JP2008283966A - 糖尿病随伴性および／または動脈性難治創傷の治療および／または予防のための、そして薬理学的に活性な物質を同定するための、アルファ１−アンチキモトリプシンポリペプチド類またはそれらをコードしている核酸の使用、または、ａｃｔポリペプチドまたはそれをコードしている核酸を、発現している細胞の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】世界的にＩＩ型糖尿病患者の数が顕著に増加してること、また動脈性潰瘍に罹っている患者が非常に大勢いることを視野に入れて、難治性糖尿病随伴創傷および難治性動脈創傷の治癒を決定的に改善する新規な活性化合物が、強く求められている。ゆえに、難治性糖尿病随伴創傷および難治性動脈創傷の治癒を決定的に改善する新規な活性化合物を提供する。
【解決手段】難治性である糖尿病随伴性および／または動脈性創傷の診断、治療および／または予防のための、そしてアルファ１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）の発現または機能、特に活性に影響を及ぼす薬理学的に活性な物質を同定するための、特定の配列からなるＡＣＴポリペプチド類および／またはそれらをコードしている核酸、または当該ポリペプチドに対して向けられた抗体またはその断片、または当該ポリペプチドまたはそれをコードしている核酸を発現している細胞の使用に関する化合物。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

本発明は、難治性の糖尿病随伴性および／または難治性の動脈性創傷の診断、治療および／または予防のための、そしてアルファ１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）の発現または機能に影響を及ぼす薬理学的に活性な物質を同定するための、ＡＣＴポリペプチド類および／またはそれらをコードしている核酸の使用、または、ＡＣＴポリペプチドまたはそれをコードしている核酸を、発現している細胞の使用に関する。

健常患者の皮膚創傷は、通常、なんらの合併症を伴わずに治癒する。しかし当該組織の完全治癒を達成するためには、皮膚の細胞組成における多数の時間的および空間的変化が必要である。本過程は２年間も続くことがあり、そして非胎児組織では瘢痕形成を常に伴う。このことは、皮膚における創傷治癒過程の途方もない複雑性を示している。創傷治癒過程の間には、異なる時間的そして一部重複する相、すなわち凝固、炎症、増殖、および再形成を区別することが可能である（ＴｈｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ，１９９８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ）。凝固の間に、血小板が凝集し、そして成長および凝固因子類を放出する。フィブリンマトリックスが形成され、それゆえに当該創傷中へ細胞が移動できるようになる。損傷後５−７日ほどで、当該創傷中への、さまざまな細胞型、特に、炎症反応のメディエーターを放出する好中性顆粒球および単球の移動により、炎症反応が引き起される。増殖相の間に、血管が修復され、傷害組織が再生され、そして再生された組織が再形成される。増殖相の間の過程は、特に、新生血管形成、繊維芽細胞増殖、および角化細胞の増殖と分化による上皮再形成を含む。繊維芽細胞はＰＤＧＦおよびＴＧＦベータのようないくつかの成長因子を分泌し、それらが今度は、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン類およびコラーゲンのような、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分の合成と沈着を調節する。当該組織の再編成の間に、ＥＣＭ成分、特にコラーゲンが交換される。コラーゲンは常に分解され、そして新たに合成されているので、再上皮形成された創傷は成熟が可能で、そして２年以内に平坦な瘢痕が形成される。協調的な仕方で当該組織を再構築するには、やはり非常に多くの成長因子および走化性誘引物質が必要である。それゆえ、インターロイキン１、ＴＮＦベータおよびインターフェロンガンマが、ＥＣＭ成分の分泌に影響する。ＴＧＦベータ、ＰＤＧＦおよびＦＧＦも再形成に不可欠である。

しかし、破壊された構造体の再構築に寄与する過程に加えて、創傷治癒にはタンパク質分解過程も重要である。タンパク質分解過程は、細胞残骸の除去およびフィブリンマトリックスのような中間構造体の分解に、関与する。それゆえ、非常に多くのプロテアーゼが、創傷の縁で活動している（Ｍａｒｔｉｎら，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：７５−８１）。例えば、プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性化因子により活性化され、そしてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は遊走性角化細胞中で正に制御され、それらの前に位置するフィブリンマトリックスをそれらが分解することを可能にする。これは、プラスミノーゲンノックアウトマウスが上皮再形成を実質的に全く示さないという観察と、一致する。メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）類も重要な役割を果している。ＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ），ＭＭＰ１（間質コラゲナーゼ）およびＭＭＰ１０（ストロメライシン２）はさまざまな時点で活性化され、そして異なる基質特異性により特徴づけられる。好中性顆粒球および単球（マクロファージ）もプロテアーゼを分泌する（Ｄｏｒｎｅら，１９９９，ＷｏｕｎｄＲｅｐ．Ｒｅｇ．７：４３３−４４１；Ｓｈａｐｉｒｏら，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９１，２７；９５−９８）。単球は細胞内セリンプロテアーゼ類のエラスターゼおよびカテプシンＧを含み、そして少量のメタロプロテイナーゼ類を分泌する。一方、分化中の単核貧食細胞では、カテプシンＧの発現は抑圧され、そしてコラゲナーゼの発現は遅らされている。成熟マクロファージ中では、メタロプロテイナーゼ類の発現は刺激後に強力に誘導されることが、観察されている（Ｓｈａｐｉｒｏら，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９１，２７：９５−９８）。

慢性創傷に関して、特に関心が集中しているのが、マトリックスメタロプロテイナーゼ類である。すなわち、慢性創傷の浸出物中に見られるコラーゲン溶解活性の量は、外科創傷または開放皮膚創傷の浸出物中に見られるものに比べて、有意に増加している（Ｙａｇｅｒら，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０７：７４３−７４８）。例えば、多様な研究は、ＭＭＰ１の量が慢性創傷で顕著に増加しており、そして慢性創傷の浸出物中ではＭＭＰ１が主なコラゲナーゼであるという証拠を、提出している（Ｖａａｌａｍｏら，１９９７，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０９；９６−１０１；Ｎｗｏｍｅｔｈら，１９９９，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，８１；１８９−１９５）。ＭＭＰ８も慢性創傷でより強く発現される（Ｙａｇｅｒら，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０７：７４３−７４８；Ｎｗｏｍｅｔｈら，１９９９，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，８１；１８９−１９５）。間質コラゲナーゼ部類に属するＭＭＰ類に加えて、他のＭＭＰ類すなわちゼラチナーゼ類ＭＭＰ２およびＭＭＰ９とストロメライシン類ＭＭＰ３，ＭＭＰ１０およびＭＭＰ１１が、慢性創傷中に増量して存在することが証明されている（ＮａｇａｓｅおよびＷｏｅｓｓｎｅｒ，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４；２１４９１−２１４９４）。セリンプロテアーゼ活性、すなわちエラスターゼ活性が慢性創傷に存在し、この活性がフィブリンおよびフィブロネクチンを分解するとみなされてきた（Ｐａｌｏｌａｈｔｉら，１９９３，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２：２９−３７；Ｒａｏら，１９９５，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０５；５７２−５７８；ＧｒｉｎｎｅｌｌおよびＺｈｕ，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０６：３３５−３４１；Ｈｅｒｒｉｃｋら，１９９７，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７７：２８１−２８８）。

もう１つのセリンプロテアーゼ、カテプシンＧは、慢性褥瘡性潰瘍の顆粒形成組織で検出されている（Ｒｏｇｅｒｓら，１９９５；ＷｏｕｎｄＲｅｐ．Ｒｅｇ．，３：２７３−２８３）。対照的に、静脈性足潰瘍ではカテプシンＧ量の増加は、全く観察できなかった（Ｗｅｃｋｒｏｔｈら，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０６：１１１９−１１２４）。これらの明らかに矛盾する結果は、“慢性皮膚創傷”という用語が、異なる病因背景をもつ完全に別個の疾患を含むことを示している。一般に、糖尿病性潰瘍、静脈性潰瘍、動脈性潰瘍、および褥瘡性潰瘍は区別される。褥瘡性潰瘍は非常に深い創傷で、当該組織の壊死、感染症、および浸軟を伴う。それらは、ある皮膚部位への長期加圧により生成する。対照的に、静脈性潰瘍はかなり表面的で、静脈静止に起因するのに対して、動脈性潰瘍は動脈閉塞疾患により起ることが多い。次に糖尿病性潰瘍は、糖尿病患者に生じることが多い潰瘍である。非常に多くの糖尿病関連合併症の中で、糖尿病の末期合併症は、頻繁感染、栄養障害、およびリポイド類壊死のような、皮膚に特有の変化も含む。これらの変化は、しばしば微小血管症性障害の結果として、難治性潰瘍へ発達することがある。次の調査知見、すなわち、ＩＩ型糖尿病に罹っている患者の２５％が、しばしば慢性潰瘍（“糖尿病足”）を発症し、その約半数が念入りな入院治療を要することを考えれば、これらの疾患の疫学的重要性は明らかである。にもかかわらず、これらの潰瘍は、結局ほとんど治癒しない。糖尿病足は、糖尿病に伴う他のどの合併症より、入院の原因となる。Ｉ型およびＩＩ型糖尿病に伴う症例の数は増え続けており、全入院患者の約２．５％になっている。

異常かつ過度に強力なタンパク質分解活性が、慢性創傷の難治の原因と想定されてきた（Ｙａｇｅｒら，１９９９，ＷｏｕｎｄＲｅｐ．Ｒｅｇ．，７：４３３−４４１）。正常に治癒している創傷では、タンパク質分解活性と抗タンパク質分解活性との間の平衡は、広範なプロテアーゼインヒビターによりもたらされる。この学説は、メタロプロテイナーゼインヒビターＴＩＭＰ−１、非特異的プロテアーゼインヒビターのアルファ２−マクログロブリン、およびエラスターゼインヒビターのアルファ１−プロテアーゼインヒビターのような、慢性創傷内のプロテアーゼインヒビター類の量が減少しているという観察により、支持される（Ｙａｇｅｒら，１９９７，ＷｏｕｎｄＲｅｐ．Ｒｅｇ．，５：２３−３２；Ｇｒｉｎｎｅｌｌら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１０；７７１−７７６；Ｂｕｌｌｅｎら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０４；２３６−２４０；Ｒａｏら，１９９５；Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０５：５７２−５７８；ＧｒｉｎｎｅｌｌおよびＺｈｕ，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０６：３３５−３４１）。この欠乏は、それらのプロテアーゼインヒビターに関して、不完全な“抗プロテアーゼ遮蔽”をもたらす可能性が考えられる。その結果、コラーゲンの代謝回転速度が、その合成より速くなる。これらの結果は、他の研究により確証されている（Ｎｗｏｍｅｈら，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，８１：１８９−１９５；Ｖａａｌａｍｏら，１９９６，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１３５；５２−５９；Ｗｉｔｔｅら，１９９８，Ｓｕｒｇｅｒｙ１２４：４６４−４７０）。したがって、外因性プロテアーゼインヒビター類を投与することにより、それぞれ、減少しているか、または欠けているプロテアーゼインヒビターの発現を高めるか、または誘導するかによって、抗プロテアーゼ遮蔽を増加することが示唆されてきた。本仮説に基づいて、メタロプロテイナーゼ類の非常に多くのインヒビターが開発されてきた（例えば、ＷＯ２０００７３２９５；ＵＳ６１６６０８４；ＷＯ２００１０５３９７；ＷＯ２０００６３１６５；ＷＯ２０００４６１８９；ＷＯ２０００４４７２３；ＤＥ１９８５１１８４；ＵＳ６０７１９０３；ＥＰ−１００４５７８；ＥＰ−９４９２４６；ＷＯ９８５８９２５；ＥＰ−８７８４６７）；しかしそれらのどれも、慢性皮膚創傷の治療用に意図され、そしてプロテアーゼ・抗プロテアーゼ平衡に介入する薬剤として、認定されたものはない。さらに、現在までの研究は、用語“慢性潰瘍”の下にまとめられているさまざまな疾患を区別しなかった。そのため、それらの研究の結果を、創傷治癒過程内の他の障害に安易には適用できない。それゆえこれまでのところ、慢性創傷治癒障害のための有効な治療法はなかった。確立された形の治療法は、創傷治癒の物理的支持（例えば、包帯、圧迫法体、およびゲル剤）に、壊死組織の除去に、および皮膚組織、培養皮膚細胞、および／またはマトリックスタンパク質の移植に、限定されている。近年、増殖因子類が、創傷治癒を改善する能力について試験されてきたが、しかし従来の治療法を明確に改善できるとはされていない。

世界的にＩＩ型糖尿病患者の数が顕著に増加してること、また動脈性潰瘍に罹っている患者が非常に大勢いることを視野に入れて、難治性糖尿病随伴創傷および難治性動脈創傷の治癒を決定的に改善する新規な活性化合物が、強く求められている。ゆえに、本発明の目的は、難治性糖尿病随伴創傷および難治性動脈創傷の治癒を決定的に改善する新規な活性化合物を見つけることにあった。

驚いたことには、本発明は、糖尿病マウスの創傷でマウスＡＣＴの発現が、無傷の皮膚でのものと比較して、有意に減少してることが判明したが、一方ＡＣＴ発現の顕著な増加が、無傷の皮膚でのものと比較して、正常に治癒している対照動物の創傷中および老齢動物の難治性創傷中の両方で、また創傷難治に罹っているデキサメタゾン治療動物で、観察されたことを、明らかにしている。健康被験者における創傷治癒過程に比較して、ＡＣＴの発現のレベルの正の制御のための能力の顕著な低下が、ヒトにおける慢性糖尿病性潰瘍についても証明された。これは、糖尿病性哺乳動物および糖尿病性ヒトの難治性創傷の場合のみならず、難治性動脈性創傷においても、ＡＣＴ発現の特異的調節解除を示している。正常に治癒している対照動物および健康なヒトにおいては、ＡＣＴの発現が、創傷後の創傷組織で劇的に増加する。別の実験は、ＡＣＴ転写産物の濃度低下のほかに、ＡＣＴポリペプチドの活性も、正常に治癒している創傷ならびに静脈性潰瘍において観察される活性増加に比較して、難治性糖尿病性創傷では選択的に減少していることを、確認した。このように、抗プロテアーゼ遮蔽の強化をもたらし、次にコラーゲンの新合成の増加を可能にし、そして結果として正常に治癒している創傷における迅速な創傷治癒を支えるのは、ＡＣＴの発現および機能、特に当該活性の増加である。ＡＣＴの発現および機能、特に活性の両方の強度が、一方で糖尿病性哺乳動物および糖尿病性ヒトの難治性創傷の場合で、そして他方で難治性動脈性創傷の場合で、無傷の皮膚でのものに比べてまたは正常な創傷治癒に比べて、それぞれ、変化しないか、または強く低下したという驚くべき観察は、創傷におけるＡＣＴの量および機能、特に活性を増加させることによる創傷治癒の治療の可能性を開いた。さらに、当該結果は、ＡＣＴプロテアーゼインヒビター平衡におけるこの乱れが、糖尿病性哺乳動物および糖尿病性ヒトの難治性創傷に、ならびに難治性動脈性創傷に、特異的であることを示している。老齢動物の難治性創傷および創傷難治に罹っているデキサメタゾン治療動物で見られた創傷治癒障害の場合には、それぞれ、無傷の皮膚または正常の創傷治癒と比較した創傷で、ＡＣＴ発現および機能、特に活性の異常調節が、それらの場合には、なかったことから、創傷難治性の原因として他の要因を考える必要がある。

