JP2007537847A - 熱反応デバイスおよびその熱反応デバイスの使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、以下の出願の各々に対する優先権を主張する:
2005年2月14日に出願された米国特許出願第11/058,106号;2005年1月25日に出願された米国特許第11/043,895号;2004年6月23日に出願された米国特許出願第10/876,046号;および2004年5月2日に出願された米国特許第10/837,885号。これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
本願はまた、2004年4月5日に出願された米国特許出願第10/818,642号;2003年4月3日に出願された米国仮特許出願第60/460,634号;2004年4月5日に出願された米国特許出願第10/819,088号;2004年4月5日に出願された米国特許出願第10/818,642号;2002年11月27日に出願された米国特許出願第10/3306,798号;2002年6月24日に出願された米国仮特許出願第60/391,529号;および米国仮特許出願第60/335,292号にも関連する。これらの各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。
近年、種々の化学的および生化学的な分析および合成(いずれも調製的用途および分析的用途のため)を実施する微小流体システムを開発および製造するための協調した努力がなされている。マクロ規模で実施される分析および合成に対して微細化によって現実化され得る顕著な利益から、このようなデバイスを作製するという目標が生じている。このよな利益としては、分析または合成を行うために利用されるデバイスのために必要とされる実質的な時間、経費および空間の減少が挙げられる。さらに、微小流体デバイスは、自動システムと一緒に使用するのに適合しており、それによってさらなる経費削減および人の関与の減少による操作者の誤差の減少というさらなる利益を提供するという潜在性を有する。微小流体デバイスは種々の用途における使用が提唱されており、その用途としては、例えば、キャピラリー電気泳動、ガスクロマトグラフィーおよび細胞分離が挙げられる。
熱サイクリング反応(例えば、核酸増幅反応)を行うために使用され得るデバイスを含む、微小流体分析を行うための種々のデバイスおよび方法が本明細書中において提供される。このデバイスは、エラストマー構成要素を備える点で従来の微小流体デバイスとは異なり、いくつかの例では、このデバイスのほとんどまたは全てがエラストマー材料から構成される。
(i)エラストマー基板に形成された第一の複数のフローチャネル、
(ii)第一の複数のフローチャネルと交差してアレイの反応部位を規定する、エラストマー基板に形成された第二の複数のフローチャネル、
(iii)第一および第二の複数のフローチャネル内に配置された複数の隔離バルブであって、このバルブが駆動されて各反応部位内の溶液を他の反応部位における溶液から隔離する、隔離バルブ、ならびに
(iv)1つ以上のフローチャネルおよび/または1つ以上の反応部位に重なり、反応部位からの溶液の蒸発を防ぐ、複数の保護チャネル、
を備える。
(I.定義)
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する:Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(第2版、1994);THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker編、1988);THE GLOSSARY OF GENETICS、第5版、R.Riegerら(編)、Springer Verlag(1991);およびHale & Marham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。本明細書中で使用される場合、以下の用語は、そうでないと明記されない限り、それらに属する意味を有する。
これらの用語間に意図される長さの差異は存在しない。さらに、これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、特定の実施形態において、これらの用語は、三本鎖DNA、二本鎖DNAおよび一本鎖ならびに三本鎖RNA、二本鎖RNAおよび一本鎖RNAを包含し得る。これらはまた、メチル化またはキャッピングによるような改変形態および非改変形態のポリヌクレオチドも包含する。より具体的には、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシヌクレオチド(2−デオキシ−D−リボースを含む)、ポリリボヌクレオチド(D−リボースを含む)、N−グリコシドまたはC−グリコシドのプリンまたはピリミジン塩基である任意の他の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー(例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸(PNA))およびポリモルホリノ(Anti−Virals,Inc.、Corvallis、Oregon、Neugeneとして市販されている)、ならびにDNAおよびRNAにおいて見られるような塩基対合および塩基堆積を可能にする構成で核酸塩基を含むポリマーを提供する他の剛性配列特異的核酸ポリマー)を包含する。
独自とフローチャネル構造を有する多数の異なる微小流体デバイス(ときにチップとも呼ばれる)が、本明細書中で提供され、同様に種々のハイスループット分析を行うためのそのようなデバイスの使用も提供される。このデバイスは、温度制御を必要とする分析、特に熱サイクリング(例えば、核酸増幅反応)に関する分析における使用のために設計される。この微小流体デバイスは、特定の設計の特徴を組み込み、この特徴は、多くの従来の微小流体デバイスよりも顕著に小さいフットプリントを与え、そのデバイスが他の寄付に容易に統合されるのを可能にし、自動化された分析を提供する。
(A.ポンプおよびバルブ)
本明細書中に開示される微小流体デバイスは、代表的に少なくとも一部は、エラストマー材料から構成され、単層および多層のソフトリソグラフィ(MSL)技術および/または犠牲層カプセル化法(sacrificial−layer encapsulation methods)により構築される(例えば、Ungerら、(2000)、Science 288:113−116およびPCT公開WO 01/01025、これらは両方とも全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される)。このような方法を利用して、微小流体デバイスは、そのデバイスのフローチャネルを通って流れる溶液が少なくとも一部は、エラストマー膜またはセグメントによりフローチャネルから分離された一つ以上の制御チャネルで制御されるように設計され得る。この膜またはセグメントは、フローチャネル内に偏向され得るか、またはフローチャネルから引っ込められ、そのフローチャネルには、制御チャネルに作動力を適用することによって制御チャネルが結合されている。膜が、フローチャネル内に偏向されるか、またはフローチャネルから引っ込む程度を制御することによって、溶液の流れは、遅くなり得るか、またはフローチャネルを通して完全に遮断され得る。Ungerら(2000)Science 288:113−116およびPCT公開WO/02/43615およびWO 01/01025に広範に詳細に記載されるように、この型の制御チャネルおよびフローチャネルの組み合わせを使用して、溶液の流れを調節するための種々の異なる型のバルブおよびポンプを作製し得る。
