JP2008161817A - 中空マイクロカプセルの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】単一の気泡からなり，好ましくは、殻の厚さが2μｍ以下である粒径１μｍから１０μｍの均一な中空のマイクロカプセルを、短時間に大量に安価に製造する方法を提供する。
【解決手段】水不溶性の高分子物質を含む水難溶性の有機溶剤溶液を、水媒体中に液滴として点在させた後，該液滴内部に気泡を発泡させ，気泡の周囲に殻となる水不溶性の高分子物質を凝集沈着させた後、有機溶剤を除去することにより中空マイクロカプセルを製造する。
【選択図】なし

Description

本発明は、微細な粒子径を有する中空のマイクロカプセルを製造する方法に関し、より詳しくは、医療用あるいは化学工業用として利用するのに好適な中空マイクロカプセルの製造方法に関する。

マイクロカプセルの製造方法には大きく分けて界面重合法、コアセルベーション法、界面沈殿法などがあり（例えば、非特許文献１参照）、原理的には微粒化した芯物質を適当な媒質中に分散し、次いで微粒子の膜で被覆する方法である。
界面重合法は、界面における重合反応をマイクロカプセル化に利用するもので、多くの場合に縮重合反応が利用される。例えば、油溶性モノマーとしては酸クロライド、セバコイルクロライド、テレフタル酸クロライド、水溶性モノマーとしてポリアミン、ポリフェノールを用い、壁物質としてポリアミドやポリエーテルを用いて重合反応を起こし被膜することができる。コアセルベーション法は相分離とそれに基づく界面化学的な変化を利用している。例としては、ゼラチン−アラビアゴムの組み合わせによるマイクロカプセルが有名である。界面沈殿法は温度やｐＨ等の条件の違いによる溶解度の差を利用して、液中に分散させた芯物質の表面に壁物質を付着させてカプセル化する方法である。

しかし、これらの方法はいずれも液体あるいは固体を芯物質として利用しており、気体を芯物質としてマイクロカプセル化、すなわち中空のカプセルを界面重合法、コアセルベーション法、界面沈殿法などで生成した例ではない。

一方、気体を芯物質とする中空マイクロカプセルの製造方法としては、液体を内包するマイクロカプセルを作製し、ついでその内部の液体を抽出して中空にする方法（例えば、特許文献１、２参照）、あるいは同様のマイクロカプセルを熱膨張させてマイクロカプセルを生成する技術（例えば、特許文献３）等が知られている。

しかし、従来の、液体を内包するマイクロカプセルを生成し、その内部の液体を外部に排出して中空にする方法では、液体の抽出のプロセスが複雑で、かつ排出方法によっては中空カプセルが球状を保てない場合もある。また、抽出等に時間がかかることから大量にマイクロカプセルを生産することは難しく、コストも高くなり、さらに微粒化が難しく大きさの均一性を整えることが困難であり、そのために長い時間を要することから生産効率が極めて低いといった、問題点がある。
一方、熱膨張を利用する方法では気体を急激に膨張させるという手段を講じる必要があり、またその原理上、１０μｍ以下のカプセルを作ることは難しく大きさもそろえることは困難であった。
また、これまでの通常のマイクロカプセルの製法では生成の初期において芯物質を乳化分散させる必要があった。

このような問題点を解消するために、本発明者等は、先に、「水に難溶性の液体中に水に不溶なマイクロカプセルの殻となる物質を少量溶解させ、その混合溶液を水中に乳化分散させた乳化液中に気泡を発生させ、該気泡の周囲に殻物質を凝集沈着させた、直径１μｍから１００μｍの中空のマイクロカプセルを製造する方法」を提案した（特許文献４）。

しかしながら、その後の本発明者等の検討によれば、この方法は、１０μｍ以下のサイズを持つ比較的均一な粒子を作成することはできるものの，発泡状態を制御することが難しく，多数の気泡が含まれたりあるいは全く含まれなかったりする場合があり、単一の気泡からなり、その粒径が小さく、かつ均一な中空マイクロカプセルの更なる製造方法の研究開発が必要であることが判明した。