本発明の状況内で行われた実験（例えば実施例３）は、糖尿病哺乳動物の難治性創傷および難治性動脈性創傷の治療に、本発明の、ＡＣＴポリペプチドの使用の効能を証明している。動脈傷害をもつ糖尿病性ラットの創傷でネズミＡＣＴ相同体（ｍＡＣＴ）を増加させることにより、正常に治癒している創傷に対して、糖尿病動物の難治性創傷の創傷治癒の著しい改善を達成することが可能であったが、一方、正常に治癒している創傷の創傷治癒は、ｍＡＣＴを投与することにより影響されなかった。ＡＣＴの発現減少は、創傷難治、具体的には難治性糖尿病関連創傷および難治性動脈性創傷に、因果的に関係する。したがって当該問題は、配列番号１から配列番号４の少なくとも１つのＡＣＴポリペプチド、またはそれらの機能性変異体、またはそれらをコードする核酸、またはそれらの変異体、または配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチドまたはそれをコードする核酸を発現する細胞を、哺乳動物における糖尿病関連および／または動脈性難治性創傷の治療および／または予防に、使用することにより解決される。

ＡＣＴはカテプシンＧの２つの既知内因性プロテアーゼインヒビターの１つであることが知られており、ＡＣＴは、カテプシンＧを特異的に阻害するが、エラスターゼには測定できるほどの作用を発揮しない（Ｔｒａｖｉｓら，１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７；５６５１−５６５６；Ｓｃｈｉｃｋら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１８４９−１８５５），それに対して、他方のプロテアーゼインヒビターＳＣＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）は、カテプシンＧおよびエラスターゼの両方を阻害するという事実により、該他方のプロテアーゼインヒビターＳＣＣＣＡ２と相違する。ヒトでは１つのＡＣＴ遺伝子が知られるが、多形性が、特にシグナルペプチド配列に、報告されている（Ｒｕｂｉｎ，１９８９，データベース登録）。本研究で同定された対立遺伝子および、当該成熟タンパク質および４アミノ酸のシグナルペプチドを含むポリペプチド断片の配列（ＵＳ５３６７０６４−Ａ）は、それぞれ配列番号３および配列番号４に挙げられており、一方、相当するｃＤＮＡは、配列表の配列番号７および配列番号８に挙げられている。げっ歯動物の場合、ＡＣＴに相同的である非常に多くの遺伝子が証明されており、マウスセリンプロテアーゼインヒビター２−２（配列番号２；ｔｒＥＭＢＬ：Ｑ６２２５８）は、反応中心、組織分布、および炎症後の誘導能に関して広い一致が存在するので、ヒトＡＣＴ遺伝子に機能的相同体である（Ｉｎｇｌｉｓら，１９９１，Ｇｅｎｅ１０６：２１３−２２０）。げっ歯類セリンプロテアーゼインヒビター２−２ファミリーの他のメンバーは、ラットでｓｐｉ２−２およびｓｐｉ３、そしてＡｄｏｄｅｍｕｓｓｙｌｖａｔｉｃｕｓからのｓｐｉ２−２相同体がある（Ｉｎｇｌｉｓら、上記参照）。反応中心はプロテアーゼインヒビター特異性に不可欠で（Ｒｕｂｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７６２７−７６３３），シグナルペプチドのない成熟タンパク質のアミノ酸３５６−３６１は、その特異性に特に重要である。Ｐ１位と呼称されるものに相当する、シグナルペプチドのない成熟タンパク質のアミノ酸３５８は、その点に関して特別に重要らしく、このアミノ酸における突然変異は、たとえごく弱くても、測定可能なエラスターゼ活性を生じさせるからである。しかし、それらの反応性ループが必然的に保存され、その結果エラスターゼに何らの阻害作用を示さないのは、特にそれらのポリペプチドであり、本発明に従って使用可能である。

ＡＣＴはさまざまな疾患との関係で記載されているが、ＡＣＴ発現の減少と、難治性糖尿病性創傷および／または難治性動脈性創傷とが、関連づけられたことはないという証拠を、以下の観察が提供している。

遺伝性ＡＣＴ欠損症は多形態性で、しばしば慢性肝炎および残留肺容積の増加に随伴する（Ｅｒｉｋｓｓｏｎら，１９８６，ＡｃｔａＭｅｄ．Ｓｃａｎｄ．２２０，４４７−４５３）。さらに、アルツハイマー病の発病に重要な役割が示唆されているが、それは神経原繊維プラークが多量のＡＣＴを含むからである（Ｋａｌｓｈｅｋｅｒ，１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，２８：９６１−９６４）。ＡＣＴヌクレオチド配列もわかっており（Ｃｈａｎｄｒａら，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２：５０５５−５０６１；ＭｏｒｉｉおよびＴｒａｖｉｓ，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：１２７４９−１２７５２）そしてＡＣＴと臨床症候群との関連も、当該タンパク質のレベルで提案および／または研究されてきた（例えばＫｏｚａｋａおよびＴａｚａｗａ，１９７６，ＴｏｈｏｋｕＪ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ １１９：３６９−７６；Ｋｅｌｌｙら，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ２８：２０９−１５；Ｔｅｇｎｅｒ，１９７８；Ａｃｔａ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ，８５：２８２−９）。
ＡＣＴはまた、マスト細胞中のキマーゼ類を阻害することも明らかにされたが、その理由としてＡＣＴはアレルギー反応との関係で記載されている（ＬｉｎｄｍａｒｋおよびＷａｌｌｅｎｇｒｅｎ，Ａｌｌｅｒｇｙ，１９９２，４７：４５６−４５８）。さらに、キマーゼおよびそのインヒビターＡＣＴの役割が、乾癬性病巣で研究されている。しかしそれらの結果は、キマーゼが、乾癬の病理機構で付随的役割を演じているに過ぎなく（Ｈａｒｖｉｍａら，１９９９，ＡｃｔａＤｅｒｍ．Ｖｅｎｅｏｒｏｌ．，７９：９８−１０４）、そして乾癬患者の非損傷皮膚でのキモトリプシンインヒビター活性のレベルは変わっていない（Ｇｌｉｎｓｋｉら，１９９１，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，２８３：２２４−２２９）ことを、示している。ＥＰ０４３２１１７によれば、ＡＣＴは“皮膚炎症”、“火傷”、および“皮膚病状態”の治療に使用可能という。しかしＥＰ０４３２１１７は“皮膚病状態”の意味を説明していない。“皮膚炎症”は、機械的に傷害を受けた皮膚すなわち創傷、または創傷治癒の途中で消失組織が回復する経過における変質、とは異なる、乾癬または皮膚炎のような皮膚の炎症性疾患を指す。“皮膚炎症”は、したがって、本発明の難治性動脈性創傷または難治性糖尿病随伴創傷を含まない、皮膚の病理的状態を表す。同じ理由で、用語“皮膚病状態”は本発明の創傷を含まない：すなわち用語“皮膚病状態”は、本質的に内的過程に由来する皮膚の障害の症状を表す水疱、のう疱、斑のような障害皮膚の状態を指す。他方、創傷は身体外部から来る機械的な力に起因する。

まとめると、本酵素はバイオテクノロジーで長い間知られており、そして医学的見地から広範に研究されてきたが、ＡＣＴと、治癒しにくい動脈性または糖尿病随伴性創傷との関係は、これまで記載されていない。それゆえ例えば、創傷、特に治癒しにくい糖尿病随伴性または動脈性創傷におけるＡＣＴの発現に関しては、研究は全く存在しない。非常に多くのさまざまな可能性のある創傷の中で、２つの難治性創傷、すなわち糖尿病随伴性または動脈性潰瘍が、専門家によっても考えられもしなかったＡＣＴによる治療成功の最良のチャンスを意外にももつことを、本発明は初めて明らかにしている。

当該技術分野は、１つのプロテアーゼを特異的に阻害するプロテアーゼインヒビターでの創傷の治療を見込みのないものとみなし、１つの以上のプロテアーゼを阻害するプロテアーゼインヒビターを開発することに集中している。そのため、いくつかのプロテアーゼに作用する、多数の変異体、なかでもＡＣＴの変異体が存在する：Ｌｅｘ０３２は、ＡＣＴおよびアンチトリプシンの複合体として、カテプシンＧとエラスターゼの両方に働き、そして膵臓炎の治療に使われる（ｖｏｎＤｏｂｓｃｈｕｅｔｚら，１９９９，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：７８２−８）。エラスターゼ阻害およびカテプシンＧ阻害の性質をもつ二機能性変異体が、炎症性疾患、例えば慢性創傷および乾癬の治療用に明らかにされている（（ＷＯ９５／２７０５５）。しかしそのようなハイブリッド変異体は、それらのタンパク質を外来であると認識する抗体と一緒にあるか、または他の未試験のプロテアーゼと一緒にある場合、予知し得ない副作用および相互作用の危険をもつ。それに対して、単一のプロテアーゼのみへの作用は、モニターするのが比較的簡単で、それだけにほとんど副作用のない特異的な治療効果を達成することが可能である。

したがって要するに、当該技術分野は、治癒しにくい糖尿病随伴性および／または動脈性創傷の治療および／または予防のためのＡＣＴの使用に関心を示しておらず、それだけに、本発明に従ってＡＣＴが使用可能なことは、予想外であり、驚きであった。

本発明は、難治性糖尿病随伴創傷および／または難治性動脈性創傷から選択される疾患の診断、治療および／または予防のための、配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチドの、またはそれをコードしている核酸の、または配列番号１から配列番号４のポリペプチドに対して向けられた抗体またはその断片、または配列番号１から配列番号４のポリペプチドに対して向けられた触媒性抗体、または配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチドまたはそれをコードしている核酸を発現している細胞の、使用に関する。

用語“機能性変異体”は、本発明に従って使用可能なポリペプチドの変異体であって、未変性のＡＣＴポリペプチドのものと比較してかなり相違していて、しかもカテプシンＧについてのプロテアーゼインヒビター特異性を、それらの変異体が全くもたないものを意味すると理解されるものとする。例えば、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号１から配列番号４の配列の１つと、少なくとも約７０％、特に少なくとも約８０％、とりわけ少なくとも約９０％の配列同一性をもつ。当該ポリペプチドの機能性変異体はまた、未変性のＡＣＴポリペプチドと比較したとき、何ら有意に相違したプロテアーゼインヒビター特異性を示さない、本発明に従って使われる前記ポリペプチドの部分であってもよい：例えば、第１アミノ酸、すなわちメチオニンは、当該ポリペプチドの機能に何ら有意な変化を起さずに、欠損することも可能である。約１−６０、好ましくは約１−３０、特に約１−１５、とりわけ約１−５アミノ酸の範囲での、当該ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端および／または内部の欠失も、当該プロテアーゼインヒビター特異性が未変性ポリペプチドのものと比較して本質的に変化していなければ、含まれる。当該ポリペプチドのＮ末端におけるシグナルペプチドまたはその一部に影響する欠失は、特に優先される。未変性のポリペプチドのものと比較して、そのプロテアーゼインヒビター特異性が有意に変化していない、そうした変異体の例は、本発明に従って使われるポリペプチドと相同で、そして特にヒトまたはマウス以外の生物に、好ましくはサル、ブタ、およびラットのような非ヒト哺乳動物に由来する、ポリペプチドである。ポリペプチドの他の事例は、異なる個人でまたは異なる器官で、当該遺伝子の異なる対立遺伝子によりコードされており、そして未変性のポリペプチドと比較したとき、ある生物における当該未変性ポリペプチドのものと比較して有意に相違するプロテアーゼインヒビター特異性を、全く示さないポリペプチドである。さらに、未変性状態で存在するポリペプチド鎖の翻訳後または共翻訳修飾は、欠損または変更が可能である。特に、共有結合した糖残基は欠損または変更が可能である。

好ましい機能性変異体は、シグナルペプチドまたはその一部が欠失したＡＣＴポリペプチド、例えば配列番号４のポリペプチドである。さらに、本発明に従って使用してもよいＡＣＴポリペプチドは、糖鎖付加、部分的糖鎖付加、または糖鎖不形成が可能である。配列番号３に比較して保存されている反応性ループをもち、そして成熟未変性ＡＣＴポリペプチドと本質的に同様なプロテアーゼインヒビター特異性を示す、ヒト変異体が優先される。他の好ましい変異体は、配列番号１のように、本質的に保存されている反応性ループを含む、セリンプロテアーゼインヒビター２−２ポリペプチド類である。

用語“コード核酸”は、本発明に従って使用可能なＡＣＴポリペプチド、またはその機能性変異体、またはその前駆体段階のもの、例えばプロポリペプチドまたはプレプロポリペプチドを、コードするＲＮＡまたはＤＮＡに関する。当該ポリペプチドは、それが機能性変異体であれば、完全長配列または当該コード配列のどの部分によりコードされてもよい。

用語“変異体”は、配列番号１から配列番号４の本発明に従って使われるポリペプチド、またはそれらの機能性変異体をコードするＤＮＡ配列（標準配列）であって、そして当該標準配列に少なくとも約７０％、特に少なくとも約８０％、とりわけ少なくとも約９０％の配列同一性を示す、前記ＤＮＡ配列に相補的であるすべてのＤＮＡ配列を表す。用語“変異体”はさらに、前記標準配列に相補的でありそしてストリンジェントな条件下でその標準配列とハイブリッド形成し、そして当該標準配列によりコードされるポリペプチドと本質的に同じ活性を示すポリペプチドをコードする、すべてのＤＮＡ配列、およびまたそれらの縮重型を表す。本発明に従って使用可能な核酸の配列中には、小さな変化が存在することがあることはわかっている；例えば、機能性変異体の性質が失われることなしに、これらの変化は、当該遺伝暗号の縮重により、または当該核酸の５’末端および／または３’末端に付加される非翻訳配列により、もたらされることがある。それゆえ本発明は、既に記載された核酸のいわゆる“変異体”も含む。
用語“ストリンジェントなハイブリッド形成条件”は、ハイブリッド形成が、例えば、２．５ｘＳＳＣ緩衝液中で６０℃で起り、続いてより低い緩衝液濃度で３７℃において数回の洗浄工程を行い、そしてなお安定なままである条件を、特に意味するとして、理解されるものとする。