本明細書中に提供されるエラストマー微小流体デバイスからのサンプルおよび試薬の蒸発を減少させるために、複数の保護チャネルが、そのデバイス中に形成され得る。この保護チャネルは、代表的にフローチャネルおよび/または反応部位を覆うエラストマーの層に形成される点で制御チャネルに類似している。従って、制御チャネルと同様に、保護チャネルは、その下にあるフローチャネルおよび/または反応部位から、エラストマー物質の膜またはセグメントにより分離される。しかし、制御チャネルとは違って、保護チャネルは、断面積はかなり小さい。一般に、より小さい面積を有する膜は、同じ圧力下では、より大きい面積の膜より偏向が小さい。保護チャネルは、溶液(代表的に水)が保護チャネル内に流動することを可能にするような圧力に設計される。保護チャネルに由来する水蒸気は、フローチャネルまたは反応部位に隣接するエラストマーの細孔に拡散し得、従って、フローチャネルまたは反応部位に隣接する水蒸気の濃度を増加させ、そこからの溶液の蒸発を減少させる。
(概要)
マトリクス設計を使用するデバイスは、一般的に、アレイの接合部を形成するように交差する複数の垂直フローチャネルおよび水平フローチャネルを有する。種々のサンプルおよび試薬(または試薬のセット)が、それぞれのフローチャネルに導入され得るので、多数のサンプルが、比較的多数の反応条件に対して高スループットフォーマットで試験され得る。従って、例えば、異なるサンプルがM個の異なる垂直フローチャネルのそれぞれに導入され、異なる試薬(または試薬のセット)が、N個の異なる水平フローチャネルのそれぞれに導入される場合、M×N個の異なる反応が、同時に行なわれ得る。代表的に、マトリクスデバイスは、垂直フローチャネルおよび水平フローチャネルの切替可能な分離を可能にするバルブを備える。別の言い方をすると、バルブは、垂直フローチャネルまたは水平フローチャネルのみを通って選択的に流れることを可能にするように配置される。この型のデバイスは、サンプルの型および数、ならびに試薬の数および型の選択に関して可撓性を可能にするので、これらのデバイスは、比較的多数の反応条件に対して多数のサンプルのスクリーニングが所望される分析を行なうのに十分に適している。マトリクスデバイスは、サンプルおよび反応物の蒸発の防止を補助するために、必要に応じて保護チャネルを組込み得る。
図1Aは、一つの例示的なマトリクスデバイスの例証を提供する。このデバイス100は、7個の垂直なフローチャネル102および7個の水平なフローチャネル104を備え、これらは交差し、49個の異なる交差点のアレイすなわち反応部位106を形成する。従って、この特定のデバイスは、7個のサンプルが、7個の異なる試薬または試薬のセットと反応することを可能にする。垂直な向きの溶液の流れを調節する行バルブ110は、単一の注入口114で全て作動され得る制御チャネル118により制御され得る。
(A.概略)
ブラインドチャネル設計を利用するデバイスは、特定の特徴を有する。第一に、そのデバイスは、一つ以上のブラインドチャネルが枝分かれする一つ以上にフローチャネルを備える。上に示したように、このようなチャネルの末端領域は、反応部位としての役目を果たし得る。フローチャネルを覆うことにより形成されるバルブは、ブラインドチャネルの末端で反応部位を分離するために作動され得る。バルブは、反応部位を切替可能に分離するための機構を提供する。
なお他のデバイスは、マトリクスのハイブリッドおよびブラインドフィル設計である。この型のデバイスの設計は、各水平フローチャネルがそれ自体のサンプル注入口ポートに接続し、水平フローチャネルが垂直フローチャネルを介して相互接続していないことを除いて、図3Aに示すブラインドチャネルデバイスに類似している。結果的に、任意の所定の水平フローチャネルに導入されたサンプルは、その水平フローチャネルおよびそれに接続する反応部位のみを満たす。それに対して、図3Aに示すブラインドフローチャネルデバイスにおいて、サンプルは、垂直フローチャネル302を介して水平フローチャネル304の間に流れ得る。
(A.デバイスおよび構成要素)
微小流体デバイスの選択された領域またはそのデバイス全体の温度を制御するために、種々の精巧さの多数の異なる選択肢が利用可能である。従って、本明細書中で使用される場合、用語温度コントローラーは、微小流体デバイス全体または微小流体デバイスの一部内(例えば、特定の温度領域内で、またはブラインドチャネル型微小流体デバイスのマトリクス内の一つ以上の接合部で)の温度を調節し得るデバイスまたは要素を広くいうことを意味する。
下記の製作のセクションでより詳細に記載されるように、ブラインドチャネルデバイスは、試薬が配置される基底層を有する。フローチャネルおよび制御チャネルを備える2つの層を含む構造は、上記フローチャネルが沈積された試薬と整列するように基底層上の表面を覆う。次いで、この基底層の反対側は、基材(例えば、ガラス)上に配置される。通常、反応が起こる反応部位は、基材/ガラスの界面から約100〜150ミクロン上である。熱拡散率についての公知の式および上記デバイスに利用されるエラストマーおよびガラスについて適切な値を使用して、反応部位内の温度がコントローラーが維持する温度に達するために必要とされる時間を計算し得る。表1に示される計算値は、反応部位が約100〜150ミクロンであるデバイス(すなわち、本明細書において記載されるデバイスについての代表的な距離)において利用されるものよりもかなり厚いエラストマーおよびガラスの層を使用した場合でさえも、その温度が迅速に達成されることを実証する。
(A.概要)
多くの異なる検出ストラテジーが、本明細書において提供される微小流体デバイスを用いて利用され得る。適切なシステムの選択は、事象の型および/または検出される試薬に関して部分的に知られている。検出器は、多くの異なるシグナル型を検出するために設計され得、これらのシグナル型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:放射性同位体、フルオロフォア、発色団、電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を発する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補因子、核酸プローブおよび酵素基質に連結された酵素からのシグナル。
(1.介在性色素)
二本鎖DNAへの結合の際にのみ蛍光を発する特定の介在性色素が、二本鎖増幅DNAを検出するために使用され得る。適切な色素の例としては、SYBRTMおよびPico Green(Molecular Probes,Inc.of Eugene,ORから入手)、エチレンブロマイド、ヨウ化プロピジウム、クロモマイシン、アクリジンオレンジ、Hoechst 33258、Toto−1、Yoyo−1、およびDAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドールヒドロクロライド)が挙げられるが、これらに限定されない。介在性色素の使用に関するさらなる考察は、Zhuら、Anal.Chem.66:1941−1948(1994)(これはその全体が本明細書において参考として援用される)によって提供される。
この型の検出方法は、ドナー/アクセプターフルオロフォア対中のドナー(レポーター)および/またはアクセプター(クエンチャー)フルオロフォアからの蛍光の変化を検出する工程を包含する。ドナーおよびアクセプターのフルオロフォア対は、上記ドナーの発光スペクトルが上記アクセプターの励起スペクトルと重なるように選択される。従って、フルオロフォアの対が互いに十分に近接してもたらされる場合、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が起こり得る。このエネルギー移動が、検出され得る。
これらの方法は、一般的にドナー/アクセプター対の1つのメンバーで標識されたプライマーと、ドナー/アクセプター対の他のメンバーで標識されたヌクレオチドとを利用する。テンプレート依存伸長反応の間にプライマーに標識ヌクレオチドを組み込む前に、上記ドナーおよびアクセプターは、エネルギー移動が起こり得ないように十分離れて配置される。しかし、標識ヌクレオチドがプライマーに組み込まれてその配置が十分に近い場合、エネルギー移動が起こり、それが検出され得る。これらの方法は、一塩基多型を検出する際の一塩基対伸長反応の実施において特に有用であり(前出)、米国特許第5,945,283号およびPCT公開公報WO 97/22719に記載される。
