでの電気泳動に供し、そしてＰＥＩ−セルロースＴＬＣプレート（Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）上でＵＶ影付することにより可視化し、正確な大きさのオリゴヌクレオチドを含むゲルの１部分を切除し、そしてこのオリゴヌクレオチドを、ゲルから０．５Ｍ ＮＨ4Ａｃ、１０ｍＭ ＭｇＯＡｃ2中で３７℃で１晩溶出した。次に、溶出されたオリゴヌクレオチドを、エタノール沈殿し、そしてＨ2Ｏ中に再懸濁した。ＯＤ260の測定を行ない、そして各オリゴに対する消衰係数を用いて濃度を決定した。
等モル量のＭＢ１１０およびＭＢ１１１（２５ｐｍｏｌ）を、少容量（２０μｌ）で１×アニーリング緩衝液（１０×アニーリング緩衝液＝７０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）／６０ｍＭ ＭｇＣｌ2／２００ｍＭ ＮａＣｌ）中で９５℃で５分間アニールし、次に、２０分間６５℃に移し、続いて室温までゆっくりと冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチド（２０μｌ）に、２μｌの１０×アニーリング緩衝液、各２．８μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．８μｌの０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２．４μｌのＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント（５単位／μＬ）、および体積が４０μＬになるようなＨ2Ｏを加えた。混合物を、３７℃で３０分間、６５℃で１０分間、および最後に室温で１０分間置いた。完全に伸長した放射性オリゴヌクレオチドの確認を、変性アクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーに試料を供することにより成し遂げた。伸長した産物の増幅を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して行なった。１００μＬの反応物は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）／２５ｍＭ ＫＣｌ／１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ／各５０μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）／２２ｐｍｏｌ ＰＣＲプライマー１／２０ｐｍｏｌ ＰＣＲプライマー２／２単位のＴａｑポリメラーゼおよび６ｐｍｏｌの伸長されたランダムなオリゴヌクレオチド；プライマー１＝５’−ＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡＣＡＴＧＣＣＣＣＧＣＣ−３’（配列番号６）およびプライマー２＝５’−ＡＴＧＡＧＧＴＡＣＣＧ−３’（配列番号７）を含んでいた。１滴の鉱油を、各チューブに加え、その後、これをＰｅｒｋｉｎｓ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラー（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）に配置し、そして９５℃で１分間および３４℃で２分間の３０サイクルでプログラムした。３０サイクルの終わりに、反応物を７２℃で７分間にし、次に、サイクラーを４℃で維持した。２％アガロースゲル電気泳動による増幅の確認後、産物を含んでいる反応物をプールし、沈殿し、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化した。二重制限処理されたフラグメントを、非変性アクリルアミドゲル上で単一切断または非切断フラグメントから区別し、適切なフラグメントを上記記載のように切り出し、そして単離した。
（２．ランダムな配列を含むライブラリーの作製）
実施例１で上記記載のように構築し、塩化セシウム勾配で精製したｐＭＤＣ（「ダミー」ベクター）を、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてＧｅｎＣｌｅａｎ ＩＩ（Ｂｉｏ１０１、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて１％アガロース／１×ＴＢＥゲルからゲル単離した。このベクターを、ＰＣＲ増幅し、ゲル単離したランダムフラグメントと１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１晩連結した。
（３．ＴＫ変異体の選択）
次に、連結した混合物を、エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ、２ｋＶ、２５μＦ、４００Ω）によりＫＹ８９５を形質転換するために用いた。手短に言えば、細胞をＢｉｏＲａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）により提供されたプロトコルに従ってエレクトロポレーションのために調製した。各パルス後、１ｍＬのＳＯＣ（２％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ／０．５％酵母抽出物／１０ｍＭ ＮａＣｌ／２．５ｍＭ ＫＣｌ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2／１０ｍＭ ＭｇＳＯ4／２０ｍＭグルコース）を、キュベット（ｃｕｒｅｔｔｅ）に加え、そしてエレクトロポレーション混合物を、２５ｍＬスナップキャップＦａｌｃｏｎチューブに移した。その後、チューブを３７℃で１時間振盪し、細胞をカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢプレート［１リットルあたり：１０ｇトリプトン／５ｇ 酵母抽出物／１０ｇ ＮａＣｌ（ｐＨ７）］（「ＬＢ＋ｃａｒｂ50プレート」）上にプレーティングし、そして３７℃で１晩インキュベートした。コロニー数を計測し、爪楊枝で拾い、そしてＴＫ選択培地［２％ ＢＢＬ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）／０．５％ ＮａＣｌ／０．８％ Ｇｅｌ−Ｒｉｔｅ（Ｓｃｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｓｏｎ、ＣＡ）／０．２％グルコース／５０μｇ／ｍＬカルベニシリン／１０μｇ／ｍＬ ５’−フルオロデオキシウリジン／２μｇ／ｍＬチミジン／１２．５μｇ／ｍＬウリジン］にストリークした。この選択の基礎は、５’−フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）が、チミジンキナーゼによりリン酸化されてＦｄＵＭＰ（デノボ経路の酵素であるチミジレートシンテースのインヒビター）を形成することである。次に、ｄＴＭＰに対する要求は、活性なチミジンキナーゼによってのみ満たされ得る。ウリジンをチミジンホスホリラーゼを阻害するために供給する。１６〜２４時間後、ＴＫ選択プレートを増殖に関して記録し、任意のポジティブを拾い、そしてＴＫ選択プレートおよびＬＢ＋ｃａｒｂ50プレート上に再ストリークして表現型を確認した。
約２６０個のランダムな形質転換体を、ＴＫ選択培地上でのＫＹ８９５（ＴＫ欠損Ｅ．ｃｏｌｉ）を相補する能力についてスクリーニングした。これらのうち８２個がポジティブとして記録され、配列決定された。従って、全ての形質転換体のうちの約３２％は、機能的酵素をコードしていた。
（Ｂ．変異体の分析）
ＴＫ変異体を以下のように単離し、そして配列決定した。手短に言えば、変異体ＤＮＡを２×ＹＴ（１リットルあたり：１６ｇトリプトン／１０ｇ酵母抽出物／５ｇ ＮａＣｌ）＋ｃａｒｂ50中で、低いコピー数のプラスミドなので、１回の単離あたり３ｍＬの培養物を使用したことを除いて、製造業者の使用説明書に従ってＰｒｏｍｅｇａ Ｍａｇｉｃミニプレップキットを用いて増殖させた１晩培養物から単離した。各１０μｌのｄｓＤＮＡをアルカリ変性し、沈殿し、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ反応緩衝液、Ｈ2Ｏ、および配列決定用プライマー（５’−ＣＡＴＧＣＣＴＴＡＴＧＣＣＧＴＧＡ−３’）（配列番号１１）中に再懸濁した。次に、プライマーをアニールし、そしてＤＮＡを製造業者の使用説明書（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）に従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅを用いてジデオキシ配列決定（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）に供した。
クローンのうちの１１個は、野生型アミノ酸配列をコードし（１３．４％）、これらの内の７個は、野生型ヌクレオチド配列を含んでいた。野生型アミノ酸残基を有する３つのクローンは、単一のヌクレオチド変化（全て異なる）を含み、そして１つは、３つのヌクレオチド変化を含んでいた。以下の表ＩＡに示すように、単一なアミノ酸変化を含む計４９個のＴＫポジティブクローン（５９．８％）を同定した。１９個の２重のアミノ酸変異（２３．２％）、２個の３重変異（２．４％）および４アミノ酸変化を含む１個のクローン（１．２％）を同定した。表ＩＡ中に、変異した野生型ＨＳＶ−１ ＴＫアミノ酸を、配列の大多数において見出される残基数および残基の型をボールドフェースボックス中に与える［Ｏ＝疎水性残基；Ｉ＝親水性残基；（＋）＝正荷電残基；（−）＝負荷電残基］。野生型残基の下は、特定のアミノ酸置換が見出された時間数である。下部に、見出された残基の各型のパーセンテージを列挙する。
多重変化を有するクローンのアミノ酸配列を表ＩＢに示す。ＨＳＶ−１ ＴＫポリペプチドにおける野生型アミノ酸およびそれらの位置を表の上部に示す。２重、３重および４重のアミノ酸置換をそれぞれの分類で示す。変異体のセットが、２回以上同定された場合、出現数を左に括弧内に記す。
Figure 2008301828
Figure 2008301828
 （Ｃ．２次スクリーニングおよびサブクローニング）
ｐＭＣＣ（ＫＹ８９５）および３５対数期変異体ｐＭＤＣ（ＫＹ８９５）培養物がアシクロビル（「ＡＣＶ」）プレート上またはＡＺＴプレート上にコロニーを生じる能力を、以下に記載のような２次スクリーニングで決定した。手短に言えば、ＴＫポジティブクローンの対数期培養物を０．９％ ＮａＣｌ中に系列希釈し、そしてアシクロビルプレートまたはＡＺＴプレート（１μｇ／ｍＬチミジンを除き、１μｇ／ｍＬアシクロビルまたは０．０５μｇ／ｍＬ ＡＺＴを加えたＴＫ選択プレート）上に広げた。変異体培養物もまた、２組のＴＫ選択プレートおよびＬＢ＋ｃａｒｂ50プレート上に広げた。１セットのＴＫ選択プレートおよびＬＢ＋ｃａｒｂ50プレートを４２℃でインキュベートした。他の全てのクローンを、３７℃でインキュベートした。１６〜２４時間後、プレートを記録した。
結果を以下の表ＩＩに示す。手短に言えば、野生型ｐＭＣＣ（ＫＹ８９５）で観察された結果と異なる結果を与える変異体だけを示す。変異体を、野生型残基および位置番号の後にヌクレオチド配列より推論されるアミノ酸置換（例えば、Ｆ１６１Ｉは、イソロイシンがこの特定の変異体における残基１６１でフェニルアラニンを置換することを示す）で表す。（＋＋）は、コントロールプレートと比較して同数のコロニーが観察されたことを示し；（＋）は、コントロールプレートと比較して少数（ｐＭＣＣで観察したコロニーの約２０％より少ない）および一般に小さい（約５０％より小さい直径）コロニーが観察されたことを示し；そして（−）は、コロニーが観察されなかったことを示す。
Figure 2008301828
 表ＩＩに示すように、全ての培養物は、コントロールのＴＫ選択プレートおよびＬＢ＋ｃａｒｂ50プレート上にコロニーを形成した。野生型と比較して、いくつかの変異体は、チミジンを超えて１つまたは両方のヌクレオシドアナログを優先的に利用するようであった（Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１Ｖ、Ｆ１６１Ｉ、Ｆ１６１Ｃ、およびＲ１６３Ｐ／Ｈ１６４Ｑ）。さらに、いくつかの変異体は、４２℃でＴＫ選択プレート上にコロニーを形成できず（Ｆ１６１ＬおよびＲ１６３Ｐ／Ｈ１６４Ｑ）、そして１つ（Ｆ１６１Ｉ／Ｒ１６３Ｈ）は、４２℃でコロニーを形成する能力の激しい減少を示した。
（Ｄ．無細胞翻訳系における変異体酵素の発現）
（１．選択された変異体のサブクローニング）
変異体ＴＫの特性を研究するために、８つの変異体の１．０７ｋｂｐ ＭｌｕＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントを、インビトロでベクターｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩにサブクローニングした。より詳細には、選択したクローンのＤＮＡを、ＭｌｕＩおよびＢｓｓＨＩＩで制限処理して１．０７ｋｂｐフラグメント［ＭｃＫｎｉｇｈｔ配列（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：５９４９〜５９６４、１９８０；ＭｃＫｎｉｇｈｔ株は、ＨＳＶ−１のｍｐ株（Ｗａｇｎｅｒ、ＰＮＡＳ ７８：１４４１〜１４４５、１９８１）に由来した）上でヌクレオチド番号約３３５から１４００］を遊離させた。このフラグメントを、ＧｅｎＣｌｅａｎＩＩを用いて１％アガロースゲルからゲル単離し、ＭｌｕＩおよびＢｓｓＨＩＩで制限処理され、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理され、ゲル単離されたｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩベクターＤＮＡに連結した。ｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩは、ＢｌａｃｋおよびＨｒｕｂｙにより、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９７４３〜９７４８，１９９２に記載される、ｐＴ７：ＨＳＶＴＫ転写ベクターから誘導した。手短に言えば、ｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩは、ｔｋ遺伝子の最初のクローニングを助けるために元々使用した、ＨＳＶ−１ ｔｋ遺伝子の末端の３’側のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの欠損だけがｐＴ７：ＨＳＶＴＫと異なる。
（２．配列分析）
ｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩベクター中にサブクローニングされた、８つの変異体フラグメントの最後の配列分析において、２つの付加的なアミノ酸の差異を、これらのｔｋ遺伝子の間で同定した。ｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩの配列は、ＭｃＫｎｉｇｈｔ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ８（２４）：５９４９〜５９６３、１９８０）により公開された配列と正確に同じである。ｐＭＤＣの親のプラスミドであり、そしてそれ故に、ランダムな配列が連結されたベクターであるｐＭＣＣは、ＭｃＫｎｉｇｈｔ配列から２つのアミノ酸異常を含む。これらは、４３４位（Ｃ→Ｔ）および５７５位（Ｇ→Ａ）であり、そしてプロリン４９からロイシンへおよびアルギニン８９からグルタミンへの変化を結果として生じる。従って、全ての変異体は、記載された変異に加えて、これらの２つの変異を含む。さらに、４８０位での単一のヌクレオチドの相違（Ｃ→Ｔ）もまた同定されたが、これはアミノ酸変化を結果として生じない。
全てのインビトロ分析を野生型としてｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩに対して比較したので、ｐＭＣＣ由来のＭｌｕＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントを、ｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩ（ここでｐＴ７：ＭＣＣと称する）の対応する部位の中にサブクローニングし、そして引き続いて無細胞翻訳産物を、ｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩ由来の産物と比較した。経時分析および熱安定性分析は、ｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩ由来翻訳産物とｐＴ７：ＭＣＣ由来翻訳産物との間で顕著な相違を示さなかった。チミジン（１．３倍）、デオキシシチジン（１．３倍）、ＧＣＶ（０．８倍）、ＡＣＶ（０．９５倍）、またはＡＺＴ（１．１倍）を基質として使用した場合、リン酸化効率における顕著な差異は、ｐＴ７：ＭＣＣとｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩの間で観察されなかった。さらに、Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２：９１７〜９１９、１９８８）は、ｐＨＥＴＫ２（ｐＭＣＣの親プラスミド）を保持しているＥ．ｃｏｌｉおよびＨＳＶ−１感染細胞から精製されたＴＫのチミジンおよびＡＴＰに対するＫm、ならびにＶmaxが、識別不能であったことを報告した。従って、変異体ＹＫの特性において観察される変化は、標的領域内でのヌクレオチド置換に寄与し得、そしてベクター（ｐＴ７：ＭＣＣおよびｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩ）の間のその任意の相違は、触媒特性に重要でない変化しか発揮しなかった。
（３．インビトロでの転写および翻訳）
次に、上記記載の転写物を、ウサギ網状赤血球溶解物無細胞翻訳系において使用して活性な酵素を合成した。無細胞翻訳は、ヌクレアーゼで処理されたウサギ網状赤血球溶解物を用い、Ｐｒｏｍｅｇａに従った。