配列同一性は、ポリペプチドの場合には例えばＢｌａｓｔＰ ２．０．１により決定可能な、そして核酸の場合には例えばフィルターが相殺され、ＢＬＯＳＵＭが６２である、ＢＬＡＳＴＮ２．０１４により決定可能な、２つの配列の同一性の程度（％同一）として理解される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）。“配列相同性”は、例えば、フィルターが相殺され、ＢＬＯＳＵＭが６２である、ＢｌａｓｔＰ ２．０．１により決定される２つのポリペプチド配列の類似性（％正）として理解される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）。

本発明の意味内で、治癒しにくい糖尿病随伴創傷は、糖尿病に罹っている哺乳動物およびヒトにおける皮膚病変であると理解されるものとする。そうした皮膚病変の例は、特に、糖尿病に起因する潰瘍、例えば下肢動脈潰瘍、リポイド類壊死、および動脈性潰瘍、および、血管の動脈硬化性破壊に起因する創傷治癒遅延であると理解されるものとする。
本発明の意味内で、治癒しにくい動脈性創傷は、例えば、動脈性潰瘍、および、血管の動脈硬化性破壊に起因する創傷治癒遅滞であると理解されるものとする。

本発明の意味内で、ＡＣＴの機能は、ＡＣＴがプロテアーゼカテプシンＧへ作用する活性として、理解されるものとする。ＡＣＴの機能はまた、ＡＣＴとカテプシンＧとの複合体、すなわち、受容体、例えばセルピン（ｓｅｒｐｉｎ）−酵素複合体受容体（ＳＥＣＲ）に結合する、カテプシンＧ：ＡＣＴ複合体、の形でのＡＣＴの活性も含む（Ｃｈｅｎら，１９９３，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４３：１２２３−７；Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒら，１９９０ ＰＮＡＳ：８７：３７５３−７）。

本発明の意味内で、ＡＣＴの活性は好ましくは、カテプシンＧプロテアーゼの結合および阻害を含む。ＡＣＴの活性を定量するための適切な検定法は、例えば、実施例５またはＨｅｉｄｔｍａｎｎら，１９９０，ＣｌｉｎＣｈｅｍ ３６：２０７７−２０８１のようなプロテアーゼ阻害検定法である。

“反応性ループ”は、本発明に従って使用可能なＡＣＴポリペプチド中の配列モチーフであって、天然に存在し、当該ＡＣＴポリペプチドの特異性の原因であり、そして成熟ヒトＡＣＴポリペプチドのアミノ酸３５６から３６１に相当し、または配列番号４のヒトポリペプチドのアミノ酸３６０から３６５に相当し、または配列番号３のヒトポリペプチドのアミノ酸３８１から３８６に相当し、そしてマウス配列の場合、配列番号１または配列番号２のアミノ酸３７９から３８４に相当する、前記配列モチーフであるとして理解されるものとする。

本発明の意味内で、“保存された反応性ループ”は、唯一のアミノ酸の相違が、エラスターゼについてのプロテアーゼインヒビター特異性に何ら有意な変化をもたらさないものである、反応性ループであるとして理解されるものとする。
エラスターゼについての“プロテアーゼインヒビター特異性における有意な変化”とは、エラスターゼインヒビター活性に、未変性のＡＣＴ配列と比較して、少なくとも１００倍台の、特に少なくとも１０００倍台の、とりわけ少なくとも１００００倍台の、増加があること、または、もしそうした活性が当該未変性配列で測定できなければ、内因性エラスターゼインヒビターアルファ１−プロテアーゼインヒビターのものと比較して、少なくとも０．０００１倍のエラスターゼインヒビター活性がある、変化であるとして理解されるものとする。プロテアーゼインヒビター特異性の測定のための検定法は、当業者に知られており、そしてさらに詳しく以下に記載される。

本発明に従って使用可能であり、そして本発明に従って使用可能なＡＣＴポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの機能性変異体は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡである。さらに、当該核酸の配列は、それが少なくとも１つのイントロンおよび／またはポリＡ配列をもつという事実により、特徴づけが可能である。

一般に、本発明に従って使用可能なポリペプチドを調製するための、および遺伝子治療に適用できそして本発明に従って使用可能なベクターと組合せる、両方の、関連遺伝子を発現するために二本鎖ＤＮＡが優先され、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域が特に優先される。真核生物では、本領域は、コザック配列（Ｋｏｚａｋ，１９８７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：８１２５−４８）中に位置する第１開始コドン（ＡＴＧ）で始まり、そしてＡＴＧと同じ読み枠中に位置する次の終止コドン（ＴＡＧ，ＴＧＡまたはＴＡＡ）に及ぶ。原核生物の場合、本領域は、シャイン・ダルガルノ配列の後の第１ＡＵＧ（またはＧＵＧ）で始まり、そしてそのＡＴＧと同じ読み枠中に位置する次の終止コドン（ＴＡＧ，ＴＧＡまたはＴＡＡ）で終る。

さらに、本発明を履行するために合成的に調製された核酸を使用することも可能である。それゆえ、本発明に従って使用される核酸は、例えば、表１に記載されたＤＮＡ配列を利用して、および／または遺伝暗号を参照することによりこの表に同様に記載されている当該タンパク質配列を利用して、例えばホスホトリエステル法に従って化学的に合成することが可能である（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，９０，５４３−５８４，Ｎｏ．４を参照）。

本発明の特に好ましい実施態様では、本発明に従って使用が可能な少なくとも１つの核酸が、ベクター中の、好ましくは遺伝子治療に適用可能なベクター中の発現カセットに含まれる。本発明はまた、本発明に従って使用可能な融合タンパク質を発現するベクターの使用も含む。遺伝子治療に適用可能なベクターは好ましくは、前記の核酸に機能的に連結された、組織特異的、創傷特異的または皮膚特異的、細胞周期特異的、細胞型特異的、代謝特異的または構成的に活性な、調節配列を含む。

本発明に従って使用が可能なポリペプチドを調製するために用いられる発現ベクターは、原核生物または真核生物発現ベクターでもよい。原核生物発現ベクターの例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現に用いられるｐＧＥＭベクターまたはｐＵＣ誘導体であり、そして真核生物発現ベクターの例は、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に用いられるベクターｐ４２６Ｍｅｔ２５およびｐ４２６ＧＡＬ１（Ｍｕｍｂｅｒｇら（１９９４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２２，５７６７−５７６８）、昆虫細胞での発現に用いられ、ＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９またはＥＰ−Ｂ１−０５４９７２１に開示されたような、バキュロウイルスベクター類、および哺乳類細胞での発現に用いられるベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶ、またはＳＶ４０ベクターであり、これらのベクターはすべて一般には入手可能である。

一般に、前記発現ベクターはまた、大腸菌での発現のためのｔｒｐプロモーター（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０１５４１３３参照）、酵母での発現のためのＭｅｔ２５，ＧＡＬ１またはＡＤＨ２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌら（１９８３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，２６７４−２６８２；Ｍｕｍｂｅｒｇ上記参照）、および昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター（１．１３．ＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９参照）のような、それぞれの宿主細胞に適したプロモーターも含む。真核生物細胞において構成的で、調節可能な、組織特異的、細胞型特異的、細胞周期特異的または代謝特異的な発現を可能にするプロモーターは、例えば、哺乳類細胞における発現に適している。本発明の調節可能なエレメントは、プロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、サイレンサーおよび／またはリプレッサー配列である。

真核生物で構成的発現を可能にする適当な調節可能なエレメントの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより認識されるプロモーター、またはウイルスプロモーター類、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター（実施例３も参照）、ＳＶ４０プロモーター、または例えば、ＭＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍ウイルス；Ｌｅｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２１４，２２８−２３２）由来のＬＴＲプロモーター類、および例えば、ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＨＳＶ，ＨＰＶ，ＥＢＶ，ＨＴＬＶまたはＨＩＶ由来である他のウイルスプロモーターおよびアクチベーター配列である。

真核生物において誘導性発現を可能にする調節可能なエレメントの例は、適切なリプレッサーと組合わせたテトラサイクリンオペレーターである（ＧｏｓｓｅｎＭ．ら（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５，５１６−２０）。

本発明に従って使用が可能な核酸の発現は、組織特異的プロモーターの制御下で、特に好ましくはヒトＫ１０プロモーター（Ｂａｉｌｌｅｕｌら，１９９０．Ｃｅｌｌ６２：６９７−７０８），ヒトＫ１４プロモーター（Ｖａｓｓａｒら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１５６３−６７）またはウシサイトケラチンＩＶプロモーター（Ｆｕｃｈｓら，１９８８；Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｗｏｏｌ ａｎｄ Ｈａｉｒ（Ｇ．Ｅ．Ｒｏｇｅｒｓら編），２８７−３０９ページ．Ｃｈａｐｍａｎａｎｄ Ｈａｌｌ，ロンドン／ニューヨーク）のような、皮膚特異的プロモーターの制御下で行われる。

真核生物において組織特異的発現を可能にする調節可能なエレメントの他の例は、特定の細胞型でのみ発現されるタンパク質をコードするそれらの遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーからのプロモーターまたはアクチベーター配列である。
真核生物において細胞周期特異的発現を可能にする調節可能なエレメントの例は、次の遺伝子のプロモーターである：ｃｄｃ２５Ａ，サイクリンＡ，サイクリンＥ，ｃｄｃ２，Ｅ２Ｆ，Ｂ−ｍｙｂおよびＤＨＦＲ（ＺｗｉｃｋｅｒＪ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｒ．（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１３，３−６）。

真核生物において代謝特異的発現を可能にする調節可能なエレメントの例は、低酸素症により、グルコース欠乏症により、リン酸塩濃度により、または熱ショックにより、調節されるプロモーターである。

皮膚で角化細胞特異的発現を可能にする調節可能なエレメントの例は、ＦｉＲＥエレメントである（Ｊａａｋｋｏｌａら，２０００，Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．，７：１６４０−１６４７）。当該ＦｉＲＥエレメントは、ｓｙｎｄｅｃａｎ−１遺伝子のＡＰ−１駆動、ＦＧＦ誘導性応答エレメントである（Ｊａａｋｋｏｌａら，１９９８，ＦＡＳＥＢＪ．，１２：９５９−９）。

空間的および時間的発現を可能にする調節可能なエレメントの例は、部位特異的リコンビナーゼＣｒｅと修飾エストロゲン受容体との間の融合をコードする核酸である。本融合タンパク質の発現は組織特異的プロモーターにより制御される。生じた細胞質性融合タンパク質は、エストロゲン類似体のタモキシフェンの投与で核中へ移動し、そして組換えを誘導可能である（Ｆｅｉｌら，１９９６，ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ９３：１０８８７−９０）。

本発明に従って使用可能な核酸を、トランスフェクション、トランスフォーメーション、または感染によって、真核生物または原核生物細胞中へ導入可能にし、そしてそれにより、当該ポリペプチドを発現できるようにするためには、当該核酸は、プラスミドとして、またはウイルス性または非ウイルス性ベクターの一部として存在してもよい。この状況で特に適したウイルス性ベクターは：バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペルスウイルスである。この状況で特に適した非ウイルス性ベクターは：リポソーム、ウイロソーム、陽イオン性脂質、およびポリリシン複合ＤＮＡである。

遺伝子治療に適用可能なベクターの例は、ウイルス性ベクター、例えば、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎら，１９９７，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３：４６６−７６；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５４９−５８）。裸のＤＮＡは、局所的に適用された場合、皮膚細胞中へ浸透が可能なので、真核生物発現ベクターは、分離された形で存在する場合には、遺伝子治療での使用に適している（Ｈｅｎｇｇｅら，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２９１１−６；Ｙｕら，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：３７０−５）。

遺伝子治療に適用可能なベクターは、本発明に従って使用可能な核酸を、リポソームと複合体を形成させることにより得ることも可能で、これは、特に皮膚細胞の、非常に高い効率のトランスフェクションを達成することを可能にするからである（ＡｌｅｘａｎｄｅｒおよびＡｋｈｕｒｓｔ，１９９５，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２２７９−８５）。リポフェクションでは、陽イオン脂質から成る小さな単層小胞が、リポソーム懸濁液を超音波処理に付すことにより、調製される。

ＤＮＡは当該リポソームの表面上にイオン的に、具体的には、正の実効電荷が残り、そしてプラスミドＤＮＡの１００％が当該リポソームにより複合体化されるような関係で、結合される。Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７，上記参照）により採用されたＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロマイド）およびＤＰＯＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）脂質混合物に加えて、非常に多くの新しい脂質製剤が、これまでに合成され、そしてさまざまな細胞系のトランスフェクションでそれらの効力が試験されている（Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．ら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，６９８２−６９８６；Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｊ．Ｈ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０−２５６１；Ｇａｏ，Ｘ．およびＨｕａｎｇＬ．（１９９１），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１８９，１９５−２０３）。

新しい脂質製剤の例は、ＤＯＴＡＰＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルサルフェートまたはＤＯＧＳ（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。サイトフェクチン（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）ＧＳ２８８陽イオン脂質も、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で角化細胞をトランスフェクトするのに非常によく適することが明らかになっている（ＵＳ５７７７１５３；Ｌｅｗｉｓら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３１７６−３１８１）。細胞中への核酸の移入を増加させる補助物質は、例えば、ＤＮＡへ結合されるタンパク質またはペプチド、または細胞の核中へ当該核酸を輸送することを可能にする合成ペプチド・ＤＮＡ分子であってもよい（Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９９９）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ ６，２８２；Ｂｒａｎｄｅｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，７８４）。補助物質はまた、核酸が細胞の細胞質中へ放出されることを可能にする分子も含む（Ｐｌａｎｃｋら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１２９１８；Ｋｉｃｈｌｅｒら（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８，２１３）。リポソームは、本発明の意味内で、薬剤的に受容可能な担体である。リポソームは、多層小胞（ＭＬＶｓ）、小単層小胞（ＳＵＶｓ）、および大単層小胞（ＬＵＶｓ）を含む。