種々の、いわゆる「リアルタイム増幅」方法または「リアルタイム定量的PCR」方法もまた、増幅プロセスの間またはその後に形成される増幅産物の量を測定することによって、サンプル中に存在する標的核酸の量を決定するために利用され得る。蛍光発生ヌクレアーゼアッセイは、本明細書において記載されるデバイスを用いて首尾よく使用され得るリアルタイム定量方法の1つの特定の例である。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法は、二重標識の蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用してPCR産物蓄積を連続的に測定することを包含する。参考文献において、このアプローチは、しばしば「TaqMan」方法といわれる。
分子ビーコンに関して、増幅産物の相補性領域にハイブリダイズする場合のプローブのコンホメーションの変化は、検出可能なシグナルを形成させる。プローブ自体は、2つのセクションを含む:1つは5’末端のセクションであり、もう一方は3’末端のセクションである。これらのセクションは、プローブ結合部位にアニーリングするプローブのセクションに隣接し、互いに相補的である。一方の末端セクションは、代表的にレポーター色素に結合され、もう一方の末端セクションは、通常クエンチャー色素に結合される。
インベーダーアッセイ(Third Wave Technologies,(Madison,WI)は、SNP遺伝型決定のために使用され、そして単一プローブと名付けられるオリゴヌクレオチド(これは、標的核酸(DNAまたはRNA)または多型部位に相補的である)を利用する。インベーダーオリゴと名付けられる第二のオリゴヌクレオチドは、同じ5’ヌクレオチド配列を含むが、3’ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド多型を含む。このインベーダーオリゴは、標的核酸に対するシグナルプローブの結合に干渉し、それによってシグナルプローブの5’末端は多型を含むヌクレオチドにおいて「フラップ」を形成する。この複合体は、Cleavase酵素と呼ばれる構造特異的エンドヌクレアーゼによって認識される。Cleavaseは、ヌクレオチドの5’フラップを切断する。放出されたフラップは、FRET標識を有する第三のプローブに結合し、それによってCleavase酵素によって認識される別の二重鎖構造体を形成する。今回は、上記Cleavase酵素は、クエンチャーからフルオロフォアを切断して除き、蛍光シグナルを生成する。SNP遺伝子型決定のために、上記シグナルプローブは、参照(野生型)対立遺伝子または改変体(変異体)対立遺伝子のいずれかとハイブリダイズするように設計される。PCRとは異なり、核酸の増幅を用いないシグナルの線形的増幅が存在する。当業者を手引きするために十分なさらなる詳細は、例えば、Neri,B.P.ら,Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis 3826:117−125,2000)によって提供される。
核酸配列ベースの増幅(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)(NASBA)は、テンプレートとしてRNAを使用する検出方法である。RNAに対して相補的なプライマーは、T7プロモーター部位のための配列を含む。このプライマーは、テンプレートRNAと添加された逆転写酵素(RT)との結合を可能にし、3’から5’に相補鎖を作製する。続いて、RNase HがRNAを分解するために添加され、1本鎖cDNAはそのまま残る。次いで、プライマーの第二のコピーが1本鎖cDNAに結合し、二本鎖cDNAとなり得る。第1のプライマーによってcDNA配列に組み込まれたT7プロモーター部位から多くのRNAコピーを作製するために、T7 RNAポリメラーゼが添加される。言及される全ての酵素は、41℃において機能し得る(例えば、Compton,J.Nucleic Acid Sequence−based Amplification,Nature 350:91−91,1991を参照のこと)。
この方法は、例えばThelwell N.ら,Nucleic Acids Research,28:3752−3761,2000(これは、全ての目的のためにその全体が参考として援用される)によって記載され、図20はそのスキームを示す。ここでScorpionプロービング機構は以下のとおりである。工程1:標的およびScorpionステム配列(stem sequence)の最初の変性。工程2:標的に対するScorpionプライマーのアニーリング。工程3:Scorpionプライマーの伸長が、二本鎖DNAを生じる。工程4:工程3で産生された二本鎖DNAの変性。これによってScorpionプライマーが結合された一本鎖の標的分子が生じる。工程5:冷却の際、分子内様式でScorpionプローブ配列がその標的に結合する。これは相補的な標的鎖の分子内結合に関して好ましい。Scorpion(図24に示される)は、上記プローブの5’側および3’側の相補的なステム配列によってヘアピンループコンフォメーションに保持される特異的プローブ配列からなる。5’末端に結合するフルオロフォアは、上記ループの3’末端に結合した部分に結合された部分(通常は、メチルレッド)によってクエンチされる。ヘアピンループは、PCR停止配列(ストッパー)を介してプライマーの5’末端に連結される。PCR増幅の間のプライマーの伸長の後、その特異的なプローブ配列は、DNAの同じ鎖内の相補体に結合し得る。このハイブリダイゼーション事象がヘアピンループを開裂し、それによって蛍光はもはやクエンチされず、そしてシグナルの増加が観察される。PCR停止配列は、特異的標的配列の非存在下においてヘアピンループを開裂させるリードスルーを妨げる。このようなリードスルーは、非特異的PCR産物(例えば、プライマーダイマーまたはミスプライミング(mispriming)事象)の検出をもたらす。
1−kHzの電場を核酸が通過することによって引き起こされるDNA濃度と静電容量の変化との間には、直線的な関係が存在する。この関係は、種に依存しないことが見出されている(例えば、Sohnら,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:10687−10690を参照のこと)。従って、特定のデバイスにおいて、フローチャネル内(例えば、図1の実質的に円形のフローチャネル、または図2の反応チャンバー)の核酸は、そのような場に供されて増幅産物の濃度を決定する。あるいは、増幅産物を含有する溶液が回収され、次いで電場に供される。
本明細書において開示される微小流体デバイスを用いて行われる反応は、代表的には、その反応を促進するために特定の添加剤と共に行われる。だから、例えば、試薬が沈積されるデバイスの場合においては、これらの添加剤は、例えば反応部位において1以上の反応物と共にスポットされ得る。添加剤の1つのセットは、エラストマー基材上でタンパク質結合部位をブロックするブロッキング試薬である。多くの異なるタンパク質(例えば、ゼラチンおよび種々のアルブミンタンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン))およびグリセロールを含む、多種多様なこのような組成物が利用され得る。
本明細書において提供される微小流体デバイスは多くの反応部位を含むように製造され得るので、このデバイスは、多種多様なスクリーニング方法および分析方法において有用である。一般的に、上記デバイスは、検出可能なシグナルを形成するために反応する物質種、または検出可能なシグナルを生じる別の物質種との相互作用に関する生成物との間の反応を検出するために利用され得る。種々の型の温度制御システムの使用を考慮して、上記デバイスはまた、温度制御に必要とされる多くの異なる型の分析または反応において利用され得る。
本明細書に開示されるデバイスを利用して、本質的に全ての型の核酸増幅反応を行い得る。従って、例えば、増幅反応は、直線的な増幅(単一プライマーによる増幅)であってもよいし、指数関数的な増幅(すなわち、順方向および逆方向のプライマーセットによって行われる増幅)であってもよい。
