JP2008206427A

JP2008206427A - 免疫に対する機能性を高めた納豆及び抗アレルギー用組成物

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Publication number: JP2008206427A
Application number: JP2007044717A
Authority: JP
Inventors: Keiji Akata; 圭司赤田; Shigetaka Kuwasawa; 重隆桑沢; Masaaki Kawane; 政昭川根; Noriyuki Ukai; 紀幸鵜飼
Original assignee: Takano Foods Co Ltd
Current assignee: Takano Foods Co Ltd
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2007-02-23
Publication date: 2008-09-11
Anticipated expiration: 2027-02-23
Also published as: JP5090754B2

Abstract

【課題】免疫に対する機能性を高めた納豆及び抗アレルギー用組成物を提供する。
【解決手段】納豆菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す機能性食品、納豆菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す抗アレルギー用組成物、上記免疫に対する機能性として、花粉症、通年性アレルギー性鼻炎等に対するアレルギー症状改善作用を有する機能性食品、及び免疫に対する機能性が高い納豆菌株。
【選択図】図１

Description

本発明は、免疫に対する機能性を高めた納豆及び抗アレルギー用組成物に関するものであり、更に詳しくは、免疫機能調節を可能とした納豆菌利用技術、特に、花粉症や通年性アレルギー性鼻炎などのアレルギー症状改善に関する作用を示す機能性食品、抗アレルギー用組成物及び免疫に対する高い機能性と高い品質の納豆の製品化を可能とする性質を合せ持つ納豆菌株に関するものである。

乳酸菌を利用した食品は、花粉症や通年性アレルギー性鼻炎などのアレルギー改善に関する効果の解明が進んでおり、納豆菌も、乳酸菌と同様のグラム陽性菌であることから、同様の機能があると予想される。しかし、これまで、納豆菌の免疫に対する機能性については解明されていないのが実情である。

先行技術として、例えば、乳酸菌培養物を有効成分とする抗アレルギー剤が提案されている（特許文献１）。また、６０％以上のインターロイキン１２産生量を示し、且つ、乳酸菌無添加コントロールの５０％未満のインターロイキン４生成量を示す乳酸菌を有効成分として含んでなる抗アレルギー用組成物（特許文献２）、また、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を添加した抗アレルギー機能を有する食品及び飲料（特許文献３）、が提案されている。

また、先行技術として、例えば、乳酸菌及び水を含有することを特徴とする点鼻腔洗浄組成物（特許文献４）、乳酸発酵産物とメシマコブ抽出物を含む健康食品（特許文献５）、花粉症の改善に有効な乳酸菌飲料（特許文献６）、花粉症、アレルギー性気管支喘息、アレルギー疾患を改善、予防する抗アレルギー効果を有する食品（特許文献７）、が提案されている。

特開２００６−２９８７７９号公報特開２００５−１３９１６０号公報特開２００５−１３７３５７号公報特開２００５−８９４３７号公報特開２００４−１４１１１４号公報特開２００４−４１１３９号公報特開２０００−９５６９７号公報

このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、アレルギー改善に納豆菌を利用することを着想し、納豆菌の免疫に対する機能を明らかにすると共に、免疫に対する機能性の高い納豆菌株の選抜に関する研究を鋭意積み重ねた結果、納豆菌が免疫に対する機能性を持ち、納豆菌の摂取が鼻過敏症モデルモルモットの鼻汁漏出を抑制するとの新規知見を得て、本発明を完成するに至った。

本発明は、納豆菌を有効成分として含み、インターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を高めた機能性食品及び抗アレルギー用組成物を提供することを目的とするものである。また、本発明は、納豆菌を有効成分として含む花粉症や通年性アレルギー性鼻炎などに対するアレルギー改善作用を有する機能性食品又は抗アレルギー用組成物を提供することを目的とするものである。更に、本発明は、上記免疫に対する高い機能性と高い品質の納豆の製品化を可能とする性質を合せ持つ納豆菌株を提供することを目的とするものである。