リポソーム・核酸複合体を調製するための方法は、当業者には知られている（例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：４１９４−４１９８）。用語“リポソーム”は、例えば、ＵＳ５４２２１２０，ＷＯ９５／１３７９６，ＷＯ９４／２３６９７，ＷＯ９１／１４４４５およびＥＰ５２４９６８Ｂ１に開示されているリポソーム組成物を含む。リポソームは、本発明に従って使用できる核酸のために、ならびに本発明に従って使用できるポリペプチドのために、または両者のために、薬剤担体として使用可能であるが、好ましくはそれらは本発明の核酸のために薬剤担体として使用される。治療的に活性な物質もリポソームに結合させることが可能であり、あるいはそれは、ヒドロゲルポリマーに結合可能であるが、その場合当該ヒドロゲルポリマー（または当該ヒドロゲルポリマーの成分）は、リポソームに結合されるか、またはリポソームにより包まれることも可能である。

遺伝子治療用ベクターのもう１つの特に適した形は、本発明に従って使用できる核酸を金粒子に適用することによって得ることが可能で、そしていわゆる“遺伝子銃”の助けを借りて、それらを皮膚または細胞中へ撃ち込むことにより、これらを局所的に適用可能である（実施例３；Ｗａｎｇら，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１２：７７５−８１，Ｔｕｔｉｎｇら，１９９８，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１１：１８３−８）。

用語“リポソーム”は、例えば、ＵＳ５４２２１２０，ＷＯ９５／１３７９６，ＷＯ９４／２３６９７，ＷＯ９１／１４４４５およびＥＰ５２４９６８Ｂ１に開示されているリポソーム組成物を含む。リポソームは、本発明に従って使用可能な核酸のための、そして本発明に従って使用可能なポリペプチドのための、薬剤担体として使用可能である；それらは好ましくは、本発明に従って使用可能な核酸のための薬剤担体として使用される。治療的に活性な物質はリポソームに結合させることが可能であり、あるいはそれは、ヒドロゲルポリマーに結合可能であるが、その際、当該ヒドロゲルポリマー（または当該ヒドロゲルポリマーの成分）が、リポソームに結合されるか、またはリポソームにより包まれることも可能である。遺伝子治療用ベクターのもう１つの特に好ましい形は、本発明に従って使用される核酸を金粒子に適用し、そして負荷された粒子を皮膚または細胞中へ撃ち込むことにより、当該粒子を局所的に投与するために、遺伝子銃を使うことによって、得ることも可能である（実施例３；Ｗａｎｇら，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１２：７７５−８１，Ｔｕｔｉｎｇら，１９９８，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１１：１８３−８）。圧力を用いて皮内注射を実施するための装置は、例えば、ＵＳ５６３０７９６に開示されている。
遺伝子治療で適用可能なベクターのもう１つの形は、生体適合性マトリックス、例えばコラーゲンマトリックス中へ“裸の”発現ベクターを導入することにより、調製が可能である。このマトリックスは、例えば、当該発現ベクターで移入細胞をトランスフェクトするために、そして当該細胞中で本発明に従って使用されるポリペプチドを発現させるために、糖尿病随伴性および／または動脈性創傷へ導入が可能である（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＢａｎａｄｉｏ，ＵＳ５９６２４２７）。

遺伝子治療における前記核酸の使用のためには、当該ポリペプチドをコードする核酸の一部が、好ましくは当該ポリペプチド用のプロモーターと開始コドンとの間に、イントロン配列（実施例３参照）、および／またはポリＡ配列、特に天然に存在するポリＡ配列、または、特に当該遺伝子の３‘末端にＳＶ４０ウイルスポリＡ配列、を含む１つまたはそれ以上の非コード配列を含めば、それによって当該ｍＲＮＡを安定化することを可能にするで、それもまた有利である（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９３）Ｃｅｌｌ７４，９−１４およびＰａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，４７８−４８２）。

細胞は原核生物または真核生物のいずれの細胞であってもよい。原核生物細胞の例は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、そして真核生物細胞の例はパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または昆虫細胞である。このように、大腸菌細胞は、例えば、ヒトＡＣＴを発現するために適当な細胞であることが明らかになっている（Ｒｕｂｉｎら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１９９−１２０７）。本発明に従って使用可能なポリペプチドを調製するための大腸菌の使用は、好ましい実施態様になる。本発明に従って使用可能なポリペプチドは、例えば、当業者には周知である方法を用いて、既に上に記したように、適当な発現系中で前記の核酸を発現させることにより、調製される。適当な細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨＳ，ＨＢ１０１またはＢＬ２１、酵母株Ｓａｃｃｈｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，昆虫細胞系、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからのＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ、または動物細胞ＣＯＳ，Ｖｅｒｏ，２９３，ＨａＣａＴおよびＨｅＬａで、それらはいずれも一般に入手可能である。

糖尿病性潰瘍および／または動脈性潰瘍の、または糖尿病患者における難治性創傷の、または血管のアテローム性動脈硬化性破壊に罹っている患者における難治性創傷の、治療および予防が優先される。
本発明のもう１つの好ましい態様は、治癒し難い糖尿病随伴性および／または動脈性創傷の予防および／または治療のために融合タンパク質の形での、本発明に従って使用可能なＡＣＴポリペプチドの使用であって、その融合タンパク質は、本発明に従って使用可能な前記の核酸を用いて調製される。

これは、本発明に従って使用可能な上記ポリペプチドまたはそれらの機能性変異体を含む融合タンパク質を調製することを含み、当該融合タンパク質自身が既に前記のＡＣＴポリペプチドの１つの機能性変異体を構成するか、あるいは当該融合部分が除去されてはじめて機能性変異体になるものである。これらの融合タンパク質は、特に約１から３００、好ましくは約１から２００、特に好ましくは約１から１５０、とりわけ約１から１００、そしてなかんずく約１から５０個の外来アミノ酸の含量をもつ融合タンパク質を、含む。そうしたペプチド配列の例は、例えば、大腸菌ガラクトシダーゼ由来であってもよい原核生物ペプチド配列である。

融合タンパク質のためのペプチド配列の他の好ましい例は、当該融合タンパク質の検出を容易にするペプチドである；それらは、例えば、緑色蛍光タンパク質またはそれらの変異体を含む。

本発明に従って使用可能な上記ポリペプチドは、合成的に調製されてもよい。それゆえ、当該ポリペプチド全体、またはその部分は、例えば、古典的な合成（メリフィールド法）により合成されてもよい。前記の核酸の１つを用いて組換え的に調製されたポリペプチドを用いることが、特に優先される。さらに、ＡＣＴポリペプチドは、生物から、または組織または細胞から単離され、次いで本発明に従って使用することも可能である。それゆえ例えば、本発明に従って使用可能なポリペプチドを、例えばヒト血清から精製することができる（Ａｂｄｕｌｌａｈら，１９８３，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２２５：３０６−３１２）。さらに、ＡＣＴ発現細胞から細胞系を調製すことができ、その細胞系を次いでＡＣＴを単離するのに使用することも可能である。それゆえ、活性ＡＣＴは、例えば、大腸菌細胞中で組換え体発現により調製することも可能である（Ｒｕｂｉｎら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１９９−１２０７）。

前記のタンパク質を精製する目的のために、少なくとも１つの“ポリペプチドタグ標識”を添加することができる。例えば、適当なタンパク質タグ標識は、精製される予定のタンパク質を、あるマトリックスに高親和力で吸収されることを可能にする。次いでこれに、例えば、次の工程が続く：有意な程には当該複合体を溶出せずに、適当な緩衝液で徹底的に洗浄すること、そして引続き、吸収された当該複合体の特異的溶出である。当業者に知られているタンパク質タグ標識の例は、（Ｈｉｓ）₆標識，Ｍｙｃ標識，ＦＬＡＧ標識，血球凝集素標識、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識，アフィニティーキチン結合ドメインにより隣接されたインテインから成る標識、およびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）標識である。これらのタンパク質は、Ｎ末端に、Ｃ末端に、および／または内部に位置させることが可能である。

もう１つの好ましい態様で、本発明に従って使用できる抗体または抗体断片は、本発明に従ってＡＣＴポリペプチドの活性を増加させる触媒性抗体である。触媒性抗体の例は、例えば、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１５６６−７０に見られる。

本発明はまた、配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチドの、またはその機能性変異体の、またはそれをコードしている核酸の、または配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチド、またはその変異体、またはそれをコードしている核酸、またはその変異体、または本発明の触媒性抗体を、発現している細胞の、使用であって、適切な場合には、治癒し難い糖尿病随伴性創傷および／または治癒し難い動脈性創傷から選択された疾患の治療および／または予防用の薬剤を製造するために、適当な添加物および補助物質とともに、または組合せての、前記使用に関する。

治癒し難い糖尿病随伴性および／または動脈性創傷の治療は、例えば、本発明に従って使用可能な薬剤を含有する、包帯、絆創膏、圧迫包帯、またはゲル剤を用いて、通常の仕方で行うことが可能である。したがって、創傷治癒に即時的および直接的作用を及ぼすために、当該薬剤を限局的にかつ局所的に投与することができる。治療用組成物の局所投与は、例えば、溶液、乳化液、クリーム、軟膏、泡剤、エアゾール噴霧剤、ゲルマトリックス、スポンジ、滴剤、または洗浄剤、の形で行うことが可能である。適当な添加物または補助物質は、生理的塩化ナトリウム溶液またはアルギン酸ナトリウムのような等張液、脱塩水、安定剤、ジデムＩＩ（ＺｙｄｅｍＩＩ）のような物質を含むコラーゲン、またはポビドンのようなマトリックス形成物質である。ゲル基剤をつくるには、水酸化アルミニウム、カルボポール^R（Ｃａｒｂｏｐｏｌ^R）のようなポリアクリル酸誘導体、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース誘導体などの処方物が適当である。これらのゲルは、水ベースのヒドロゲル類として、または低および高分子パラフィン類またはワセリンおよび／または黄ろうまたは白ろうとのオレオゲル類として、調製が可能である。乳化剤として、アルカリ石鹸、金属石鹸、アミン石鹸、またはソルビタントの部分脂肪酸エステルが使用可能であり、一方、脂質は、ワセリン、天然および合成ろう、脂肪酸、モノ、ジ、トリグリセリド、パラフィン、やし油のような天然油、ミグリオール^R（Ｍｉｇｌｙｏｌ^R）のような合成脂肪、として添加可能である。投与のこれらの形は、本発明に従って使用可能な少なくとも１つのＡＣＴポリペプチドを用いるために、好ましい。本発明の薬剤はまた、適切な場合には、リポソーム複合体または金粒子複合体の形で、創傷の部分に限局的かつ局所的に投与も可能である。投与のこの形は、遺伝子治療に適用可能で、そして本発明に従って使用可能な核酸を含む、ベクター用に好ましい。

さらに、当該治療は、本発明の薬剤が、時間的に制御された仕方で放出されるのを可能にする、経皮的治療システム（ＴＴＳ）を用いて行うことも可能である。当該膜を通じての、投与された薬の浸透を助けるために、エタノール、尿素、またはプロピレングリコールのような添加物を、ユードラジット^R（Ｅｕｄｒａｇｉｔ^R）のような重合性助剤の外に、加えてもよい。ＴＴＳは、例えば、ＥＰ０９４４３９８Ａ１，ＥＰ０９１６３３６Ａ１，ＥＰ０８８９７２３Ａ１またはＥＰ０８５２４９３Ａ１に開示されている。

本発明の薬剤は、本発明のポリペプチドを発現し、次いでそれが創傷部位に分泌される、細胞、例えば、角化細胞として、投与されることも可能である。それらの修飾細胞を投与するための適当な担体は、例えばデキストランマトリックスのような生体適合材料から成る微小担体であろう（ＵＳ５９８０８８８）。

しかし、本発明の薬剤による治療は、注射または注入または経口投与のような腸管外投与を用いて、全身的に行うことも可能である。注射は、皮下に、皮内に、上皮内に、筋紡錘内に、筋内に、静脈内に、皮膚内に、腹腔内に、または胸内に適用可能であり、そして溶液、懸濁液として、等張液で希釈可能な濃縮物または凍結乾燥粉末として処方が可能である。注入はまた、等張液として、または脂肪乳化液として、リポソーム、マイクロエマルジョン、ナノスフェア、マイクロスフェア、マイクロカプセルのような“ハイテク”処方物として適用も可能である。腸管外に適用された薬剤のタンパク質またはポリマーへの吸着を助け、および／または当該薬のガラスまたはプラスチック表面との会合を減らすために、アルブミン、有機溶剤、プラスマエクスパンダー、または界面活性剤のような物質を使うことも可能である。腸管外適用薬剤の生産のために適当な助剤は、塩化ナトリウムのような等張性物質、炭酸水素ナトリウムのような等水性物質、またはトゥイーン^R（Ｔｗｅｅｎ^R）、クレモフォア^R（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ^R）のような界面活性剤または表面活性物質および乳化剤、または尿素およびクエン酸のような複合体誘導性物質、である。別の腸管外投与は、鼻腔、口腔、または直腸からの投与があろう。鼻腔および口腔適用のためには、噴霧剤、軟膏剤、吸入できるエアゾール剤または滴剤のような投与が使用可能である。適当な推進薬はテトラヒドロフランまたはヘプタフルオルプロパンであろうが、手圧式も適するであろう。これらの推進薬は、ミリスチン酸イソプロピルのような界面活性物質を含んでもよい。直腸投与のためには、浣腸剤、錠剤またはカプセル剤または坐剤のような調製物がある。補助物質として、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ^R，Ｍａｓｓａ Ｅｓｔａｒｉｕｍ^RまたはＮｏｖａｔａ^Rが使用可能である。腸管外放出の修飾された形は、好ましくは生分解性ポリマーの基剤から成り、皮下に移植されるデポー剤の使用であろう。

さらなる全身的適用形式は、錠剤、発泡性錠剤、カプセル剤、ペレット剤、糖剤、粉末、顆粒、トローチ、チューインガム、ドロップ、または懸濁剤のような経口投与である。適当な助剤は、例えば、デンプン、ラクトース、タルク（打ち粉）、ステアリン酸、セルロース、ＰＶＰ，またはエアロシル^R（Ａｅｒｏｓｉｌ^R）である。適当な添加物は、例えば、香料、色素、抗酸化剤、ビタミン、グルコースまたはアスパルテームのような甘味料である。これらの経口適用系は、例えばＥｕｄｒａｇｉｔ^Rを用いることによる徐放系として、または胃腸治療系または口腔浸透系として、調製することも可能である。胃または腸内での薬剤の空間的放出は、異なる溶解性をもつ異なるコート剤でコートされた錠剤の使用により変えることも可能であろう。

配列番号１から４のＡＣＴポリペプチドまたはそれらの機能性変異体の量および／または機能、特に活性に増加をもたらす薬剤が優先される。当該ポリペプチドは合成的にまたは組換え的に調製も可能であり、あるいは組織または細胞から分離も可能であるが、特に大腸菌細胞を用い、上記の発現系を用いる調製が特に優先される。このようにして調製された組換え体タンパク質は、例えば精製または検出を容易にするために、融合タンパク質として存在することも可能である。