(1.概要)
宿主生物または感染生物のいずれかの、ゲノム改変に関連する多くの疾患は、少数のヌクレオチドの変化の結果であり、しばしば単一ヌクレオチドの変化に関連する。このような単一のヌクレオチド変化は、一塩基多型(single nucleotide polymorphism)または単にSNPといわれ、SNPが起こる部位は、代表的には多型部位といわれる。本明細書において記載されるデバイスは、そのような多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するために利用され得る。この性能を拡張すると、上記デバイスは、遺伝子型決定分析において利用され得る。遺伝子型決定は、二倍体生物(すなわち、各遺伝子の2つのコピーを有する生物)が、参照対立遺伝子の2つのコピー(参照型ホモ接合体)、参照対立遺伝子および改変対立遺伝子の各1コピー(すなわち、ヘテロ接合体)を含むか否か、または改変対立遺伝子の2つのコピー(すなわち、改変型ホモ接合体)を含むか否かの決定を包含する。遺伝子型決定分析を行う場合、本発明の方法は、単一改変部位を問いただす(interrogate)ために利用され得る。しかし、多重化に関するセクションにおいて以下にさらに記載されるように、この方法は、 多くの異なるDNA遺伝子座(同じ遺伝子、異なる遺伝子、またはその組み合わせのいずれか)において個体の遺伝子型を決定するためにも使用され得る。
遺伝子型決定分析は、種々の異なるアプローチを使用して行われ得る。これらの方法において、「イエス」または「ノー」の結果を得ることが一般的に十分である。すなわち、検出は、所定の対立遺伝子が存在するか否かという質問に回答し得ることのみを必要とする。従って、分析は、潜在的に多型部位において1つの対立遺伝子の存在を検出するのに必要とされるプライマーまたはヌクレオチドによってのみ行われ得る。しかし、より代表的には、潜在的に多型部位で各対立遺伝子の存在を検出するためのプライマーおよびヌクレオチドが含まれる。適切なアプローチの例は以下である。
SBPE反応は、遺伝子型決定分析を行うために特異的に開発された技術の1つである。多くのSPBEアッセイが開発されているが、一般的なアプローチはかなり似ている。代表的には、これらのアッセイは、標的核酸に対して相補的であるプライマーをハイブリダイズする工程を包含し、これによってそのプライマーの3’末端が直接改変部位の5’であるか、またはそれに隣接するようになる。改変部位およびポリメラーゼを占めるヌクレオチドに対して相補的である1以上の標識された伸長可能でないヌクレオチドの存在下において、伸長は行われる。この伸長可能でないヌクレオチドは、一旦プライマーに組み込まれた場合にポリメラーゼによるさらなる伸長を妨げるヌクレオチドアナログである。添加された伸長可能でないヌクレオチドが、改変部位でのヌクレオチドに相補的である場合、標識された伸長可能でないヌクレオチドは、上記プライマーの3’末端に組み込まれて、標識された伸長産物を産生する。従って、伸長プライマーは、そのヌクレオチドが標的核酸の改変部位に存在することの指標を提供する。このような方法および関連する方法は、例えば、米国特許第5,846,710号;米国特許第6,004,744号;米国特許第5,888,819号;米国特許第5,856,092号;および米国特許第5,710,028号;ならびにWO 92/16657に議論されている。
遺伝子型決定分析は、先立って記載された定量的PCR方法を使用して行われ得る。この場合において、対立遺伝子形態の各々に相補的な示差的に標識されたプローブは、プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼと一緒に試薬として含まれる。しかし、反応は、単一プローブのみを使用して行われ得るが、このことから、シグナルの欠如が特定の遺伝子座が存在しないことに起因するのか、または単なる反応の失敗に起因するのかということに関しては、あいまいさが生じ得る。多型部位について2つの遺伝子座が可能性があるような代表的な2対立遺伝子(biallelic)の場合については、2つの示差的に標識されたプローブは、各々がその対立遺伝子の1つに対して完全に相補的であり、これらのプローブは、通常は試薬混合物中に、増幅プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼと一緒に含まれる。標的DNAを含むサンプルは、反応部位に導入される。プローブが相補的である対立遺伝子が標的DNA中に存在する場合、次いで増幅が起こり、それによって上記の検出おいて記載されたように検出可能なシグナルを生じる。示差的シグナルが得られた場合には、多型部位においてヌクレオチドの同一性が決定され得る。両方のシグナルが検出される場合、その場合は両方の対立遺伝子が存在する。反応の間の熱サイクリングは、前出の温度制御セクションにおいて記載されるように行われる。
(1.概要)
遺伝子発現分析は、1以上の遺伝子が特定の細胞において発現されるレベルを決定する工程を包含する。決定は定性的であり得るが、一般的には定量的である。示差的遺伝子発現分析において、1つの細胞(例えば、試験細胞)における遺伝子のレベルは、別の細胞(コントロール細胞)の発現レベルの同じ遺伝子の発現レベルと比較される。多種多様なこのような比較がなされ得る。例としては、健康な細胞と疾患細胞との間の比較、1種の薬物で処置された個体由来の細胞と別の未処置個体由来の細胞との間の比較、特定の毒物に曝された細胞と曝されていない細胞との間の比較などが挙げられるが、これらに限定されない。試験細胞とコントロール細胞との間で発現レベルが異なる遺伝子は、治療のためのマーカーおよび/または標的として役立ち得る。例えば、特定の群の遺伝子が健康細胞よりも疾患細胞においてアップレギュレートされることが見出される場合、そのような遺伝子は、その疾患のマーカーとして機能し得、診断試験のための基準として利用され得る可能性がある。これらの遺伝子は標的でもあり得る。上記疾患を処置するためのストラテジーとしては、アップレギュレートされた遺伝子の発現の低下をもたらす手順が挙げられる。
遺伝子の転写レベル(そしてそれによって発現レベル)を測定するために、その遺伝子もしくは遺伝子フラグメントのmRNA転写産物を含む核酸サンプル、またはそのmRNA転写産物に由来する核酸が得られる。mRNA転写産物に由来する核酸とは、その合成のためにmRNA転写産物またはそのサブ配列が最終的にテンプレートとして役立つ核酸を指す。従って、mRNAから逆転写されるcDNA、cDNAから転写されるRNA、cDNAから増幅されるDNA、増幅DNAから転写されるRNAは、全て上記mRNA転写産物に由来し、このような由来産物の検出は、サンプル中のもとの転写産物の存在および/またはアバンダンスの指標である。従って、適切なサンプルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:遺伝子のmRNA転写産物、mRNAから逆転写されるcDNA、cDNAから転写されるcRNA、遺伝子から増幅されるDNA、増幅DNAから転写されるRNA。
代表的に、発現分析は定量分析を包含するので、検出は、上記に記載される定量的リアルタイムPCR方法のうちの1つを使用して、代表的には達成される。従って、TaqManアプローチが利用される場合、反応部位に導入される(または前もってスポットされる)試薬は、プライマー、標識プローブ、ヌクレオチド、およびポリメラーゼのうちの1つまたは全てを含み得る。介在性色素が利用される場合、上記反応試薬は、代表的に、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および介在性色素のうちの1つまたは全てを含む。
本明細書において記載されるアレイベースのデバイス(例えば、図1A、1F、2、3Aおよび3B、ならびに添付されるテキストを参照のこと)は、本来、同時に多数の増幅反応を行うために設計される。しかし、この特徴は、各反応部位内で多重分析(例えば、遺伝子型決定および発現分析)を行うことによってさらに容易に拡張され得る。