全長タンパク質の発現を、35Ｓ放射性標識化無細胞翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーに供することにより分析した。手短に言えば、各１μｌの放射性標識化無細胞インビトロ翻訳に由来する変異体ｍＲＮＡを、ＳＤＳを含むポリアクリルアミド（１２％）ゲル電気泳動に供した。このゲルのオートラジオグラフを、図７に示す。第１レーンは、左に与える見かけ上の分子量（×１０-3）を有する14Ｃ標識化レインボー分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む。第２レーンは、付加ｍＲＮＡの全くの不在下で実行した無細胞翻訳に対応する。第３のレーンは、野生型ｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩ ｍＲＮＡ翻訳産物に対応する。他の全てのレーンは、上記記載のように生成された変異ｍＲＮＡの翻訳産物を含んでいた。図７より明白なように、各変異体転写物由来の主要な放射性標識化翻訳産物は、野生型ｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩ転写物由来の翻訳産物で観察されたのと同じ電気泳動移動度で、約４３ｋＤａのタンパク質として、電気泳動中に移動する。
各翻訳に対するタンパク質合成のレベルの決定のために、各同じ試料からトリクロロ酢酸で沈殿性のカウントの決定を３連で実行した。酸沈殿性のカウントの量は、図７において各変異体のバンド強度に匹敵する。
（Ｅ．変異体酵素の経時分析）
ＴＫ活性を基礎として、変異体ＴＫを２つのサブセットに分類した：（１）高活性変異体（Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１Ｖ、Ｆ１６１Ｉ、Ｆ１６１Ｃ、およびＤ１６２Ｅ）；（２）低活性変異体（Ｆ１６１Ｉ／Ｒ１６３Ｈ、Ｆ１６１Ｌ、Ｄ１６２Ｇ、およびＲ１６３Ｐ／Ｈ１６４Ｑ）。高活性変異体酵素に関して、非標識翻訳産物を１／９に希釈し、そして３０℃で０、５、１０、２０、または３０分間インキュベートした。この実験の結果を、図８Ａに示す。ＴＫ活性の結果（カウント／分）を、対応するＴＣＡ沈殿性のカウント（35Ｓ ｃｐｍ）を用いて、等価なタンパク質合成レベルを反映するために調整した。変異体のうちの２つ（Ｆ１６１ＩおよびＰ１５５Ａ／Ｆ１６１Ｖ）は、野生型ＴＫよりも統計的に高い、チミジンに対する親和性を示した。Ｆ１６１ＣおよびＤ１６２Ｅの活性の標準偏差（データは示さない）は、野生型ＴＫ酵素活性と比較した場合、活性に差がないことを示す。
低活性変異体を、１／５に希釈し、そして時間の関数としてのリン酸化の速度もまた決定した。この実験の結果を図８Ｂに示す。経時分析は、ほとんどの変異体が野生型活性の１０％未満の活性を有することを示す。しかし、１つの変異体Ｆ１６１Ｌは、ＨＳＶＴＫＩＩからずっと非常に減少した速度においてではあるが、チミジンをリン酸化する中程度の能力を示した。
（Ｆ．熱安定性アッセイ）
ＴＫ選択プレート上でのコロニー形成に関するアッセイにおいて、いくつかの変異体は、４２℃でＫＹ８９５を相補し得た。このことはこれらの変異体ＴＫが熱感受性であることを示す。この観察を実証するために、無細胞翻訳産物を、酵素活性に関してアッセイする前に、徐々に長くなる時間の間、４２℃でインキュベートした。手短に言えば、各高活性変異体の無細胞翻訳（「ＣＦＴ」）産物（−ＲＮＡ）、およびＨＳＶＴＫＩＩ試料を、１／９に希釈し、そして４２℃で０、５、１０、および２０分間インキュベートした。次に、プレインキュベートした試料を、５分間（Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１ＶおよびＦ１６１Ｉ）または２０分間（−ＲＮＡ、ＨＳＶＴＫＩＩ、Ｆ１６１Ｃ、およびＤ１６２Ｅ）アッセイした。残存する活性のパーセントを、未処理の試料を１００％にして決定した。図９Ａに示すように、Ｆ１６１Ｃを除いて、全ての高活性変異体は、６０分間という長時間の４２℃でのプレインキュベーション時間の後、ＨＳＶＴＫＩＩと類似の熱安定性を示した（データは示さない）。Ｆ１６１Ｃは、４２℃での最初の２０分以内に９０％より大きい酵素活性を失ったので、４２℃でのより短いインキュベーション時間を実行した（０、５、１０、および２０分間）。Ｆ１６１Ｃは、４２℃での５分間だけの後、約８５％の活性の損失を示して、例外的に熱不安定性であった。
低活性変異体ＣＦＴ産物を、１／５に希釈し、そして４２℃で０、２０、４０、および６０分間インキュベートした。次いで、プレインキュベートした試料を、チミジンリン酸化に関して６０分間、３連でアッセイした。残存する活性のパーセントを、未処理（時間０）の試料を１００％として用いて決定した。図９Ｂに示すように、低活性変異体のサブセットに関しては、１つの翻訳産物（Ｆ１６１Ｌ）は、ＨＳＶＴＫＩＩよりさらに熱不安定性であった。このセットにおける別の変異体（Ｒ１６３Ｐ、Ｆ１６１Ｉ／Ｒ１６３Ｈ、Ｈ１６４Ｑ、およびＤ１６２Ｇ）は、ＨＳＶＴＫＩＩと等価であった。
（Ｇ．基質特異性アッセイ）
変異体のうちの３つ（Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１Ｖ、Ｆ１６１ＩおよびＦ１６１Ｃ）を、基質としてチミジン、デオキシシチジン、ＡＣＶ，ＧＣＶ，またはＡＺＴを用い、リン酸化の相対レベルに関して３連でアッセイした。手短に言えば、４８μｍｏｌの各トリチウム化した基質を、各アッセイ反応に使用した。翻訳産物を、以下のように各ヌクレオチドアッセイのために希釈した（翻訳物／Ｈ2Ｏ）：１／１００、チミジン；２／３、デオキシシチジン、ＧＣＶ、およびＡＺＴ；４／１、ＡＣＶ。アッセイの各セットを、３０℃で２時間インキュベートし、そしてリン酸化産物の量を決定した。
アッセイの各セットのカウント／分を、調整し、そして図１０に示すようにプロットした。手短に言えば、Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１ＶおよびＦ１６１Ｉの両方は、ＨＳＶＴＫＩＩと比較して、それぞれ２．６倍および２．２倍上昇したチミジンリン酸化能を示した。変異酵素によるデオキシシチジンのリン酸化は、野生型酵素に対して１．９倍〜２．８倍の範囲であった（Ｆ１６１Ｉ、１．９倍；Ｆ１６１Ｃ、２．８倍；Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１Ｖ、２．８倍）。２つの変異体はＡＣＶをリン酸化する増強された能力を共有するようであった（Ｆ１５５Ａ／Ｆ１６１ＶおよびＦ１６１Ｃは、ＨＳＶＴＫＩＩに対してそれぞれ２．４倍および２倍）。全ての変異体は、ほぼ野生型のレベルのＡＺＴリン酸化を示した。アッセイされた全ての変異体は、野生型リン酸化レベルと比較して３．９倍〜５．２倍のＧＣＶリン酸化の大きな増強を共有するようであった。
（実施例４）
（変化した触媒効率を有するＴＫ変異体の分析）
変化した触媒活性を有する変異体を同定するために、実施例１で単離されたＴＫ変異体（ＴＫＦ）のうちの１９０個を、以下に記載のアッセイで分析した。
（Ａ．機能的なチミジンの取り込みとしてのコロニー形成能力）
精製された酵素のタンパク質含量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイの変法により見積もった。標準曲線を、１２５μｌの最終体積中のＢＳＡおよび２５μｌのＢｉｏ−Ｒａｄ試薬を用いて確立した。タンパク質量を、５９５ｎｍでのＯＤを測定し、そしてこのＯＤをＢＳＡのＯＤと比較することにより決定した。
変化したＴＫ活性を有する変異体を同定するために、２次スクリーニングプロトコルを、異なった濃度のチミジンを含む培地上で変異体が増殖する能力に基いて設計した（表Ｉ）。手短に言えば、野生型ｔｋプラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉの増殖を支持する培地中のチミジンの最小濃度および最大濃度が、１．０μｇ／ｍＬおよび１０．０μｇ／ｍＬであることを、まず確立した。野生型プラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉが、低濃度（０．０５μｇ／ｍＬ）のチミジンを含むＴＫ選択培地上で肉眼で見えるコロニーを形成し得ないので、このチミジン濃度での増殖は、変異体がチミジンをリン酸化する増大した能力を有することを示し得ることが仮定される。従って、０．０５μｇ／ｍＬのチミジンを、高ＴＫ活性を有する改変体を選択するために使用し、２０μｇ／ｍＬのチミジンを低活性を有する改変体を選択するために使用した。
以下の表Ｉは、選択された変異体がｔｋ-Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＹ８９５を機能的に相補する能力を漸増するチミジン濃度の関数として示す。１９０個の全てのＴＫ改変体および野生型を、表Ｉに示したチミジン濃度でスクリーニングに供した場合、ただ１つの改変体ＴＫＦ３６が、試験された最低チミジン濃度（０．０５μｇ／ｍＬ）でコロニーを形成した。一方、ＴＫＦ４１だけは、培地中の最高チミジン濃度で増殖した。他の１８８個の変異体および野生型の全ては、１μｇ／ｍＬのチミジンを含む培地上で肉眼で見えるコロニーを形成した。
Figure 2008301828
 （Ｂ．高活性クローンおよび低活性クローンの配列分析）
野生型ｔｋおよび選択された変異体を、上記で実施例２に記載したように配列決定した。表ＩＩは、コドン１６５〜１７５の野生型ｔｋおよび選択された変異体のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸の配列を示す。手短に言えば、低チミジン含有培地上でコロニーを形成する変異体であるＴＫＦ３６は、ただ１つのアミノ酸置換（Ａｌａ１６８→Ｓｅｒ）を含む。一方、ＴＫＦ４１は、４つの置換を含んでいた：Ｐｒｏ１６５→Ｓｅｒ、Ａｌａ１６７→Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１７０→Ｇｌｎ、およびＡｌａ１７４→Ｖａｌ。興味深いことに、ＴＫＦ５２は、ＴＫＦ３６と同じ位置で異なったアミノ酸置換（Ａｌａ１６８→Ｔｈｒ）を有するが、低チミジン含有培地上でコロニーを形成し得ない。ＴＫＦ９９は、２つのアミノ酸置換（Ｃｙｓ１７１→ＬｅｕおよびＡｌａ１７４→Ｔｈｉ）を含む。ＴＫＩ２０８は、Ｌｅｕ１７０→Ｖａｌ置換を生じる単一のヌクレオチド置換を有する。
Figure 2008301828
 （Ｃ．野生型ＴＫプラスミドおよび変異体ＴＫプラスミドを保持しているＥ．ｃｏｌｉへのチミジンの取り込み）
野生型プラスミドまたは変異体プラスミドを保持しているＥ．ｃｏｌｉへのチミジンの取り込みの実際のレベルを確認するために、以下のアッセイを行なった。
（１．［メチル−3Ｈ］チミジン取り込みアッセイ）
野生型プラスミドまたは変異体プラスミドを保持しているＥ．ｃｏｌｉへの［メチル−3Ｈ］チミジン取り込みを、本質的に以下のように決定した。手短に言えば、ｐＭＤＣ（不活性ＴＫ）、野生型ＴＫを含むプラスミドまたはＴＫ３６、を含むＥ．ｃｏｌｉの１晩培養物を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地で１：１００に希釈し、Ａ550で０．１ ＯＤになるまで培養し、３７℃に移し、激しく振盪しながらインキュベートした。一旦、１．０のＯＤに達したら、培養物を、室温（約２５℃）にし、そしてチミジンを最終濃度０．２１μＭ（０．１６μＣｉ［メチル−3Ｈ］チミジン）で１．０ｍＬアリコートに加えた。２２℃で０、５、１０、２０、３０、および６０秒間のインキュベーション後、５０μｌのアリコートを、ニトロセルロースフィルター（０．４５μｍ）上に移し、減圧下で１０ｍＬの冷却した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．９％ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し、そしてシンチバース（ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ）ＢＤ（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてシンチレーションカウンターでカウントした。結果を図１１に示す。手短に言えば、ｐＭＤＣを保持しているＥ．ｃｏｌｉへのチミジンの取り込みは、本質的になかった。ＴＫＦ３６を保持しているＥ．ｃｏｌｉにおけるチミジンの取り込み量は、野生型プラスミドを保持しているＥ．ｃｏｌｉにおいてよりも４２％多かった（１０秒間のインキュベーション後、１２．７ｐｍｏｌ／１０8細胞と比較して１８ｐｍｏｌ／１０8細胞）。
（２．酸不溶性物質への［メチル−3Ｈ］チミジンの取り込み）
野生型および変異体プラスミドを含む粗Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物におけるＴＫ活性の量を、酸不溶性物質へのチミジンの取り込みを測定することにより、間接的に決定した。
手短に言えば、培養物を、第１章に上記記載のように増殖した。０．５ｍＬの培養物に、チミジンを最終濃度１．３２μＭ（０．２μＣｉ［メチル−3Ｈ］チミジン）で加えた。３０μｌアリコートを、示された時間のインキュベーション後に取り出し、そして２．０ｍＬの５％冷過塩素酸に加えた。沈殿物を洗浄し、そして酸不溶性物質へ取り込まれた放射能を、本質的にＤｕｂｅら、１９９１により記載されたように決定した。
図１２は、酸不溶性産物への［メチル−3Ｈ］チミジンの取り込みが、ＴＫＦ３６ Ｅ．ｃｏｌｉでは、野生型プラスミドまたは試験された他のｔｋ変異体を保持しているＥ．ｃｏｌｉよりも迅速であることを示す。変異体のうちの１つであるＴＫＦ９９（２つのアミノ酸置換（Ｃｙｓ１７１→ＬｅｕおよびＡｌａ１７４→Ｔｈｒ）を有する）は、野生型と同じ速度のチミジン取り込み速度を示した。ＴＫＦ５２は、Ａｌａ１６８→Ｔｈｒ置換（ＴＫＦ３６のＡｌａ１６８→Ｓｅｒに匹敵する）を含み、そして最低チミジン含有ＴＫ選択培地においてコロニーを形成し得ないが（表Ｉ）、野生型の速度よりも速い速度であるが、ＴＫＦ３６よりも遅い速度で、酸不溶性物質へチミジンを取り込む。
（Ｄ．野生型および変異体ＴＫＳの精製）
異なった変異体の粗抽出物を、Ａ550が０．１ ＯＤになるまで３０℃で増殖し、３７℃に移し、そして１．０ ＯＤまで増殖させた１１個の培養物から得た。細胞を４℃で遠心分離により収集し、２５％（ｗ／ｖ）スクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２５ｍＬの溶液で洗浄した。遠心分離後、細胞ペレット（約５〜６ｇ重量）を−７０℃で保存した。細胞ペレットを融解し、そして２０ｍＬの緩衝液Ｉ（緩衝液Ｉは、１容量の０．３Ｍスペルミジン−ＨＣｌ、２．０Ｍ ＮａＣｌ、１０％スクロースおよび０．５ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐＨ７．５）と混合した１０容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％スクロースからなる）中に懸濁した。一旦、再懸濁物が均一になったら、６．２５ｍｇのリゾチームを含む４．０ｍＬの緩衝液Ｉを加えた。懸濁物を冷却した遠心分離用チューブに注ぎ、そして３０分間氷上に置いた。細胞が、３０分以内に溶解しなかった場合、溶解を増強するためにチューブを４〜６分間３７℃ウォーターバス中に置いた。一旦、細胞が、糸を引くことの増加により判断されるように溶解し始めたら、５０μｇ／ｍＬアプロチニンならびに各２μｇ／ｍＬのロイペプチンおよびペプスタチンを含む２〜３ｍＬの冷却緩衝液Ｉを最終体積が２５ｍＬに成るように加え、そして混合物を、４℃で１時間２８，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして上清を７０℃で保存した。
野生型および変異体ＴＫを、ＬｅｅおよびＣｈｅｎｇ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：２６００〜２６０４、１９７６）による変法を加えたＫｏｗａｌおよびＭａｒｃｕｓ（Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：３６９〜３８５、１９７６）より記載されたように、ｐ−アミノフェニルチミジン３’−リン酸がＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合したマトリックスでアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＴＫの精製において使用した全ての緩衝液は、５ｍＭ ＤＴＴ、５０μ／ｍＬアプロチニン、各２μｇ／ｍＬロイペプチンおよびペプスタチン、ならびに１ｍＭ ＰＭＳＦを、そうでないと表示される場合を除いて含んでいた。７ｍＬのベッド容積のカラムを、緩衝液Ａ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール）で平衡化し、次に、８〜１０ｍＬ／時の速度で、約２５ｍＬの未分画の上清をロードした。カラムに、素通り画分を２回再度通し、次に、連続的に１０ベッド容積の緩衝液Ｂ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＫＣｌ、１０％グリセロール）で洗浄し、その後、１０ベッド容積の緩衝液Ａで洗浄した。ＴＫを各３０ｍＬの緩衝液Ａおよび緩衝液Ｃ（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール）を用いてチミジンの線形勾配（０〜６００μＭ）で溶出した。ＴＫアッセイを全ての画分について行ない、そしてピークのＴＫ画分をプールし、そして２１の透析緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール）に対して３回交換して透析した。最終の透析において、プロテアーゼインヒビターを緩衝液から除き、透析画分を等分し、そして−７０℃で保存した。カラムを各抽出調製物の適用の前に、上記記載と同一の洗浄および溶出プロトコルを用いることにより、徹底的に２度洗浄した。
精製酵素のタンパク質含量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイの変法により見積もった。標準曲線を、１２５μｌの最終体積中のＢＳＡおよび２５μｌのＢｉｏ−Ｒａｄ試薬を用いることによって確立した。タンパク質量を、５９５ｎｍでのＯＤを測定すること、およびこのＯＤをＢＳＡのＯＤと比較することにより決定した。
（［メチル−3Ｈ］チミジンの取り込み）
結果を図１１に示す。手短には、ｐＭＤＣを保持するＥ．ｃｏｌｉにおいてチミジンの取り込みは本質的になかった。ＴＫＦ３６を保持するＥ．ｃｏｌｉにおけるチミジンの取り込み量は、野生型プラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉにおける取り込み量よりも４２％多かった（１０秒間のインキュベーション後、１２．７ｐｍｏｌ／１０8細胞と比較して１８ｐｍｏｌ／１０8細胞）。
