JP2008196860A - 微粒子検出装置及び微生物検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細菌等の微生物を始めとした検体液中に含まれる種々の微粒子について、簡易に効率よく、確実に検出及び計数できる手段を提供する。
【解決手段】上面に相互に噛み合う櫛歯状パターン部２０を有する一対の薄膜電極２Ａ，２Ｂが形成された検出基板１と、両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に交流電界を印加する誘電泳動制御ユニット３と、検出基板１上面の所定領域の拡大視野を得る光学顕微鏡４とを備える微粒子検出装置を用いる。検出基板１の上面に微粒子を含む検体液Ｌを展開させ、薄膜電極２，２間に交流電界を印加することにより、検体液Ｌ中の正の誘電泳動力による影響を受ける微粒子Ｐ…が電極間隙５に臨む電極縁部２１ａ，２１ａに一端側を付着して整列集合し、この整列集合状態を前記光学顕微鏡４の拡大視野で捉える。
【選択図】図３

Description

本発明は、細菌の如き微生物を始めとして検体液中に含まれる種々の微粒子を誘電泳動を利用して検出する装置と、この検出装置を用いた微生物の検出方法に関する。

飲食品や医薬品の品質管理、医療衛生や環境衛生等に携わる上で、細菌等の微生物による汚染の有無や繁殖状況を調べる機会が多いが、このような微生物の検出は専ら公定法（培養法）によっているため、その検出作業に多大な時間及び労力を費やすことを余儀なくされている。また、微生物の数については、検体液等の媒体から直接に自動的に計数する適当な手段がないから、現状では光学顕微鏡による目視観察で数えているが、非常に手間を要することに加え、個人の技量差による計測値のバラツキが大きいという難点があった。しかも、媒体中の微生物密度が１０⁶ 個／ml程度以下になると、顕微鏡の拡大視野に微生物を捉えるのも難しく、計数は無論のこと観察すら容易には行えなくなる。

一方、近年においては、水の如き低導電率の液中に分散した微粒子について、その分散液に電極を接触させ、電圧印加に伴う電気泳動や誘電泳動により、微粒子を所要の部位に集めて検出・計測する試みが種々なされている。その電気泳動による手段では、微粒子の分散液に接触する正負電極間に直流電界を印加した際、電化を持つ微粒子が電気泳動によって逆極性の電極側に移動することを利用する。また、誘電泳動による手段では、微粒子の分散液に接触する一対の電極間に交流電界を印加した際、これに伴う微粒子内の分極による電位と媒体液の電位とのずれにより、当該微粒子が電界の強弱一方側へ移動する現象を利用する。

しかして、電気泳動による手段として、液中測定セルの上下部電極間に分散液を収容し、電気泳動にて一方の電極表面に固着した微粒子を、該液中測定セルの液中に走査プローブ顕微鏡の探針を挿入して観察する方法（特許文献１）や、表面に一対の電極を設けたスライドガラス上に分散液を配置し、電気泳動にて一方の電極近傍に固着した微粒子を光学顕微鏡にて観測する方法（特許文献２）が提案されている。また、誘電泳動による手段として、基板上に中抜き部を有する電極を形成し、該電極への電圧印加によって生じる負の電気泳動力により影響を受ける物質を該中抜き部に集合させることにより、蛍光強度等で物質を検出する際のバックグラウンドを低減させ、Ｓ／Ｎ比を向上させて測定感度を確保する方法が提案されている（特許文献３）。
特開２００１−１０８５９６号公報 特開２００４−１４４６３９号公報 特開２００２−１７４６２４号公報

しかしなから、前記の電気泳動による観察方法では、電気分解による発熱を生じるため、細菌やバクテリヤ等の微生物を対象とした測定に不向きである上、正負極が蒸着やスパッタリング等による薄膜電極である場合に融け易く、充分な耐久性が得られないいう問題があった。また、前記の誘電泳動による検出方法では、測定対象物に励起光を照射した際に生じる蛍光強度や吸光度に基づく測定を行うため、その測定機器による設備コストが嵩む上、電極の中抜き部に集合した微粒子が立体的に重なり合った状態になるから、光学顕微鏡等による計数も困難であるという難点があった。