上記デバイスは、多種多様な核酸分析を行うために有用であるが、このデバイスはまた、同様に多くの他の適用においても利用され得る。上に示されるように、上記デバイスは、検出可能なシグナルまたは反応産物との相互作用の際にシグナルを生じる検出試薬と反応し得る反応産物を生じる、2種以上の物質種の間の任意の相互作用を本質的に分析するために利用され得る。
(一般的局面)
上で示唆されるように、提供される微小流体デバイスは、一般的に、単一および多層のソフトリソグラフィー(multilayer soft lithography)(MSL)技術および/または犠牲層カプセル化法(sacrificial−layer encapsulation method)を利用して構築される。基本的なMSLアプローチは、一連のエラストマー層を小型機械鋳型で鋳造する工程、その鋳型から層を取り出す工程、次いでその層を一緒に融合させる工程を包含する。犠牲層カプセル化アプローチにおいては、フォトレジストのパターンをチャネルが所望される場所に沈積する。これらの技術および微小流体デバイスを製造する方法におけるこれらの技術の使用は、例えば、以下に詳細に議論される:Ungerら(2000)Science 288:113−116,Chouら,(2000)「Integrated Elastomer Fluidic Lab−on−a−chip−Surface Patterning and DNA Diagnostics, in Proceedings of the Solid State Actuator and Sensor Workshop」,Hilton Head,S.C.;ならびにPCT公開公報WO01/01025(これらの各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書において参考として援用される)。
(1.層形成)
製造の間に試薬が反応部位に沈積されるブラインドチャネル設計に基づく微小流体デバイスは、代表的には3層から形成される。下側の層は、試薬が沈積される層である。その下側の層は、上記のMLS方法に関して列挙される参考文献中で記載されるように、種々のエラストマー材料から形成され得る。代表的には、上記材料は、ポリジメチルシロキサン(PMDS)エラストマーである。特定のデバイスのために所望される反応部位の配置および位置に基づいて、適切な試薬がスポットされるべき下側層上の位置を決定することが可能である。PMDSは親水性であるので、沈積された水溶性スポットは、小さくなって非常に小さなスポットを形成する。沈積された試薬は、試薬とエラストマーの表面との間に共有結合が形成されないように沈積される。なぜならば、上に記載されたように、上記試薬は、試薬が反応部位に導入されたときに、サンプル溶液中に溶解することが意図されるからである。
上記試薬は、多くの市販の試薬スポッターのいずれかを利用して、種々の確立されたスポッティング技術を用いて堆積され得る。上記デバイスの調製で利用され得る適切なスポッターの例としては、ピンスポッター、アコースティックスポッター、自動マイクロピペッター、電気泳動ポンプ、インクジェットプリンタデバイス、インクドロッププリンタ、および特定の浸透圧ポンプが挙げられる。市販のスポッターとしては、Cartesian Tschnologies MicroSys 5100(Irvine,CA)、Hitach SPBIO(Alameda,CA)、Genetix Q−Array(United Kingdom)、Affymetrix 417(Santa Clara,CA)およびPackard Bioscience SpotArray(Meriden,CT)が挙げられる。一般的に、試薬の非常に小さいスポットが堆積される;通常は、10nl未満のスポットが堆積され、他の例では、5nl未満、2nl未満または1nl未満、そしてさらに他の例では、0.5nl未満、0.25nl未満、または0.1nl未満のスポットが堆積される。
(シグナル強度評価)
I.緒言
この一連の実験の目的は、本明細書に示される設計の微小流体デバイスを用いて、Macro TaqMan反応に関して50%を超えるシグナル強度で、成功したPCR反応が行われ得ることを実証することであった。
MSLプロセスを用いて組み立てられる三層微小流体デバイスを設計し、以下の実施例で記載される実験を行うために組み立てた。図7Aはこのデバイスの断面図を示す。示されるように、このデバイス700は、フローチャネルが形成される層722を備える。この流体層722は、上にある層720の間にはさまれ、この上にある層は、制御保護層および下にあるシーリング層724を備える。このシーリング層724は、フローチャネルの片側を形成する。こうして得られる三層構造は、基板726(この例では、スライドまたはカバースリップ)に固定され、このことが構造的な固さを提供し、熱伝導率を増加させ、そして微小流体デバイス700の底部からの蒸発を防止する。
男性のヒトゲノムDNAに由来するβ−アクチン遺伝子のエキソン3(Promega,Madison WI)を増幅するために、β−アクチンプライマーおよびTaqManプローブを用いるPCR反応をデバイス700で行った。このTaqMan反応は、以下の成分からなる:1× TaqMan緩衝液A(50mM KCl、10mM Tris−HCl、0.01M EDTA、60nM 受動的参照(Passive Reference 1)(PR1)、pH8.3);3.5〜4.0mM MgCl;200nM dATP、dCTP、dGTP、400nM dUTP;300nM β−アクチン順方向プライマーおよび逆方向プライマー;200nM FAM標識β−アクチンプローブ;0.01U/μl AmpEraseUNG(Applied Biosystems,Foster City CA);0.1〜0.2U/μl DyNAzyme(Finnzyme,Espoo,Finland);0.5% Triton−x−100(Sigma,St. Louis,MO);0.8μg/μl ゼラチン(Calbiochem,San Diego,CA);5.0% グリセロール(Sigma,St.Louis,MO);脱イオン水ならびに男性のゲノムDNA。この反応成分を、25μlの総反応容積を生じるように添加した。標的DNA以外のすべての上記TaqMan反応成分からなるネガティブコントロール(コントロール)を、PCR反応の各セットに含めた。
1. 95℃まで初期傾斜し、1分間維持する(75℃まで1秒あたり1.0℃、95℃まで1秒あたり0.1℃)
2. 3段階の熱サイクルを40サイクル(92℃で30秒間、54℃で30秒間、そして72℃で1分間);または
3. 2段階の熱サイクルを40サイクル(92℃で30秒間、そして60℃で60秒間)。
最初に、AmpliTaq Gold(Applied Biosystems,Foster City,CA)をTaqMan反応で使用し、1.5〜2.0のFAM/PR1/コントロール比を生じ、5.0〜14.0のMacro TaqMan反応比と比較した。結果はポジティブであったが、シグナル強度の増加が望ましかった。それゆえ、DyNAzymeポリメラーゼの熱安定性、校正、および不純物に対する抵抗性に起因して、AmpliTaq GoldポリメラーゼをDyNAzymeポリメラーゼに置き換えた。0.025U/μlの標準的なMacro TaqMan DyNAzyme濃度を、微小流体実験で使用した。このDyNAzymeへのポリメラーゼの変更は、3.5〜5.8のFAM/ROX/コントロール比を生じた。シグナル強度は改善されたが、一貫した結果を得ることは困難であった。理由として、いくつかのタンパク質がPDMSに結合すること、ポリメラーゼの濃度が増加したこと、および表面を改変する添加物が含まれていたことが分かっている。2つの増加させた濃度のDyNAzymeについて試験した(微小流体デバイス中、1nlあたり100pgまたは10pgのゲノムDNAで、Macro TaqManについての標準的な濃度の8倍(0.2U/μl)および4倍(0.1U/μl))。ゼラチン、グリセロール、および0.5% Triton−x−100を添加して、ポリメラーゼがPDMSに結合しないようにした。微小流体デバイス(チップ)およびMacro TaqManコントロールの反応の結果を、図8に示す。