野生型プラスミドおよび変異体プラスミドを含む粗Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物におけるＴＫ活性の量を、酸不溶性物質へのチミジンの取り込みを測定することにより間接的に決定した。
（Ｅ．精製した変異体チミジンキナーゼの反応速度論的パラメーター）
今までに研究された３つの細胞性のパラメーターは、ＴＫＦ３６が、試験された任意の他の変異体酵素または野生型よりも活性な酵素であることを示唆する。触媒の反応速度論的パラメーターを決定するために、野生型、ＴＫＦ３６、および３つの他の変異体チミジンキナーゼを、上記記載のようにアフィニティークロマトグラフィーを用いてほぼ均一に精製した。精製した野生型、ＴＫＦ３６、およびＴＫＩ２０８を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ系での電気泳動により試験し、そして銀染色により９５％均質であると判断された４３ｋＤａで移動した単一の顕著なバンドを示すことを見出した。
反応速度論的パラメーターを、本質的に以下に記載のように決定した。手短には、ＴＫアッセイ混合物（５０μｌ）は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ ＤＴＴを含んでいた。１２ｍＭ ＫＣｌ、０．１８ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、５％グリセロール、１μＭチミジン（０．３μＣｉ［メチル−3Ｈ］チミジン）および表示した量の精製酵素。チミジンリン酸化の反応速度論を、非標識チミジン濃度を変化させ（０〜４．０μＭ）、そして既知量の精製酵素（精製ＴＫのｓｐ．作用が、それぞれ野生型、ＴＫＦ３６、ＴＫＩ２０８、ＴＫＦ９９、およびＴＫＦ４１に関して１．１、３．０、０．５、０．３４、および０．０１単位であった）により決定した。１単位の酵素を、上記記載の条件下で１分で１．０ｐｍｏｌのチミジンをチミジル酸にリン酸化する量として定義する。インキュベーションは、３４±１℃で１０分間であった。反応を１ｍＭ冷チミジンの添加により停止した。反応混合物の半分を、ＤＥＡＥ−セルロースディスク（２５ｍｍ）上にピペットで移し、そしてディスクを蒸留水中に浸漬（１分間）し、続いて、各１０ｍＬの無水エタノール中で４回洗浄した。ディスク上に吸着した産物を、シンチレーションカウンターでカウントした。速度論的パラメーターＫmおよびＶmaxを、Ｃｌｅｌａｎｄ ＳＵＢＩＮプログラム（Ｃｌｅｌａｎｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６３：１０３〜１３８、１９７９）を用いることにより決定し、ｋcat値を、式Ｖmax＝ｋcat［Ｅ］0から計算した。ここで［Ｅ］0は、全酵素濃度である。
これらのアッセイの結果を、表ＩＩＩに要約する。ＴＫＦ３６におけるＡｌａ１６８→Ｓｅｒ置換は、ｋcatにおいて４．８倍の増強を生じた。分析した他の精製した変異体酵素（ＴＫＦ４１、ＴＫＦ９９、およびＴＫＩ２０８）は、ｋcatにおいて野生型ＴＫのｋcatと比較して増加を示さなかった。ｋcatにおける２．２倍の減少は、ＴＫＩ２０８におけるＬｅｕ１７０→Ｖａｌ置換に起因するが、インビボアッセイにおいて減少した効率を有する、他のｔｋ変異体のうちの２つであるＴＫＦ９９およびＴＫＦ４１は、ｋcatにおいて２８倍および３４７００倍の減少を示した。表ＩＩＩはまた、基質としてチミジンを用いる、変異体および野生型についてのミカエリス定数（Ｋm）を示す。野生型酵素についての見かけののＫmは、０．４７μＭであり、これは、以前に報告された値（ＪａｍｉｅｓｏｎおよびＳｕｂａｋ−Ｓｈａｒｐｅ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２４：４８１〜４９２、１９７４；Ｅｌｉｏｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．７３：７〜１３、１９８２；Ｗａｌｄｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１５７１〜１１５７５、１９８３）とよく一致する。ＴＫＦ３６がより高いｋcat値を示したとはいえ、チミジンに対するＴＫＦ３６の親和性は、Ｋmに反映されるように、野生型ＴＫよりも６．２倍低い。ＴＫＩ２０８、ＴＫＦ４１、およびＴＫＦ９９は、野生型のＫmと類似のＫmを有する。興味深いことに、ＴＫＦ３６のｋcat／Ｋm値［２．０×１０6ｓ-1Ｍ-1］は、野生型［２．５×１０6ｓ-1Ｍ-1］と大きく違わなかったが、ＴＫＩ２０８、ＴＫＦ９９、およびＴＫＦ４１は、それぞれ１．５７×１０6ｓ-1Ｍ-1、０．１５×１０6ｓ-1Ｍ-1、および０．０００１２×１０6ｓ-1Ｍ-1というより低い値を示す。
Figure 2008301828
 （実施例５）
（変異体ＨＳＶ−１ ＴＫを含むレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞の選択的殺傷）
本実施例は、１型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、１５５位でのプロリンからアラニンへの変異、および１６１位でのフェニルアラニンからバリンへの変異を発現するレトロウイルスベクターの構築を記載する。
（Ａ．ベクター構築）
Ｐ１５５Ａ／Ｆ１６１Ｖ由来のチミジンキナーゼ遺伝子を、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：８３、１９９３を参照のこと）からの、モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭｏＭＬＶ」）ベースのベクターＧ１ＴｋＳｖＮａ．９０における野生型ＨＳＶｔｋ配列を置換するために利用する。特に、変異体ｔｋ遺伝子を、ｔｋ遺伝子がプロモーターとして使用する、５’長末端反復配列から下流に挿入する。このベクターはまた、ＳＶ４０初期プロモーターから発現されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）を含む。
（Ｂ．プロデューサー細胞株）
次に、上記記載のレトロウイルスベクターを、リン酸カルシウムトランスフェクション後、両種同性レトロウイルスパッケージング細胞株ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２（米国特許第５，２７８，０５６号）によりパッケージングし得る。β−ガラクトシダーゼの遺伝子を含むベクターを、コントロールベクターとして使用する。クローン化されたベクタープロデューサー細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、５０単位／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２．５μｇ／ｍｌ ファンジゾンを有するダルベッコ改変イーグル培地を含む培養液中で維持する。投与の前に、培地を除去し、細胞を生理食塩水ですすぐ。単層を３７℃で５〜１０分間トリプシン処理し、収集し、２度洗浄し、そして５〜１０×１０8細胞／ｍｌで再懸濁する。
（Ｃ．ガンシクロビルへのインビトロでの感受性）
変異体または野生型ｔｋ遺伝子を含むベクターを形質導入した細胞の感受性を評価するために、ラット９Ｌ神経膠腫細胞およびヒトＵ２５１神経膠芽腫細胞を、複製不能なベクター粒子を含む上清に細胞を暴露することにより、インビトロで形質導入する。形質導入された細胞を培養培地中にＧ１４８（１ｍｇ／ｍｌ）を含めることにより選択する。次に、形質転換されなかった細胞、ＨＳＶ ｔｋ野生型が形質導入された細胞、およびＨＳＶ ｔｋ変異体が形質導入された細胞を、漸増するレベルのガンシクロビルに対するそれらの感受性について評価する。ＤＮＡ合成レベルを、種々のガンシクロビル曝露時間およびガンシクロビルレベルの後の、トリチウム化チミジン取り込みにより決定する。細胞生存率を、ガンシクロビルの非存在下または種々のガンシクロビル濃度の存在下で、１０ｃｍ組織培養プレートに細胞をプレーティングすることにより、そして２４時間間隔で細胞数をカウントすることにより決定する。
（Ｄ． インビトロ形質導入）
腫瘍細胞におけるベクター遺伝子発現のインサイチュ形質導入の効率、およびベクター遺伝子発現の相対レベルを、βガラクトシダーゼを含むベクターを用いて決定する。手短に言えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラットを、麻酔し、そして定位注入装置に連結した１０μｌハミルトンシリンジを用い、４×１０4同系９Ｌ神経膠肉腫細胞を注入する。１０日後、同じ定位置を、１．５×１０6、３×１０6、または６×１０6ＨＳＶｔｋ（野生型または変異型）β−ガラクトシダーゼ形質導入プロデューサー株細胞または非形質導入プロデューサー株細胞、およびプロデューサー株細胞上清を９Ｌ腫瘍内に直接注入するために使用する。コントロールとして、ラットに細胞に代えて同容積の滅菌生理食塩水を注入する。次に、ガンシクロビルを投与し、そしてラットを、抗腫瘍効果を決定するために屠殺する。組織学的な実験もまた行なう。
（Ｅ．ガンシクロビルの用量最適化）
ラットに、４×１０4ＨＳＶｔｋ（野生型または変異型）あるいはβ−ガラクトシダーゼを形質導入したラット９Ｌプロデューサー細胞を大脳内に注入した。接種後７日、ガンシクロビルを、７日間、毎日２回５、２０または１５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与する。コントロールのラットは、生理食塩水の腹腔内注射を受ける。全てのラットをガンシクロビル処置後屠殺し、脳および腫瘍を重量決定および組織学的実験のために取り出す。
（Ｆ．野生型および変異体ＨＳＶｔｋ形質導入ならびにＧＣＶでの腫瘍後退）
ガンシクロビル投与最適化の結果に基いて、形質導入もしくは非形質導入プロデューサー株細胞、または産生された細胞上清を接種されたラット腫瘍に、特定の時間期間の間ガンシクロビル用量を投与した。抗腫瘍効果を、腫瘍重量の決定および組織学的実験により決定した。
（実施例６）
（選択的相同組換えのための標的としてのＶＺＶ ＴＫ変異体の使用）
この実施例は、安定トランスフェクト化細胞株、系統、または組換えウイルスの構築における相同組換えのための標的としての変異体水痘‐帯状ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「ＶＺＶ ｔｋ」）の使用を記載する。特に、ＴＫ+細胞株における組換えウイルスの選択のための変異体ＶＺＶ ＴＫを含むクローニングベクターとしてのワクシニアウイルスの構築を記載する。
（Ａ．ＶＺＶ ＴＫ変異体を含む組換えワクシニアウイルスプラスミドの構築）
ＶＺＶ ｔｋ遺伝子（野生型および変異体）を、構成的な遺伝子発現のために、組換えプラスミド内のワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターの後にクローン化する。さらに、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、選択マーカーとして役立つように、ＶＺＶ ｔｋ遺伝子の３’末端の後にクローン化する。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするワクシニアウイルスの５’または３’領域は、ＶＺＶ ｔｋ遺伝子の５’末端およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）の３’末端に隣接する。これは、ウイルスゲノム内へのＶＺＶ ｔｋ遺伝子の挿入、およびワクシニアチミジンキナーゼ遺伝子の付随した不活性化を受容する。プラスミドの残部は、ｐＵＣに基き、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの維持のためのＣｏｌＥ１複製起点を含む。
（Ｂ．組換えポックスウイルスの構築）
ＶＺＶ ｔｋ（野生型または変異体）＋ｎｅｏ組換えプラスミドあるいはｎｅｏ遺伝子だけを含む組換えプラスミドを、ＢＳＣ４０細胞内に野生型ワクシニアウイルスと共に同時トランスフェクトする。組換えウイルスを、Ｇ４１８に対する耐性により選択する。数回のプラーク精製の後、組換えウイルスを、外来遺伝子の挿入およびその位置を確認するためにプラークハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ分析に供する。
（Ｃ．ガンシクロビルの用量最適化）
ワクシニアウイルスを感染したＢＳＣ４０細胞株および感染していないＢＳＣ４０細胞株を、耐性レベルを決定するために種々の用量のガンシクロビルでの処置に供する。ＶＺＶ ＴＫおよびｎｅｏを発現する組換えウイルス、またはｎｅｏのみを発現する組換えウイルスで感染された細胞を、種々のレベルのガンシクロビルの存在下で増殖させる。ＶＺＶ ｔｋ遺伝子を含むウイルスは、細胞のみまたは野生型ワクシニアウイルスで感染した細胞よりもガンシクロビル処置により感受性である。ガンシクロビルのレベルを、ＶＺＶ ｔｋ遺伝子座内に挿入される他の遺伝子との相同組換えに関するガンシクロビルに対する感受性の喪失を選択するためのこの実験の結果から選択する。
（Ｄ．ガンシクロビルを用いる組換えＶＺＶ ｔｋポックスウイルスの選択）
ＢＳＣ４０に隣接するＶＺＶ ｔｋ配列と共にクローン化されたＶＶ７．５Ｋプロモーターに隣接したＶＶゲノム内に導入される遺伝子を保有する組換えプラスミドの存在下で、ＶＺＶ ｔｋ組換えウイルスを感染させる。組換えウイルスをガンシクロビルで選択する。
ＶＺＶ ｔｋ遺伝子で安定にトランスフェクトされた任意の細胞株は、相同組換えによる外来遺伝子の導入のため、およびガンシクロビルへの耐性によるこのような事象の選択のための標的となり得る。
（実施例７、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼおよびＨＳＶ−１ ＤＮＡポリメラーゼベクターの構築および分析）
（Ａ．ベクターの構築）
ＨＳＶ−１ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子のいずれかまたは両方を含む３つの構築物を作製した。
ａ） ｐＨＳＧ５７６：ＨＳＶｐｏｌ ｐＧＥＭ２−７０２（Ｄａｖｉｄ Ｄｏｒｓｋｙ、Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｃｏｎｎ）由来の５．５ｋｂのＨｉｎＤＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＨＳＧ５７６（ＳｗｅａｓｙおよびＬｏｅｂ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６７：１４０７−１４１０、１９９２）中に２工程でクローニングした：
１）２．４ｋｂのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＨＳＧ５７６中へクローニングした。このクローンをｐＨＳＧ５７６：１／２ｐｏｌと称した。
２）ＨＳＶ ＤＮＡポリメラーゼの３．１ｋｂのＨｉｎＤＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントをＨｉｎＤＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＨＳＧ５７６：１／２ ｐｏｌ中にクローニングした。このクローンをｐＨＳｇ５７６：ＨＳＶ ＤＮＡ ｐｏｌと称した。
ｂ） ｐＨＳＧ５７６：ＨＳＶ−１ ＴＫ ｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ（ｐＥＴ２３ｄ中にＨＳＶ−１ ＴＫのＮｃｏＩ−ＮｃｏＩフラグメントを含む、Ｎｏｖａｇｅｎ）由来のＸｂａＩ／ＢａｍＩＩＩフラグメントを平滑末端化し、そしてｐＨＳＧ５７６のＳｍａＩ部位にクローニングした。このクローンをｐＨＳＧ５７６：ＨＳＶ−１ ＴＫと称した。
ｃ） ｐＨＳＧ５７６：ＨＳＶ ｐｏｌ／ＴＫ
このクローンは、ＨＳＶ−１ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子およびＴＫ遺伝子の両方を、同じベクターから同時発現させるために含む。これは２工程のクローニング手順で作製された。
１） ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ−平滑末端化ＴＫフラグメントをＥｃｏＲＩ部位を平滑末端化したｐＨＳＧ５７６：１／２ｐｏｌ（２．４ｋｂのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを含む）中にクローニングした。
２） ３．１ｋｂのＨｉｎＤＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメント（ポリメラーゼ遺伝子の５’末端）をＨｉｎＤＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＨＳＧ５７６：１／２ｐｏｌ／ＴＫ中にクローニングした。このクローンをｐＨＳＧ５７６：ＨＳＶｐｏｌ／ＴＫと称した。
（Ｂ．ＤＮＡポリメラーゼ欠損Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＳ２００（ｐｏｌＡ１２ｒｅｃＡ７１８）をｐＨＳＧ５７６：ＨＳＶ ＤＮＡ ｐｏｌまたはｐＨＳＧ５７６ ＤＮＡで形質転換し、そしてテトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）を含む栄養寒天（ＮＡ）上にプレートした。プレートを３０℃（許容温度）でインキュベートした。単一のコロニーを、ＮＢ＋ｔｅｔ＋Ｃｍ中で一晩増殖させた。ＤＮＡをこれらの培養物から単離し、そしてＪＳ２００を再び形質転換するために使用した。第二の形質転換から、各々からのコロニーの幾つかを拾い上げ、そしてＩＰＴＧ存在下または不在下でＮＢ＋ｔｅｔ＋Ｃｍを播種するために使用した。３０℃での一晩の増殖の後、各培養物の単一の環状物（ｌｏｏｐｆｕｌ）を、プレート中心部から漸増希釈度の発散螺旋で拡散した。ＮＡプレート＋ｔｅｔ＋Ｃｍ＋／−ＩＰＴＧを３０℃（許容温度）または３７℃（非許容温度）でインキュベートした。
ｐＨＳＧ５７６：ＨＳＶ ＤＮＡ ｐｏｌを含む細胞の増殖パターンは、３７℃において単一コロニー（低細胞密度）の増殖を示したのに対し、ベクターのみを含む細胞は、非許容温度での低細胞密度で増殖させ得なかった。
これらの結果は、ヘルペスＤＮＡポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ ＰｏｌＩの欠損をインビボで相補し得ることを実証する。
（実施例８、１００％ランダムなライブラリーを利用する、１５９〜１６１におけるコドン変異および１６８〜１７０におけるコドン変異を有するＴＫ変異体の構築および分析）