上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）納豆菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す機能性食品。
（２）上記免疫に対する機能性として、花粉症、通年性アレルギー性鼻炎に対するアレルギー改善作用を有する、前記（１）に記載の機能性食品。
（３）上記食品が、納豆製品である、前記（１）又は（２）に記載の機能性食品。
（４）納豆菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す抗アレルギー用組成物。
（５）上記免疫に対する機能性として、花粉症、通年性アレルギー性鼻炎に対するアレルギー改善作用を有する、前記（４）に記載の抗アレルギー用組成物。
（６）前記（１）又は（４）に記載の機能性食品又は抗アレルギー用組成物に使用する納豆菌であって、ＦＥＲＭＡＰ−２１１７２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＴＴＣＣ８４８株とその変異株。
（７）前記（１）又は（４）に記載の機能性食品又は抗アレルギー用組成物に使用する納豆菌であって、ＦＥＲＭＡＰ−２１１７３で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＴＴＣＣ９０３株とその変異株。
（８）前記（１）又は（４）に記載の機能性食品又は抗アレルギー用組成物に使用する納豆菌であって、ＦＥＲＭＡＰ−２１１７４で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＴＴＣＣ８４１株とその変異株。
（９）前記（６）から（８）のいずれかに記載の納豆菌を１つ以上含む複数の納豆菌の混合菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す機能性食品。
（１０）前記（６）から（８）のいずれかに記載の納豆菌を１つ以上含む複数の納豆菌の混合菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す抗アレルギー組成物。

次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、インターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す機能性食品又は抗アレルギー用組成物であって、納豆菌を有効成分として含むことを特徴とするものである。本発明では、上記免疫に対する機能性として、花粉症、通年性アレルギー性鼻炎に対するアレルギー改善作用を有すること、上記食品が納豆製品であることを好ましい実施の態様としている。

また、本発明は、上記機能性食品又は抗アレルギー用組成物に使用する納豆菌であって、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＴＴＣＣ８４８株（ＦＥＲＭＡＰ−２１１７２）、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＴＴＣＣ９０３株（ＦＥＲＭＡＰ−２１１７３）、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＴＴＣＣ８４１株（ＦＥＲＭＡＰ−２１１７４）やその変異株、もしくはそれを１つ以上含む複数の納豆菌の混合物であることを特徴とするものである。

本発明では、納豆菌の免疫に対する機能性を細胞レベルでの評価系で明らかにすると共に、免疫に対する機能性の高い納豆菌の選抜及びその納豆菌を使用した納豆の製品化を実施可能とした。本発明では、納豆菌の免疫に対する機能性評価試験において、納豆菌として、ナットウキナーゼ高生産株であるＴＴＣＣ８６５株を用いた。また、免疫に対する機能性の高い納豆菌の選抜は、６２３株行った。

納豆菌胞子は、滅菌水に懸濁させた状態で用いた。納豆菌栄養細胞は、例えば、納豆菌胞子を肉汁で、３７℃、4時間培養した後、新しい肉汁に植え継いで、３７℃、１８時間培養して調製される。また、納豆菌栄養細胞破砕物は、例えば、ジルコニアシリカビーズ、タングステンビーズを用い、シェイクマスター（株式会社バイオメディカルサイエンス）等を用いて、破砕して調製する。この場合、上述の温度、時間、手段等は、任意に設定することができる。

次に、本発明では、納豆菌の免疫に対する機能性評価試験において、細胞として、例えば、マウス由来マクロファージ様細胞株であるＪ７７４．１細胞が使用される。この細胞は、例えば、１０％牛胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｕｉｎｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０（日水製薬株式会社）で５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、２４ｗｅｌｌプレートに１ｍｌ／ｗｅｌｌ蒔いて使用する。これらの条件及び手段についても任意に設定することができる。

次に、Ｊ７７４．１細胞の培養は、例えば、細胞を蒔いた各ｗｅｌｌに濃度を変えて納豆菌を１００μｌ添加し、５％ＣＯ_２条件下で３７℃、２４時間行い、培養終了後、培養上清を回収し、ＩＬ−１２ｐ４０測定時まで−８０℃で保存する。この場合、上述の条件及び手段は、必要に応じて任意に変更することができる。次に、ＩＬ−１２ｐ４０の測定は、例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ｍｏｕｓｅＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行うことができる。

次に、免疫に対する機能性が高い納豆菌の選抜について説明する。本発明では、前述のように、６２３株の納豆菌から選抜を行った。選抜は、例えば、粘質物産生能、納豆品質、ＩＬ−１２ｐ４０の誘導の評価で行うことができる。また、評価系に用いる細胞としては、納豆菌の免疫に対する機能性評価で使用される細胞と同様のものを使用することができる。