(スポッティング試薬)
I.緒言
本実験の目的は、微小流体デバイスにおける成功したスポット状の(spotted)PCR反応を実証することであった。この文脈において用語「スポット状の(spotted)」とは、基板に試薬の小さな液滴(スポット)を置くことを指し、次いで、この基板は組み立てられて微小流体デバイスの一部になる。スポットした試薬は、一般的に、PCRを行うために必要とされる試薬混合物のサブセットである。
A.試薬のスポッティング
コンタクトプリンティングによって、通常の試薬のスポッティングを行った。試薬を一連の供給源のウェルから金属ピンに取り、このピンを標的基板に接触させることによって堆積させた。このプリンティングプロセスは、図9にさらに概説される。示されるように、試薬を供給源(例えば、マイクロタイタープレート)から取り、次いで、この充填したピンを基板と接触させることによってプリントした。脱イオン水中での攪拌からなる洗浄工程の後、真空乾燥させた。この試薬スポットをプリントするために使用したシステムは、TeleChem「ChipMaker」ブランドのピンを使用するCartesian Technologies MicroSys 5100(Irvine,CA)であるが、他のシステムが上に記載されるように使用され得る。
上記PCRデバイスのフロー層および制御層を、上に記載される通常のMSLプロセスに従って組み立てる。微小流体デバイスの設計は、実施例1に記載されるものと同じである。平行して、30:1の構成比を有する150μmの厚さのPDMSからなる基板層を、無地のシリコーンウエハーを介して形成し、次いで、80℃で90分間硬化させる。
プライマー(順方向プライマーおよび逆方向プライマー)とプローブ分子とをスポットしたデバイスを用いて、PCR反応が首尾よくかつ再現可能に行われた。反応が首尾よく行われたチップに由来するデータの例を、図10に示す。
(遺伝子タイピング)
I.緒言
以下の実験の目的は、本明細書に記載されるような微小流体デバイスまたはチップを利用して遺伝子タイピング実験が行われ得ることを実証することであった。具体的には、上記デバイスで行われる反応が十分な感度を有するかどうかを決定し、そしてβ−アクチンのほかに、他のプライマー/プローブセットが微小流体デバイスで実施され得ることを確実にするように、これらの実験を設計した。
A.RNase P実験
RNase P TaqMan反応(Applied Biosystems;Foster City,CA)を、実施例1に記載されるように微小流体デバイスで行って、他のプライマー/プローブセットが検出可能な結果を生じることを実証した。RNase Pプライマー/プローブセットがβ−アクチンプライマー/プローブセットと対照的に単一コピー遺伝子(2コピー/ゲノム)を検出するので、RNase P反応もまたより高い感度を必要とする。β−アクチンセットは、単一コピーβ-アクチン遺伝子および数個の偽遺伝子を検出し、これは1ゲノムあたりまとめて合計およそ17コピーである。β−アクチンプライマー/プローブセットをRNase Pプライマー/プローブセットに置き換えたことを除いて実施例1に記載したものと同じ成分で、RNase P反応を行った。さらに、蛍光シグナルを増強するために、RNase Pプライマー/プローブセットを、製造業者の推奨する値の4倍で使用した。VIC色素をRNase Pに対するプローブに結合させ、この分析をVIC/PR1比に集中した。4回の実験のうちの1つの結果を、図11に示す。
微小流体デバイスにおけるTaqMan反応の感度をさらに決定するために、β−アクチンプライマー/プローブセットを用いて、ゲノムDNAの希釈を試験した。反応組成は、4倍のDyNAzymeおよびゲノムDNAの希釈物を用いて、概して、実施例1に記載されるように構成した。ゲノムDNAを、0.25pg/nl(これは、1nlあたり約1コピーに対応する)まで希釈した。1つの希釈シリーズの結果を、図12に示す。
微小流体デバイスにおけるTaqManは少ない標的数を検出し得るので、SNP(Single Nucleotide Polymorphism:一塩基多型)遺伝子タイピングの予備試験を、Predetermined Allelic Discriminationキット(Applied Biosystems;Foster City,CA)を用いて、CYP2D6 P450シトクロム遺伝子に対して行った。このキットは、1つのプライマーセットおよび2つのプローブ;野生型対立遺伝子もしくは参照対立遺伝子に対して標識されたFAM、CYP2D6*1、およびCYP2D6*3変異体対立遺伝子もしくは改変体遺伝子、を含む。ゲノムDNAとともに各々の対立遺伝子に対するポジティブコントロール(PCR産物)を、実施例1に記載される条件と同じ条件を用いて、上記デバイスで試験した。1つの実験に由来する結果を、図13および図14に示す。実験を少なくとも3回繰り返して、結果を確認し、信頼性を実証した。
(ゲル電気泳動によるPCRの確認)
I.緒言
DNAの増幅を証明する代替的な方法が微小流体デバイスで生じるように、ゲル電気泳動によってPCR産物を検出するための方法を行った。TaqManプローブを省きβ−アクチン順方向プライマーをFAMに結合させたことを除いて、PCR反応組成は実施例1に記載したとおりであった。
A.微小流体デバイス
MSLプロセスを使用して製造される三層微小流体デバイスを、本実施例に記載される実験を行うために設計し、製造した;図15は、この設計の概略図を示す。このデバイス1500は、概して、サンプル領域1502および制御領域1504からなる。サンプル領域1502は、フローチャネル1506に沿って配置された長方形で表される341個の1nl反応部位1508を含み、このフローチャネルは、入口ビア1510および出口ビア1512を備える。制御領域1504は、3つの制御フローチャネル1514を含み、各々が10個の反応部位1518(これもまた長方形で表される)および入口ビア1516を含む。制御ライン1522のネットワークは、十分な圧力が入口ビア1524に適用される場合に、各々の反応部位1508、1518を隔離する。一連の保護チャネル1520は、液体が反応部位1508、1518からエバポレートするのを防ぐために備えられる。このデバイスは、実施例1に記載されるように三層デバイスである(図7Awo参照のこと)。この全チップがカバースリップに置かれる。
微小流体デバイス1500を充填し、実施例1に記載される3つの温度プロフィールを用いて熱サイクルした。残りの反応サンプルを、微小流体デバイス1500に関する熱サイクルプロフィールと同じ熱サイクルプロフィールを用いてGeneAmp 9700で熱サイクルした。熱サイクルが完了した後、反応生成物を回収した。増幅されたDNAを回収するために、3μlの水をサンプル入力ビア1506に注入し、そして3〜4μlの生成物を出口ビア1512から取り出した。デバイス1500およびMacro反応からの反応生成物を、2μlのExoSAP−IT(USB,Cleveland,OH)(これは、DNAエキソヌクレアーゼIおよびShrimpアルカリホスファターゼからなる)で処理して、過剰なヌクレオチドおよびプライマーを除去した。Macro生成物を、1:10〜1:106に希釈した。デバイス1500からの生成物を脱水し、4μlのホルムアミドに再懸濁させた。
両方の生成物を、ネガティブコントロールとともに、ポリアクリルアミドゲルで分析した。図16は、ゲル電気泳動の結果を示す。長さ294塩基対の適切なサイズのDNAバンドが、図16で観察される。
(大規模な分割)
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、分子生物学において必須のツールになっている。感度(DNAの単一分子の増幅)、特異性(一塩基ミスマッチを区別すること)およびダイナミックレンジ(リアルタイム計測で105)の組み合わせは、PCRを既存の最も強力な分析ツールの1つにする。PCRの性能により反応容積が減少するように改善されることが実証された:本発明者らは、単一の微小流体チップで、1反応あたり90pLの容積で単一のテンプレート分子感度で、21,000の同時PCR反応を行った。