本発明は、上述の状況に鑑み、細菌の如き微生物を始めとして検体液中に含まれる種々の微粒子について、簡易に効率よく且つ確実に検出及び計数でき、また設備コスト負担が少なく耐久性にも優れる検出装置と、この装置を利用して特に細菌等の微生物を検出する方法とを提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明の請求項１に係る微粒子検出装置は、図面の参照符号を付して示せば、上面に一対の薄膜電極２Ａ，２Ｂを形成した検出基板１と、両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に交流電界を印加する通電手段（誘電泳動制御ユニット３）と、該検出基板１上面の所定領域の拡大視野を得る光学顕微鏡４とを備え、前記一対の薄膜電極２Ａ，２Ｂは相互に噛み合うように配置する櫛歯状パターン部２０を有し、両薄膜電極２Ａ，２Ｂの櫛歯状パターン部２０，２０間に蛇行状の電極間隙５が形成され、前記検出基板１の上面に微粒子を含む検体液Ｌを展開させ、前記薄膜電極２，２間に交流電界を印加することにより、検体液Ｌ中の正の誘電泳動力による影響を受ける微粒子Ｐ…が前記電極間隙５に臨む電極縁部２１ａ，２１ａに一端側を付着して整列集合し、この整列集合状態を前記光学顕微鏡４の拡大視野で捉えるように構成されてなる。

請求項２の発明は、上記請求項１の微粒子検出装置において、光学顕微鏡４による拡大視野を撮影して電気信号に変換して出力する撮影手段（ＣＣＤカメラ６）と、この撮影手段からの電気信号に基づいて前記拡大視野の映像を画面表示するディスプレイ７とを具備してなるものとしている。

請求項３の発明は、上記請求項２の微粒子検出装置において、光学顕微鏡４による拡大視野を電極間隙５に沿って相対移動させる走査手段（ＸＹＺステージ８）と、該拡大視野における電極縁部２１ａに整列集合した微粒子の数を画像処理によって計数する自動計数手段（画像処理ボード９）とを具備するものとしている。

請求項４の発明は、上記請求項１〜３のいずれかの微粒子検出装置において、薄膜電極２，２の厚さが０．１〜１μｍ、櫛歯状パターン部２１の櫛歯一本の幅が１０〜５００μｍ、電極間隙５が１〜１００μｍであるものとしている。

また、請求項５の発明に係る微生物検出方法は、上記請求項１〜４のいずれかの微粒子検出装置を用い、その検出基板１の上面に微生物を含む検体液Ｌを滴下し、この滴下液面上に透明性カバー板を被せて、両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に交流電界を印加することにより、検体液Ｌ中の微生物Ｐを正の誘電泳動力で電極間隙５に臨む電極縁部２１ａに一端側が付着するように整列集合させ、この整列集合状態を光学顕微鏡４の拡大視野で捉えることを特徴としている。

請求項６の発明は、上記請求項５の微生物検出方法において、検出基板１上に滴下した検体液Ｌ中の微生物Ｐを、検出前の両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間への交流電界の印加による予備誘電泳動で検出領域に濃集させるようにしている。

請求項７の発明は、上記請求項５又は６の微生物検出方法において、検出基板１と透明性カバー板１１との間に環状のシリコンシールド層１２を介在させ、このシリコンシールド層１２の内側に検体液Ｌを封入するようにしている。

請求項８の発明は、上記検出基板１の両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に交流電界を印加して誘電泳動を行いながら、該検出基板１と透明性カバー板１１との間に検体液Ｌを通過させるようにしている。

請求項９の発明は、上記請求項１〜４のいずれかの微生物検出方法において、交流電界を電圧１〜５０Ｖ、周波数を５０Ｈｚ〜２００ＭＨｚの範囲で調整するようにしている。

請求項１の発明に係る微粒子検出装置によれば、検出基板の上面に微粒子を含む検体液を展開させ、薄膜電極間に交流電界を印加した際、検体液中に分散していた該微粒子は、正の誘電泳動力によって電界の強い側へ引き寄せられ、最も電界が強い部位となる電極間隙に臨む電極縁部に沿って平面的に整列集合し、且つ一端側を該電極縁部に付着した形でブラウン運動のない固定状態になるから、活きた細菌のように本来は高速で動き回るような微生物でも、また検体液中の微粒子濃度が低い場合でも、光学顕微鏡の拡大視野に確実に捉えて容易に観察及び計数することができる。しかして、一対の電極が櫛歯状パターン部で相互に噛み合った形になり、この噛み合い部分では電極間隙の単位長さ当たりで誘電泳動力が両側の櫛歯電極部の幅方向中央位置まで及ぶから、検出領域を両電極の櫛歯状パターンの噛み合い部分に設定して電極間隙に沿って順次に計数してゆく方式により、検出領域全体の微粒子を漏れなく合算計数できる。一方、この検出装置では、光学顕微鏡による計測を行えるから、蛍光強度や吸光度による計測におけるような高価な測定機器が不要であり、それだけ設備コスト負担が少なくて済む。

請求項２の発明によれば、上記の微粒子検出装置において、光学顕微鏡による拡大視野を映像としてディスプレイに表示できるから、検体液中の微粒子の観察及び計数をより容易に行える。