監修 近藤保「最新マイクロカプセル化技術」（昭和６２年１２月２１日、総合技術センター発行）ｐ．３〜ｐ．３６ 特表平９−５０８０６７号公報 特開２００２−１０５１０４号公報 特公平３−７９０６０号公報 特願２００５−３７８４７５

本発明は、上記のような従来技術の実情に鑑みなされたものであって、その目的は、単一の気泡からなり，好ましくは、殻の厚さが2μｍ以下である粒径１μｍから１０μｍの均一な中空のマイクロカプセルを、短時間に大量に安価に製造する方法を提供することにある。

本発明者らは上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、本発明者らがすでに提案した上記特願２００５−３７８４７５に記載した方法を発展させ，マイクロカプセルの殻となる水不溶性の高分子物質を含む水難溶性の有機溶剤溶液を、水媒体中に、混合・乳化分散することなく、液滴として点在させた後，該液滴内部に気泡を発泡させると，意外にも内部に確実に単一の気泡を含み、殻の厚さが2μｍ以下であり、粒径１μｍから１０μｍの均一な中空のマイクロカプセルが得られることを見出し，これらの知見に基づき本発明をなすに至った。
すなわち、この出願によれば、以下の発明が提供される。
（１）水不溶性の高分子物質を含む水難溶性の有機溶剤溶液を、水媒体中に、液滴として点在させた後，該液滴内部に気泡を発泡させ，気泡の周囲に殻となる水不溶性の高分子物質を凝集沈着させた後、有機溶剤を除去することを特徴とする中空マイクロカプセルの製造方法。
（２）中空マイクロカプセルが、単一の気泡とそれを被覆する殻からなり、そのカプセル直径が１μｍから１０μｍの範囲内にあることを特徴とする（１）に記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
（３）液滴の直径が、中空マイクロカプセルの粒子径の１００〜１０００倍であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
（４）液滴内に均一な径を持つ多数の気泡を発泡させることを特徴とする（１）から（３）の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
（５）液滴内に加圧ガスを溶解させ、過飽和状態を維持させた後、減圧し過飽和状態を解除して発泡させることを特徴とする（４）に記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
（６）発泡後、液滴内の有機溶剤を除去することにより高分子物質の濃度を高め、気泡の周囲に高分子物質を凝集沈着させることを特徴とする（１）から（５）の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
（７）液滴が固化する前にその表面に生成する中空マイクロカプセルを分離することを特徴とする（１）から（６）の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
（８）水媒体が、液滴の融合防止剤を含有することを特徴とする（１）から（７）の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
（９）高分子物質が生分解性あるいは生体適合性を持つポリマーであることを特徴とする（１）から（８）の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
（１０）高分子物質の濃度を変化させ、マイクロカプセルの殻の膜厚を制御することを特徴とする（１）から（９）の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。

本発明によれば、たとえば、以下のような作用効果が奏せられる。
（１）マイクロカプセルの殻となる高分子物質（以下、殻物質ともいう）を含む有機溶剤の液滴を点在させ，液滴内部で発生させた微細気泡の各々の気液界面において殻物質を固化させて安定させることから、確実に単一の気泡を内部に含む中空のマイクロカプセルを製造することができ、品質と収率の大幅な向上が可能となる。
（２）粒径１μｍから１０μｍの均一な中空のマイクロカプセルを製造できることから，超音波による血管造影剤などにも適用可能である。実際，生分解性のポリマーの一種であるポリ乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)で作成した造影剤用の非球体ポーラス体（J. A. Straub et al., Porous PLGA microparticles: AI-700, an intravenously administered ultrasound contrast agent for use in echocardiography, Journal of Controlled Release 108(2005), pp. 21-32.）と比較しても，本カプセルは球体かつ均一な薄い殻を持つカプセルであることから，その音響特性はより優れたものになる。
（３）カプセルの殻として高分子物質を原料とするので、殻形成が迅速で、幅広い、種々の中空ポリマーマイクロカプセルに適用でき、生分解性のポリマーを殻物質にした中空マイクロカプセルも生成できる。
（４）高分子物質の濃度を変化させ、マイクロカプセルの殻の膜厚を制御することができる。