1.Ungerら、Science 288,113−116(2000)。
2.サンプルチャネルおよび制御ラインは、「ブラインドフィリング」で充填される−PDMSは、十分にガス透過性であり、数psiで加圧された液体は、ガスをチャネルから外に出し、チャネルを液体で完全に満たす。Hansenら、PNAS 99,16531−16536(2002)を参照のこと。
3.ヒトβ−アクチン遺伝子の294bpセグメントを、5’−エキソヌクレアーゼアッセイ(Taqman)を使用して増幅した。順方向プライマーおよび逆方向プライマーの配列は、それぞれ、5’−TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3’および5’−CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3’であった。図1bは、TAMRAベースのFRETプローブ、配列5’−(FAM)ATGCCC−X(TAMRA)−CCCCCATGCCATCCTGCGTp−3’を用いて取得した。図1cのデータは、暗いクエンチャーベースのプローブを用いて取得した。なぜなら多数のこれらのプライマー−プローブセットが市販されているからである。反応物は、1× Taqman緩衝液A(50mM KCl、10mM Tris−HCl、0.01M EDTA、60nM 受動的参照1、pH 8.3)、4mM MgCl2、200nM dATP、dCTP、dTTP、400nM dUTP。300nM 順方向プライマー、300nM 逆方向プライマー、200nM プローブ、0.01U/μL Amperase UNG(すべてApplied Biosystems製、Foster City,CA)、0.2U/μL DyNAzyme(Finnzyme,Espoo,Finland)、0.5% Triton−x−100、0.8μg/μl ゼラチン(Calbiochem,San Diego,CA)、5.0% グリセロール、脱イオン水およびヒト雄性ゲノムDNA(Promega)を含んだ。
4.Quantitative PCR Tschnology,Chapter on “Gne Quantification”,LJ McBride,K Livak,M Luceroら、編者、Francois Ferre,Birkause,Boston,MA p 97−110,1998。
E.T.Lagally,I.Medintz,R.A.Mathies,Anal Chem 73(3),565−570(2001)、ならびにB.Vogelstein,K.W.Kinzler,PNAS 96,9236−9241(1999)を参照のこと。
Claims (79)
- 選択された温度または温度範囲において経時的に反応を行う方法であって、該方法は、以下:
複数の別個の反応チャンバーを収容するためのアレイデバイスを提供する工程であって、該アレイデバイスは、複数の層から形成されるエラストマーブロックを備え、ここで少なくとも1つの層は、該層の中に形成される少なくとも1つの凹部を有し、該凹部は、該凹部を備える該層と一体型の少なくとも1つの湾曲可能な膜を有し、該アレイデバイスは、少なくとも1つの該反応チャンバーの近位にある熱転写テバイスを備え、該熱転写デバイスは、熱制御源に接触するように構成されている、工程;
該アレイデバイスに、所望の反応を実行するための試薬を導入する工程;および
熱制御デバイスが該熱制御源と熱的に連通するように、該アレイデバイスを該熱制御デバイスと接触させる工程であって、その結果、少なくとも1つの該反応チャンバーにおける該反応の温度が、該熱制御源の温度の変化の結果として変化する、工程、
を包含する、方法。 - 前記熱転写デバイスが半導体を備える、請求項1に記載の方法。
- 前記熱転写デバイスがシリコーンを備える、請求項1に記載の方法。
- 前記熱転写デバイスが、反射性材料を備える、請求項1に記載の方法。
- 前記熱転写デバイスが、金属を備える、請求項1に記載の方法。
- 前記熱転写デバイスが、該熱転写デバイスへ力を加え、該熱転写デバイスを前記熱制御源に向けて動かすのに適合している、請求項1に記載の方法。
- 前記力が、磁力、静電気力、または真空力を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記力が、前記熱制御デバイスまたは前記熱転写デバイスの表面に形成されたチャネルを通して該熱転写デバイスへ加えられる真空力を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記熱制御デバイスの前記表面と前記熱転写デバイスの前記表面との間で達成される真空のレベルを検出する工程をさらに包含する、請求項8に記載の方法。
- 前記真空のレベルを検出する工程は、真空源の位置から遠位の1個のチャネルまたは複数のチャネルに沿った場所に位置する真空レベル検出器を用いて実施される、請求項9に記載の方法。
- 前記真空のレベルが所定のレベルを超えない場合に、警告が現れるか、または再調製プロトコルが連動する、請求項10に記載の方法。
- 前記アレイデバイスを前記熱制御デバイスと接触させる工程は、1つ以上の機械的位置決めデバイスまたは電気機械的位置決めデバイスを用いることによって実行される、請求項1に記載の方法。
- 前記方法の実行を自動で制御またはモニタリングする工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記方法の実行を自動で制御およびモニタリングする工程は、前記熱制御デバイスに前記アレイデバイスを導入するため、および該熱制御デバイスから該アレイデバイスを取り外すためのロボットの制御システムに操作可能に連通されている自動制御システムにより実施される、請求項13に記載の方法。
- 前記反応の進行をモニタリングする工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載のアレイデバイスを備える、デバイス。
- 請求項9に記載の熱制御デバイスを備える、ユニット。
- 請求項1に記載のアレイデバイスと請求項9に記載の熱制御デバイスとを備える、システム。
- 微小流体システムであって、以下:
複数の別個の反応チャンバーを収容するためのアレイデバイスであって、該反応チャンバーは反応領域内に配置され、かつ該反応領域外に配置された該アレイデバイスに流体注入口で流体連通しており、該アレイデバイスは、複数の層から形成されたエラストマーブロックを備え、ここで少なくとも1つの層は、該層の中に形成された少なくとも1つの凹部を有し、該凹部は、該凹部を備える該層と一体型の少なくとも1つの湾曲可能な膜を有する、アレイデバイス;
キャリアであって、該キャリアは、該アレイデバイスを保持するのに適合しており、そして該流体注入口と連結している複数の流体チャネルを有する、キャリア;および
熱転写インターフェースであって、該熱転写インターフェースは、熱制御源から該反応領域への実質的に均一の熱的連通を提供するように配置された熱伝導性材料を備える、熱転写インターフェース、
を備える、微小流体システム。 - 前記熱伝導性材料は、反射性である、請求項19に記載の微小流体システム。
- 前記熱伝導性材料は、半導体を含む、請求項19に記載の微小流体システム。
- 前記熱伝導性材料は、シリコーンを含む、請求項19に記載の微小流体システム。
- 前記熱伝導性材料は、研磨されたシリコーンを含む、請求項19に記載の微小流体システム。
- 前記熱伝導性材料は、金属を含む、請求項19に記載の微小流体システム。
- 前記反応領域は、前記アレイデバイスの中央部分に位置し、前記流体注入口は該アレイデバイスの周囲に配置される、請求項19に記載の微小流体システム。
- 前記アレイデバイスは、該アレイデバイスの周囲で前記キャリアと連結され、該熱伝導性材料は、前記反応領域で該アレイデバイスの表面に連結される、請求項25に記載の微小流体システム。
- 前記熱転写インターフェースを前記熱制御源に向けて動かすために、該熱転写インターフェースに力を加えるための手段をさらに包含する、請求項19に記載の微小流体システム。