納豆菌の粘質物産生能を評価するために、例えば、納豆菌を粘質物産生用の培地上で、３７℃、２４時間培養した後、形成したコロニーの形状を＋＋＋（粘質物産生多）〜−（粘質物産生なし）の４段階で目視により評価し、この評価を粘質物産生能の評価とする。

納豆品質を評価するために、例えば、納豆用大豆を一晩浸漬の後、蒸煮し、納豆菌を接種し、４０℃前後の恒温槽で１８時間発酵させて納豆を作製する。作製した納豆は、パネルテストにより、納豆の外観、粘り、香り、硬さ、味、総合をＡ（良い）〜Ｄ（悪い）の４段階で評価し、この評価を納豆品質の評価とする。

ＩＬ−１２ｐ４０の誘導を評価するために、例えば、Ｊ７７４．１細胞を使用し、細胞を蒔いた各ｗｅｌｌに納豆菌胞子を２×１０^６ｃｆｕ／１００μｌ添加、５％ＣＯ_２条件下で、３７℃、２４時間培養する。培養終了後、培養上清を回収し、ＩＬ−１２ｐ４０濃度を測定する。この結果をＩＬ−１２ｐ４０の誘導の評価とする。

本発明により、納豆菌の免疫に対する機能性評価を行った結果、これまで評価が不明であった納豆菌の免疫に対する機能性について、納豆菌栄養細胞のＩＬ−１２ｐ４０の誘導が認められた。また、納豆菌胞子、納豆菌栄養細胞、納豆菌栄養細胞破砕物のＩＬ−１２ｐ４０誘導を様々な濃度（ＯＤ_６０００．１〜５）で検討したところ、納豆菌胞子では、量依存的にＩＬ−１２ｐ４０が増加し、納豆菌栄養細胞では、ＯＤ_６００１．０までは増加が認められ、それ以上の濃度では減少が認められた。納豆菌栄養細胞破砕物では、一定量の誘導は認められたが、添加濃度の違いによるＩＬ−１２ｐ４０誘導の変化は認められなかった。

本発明では、納豆菌として、納豆菌栄養細胞、納豆菌胞子、納豆菌栄養細胞破砕物を使用することができる。本発明の機能性食品は、粉末、固体又は液体等の任意の形態の食品として利用することができ、その製品形態は特に限定されるものではない。また、本発明で選抜した納豆菌株は、前述の免疫に対する機能性評価を行ったＴＴＣＣ８６５株に比べ、ＩＬ−１２ｐ４０の誘導が１４０〜１６０％強であった。本発明に係る納豆菌株には、選抜した納豆菌株ＴＣＣ８４８株、同９０３株、同８４１株及びそれらの変異株が含まれる。また、本発明は、上記納豆菌株又は該納豆菌株を１つ以上含む複数の納豆菌の混合菌を有効成分とする機能性食品又は抗アレルギー用組成物を提供する。更に、これらの納豆菌を用いて納豆の製品化を試みた結果、品質が良好な納豆製品が得られた。

本発明により、次のような効果が奏される。
（１）免疫機能調節を可能とする納豆菌利用技術を提供することができる。
（２）納豆菌を有効成分とする免疫に対する機能性を高めた機能性食品を提供することができる。
（３）免疫に対する機能性を高めた納豆製品を提供することができる。
（４）免疫に対する機能性が高い納豆菌株を提供することができる。
（５）免疫に対する機能性を高めた抗アレルギー用組成物を提供することができる。

次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。

本実施例では、納豆菌の免疫に対する機能性評価を行った。
（１）納豆菌
納豆菌として、ナットウキナーゼ高生産菌であるＴＴＣＣ８６５株（ＦＥＲＭＰ−１９１７６、特開２００４−２２２５１６）を用いた。納豆菌胞子を肉汁で３７℃、４時間培養した後、新しい肉汁に植え継ぎして、３７℃、１８時間培養して納豆菌栄養細胞を調製した。これを、ジルコニアシリカビーズ、タングステンシリカビーズを用い、シェイクマスター（株式会社バイオメディカルサイエンス）で１５分間破砕し、その後、５分間、−８０℃で冷却し、再び１５分間破砕して、納豆菌栄養細胞破砕物（納豆菌破砕物）を調製した。破砕の際に、−８０℃で冷却した凍結用ラックを用いた。