請求項３の発明に係る微粒子検出装置によれば、光学顕微鏡による拡大視野を電極間隙に沿って相対移動させながら、該拡大視野に捉えた微粒子の数を画像処理によって自動的に計数できる。

請求項４の発明によれば、検出基板における薄膜電極の厚さと、その櫛歯状パターン部の櫛歯一本の幅と、電極間隙とが、それぞれ特定範囲に設定されることから、検体液中の微粒子の観察及び計数をより的確に行える。

請求項５の発明に係る微生物検出方法によれば、上記請求項１〜４の何れかの微粒子検出装置を用い、検体液中の細菌等の微生物を正の誘電泳動力で電極間隙に臨む電極縁部に整列付着させ、この整列付着状態を光学顕微鏡の拡大視野で捉えて能率よく容易に且つ確実に検出できる。

請求項６の発明によれば、上記の微生物検出方法において、検出基板上に滴下した検体液中の微生物を予備誘電泳動で検出領域に濃集させることから、特に微生物濃度の低い検体液でも確実に微生物を光学顕微鏡の拡大視野に捉えて観察することが可能となる。

請求項７の発明によれば、上記の微生物検出方法において、検体液Ｌを検出基板と透明性カバー板との間に介在する環状のシリコンシールド層の内側に封入することから、検出中の検体液の乾燥を防止でき、例えば微生物の観察及び計数を行う場合に時間的な余裕が得られる。

請求項８の発明によれば、上記の微生物検出方法において、誘電泳動を行いながら検出領域に検体液を通過させるため、検出領域に流入する検体液中の微生物が電極間隙内に補集され、液媒体のみが排出されることになり、微生物濃度の低い検体液でも検出領域に微生物を濃集させて光学顕微鏡の拡大視野に確実に捉えることができる。

請求項９の発明よれば、上記の微生物検出方法において、検出基板の一対の薄膜電極に印加する交流電界の電圧及び周波数を特定範囲に調整することから、微生物の観察及び計数をより効率よく行える。

以下、本発明に係る微粒子検出装置の一実施形態について、図面を参照して具体的に説明する。図１は該微粒子検出装置の全体構成、図２は検出基板、図３は検出時の検出基板の状態、図４は光学顕微鏡による拡大視野のディスプレイ画面映像、図５は該検出基板の電極パターンの一部、図６はシリコンシールド層を用いた検出時の検出基板の状態、をそれぞれ示す。

図１において、１０は検出装置本体であり、その内部に、対物レンズ４ａ側を下向きにして垂直に配置した光学顕微鏡４と、該光学顕微鏡４の頂端に連結された撮影手段であるＣＣＤ（Chargre Coupled Device)カメラ６と、該光学顕微鏡４の下方に配置して前後左右及び上下方向に移動可能な走査手段としてのＸＹＺステージ８と、このＸＹＺステージ８の動作を司る走査用コントローラ８１とを備えており、ＸＹＺステージ８上に保持させた検出基板１の所要部位を光学顕微鏡４で捉え，その拡大視野をＣＣＤカメラ６にて撮影して電気信号に変換するようになっている。

１３はパーソナルコンピュータであり、キーボード１４及びマウス１５の操作により、ＣＣＤカメラ６からの電気信号によって光学顕微鏡４の拡大視野を直接に映像として、また該電気信号を画像処理ボード９にて種々加工した画像として、それぞれディスプレイ７に表示させたり、誘電泳動制御ユニット３による検出基板１の電極への交流電界の印加条件を指示したり、走査用コントローラ９の設定を行うようになされている。

図２（Ａ）（Ｂ）で示すように、検出基板１は、矩形のガラス板１ａの上面に、フォトリソグラフィー等の微細加工技術によってクロム等の導電性金属からなる左右一対の薄膜電極２Ａ，２Ｂを形成したものである。そして、両薄膜電極２Ａ，２Ｂは相互に噛み合うように配置した櫛歯状パターン部２０を有しており、両櫛歯状パターン部２０，２０間に一定長さで折り返して蛇行状に連続する電極間隙５が構成されている。この電極間隙５はガラス板１ａ上で薄膜電極の厚み分だけ深くなった溝状の無電極領域をなしている。また、検出基板１の上面の前後両側位置には、電極間隙５に連通した広い矩形の無電極領域５１，５１を有している。

図２（Ａ）において、両薄膜電極２Ａ，２Ｂの櫛歯状パターン部２０，２０が噛み合った中央部分に仮想線で記した正方形は、その内側が検出領域Ｚ１であることを示している。しかして、この検出領域Ｚ１の対角線方向の両端外側部には、電極間隙５の各溝３本に拡幅部５ａを設けており、検出操作に際して光学顕微鏡の拡大視野に該拡幅部を捉えることにより、検出始端及び検出終端の位置を容易に確認できるようにしている。