本発明の中空マイクロカプセルの製造方法は、マイクロカプセルの殻となる水不溶性の高分子物質を含む水難溶性の有機溶剤溶液を、水媒体中に、乳化分散することなく、液滴として点在させた後，該液滴内部に気泡を発泡させ，気泡の周囲に殻となる水不溶性の高分子物質を凝集沈着させた後、有機溶剤を除去することを特徴としている。

すなわち、本発明方法においては、まず、マイクロカプセルの殻となる水不溶性の高分子物質を含む水難溶性の有機溶剤溶液を、水媒体中に、乳化分散することなく、液滴として点在させる。
ここでいう、「有機溶剤溶液を水媒体中に、液滴として点在させる」とは、「混合操作や攪拌操作更には乳化分散する操作を行わずに、有機溶剤溶液を水媒体中に添加することにより、水媒体中に有機溶剤溶液の液滴を数多く点状に作製すること」を意味する。

このように、水媒体中に有機溶剤溶液を液滴として点在させて、発泡させると、後記の図１に示されるように、その内部に多数の均一な気泡が整然と発生する。また、液滴（滴状溶液）であることから、その粒径がエマルジョンの場合の比し極めて大きく、有機溶剤の乾燥速度や液滴の固化速度を遅くすることができる。
このため、本方法によれば、気泡径が著しく異なるマイクロカプセルや気泡が合一した不均一なマイクロカプセルあるいは気泡の全く存在しないカプセルの生成を防止することができ、単一の気泡からなり、その表面に殻物質が均一に被覆された中空マイクロカプセルを効率よく製造することができる。

この場合、殻物質を含む有機溶剤溶液の液滴ではなく、その水−乳化分散液（エマルジョン）や混合攪拌分散液を用いた場合には、気泡径が著しく異なるマイクロカプセルや気泡が合一した不均一なマイクロカプセルあるいは気泡の全く存在しないカプセルが生成してしまい、本発明のような適正な中空マイクロカプセルを得ることができない。

すなわち、殻物質を含む液滴に、発泡現象を利用してその内部に気泡を発生させると，図１に示すように液滴内部に大きさが１〜数μｍの均一な多数の気泡群を含む状態となる。これに対して、殻物質を含むエマルジョン分散液の場合には、図２に示すような不均一な気泡群を含む状態となる。
よって，１〜数μｍの均一な多数の気泡群を含む状態は，発生した気泡サイズより十分な大きさの液滴により達成できるが、エマルジョン分散液でこのような気泡群を内包することは困難となる。
また、１〜数μｍの均一な多数の気泡群を含む状態になった液滴内部では，殻物質が表面エネルギーの違いから気泡界面に凝集沈着し，速やかに該気泡の周囲に殻物質が取り囲み気泡表面が安定化し、このことにより容易にそのカプセル構造が壊れない状態が実現される。またエマルジョンに比べ液滴の直径が大きいので、有機溶剤の乾燥速度が遅くなり、固化速度も遅くなるために．中空マイクロカプセルを固化前に効率よく取得することができるが、エマルジョン分散液を用いた場合には、有機溶剤の乾燥速度が速いため、このような作用効果は奏することができない。

本発明において用いるマイクロカプセルの殻となる水不溶性の高分子物質としては、水に不溶であり、気泡の表面に被膜形成能を有するものであれば、いずれの高分子物質も使用できる。
このような高分子物質としては、たとえば、アクリル系樹脂、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリ塩化ビニリデン系樹脂、ポリ酢酸ビニル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトンおよびε−カプロラクトンと乳酸もしくはグリコール酸との共重合体、タンパク質などの生分解性あるいは生体適合性の高分子などが挙げられる。
本発明で好ましく使用される高分子物質は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸との共重合体、ポリ−ε−カプロラクトンおよびε−カプロラクトンと乳酸もしくはグリコール酸との共重合体、タンパク質などの生分解性あるいは生体適合性の高分子である。

