JP2008070187A - 表面プラズモンによるイオン化を利用した質量分析 - Google Patents

Abstract

【課題】本願発明の目的は、これら表面プラズモンによる表面増強効果をイオン化に利用することにより、高感度（電磁効果）でソフト（化学効果）なイオン化を行うことである。
【解決手段】本願発明においては、試料に金のコロイドを混合し、乾燥させ、その状態において、レーザー光を照射し、金の粒子の表面にプラズモンを励起し、そこに生じた電場により、金に付着した試料をイオン化して、質量分析を行うものである。また、用いる基板は、金コロイドを用いているため、平滑基板である必要はなく、どんな角度でも一様に表面プラズモンを励起できる。入射レーザーの条件は、レーザーを当てることが出来ればどんな入射でも問題はない。金コロイドの場合、520nm付近に表面プラズモン吸収波長があるが、その付近（本件では532nm)のレーザー光を当てさえすれば励起可能である。
【選択図】 図４

Description

本願発明は、MALDI−MS（Matrix Assisted Laser Desorption／Ionization-Mass Spectrometry：マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法）などに代表されるレーザー脱離質量分析法に関し、特に、イオン化するに当たり、表面プラズモンによる表面増強効果を利用するものである。

レーザー脱離-質量分析法（Laser Desorption Mass Spectrometry：LD-MS）は、１９８０年代に注目され、主に金属や半導体などの表面分析に用いられてきた。レーザーを用いているため、レンズを用いて容易に集光が可能であり、微小領域の分析が可能である。また、試料を容易にイオン化することが可能であり、広範囲の試料種に対応することが可能である。

しかしながら、イオン化効率が低く、また、目的分子を解離させてしまうなどの欠点を持っており、巨大分子の測定が不可能とされていた。

そのような背景の中、たんぱく質などの巨大分子を分析する手法の一つとして、２００２年のノーベル化学賞受賞者である田中耕一が開発したMALDI―TOF―MS（マトリックス支援レーザー脱離-飛行時間型-質量分析）を筆頭にソフトなLDI法が次々に開発された。

ソフトなＬＤＩ法においては、試料分子は照射レーザーエネルギーを吸収する吸収体を経由してイオン化に必要なエネルギーを間接的に受け取る。

該吸収体は、MALDI法においてはマトリックス分子であり、DIOS（Desorption/Ionization on Silicon)法においては、多孔質シリコン基板であり、その他にも、焦電性基板、ゲルマニウムドット基板など多種のものが開発されている。

しかしながら、間接的なエネルギー供給によるイオン化機構については詳細が明らかになっていない。

提案されているイオン化機構としては、急速な熱の移動あるいは電荷の相互作用が定性的に論じられているのみであり、それらがソフトなイオン化に効果的であることが報告されている。

本件発明においては、ソフトなイオン化のために、表面プラズモン（Surface Plasmon: SP）による増強効果を利用する。表面プラズモン（SP）励起により誘起される電場増強効果は、Raman散乱信号やIR吸収強度等といった入射電場の大きさに依存する信号を飛躍的に増強させる効果として知られている。

例えば、表面増強ラマン散乱効果（Surface-Enhanced Raman Scattering : SERS)の場合では、表面プラズモンにより誘起された電場増強効果により1000〜10000倍の増強、表面プラズモンにより基板表面にたたき出された電荷の移動効果により10〜100倍の増強が確認されている。また、分子レベルの領域においてはさらに数桁の増強効果が報告されている。単分子レベルの信号取得への研究も開始されている。

ところで、表面プラズモンとは、光励起により金属表面において生じる自由電子の集団振動である。表面プラズモン励起を生じる金属としては、金、銀、銅、リチウム、カルシウム、ナトリウム等であり、励起波長は、金属に固有である（金の場合は、520nm）。励起条件としては、サブミクロンあるいは原子スケールの表面粗さが必要である。

図１にその状況を模式的に示す。表面粗さの極限の例として、金属ナノ微粒子に対して、励起光が照射されると、該微粒子の表面にプラズモンが励起され、増強電場が誘起される。その電場は、金属ナノ微粒子表面から急激に減衰するため、粒径程度の極微小空間のみに存在する。

図２に、金属ナノ微粒子の表面に試料の分子が付着している様子を模擬的に示す。金属ナノ微粒子表面近傍に存在する分子でも、第一層に吸着している分子のみは電荷のやり取り（電荷の相互作用）を行える関係にある。いわゆる化学的な（あるいは化学的な吸着に近い状態）吸着をしている。第二層目以降は物理的に重なっているだけであるため、電荷の相互作用は行われない。