ここで、薄膜電極２Ａ，２Ｂとしては、後述する検体液中の微粒子の観察及び計数をより的確に行う上で、電極厚さを０．１〜１μｍ程度、櫛歯状パターン部２０の各櫛歯電極部２１の幅を１０〜５００μｍ程度、検出始端及び終端の拡幅部５ａを除く電極間隙５を１〜１００μｍ程度に設定することが推奨される。

なお、薄膜電極２Ａ，２Ｂをフォトリソグラフィーによって形成する場合、まずガラス板１ａの片面に真空蒸着、スパッタリング、メッキ、スクリーン印刷等によって金属薄膜を形成し、この金属薄膜上にフォトレジストを塗布し、電極のネガパターンのマスキングを介して該フォトレジストを露光硬化させ、未露光部のフォトレジストを除去して現像したのち、露呈した金属薄膜をエッチングで除去し、最後にフォトレジストの硬化層を除去すればよい。ただし、金属薄膜の電極間隙５に臨む縁部は、エッチング時の側方侵食で荒れるため、後加工としてレーザービームの照射で該縁部に沿う凹凸部分を蒸発除去してシャープな直線状（折り返し部分は円弧状）に修正する所謂レーザーミリングを行うことが望ましい。

上記構成の微粒子検出装置によって検体液中に分散した微粒子を検出するには、該検体液を攪拌して微粒子が均一分散した状態でマイクロピペットにて適量を採取し、該検体液を検出基板１の電極形成面上に滴下して展開させ、その上に図３（Ａ）（Ｂ）で示すように透明性カバー板としての正方形のカバーガラス１１を被せた上で、誘電泳動制御ユニット３を介して検出基板１の両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に、検出対象の微粒子に正の誘電泳動力を作用させる交流電界を印加すると共に、ディスプレイ７の画面でモニターしつつ、電極間隙５に臨む電極縁部に集合した微粒子に、検体液Ｌの層を通して光学顕微鏡４の焦点を合わせる。

この交流電界の印加により、図４（Ａ）の如く検体液Ｌ中に分散していた各微粒子Ｐと媒体液の相対的な電位のずれによって当該微粒子Ｐに正の誘電泳動力が作用するため、これら微粒子Ｐ…は電界の強い側へ引き寄せられるように移動し、最終的に図４（Ｂ）の如く最も電界が強い部位となる電極間隙５に臨む電極縁部２１ａ，２１ａに沿って平面的に整列集合し、且つ一端側を電極縁部２１ａに付着した形でブラウン運動のない固定状態になる。従って、微粒子Ｐが活きた細菌のように本来は高速で動き回るような微生物でも、また検体液中の微粒子濃度が低い場合でも、光学顕微鏡４の拡大視野に確実に捉えてディスプレイ７の画面に表示でき、その映像から微粒子Ｐ…を容易に観察及び計数することができる。

図４（Ａ）（Ｂ）における矩形の表示域は光学顕微鏡４による一回の拡大視野として捉えられる検出単位面Ｚ２であり、図５（Ａ）とその一点鎖線円Ｃ内を拡大した図５（Ｂ）とに示すように、電極間隙５とその両側の薄膜電極２Ａ，２Ｂの一部とを含む幅で、検出領域Ｚ１内における電極間隙５の各直線部の全長を数十分割する大きさに設定されている。しかして、各検出単位面Ｚ２に対応して誘電泳動力の及ぶ範囲は、図５（Ｂ）で幅Ｅとして示すように、電極間隙５の幅方向中央位置から両側の櫛歯電極部２１，２１の幅方向中央位置までになる。この幅Ｅは櫛歯電極部２１の幅Ｗ１と電極間隙５の幅Ｗ２の合計に等しい（Ｅ＝Ｗ１＋Ｗ２）。故に、検出領域Ｚ１に存在する微粒子Ｐの数は、各検出単位面Ｚ２にある微粒子Ｐの総和である。なお、図５（Ｂ）に、検出単位面Ｚ２に対応して誘電泳動力の及ぶ幅Ｅの領域をＺ３として示す。

