JP2008029320A5 - - Google Patents
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Claims (15)
- 生体から採取された細胞の細胞膜に存在する膜貫通型のキナーゼの活性を測定する方法であって、
前記細胞を緩衝液中で破砕した破砕液を直接遠心分離し、沈殿物を取得する工程と、
得られた沈殿物と、界面活性剤とを混合する工程と、
得られた混合液を遠心分離し、上清を採取することにより、膜貫通型キナーゼを含む試料を調製する工程と、
前記試料中の膜貫通型キナーゼとこれに対応する基質とを接触させ、前記膜貫通型キナーゼの活性により基質をリン酸化させる工程と、
標識物質を前記リン酸化した基質（リン酸化基質）に結合させる工程と、
前記リン酸化基質に結合した標識物質の検出結果に基づいて前記膜貫通型キナーゼの活性を測定する工程と、
を含む測定方法。 - 前記緩衝液のpHが4.0〜9.0である請求項１に記載の測定方法。
- 前記界面活性剤が、前記膜貫通型キナーゼと実質的に結合しない非イオン性界面活性剤である請求項１または２に記載の測定方法。
- 前記基質がアフィニティータグを有し、
前記アフィニティータグを有する基質と、前記アフィニティータグと結合可能な結合物質を有する固相とを接触させて複合体を形成させる工程と、
この複合体を回収する工程と、
結合物質とアフィニティータグとの結合を解離させることにより、前記複合体から前記基質を回収する工程とをさらに含む請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。 - 前記標識物質が、前記リン酸化基質に結合することができる一次抗体と、前記第一抗体に結合することができる二次抗体と、を介して前記リン酸化基質に結合する請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
- 前記膜貫通型キナーゼが膜貫通型チロシンキナーゼである請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法。
- 前記膜貫通型チロシンキナーゼが、インシュリン様成長因子受容体（insulin-like growth factor receptor；IGFR）、血小板由来増殖因子受容体（platelet-derived growth factor receptor；PDGFR）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（human epithelial growth factor receptor；HER）及び血管内皮増殖因子受容体（vascular endothelial growth factor；VEGFR）からなる群より選択される少なくとも1つである請求項６に記載の測定方法。
- 前記基質が、膜貫通型チロシンキナーゼに対応する基質である請求項６または７に記載の測定方法。
- 前記基質が、増殖因子受容体結合タンパク質2（Grb2）、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ヒストンH2B（HH2B）、及びホスホリパーゼC ガンマからなる群より選択される少なくとも1つである請求項８に記載の測定方法。
- 前記基質が、複数種類の膜貫通型チロシンキナーゼによりリン酸化されうる基質である請求項８に記載の測定方法。
- 前記基質が、グルタミン酸残基及びチロシン残基を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含む請求項１０に記載の測定方法。
- 前記アミノ酸配列が、
グルタミン酸残基及びチロシン残基からなり、グルタミン酸残基とチロシン残基の比率が４：１であるアミノ酸配列A、
グルタミン酸残基及びチロシン残基からなり、グルタミン酸残基とチロシン残基の比率が１：１であるアミノ酸配列B、
グルタミン酸残基、チロシン残基及びアラニン残基からなり、グルタミン酸残基とアラニン残基とチロシン残基の比率が６：１：３であるアミノ酸配列C、
グルタミン酸残基、チロシン残基及びアラニン残基からなり、グルタミン酸残基とアラニン残基とチロシン残基の比率が１：１：１であるアミノ酸配列D、及び
グルタミン酸残基、チロシン残基、アラニン残基及びリジン残基からなり、グルタミン酸残基とチロシン残基とアラニン残基とリジン残基の比率が２：１：６：５であるアミノ酸配列E、
からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１１に記載の測定方法。 - 前記標識物質が、蛍光または酵素である請求項１〜１２のいずれかに記載の測定方法。
- 細胞の細胞膜に存在する膜貫通型キナーゼの活性を、請求項１に記載の方法により測定して第1の測定結果を取得し、
膜貫通型キナーゼ阻害剤と接触させた前記細胞の前記膜貫通型キナーゼの活性を、請求項１に記載の方法により測定して第2の測定結果を取得し、
第1及び第2測定結果に基づいて細胞に対する膜貫通型キナーゼ阻害剤の影響を推定することを特徴とする膜貫通型キナーゼの阻害剤の影響を推定する方法。 - 細胞の細胞膜に存在する膜貫通型キナーゼの活性を、請求項１に記載の方法により測定して第1の測定結果を取得し、
膜貫通型キナーゼリガンドと接触させた前記細胞の前記膜貫通型キナーゼの活性を、請求項１に記載の方法により測定して第2の測定結果を取得し、
第1及び第2測定結果に基づいて細胞に対する膜貫通型キナーゼリガンドの影響を推定することを特徴とする膜貫通型キナーゼリガンドの影響を推定する方法。
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