本実施例は、１５９から１６１にかけてのコドンおよび１６８から１７０にかけてのコドンを変異誘発させたＴＫ変異体の構築および分析を記載する。
（細菌株）。ＳＹ２１１（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｔｄｋ、ｐＬｙｓＳ）を非選択プレート（クロラムフェニコールなし）での継代を繰り返すことによりｐＬｙｓＳを回復させた。（ＳＹ２１１は、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓｕｍｍｅｒｓ（Ｙａｌｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）から授与され、そしてＳｕｍｍｅｒｓ，Ｗ．Ｃ．およびＲａｓｋｉｎ，Ｐ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７５：６０４９−６０５１，１９９３において記載される）。得られた株であるＢＬ２１（ＤＥ３）ｔｄｋを、チミジンキナーゼ活性についての遺伝的相補性アッセイにおいて使用する。他の使用する株を実施例３において記載する。
（細胞）。ＢＨＫ ｔｋ（ｔｓ１３）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６３２）をアメリカンタイプカルチャーコレクションから購入し、そして３７℃、６％ＣＯ2下でＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
（材料）。実施例３に記載した通り。
（Ａ．ＴＫ変異体の生成）
（１．ランダム挿入体の構築）
２つのオリゴヌクレオチドをＯｐｅｒｏｎ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）により合成する：ＭＢ１２６（５８マー）、５’−ＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡ ＣＡＴＧＣＣＣＣＧＣ ＣＣＣＣＧＧＣＣＣＴ ＣＡＣＣＮＮＮＮＮＮ ＮＮＮＧＡＣＣＧＣＣ ＡＴＣＣＣＡＴＣ−３’（配列番号２４）およびＭＢ１２７（５１マー）５’−ＡＴＡＡＧＧＴＡＣＣ ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧ ＧＴＡＧＣＡＮＮＮＮ ＮＮＮＮＮＧＧＣＧＡ ＴＧＧＧＡＴＧＧＣＧＧ−３’（配列番号２５）。Ｎは、合成の間における４つ全てのヌクレオチドの等モル混合を表す。
ＰＣＲによるオリゴヌクレオチドの精製、アニーリング、伸張および増幅は、本質的には実施例３に記載の通りである。
（２．ランダム配列を含むライブラリーのベクター構築物の生成）
ｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎから購入）は、ｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ−Ｄｕｍｍｙの構築のためのバックボーンである。ｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ−Ｄｕｍｍｙを、ランダム配列を挿入するためにｐＭＤＣ（実施例１および３において記載した）の代わりに使用する。簡単に述べると、１．７ｋｂのＮｃｏＩ／ＨｉｎＤＩＩＩフラグメントをｐＴ７：ＨＳＶＴＫＩＩ（実施例３）の制限消化から精製し、そして同じ酵素を使用して制限したｐＥＴ２３ｄ中にクローニングしてｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫを生成する。このダミーベクターを、ＫｐｎＩ部位とＳａｃＩ部位との間のｔｋ配列をｐＭＤＣ（実施例３）由来のＫｐｎＩ／ＳａｃＩフラグメントに置きかえることにより構築する。
（ライブラリーの構築）
Ｑｉａｇｅｎのカラムで精製したｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ−Ｄｕｍｍｙ ＤＮＡをＫｐｎＩおよびＳａｃＩで制限し、そしてこのベクターをＧｅｎＣｌｅａｎＩＩ（Ｂｉｏ１０１、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してゲルから単離して小型の挿入フラグメントを取り出す。このベクターを、ゲルから単離したＰＣＲ増幅ランダムフラグメントと、１６℃で一晩Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結させる。
（３．ＴＫ変異体の選択）
次いで、連結混合物を使用して実施例３に記載されるエレクトロポレーションによりＢＬ２１（ＤＥ３）ｔｄｋ細胞を形質転換する。この形質転換体を、ＴＫ選択プレート（実施例３）上に、２×ＹＴ（１リットルあたり１６ｇのトリプトン／１０ｇの酵母抽出物／５ｇのＮａＣｌ／１５ｇのＢａｃｔｏＡｇａｒ）＋５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン（ｃａｒｂ50）上にプレートした小画分と直接プレートして形質転換物の総数を決定する。このプレートを３７℃で一晩インキュベートし、そしてＴＫ選択プレート上での増殖について計数し、そして形質転換効率を決定する。ＴＫ選択プレート上で増殖したコロニーを拾い上げ、そして新しいＴＫ選択プレートおよび２×ＹＴ＋ｃａｒｂ50プレート上に再画線する。約４２６の陽性クローンを１．１×１０6の形質転換体または０．０３９％のＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｔｄｋ（図１４）に対してＴＫ活性が付与された全ての形質転換体のライブラリーから同定する。
（Ｂ．変異体の解析）
（１．選択および非選択クローンの配列決定）
ＴＫ活性を示した１７のクローン（選択）、または２×ＹＴ＋ｃａｒｂ50プレートから得る１７のクローン（非選択）を首尾良く配列決定する。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して単離し、そして実施例３に記載のように二本鎖配列決定に供する。図１５は各群からの配列を示し、そして最初のランダムオリゴヌクレオチドがランダム化されることを実証する。選択したｔｋ遺伝子、および選択しなかったｔｋ遺伝子の両方において、ランダム化領域から遠位の部位における二次変異の導入を観察する。しかし、この変異は２つのコドン１５５および１５６に本来は限定される。これらの変異は、本来のランダムオリゴヌクレオチドの合成間の混入により最も導入されるようである。コドン１５５における全ての変化はサイレントである。コドン１５６における変化は、アラニンからバリン、セリンまたはプロリンへの交互変化を生じた。アラインメントの研究は、部位１５６は、アラニンまたはこの部位におけるアミノ酸のタイプのいずれかを保存しないことを示す。従って、これら二次変異は、変異体の酵素活性における任意の実際の影響を生じないようである。選択された全ての変異体は少なくとも２つのアミノ酸変化を含んだ。
（２．ＧＣＶおよびＡＣＶ感受性についての２次スクリーニング）
４２６の変異体それぞれを拾い上げ、そして９６ウェルのマイクロタイタープレートのフォーマット中の２００μｌのＴＫ選択培地（実施例３）に播種するために使用する。次いで、４２６全てのクローンを４８−ｐｒｏｎｇ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して０．９％ ＮａＣｌ中で１０4に連続的に希釈する。３０μｌの最終希釈物を、１μｇ／ｍｌチミジンを含み、かつガンシクロビルまたはアシクロビルの濃度を変化させたＴＫ選択プレート上に塗布した。最初に、２μｇ／ｍｌ ＧＣＶを使用し、そして増殖し得ないクローンを陽性として計数する。なぜなら、活性毒素へのプロドラッグの増加された変換を有する任意の変異体は致死性を生じるからである。２μｇ／ｍｌ ＧＣＶにおいて１９７のクローンを同定する。１μｇ／ｍｌ ＧＣＶおよび０．５μｇ／ｍｌ ＧＣＶ上への引き続くプレーティングは４７の変異体の同定を導いた。ＡＣＶプレート（１μｇ／ｍｌ）上のプレーティングは１１６のＡＣＶ感受性クローンをもたらした。クローンがヌクレオシドアナログに対して本当に感受性であり、そして使用したより低濃度のチミジン上での増殖に無能性であることから単純に計数されないことを確認されないことを確認するために、４７のＧＣＶクローンおよび１１６のＡＣＶクローンを１μｇ／ｍｌのチミジンを含むＴＫ選択培地上にプレートする（ヌクレオシドアナログはなし）。ほぼ半分のクローンが、総計で２６のＧＣＶ感受性変異体および５４のＡＣＶ感受性変異体について低量チミジン上で増殖不可能である。結果を図１６において示す。
（Ｃ．インビトロ分析）
（１．インビトロ転写および翻訳）
プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎカラムクロマトグラフィーにより精製する。８０の選択した変異体の転写および翻訳を、単離したプラスミドを転写前に線状化しないことを除いては実施例３と同様に行う。インビトロ翻訳産物を、チミジン、ガンシクロビルおよびアシクロビルのリン酸化について二連でアッセイし、そしてｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ ｍＲＮＡ翻訳産物アッセイと比較する（実施例３を参照のこと）。
（２．酵素活性の測定）
放射標識化ヌクレオチドは、チミジン、ガンシクロビルおよびアシクロビルそれぞれについて１μＭ、７．５μＭおよび７．５μＭで各アッセイにおいて存在する。活性のレベルを、35Ｓメチオニンを使用する二連翻訳物由来のＴＣＡ沈殿の計数から決定されるようなタンパク質合成のレベルを反映するために調節する。８０の変異体酵素の多数について、チミジン、ガンシクロビルおよびアシクロビルレベルは、野生型ＴＫのレベルの１％未満である。１０の変異体酵素は、少なくとも１つのアッセイしたヌクレオシドでのリン酸化を１０％より高く示した。このヌクレオチド配列を図１７において示す。幾つかのクローンは、ランダム化領域の外側に変異を含む。２つのクローンである３０および８４は、アミノ酸変化、Ａ１５２ＶおよびＡ１５６Ｓをそれぞれ生じる変異を有する。４つのクローンは、インフレームの欠失を含む；−３欠失を有する３つ（２２６、３４０および４１１）ならびに−６欠失を有する１つ（１９７）。これら全ての変異は、ペプチドＡＰＰＰＡについてコードするＧＣリッチ領域周辺に集中している。このプロリンリッチペプチドは、ループ部分の頂点において反転部分を含むようである。この１つまたは２つののアミノ酸の損失は、ループの短縮を単に生じ得る。これら全ての変異体は、インビトロで決定されたそれぞれの活性レベルを有する図１８において示されるような３〜６のアミノ酸の交互変化をランダム化領域内部に含む。
（Ｄ．変異体チミジンキナーゼを発現する哺乳動物細胞におけるＧＣＶおよびＡＣＶの効果）
（１．哺乳動物発現ベクターへのサブクローニング）
３つの変異体チミジンキナーゼをガンシクロビルまたはアシクロビルの存在下のインビボにおける細胞傷害性について評価するために選択する。変異体クローン番号３０、７５および１３２ならびに野生型のチミジンキナーゼ遺伝子をＮｃｏＩで制限化してＫｌｅｎｏｗで平滑末端化させる。このゲルで単離したフラグメント（ＮｃｏＩ−平滑末端）をＮｏｔＩで制限化したｐＣＭＶに連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＮＭ５２２に形質転換する。ＣＭＶプロモーターに関して誤方向にある野生型ＴＫ遺伝子もまたコントロールとして使用する。Ｑｉａｇｅｎカラム精製クローンを配列決定して、方向、配列および５’連結領域を確認する。このクローンをｐＣＭＶ、ｐＣＭＶ：ＴＫ−誤（方向）、ｐＣＭＶ：ＴＫ、ｐＣＭＶ：３０、ｐＣＭＶ：７５およびｐＣＭＶ：１３２と称する。
（２．形質転換）
これらの変異体を評価する最初の工程として、ｐＣＭＶクローンを、ネオマイシン耐性マーカープラスミド（ｐＳＶ２ｎｅｏ）の存在下で、ＴＳ１３ ＢＨＫ ｔｋ細胞（ハムスター乳児の腎臓細胞）中へ、ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ（Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２、１９８７）の改変型を使用するリン酸カルシウム沈殿法により導入する。
簡単に述べると、この細胞トランスフェクションを以下のように実施する。約５×１０5のｔｓ１３ ＢＨＫ ｔｋ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３２）を、１０％ウシ血清を添加したＤＭＥＭにおける１００ｍｍディッシュにプレートする。各々のトランスフェクションについて、１μｇのｐＳＶ２ｎｅｏおよび１０μｇのｐＣＭＶ構築物（ｐＣＭＶ、ｐＣＭＶ：ＴＫ−誤（方向）（プロモーターに対して逆方向におけるＨＳＶＴＫ）、ｐＣＭＶ：ＨＳＶＴＫ、ｐＣＭＶ：３０、ｐＣＭＶ：７５またはｐＣＭＶ：１３２ＤＮＡ）を０．２５Ｍ ＣａＣｌ2中で０．５ｍｌの２×ＢＢＳと混合し（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａを参照のこと）、そして３７℃、２．５％ＣＯ2で２４時間プレインキュベートする。このＣａＣｌ2／ＤＮＡ混合物をプレートに滴下し、そしてよく混合する。２．５％ＣＯ2湿潤型インキュベーター中で３７℃での２４時間のインキュベート後、細胞をＣａ／Ｍｇ未添加のダルベッコのＰＢＳで２回リンスし、そして１０％ウシ血清を添加した新しいＤＭＥＭを供給する。プレートを３７℃、６％ＣＯ2でインキュベートする。トランスフェクションしてから７２時間後、細胞を１：３に分割し、そしてＧ４１８を６００μｇ／ｍｌを含む１０％ウシ血清を添加したＤＭＥＭ中にプレートする。
（３．選択およびＥＤ50の決定）
細胞をＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）において３７℃、１７日間で選択する。この期間中、プレートを（各ＤＮＡトランスフェクションについて）プールし、そして１：３の割合で３回分割する。約３０〜４０のクローンを、この様式において、正確な方向でｔｋ遺伝子を含む各トランスフェクトしたＤＮＡについて選択する。ｐＣＭＶおよびｐＣＭＶ：ＴＫ−誤（方向）のトランスフェクションは、１３０〜１４０のクローンをそれぞれ得た。Ｇ４１８耐性クローンを収集し、プールし、そして９６ウェルのマイクロタイタープレート中に１０％ウシ血清および２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８＋６％ＣＯ2を添加した１００μｌのＤＭＥＭ中に２０００細胞／ウェルの密度でプレートする。ガンシクロビル（０．１２５、０．２５、０．５、１、２．５、５、７．５、１０および２０μＭ）またはアシクロビル（０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０、７５および１００μＭ）のいずれかの濃度範囲を、各トランスフェクト集団（ヌクレオシドアナログのコントロールは、各々１６の繰り返しを有しない）について各濃度を８回繰り返して各プレートに添加する。ヌクレオチドアナログの存在下で３日後、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）を添加し、そして６時間後にプレートを製造者のプロトコル（Ａｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）に従って蛍光光度計を使用して走査する。プレートをさらに２４時間３７℃でインキュベートし、そして再び走査する。
アラマーブルー存在下でのインキュベートした細胞の蛍光レベルの決定は、細胞生存度に直接関連する。蛍光バックグラウンドの減算は、ヌクレオシドアナログの濃度に対する細胞の生存をプロットして、細胞の５０％を殺傷するために効果的な用量（ＥＤ50）を決定することを可能にする。生存曲線を、二次走査からのデータでプロットし、そして図１９（ＧＣＶ）および図２０（ＡＣＶ）において示す。
４日後の、ヌクレオシドアナログにおけるＧＣＶおよびＡＣＶでの５０％の細胞を殺傷するための効果的な用量を、図１９および図２０から決定する（表ＩＶを参照のこと）。
Figure 2008301828
 （４．酵素アッセイおよびイムノブロット）
２．４×１０6のプールしたトランスフェクタント物由来の細胞抽出物を、チミジン、ガンシクロビルおよびアシクロビル活性についてアッセイする。リン酸化のレベルはインビトロで決定した活性（ウサギの網状赤血球溶解物の翻訳産物）およびウェスタンブロット分析により決定されたようなタンパク質の発現量と良好に一致した。免疫反応性バンドは、ｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ：ＴＫ−誤（方向）（誤方向におけるＴＫ遺伝子）に対応するレーンでは見られない。野生型ＴＫ（ｐＣＭＶ：ＨＳＶＴＫ）およびｐＣＭＶ：１３２トランスフェクト細胞溶解物の両方は、おおまかに等しいバンド強度を示した。ｐＣＭＶ：３０細胞溶解物についての免疫反応性バンドは、実質的により強く（５〜１０倍）そしてｐＣＭＶ：７５の免疫反応性バンドは、等しい細胞数についてｐＣＭＶ：ＨＳＶＴＫのバンドの強度の約半分である。
（５．膠芽細胞腫細胞株における変異体の試験）
ｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ、ｐＥＴ２３ｄ：３０およびｐＥＴ２３ｄ：７５から単離した平滑末端化ＮｃｏＩフラグメントを、ｐＬＸＳＮ（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０、１９８９）のＨｐａＩ部位中にクローニングする。プラスミドの精製をＱｉａｇｅｎのクロマトグラフィーにより実施し、そして単離したＤＮＡを配列決定して方向および５’連結領域を確認する。ラットのＣ６膠芽細胞腫（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０７）およびヒト膠芽細胞腫細胞株（ＳＦ７６７）の安定したトランスフェクト物を、ｐＳＶ２−ｎｅｏを同時にトランスフェクトしないことを除いては上記のように作製する。なぜなら、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子はｐＬＸＳＮによりコードされるからである。選択および分析は本質的に上記と同じである。
（Ｅ．変異体チミジンキナーゼの速度論的分析）
（１．変異体酵素および野生型酵素の過剰発現）