具体的に説明すると、各検出単位面Ｚ２において幅Ｅの領域Ｚ３内に存在していた全ての微粒子Ｐ…が誘電泳動によって電極間隙５内へ移動して電極縁に固定化されることになるから、検出単位面Ｚ２…を順次走査して検出される微粒子Ｐ…の数を合算してゆくことにより、検出領域Ｚ１内に存在していた微粒子Ｐ…の総数を知ることができる。そして、検出基板１上へ滴下する検体液Ｌを、その上に被せるカバーガラス１１の下面全体に液が拡がって、且つ表面張力で当該カバーガラス１１から外側にはみ出さない適量範囲に設定すれば、マイクロピペットにて精測できる滴下液量とカバーガラス１１の面積から液層の厚さが判るため、この液層厚から算出される検出領域Ｚ１内の液量と微粒子Ｐ…の総数とから検体液Ｌの微粒子濃度を精密に算定できる。

なお、薄膜電極２Ａ，２Ｂの膜厚が非常に薄く、電極間隙５と無電極領域５１，５１による凹部の液容量は滴下液量に対して格段に小さくなるため、通常の微粒子濃度の算定では該液容量を無視して差し支えないが、該液容量も既知であるから、これを含めた液量補正によって微粒子濃度を更に精密に算定可能である。

一方、この検出装置では、検体液Ｌ中の微粒子Ｐを光学顕微鏡４の拡大視野に捉えたサイズや形態等から特定できる場合、画像処理ボード９で識別条件のパラメーターを設定しておけば、画像処理によって検出される該微粒子Ｐの計数とその合算を自動的に迅速に行うことができる。また、検体液Ｌ中に複数種の微粒子Ｐが存在していても、互いの識別条件が重複しなければ、これら微粒子Ｐの種類ごとに自動計数することも可能となる。なお、識別条件のパラメーターとしては、径や長さ、長さと幅の比率等の他、電極に対する付着の有無もある。

このような微粒子検出装置において、細菌等の微生物を検出対象として、その検体液Ｌ中の濃度が１０⁴ 個／ｍｌ以下といった非常に低い場合に対応するには、検出前に予備泳動を行わせるのが有効である。この予備泳動は、検出基板１上に滴下した検体液Ｌの液面上にカバーガラス１１を被せる前に、予め両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に交流電界を印加することにより、検体液Ｌ中の微生物Ｐを誘電泳動によって検出領域Ｚ１に濃集させ、もって微生物Ｐを光学顕微鏡４の拡大視野に捉え易くするものである。すなわち、カバーガラス１１を被せる前の段階では、検出基板１上に滴下した検体液Ｌは拡がらずに表面張力で盛り上がっているから、この状態で誘電泳動力が作用すれば、微生物Ｐは基板中央の検出領域Ｚ１に濃集することになる。

上記予備泳動のための交流電界の印加は、検出基板１上への検体液Ｌの滴下前から滴下後までのいずれの段階で始めてもよく、またカバーガラス１１を被せる際にも印加を継続してもよい。これは、検出基板１上で盛り上がっていた検体液Ｌがカバーガラス１１を載せることで周辺へ拡がるが、この段階でも誘電泳動力が作用しておれば、未補集で残っていた微生物Ｐも周辺へ拡がる流れに伴って電極間隙５に効率よく捉えられることによる。従って、両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間への交流電界の印加は予備泳動から本来の検出時まで連続して行うようにしてもよい。

更に、この微粒子検出装置では、微生物濃度が極端に低い検体液Ｌをも検出対象として、その僅かに存在する微生物Ｐを光学顕微鏡４の拡大視野に確実に捉えて観察することを可能にする。この検出手法は、誘電泳動力をフィルタリング作用に利用するものであり、検出基板１の両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に交流電界を印加して誘電泳動を行いながら、該検出基板１とカバーガラス１１との間に検体液Ｌを通過させる。これにより、検出領域Ｚ１に流入する検体液Ｌ中の微生物Ｐが電極間隙５内に補集され、残った液媒体のみが流出するから、通常の液滴程度の量では微生物の有無の判定が困難な低濃度の検体液でも、通過量を多くすることによって検出が可能になる。

このように検出基板１とカバーガラス１１との間に検体液Ｌを通過させるには、例えば図３に示す検出基板１では、検出基板１の上面で対向配置する一対の無電極領域５１，５１の一方側に濾紙のような液吸収材を配置し、毛管現象で電極間隙５の一端から液を吸収させると共に、他方側に検体液Ｌを滴下して電極間隙５の他端から継続して供給すればよい。

上述した検出方法では検出基板１上に検体液Ｌを滴下した上にカバーガラス１１を被せるようにしているが、図６（Ａ）（Ｂ）に示すように、検出基板１とカバーガラス１１との間に環状のシリコンシールド層１２を介在させ、その内側に検体液Ｌを封入するようにしてもよい。

シリコンシールド層１２は、外形が正方形で内周円形をなす環状に形成した厚さ０．１〜０．２ｍｍ程度の均一な厚みのシリコンゴムからなり、独立した環状シート材として検出時に検出基板１上に貼り付ける以外に、予め検出基板１の上面又はカバーガラス１１の下面に接着一体化したものとしてもよい。