（２）細胞
細胞として、マウス由来マクロファージ様細胞株であるＪ７７４．１細胞（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから購入）を用いた。このＪ７７４．１細胞をＲＰＭＩ１６４０（日水製薬株式会社）で５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。上記ＲＰＭＩ１６４０には、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、コージンバイオ株式会社）、２ｍＭＬ−グルタミン（和光純薬工業株式会社）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（株式会社同仁化学研究所）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（インビトロジェン株式会社）が含まれる。次いで、上記細胞を２４ｗｅｌｌマルチウエルセルカルチャープレート（ベクトン・ディッキンソン株式会社）に１ｍｌ／ｗｅｌｌ蒔いて使用した。

（３）Ｊ７７４．１細胞の培養
次に、細胞を蒔いた各ｗｅｌｌに、ＯＤ_６０００．１、０．５、１．０、２．５、５．０の納豆菌を１００μｌ添加し、５％ＣＯ_２条件下で３７℃、２４時間培養を行った。培養終了後、培養上清を回収し、ＩＬ−１２ｐ４０測定時まで−８０℃で保存した。

（４）ＥＬＩＳＡ
Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ｍｏｕｓｅＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＩＬ−１２ｐ４０の測定を行った。

（５）結果
１）納豆菌栄養細胞のＩＬ−１２ｐ４０誘導
納豆菌栄養細胞（ＯＤ_６０００．１）のＩＬ−１２ｐ４０誘導試験結果を図１に示す。Ｊ７７４．１細胞に納豆菌栄養細胞を添加して培養した場合は、ＩＬ−１２ｐ４０の誘導が認められた。一方、納豆栄養細胞を加えなかった場合には、ＩＬ−１２ｐ４０の誘導は認められなかった。

２）状態の異なる納豆菌のＩＬ−１２ｐ４０誘導
納豆菌胞子、納豆菌栄養細胞、納豆菌破砕物のＩＬ−１２ｐ４０誘導試験の結果を図２に示す。納豆菌胞子を添加して培養した場合は、本実施例で検討したＯＤ_６００５まで量依存的にＩＬ−１２ｐ４０の増加が認められた。一方、納豆菌栄養細胞を添加した場合には、ＯＤ_６００１．０までは増加が認められ、それ以上の濃度では減少が認められた。納豆菌の破砕物では、ある一定のＩＬ−１２ｐ４０誘導は認められたが、添加濃度の違いによるＩＬ−１２ｐ４０誘導の変化は認められなかった。

本実施例では、免疫に対する機能性が高い納豆菌の選抜を行った。
（１）納豆菌
納豆菌の選抜は６２３株行った。

（２）細胞
細胞として、実施例１の（２）に記載した細胞と同様のものを使用した。

（３）粘質物産生能の評価
粘質物判定用培地上で、提供された納豆菌を３７℃、２４時間培養した後、形成したコロニーの形状を＋＋＋（粘質物産生多）〜−（粘質物産生なし）の４段階で目視により評価した。この評価を粘質物産生能の評価とした。一定の評価が得られた優良株については、納豆品質の評価を行った。

（４）納豆品質の評価
納豆大豆を一晩浸漬の後、蒸煮し、納豆菌を接種し、４０℃前後の恒温槽で１８時間発酵させて納豆を作製した。熟練のパネラー３名により、納豆の外観、粘り、香り、硬さ、味、総合をＡ（良い）〜Ｄ（悪い）の４段階で納豆品質の評価を行った。総合的に一定の評価が得られた優良株に対して、ＩＬ−１２ｐ４０の誘導について評価を行った。

（５）ＩＬ−１２ｐ４０の誘導評価
Ｊ７７４．１細胞を蒔いた各ｗｅｌｌに納豆菌胞子を２×１０^６ｃｆｕ／１００μｌを添加し、５％ＣＯ_２条件下で、３７℃、２４時間培養を行った。培養終了後、培養上清を回収し、実施例１の（４）に記載したキットを用いてＩＬ−１２ｐ４０濃度を測定、ＩＬ−１２ｐ４０の誘導評価を行った。

（６）試験結果
１）粘質物産生能の評価
納豆菌６２３株について、粘質物産生能の評価を行ったところ、５１９株の優良株が得られた。

２）納豆品質の評価
粘質物産生能の優良株５１９株について納豆品質の評価を行ったところ、２０９株の優良株が得られた。

３）ＩＬ−１２ｐ４０誘導評価
納豆品質の優良株２０９株のうち、１３９株についてＩＬ−１２ｐ４０の誘導評価を行ったところ、ＴＴＣＣ８６５株よりもＩＬ−１２ｐ４０の誘導の高い株が確認された。ＴＴＣＣ８６５株のＩＬ−１２ｐ４０の誘導を１００％とした場合、最も誘導が高い株でＴＴＣＣ８６５株の１６０％強であった（表１）。これらの株を微生物寄託機関に寄託した。受領機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、受領日：平成１９年２月２日、受領番号：ＦＥＲＭＡＰ−２１１７２、ＦＥＲＭＡＰ−２１１７３、ＦＥＲＭＡＰ−２１１７４。