本発明で用いる水難溶性の有機溶剤とは、水１００ｇに対する溶解度（２０℃で）が好ましくは５ｇ以下、より好ましくは２ｇ以下のものをいい、このような要件を満たすものあれば何れのものも使用できるが、低沸点（好ましくは沸点５〜５０℃）および易揮発性である塩素系有機溶剤たとえば塩化メチレン、クロロホルムなどが好ましく用いられる。

前記殻物質を含む水難溶性の有機溶剤溶液を調製するには、水難溶性の有機溶剤に殻物質を溶解させればよい。
有機溶剤に対する殻物質の使用濃度に格別の制限はないが、殻物質を水難溶性の有機溶剤に対し、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１〜１０質量％含有させる。この殻物質の濃度を調製することにより、中空マイクロカプセルの膜厚を所望により調製することができ、たとえば２mｍ以下のような薄いものとすることも可能である。

つぎに、本発明方法においては、前記殻物質を含む水難溶性の有機溶剤溶液の液滴を水媒体中に点在させる。点在させるに当たって留意すべきことは、有機溶剤溶液を水媒体に滴状に添加することである。滴状に添加する方法としては、たとえばマイクロシリンジによって静かに液体を導入して所望の液滴を生成するなどの方法が採られる。
界面活性剤を用いた乳化分散法や混合攪拌法では、所望の液滴を形成することができない。

本発明方法においては、水媒体、殻物質および有機溶剤の使用量に特に制限はないが、水媒体１００ｇに対し、有機溶剤及び殻物質を合計で２０ｇ以下、好ましくは１〜１０ｇの割合で用いることが好ましい。
また、本発明においては、上記液滴が水中で融合しないように，融合防止剤を添加することもできる。このような融合防止剤としては、界面活性効果を有するような機能を有する物質を選定すればよい。このような合体防止剤としては、たとえば、ポリビニルアルコール、胆汁酸塩，アルギン酸塩，ポリエチレングリコールなどが挙げられる。特に好ましいこの態様として、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液あるいは人体への影響の少ない胆汁酸塩水溶液を挙げることができ、その界面活性剤濃度は０．５〜２．０（質量）％が好ましい。

上記液滴の直径は、その内部に取り込まれる気泡の大きさ、水媒体−有機溶剤溶液界面の曲率比、気泡の浮力などを勘案して適宜定められるが、液滴が小さい場合には液滴からの有機溶媒乾燥速度が速すぎ，カプセルを液滴より取り出す前に固化してしまうこと，液滴が大きい場合は液滴が球形を保てずに水媒体−有機溶剤溶液界面の曲率比が大きくなり，浮力により気泡がカプセルより離脱しやすい状態となることなどの観点からみて、所望とする中空マイクロカプセルの粒径の５０〜５０００倍好ましくは１００〜１０００倍とすることが望ましい。

本発明方法においては、殻物質を含む水難溶性の有機溶剤溶液を水媒体中に乳化分散することなく、液滴として点在させた後，該液滴内部に気泡を発泡させる。
気泡を発泡させる手段に特に制限はなく、たとえば加圧ガスを溶液内に封入した後減圧する、加圧ガス封入法が好ましく使用される。

気泡となるガスは殻物質等に不活性なものであればどのようなものでもよく、たとえば窒素ガス、ヘリウムガス、水素ガス等が挙げられるが、取り扱いやコストの面から空気が最適である。
ガスの封入圧力に特に制限はないが、０．２０ＭＰａ（２気圧）以上、好ましくは０．３０ＭＰａ（３気圧）以上に保持するが、高くても２．０ＭＰａ（２０気圧）程度である。

本発明方法においては、ガスを液滴内に溶解した後、常圧まで減圧し、発泡現象を利用することにより大量の微細気泡を液滴内に作製することができる。
発泡状態が良好でない場合には、例えば超音波などの衝撃を与えることで、過飽和状態を解除すると、気泡の発泡性が改善され、多数の均一な気泡を形成することができる。