このシリコンシールド層１２を用いる構成では、検出中の検体液の乾燥を防止できるから、特に検出対象の微粒子が細菌等の微生物である場合に、その観察及び計数を時間的に余裕をもって行える上、検出基板１上に滴下した検体液Ｌの余剰分が外側へ溢れ出て常に一定の封入液量になるから、検体液Ｌの微粒子濃度の算定が容易である。また、検出使用後の検体液Ｌを封入した検出基板１は、シリコンシールド層１２の外周側を接着剤で恒久封止すれば、保存用のプレパラートが作成できる。

この場合、検出基板１上にある検体液Ｌの液層厚はシリコンシールド層１２の厚みになるから、この液層厚から算出される検出領域Ｚ１内の液量と微粒子Ｐ…の総数とから検体液Ｌの微粒子濃度を算定できる。

そして、シリコンシールド層１２を用いる構成においても、該シリコンシールド層１２に検出基板１の無電極領域５１，５１に臨む径方向両側位置で断裂方向のスリットを入れることにより、検出基板１の両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に交流電界を印加して誘電泳動を行いながら、該スリットを通して検出基板１とカバーガラス１１との間に検体液Ｌを通過させる手法を採用できる。従って、この手法により、極端に微生物濃度の低い検体液Ｌであっても、その微生物Ｐを電極間隙５内に補集し、もって光学顕微鏡４の拡大視野に確実に微生物Ｐを捉えて容易に観察と計数ができる。

微粒子Ｐに正の誘電移動力を作用させるための両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に印加する交流電界の電圧と周波数は、検出対象となる微粒子の種類によって適正範囲が異なるが、細菌等の微生物を検出対象とする場合には電圧１〜５０Ｖ、周波数５０Ｈｚ〜２００ＭＨｚの範囲が好適である。

本発明の微粒子検出装置においては、検出基板１の外形とその上面に占める薄膜電極２Ａ，２Ｂの面積比率、両薄膜電極２Ａ，２Ｂの櫛歯電極部２１の本数と長さ、無電極領域５１のパターン、櫛歯状パターン部２０，２０同士の噛み合い部分に対する検出領域Ｚ１の面積比率、検出単位面Ｚ２の大きさ等、細部構成については実施形態以外に種々設計変更可能である。

本発明の微生物検出方法は、検体液中の微生物を生かした状態で容易に短時間で観察及び計数できるから、加工食品や医薬品、工業製品等の品質管理、医療衛生や環境衛生等に関連して、微生物による汚染の有無や繁殖状況を調べるのに極めて有用であると共に、医薬品，殺菌剤，食品添加物等の開発研究及び効能試験等にも好適に採用できる。

〔検出基板１の電極形成〕
縦２０ｍｍ，横２４ｍｍ，厚さ１ｍｍの顕微鏡スライドグラス用ガラス板（検出基板１１）の片面に、スパッタリングによって厚さ０．１５μｍのクロムからなる金属薄膜を形成し、通常のフォトリソグラフィーの技法に準じ、該金属薄膜上にフォトレジストを塗布し、電極のネガパターンのマスキングを介して該フォトレジストを露光硬化させ、未露光部のフォトレジストを除去して現像し、露呈した金属薄膜をエッチングで除去したのち、フォトレジストの硬化層を除去し、最後に金属薄膜の電極間隙５に臨む縁部を後加工のレーザービーム照射でシャープな直線状（折り返し部分は円弧状）に修正し、図２（Ａ）で示すパターンの薄膜電極２Ａ，２Ｂを形成した。

〔検体液の封入〕
次に、このガラス板における両薄膜電極２Ａ，２Ｂの櫛歯状パターン部２０，２０が噛み合った中央部分に、シリコンシールド層１２とするシリコンゴムの環状シート材を貼り付けた。そして、該環状シート材の内側領域に、マイクロピペットで採取した既知菌濃度の滅菌水からなる検体液Ｌ１〜Ｌ４を過剰に滴下したのち、該環状シート材上にカバーガラス１１を被せ、余剰の検体液Ｌを溢れ出させることにより、図６（Ａ）（Ｂ）に示すように、検出基板１（顕微鏡スライドグラス用ガラス板）とカバーガラス１１との間に挟まれたシリコンシールド層１２の内側に、所定量の検体液Ｌ１〜Ｌ４を空気混入のない状態で封入し、菌数測定用のプレパラート（各菌濃度ごとに５個…計２０個）を作成した。