本発明の薬剤のもう１つの好ましい態様は、本発明に従って、ＡＣＴポリペプチドの活性を増加する活性化抗体またはその断片の投与である。そのような触媒性抗体の適用は、上に記したように実施可能である。

もう１つの好ましい態様では、配列番号１から４のＡＣＴポリペプチドまたはその機能性変異体をコードする少なくとも１つの核酸を含む細胞を、治癒し難い糖尿病随伴性創傷および／または治癒し難い動脈性創傷から選択された疾患の治療および／または予防用の薬剤を製造するために、使用する。

本発明に従って使用可能であり、そして上記の発現ベクターまたは遺伝子治療に適用可能なベクターの形で当該核酸を含む細胞が、特に優先される。より好ましいのは、本発明に従って使用可能な融合タンパク質、または本発明に従って使用可能な抗体またはその断片を、発現する細胞の使用である。当該細胞はそれから、直接に前記創傷へ導入する、または適切な場合には、適当な担体系および／または添加物および／または補助物質と組合せて、それから当該創傷へ導入することも可能である。適当な担体系は、例えば、ＵＳ５９８０８８８，ＷＯ９２／０６１７９，ＥＰ０２４２２７０またはＷＯ９０／０２７９６に開示されている。好ましい細胞は自己由来のまたは同種異系の細胞であり、とりわけ好ましいのは、皮膚細胞、特に角化細胞、内皮細胞および繊維芽細胞である。
本発明に従って使用可能な核酸を含み、そして上で説明したように、ベクターまたは細胞中に含まれる、または本発明に従って使用可能なポリペプチドを含む、遺伝子療法治療のための、薬剤が特に優先される。

本発明に従って使用可能なもう１つの好ましい形質転換細胞は、本発明の発現カセットをそれが含むという事実によって特徴づけられるトランスジェニック胚性非ヒト幹細胞である。細胞および／または幹細胞を形質転換するための方法は、当業者にはよく知られており、そして、例えば、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを含む。本発明はさらに、そのゲノムが前記の発現カセットを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の使用に関する。一般に、トランスジェニック動物は、核酸および／またはポリペプチドの組織特異的発現増加を示し、そしてそのため本発明に従って使用可能なポリペプチドを調製するのに適している。もし、例えば、乳腺特異的プロモーターが選択されるならば、本発明に従って使用可能な組換え体ポリペプチドが、産生されるミルクから、次いで分離されることもあり得る（Ｃｌａｒｋ，１９９８，Ｊ．ＭａｍｍａｒｙＧｌａｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，３：３３７−３５０）。例えば、ベータラクトグロブリン遺伝子プロモーターのコントロール下で、トランスジェニックヒツジの乳腺中での血液凝固因子ＶＩＩＩの発現が、記載されている（Ｎｉｅｍａｎｎら，１９９９，ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．，８：２３７−２４７）。

本発明に従って使用可能な核酸を含む発現ベクターで、例えばトランスフェクションによって、適当な細胞または器官を、提供することにより、本発明に従って哺乳動物で非胚性真核生物を使うことも、さらに可能である。それゆえ、ｈＧＨ遺伝子を含む発現ベクターでモルモット乳汁分泌管をトランスフェクトするために、ＤＥＡＥデキストランまたはポリイオン複合体を用いれば、例えば、ｈＧＨの連続的な発現をもたらす（Ｈｅｎｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０００，１５２３：１６１−１７１）。

トランスジェニック動物、特にマウスを調製するための方法は、例えば、ＤＥ１９６２５０４９およびＵＳ４７３６８６６；ＵＳ５６２５１２２；ＵＳ５６９８７６５；ＵＳ５５８３２７８およびＵＳ５７５０８２５から当業者には知られており、そして、例えば、胚または精母細胞中への発現ベクター（上記参照）の直接注射により、または胚性幹細胞中への発現ベクターのトランスフェクションにより、作出可能なトランスジェニック動物を含む（ＰｏｌｉｔｅｓおよびＰｉｎｋｅｒｔ：ＤＮＡＭｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１５−６８ページ Ｐｉｎｋｅｒｔ中，１９９４：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ロンドン、英国：Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，１９９７，ＨａｒｗｏｏｄＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，アムステルダム、オランダ；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ：ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１１５−１４６ページ Ｐｉｎｋｅｒｔ中，１９９４、上記参照；Ｗｏｏｄ：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，１４７−１７６ページ Ｐｉｎｋｅｒｔ中，１９９４，上記参照；Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ：Ｇｅｎｅ ＴｒａｎｓｆｅｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１７７−２２０ページ Ｐｉｎｋｅｒｔ中，１９９４、上記参照）。

本発明はさらに、治癒し難い糖尿病随伴性創傷および／または治癒し難い動脈性創傷から選択される疾患の診断用の診断薬を調製するための、配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチド、またはその機能性変異体の、またはそれをコードしている核酸の、または配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチド、その機能性変異体、またはそれをコードしている核酸、または配列番号１から配列番号４のポリペプチドに対して向けられた抗体または抗体断片、を発現している細胞の、使用に関する。この状況で診断薬は、本発明に従って使用可能なポリペプチドに対して向けられる少なくとも１つの抗体またはその変異体を含む。

本発明の診断薬は、難治性糖尿病随伴および難治性動脈性創傷を診断するために、組織試料内の関心ある遺伝子の発現レベルおよび／または機能、特に活性レベルを定量するのに使用可能である。本方法は、難治性糖尿病随伴および難治性動脈性創傷の早期診断にとりわけ好ましい。
診断薬の好ましい態様は抗体である。本発明に従って使用可能な抗体は、当業者に知られている（例えば、ＥＰ０１６２８１２；ＥＰ５８５２０１；Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒら，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，９３：１５６−６３）；しかしそれらは周知の方法を用いて調製することも可能である：前記のＡＣＴポリペプチド、またはその機能性変異体、または少なくとも６アミノ酸の、好ましくは少なくとも８アミノ酸の、特に少なくとも１２アミノ酸の、長さをもつそれらの部分で、適切な場合には、例えばフロイントアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムゲルの存在下において、哺乳動物、例えばウサギを免疫することによる（例えば、ＤｉａｍｏｎｄＢ．Ａ．ら（１９８１）Ｔｈｅ Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１３４４−１３４９を参照）。免疫反応の結果として当該動物中に形成されるポリクローナル抗体は、次いで、周知の方法を用いて当該血液から、容易に単離し、例えば、カラムクロマトグラフィーにより精製が可能である。モノクローナル抗体は、例えばＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３−２９９）の既知の方法を用いて、調製が可能である。本発明に従って、用語の抗体はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体、両特異的またはオリゴ特異的抗体、一本鎖抗体、およびＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２断片のような組換え的に調製され、そして適切な場合には、修飾された抗体、およびそれらの抗体結合部分、も意味することと理解される（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３６８６８４，ＵＳ４８１６５６７，ＵＳ４８１６３９７，ＷＯ８８／０１６４９，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９８／２４８８４を参照）。ポリクローナルウサギ抗ヒト抗血清は商業的に入手可能であり、そして本発明に従って診断薬として使用することが可能である（Ｈｅｉｄｔｍａｎｎら，１９９０，ＣｌｉｎＣｈｅｍ ３６：２０７７−２０８１）。

これらの抗体を用いて、例えば、創傷分泌物を容易に調べ、そして本発明に従って使用可能なＡＣＴポリペプチドが、普通に治癒している創傷中にそれがあるよりも、ある生物の創傷分泌物中に顕著に高い量で存在するかしないかを、迅速に決定することができる。あるいは、これらの抗体はまた、ある生物の創傷分泌物内のＡＣＴポリペプチドの機能、特に活性を定量し、そして普通に治癒している創傷由来の創傷分泌物に対する活性の増加または減少を比較するのに、使用することも可能である。このように、本発明に従って治療が可能である、潜在的な創傷治癒障害の徴候を得ることができる。本発明に従って当該抗体を検出するためには、それらは、既に記載されているように、例えば、酵素で標識される。これは、酵素発色反応によって、特定の抗体・ペプチド複合体を容易に、そして実に迅速に、検出することを可能にする（実施例３）。

診断薬のさらに好ましい態様は、プローブ、好ましくはＤＮＡプローブおよび／またはプライマーである。プローブの調製には、約１００−１０００ヌクレオチドの長さをもつ、好ましくは２００−５００ヌクレオチドの長さをもつ、特に好ましくは３００−４００ヌクレオチドの長さをもつ、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片が適している。これらのプローブの配列は、配列番号５−８の配列に由来することも可能である。これらのプローブは、例えば、組織切片またはノーザンブロットのようなハイブリッド形成の目的のために、用いることが可能である。

あるいは、プライマー配列は、ＰＣＲ反応に用いることも可能な配列番号５−８をもつ配列に従って、決定可能である。これらプライマーは、本発明の核酸またはそのｃＤＮＡ断片を、増幅し、そして単離するのに用いることが可能である（実施例１、２、３、４）。プライマーの適当な長さとして、１０−１００ヌクレオチド、好ましくは１５−５０ヌクレオチド、特段に好ましくは２０−３０ヌクレオチドが好ましい。

本発明はさらに、ＡＣＴポリペプチドの機能、特に活性に影響を及ぼす少なくとも１つの薬理学的に活性な物質を同定するための、配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチドの、またはそれをコードしている核酸の、または配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチド、またはそれをコードしている核酸、または配列番号１から配列番号４のポリペプチドに対して向けられた抗体または抗体断片、を発現している細胞の、使用に関する。

好ましい態様では、ＡＣＴポリペプチドおよびそれらをコードしているｍＲＮＡｓの機能、特に活性に影響を及ぼす少なくとも１つの薬理学的に活性な物質を同定するために、配列番号１から配列番号４の少なくとも１つのＡＣＴポリペプチド、または当該ポリペプチドまたは当該ポリペプチドをコードしている核酸、または当該ポリペプチドに対して向けられた抗体またはその断片を発現している細胞が、固相に結合され、そして少なくとも１つの物質がその薬理学的活性について調べられる。
もう１つの好ましい態様では、ＡＣＴポリペプチドおよびそれらをコードしているｍＲＮＡｓの機能、特に活性に影響を及ぼす薬理学的に活性な物質を同定するために、少なくとも１つのＡＣＴポリペプチドが少なくとも１つの細胞により発現され、そして少なくとも１つの物質がその薬理学的活性について調べられる。

例えばこれは、皮膚の細胞、特に角化細胞、単核球、好中性顆粒球、繊維芽細胞、および内皮細胞中のＡＣＴの機能、特に活性への有望な薬理学的に活性な物質の影響をテストするための系により行うことが可能である。

好ましい態様では、本発明に従って使用可能な少なくとも１つのＡＣＴポリペプチドが少なくとも１つの細胞により発現され、そして少なくとも１つの物質が、その薬理学的活性について調べられる。このために、細胞培養は、例えば、調べられる予定の物質を含む液体と、接触させられてもよい。細胞外活性を測定するために、当該細胞は、例えば遠心分離により、上清から分離される。次いでその細胞上清を単離し、そしてそのＡＣＴ活性について調べることも可能である。細胞内ＡＣＴ活性を測定するためには、当該上清を除去し、そして当該細胞を溶解することが可能である。それから当該細胞溶解物を、そのＡＣＴ活性について調べることも可能である。シグナルペプチドをもつＡＣＴの場合、細胞内局在および細胞外局在の両方のＡＣＴポリペプチドを、その活性について試験することが可能である。シグナルペプチドをもたないＡＣＴポリペプチドの場合、細胞内ＡＣＴの活性を測定するのが適切である。周知のプロテアーゼインヒビター検定法が、ＡＣＴ活性の測定に適しており（ＣｈａｓｅおよびＳｈａｗ，１９６７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２９：５０８−５１４）、その場合、例えば、カテプシンＧに対して標準化することも可能である（実施例５、Ｈｅｉｄｔｍａｎｎら，１９９０，ＣｌｉｎＣｈｅｍ ３６：２０７７−２０８１，Ｋａｉｎｕｌａｉｎｅｎら，１９９８，２７３：１１５６３−１１５６９）。

本発明に従って使用可能なもう１つの適当なテストシステムは、２ハイブリッド系(two hybrid system)との相互作用を確認することに基づいている（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｒｎｇｌａｎｚ，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，２８６−２９２；ＣｏｌａｓおよびＢｒｅｎｔ，１９９８ ＴＩＢＴＥＣＨ，１６，３５５−３６３）。本テストシステムでは、本発明の少なくとも１つのポリペプチドおよびＧａｌ４またはＬｅｘＡのような転写因子のＤＮＡ結合ドメインから成る融合タンパク質を発現する発現ベクターで、細胞は形質転換される。当該形質転換細胞はまた、そのプロモーターが、相当するＤＮＡ結合ドメインに対する結合部位を含む、レポーター遺伝子も含む。既知または未知ポリペプチドおよび、例えばＧａｌ４または単純ヘルペスウイルスＶＰ１６からの活性化ドメインから成る、第２融合タンパク質を発現する、さらなる発現ベクターを形質転換することにより、もしその第２融合タンパク質が本発明に従って調べられているポリペプチドと相互作用するならば、当該レポーター遺伝子の発現は、大いに増加することもあり得る。発現のこの増加は、例えば、第２融合タンパク質を構築する目的のための再生組織からｃＤＮＡライブラリーを調製することによって、新しい相互作用パートナーを同定するために、使用することもできる。本テストシステムは、本発明のポリペプチドと当該相互作用パートナーとの間の相互作用を阻害する物質をスクリーニングするためにも使用可能である。そうした物質は、本発明のポリペプチドおよび当該相互作用パートナーの融合タンパク質を発現している細胞中の当該レポーター遺伝子の発現を、減少させる（ＶｉｄａｌおよびＥｎｄｏｈ，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：３７４−８１）。このようにして、糖尿病随伴性および／または動脈性難治性創傷の治療および／または予防のために採用することが可能な新しい活性化合物を、迅速に同定することができる。