本発明方法においては、気泡を発生させた後、気泡の周囲に殻物質が凝集沈着するが、その後、有機溶剤を除去することにより中空マイクロカプセルを得ることができる。
気泡の周囲に殻物質を効率的に凝集沈着させるには、発泡後、たとえば、水媒体系に追加的な水（有機溶剤の溶解度を高めるための水）を添加し、液滴内の有機溶剤を水中に吸収（溶解）させ、液滴内の殻物質の濃度を高め、気泡の周囲に高濃度の殻物質を凝集沈着させることが好ましい。また、液滴が固化する前にその表面に存在する各中空マイクロカプセルの各々を，水溶液を静止させた状態でも問題はないが，液滴周囲に穏やかな流れを生成して表面に生じたカプセルを素早く離脱させる態様を採ることが望ましい。

得られた中空マイクロカプセルを含有する水溶液からの中空マイクロカプセルの分離はろ過などの分離手段によって容易によって行うことができる。

本発明方法によれば、使用した微細気泡とほぼ同様の粒径を持つ、中空マイクロカプセルを製造することができ、例えば、１μｍ〜１０μｍ程度の微細気泡を用いれば、これとほぼ同様の粒径を持つ中空マイクロカプセルを得ることができる。

また、本発明方法では、殻物質を含む液滴を点在させ，液滴内部で発生させた微細気泡の各々の気液界面において殻物質を固化させて安定させることから、確実に単一の気泡を内部に含む中空のマイクロカプセルを製造することができ、品質と収率の大幅な向上が可能となる。

また、直径１μｍから１０μｍの均一な中空のマイクロカプセルを製造できることから，超音波による血管造影剤などにも適用可能であり、従来品と比較しても，本カプセルは球体かつ均一な薄い殻を持つカプセルであることから，その音響特性はより優れたものになる。

また、カプセルの殻として高分子物質を原料とするので、殻形成が迅速で、幅広い、種々の中空ポリマーカプセルに適用でき、生分解性のポリマーを殻物質にした中空マイクロカプセルも生成できる。

更には、水難溶性有機溶剤中のポリマー濃度を変化させ、マイクロカプセルの殻の膜厚を制御することができる。
また、本発明の方法で得られる中空マイクロカプセルは、他のさまざまな用途に応用でき、化学工業用としては表面に触媒粒子等を吸着させることにより、沈降しない触媒として利用することができ、さらに、光の屈折率や透過率が中実の粒子と異なるため、光学材料あるいは化粧品等の分野にも応用することが可能である。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１
（１）３００ｍＬガラス圧力容器に濃度１％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液１００gを入れた。ポリ乳酸０．０１ｇを塩化メチレン５ｍＬに溶解させた溶液を，シリンジを用いて、上記ＰＶＡ水溶液中に滴下し，直径０．５mmから５mmの塩化メチレン溶液の液滴（液滴）（図３）を作製し，水溶液中に沈めた。このとき液滴を乳化分散および攪拌しないように操作した。
（２）つぎにガラス圧力容器内を０．４０ＭＰａ（４気圧）の空気で１時間加圧し，塩化メチレン液滴を含む水溶液中全体に空気を溶解させた。ガラス圧力容器を液滴同士が合体しないように静かに大気圧まで減圧し、塩化メチレン液滴中に数μｍのサイズを持つ多数の気泡を作製した（図１）。なお、超音波による圧力刺激を与えて泡を促進させた。
（３）ついで、塩化メチレンが水溶液に少量溶解する性質を利用して，水を添加し、塩化メチレン液滴内部から塩化メチレンを数時間程度かけて徐々に水に吸収させた。塩化メチレンが水に吸収されることにより，時間の経過と共に液滴サイズが小さくなるとともに液滴中のポリ乳酸の濃度が上昇した（図４）。また，吸収された塩化メチレンはその高い揮発性により大気中に蒸散した。
（４）この発泡で液滴内に生じた気泡の周囲には速やかにポリ乳酸が凝集沈着し，薄い殻を生成して安定することから，塩化メチレン吸収過程ともに液滴表面に一つの気泡を含んだ多数の中空カプセルが現れた（図５）。
（５）液滴内の塩化メチレンが全て吸収され完全に固まる前に，表面に現れた中空カプセルを水溶液中に分離放出させることにより，一つの液滴より直径が１μｍ〜１０μｍの多数の中空カプセルを得ることができた。
（６）塩化メチレンが全て水に吸収され，大気中に蒸散した後，水溶液中には最終的にポリ乳酸を殻物質とする中空マイクロカプセルと５０μｍ〜２００μｍの大きさを持つポリ乳酸中実粒子が生起した。図６にポリ乳酸中実粒子を示す．表面がクレーター状になっており，カプセルが分離した形跡がしっかりと残っていることが分かる。
（７）フィルターを用いてポリ乳酸粒子を濾別し、濾液中の水分を蒸散させて生成した中空マイクロカプセルを得た。
得られた中空マイクロカプセルの粒径分布を，図５に示した顕微鏡写真より，表面に生じたカプセル直径を直接測定して求めた．その結果を図７に示す。図７から、粒径分布が均一でほぼ１０μｍ以下のサイズとなっていることがわかる。
なお、ポリ乳酸に水に溶解しない蛍光物質を含有させて作成した本中空マイクロカプセルの蛍光写真を図８に示す。蛍光している部分がポリ乳酸の存在する部分である。図８から、本カプセルはその内部に一つの気泡を含み、殻の厚さが２μｍ〜１０μｍの気泡から形成されていることがわかる。