〔誘電泳動による菌数測定〕
図１に示す構成の微粒子検出装置（アリオテクノ社製Ｂ−ＥＸ）を用い、前記の各プレパラートをＸＹＺステージ８上に保持させ、その両薄膜電極２Ａ，２Ｂ間に交流電界を印加して誘電泳動作用を生じさせると共に、設定した各検出単位面Ｚ２…の光学顕微鏡４で捉えた拡大視野をＣＣＤカメラ６で撮影し、このＣＣＤカメラ６からの電気信号によってパーソナルコンピュータ１３のディスプレイ７に直接に映像として表示させる一方、該電気信号を画像処理ボード９にて加工し、画像処理による菌数の自動測定を各菌濃度ごとに異なるプレパラートにて５回行った。その結果を捕捉率と共に後記表１に示すと共に、捕捉率のデータを図７に示す。なお、プレパラートの薄膜電極２Ａ，２Ｂ、カバーガラス１１及びシリコンシールド層１２、検体液Ｌ１〜Ｌ４、測定条件、画像処理パラメーター等の詳細は次のとおりである。

〔薄膜電極２Ａ，２Ｂ〕
薄膜電極２Ａ，２Ｂの櫛歯電極部２１…各２０本、長さ１４ｍｍ、幅０．２３ｍｍ
電極間隙５…幅４０μｍ、深さ０．１５μｍ
電極間隙５と無電極領域５１とからなる凹部
…合計面積８３．１７ｍｍ² 、液容量０．０１２μｌ

〔カバーガラス１１，シリコンシールド層１２〕
カバーガラス１１…１８ｍｍ角、厚さ０．７５ｍｍ、面積３２４ｍｍ²
シリコンシールド層１２…厚さ０．１ｍｍ、内径１１ｍｍ、面積９４．９８５ｍｍ²

〔検体液Ｌ１〜Ｌ４〕
Escherichia coli JM109（大腸菌）を培養後に滅菌した菌分散液（血球計算板による測定菌数…４．７×１０⁷ 個／ｍｌ、導電率５μＳ／ｃｍ）をサンプルとし、これを菌濃度１×１０⁷ 個／ｍｌとなるように精製水で希釈して検体原液を調製し、この検体原液を菌濃度を血球計算板によって確認した上で、均一に分散させながら精製水で順次に希釈することにより、次の各菌数の検体液Ｌ１〜Ｌ４を調製した。
検体液Ｌ１…菌濃度１×１０⁶個／ｍｌ
検体液Ｌ２…菌濃度１×１０⁵個／ｍｌ
検体液Ｌ３…菌濃度１×１０⁴個／ｍｌ
検体液Ｌ４…菌濃度５×１０³個／ｍｌ

〔測定条件〕
検出領域Ｚ１…面積３４．８５９ｍｍ²
検出単位面Ｚ２…
面積０．０１０４ｍｍ² 、総数…５３枚×２１行＝１１１３面
誘電泳動力の及ぶ幅Ｅ…０．２７ｍｍ、領域Ｚ３の面積０．０３１３ｍｍ²
誘電泳動範囲容積…３．４８６μｌ
誘電泳動用の出力電圧…２０Ｖ、周波数１ＭＨｚ

〔画像処理パラメーター〕
電極間隙５に臨む両側の電極縁に付着した状態の粒子像中、次のサイズ範囲に入るものを大菌及び小菌と定義して識別した。計数は大菌と小菌の２段階の画像処理で行い、その大菌数と小菌数を合計して菌数としたが、１段階目で計数された粒子像は当然に２段階目では計数から除外されるように設定としている。
大菌・・・幅１．２〜６μｍ、高さ１．６〜１８μｍ
小菌・・・幅１．２〜６μｍ、高さ１．２〜６μｍ

表１及び図７の結果から、本発明の微粒子検出装置及び微生物検出方法によれば、検体液中に分散していた微生物を、誘電泳動力で誘引して電極間隙に臨む電極縁部に平面的に整列集合させて固定させ、これを光学顕微鏡の拡大視野に捉えて画像処理によって自動計数を行えることが判る。しかして、この自動計数による菌体の捕捉率は、４０％強〜６０％強程度であるが、菌濃度１０⁶ 個／ｍｌで５９〜６４％（平均６２％程度）を示すように、各菌濃度で変動が少なく比較的安定した値になることから、この捕捉率の平均値を測定の感度として捉え、自動計数で得られる値から実数に近い菌数を割り出すことも可能である。無論、画像処理のパラメーターをより適切に選択すれば、捕捉率（感度）を高め、更には実数と見なしうる程度まで計数精度を上げることも無理ではない。なお、実施例で微生物の検体液として滅菌サンプルを利用したのは、生菌では短時間でも繁殖・死滅による菌数変動が顕著で、データ比較の意味合いが薄れることによる。