もう１つの好ましい態様で、少なくとも１つのＡＣＴポリペプチド、または当該ポリペプチドをコードしている核酸、またはＡＣＴポリペプチドまたは本発明のポリペプチドをコードしている核酸または配列番号１から配列番号４のポリペプチドに対して向けられた抗体または抗体断片を発現している細胞が、固相に結合され、そして少なくとも１つの物質がその薬理学的活性について調べられる。固相への結合は、例えば、アレイの形で行うことも可能である。固相化学および感光性保護基を用いてその種のアレイを調製するための方法は、例えば、ＵＳ５７４４３０５に開示されている。固相へ結合されるＡＣＴタンパク質に対する試験物質の薬理学的作用を調べるための適当なテストシステムはよく知られており、そしてプロテアーゼインヒビター検定法を含み（ＣｈａｓｅおよびＳｈａｗ，１９６７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２９：５０８−５１４）、その場合、標準化を、例えば、カテプシンＧに対して行うことも可能である（実施例５、Ｈｅｉｄｔｍａｎｎら，１９９０，ＣｌｉｎＣｈｅｍ ３６：２０７７−２０８１，Ｋａｉｎｕｌａｉｎｅｎら，１９９８，２７３：１１５６３−１１５６９を参照）。ＡＣＴの活性を増加させ、そしてＧＡＰＤＨのような対照タンパク質の活性にできるだけ影響を及ぼさない物質を同定するのに適しているテストシステムが、特別に好ましい。さらに、固相へ結合される本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現する細胞に対する試験物質の薬理学的作用を調べるためのテストシステムは、よく知られている。例えば細胞内または細胞外ＡＣＴ活性は、上記のように測定が可能である（実施例５も参照）。

さらに、例えば、マウスで行われる創傷治癒検定において、創傷に対して、単独のまたはＡＣＴポリペプチドおよび／またはそれらをコードしている核酸と一緒の、物質の適用が当該創傷治癒を変えるかどうかを、調べることもできる。これは、例えば、上皮再形成の速度を測定することにより、決定が可能である。

本発明はさらに、ＡＣＴポリペプチドおよびそれらをコードしているｍＲＮＡｓの発現に影響を及ぼす薬理学的に活性な物質を同定するための、配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチドの、またはそれをコードしている核酸の、または配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチド、またはそれをコードしている核酸、または配列番号１から配列番号４のポリペプチドに対して向けられた抗体または抗体断片、を発現している細胞の、使用に関する。遺伝子の発現に影響を及ぼす薬理学的物質を同定するためのテストシステムは、当業者には周知である（例えば、Ｓｉｖａｒａｊａら，２００１，ＵＳ６１８３９５６を参照）。

もう１つの好ましい態様では、ＡＣＴポリペプチドおよびそれらをコードしているｍＲＮＡｓの発現に影響を及ぼす薬理学的に活性な物質を同定するために、本発明の少なくとも１つのＡＣＴポリペプチドが、少なくとも１つの細胞により発現され、そして少なくとも１つの物質がその薬理学的活性について調べられる。
それゆえ、本発明に従って使用可能なＡＣＴを発現する細胞、例えば好中球は、生体外で（ｉｎｖｉｔｒｏ）の遺伝子発現を分析するためのテストシステムとして培養可能で、その際、皮膚細胞、特に角化細胞、繊維芽細胞、または内皮細胞が優先される。この状況では、可能性があるテストシステムは、一般に入手可能なヒト角化細胞細胞系ＨａＣａＴである。

遺伝子発現は、例えば、ｍＲＮＡのまたはタンパク質のレベルで分析される。この状況では、当該細胞培養に１つまたは１つ以上の物質を添加した後、ＡＣＴｍＲＮＡまたはタンパク質の量が測定され、そして対照培養中の対応する量と比較される。これは、例えば、当該細胞の溶解液中に存在するＡＣＴｍＲＮＡを検出するために使用可能な、アンチセンスプローブのハイブリッド形成により、行われる。当該ハイブリッド形成は、例えば、ｍＲＮＡ−プローブ複合体に特異的抗体を結合させることにより、定量が可能である（ＳｔｕａｒｔおよびＦｒａｎｋ，１９９８，ＵＳ４７３２８４７を参照）。本状況では、例えば、高速処理法として当該分析を行い、そしてＡＣＴ発現のモジュレーターとしての使用のための適合性について非常に多数の物質を分析することができる（Ｓｉｖａｒａｊａら，２００１，ＵＳ６１８３９５６）。

分析予定の物質は、非常に不均質なことが多い数千の物質を含むことがある物質ライブラリー（例えば、ＤＥ１９８１６４１４およびＤＥ１９６１９３７３を参照）から取ることも可能である。あるいは、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡをまず細胞から単離し、そしてそれから、ＡＣＴｍＲＮＡの絶対量または相対割合を、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ（実施例１、２、４、ＥＰ０２００３６２；Ｗｉｔｔｗｅｒら，１９９７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１３０−８；Ｍｏｒｒｒｉｓｏｎら，１９９８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：９５４−６２を参照）により、またはＲＮＡ分解酵素保護検定法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク、第７章；ＥＰ００６３８７９を参照）により、測定可能である。もう１つの可能性は、本発明に従って使用可能なＡＣＴポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、細胞溶解液中のタンパク質の量を分析することである。この場合、定量は、例えば、よく知られているエライザまたはウェスタンブロットを用いて行うことも可能である。ＡＣＴの発現に対する当該物質の特異性を測定するために、ＡＣＴ発現に対する物質の影響を、他の遺伝子、例えばＧＡＰＤＨのような代謝遺伝子の発現への影響と比較することも可能である。これは、ＡＣＴの分析とは別の分析で、あるいは平行しての、いずれで行うことも可能である。ＡＣＴの発現を増加し、ＧＡＰＤＨのような１つまたは１つ以上の対照遺伝子の発現へできる限り影響を及ぼさない、物質を同定するために適当なテストシステムが、特に好ましい。
本発明のもう１つの態様は、当該スクリーニング法を用いて同定される、薬理学的に活性な物質に関する。

本発明はさらに、難治性糖尿病随伴性創傷または難治性動脈性創傷の治療のための薬理学的に活性な物質を含む製剤に関する。

好ましい態様では、本発明に従って使用可能な少なくとも１つのＡＣＴポリペプチドが固相に結合され、そして少なくとも１つの物質がその薬理学的活性について調べられる。
もう１つの好ましい態様では、本発明に従って使用可能な少なくとも１つのＡＣＴポリペプチドが少なくとも１つの細胞により発現され、そして少なくとも１つの物質がその薬理学的活性について調べられる。

本発明の特に好ましい態様では、少なくとも２つの物質が、薬理学的物質を同定することの目的のために、それらの薬理学的活性について調べられるが、その際、当該物質は少なくとも１つの、物質のライブラリーから選択される。
本発明はまた、第１工程で、薬理学的に活性な物質が、そうした物質を同定するための前記方法の１つを用いて同定され、そしてさらなる工程で、同定された薬理学的に活性な物質（類）が、適当な補助物質および／または添加物と接触または組合せられる、薬剤を製造するための方法に関する。

ここで本発明は、それらに限定されずに、次の図面および実施例の助けを借りて、さらに説明される。
表および配列
表１： 本発明に従って使用可能であるＡＣＴポリペプチドおよびそれらをコードしているｃＤＮＡ，およびまたＳｗｉｓｓＰｒｏｔ，Ｇｅｎｅｂａｎｋおよび示された特許明細書に見られるようなアクセス番号を、表にした要約。
表２： さまざまなマウス創傷治癒モデルにおけるｍＡＣＴの相対発現を表にした要約。実験は、若齢の、老齢の、難治性の、および正常治癒のＢａｌｂ／ｃマウスを用いて行った。糖尿病性および対応する対照動物で実施した実験は、それぞれＣ５７／Ｂ１／ＫｓおよびＣ５７／Ｂ１／Ｋｓ−ｄｂ／ｄｂ／Ｏｌａマウスで実施した。難治性創傷を発生させるために、Ｂａｌｂ／ｃ株のマウスを薬剤デキサメタゾン（ＤＥＸ）で処理した。
表３： 遺伝子治療によりｍＡＣＴで処理された正常および糖尿病ラットにおける創傷の引張り強さの変化を、対照ベクターで処理された創傷の引張り強さに比べた、平均値。Ｅ／Ｃ値は、ＡＣＴで処理されたラットで測定された絶対引張り強さ（Ｅ）および対照ベクターで処理されたラットで測定された絶対引張り強さ（Ｃ）の商である。
表４：ＡＣＴの欠損の状況下にある創傷治癒障害の例として、無傷の皮膚に比較して、創傷後の時間（時間（ｈ）および日（ｄ））との関係で、正常および糖尿病マウスの創傷治癒におけるＡＣＴ発現の、“Ｔａｑ−Ｍａｎ”分析により決定された示差的調節の速度論。
表５： ＡＣＴの欠損により起因する糖尿病患者において選択的に生じている創傷治癒障害についての例として“Ｔａｑ−Ｍａｎ”分析により測定されたヒト（正常創傷治癒および糖尿病性潰瘍）の２つの異なる創傷治癒状態におけるＡＣＴ発現の示差的発現に関する比較データ。“患者１−５のプール”は、無傷の皮膚または創傷後の示された時点のいずれかから採取された６名の健康人の生検からつくられた、それぞれＲＮＡプールまたはｃＤＮＡプールを表す。“患者６−８のプール”は、無傷の皮膚、糖尿病随伴性潰瘍の創傷縁または創傷基部のいずれかから採取された６名の糖尿病患者の生検からつくられた、それぞれＲＮＡまたはｃＤＮＡプールを表す。
表６： 糖尿病随伴性難治性創傷に選択的に生じている低下活性の例としての、正常に治癒している創傷および示されたような異なる難治性創傷に由来するヒト創傷浸出液内の活性ＡＣＴタンパク質相対量の比較。
配列番号１から配列番号４は、本発明に従って使用が可能であるポリペプチドの配列を示す。
配列番号５から配列番号８は、本発明に従って使用が可能である核酸の配列を示す。
配列番号９から配列番号１８は、実施例のために使われたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
実施例
実施例１： 正常に治癒している、よく治癒している、および異なる病因背景をもつ３つの異なるタイプの難治性の、創傷におけるマウスＡＣＴ発現のＴａｑＭａｎ分析
ＴａｑＭａｎ分析を使って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給されたＧｅｎｅＡｍｐ５７００中で、マウスＡＣＴ（ｍＡＣＴ）ｃＤＮＡｓの発現の強さを測定したが、その際、まずさまざまなマウス創傷治癒モデルで測定し、それによって創傷治癒の過程の病因背景をＡＣＴ発現に関連づけることが可能になった。このために、正常に治癒している１日目の創傷および無傷の皮膚を、等張塩類溶液で処理された１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスから、鋏で切ることにより採取した。特に良好な創傷治癒を示したマウスからの組織を採取するために、4週齢の若いＢＡＬＢ／ｃマウスから得た無処理１日目創傷および無傷皮膚を使用した。グルココルチコイドデキサメタゾンで処理した動物（ＤＥＸ動物）、老齢動物、および糖尿病動物を創傷難治癒の動物モデルとして使用した（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，１９９８，Ａｒｃｈ．Ｄｅｍ．Ｒｅｓ．，２９０：Ｓ１−Ｓ１１）。ＤＥＸ動物を得るために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、創傷形成前に、デキサメタゾン（体重１ｋｇ当り等張塩類溶液中０．５ｍｇのデキサメタゾンを１日２回５日間、腹腔内注射）で処理した。上記のように、等張塩類溶液で処理されたマウスからの無傷の皮膚を、対照として使用した。老齢マウスからの組織は無処理１日目の創傷から、無傷皮膚試料は１２月齢ＢＡＬＢ／ｃマウスから、分離した。創傷組織および無傷皮膚は糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウスから無処理１日目の創傷を分離することにより、および無傷皮膚は１０週齢Ｃ５７Ｂ１／ｋｓ−ｄｂ／ｄｂ／Ｏｌａマウス）から鋏で切ることにより、採取した。Ｃ５７Ｂ１／Ｋｓ野生型マウスを対照動物として用いた。無傷皮膚および無処理１日目創傷は、同様に後者動物から採取した。