塩化メチレン液滴内に発生する気泡の状態説明図 ポリ乳酸を含む塩化メチレン溶液の乳化分散液を用いて得た中空マイクロカプセルの光学顕微鏡写真 気泡を発生させる前の塩化メチレン液滴の説明図 塩化メチレン液滴の直径の経時変化を収めた光学顕微鏡写真 塩化メチレン液滴表面に生成する、単一の気泡からなる多数の中空マイクロカプセルの光学顕微鏡写真 ポリ乳酸中実粒子の走査型電子顕微鏡写真 本中空マイクロカプセルの粒径分布の測定図 蛍光物質を含有するポリ乳酸から得られた中空マイクロカプセルの蛍光画像

Claims (10)

1. 水不溶性の高分子物質を含む水難溶性の有機溶剤溶液を、水媒体中に液滴として点在させた後，該液滴内部に気泡を発泡させ，気泡の周囲に殻となる水不溶性の高分子物質を凝集沈着させた後、有機溶剤を除去することを特徴とする中空マイクロカプセルの製造方法。
2. 中空マイクロカプセルが、単一の気泡とそれを被覆する殻からなり、そのカプセル直径が１μｍから１０μｍの範囲内にあることを特徴とする請求項１に記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
3. 液滴の直径が、中空マイクロカプセルの粒子径の１００〜１０００倍であることを特徴とする請求項１又は２に記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
4. 液滴内に均一な径を持つ多数の気泡を発泡させることを特徴とする請求項１から３の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
5. 液滴内に加圧ガスを溶解させ、過飽和状態を維持させた後、減圧し過飽和状態を解除して発泡させることを特徴とする請求項４に記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
6. 発泡後、液滴内の有機溶剤を水中に吸収させることにより高分子物質の濃度を高め、気泡の周囲に高分子物質を凝集沈着させることを特徴とする請求項１から５の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
7. 液滴が固化する前にその表面に生成する中空マイクロカプセルの各々を分離することを特徴とする請求項１から６の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
8. 水媒体が、液滴の融合防止剤を含有することを特徴とする１から７の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
9. 高分子物質が生分解性あるいは生体適合性を持つポリマーであることを特徴とする請求項１から８の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。
10. 高分子物質の濃度を変化させ、マイクロカプセルの殻の膜厚を制御することを特徴とする請求項１から９の何れかに記載の中空マイクロカプセルの製造方法。