本発明の一実施形態に係る微粒子検出装置の全体構成を示す模式図である。 同微粒子検出装置に用いる検出基板を示し、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＸ−Ｘ線における厚み方向を強調した断面矢視図である。 同検出基板の一方式による検出時の状態を示し、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＹ−Ｙ線における厚み方向を強調した断面矢視図である。 微粒子検出装置の光学顕微鏡による拡大視野のディスプレイ画面映像を示し、（Ａ）は誘電泳動前の映像図、（Ｂ）は誘電泳動後の映像図である。 検出基板における薄膜電極の櫛歯状パターン部を示し、（Ａ）は要部の平面図、（Ｂ）は（Ａ）の一点鎖線円Ｃ内の拡大図である。 同検出基板の他方式による検出時の状態を示し、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＺ−Ｚ線における厚み方向を強調した断面矢視図である。 本発明の実施例による菌数測定の捕捉率を示す特性図である。

符号の説明

１ 検出基板
１ａ ガラス板
１１ カバーガラス（透明性カバー板）
１２ シリコンシールド層
２Ａ，２Ｂ 薄膜電極
２０ 櫛歯状パターン部
２１ 櫛歯電極部
２１ａ 電極縁部
３ 誘電泳動制御ユニット（通電手段）
４ 光学顕微鏡
５ 電極間隙
６ ＣＣＤカメラ（撮影手段）
７ ディスプレイ
８ ＸＹＺステージ
９ 画像処理ボード（自動計数手段）
Ｅ 誘電泳動力が及ぶ幅
Ｐ 微粒子（微生物）
Ｚ１ 検出領域
Ｚ２ 検出単位面
Ｚ３ 誘電泳動力が及ぶ領域

Claims (9)

1. 上面に一対の薄膜電極を形成した検出基板と、両薄膜電極間に交流電界を印加する通電手段と、該検出基板上面の所定領域の拡大視野を得る光学顕微鏡とを備え、
   前記一対の薄膜電極は相互に噛み合うように配置する櫛歯状パターン部を有し、両薄膜電極の櫛歯状パターン部間に蛇行状の電極間隙が形成され、
   前記検出基板の上面に微粒子を含む検体液を展開させ、前記薄膜電極間に交流電界を印加することにより、検体液中の正の誘電泳動力による影響を受ける微粒子が前記電極間隙に臨む電極縁部に一端を付着して整列集合し、この整列集合状態を前記光学顕微鏡の拡大視野で捉えるように構成されてなる微粒子検出装置。
2. 前記光学顕微鏡による拡大視野を撮影して電気信号に変換して出力する撮影手段と、この撮影手段からの電気信号に基づいて前記拡大視野の映像を画面表示するディスプレイとを具備してなる請求項１に記載の微粒子検出装置。
3. 前記光学顕微鏡による拡大視野を前記電極間隙に沿って相対移動させる走査手段と、該拡大視野における電極縁部に整列集合した微粒子の数を画像処理によって計数する自動計数手段とを具備してなる請求項２に記載の微粒子検出装置。
4. 前記薄膜電極の厚さが０．１〜１μｍ、前記櫛歯状パターン部の櫛歯一本の幅が１０〜５００μｍ、前記電極間隙が１〜１００μｍである請求項１〜３のいずれかに記載の微粒子検出装置。
5. 前記請求項１〜４のいずれかに記載の微粒子検出装置を用い、その検出基板の上面に微生物を含む検体液を滴下し、この滴下液面上に透明性カバー板を被せて、前記薄膜電極間に交流電界を印加することにより、検体液中の微生物を正の誘電泳動力で前記電極間隙に臨む電極縁部に一端側が付着するように整列集合させ、この整列集合状態を前記光学顕微鏡の拡大視野で捉えることを特徴とする微生物検出方法。
6. 検出基板上に滴下した検体液中の微生物を、検出前の両薄膜電極間への交流電界の印加による予備誘電泳動で検出領域に濃集させる請求項５に記載の微生物検出方法。
7. 検出基板と透明性カバー板との間に環状のシリコンシールド層を介在させ、このシリコンシールド層の内側に検体液を封入する請求項５又は６に記載の微生物検出方法。
8. 検出基板の両薄膜電極間に交流電界を印加して誘電泳動を行いながら、該検出基板と透明性カバー板との間に検体液を通過させる請求項５〜８のいずれかに記載の微生物検出方法。
9. 交流電界を電圧１〜５０Ｖ、周波数５０Ｈｚ〜２００ＭＨｚの範囲で調整する請求項５〜８の何れかに記載の微生物検出方法。

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