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｔｋ細胞中のｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ、ｐＥＴ２３ｄ：３０、ｐＥＴ２３ｄ：７５およびｐＥＴ２３ｄ：１３２のシングルコロニーを、カベニシリン（ｃａｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を２０μｇ／ｍｌで含む５ｍｌのＭ９ＺＢ培地（１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌ、１×Ｍ９塩、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、１００μＭ ＣａＣｌ2および０．２％グルコース）を播種するために使用する。この培養物を３７℃で一晩インキュベートする。翌日、５ｍｌの培養物を、カベニシリンを２０μｇ／ｍｌで含む１ＬのＭ９ＺＢ培地に播種するために使用し、そして培養物を３７℃でＯＤ６００が０．１になるまで増殖させる。その時点でＩＰＴＧを０．４ｍＭで添加し、そしてさらに３時間培養物をインキュベートする。細胞を氷上で冷却し、遠心分離によりペレット化し、そしてペレットを−７０℃で凍結させる前に、ペレットを細胞洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％スクロース）で１回洗浄する。翌日、細胞を１２ｍｌの緩衝液１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０％スクロース、２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で再懸濁し、そしてこの容積物を２本の１３ｍｌ Ｏａｋｒｉｄｇｅ超遠心分離用チューブに分割する。３ｍｇのリゾチームを含む１ｍｌの緩衝液１を各チューブに添加し、そしてチューブを氷上で１時間放置する。さらにプロテアーゼインヒビターを含む１ｍｌの緩衝液１の混合物を添加し、そしてチューブを３５ｋｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌ Ｔ−１２５０ローターを使用して４℃で遠心分離する。次いで清澄な上清をアリコートし、そして−７０℃で凍結させる。
（２．アフィニティー精製）
チミジリル−セファロースカラムを、１工程精製手順（実施例２を参照のこと）について使用する。１ｍｌのベッド容量のカラムを、１０ｍｌの緩衝液１、次いで１０ｍｌの吸着緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０％スクロース、２ｍＭ ＤＴＴ、２５ｍＭ ＭｇＡｃ2、１０ｍＭ ＡＴＰ）をカラム全体に通過させることにより調製する。２ｍｌの清澄な溶解物を２ｍｌの吸着緩衝液と混合し、そして０．２μｍのフィルターを通過させる。この混合物をカラム全体に３回通過させた。カラムを５ｍｌの吸着緩衝液で３回洗浄し、そして５ｍｌの画分を回収する。酵素を溶出するために、チミジン緩衝液（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０％ スクロース、２ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＫＣｌ、６００μＭ チミジン）の３〜１ｍｌの画分をカラム全体に通過させ、そして各々1ｍｌの画分を回収する。カラムを、１０ｍＭ 高塩緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０％ スクロース、２ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＫＣｌ）および１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５を充填することにより再活性化させる。カラムを、０．００４％アジ化ナトリウムを添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５中で保管する。精製の程度をクマシー染色したＳＤＳ：ＰＡＧＥ分析によりモニターし、そして精製タンパク質の濃度をＢｉｏＲａｄ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用して決定する。ＴＫタンパク質を含む画分を、数リットルの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０％ スクロース、２ｍＭ ＤＴＴに対して４℃で透析してチミジンを除去する。
（３．酵素の速度論）
野生型、変異体３０および７５のチミジンキナーゼ酵素の、様々な濃度の放射活性ヌクレオチド基質を用いるチミジン、ガンシクロビルおよびアシクロビルのリン酸化の速度論を、実施例３の記載と本質的に同じように決定する。ＫmおよびＶmaxの値を二重逆数プロットから決定し、そしてｋｃａｔ値を等式Ｖmax＝ｋcat[Ｅ0]（ここで[Ｅ0]は全酵素濃度である）を使用して算出する。ＢｉｏＲａｄ試薬を精製したチミジンキナーゼ酵素の全酵素濃度を決定するために使用した。結果を以下の表Ｉにおいて示す。
Figure 2008301828
 （実施例９、残基１５９〜１６１および残基１６８〜１６９におけるアミノ酸置換を有する第２世代ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ変異体の生成）
本実施例は第２世代ＴＫ変異体の構築および分析を記載する。このＴＫ変異体は、コドン１５９〜１６１およびコドン１６８〜１６９において変異誘発される。
（Ａ．第二世代ＴＫ変異体の単離）
上記のように、ＬＩＦ−ＡＬＬライブラリーから単離した変異体は、野生型ＴＫと比較して増加したプロドラッグ特異性を示す（Ｂｌａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．ＵＳＡ ９３：３５２５−３５２９、１９９６）。ＬＩＦ−ＡＬＬライブラリーから単離した１０の最も活性な変異体からの情報を使用して、ランダム化オリゴヌクレオチドの新規のセットを合成して第二世代ランダムライブラリーを産生するために使用する。ライブラリーは、残基１５９〜１６１および残基１６９〜１７０をコードするコドンを変異誘発して少数のアミノ酸置換のみを提示するため、このライブラリーはセミランダムであると考えられる。
図２１は、ライブラリーおよび予想される可能なアミノ酸置換物を産生するために使用したセミランダム化オリゴヌクレオチドを示す。これらの相補的かつ部分的に重複するオリゴヌクレオチド（ＤＭＯ２２１１および２２１２）を変性ゲル上での分離後に精製した。それぞれの３’末端のアニーリング後、オリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで伸張して１００ｂｐの二本鎖ＤＮＡフラグメントを形成した。ＳａｃＩおよびＫｐｎＩでの制限化後、ランダムなフラグメントをｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ−Ｄｕｍｍｙ（これは、上記およびＢｌａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．ＵＳＡ ９３：３３２５−３５２９、１９９６に記載される）に連結した。ランダム配列の混合物を含むベクターをチミジンキナーゼ欠失Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用し、そして形質転換したＥ．ｃｏｌｉを機能的プラスミド骨格であるＴＫの存在を必要とする増殖培地上にプレートした。総数で１２０のクローンを拾い上げ、そして選択培地上に再画線して表現型を確認した。個別のクローンを９６ウェルのプレート中にアリコートされた選択培地に播種するために使用した（１クローン／１ウェル）。培養物を、異なるレベルのＧＣＶまたはＡＣＶに対するそれらの感受性について試験した。全部で１２０の変異体の溶解物をチミジン、ＡＣＶおよびＧＣＶをリン酸化する能力について上記の方法を使用してアッセイした。
活性を必要とすることが実証された７つの変異体を、さらなる研究のために選択した。表ＶＩはこれら７つの変異体（ＳＲ１１、ＳＲ２６、ＳＲ３９、ＳＲ４、ＳＲ１５、ＳＲ３２、ＳＲ５３）の推定アミノ酸配列を示す。
Figure 2008301828
 （Ｂ．第二世代ＴＫ変異体の分析）
（１．細胞株における第二世代半ランダム変異体のインビトロ分析）
この７つの変異体を哺乳動物発現ベクター、ｐＲＥＰ８Ｄ７：ｄｕａｌＧＦＰにサブクローニングした。このベクターは、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を駆動する構成的メタロチオネインプロモーター、およびＴＫ変異体の発現を刺激したＲＳＶ ＬＴＲプロモーターを含む。このベクターはまた、形質転換体の選択のためのヒスチジノール抵抗性遺伝子を含む。これらの構築物の精製したベクターＤＮＡを用いて、エレクトロポレーションによりＢＨＫ ｔｋ−細胞をトランスフェクトした。このトランスフェクタントを、ヒスチジノールに対する抵抗性により選択し、そしてＧＦＰ発現についてのＦＡＣＳ分析を用いて分類した。次いで、トランスフェクタントのプールを、ある範囲にわたるプロドラッグの用量にわたるＧＣＶまたはＡＣＶへの感受性についてアッセイした。ＡＣＶおよびＧＣＶアッセイの両方において、この７つの変異体のうち６つは、野生型ＴＫトランスフェクタントプールより低いＩＣ50値を示した。残りの変異体トランスフェクタントプール（ＳＲ５３）は、低いプロドラッグ感受性を説明し得る低レベルのＴＫタンパク質を発現した。表ＶＩＩに示した結果は、変異体ＳＲ１１、ＳＲ２６およびＳＲ３９が、ＡＣＶを基質として用いて、野生型ＴＫまたは変異体７５より優れていることを示す。表ＶＩＩＩは、ＳＲ１１、ＳＲ２６およびＳＲ３９変異体でのラットＣ６殺傷曲線からのＩＣ50値を図示している。
（２．インビボマウス異種移植片腫瘍モデルにおける第二世代半ランダム変異体のインビボ分析）
ラットＣ６グリア芽細胞腫細胞を、種々のＴＫ変異体を含む上記のような安定発現ベクターｐＲＥＰ８Ｄ７：ｄｕａｌＧＦＰを用いてトランスフェクトした。細胞は、ＷＴ、ＳＲ３９または変異体 ３０（ＬＩＦ−ＡＬＬシリーズ）のいずれかでトランスフェクトし、そしてＧＦＰ発現の匹敵するレベルについて分類した。実験を実行して、腫瘍の切除および治療の効力についてプロドラッグ投与レベルを確立した。ヌードマウス（ＪＡＸ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）に、０．５×１０6のトランスフェクトしたラットＣ６細胞を、皮下に注射した。５日後、プロドラッグ（ＡＣＶおよびＧＣＶ）を、１日２回さらに５日間投与した。プロドラッグを２つの濃度（ｍｇ／ｋｇで示した）のどちらかで与えた。この期間およびさらなる６日間の間、腫瘍サイズを１日ごとに、カリパス（ｃａｌｉｐｅｒ）測定によりモニターした。この期間の終わりに、マウスを屠殺し、そして腫瘍を切り出し、そして秤量した。
データを、図３２、３３（腫瘍直径）および図３４（最終腫瘍重量）に示し、そしてＳＲ３９（ならびに変異体３０）が、高度に効果的な変異体であり、そしてＡＣＶまたはＧＣＶのどちらかを用いて有意な腫瘍減少を生じ得ることを実証する。変異体３０およびＳＲ３９の両方を用いたインビボ腫瘍阻害の程度は、野生型酵素のものより明らかに優れていた。さらに、ＳＲ３９およびＡＣＶでのデータは、ＡＣＶが、自殺遺伝子治療のために有効なプロドラッグとして機能し得ることを初めて示唆する。
Figure 2008301828
Figure 2008301828
 精製ＳＲ１１、ＳＲ２６およびＳＲ３９タンパク質の酵素反応速度論分析を、上記のように実施した。これらの研究の結果は表ＩＸにまとめる。
Figure 2008301828
 （実施例１０：ＨＳＶ−１チミジンキナーゼのＱ基質結合ドメイン内領域の変異誘発）
この実施例は、最近、同定されたＱ基質結合ドメインの領域において変異誘発されたＴＫ変異体の構築と分析を記載する。
（Ａ．基質結合ドメインに改変を有するＴＫ変異体の単離）
ランダム配列の挿入のためのダミーのベクターを構築するために、ＮａｒＩ（またはＫａｓＩ）部位を、ＡＴＧからのヌクレオチド２７６位で野生型チミジンキナーゼオープンリーディングフレーム内のプライマーＤＭＯ１３５８（５’−ＧＴＣＴＣＧＧＡＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣ−３’）を用いて、部位特異的変異誘発により、ｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫＩＩに導入した。このｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫＩＩベクターは、Ｂｌａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３５２５−３５２９、１９９６に記載されている。ＳａｃＩおよびＮａｒＩにより、操作されたＮａｒＩ部位を有するｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫＩＩベクターであるｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ−Ｎａｒの制限は、ＴＫ配列を除去することおよびベクターｐＬＸＳＮからの１ｋｂのＮａｒＩ／ＳａｃＩフラグメントによる置換を可能にした。このベクターは、ｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ−Ｎａｒ Ｄｕｍｍｙと命名した。
初回のランダムライブラリーのために、２つのオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドは、残基１１２〜１３２に対応するコドンに、９％の頻度で、３つの非野生型ヌクレオチドを含む（すなわち、野生型ヌクレオチドは９１％の頻度で示された）。図２２は、相補的であり、そして重複しているオリゴヌクレオチドＤＭＯ−１８６０および１８６１の配列を示す。これらのヌクレオチドは、野生型の配列を示す。ランダム変異体を、ＤＭＯ−１８６０およびＤＭＯ−１８６１オリゴヌクレオチドの太字型において示される領域の合成のために９％の頻度で非野生型のヌクレオチドを含むことにより、導入した（すなわち、それぞれの配列において示された不連続性の後）。図２２はまた、正しいサイズのフラグメントを産生するためにＰＣＲ増幅において、オリゴヌクレオチドをいかに用いたかを要約している。簡略に言えば、ポリメラーゼ連鎖反応の初回セット（２０回）を実施して、４つの内在オリゴヌクレオチド（ＤＭＯ−１８６０、ＤＭＯ−１８６１、ＤＭＯ−１８９３およびＤＭＯ−１８９４）と合わせ、完全長産物にした。第二のＰＣＲセット（１０回）では、２つのより小さなオリゴヌクレオチド（ＤＭＯ−１８９５およびＤＭＯ−１８９６と命名した）を用いて、産物を増幅し、そして制限切断のためにオーバーハンギング配列を付加した。この反応の産物を、ＫａｓＩおよびＳａｃＩで切断し、ｐＥＴ２３ｄ：ＨＳＶＴＫ−Ｎａｒ Ｄｕｍｍｙ（ＫａｓＩ／ＳａｃＩ）ベクターに連結した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｔｄｋ−Ｅ．ｃｏｌｉへのエレクトロポレーション後に、その細胞をＴＫ選択プレート上にプレートし、そして増殖をスコアづけした。すべてのコロニーを新鮮ＴＫ選択プレート上で再試験した。数百のコロニーを配列決定し、そして２０アミノ酸領域の範囲に０〜６アミノ酸置換が含まれることを見出した。
２つの連続したライブラリーを、単一アミノ酸変化の頻度を上昇させるために変異原性オリゴヌクレオチドの１つのみを用いて構築した。数百のＴＫ陽性クローンを配列決定した。これらの変異体からの溶解物を、チミジン、アシクロビルおよびガンシクロビルをリン酸化する能力についてアッセイした。このアッセイは、Ｑ基質結合ドメイン内の変異が基質特異性を変化させることを実証する。
（実施例１１：ヒトおよびマウスグアニル酸キナーゼの単離ならびにＨＳＶ−１チミジンキナーゼおよびグアニル酸二重発現ベクターの構築）
本実施例は、ヒトおよびマウスのグアニル酸キナーゼ遺伝子の単離ならびにヘルペスチミジンキナーゼおよびグアニル酸キナーゼの二重発現のためのベクター構築を記載する。
（Ａ．ヒトグアニル酸キナーゼ遺伝子の単離）
１．ヒトグアニル酸キナーゼ遺伝子の単離
２つのヌクレオチドを、ヒトグアニル酸キナーゼオープンリーディングフレーム全体を増幅するように設計する。以下の２つのオリゴヌクレオチドを、ＧｅｎＳｅｔ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）により合成する：５’−ＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴ［ＣＣＡＴＧＧ］ＣＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧ−３’、３３マー（配列番号２６）および５’−ＴＡＣＴＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＣＴＴＴＧＡＧＣ−３’、３３マー（配列番号２７）。それぞれの末端でＢａｍＨＩ部位に下線を引き、そして開始メチオニンコドンでのＮｃｏＩ部位は角括弧内に示す。太線のヌクレオチドはもとの配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ１１０４２）からのヌクレオチド変化を示す。ヒトグアニル酸キナーゼ遺伝子を、α−ＣＤ３で刺激されたヒトＢリンパ球増殖のｃＤＮＡライブラリーから増幅する。得られた一本鎖（約６００ｂｐ）を、ＢａｍＨＩで制限処理し、そしてｐＵＣ１１８（ＢａｍＨＩ）にクローニングして、ｐＵＣ１１８：Ｈｕｇｍｋを産生した。このインサートを、以下のオリゴヌクレオチドセットを用いて、全体を（両鎖）配列決定する：５’ＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＣ−３’（１８マー）（ＤＭＯ ５１２）（配列番号２８）、５’−ＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＣＡＴＧ−３’（１９マー）（ＤＭＯ ５１３）（配列番号２９）、５’−ＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧ−３’（１８マー）（ＤＭＯ ５１４）（配列番号３０）、５’−ＧＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＡＴＣ−３’（１８マー）（ＤＭＯ ５１５）（配列番号３１）、５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（１８マー）（ＡＢＩから購入したＭ１３順プライマー）（配列番号３２）および５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’（１８マー）（ＡＢＩより購入したＭ１３逆プライマー）（配列番号３３）。配列分析は、アラニン変化にセリンを生じる（Ｓ２Ａ）ＮｃｏＩ部位での予期される変化を除けば、ＧｅｎＢａｎｋ配列と同一性を示した（図２４）。