表面プラズモンの効果としては、励起光によって金属上で表面プラズモンの共鳴励起が生じ、金属表面上の極近傍（≦100nm)領域の電界強度が増大し、金属表面と吸着分子との間において電荷の相互作用が生じる。本件発明は、この表面プラズモンによる表面増強効果を試料のイオン化に利用することで、高感度（電磁効果）でソフト（化学効果）なイオン化を達成する。

なお、従来技術として、表面プラズモン共鳴法を質量分析に利用したものがある（下記特許文献１参照）。この文献に記載された発明においては、金属基板に裏側から全反射条件を満たしつつ表面プラズモンを励起し、表面に吸着した分析物などの影響により変化する反射光強度をモニタリングするものである。その強度変化と励起光の入射角度との間に一定の相関関係を得ることができる。この場合、用いる基板は平滑な基板を用いる必要がある。その理由は、平滑でない基板を用いると角度依存性が得られないからである。この手法においては、表面に捕捉した分析物により表面プラズモンの励起条件が変化するため入射角度の依存性が現れる。その変化が分析物の種類に依存するため、分析手法として用いられている。この手法は、高感度であるため、注目されている。
特表平１１−５１２５１８

しかし、上記方法は、あくまでも分析手法であり、イオン化を目的とするものではない。本願発明の目的は、これら表面プラズモンによる表面増強効果をイオン化に利用することにより、高感度（電磁効果）でソフト（化学効果）なイオン化を行うことである。

本願発明においては、試料に金のコロイドを混合し、乾燥させ、その状態において、レーザー光を照射し、金の粒子の表面にプラズモンを励起し、そこに生じた電場により、金に付着した試料をイオン化して、質量分析を行うものである。

また、用いる基板は、平滑基板である必要はなく、どんな角度でも一様に表面プラズモンを励起できる金コロイドを用いているため、入射レーザーの条件は、レーザーを当てることが出来ればどんな入射でも問題はない。金コロイドの場合、520nm付近に表面プラズモン吸収波長があるが、その付近（本件では532nm)のレーザー光を当てさえすれば励起可能である。コロイドが球体であるため角度依存性は、全くない。

（１）表面プラズモンを誘起しうる金コロイドを添加することにより飛躍的に検出限界を向上させた。
表面プラズモンによる影響が高効率なイオン化に非常に有効であり、その結果、検出限界をアトモル領域から数100ゼプトモルまで向上させることが可能となり、従来法では測定できないような極微量分子の検出への応用展開の可能性を示した。

（２）金コロイド表面に直接吸着している分子が特に高効率でイオン化された。
電荷の授受がイオン化過程に寄与していることを示した。今回の4糖の試料においては、2糖のフラグメントピークが観測されたが、試料分子を複雑に壊すことなく検出することに成功したことは、ソフトイオン化への応用展開において非常に意義のある結果である。

以下に、本願発明を実施するための最良の形態を示す。

＜試料の調整＞
Ｎ−アセチル−キトテトラオース（４糖）２μｌ（濃度：１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ 溶媒：水）に５０ｎｍ金コロイド微粒子２μｌ（BBI社製 4.5×10¹⁰ 個/ml、表面プラズモン励起波長は520 nm付近）を混合し、その内の２μｌを試料台に塗布し、乾燥させた。

該試料を測定装置（図３参照）にセットし、マススペクトルを測定した。
励起光は、Ｎｄ／ＹＡＧレーザーであり、図３の測定装置の左下から、斜めに照射し、プリズムで反射させ中央部の試料台を照射する。その後、試料台から反射された光を、プリズムを通し外へ導く。試料は、励起光により励起され、イオン化され、リニア飛行時間型質量分析計により測定された。

＜測定条件＞測定条件は、以下のとおりである。
Nd:YAG 532 nm/10 Hz
300μJ/pulse
加速電圧： 4.0 kV（1段目）
2.8 kV（2段目）
MCP電圧： 1.90kV
飛行距離： 450 mm
検出器： MCP
真空度 ≦１×10^-4 Pa order
delay 3μs
パルス幅 3μs
データ積算 64 回平均