ＲＮＡは、１／１００容量の２−メルカプトエタノールを分注器を用いて加えたＲＮＡｃｌｅａｎ緩衝液（ＡＧＳ，ハイデルベルク）中で、前記生検をホモジナイズすることにより単離した。それから当該ＲＮＡは、１−ブロモ−３−クロロプロパンの存在下で水飽和酸性フェノールで２回それをフェノール処理することにより、抽出した。次に、イソプロパノール沈澱およびエタノール沈澱を行い、そしてそのＲＮＡを７５％エタノールで洗浄した。その後で、当該ＲＮＡをＤＮアーゼＩで消化した。このために、２０μｇのＲＮＡ（ＤＥＰＣ処理水で５０μｌに定容）を、５．７μｌの転写緩衝液（Ｒｏｃｈｅ），１μｌのＲＮアーゼ インヒビター（Ｒｏｃｈｅ；４０Ｕ／μｌ）および１μｌのＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ；１０Ｕ／μｌ）とともに、３７℃で２０分間インキュベートした。それから、さらに１μｌのＤＮアーゼＩを加え、そしてその混合液を３７℃でさらに２０分間インキュベートした。当該ＲＮＡは、次いでフェノール処理し、エタノールで沈澱し、そして洗浄した。上記の全工程は、これらの溶液／液体が反応性アミノ基を全く含まないかぎりは、ＤＥＰＣ（ジエチルピロ炭酸）処理溶液および／または液体を用いて行った。次いで、ｃＤＮＡを抽出されたＲＮＡから調製した。これは、１ｘ ＴａｑＭａｎ ＲＴ緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ），５．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）存在下、いずれの場合も５００μＭのｄＮＴＰｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ），２．５μＭのランダムヘキサマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ），１．２５ＵのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ／μｌ（５０Ｕ／μｌ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ），０．４ＵのＲＮアーゼ インヒビター／μｌ（２０Ｕ／μｌ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ），２０μｌのＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）およびＤＥＰＣ処理水（１００μｌに定容するため）で行った。当該ＲＮＡを添加後、そして十分な混合後、当該溶液を２ ｘ ０．２ｍｌチューブにアリコートし（いずれの場合も５０μｌ）、そして逆転写を温度サイクラー中で行った（２５℃で１０分間；４８℃で３０分間および９５℃で５分間）。当該ｃＤＮＡは続いて，ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて定量ＰＣＲにより定量したが、その際、（いずれの場合も、ｍＡＣＴプライマー（ｍＡＣＴプライマー３：５’ＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＡ ３’（配列番号１３）；ｍＡＣＴプライマー４：５’ＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧ ３’（配列番号１４））；およびＧＡＰＤＨプライマー（ＧＡＰＤＨプライマー１：５’ＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＴＣ Ａ ３’（配列番号１１）；ＧＡＤＰＨプライマー２：５’ＧＡＣＡＴＡＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＴ ３’（配列番号１２））でｍＡＣＴ ｃＤＮＡを３回定量した。５７μｌの総容量で、各トリプレットに対する原液は、３７．５μｌの２ ｘ ＳＹＢＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ，０．７５μｌのＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ（１Ｕ／μｌ）および１８．７５μｌのＤＥＰＣ処理水を含んでいた。３回の定量には、各１．５μｌのフォワードおよびバックワードプライマーを、５７μｌの原液に、予め最適化した濃度比で添加した。いずれの場合も、６０μｌの原液／プライマー混合液を、１５μｌのｃＤＮＡ溶液（２ｎｇ／μｌ）と混合し、そしてその全体を３本の反応チューブにアリコートした。これと並行して、ＧＡＰＤＨを定量するためのプライマーを含む原液を標準液として調製し、さらに１５μｌの同じｃＤＮＡ溶液と混合し、そして３本の反応チューブにアリコートした。さらに、各種ｃＤＮＡ溶液を、ＧＡＰＤＨＰＣＲについての標準曲線を測定するための希釈系列（４ｎｇ／μｌ；２ｎｇ／μｌ；１ｎｇ／μｌ；０．５ｎｇ／μｌおよび０．２５ｎｇ／μｌ）として、調製した。いずれの場合も、１５μｌのこれらのｃＤＮＡ溶液を、ＧＡＰＤＨを測定するための６０μｌの原液／プライマー混合液と混合し、そして３本の反応チューブにアリコートした。標準曲線を同様にｍＡＣＴＰＣＲのために構築した；ＧＡＰＤＨ標準曲線に使用したのと同じ希釈をこのために使用した。ｃＤＮＡのないＰＣＲ混合液を対照として供した。１５μｌのＤＥＰＣ水をいずれの場合も、ｍＡＣＴ用およびＧＡＰＤＨ用の６０μｌの原液／プライマー混合液に添加し、そして混合後、これらの溶液はいずれの場合も、３本の反応チューブにアリコートした。当該混合液はＧｅｎｅＡｍｐ５７００中で増幅した（５０℃で２分間；９５℃で１０分間、次いで９６℃で１５秒間および６０℃で２分間を３サイクル；その後で、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を３７サイクル）。評価は、ＧＡＰＤＨ標準に比べたｍＡＣＴの相対存在量を定量することにより、行った。このために、標準曲線を、まず最初に、前記希釈系列のＣ_T値を、ＰＣＲ混合液中のｃＤＮＡ量の値（転写されたＲＮＡのｎｇで）の対数に対してプロットすることにより、決定し、そしてその直線の勾配を測定した。すると、ＰＣＲの効率（Ｅ）は次のように与えられる：Ｅ＝１０^-1/S−１。ＧＡＰＤＨに比べたｍＡＣＴ ｃＤＮＡ（Ｙ）の相対存在量（Ｘ）は、すると：Ｘ＝（１＋Ｅ_GAPDH）^C _T ^(GAPDH)／（１＋Ｅ_Y）^C _T ^(Y)となる。続いて、それぞれの対照動物としての１０週齢ＢＡＬＢ／ｃ動物の無傷皮膚およびＣ５７Ｂ１／Ｋｓ動物の無傷皮膚からのｃＤＮＡの量を、１に等しいとセットすることにより、数値を標準化した。

異なる創傷治癒モデルにおける発現の相対変化は、表２にまとめてある。無傷皮膚のものと比較して、５から１３倍量へｍＡＣＴ発現の顕著な増加が、創傷が正常に治癒した、およびよく治癒した動物モデルの場合、および乱れた創傷治癒についての、すなわち老齢動物およびグルココルチコイドで処理された動物における、２種の動物モデルの場合の両方で、１日目創傷に観察された。意外なことに、糖尿病動物の創傷では有意な区別を示す調節は全く観察されなかった。このことは、乱れた創傷治癒が、ｍＡＣＴの発現減少に起因し、そして糖尿病随伴性創傷に特異的であることを、示している。本実験の結果はさらに、治癒い難い糖尿病随伴性および／または動脈性創傷の特に治療および／または予防に、ｍＡＣＴが意外にも特に有効であることを、示している。加えて、当該実験は、ＡＣＴポリヌクレオチド類が、治癒が難しい糖尿病随伴性および／または動脈性創傷の診断に使用が可能なことを、示している。

実施例２： “Ｔａｑ−Ｍａｎ”分析により測定された健康および糖尿病マウスにおける創傷治癒中のＡＣＴの発現の速度論
創傷の満足すべき閉鎖は、全治癒過程の間の当該創傷の部位におけるタンパク質分解および抗タンパク質分解活性の微妙に調整された平衡に決定的に依存するので、創傷治癒過程の際のＡＣＴ発現の速度論を、健康および糖尿病動物で比較した。この目的のために、無傷皮膚の創傷のパンチ生検を、正常治癒対照マウス（Ｃ５７Ｂ１／６）および糖尿病マウス（Ｃ５７Ｂ１／Ｋｓ−ｄｂ／ｄｂ／Ｏｌａ）から、さまざまな時点で（創傷形成後、１時間、７時間、１５時間、２４時間、３日、５日、７日、１４日）採取した。実施例１に記載のように、当該生検をホモジナイズし、そしてＲＮＡを単離した。続いて、ＤＮアーゼ消化およびｃＤＮＡへの逆転写を行った。創傷治癒関連ｃＤＮＡｓの定量も、実施例１に記載のように行った。マウスＡＣＴの特異的増幅のために、配列番号１３（５’ＴＣＣＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＡ ３’）および配列番号１４（５’ＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧ ３’）のプライマーを、ＡＣＴ（配列番号５）の配列に基づいて選択した。ＧＡＰＤＨを基準遺伝子として本実験では使用した。それゆえ、配列番号１１（５’ＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡ ３’）および配列番号１２（５’ＧＡＣＡＴＡＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＴ ３’）のプライマーを、ＧＡＰＤＨ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ：Ｍ１７８５１）の配列に基づきＰＣＲ増幅のために採用した。各反応における定量のために、１０ｎｇの逆転写総ＲＮＡから得たｃＤＮＡを、２５μｌの全容量中で増幅した。ＰＣＲは、製造元の説明書（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ａｎｄＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，１９９８）に従って、行った。Ｃ_T値を分析し、そしてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡと比較したＡＣＴ ｍＲＮＡの頻度を、これらの値に基づいて計算した（実施例１を参照）。実験の結果は表４に表されており、そして観察の全間隔の間中、ＡＣＴは、無傷の皮膚に比較して糖尿病動物で強く減少した仕方で発現された。正常に治癒している創傷で観察された発現速度論との比較は、創傷生成後の最初の３日以内に、プロテアーゼインヒビターＡＣＴの強く増加した発現と、それゆえに対応するプロテアーゼの減少した活性とが、正常な創傷治癒過程に不可欠らしいことを、明らかにしている。。これは、健康マウスにおける創傷治癒の際のＡＣＴの極度に強く増加した発現から明らかであり、それは糖尿病動物の場合、５．１の倍率で減少している。

これらのデータは、その示差発現が、創傷治癒の長い時間間隔にわたる創傷治癒過程の正常な経過には必須であることを、証明している。この観察はまた、治療のための適当な時点を確定するための重要な基準を表しており、それは最も好ましくは創傷生成後の初日を含むはずである。さらに、正常な創傷治癒を示すマウスと遅滞した創傷治癒を示す糖尿病マウスとにおけるＡＣＴ発現のレベルの比較は、ＡＣＴの発現減少が、創傷治癒の重度の障害をもたらすことを、明白に示している。
実施例３：生体内に（ｉｎ ｖｉｖｏ）マウスＡＣＴ相同体を投与することによる糖尿病ラットの創傷治癒の改善
ここでの目的は、ラット創傷におけるｍＡＣＴの量の増加が、実際に、糖尿病動物において改善された創傷治癒をもたらすかどうかを、調べることであった。このために、糖尿病性雄ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットに、配列番号１のマウスＡＣＴ遺伝子を投与した後で、創傷治癒を調べた。創傷治癒を定量化するために、当該創傷の引張り強さを調べたが、この場合、より高い引張り強さは創傷治癒の改善を反映した。
当該糖尿病性ラット動物モデルは、治癒が難しい糖尿病随伴性創傷を調べるための確立されたモデル系である（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２９０：Ｓ１−Ｓ１１）。糖尿病は微小血管障害を伴うので、本動物モデルも、創傷治癒における動脈的に決められた障害を調べるに適している。

ベクターｐＭＨ（Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）に基づいて調製された適当な発現ベクターｐＭＨｉｎｔは、まず第一に、ＣＭＶプロモーターとマルチプルクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）との間のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位へラットインスリン遺伝子のイントロンＩＩを挿入することにより、構築した。次にｍＡＣＴｃＤＮＡを、当該マルチプルクローニングサイトを用いてｐＭＨｉｎｔ中へクローン化した。このために、配列番号4のｍＡＣＴ ｃＤＮＡのコード領域を、ＰＣＲ（ｍＡＣＴプライマー１：５’ＧＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＧ３’（配列番号９）およびｍＡＣＴプライマー２：５’ＧＡＡＴＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧ ＣＴＡＴＣ３’（配列番号１０））により増幅し、次いでＫｐｎＩおよびＰｍｌＩで切断し、そしてＫｐｎＩおよびＰｍｌＩで切断された発現ベクターｐＭＨｉｎｔへ結合し、それによって発現プラスミドｐＭＨｉｎｔＡＣＴを生じさせた。ルシフェラーゼ遺伝子（ｐＭＨＩｎｔＬｕｃ）を含むｐＭＨｉｎｔを対照ベクターとして使用した。

糖尿病を誘導するために、２５０−３００ｇの体重をもつ4匹のラットに、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）（５０ｍｇ／ｋｇ体重）の新たに調製した水溶液を腹腔注射した。当該動物の血糖を誘導後７−９日にチェックしたところ、２００ｍｇ／ｄＬ以上の血糖レベルがあり、糖尿病状態を確認した。

4匹の糖尿病ラットおよび4匹の非糖尿病対照動物を、続いて、２％Ｏ₂（２ ｌ／分）および１．２５％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎ）から成る混合物で麻酔した。背中を脱毛し、そしてその後の創傷形成のために各動物の背中に４部位をマークした。いずれの場合も、金粒子（ＢｉｏＲａｄ）上に固定化された０．５μｇのプラスミドＤＮＡを、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子銃（ＢｉｏＲａｄ）を用いて５００ｐｓｉで各部位中に発射したが、その際いずれの場合も、２部位がＡＣＴ発現ベクターｐＭＨＩｎｔＡＣＴで爆撃され、および２部位が対照ベクターｐＭＨＩｎｔＬｕｃで爆撃され、そしてその際いずれの場合も、ｐＭＨＩｎｔＬｕｃによる１爆撃は前部に行われ、そして１爆撃は後部に行われた。次に、長さ１ｃｍの切開創傷を当該爆撃部位を通してつくり、そして当該創傷を創傷クリップで閉鎖した。１０日後に創傷生検を採取し、また当該創傷の引張り強さを、製造元の説明書に従ってＩｎｓｔｒｏｎ張力計を用いて測定し、そして当該創傷の断面積に対して標準化した。続いて、商（Ｅ／Ｃ値）を、ｐＭＨＩｎｔＡＣＴで爆撃された創傷の引張り強さの絶対値および対照ベクターｐＭＨＩｎｔＬｕｃで爆撃された同じ動物の創傷の引張り強さの絶対値から、計算した。Ｅ／Ｃ値の平均値を決定し、そしてそれによって、ｍＡＣＴに依存する引張り強さの変化を明らかにした。それらの平均値は表２に示す。
ｐＭＨＩｎｔＡＣＴで治療された創傷の引張り強さは糖尿病動物だけでは明白に増加するが、一方このプラスミドの投与は対照動物では何ら有意な作用を及ぼさないことが、判明した。このことは、難治性糖尿病随伴性および／または動脈性難治性創傷におけるＡＣＴの発現の調節低下が、ＡＣＴの投与により特異的に補われることが可能で、そして創傷治癒の著しい改善をもたらすことを、強調している。一方、本治療は、ｍＡＣＴを投与することにより創傷治癒に何ら有意な改善を達成できなかった、対照動物における創傷治癒を改善するには適当ではなかった。

実施例４： 健康被験者の無傷皮膚および創傷のヒト生検ならびに糖尿病性潰瘍の生検中のＡＣＴｍＲＮＡの示差発現
動物実験のデータがどの程度ヒトに転嫁できるかを調べることが、本実験の目的であった。この目的のために、ヒトＡＣＴの発現を、さまざまな創傷治癒障害で分析した：皮膚試料は、６名の患者から４ｍｍおよび６ｍｍパンチにより、正常無傷皮膚から、創傷形成後１時間目の創傷から、１日目創傷から、ならびに５日目および１５日目創傷から採取し、そして各ポイント時点での生検はプールした。さらに、パンチ生検を、糖尿病性潰瘍の６名の患者から、無傷皮膚からならびに創傷基部および創傷縁から、同時に採取し、続いて各群の当該生検（無傷皮膚、創傷基部、創傷縁）をプールした。実施例１に記載のように、ＲＮＡを全生検から単離し、ＤＮアーゼ−Ｉで消化した。次いでｃＤＮＡを、抽出されたＲＮＡを用いて合成した（実施例１）。このようにして得たｃＤＮＡを、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｍｅｒ）を用いる定量ＰＣＲにより３つの異なる反応で定量した（実施例１を参照）。この目的のために、配列番号１５（５’ＡＧＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＴＴＣ３’）および配列番号１６（５’ＧＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡ３’）のプライマーを、ヒトＡＣＴをコードする配列番号７に基づいて選択した。基準としてＧＡＰＤＨの代わりに、シクロフィリンＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＸＭ０３９５２６）を採用し、それは、配列番号１７（５’ＧＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＧ３’）および配列番号１８（５’ＧＧＡＴＡＣＴＧＣＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧ３’）のプライマーを用いて増幅した。分析は、シクロフィリンＡ基準に比較したＡＣＴの相対存在量を測定することにより行った。それゆえ、実施例１に示すように、最初に、前記希釈系列のＣ_T値を、ＰＣＲ反応のｃＤＮＡ量の値（転写されたＲＮＡのｎｇでの）の対数に対してプロットすることにより、そしてその直線の勾配を測定することにより、標準曲線を決定した。すると、ＰＣＲの効率（Ｅ）は次のように与えられる：Ｅ＝１０^-1/S−１。シクロフィリンとの関係で分析されたＡＣＴ ｃＤＮＡ分子種（Ｙ）の相対存在量（Ｘ）は、すると：Ｘ＝（１＋Ｅ_cyclophilin）^C _T ^{(cyclophilin)}／（１＋Ｅ_Y）^C _T ^(Y)となる。続いて、健康被験者の無傷皮膚からのｃＤＮＡの量を１に等しいとセットすることにより、数値を標準化した。さまざまな創傷治癒状態におけるＡＣＴ発現の相対的変化を表５に表した。その結果、分析した健康被験者の全創傷治癒状態で、無傷皮膚に比べて、前記動物実験と同様な３ないし７倍のＡＣＴ発現の増加が観察された。それに対して、糖尿病性難治性潰瘍に罹っている患者では、創傷治癒の際の正常値に相当する創傷縁でのＡＣＴの量の増加はなかった。これらの患者では、創傷辺縁でのＡＣＴの量は１．９の倍率だけ増加したが、一方、創傷基部ではＡＣＴの発現は本質的に全く存在しなかった。したがって、プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター平衡は、プロテアーゼに向って、それゆえ創傷治癒の悪化へシフトしている。