（２．ノーザンブロット）
ＳＰ２／０マウスＢリンパ腫細胞からの全ＲＮＡの８μｇを、１×ＭＯＰＳ緩衝液／７５％ホルムアミドに調製し、そして５５℃で１０分間熱変性し、そして１×ＭＯＰＳ緩衝液中の１．２％アガロースゲル上にロードする。ニトロセルロースフィルターへの転写後、このブロットを、ヒトｇｍｋ遺伝子でプローブする。
６００ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＵＣ１１８：Ｈｕｇｍｋからゲル単離し、そして製造業者の指示に従ってＡｍｅｒｓｈａｍのランダムプライマー標識キットを用いて標識する。遊離の放射線標識をサイズ排除クロマトグラフィーによって除去する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、そのブロットを−７０℃で２日間Ｘ線フィルムに曝露する。ノーザンブロットのオートラジオグラフィーは、単一の約７５０ヌクレオチドのＲＮＡ種を示した。増殖Ｂリンパ球からのヒトポリＡ＋ＲＮＡを用いる同様の実施例において、単一の約７５０ヌクレオチドのバンドがまた、観察される。
（Ｂ．マウスグアニル酸キナーゼ遺伝子の単離）
（１．マウスｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
マウス７０２／３細胞（Ｂリンパ腫）のλｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリーを、ヒト遺伝子（ノーザンブロット分析で用いたのと同じプローブ）を用いてプローブする。スクリーニングされたプラークの全数は２×１０5ｐｆｕである。９つの独立したλコロニーをヒトプローブへハイブリダイズした。そして、プラーク精製する。
（２．陽性クローンのサブクローニングおよび配列分析）
８つのファージＤＮＡ調製物からのＥｃｏＲＩフラグメントを、ゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩで制限処理および脱リン酸化されたｐＵＣ１１８にサブクローニングする。このＤＮＡインサートサイズは約３００ｂｐ〜１．２ｋｂの範囲であった。プライマー（Ｍ１３順プライマー）での予備的配列分析は、すべてのクローンが、ヒトおよびウシのグアニル酸キナーゼ配列を用いる配列の整列により決定される場合の推定ＡＴＧ開始コドンへおよそ６０ｂｐ ５’で始まり、そしてそれらのそれぞれの３’末端で変化したことを示す。１つの代表的クローン（両鎖）を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて完全に配列決定する：
Figure 2008301828
 最後のマウスグアニル酸キナーゼ遺伝子配列を推定アミノ酸とともに図２５に示す。
（３．新しい制限部位の導入）
新規なＮｃｏＩ制限部位を、Ｂｌａｃｋ、Ｍ．Ｅ．およびＨｒｕｂｙ、Ｄ．Ｅ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７５８４−１７５９２、１９９０）に記載のように、マウスグアニル酸キナーゼオープンリーディングフレームの開始コドンに導入する。用いられた変異原性オリゴヌクレオチドは：角括弧内に示すＮｃｏＩ部位およびＣからＧへの変化を示す太字ヌクレオチドを有する５’−ＣＴＡＧＧＴＣＣＴＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＣＧＴＣＣＧＣＧ−３’（２４マー）（ＤＭＯ６７６）（配列番号４１）である。得られたクローン、ｐＵＣ１１８：Ｍｕｇｍｋ−ＮｃｏＩを配列決定して、配向および５’接合領域を確認する。
（Ｃ．インビトロ転写および翻訳分析のためのベクターの構築）
ヒトおよびマウス両方のグアニル酸キナーゼ遺伝子をｐＥＴ２３ｄにサブクローニングする（実施例８を参照のこと）。ｐＵＣ１１８：Ｈｕｇｍｋからの６００ｂｐのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ゲル単離し、そしてＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで制限されたｐＥＴ２３ｄ（実施例８を参照のこと）に直接的にサブクローニングした。マウスグアニルキナーゼ遺伝子を、ｐＵＣ１１８ ３’ポリリンカー領域からのＡＴＧで導入されたＮｃｏＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を用い、約８００ｂｐのＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして、ゲル単離し、そしてＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで制限されたｐＥＴ２３ｄ（実施例８参照のこと）にクローニングする。次いで、得られたプラスミド、ｐＥＴ２３ｄ：ＨｇｍｋおよびｐＥＴ２３ｄ：Ｍｇｍｋをインビトロ転写のためのテンプレートとして用い、そして産生されたｍＲＮＡを、実施例３および８に記載のように、ウサギ網状赤血球溶出液無細胞翻訳系に用いる。完全長タンパク質産生および活性を確認するための酵素アッセイは、Ａｇａｒｗａｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５１：４８３−４９０、１９７８）に記載のように、陽性コントロールとして、Ｓｉｇｍａから購入したウシのグアニル酸キナーゼを用いる。
（Ｄ．ヒトおよびマウスのグアニル酸キナーゼの精製および特徴づけ）
（１．発現ベクター構築）
ｐＥＴ２３ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、ｐＥＴ：ＨＴの構築のためのベクター骨格として用いる。このベクターは、６つのヒスチジン残基ペプチドに続く、標的遺伝子産物のＮ末端に融合した除去可能なヒスチジン標識の発現を可能にするトロンビン切断部位を含む。６つのｈｉｓ−トロンビン融合コード領域の合成を、３つの連続ＰＣＲ増幅工程において以下のプライマーを用いるｐＥＴ２３ｄのプロモーター領域のＰＣＲ増幅および伸長により行う。
Figure 2008301828
 配列ＤＭＯ ６０４を全てのＰＣＲ増幅工程において、ｐＥＴ２３ｄのＢｇｌＩＩ領域へアニールする。配列ＤＭＯ６０５をＮｃｏＩに対応する領域に３’から５’方向にアニールし、そして上記配列における太字に示されたヌクレオチド変異に起因してＮｃｏＩの損失を生じる。３’から５’方向における配列ＤＭＯ ６０６またはＤＭＯ ６０７を用いる引き続く増幅を、６つのヒスチジンコドンおよびトロンビン切断部位の付加のために配列を伸長するために配列ＤＭＯ６０４と対合させる。新しいＮｃｏＩ部位にまた、上記の角括弧内に示される配列ＤＭＯ ６０７を用いて導入する。最後のＢｇｌＩＩ／ＮｃｏＩフラグメントを、対応する部位においてｐＥＴ２３ｄにクローニングし、ｐＥＴ：ＨＴを作製する。ｐＥＴ：ＨＴを配列決定して、正しい合成および挿入を確認する。新しいベクター融合ペプチドのアミノ酸配列は、下線で示されたトロンビン切断認識部位を有する：ＭＡＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＳＭ（ＮｃｏＩ部位）（配列番号４６）である。トロンビンでの切断は、アルギニン残基とグリシン残基の間である。
（２．Ｅ．ｃｏｌｉにおける過剰発現およびアフィニティー精製）
過剰発現および分析のための方法は実施例８のとおりである。Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いるアフィニティー精製を、製造業者の指示に従って実行する。トロンビンを末端の１７アミノ酸を切断するために用いて、グアニル酸キナーゼ開始メチオニンに対してＮ末端の３アミノ酸を残す。次いで、このリーダーペプチドを、切断混合物をＨｉｓ結合カラムに対して２回通過させることにより取り除く。
（３．酵素反応速度論）
グアニル酸、ＧＣＶ−リン酸およびアシクロビルリン酸についてのＫm、ＶmaxおよびＫcatの値を、精製したヒトおよびマウスのグアニル酸キナーゼを用いて決定する。Ａｇａｒｗａｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５１：４８３−４９０、１９７８）に記載されたアッセイプロトコールを用いることに加えて、放射性ヌクレオチド基質を用いて実行されたアッセイから生成されたヌクレオチド産物を、薄層クロマトグラフィーおよびシンチレーション計測により分析した。
（Ｅ．哺乳動物細胞におけるヒトおよびマウスのグアニル酸キナーゼ発現）
（１．ベクター構築）
ヒトおよびマウスの両方のグアニル酸キナーゼ遺伝子を、改変ｐＲＥＰ８ベクターにクローニングする。簡略に言えば、改変ｐＲＥＰ８（ｐＲＥＰ８−７ｋｂ）の構築のために、ｐＲＥＰ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＢｓｔＥＩＩおよびＸｂａＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで充填し、そして再連結する。得られたプラスミドｐＲＥＰ８−７ｋｂは、もはやＥＢＮＡ−１またはＥＢＶ複製起点（ｏｒｉＰ）をコードしない。（上記の）両方のグアニル酸キナーゼｐＥＴ２３ｄ：ｈｇｍｋおよびｐＥＴ２３ｄ：ｍｇｍｋを、ＮｃｏＩで制限処理し、平滑末端化し、次いでＢａｍＨＩで消化して、ゲル精製後に、約６００ｂｐ ＮｃｏＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩフラグメントを産生する。これらを、ＨｉｎＤＩＩＩ（平滑末端化）およびＢａｍＨＩで消化されたｐＲＥＰ８−７ｋｂに連結する。この新しいプラスミドを、ｐＲＥ８−７：ｈｇｍｋおよびｐＲＥＰ８−７：ｍｇｍｋと命名する。
（２．ＨＳＶＴＫを発現する安定トランスフェクタントの単離）
ＢＨＫｔｋ−（ｔｓ１３）細胞を、実施例８に記載のようにｐＳＶ２−ｎｅｏ（１０：１比）の存在下で、ｐＣＭＶ、ｐＣＭＶ：ＴＫ，ｐＣＭＶ：３０およびｐＣＭＶ：７５のＤＮＡでトランスフェクトする。それぞれのｐＣＭＶのＤＮＡトランスフェクションからのおよそ１０〜２０の個々のクローンを、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８選択下で単離する。実施例８のように、１クローンあたり約２×１０6の細胞で、ポリクローナル抗ＴＫ血清を用いてウエスタンブロットによりＴＫ発現レベルについて試験する。
ＴＫクローンＣ３の発現は非常に高いが、他方７５ Ｄ４および３０ Ａ２は、Ｃ３のＴＫ発現レベルの半分より少ない。７５Ｄ２、Ｄ３およびＤ４タンパク質発現は、それぞれ非常に低度から、低度、中等度までの範囲にわたった。
（３．ＧＣＶまたはＡＣＶへのクローンの感受性）
クローンを実施例８に記載のようにＧＣＶおよびＡＣＶへの感受性についてアッセイする。ＧＣＶおよびＡＣＶに対する感受性は、タンパク質発現のレベルに依存する。これは、７５のクローン、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４で明白に見られ得る。ここで、最高発現クローンＤ４が最も感受性で、Ｄ３がより少なく感受性で、そしてＤ２はプロドラッグに対しＤ３よりもさらに少なく感受性である（図２６、２７）。
（４．ｐＲＥＰ８−７グアニル酸キナーゼ構築物を用いたＴＫ発現細胞のトランスフェクション）
ｐＲＥＰ８−７、ｐＲＥＰ８−７：ｈｇｍｋおよびｐＲＥＰ８−７：ｍｇｍｋを用いて、ＢＨＫ ｔｋ、ＴＫトランスフェクトクローンＣ３および７５トランスフェクトクローンＤ４をトランスフェクトする。ヒスチジノールを用いて、安定なトランスフェクタントのプールを選択し、そして個々のクローンを単離する。
異なるプールにおけるグアニル酸キナーゼのタンパク質発現レベルを、イムノブロット分析で決定する。簡略に言えば、５μｌの２×１０6細胞ペレット溶解物（２００μｌ）を、電気泳動に供し、そしてニトロセルロースに転写する。ポリクローナル抗グアニル酸キナーゼ血清（１：５，０００希釈で）およびＴＫ抗血清（１：１０，０００希釈で）を利用して、得られたタンパク質バンドを検出する。
（５．ＴＫ発現クローンにおけるＧＣＶおよびＡＣＶに対するグアニル酸キナーゼトランスフェクタントプールの感受性）
実施例８のように、トランスフェクタントのプールを、１０００細胞／ウェルで９６ウェルマイクロタイターディッシュに入れる。８つの複製体を、種々の濃度のＧＣＶまたはＡＣＶの存在下で３日間インキュベートする。
図２８および２９に見られ得るように、プロドラッグ感受性のレベルは、ＴＫタンパク質発現のレベルおよびグアニル酸キナーゼの存在に関連する。野生型ＴＫの存在下におけるグアニル酸キナーゼ発現は、ＴＫ発現単独に比べてＡＣＶに対する感受性が約２倍上昇したことを実証する。野生型ＴＫの発現レベルの半分にもかかわらず、ｇｍｋ＋７５Ｄ４発現細胞によるＡＣＶへの感受性は、ＴＫ発現細胞の感受性より６〜７倍大きい。
（Ｆ．インビボでの二重発現ベクターの構築および分析）
ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子を、ＮｃｏＩ（平滑末端化）フラグメントとして、ｐＬＸＳＮ（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０、１９８９）のＨｐａＩ部位にクローニングし、そして制限マッピングにより配向を決定する。これは、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲプロモーターの後にＨＳＶ−１遺伝子を置く。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、ＢａｍＨＩ（平滑末端化）フラグメントとして、グアニル酸キナーゼ遺伝子（ヒトまたはマウス）により置き換え、その結果、グアニル酸キナーゼ遺伝子発現がＳＶ４０プロモーターにより駆動される。さらに、ｔｋおよびｇｍｋ遺伝子順序が逆にされたベクターを構築し、その結果、ｔｋ遺伝子がＳＶプロモーターから発現され、そしてｇｍｋがＬＴＲプロモーターから発現される。個々の遺伝子（ｔｋまたはｇｍｋ）を有するベクター構築物をまた構築する。さらに、野生型ＨＳＶ−１ ｔｋ遺伝子の代わりにＨＳＶ−１ ｔｋ変異体を含む発現ベクターもまた、構築する。
実施例８にあるように、上記の構築物からのプラスミドＤＮＡを用いて、Ｇ４１８上でトランスフェクタントの選択を可能にするマーカープラスミド（ｐＳＶ２−ｎｅｏ）の存在下で、ｔｓ１３ＢＨＫ ｔｋ−細胞、ＳＦ７６７ヒトグリア芽細胞腫、およびラットＣ６グリア芽細胞腫をトランスフェクトする。
安定なトランスフェクタントの選択ならびにＡＣＶおよびＧＣＶに対する感受性の上昇についてのアッセイを実施例８に記載のとおりである。
（実施例１２：グアニル酸キナーゼ−チミジンキナーゼ融合タンパク質の構築および分析）
この実施例は、グアニル酸キナーゼ活性およびチミジンキナーゼ活性の両方を有するいくつかの融合タンパク質の産生および分析を図示する。
（Ａ．融合タンパク質の構築）
遺伝子治療のための融合タンパク質の使用は、２つのプロモーターの必要性およびプロモーター強度における差異に起因するプロドラッグ活性化において関連する減少を否定するのみならず、これはまた、単独プロモーターおよび単独シストロンからの２つの酵素機能の発現を可能にする。従って、融合タンパク質は、外来のＤＮＡ（例えば、ＡＡＶベクター）の大きな切片を許容し得ない遺伝子治療ベクターのために有利である。
野生型ＨＳＶ−１ ＴＫ配列およびマウスグアニル酸キナーゼ（ｇｍｋ）配列の両方を含む２つの融合タンパク質を構築した。これらのタンパク質は、融合部位において残基の数が異なっている。両方の融合構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｐＥＴ２３ｄ骨格ベクターから過剰発現し得る。両方のベクターにおいて、グアニル酸キナーゼは、２つのＣ末端アミノ酸を取り除くｇｍｋの３’末端でＭｓｃＩ部位に融合したＴＫとともにプロモーターに隣接して位置した。１つの融合物をＴＫの最初の９つのアミノ酸が存在しないように構築した（ｐＥＴ２３ｄ：ｇｍｋ／ＴＫ−ｔｒｕｎｃ）。他の融合物は、ＴＫアミノ酸配列の全体を含む（ｐＥＴ２３ｄ：ｇｍｋ／ＴＫ−ｆｌ）。これらの構築物のマップを図３０に図示する。
さらなる６つの融合タンパク質を、ｐＥＴ２３ｄ：ｇｍｋ／ＴＫ−ｆｌの野生型ＴＫ配列がＴＫ変異体３０配列、変異体７５配列、変異体４１１配列、ＳＲ１１配列、ＳＲ２６配列またはＳＲ３９配列で置きかえられて、構築した。これらの融合タンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）ｔｋ−細胞中で過剰発現させた。
（Ｂ．融合タンパク質の分析）
上記構築物のすべてを、上記のように、ｐＲＥＰ８Ｄ７：ｄｕａｌＧＦＰにクローニングした。これらのベクターを用いて、ＢＨＫ ｔｋ−細胞をトランスフェクトし、そしてトランスフェクタントをヒスチジオール抵抗性に基づいて選択した。さらにＧＦＰ発現についてのスクリーニングを、ＦＡＣＳ分析により実行した。さらに、ｇｍｋ／ＴＫ−ｆｌ構築物を用いて、ラットＣ６神経膠腫細胞をトランスフェクトし、そして陽性のクローン／プールを上記のように選択した。ラットＣ６細胞におけるｇｍｋ／ＴＫ−ｔｒｕｎｃと野生型ＴＫを比較したガンシクロビル用量応答曲線を、図３１に示す。この曲線は、２つの酵素の間のＩＣ50の１００倍の違いを実証し、この融合タンパク質が優れた酵素である。
両方の野生型ＴＫ−ｇｍｋ融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰発現し、そしてアフィニティークロマトグラフィーを用いて均質性にまで精製した。チミジンキナーゼ活性およびグアニル酸キナーゼ活性の両方についてのミカエリス−メンテン反応速度論を、両方の融合タンパク質で試験し、そしてその結果を表Ｘに示す。このチミジンキナーゼ活性は、野生型レベルと同様である。しかし、ｇｍｋ機能は、融合タンパク質構築物において、野生型ｇｍｋに比べて３．８〜５．８倍障害される。にもかかわらず、この融合タンパク質はグアニル酸キナーゼ活性およびＴＫ活性の両方を示した。
Figure 2008301828
 前記から、本発明の特定の実施態様が、例示の目的のために本明細書で記載されたが、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得るということは理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲による場合を除いて限定されない。
［配列表］
SEQUENCE LISTING