本実施例では、納豆菌の抗原誘発鼻汁漏出抑制試験を行った。
（１）試験方法
鼻過敏症のモデルであるｔｏｌｕｅｎｅ２，４−ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＤＩ）感作モルモットに、納豆菌を３８日間経口投与し、滅菌水投与の動物と比較して抗原誘発による鼻汁漏出が抑制されるか検討した。すなわち、納豆菌投与開始後１１日目から５日間感作を行い、投与開始後２４日、３８日目に誘発及び鼻汁量の測定を行った。

感作は１日１回、動物の両鼻前庭に１０％ＴＤＩ溶液に浸した細軸綿棒を１０秒間接触させて塗布することで、誘発は、動物の両鼻前庭に５％ＴＤＩ溶液に浸した細軸綿棒を１０秒間接触させて塗布することで行った、鼻汁量は、誘発開始より１５分間で回収された鼻汁の重量とした。

（２）試験結果
鼻汁量の測定結果を図３に示す。媒体としての滅菌水投与群の鼻汁量は、投与２４日で１４２．９ｍｇ、投与３８日で１７３．３ｍｇであった。ＴＴＣＣ９０３投与群の鼻汁量は、投与２４日で７９．４ｍｇ、投与３８日で５０．５ｍｇであった。ＴＴＣＣ８４１投与群の鼻汁量は、投与２４日で２５．９ｍｇ、投与３８日で１９．１ｍｇであった。ＴＴＣＣＭｉｘ（ＴＴＣＣ９０３、８４１、８６５の混合菌）投与群の鼻汁量は、投与２４日で１２．４ｍｇ、投与３８日で５３．１ｍｇであった。ＴＴＣＣ９０３、８４１、Ｍｉｘ投与群は、滅菌水投与群に比べ、有意に鼻汁漏出を抑制した。

以上詳述したように、本発明は、免疫に対する機能性が高い納豆製品又は抗アレルギー用組成物に係るものであり、本発明により、免疫機能調節を可能とする納豆菌利用技術を提供することができる。また、本発明により、納豆菌を有効成分とする免疫に対する機能性を高めた機能性食品を提供することができる。また、本発明により、免疫に対する機能性を高めた納豆製品を提供することができる。更に、本発明は、免疫に対する機能性が高い納豆菌株を提供するものである。

納豆菌栄養細胞のＩＬ−１２ｐ４０の誘導を示す。状態の異なる納豆菌のＩＬ−２０ｐ４０誘導を示す。鼻汁量測定結果（２４日、３８日）を示す。

Claims

納豆菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す機能性食品。
上記免疫に対する機能性として、花粉症、通年性アレルギー性鼻炎に対するアレルギー改善作用を有する、請求項１に記載の機能性食品。
上記食品が、納豆製品である、請求項１又は２に記載の機能性食品。
納豆菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す抗アレルギー用組成物。
上記免疫に対する機能性として、花粉症、通年性アレルギー性鼻炎に対するアレルギー改善作用を有する、請求項４に記載の抗アレルギー用組成物。
請求項１又は４に記載の機能性食品又は抗アレルギー用組成物に使用する納豆菌であって、ＦＥＲＭＡＰ−２１１７２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＴＴＣＣ８４８株とその変異株。
請求項１又は４に記載の機能性食品又は抗アレルギー用組成物に使用する納豆菌であって、ＦＥＲＭＡＰ−２１１７３で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＴＴＣＣ９０３株とその変異株。
請求項１又は４に記載の機能性食品又は抗アレルギー用組成物に使用する納豆菌であって、ＦＥＲＭＡＰ−２１１７４で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＴＴＣＣ８４１株とその変異株。
請求項６から８のいずれかに記載の納豆菌を１つ以上含む複数の納豆菌の混合菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す機能性食品。
請求項６から８のいずれかに記載の納豆菌を１つ以上含む複数の納豆菌の混合菌を有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン１２産生量を高めて免疫に対する機能性を示す抗アレルギー組成物。