＜測定結果＞
図４には、金コロイド微粒子（粒径50 nm） 4.5×10⁷ 個を添加した場合のN-アセチル-キトテトラオース（4糖）の種々の濃度におけるＬＤＩマススペクトルが示されている。この図から明らかなことは、試料濃度と観測された試料（2糖）由来の信号強度は、比例せず、低試料量（LDIでの検出限界以下）において非常に高感度であった。

また、図５には、イオン信号の検出限界の測定結果が示されている。金コロイド微粒子（粒径50 nm） 4.5×10⁷ 個を添加した場合のN-アセチル-キトテトラオース（4糖）の検出限界は、27.7 amol (0.4分子/金コロイド１個）であった。

試料の滴下面積と濃度からコロイド表面に吸着した分子数を見積もった結果、コロイド表面に吸着分子が一層（数1000分子/金コロイド1個）以下存在する条件のときに試料由来のイオンが検出された。このレベルの試料量の測定例は、非常に稀であり、従来法の検出限界をはるかに凌駕している。

＜参考例１＞図６には、N-アセチル-キトテトラオース 1 pmolの試料に金コロイド微粒子を添加しない場合のLDIマススペクトルが示してある。この図から明らかなように、LDIでは試料由来のイオンは検出されなかった。本装置では1 pmolという試料量のLDIは、検出限界以下である。

＜参考例２＞図７には、金コロイド微粒子粒径5nmを用いたLDIマススペクトルが示されている。この試料は、Ｎ−アセチル-キトテトラオース：10 fmol、金コロイド微粒子（粒径5nm）：8.3fmolである。この図から明らかなように、粒径5nmの金コロイド微粒子においては、表面プラズモンを生じないことが知られている。したがって、表面プラズモンを誘起しうる金コロイドのみが有効であり、試料の高効率なイオン化において表面プラズモンが非常に有効であることを示している。

以上のことから、金コロイドを添加することにより飛躍的に検出限界を向上させることに成功した。また、金コロイドの添加により、試料のイオン化過程において何らかの影響を与えていることを示された。また、検出限界をアトモル（10^-18モル）領域から数100ゼプトモル（1ゼプトモル＝10^-21モル）まで向上させることが可能であることも示唆している。

金コロイド表面に直接吸着している分子が特に高効率でイオン化された。増強電場の効果では、金コロイド表面に吸着している分子が数層から数十層でも影響を及ぼすはずではあるが、一層以下において特に高効率でイオン化がなされている。従って、金コロイドと直接的に相互作用をしていることを示している。

試料としてテトラフェニルポルフィリン（TPP；分子量=614.7478）を用いた。シリコン基板上に金ナノ微粒子（60 nm）を固着させ（図８に、SEM像を示す。金ナノ微粒子の密度は、数10個/10μm×10μm程度という非常にわずかな量である。）、その基板表面にTPPを全量1 fmol塗布した。作製した試料に対してLDI測定（測定条件は実施例１に同じ）を行ったところ、図9に示すマススペクトルが得られた。分子関連イオンも観測され、ソフトな（解離しない）イオン化を高感度に達成した。

金属微粒子に励起光が照射されると電場が誘起される様子を模擬的に示した図 金属微粒子に分子が吸着されている様子を模擬的に示した図 本願発明に係る試料を測定した装置の概略図 本願発明に係るN-アセチル-キトテトラオースの種々の濃度におけるＬＤＩマススペクトル イオン信号の検出限界測定例 金属微粒子未添加のN-アセチル-キトテトラオースＬＤＩマススペクトル 金コロイド微粒子粒径５ｎｍを用いた場合のN-アセチル-キトテトラオースＬＤＩマススペクトル 粒径６０ｎｍの金コロイドの付着の様子を撮影したＳＥＭ写真 テトラフェニルポルフィリン（TPP）のＬＤＩ測定結果

Claims (4)

1. レーザー脱離質量分析法において、金属の微粒子が混合された試料に対し、該金属に固有の波長の励起光を照射することにより、該微粒子表面にプラズモンを励起し、該プラズモンにより該試料をイオン化し、質量分析することを特徴とするレーザー脱離質量分析法。
2. 上記金属は、金、銀、銅、リチウム、カルシウム又はナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載のレーザー脱離質量分析法。
3. 上記微粒子は、金のコロイドであることを特徴とする請求項１に記載のレーザー脱離質量分析法。
4. 上記微粒子に対して、１層の上記試料分子が吸着するように設定したことを特徴とする請求項１に記載のレーザー脱離質量分析法。