(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT: Darwin Molecular Corporation

(ii) TITLE OF INVENTION: THYMIDINE KINASE MUTANTS AND FUSION PROTEINS
HAVING THYMIDINE KINASE AND GUANYLATE KINASE ACTIVITIES

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 121

(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:
(A) ADDRESSEE: Seed and Berry LLP
(B) STREET: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue
(C) CITY: Seattle
(D) STATE: Washington
(E) COUNTRY: US
(F) ZIP: 98104-7092

(v) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

(vi) CURRENT APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER: PCT/US98/21672
(B) FILING DATE: 14-OCT-1998
(C) CLASSIFICATION:

(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
(A) NAME: McMasters, David D.
(B) REGISTRATION NUMBER: 33,963
(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 240052.429PC

(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:
(A) TELEPHONE: (206) 622-4900
(B) TELEFAX: (206) 682-6031

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1131 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:

ATGGCTTCGT ACCCCGGCCA TCAACACGCG TCTGCGTTCG ACCAGGCTGC GCGTTCTCGC 60
GGCCATAGCA ACCGACGTAC GGCGTTGCGC CCTCGCCGGC AGCAAGAAGC CACGGAAGTC 120
CGCCTGGAGC AGAAAATGCC CACGCTACTG CGGGTTTATA TAGACGGTCC TCACGGGATG 180
GGGAAAACCA CCACCACGCA ACTGCTGGTG GCCCTGGGTT CGCGCGACGA TATCGTCTAC 240
GTACCCGAGC CGATGACTTA CTGGCAGGTG CTGGGGGCTT CCGAGACAAT CGCGAACATC 300
TACACCACAC AACACCGCCT CGACCAGGGT GAGATATCGG CCGGGGACGC GGCGGTGGTA 360
ATGACAAGCG CCCAGATAAC AATGGGCATG CCTTATGCCG TGACCGACGC CGTTCTGGCT 420
CCTCATATCG GGGGGGAGGC TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCCCGGCCCT CACCCTCATC 480
TTCGACCGCC ATCCCATCGC CGCCCTCCTG TGCTACCCGG CCGCGCGGTA CCTTATGGGC 540
AGCATGACCC CCCAGGCCGT GCTGGCGTTC GTGGCCCTCA TCCCGCCGAC CTTGCCCGGC 600
ACCAACATCG TGCTTGGGGC CCTTCCGGAG GACAGACACA TCGACCGCCT GGCCAAACGC 660
CAGCGCCCCG GCGAGCGGCT GGACCTGGCT ATGCTGGCTG CGATTCGCCG CGTTTACGGG 720
CTACTTGCCA ATACGGTGCG GTATCTGCAG TGCGGCGGGT CGTGGCGGGA GGACTGGGGA 780
CAGCTTTCGG GGACGGCCGT GCCGCCCCAG GGTGCCGAGC CCCAGAGCAA CGCGGGCCCA 840
CGACCCCATA TCGGGGACAC GTTATTTACC CTGTTTCGGG CCCCCGAGTT GCTGGCCCCC 900
AACGGCGACC TGTATAACGT GTTTGCCTGG GCCTTGGACG TCTTGGCCAA ACGCCTCCGT 960
TCCATGCACG TCTTTATCCT GGATTACGAC CAATCGCCCG CCGGCTGCCG GGACGCCCTG 1020
CTGCAACTTA CCTCCGGGAT GGTCCAGACC CACGTCACCA CCCCCGGCTC CATACCGACG 1080
ATATGCGACC TGGCGCGCAC GTTTGCCCGG GAGATGGGGG AGGCTAACTG A 1131

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 52 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:

TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCCCGGCCCT CACCCTCATC TTCGATCGCC AT 52


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 56 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:

ATGAGGTACC GNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNATGGCG ATCGAA 56

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:

CCCCTCCAGC GCGGTAC 17


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:

CGCGCTCGAG GGGAGCT 17


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:

TGGGAGCTCA CATGCCCCGC C 21


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:

ATGAGGTACC G 11


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 52 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:

TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCCCGGCCCT CACCCTCATC TTCGATCGCC AT 52


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 70 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 23
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Where N is 80% likely to be Wild- TypeNucleotide, CYTOSINE, and 20% likely to be other Nucleotide"

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 24
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Where N is 80% likely to be Wild- TypeNucleotide, CYTOSINE, and 20% likely to be other Nucleotide"

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 25
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Where N is 80% likely to be Wild- TypeNucleotide, GUANINE, and 20% likely to be other Nucleotide"

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 41
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Where N is 80% likely to be Wild- TypeNucleotide, THYMINE, and 20% likely to be other Nucleotide"

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 42
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Where N is 80% likely to be Wild- TypeNucleotide, THYMINE, and 20% likely to be other Nucleotide"

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 43
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Where N is 80% likely to be Wild- TypeNucleotide, CYTOSINE, and 20% likely to be other Nucleotide"

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 44
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(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 45
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(B) LOCATION: 48
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(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 50
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(B) LOCATION: 52
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(ix) FEATURE:
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(B) LOCATION: 53
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(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
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(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 55
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Where N is 80% likely to be Wild- TypeNucleotide, CYTOSINE, and 20% likely to be other Nucleotide"

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:

TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCNNNGCCCT CACCCTCATC NNNNNNNNNN NNNNNATCGC 60
CGCCCTCCTG 70


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 38 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:

ATGAGGTACC GCGCAGCTGG GTAGCACAGG AGGGCGGC 38


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:

CATGCCTTAT GCCGTGA 17


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..33


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:

CCC ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG 33
Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:

Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..33


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:

CCC ATC GCC TCC CTC CTG TGC TAC CCG GCC GCG 33
Pro Ile Ala Ser Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:

Pro Ile Ala Ser Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..33


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:

TCC ATC GGC GCC CTA CAG TGC TAC CCG GTC GCG 33
Ser Ile Gly Ala Leu Gln Cys Tyr Pro Val Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:


Ser Ile Gly Ala Leu Gln Cys Tyr Pro Val Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..33


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:

CCC ATC GCC ACC CTG CTG TGC TAC CCG GCC GCG 33
Pro Ile Ala Thr Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19:

Pro Ile Ala Thr Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..33


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:

CCC ATC GCC GCC TTA CTG TTA TAC CCG ACC GCG 33
Pro Ile Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21:

Pro Ile Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..33


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:

CCC ATC GCC GCC CTC GTG TGC TAC CCG GCC GCG 33
Pro Ile Ala Ala Leu Val Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23:

Pro Ile Ala Ala Leu Val Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 58 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:

TGGGAGCTCA CATGCCCCGC CCCCGGCCCT CACCNNNNNN NNNGACCGCC ATCCCATC 58

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 51 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25:

ATAAGGTACC GCGCGGCCGG GTAGCANNNN NNNNNGGCGA TGGGATGGCG G 51

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:

ACTACTGGAT CCATGGCGGG CCCCAGGCCT GTG 33

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27:

TACTACGGAT CCTCAGGCGG CGGTCCTTTG AGC 33

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28:

CTGCTGAAGA GGCTGCTC 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 19 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29:

ACACAGATGC GGTTTCATG 19

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30:

CTGGACGTGG ACCTGCAG 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31:

GTTAATGATG ACCACATC 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32:

TGTAAAACGA CGGCCAGT 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33:

CAGGAAACAG CTATGACC 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34:

TGTGTCCCAT ACTACTACAA G 21

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35:

TGAGAACTCA GCAGCATGCT C 21

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36:

GTGCTAGATG TCGACCTA 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37:

ACCTGGATAA AGCCTATG 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 19 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38:

AAGCAGGCGC TCTCTCTGA 19

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39:

CTATTTCTCA TATGATGT 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40:

GTTACAGTGT CTCTAGAG 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 24 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:

CTAGGTCCTG CCATGGCGTC CGCG 24

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 27 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42:

ACTACTACTA GATCTCGATC CCGCGAA 27

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 41 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43:

ATGATGATGA TGATGGCTGC TAGCCATAGT ATATCTCCTT C 41

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 39 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44:

CGGCACCAGG CCGCTGCTGT GATGATGATG ATGATGGCT 39

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45:

AGTAGTATCC ATGGAGCTGC CGCGCGGCAC CAGGCCGCTG CT 42

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46:

Met Ala Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15

Arg Gly Ser Ser Met
20

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:47:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 19 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47:

Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys
1 5 10 15

Tyr Pro Ile


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 606 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 7..600


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48:

GGATCC ATG GCG GGC CCC AGG CCT GTG GTG CTG AGC GGG CCT TCG GGA 48
Met Ala Gly Pro Arg Pro Val Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly
1 5 10

GCT GGG AAG AGC ACC CTG CTG AAG AGG CTG CTC CAG GAG CAC AGC GGC 96
Ala Gly Lys Ser Thr Leu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu His Ser Gly
15 20 25 30

ATC TTT GGC TTC AGC GTG TCC CAT ACC ACG AGG AAC CCG AGG CCC GGC 144
Ile Phe Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly
35 40 45

GAG GAG AAC GGC AAA GAT TAC TAC TTT GTA ACC AGG GAG GTG ATG CAG 192
Glu Glu Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln
50 55 60

CGT GAC ATA GCA GCC GGC GAC TTC ATC GAG CAT GCC GAG TTC TCG GGG 240
Arg Asp Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly
65 70 75

AAC CTG TAT GGC ACG AGC AAG GTG GCG GTG CAG GCC GTG CAG GCC ATG 288
Asn Leu Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met
80 85 90

AAC CGC ATC TGT GTG CTG GAC GTG GAC CTG CAG GGT GTG CGG AAC ATC 336
Asn Arg Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile
95 100 105 110

AAG GCC ACC GAT CTG CGG CCC ATC TAC ATC TCT GTG CAG CCG CCT TCA 384
Lys Ala Thr Asp Leu Arg Pro Ile Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser
115 120 125

CTG CAC GTG CTG GAG CAG CGG CTG CGG CAG CGC AAC ACT GAA ACC GAG 432
Leu His Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu
130 135 140

GAG AGC CTG GTG AAG CGG CTG GCT GCT GCC CAG GCC GAC ATG GAG AGC 480
Glu Ser Leu Val Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser
145 150 155

AGC AAG GAG CCC GGC CTG TTT GAT GTG GTC ATC ATT AAC GAC AGC CTG 528
Ser Lys Glu Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu
160 165 170

GAC CAG GCC TAC GCA GAG CTG AAG GAG GCG CTC TCT GAG GAA ATC AAG 576
Asp Gln Ala Tyr Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys
175 180 185 190

AAA GCT CAA AGG ACC GGC GCC TGAGGATCC 606
Lys Ala Gln Arg Thr Gly Ala
195


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:49:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 197 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:49:

Met Ala Gly Pro Arg Pro Val Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15

Lys Ser Thr Leu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Ala His Ser Gly Ile Phe
20 25 30

Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu
35 40 45

Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln Arg Asp
50 55 60

Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu
65 70 75 80

Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met Asn Arg
85 90 95

Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile Lys Ala
100 105 110

Thr Asp Leu Arg Pro Ile Tyr Ile Ser Val Gln Pro Pro Ser Leu His
115 120 125

Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser
130 135 140

Leu Val Lys Arg Leu Ala Ala Ala Gln Ala Asp Met Glu Ser Ser Lys
145 150 155 160

Glu Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu Asp Gln
165 170 175

Ala Tyr Ala Glu Leu Lys Glu Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala
180 185 190

Gln Arg Thr Gly Ala
195

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:50:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 660 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 25..621


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:50:

CTGGGTCGGG TCCCCGCGGA CGGC ATG GCA GGA CCT AGG CCA GTA GTG CTG 51
Met Ala Gly Pro Arg Pro Val Val Leu
1 5

AGC GGG CCG TCA GGG GCA GGG AAG AGC ACT CTG CTC AAG AAG CTG TTC 99
Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Leu Lys Lys Leu Phe
10 15 20 25

CAG GAG CAC AGC AGC ATC TTC GGC TTC AGT GTG TCC CAT ACT ACA AGG 147
Gln Glu His Ser Ser Ile Phe Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg
30 35 40

AAC CCA CGA CCT GGT GAA GAA GAT GGC AAA GAT TAC TAC TTT GTG ACC 195
Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu Asp Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr
45 50 55

AGG GAG ATG ATG CAG CGT GAT ATT GCA GCA GGG GAC TTC ATT GAG CAT 243
Arg Glu Met Met Gln Arg Asp Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His
60 65 70

GCT GAG TTC TCA GGG AAC CTG TAC GGG ACA AGC AAG GAA GCT GTT CGG 291
Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu Tyr Gly Thr Ser Lys Glu Ala Val Arg
75 80 85

GCT GTG CAG GCC ATG AAC CGC ATC TGC GTG CTA GAT GTC GAC CTA CAA 339
Ala Val Gln Ala Met Asn Arg Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln
90 95 100 105

GGT GTG CGC AGC ATC AAG AAG ACT GAT CTG TGT CCC ATC TAC ATC TTT 387
Gly Val Arg Ser Ile Lys Lys Thr Asp Leu Cys Pro Ile Tyr Ile Phe
110 115 120

GTG CAG CCT CCC TCG CTG GAC GTG CTG GAG CAA CGA CTG CGA CTG CGC 435
Val Gln Pro Pro Ser Leu Asp Val Leu Glu Gln Arg Leu Arg Leu Arg
125 130 135

AAC ACT GAG ACT GAG GAG AGT CTG GCA AAG CGG CTG GCA GCT GCA CGG 483
Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser Leu Ala Lys Arg Leu Ala Ala Ala Arg
140 145 150

ACA GAC ATG GAG AGC AGC AAG GAG CCT GGC TTG TTT GAC CTG GTG ATC 531
Thr Asp Met Glu Ser Ser Lys Glu Pro Gly Leu Phe Asp Leu Val Ile
155 160 165

ATC AAT GAC GAC CTG GAT AAA GCC TAT GCA ACC CTG AAG CAG GCG CTC 579
Ile Asn Asp Asp Leu Asp Lys Ala Tyr Ala Thr Leu Lys Gln Ala Leu
170 175 180 185

TCT GAG GAA ATC AAG AAA GCA CAG GGA ACT GGC CAC GCC TGA 621
Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala Gln Gly Thr Gly His Ala
190 195

AGGCCTGCTT CATTCCACAG AGTGATGTCT GTGGTCTAA 660


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:51:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 198 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:51:

Met Ala Gly Pro Arg Pro Val Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15

Lys Ser Thr Leu Leu Lys Lys Leu Phe Gln Glu His Ser Ser Ile Phe
20 25 30

Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu
35 40 45

Asp Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Met Met Gln Arg Asp
50 55 60

Ile Ala Ala Gly Asp Phe Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu
65 70 75 80

Tyr Gly Thr Ser Lys Glu Ala Val Arg Ala Val Gln Ala Met Asn Arg
85 90 95

Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Ala Val Arg Ser Ile Lys Lys
100 105 110

Thr Asp Leu Cys Pro Ile Tyr Ile Phe Val Gln Pro Pro Ser Leu Asp
115 120 125

Val Leu Glu Gln Pro Leu Arg Leu Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser
130 135 140

Leu Ala Lys Arg Leu Pro Ala Ala Arg Thr Asp Met Glu Ser Ser Lys
145 150 155 160

Glu Pro Gly Leu Phe Asp Leu Val Ile Ile Asn Asp Asp Leu Asp Lys
165 170 175

Ala Tyr Ala Thr Leu Lys Gln Ala Leu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Ala
180 185 190

Gln Gly Thr Gly His Ala
195


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:52:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 16 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:52:

TCCCCCACCT CCAGGC 16

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:53:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:53:

CTCAGTGTTG CCCAGTCG 18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:54:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:54:

GCCGAAGATG CTGCTGTG 18


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:55:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..33


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:55:

CCC ATC GCC GCC CTC ATC TGC TAC CCG GCC GCG 33
Pro Ile Ala Ala Leu Ile Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:56:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:56:

Pro Ile Ala Ala Leu Ile Cys Tyr Pro Ala Ala
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:57:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..33


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:57:

CAC ATC TCG GCC CTC CTG TGC TAC CCG GTC GCG 33
His Ile Ser Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Val Ala
15 20


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:58:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:58:

His Ile Ser Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Val Ala
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:59:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 72 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..72


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:59:

TCA CAT GCC CCG CCC CCG GCC CTC ACC CTC ATC TTC GAC CGC CAT CCC 48
Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro
15 20 25

ATC GCC GCC CTC CTG TGC TAC CCG 72
Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro
30 35


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:60:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 24 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:60:

Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro
1 5 10 15

Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro
20

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:61:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 72 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:61:

TCACATGTCC CGCCCCCGGC CCTCACCATT TTGGCTGACC GCCATCCCAT CGCCGCATAT 60
TTATGCTACC CG 72

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:62:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 72 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:62:

TCACATGCCC CGCCCCCTGC CCTCACCGTA ATAACAGACC GCCATCCCAT CGCCTGCCTG 60
CTTTGCTACC CG 72


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:63:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 72 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:63:

TCACATGCCC CGCCCCCGGC CCTCACCCTA CTACTGGACC GCCATCCCAT CGCCGTGATG 60
CTATGCTACC CG 72

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:64:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 72 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear



(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:64:

TCACATGCCC CGCCCCCGTC CCTCACCTTG ATCCTGGACC GCCATCCCAT CGCCAGCTAC 60
TGTTGCTACC CG 72

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:65:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 72 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:65:

TCACATGCCC CGCCCCCGGC CCTCACCATG TTCATGGACC GCCATCCCAT CGCCCATAAT 60
GTATGCTACC CG 72

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:66:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 66 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:66:

TCACATGCCC CGCCCCTCAC CATATTGCTT GACCGCCATC CCATCGCAAT TTACTTATGC 60
TACCCG 66

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:67:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 69 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:67:

TCACATGCCC CGCCGGCCCT CACCTTTTAT TATGACCGCC ATCCCATCGC CCCTTTTGTT 60
TGCTACCCG 69

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:68:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 72 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:68:

TCACATGCCC CGCCCCCGGC CCTCACCTTG TTCCTCGACC GCCATCCCAT CGCCCTCATG 60
TGTTGCTACC CG 72

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:69:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 69 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:69:

TCACATGCCC CGCCCCCCCT CACCCTCGTA TTAGACCGTC ATCCCATCGC CTACTATCTA 60
TGCTACCCT 69

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:70:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 69 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:70:

TCACATGCCC CGCCGGCCCT CACCTGTTTT CTCGACCGCC ATCCCATCGC CTATTATCTT 60
TGCTACCCG 69

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:71:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:71:

Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:72:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:72:

Leu Val Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Thr Leu Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:73:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:73:

Phe Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Tyr Tyr Ile Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:74:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:74:

Val Leu Ser Asp Arg His Pro Ile Ala Arg Ile Tyr Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:75:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:75:

Leu Ile Leu Asp Arg His Pro Ile Ala Asn Phe Ile Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:76:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:76:

Thr Phe Tyr Asp Arg His Pro Ile Ala Trp Met Phe Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:77:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:77:

Val Val Cys Asp Arg His Pro Ile Ala Cys Thr Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:78:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:78:

Leu Phe Ala Asp Arg His Pro Ile Ala Thr Leu Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:79:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:79:

Val Phe Ser Asp Arg His Pro Ile Ala Leu Leu Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:80:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:80:

Leu Cys Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Tyr Cys Ile Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:81:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:81:

Ile Ile Ala Asp Arg His Pro Ile Ala Leu Leu Val Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:82:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:82:

Leu Ile Leu Asp Arg His Pro Ile Ala Val Ser Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:83:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:83:

Leu Leu His Asp Arg His Pro Ile Ala Val Cys Val Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:84:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:84:

Leu Leu Ser Asp Arg His Pro Ile Ala Tyr His Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:85:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:85:

Phe Leu Val Asp Arg His Pro Ile Ala Trp Asn Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:86:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:86:

Thr Val Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ser Thr Phe Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:87:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:87:

Leu Thr Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Gly Thr Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15


(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:88:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:88:

Leu Phe Ile Asp Arg His Pro Ile Ala Thr Ile Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:89:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:89:

Val Ala Ala Asp Arg His Pro Ile Ala Phe Ser Tyr Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:90:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:90:

Pro Thr Gln Asp Arg His Pro Ile Ala Ser Asp Pro Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:91:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:91:

Arg Ala Phe Asp Arg His Pro Ile Gly Gln Thr Ser Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:92:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:92:

Asp Gly Val Asp Arg His Pro Ile Ala Cys Arg His Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:93:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:93:

Asp Asn Asn Asp Arg His Pro Ile Ala Gln Ser Pro Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:94:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 11 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:94:

Ile Leu Asn Asp Arg His Pro Ile Ala Arg Thr
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:95:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:95:

Phe Leu Asp Asp Arg His Pro Ile Ala Pro Leu Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:96:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:96:

Tyr Tyr Val Asp Arg His Pro Ile Ala Val Ser Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:97:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:97:

Asp Arg His Pro Ile Ala Leu Arg Ser Cys Asn Pro
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:98:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:98:

Leu Asn Pro Asp Arg His Pro Ile Ala Cys Asp Cys Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:99:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:99:

Ser Trp Gly Asp Arg His Pro Ile Glu Lys Phe Ile
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:100:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:100:

Tyr Gly Ser Asp Arg His Pro Ile Ala Ile Cys Pro Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:101:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 8 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:101:

Asp Arg His Pro Ile Ala Ile Ile
1 5

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:102:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:102:

Tyr Tyr Asn Asp Arg His Pro Ile Ala Gly Ser Pro Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:103:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:103:

Trp Gly Arg Asp Arg His Pro Ile Ala Asn Leu Leu Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:104:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:104:

Arg Leu Pro Asp Arg His Pro Ile Ala Asn Glu Ala Cys Tyr Pro
1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:105:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:105:

Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:106:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:106:

Leu Phe Leu Asp Arg His Pro Ile Ala Phe Asn Leu
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:107:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:107:

Leu Phe Ala Asp Arg His Pro Ile Ala Phe Leu Leu
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:108:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:108:

Ile Phe Leu Asp Arg His Pro Ile Ala Phe Met Leu
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:109:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:109:

Ile Leu Leu Asp Arg His Pro Ile Ala Tyr Leu Leu
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:110:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:110:

Leu Phe Ala Asp Arg His Pro Ile Ala Tyr Tyr Leu
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:111:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:111:

Leu Phe Val Asp Arg His Pro Ile Ala Val Met Leu
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:112:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 12 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS:
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:112:

Ile Phe Val Asp Arg His Pro Ile Ala Phe Tyr Leu
1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:113:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:113:

GTCTCGGAGG CGCCCAGCAC C 21

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:114:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 59 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:114:

AGGCTGGGAG CTCACATGCC CCGCCCCCGG CCCTCACCAC TCTTGCGCCT CGACCGCCA 59

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:115:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 54 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:115:

ATAAGGTACC GCGCGGCCGG GTAGCACAGA CATGTACAGG CGATGGGATG GCGG 54

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:116:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 55 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:116:

CGCCTCGACC AGGGTGAGAT ATCGGCCGGG GACGCGGCGG TGGTAATGAC AAGCG 55

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:117:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 58 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:117:

GAACGGCGTC GGTCACGGCA TAAGGCATGC CCATTGTTAT CTGGGCGCTT GTCATTAC 58

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:118:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 60 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear


(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:118:

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TCGACTGAGC TCCCAGCCT 19
図１は、ランダムなヌクレオチド含有ライブラリーの構築、およびＴＫ変異体の選択についての方策を図示する概略図である。 図２は、ＴＫおよびＡＺＴ変異体の選択を示す写真である。 図３は、コドン１６５〜１７５についての以下の核酸配列およびアミノ酸配列を示す：野性型、ＴＫＦ１０５、ＴＫＩ２０８、およびＴＫＦ２ ＴＫ。 図４は、野性型ＴＫおよびＴＫ変異体の熱安定性を示す一連のグラフである。 図５は、インビトロ翻訳された野性型およびＴＫＦ２チミジンキナーゼについての熱不活化プロフィールを示すグラフである。 図６は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分画化インビトロ翻訳産物（野性型およびＴＫＦ２）のオートラジオグラフである。 図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＴＣＡ沈殿可能カウントに供された、35Ｓ−放射標識化無細胞翻訳産物のオートラジオグラフである。 図８Ａおよび図８Ｂは、ウサギ網状赤血球溶解物無細胞翻訳系において産生された高活性（Ａ）および低活性（Ｂ）変異体の時間経過分析を示す２つのグラフである。 図９Ａおよび図９Ｂは、高活性（Ａ）および低活性（Ｂ）ＴＫ変異体の熱安定性を示す２つのグラフである。 図１０は、変異体および野性型チミジンキナーゼによるヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログのリン酸化を示す棒グラフである。 図１１は、野性型、ＴＫＦ３６、およびダミー（ｐＭＤＣ）プラスミドのＴＫ活性を示す棒グラフである。 図１２は、ＴＫＦ３６、ＴＫＦ５２、野性型プラスミド、ＴＫＦ９９、またはダミープラスミド（ｐＭＤＣ）を含む細胞のチミジン取り込み活性を経時的に示すグラフである。 図１３は、ＨＳＶＴＫ変異体を利用する遺伝子治療の１つの代表的な実施例の概略図である。 図１４は、ＬＩＦ−ＡＬＬライブラリーにおいてランダム化されたヌクレオチド、ならびに選択の結果を示す図である。 図１５は、選択されたクローンおよび選択されないクローンのアミノ酸置換を示す表である。 図１６は、ＧＣＶまたはＡＣＶに感受性であったＬＩＦ−ＡＬＬライブラリーから選択される変異体の数を示す表である。 図１７は、選択されたＴＫ変異体におけるヌクレオチド変化を示す表である。 図１８は、いくつかの変異ＴＫの１５９位〜１６１位および１６８位〜１７０位のアミノ酸配列、ならびにリン酸化レベルを示す表である。 図１９は、ＧＣＶ上で増殖され、そして種々のＴＫ変異体でトランスフェクトされた細胞の生存を示すグラフである。 図２０は、ＡＣＶ上で増殖され、そして種々のＴＫ変異体でトランスフェクトされた細胞の生存を示すグラフである。 図２１は、残基１５９〜１６１および１６８〜１６９においてアミノ酸置換を有するＴＫ変異体の第２世代を生成するために使用された半ランダム化オリゴヌクレオチドを示す。 図２２は、残基１１２〜１３２においてアミノ酸置換を有するＴＫ変異体を構築するための特定のオリゴヌクレオチドの使用を図示する。 図２３は、ＨＳＶＴＫ−１のオープンリーディングフレーム（配列番号１）中のヌクレオチドを示す。 図２４は、ヒトグアニル酸キナーゼの代表的なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図示する。 図２５は、代表的なマウスグアニル酸キナーゼのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図示する。 図２６は、ＧＣＶに対するＴＫクローンの感受性を示すグラフである。 図２７は、ＡＣＶに対するＴＫクローンの感受性を示すグラフである。 図２８は、ＴＫ発現クローンにおけるＧＣＶに対するグアニル酸キナーゼトランスフェクト体プールの感受性を示すグラフである。 図２９は、ＴＫ発現クローンにおけるＡＣＶに対するグアニル酸キナーゼトランスフェクト体プールの感受性を示すグラフである。 図３０は、ｇｍｋ／ＴＫ融合タンパク質構築物の図示である。 図３１は、野性型ＴＫと、ｇｍｋ／ＴＫ融合タンパク質とを比較する、ガンシクロビル用量応答曲線を示すグラフである。 図３２は、種々のベクターによるトランスフェクション、これに続くＡＣＶへの曝露後の腫瘍増殖を示すグラフである。 図３３は、種々のベクターによるトランスフェクション、これに続くＧＣＶへの曝露後の腫瘍増殖を示すグラフである。 図３４は、種々の処置についての腫瘍重量のパーセント変化を示す棒グラフである。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の核酸分子。
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