本実験は、創傷治癒過程の際にＡＣＴの示差的発現が、ヒトでの創傷治癒の正常な過程でも不可欠なことを、証明している。さらに本実験は、動物実験の結果がヒトへ転嫁可能なことを、明白に示している：ヒトでも、本発明のＡＣＴの発現のレベルの調節低下が、当該患者の病因背景に依存している。それゆえ、糖尿病患者における創傷難治は、本疾患で、特に当該創傷の慢性領域で特異的に生じるＡＣＴの存在量の減少に起因する。
実施例５：正常治癒創傷、難治性静脈性潰瘍、および糖尿病患者の創傷のヒト創傷浸出液中のＡＣＴ活性の定量
本実験は、難治性糖尿病性創傷ではＡＣＴポリペプチドが不活性であることを、ＡＣＴについての活性検定により示すことを、目的とした。この目的のために、ＡＣＴポリペプチドの活性を、異なる難治性創傷をもつ患者からの創傷浸出液中に測定し、そして手術後の急性正常治癒創傷から由来する創傷浸出液中に見られる活性に比較した。

ＡＣＴポリペプチドの活性の測定は、Ｈｅｉｄｔｍａｎｎら，１９９０，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：２０７７−２０８１の活性検定法により実施した。本検定法の原理は、カテプシンＧでの９６ウエル・マイクロタイタープレートのコーティングを含む。カテプシンＧは、創傷浸出液からの活性ＡＣＴ分子に結合できる。活性ＡＣＴポリペプチドをカテプシンＧと複合体形成させた後、ＡＣＴポリペプチドを、ＡＣＴポリペプチドに対する一次ウサギ抗ヒト抗体により検出し、続いて、アルカリホスファターゼに結合した二次ヤギ抗ウサギ抗体により検出する。結合された活性ＡＣＴポリペプチドの量は、次いで、アルカリホスファターゼに対する色素産生物質の適用により、Ｖｅｒｓａｍａｘプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）中で吸光度４９０ｎｍの増加をモニターすることにより、検出する。

本実験を開始するために、静脈性潰瘍に罹っている１名の患者からの創傷浸出液および２名の糖尿病患者の創傷からの創傷浸出液を、難治性創傷の例として、それぞれ２４時間および４８時間の間、採集した。対照として、１名の急性正常治癒患者からの創傷浸出液も、それぞれ２４時間および４８時間採集した。それらの創傷は典型的には、乳房縮小を目的とする手術の過程で生ずる。難治性創傷からの創傷浸出液は、真空療法により採集した：真空抽出器を、創傷上に圧力を均等に分布させるスポンジとともに、相当する創傷に適用した。吸引された液汁はビンにより採集した。一方、急性手術対照創傷後の創傷に由来する創傷浸出液は、当該創傷の皮下組織内に設置され、そして感染を阻止するために手術後創傷に通常適用される排液システム（Ｒｅｄｏｎの吸引排液法）により採集した。続いて、採集された創傷浸出液は、混入している細胞を除去するため、ＨｅｒａｅｕｓＭｕｌｔｉｆｕｇｅ ３ Ｓ−Ｒ中で１０分間、４℃、１５００ｒｐｍで１０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブ中で遠心分離した。精製を完全にするため、当該上清につき１００００ｒｐｍ，４℃で１５分間、遠心分離を一回繰返した。異なる患者からの精製した創傷浸出液は、次いで、活性検定を実施するため、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１：５０００、１：１００００、および１：２００００に希釈した。そこでは、９６ウエル・マイクロタイタープレートを、２００μｌのウシ血清アルブミン溶液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ₃，ｐＨ９．６中１０ｇ／ｌ ＢＳＡ）でまずコートし、プレートシーラー（Ｑｉａｇｅｎ）でカバーし、そして３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＢＳＡ溶液を吸引し、そしてマイクロタイタープレートを２５０μｌのＰＢＳで２分間4回洗浄した。次いで、当該洗浄溶液を、原液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．５および０．５Ｍ ＮａＣｌ中３．３ｇ／ｌカテプシンＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））の１０００倍希釈により調製した１００μｌの結合（カップリング）溶液と交換した。再びインキュベーション時間は３７℃で３０分間であり、そしてウエルは２５０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２分間、4回洗浄した。カテプシンＧのカップリングを全体的に制御するため、１００μｌのカテプシンＧ基質溶液（０．１Ｍ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォネート緩衝液，ｐＨ７．５，１ＭＮａＣｌ，１２％ ＤＭＳＯ中 ２００μｇ／ｌ サクシニル−アラニル−アラニル−プロプリル−バリル−ｐ−ニトロアニリド）を、当該マイクロタイタープレートに加えた。３７℃で１００分間のインキュベーション時間後、４１４ｎｍでの吸光度の増加をＶｅｒｓａｍｅｘプレートリーダーで測定した。３０分間のインキュベーション時間後の当該マイクロタイタープレートに結合したカテプシンＧの定量値を制御するため、カップリング溶液中のカテプシンＧの活性をマイクロタイタープレート中でのインキュベーションの有無で比較した。そこで、１００μｌの基質溶液（ＤＭＳＯ中 ５ｇ／ｌサクシニル−アラニル−アラニル−プロプリル−バリル−ｐ−ニトロアニリド）を、前記マイクロタイタープレートに接触させる前および後に９００μｌのカップリング溶液に添加した。吸光度の増加を、２５℃で１分間、４１４ｎｍで両溶液について測定した。結果は当該検定法の直線性の範囲内にあった。

カテプシンＧ結合前・マイクロタイタープレートを、急性正常治癒創傷からの創傷浸出液、静脈性潰瘍からの創傷浸出液、２名の糖尿病患者の創傷からの創傷浸出液、の１００μｌの希釈液と、および対照として何らの創傷浸出液を添加せずに、インキュベートした。全患者からの試料および全濃度は、２つずつマイクロタイタープレートに適用した。インキュベーション時間は再び３０分間であり、シールされたマイクロタイタープレートを用いて３７℃で行い、続いてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎによる洗浄を繰返した。前記インキュベーション時間後、マイクロタイタープレートを１００μｌのウサギ抗ヒトＡＣＴ抗体（Ｄａｋｏ；ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ，２．５％ドライミルク中１：１０００）と３７℃で３０分間インキュベートし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで4回洗浄した。前記一次抗体のインキュベーションに続いてアルカリホスファターゼに結合させた１００μｌの二次ヤギ抗ウサギ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ，２．５％ドライミルク中１：５０００）と３７℃で３０分間インキュベートし、続いて上記のように洗浄操作を行った。当該抗体の負の対照として、創傷浸出液のみ、一次抗体のみ、二次抗体のみ、創傷浸出液と一次抗体のみ、創傷浸出液と二次抗体のみ、またはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎのみ、のいずれかをそれぞれ含む、マイクロタイタープレート上のウエルを調製した。アルカリホスファターゼは、１００μｌ／ウエルのＯＰＤ（Ｄａｋｏ；４２０μｌ／ｌ ３０％Ｈ₂Ｏ₂を含む６．６ｍｇ／ｌ）と室温でのインキュベーションにより検出した。当該反応は、ウエル当り１００μｌの０．５Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を添加することにより停止させ、そして上記のＥＬＳＩＡリーダーにより４９０ｎｍで吸光度を測定した。並行して、検量系列を、商業的に入手可能なＡＣＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；２０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．４および１５０ｍＭ ＮａＣｌ中１ｍｇ／ｍｌ）を段階的に希釈することにより決定した。標準曲線は、４９０ｎｍで測定された吸光度に対して、当該希釈系列（１：５０００、１：８０００、１：１００００、１：１２０００、１；２００００、１：３００００、１：４００００、１：５００００、１：８００００、１：１０００００、および１：１２００００）をプロットすることにより決定した。引続き、異なる創傷浸出液中の活性ＡＣＴポリペプチドの量を、前記標準曲線により測定した。数値は次いで、急性正常治癒創傷から２４時間の間に採集された創傷浸出液中に測定された活性ＡＣＴポリペプチドの量の平均値を１に等しいと設定することにより、標準化した。異なる患者からの異なる採集時間後の創傷浸出液中に測定された活性ＡＣＴポリペプチドの平均値の相対的変化を、表６に示す。

それらの結果は、急性正常治癒創傷に比べて、糖尿病患者の難治性創傷では活性ＡＣＴポリペプチドの量が３．３および２．３倍減少していることを、明らに示す。さらにそれらの結果は、難治性静脈性潰瘍の創傷浸出液中の活性ＡＣＴの量が急性正常治癒創傷の増加範囲内にあるので、活性ＡＣＴの減少が難治性糖尿病随伴性創傷に本質的に選択的であることを、証明している。それゆえ、他のアンチセリンプロテアーゼ類の中で、そしてアンチプロテアーゼシールド説の内での、ＡＣＴのその例外的位置が本実験により明らかに確立されたが、それは、糖尿病随伴性創傷内のＡＣＴの不足がこの特定タイプの難治性創傷の難治の理由であるのに対して、例えば静脈性潰瘍のような他の難治性創傷の難治には別の要因が関与しているからである。意外なことに、これらの実験は、ＡＣＴが糖尿病随伴性および／または動脈性難治性創傷の予防および／または治療に非常に有効であるという結果を、明白に証明している。ＡＣＴの作用は、これらの創傷治癒障害に特異的であって、そして他の創傷治癒障害の治療には本質的に適していないが、それは、後者の疾患ではＡＣＴ発現および機能、特に活性の調節低下がないからである（実施例１、２、４、５）。

予防および／または治療のためには、ＡＣＴの量および／または活性を、当該創傷の領域で増加させなければならない。好んで治療される適応症は、糖尿病性潰瘍および動脈性潰瘍、特に糖尿病性潰瘍である。ＡＣＴを含む薬剤の投与は、好ましくは局所的に、好ましくは遺伝子治療により行われる。当該投与は、さらに一層好ましくは本発明により組換えＡＣＴポリペプチドの局所適用により行われるが、それは、ＡＣＴポリペプチドの作用の部位が細胞外であり、そしてそれゆえ、当該タンパク質が細胞中へ浸透する必要がないからである。薬剤のさらに好ましい態様は、ＡＣＴポリペプチドの機能、特に活性を増加させる物質、例えばＡＣＴポリペプチドに対して向けられ、そして当該ポリペプチドを活性化する触媒抗体またはその断片を含む。
特に、配列番号１、２、３または４に示した配列変異型および／またはそれらの成熟変異型で、部分シグナルペプチド成分（ｍｏｉｅｔｙ）をもつ、またはもたないものを、予防および／または治療に使用が可能である。
本発明の組成物および方法にさまざまな修飾ができることは、当業者には明らかであろう。それゆえ本発明は、特許請求の範囲およびそれらの均等の範囲内にあれば、そうした修飾および変化を網羅することが、意図される。
優先権の基礎出願ＤＥ１０１２１２５５．０は２００１年4月３０日に出願され、そして米国仮出願ＵＳ ６０／３２３３４８は２００１年９月１８日に出願された。本明細書に引用されたすべての刊行物は、参照により全ての内容が援用される。

Claims (16)

1. 難治性糖尿病随伴性創傷および／または難治性動脈性創傷から選択された疾患の診断、治療および／または予防のために使用される、配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチドの機能性変異体または当該ポリペプチドをコードしている核酸、または当該ポリペプチドに対して向けられた抗体またはその断片、または当該ポリペプチドまたは当該ポリペプチドをコードしている核酸を発現している細胞。
2. 創傷が糖尿病性潰瘍または動脈性潰瘍である、請求項１記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
3. ポリペプチドが融合タンパク質の形で使われる、請求項１または２記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
4. 核酸が発現ベクターの形で使われる、請求項１から３の何れか１項記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
5. 発現ベクターが遺伝子治療に適用可能なベクターである、請求項４記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
6. 細胞が自己のまたは同種の細胞である、請求項１から５の何れか１項記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
7. 細胞が角化細胞、繊維芽細胞、または内皮細胞のような皮膚細胞である、請求項６記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
8. 抗体またはその断片が当該ポリペプチドの活性を増加させる触媒抗体である、請求項１または２記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
9. ＡＣＴの機能、特に活性に影響を及ぼす少なくとも１つの薬理学的に活性な物質の同定のために使用される、配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチド、またはその機能性変異体、または当該ポリペプチドをコードしている核酸、または当該ポリペプチドまたは当該ポリペプチドをコードしている核酸を発現している細胞、または当該ポリペプチドに対して向けられた抗体またはその断片。
10. ＡＣＴの発現に影響を及ぼす少なくとも１つの薬理学的に活性な物質の同定のための、配列番号１から配列番号４のＡＣＴポリペプチド、またはその機能性変異体、または当該ポリペプチドをコードしている核酸、または当該ポリペプチドまたは当該ポリペプチドをコードしている核酸を発現している細胞、または当該ポリペプチドに対して向けられた抗体またはその断片。
11. 配列番号１から配列番号４の少なくとも１つのＡＣＴポリペプチド、またはその機能性変異体が固相に結合されており、そして少なくとも１つの物質がその薬理学的活性について調べられる、請求項９記載のＡＣＴポリペプチド、またはその機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片。
12. 少なくとも１つのＡＣＴポリペプチドまたはその機能性変異体が少なくとも１つの細胞により発現され、そして少なくとも１つの物質がその薬理学的活性について調べられる、請求項９または１０記載のＡＣＴポリペプチド、またはその機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片。
13. 診断のための核酸がプローブまたはプライマーの形で使われる、請求項１または２記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
14. プローブがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１３記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
15. プライマーがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１３記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。
16. ポリペプチドの機能性変異体が配列番号１から配列番号４の何れか１つに対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する、請求項１乃至１５の何れか１項記載の機能性変異体、または核酸、または抗体またはその断片、または細胞。