- 前記力を加えるための手段は、熱制御デバイスの表面または熱転写デバイスに形成されたチャネルを通して、前記熱転写インターフェースに向けて真空力を加えるための手段を含む、請求項27に記載の微小流体システム。
- 前記熱制御デバイスの前記表面と前記熱転写デバイスの前記表面との間で達成される真空のレベルを検出するための真空レベル検出器をさらに備える、請求項28に記載の微小流体システム。
- 前記真空レベル検出器が、真空源の位置から遠位の1個のチャネルまたは複数のチャネルに沿った場所に位置する、請求項29に記載の微小流体システム。
- 前記熱制御源に該アレイデバイスを導入するため、または該熱制御デバイスから該アレイデバイスを取り外すためのロボット制御システムと操作可能に連通した自動制御システムをさらに備える、請求項19に記載の微小流体システム。
- 数Mの異なるサンプルを、数Nの異なる試薬で反応させるための微小流体デバイスであって、該デバイスは、以下:
複数の反応セルであって、各反応セルは、サンプルチャンバーおよび試薬チャンバーを備え、該サンプルチャンバーおよび該試薬チャンバーは、インターフェースチャネルを通して流体連通しており、該インターフェースチャネルは、該サンプルチャンバーと該試薬チャンバーとの間の流体連通を制御するための、該インターフェース内に連結されたインターフェースバルブを有する、反応セル;
各々が該サンプルチャンバーと流体連通している、複数のサンプル注入口;
各々が該試薬チャンバーと流体連通している、複数の試薬注入口;
を備え、ここで該サンプル注入口または試薬注入口のうちの1つが、それぞれビアを通して、該サンプルチャンバーのうちの1つまたは該試薬チャンバーのうちの1つと流体連通している、微小流体デバイス。 - 前記反応セルは、一緒に接着された複数の層から形成されるエラストマーブロック内に形成され、そして前記インターフェースバルブは湾曲可能な膜である、請求項1に記載の微小流体デバイス。
- 前記サンプル注入口は、サンプルチャネルを通して前記サンプルチャンバーと流体連通し、前記試薬注入口は、試薬チャネルを通して前記試薬チャンバーと流体連通し、該サンプルチャネルの一部および該試薬チャネルの一部は互いにほぼ平行の向きであり、かつ各々が該試薬チャネルを通る流体連通を制御するために該チャネルに連結された閉じ込めバルブを有する、請求項1に記載のデバイス、および請求項3に記載の微小流体デバイスであって、該サンプルチャネルに連結された該バルブおよび該試薬チャネルに連結された該バルブは、共通の閉じ込め制御バルブを通して互いに操作可能に連通している、微小流体デバイス。
- 前記閉じ込め共通制御チャネルは、前記サンプルチャネルまたは前記試薬チャネルのほぼ垂線に沿って位置している、請求項4に記載の微小流体デバイス。
- 高アスペクト比の特徴のエラストマーブロックを作製するための方法であって、該方法は、以下:
第一のエラストマー層を提供する工程;
該第一のエラストマー層の表面上にフォトレジスト層を加える工程;
該フォトレジスト層に光パターンを加え、反応したフォトレジスト材料のパターンを形成する工程;
該第一のエラストマーブロックの上の該反応したフォトレジストは残して未反応のフォトレジスト材料を除去する工程;
エッチング試薬を該第一のエラストマーの表面に加え、該反応したフォトレジスト剤得ようのパターンによって覆われていない該第一のエラストマー層の表面をエッチングする工程であって、それにより該反応したフォトレジストのパターンによって覆われていない該第一のエラストマー層の領域を除去し、該反応したフォトレジスト材料のパターンに対応する該エラストマー層のパターンは残す、工程;
を包含し、ここで、横から見たときにアスペクト比は、高さが幅の長さの約2倍という特徴と等しいかまたはそれよりも大きい、方法。 - 反応したフォトレジスト材料の前記パターンを除去する工程をさらに包含する、請求項6に記載の方法。
- 前記除去工程は、粘着性テープを前記エラストマー層および前記反応したフォトレジスト材料のパターンの前記表面に貼り、次いで該粘着性テープを該エラストマー層から引き離し、その間に該反応したフォトレジスト材料のパターンの一部または全てが該エラストマー層の該表面から除去される、請求項6に記載の方法。
- 前記フォトレジストがSU8である、請求項7に記載の方法。
- 前記エッチング試薬がフッ化テトラブチルアンモニウム−三水和物を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記特徴がビアである、請求項6に記載の方法。
- 前記エラストマーブロックは、一緒に接着された複数のエラストマー層を含み、ここで2つ以上のエラストマー層はその中に形成される凹部を有し、1つのエラストマー層の1つの凹部は、ビアを通して別のエラストマー層の凹部と連通している、請求項11に記載の方法。
- 数Mの異なるサンプルを、数Nの異なる試薬を用いて反応させるための微小流体デバイスであって、該デバイスは、以下:
複数の反応セルであって、各反応セルは複数のサンプルチャンバーおよび試薬チャンバーを備え、該サンプルチャンバーと該試薬チャンバーとは、インターフェースチャネルを通して流体連通しており、該インターフェースチャネルは該サンプルチャンバーと該試薬チャンバーとの間の流体連通を制御するために該インターフェースチャネルに連結されたインターフェースバルブを有する、反応セル;
各々が該サンプルチャンバーと流体連通している、複数のサンプル注入口;
各々が該試薬チャンバーと流体連通している、複数の試薬注入口;
を備え、ここで該チャンバーのうちの少なくとも1つが、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質ポリマーおよび介在性色素を含む、デバイス。 - 前記反応セルは、一緒に接着された複数の層から形成されるエラストマーブロック内に形成され、前記インターフェースバルブは湾曲可能な膜である、請求項1に記載の微小流体デバイス。
- 前記サンプル注入口はサンプルチャネルを通して前記サンプルチャンバーと連通しており、前記試薬注入口は試薬チャネルを通して前記試薬チャンバーと連通しており、該サンプルチャネルの一部および該試薬チャネルの一部は互いにほぼ平行の向きであり、各々が該サンプルチャネルおよび該試薬チャネルを通る流体連通を制御するために該サンプルチャネルおよび該試薬チャネルに連結された閉じ込めバルブを有する、請求項1に記載の微小流体デバイス。
- 前記サンプルチャネルに連結された前記バルブおよび前記試薬チャネル連結された前記バルブは、共通の閉じ込め制御チャネルを通して互いに操作可能に連通している、請求項3に記載の微小流体デバイス。
- 前記共通の閉じ込めバルブは、前記サンプルチャネルまたは前記試薬チャネルのうちの1つの垂線にほぼ沿っている、請求項3に記載の微小流体デバイス。
- 前記介在性色素がSYBR Green(TM)である、請求項1に記載のデバイス。
- タンパク質またはオリゴヌクレオチドの変性温度を決定するための方法であって、該方法は、請求項1に記載のデバイスを提供する工程、該デバイスの温度を変える工程、および色素の変化を検出する工程を包含する、方法。
- 熱制御デバイスの熱制御表面に対してPCR反応容器を保持するための、真空の使用。
- 前記容器は微小流体デバイスである、請求項50に記載の使用。
- 前記容器はエラストマー微小流体デバイスである、請求項51に記載の使用。
- 熱伝導を局限するための、微小流体支持体内での熱伝導性挿入物の、使用。
- 前記支持体が一体型キャリアである、請求項53に記載の使用。
- 前記熱伝導性挿入物がシリコーンである、請求項53に記載の使用。
- 前記シリコーンが研磨されている、請求項55に記載の使用。
- 前記真空圧力は、前記微小流体デバイスに接触している前記熱制御表面に形成されたチャネルを通して加えられる、請求項50に記載の使用。
- 前記微小流体デバイスはエラストマー微小流体デバイスである、請求項57に記載の使用。
- 前記微小流体デバイスがさらに熱伝導性部分を備える、請求項57に記載の使用。
- 前記熱伝導性部分がシリコーンである、請求項59に記載の使用。
- PCRを実施するための微小流体デバイスの使用であって、該PCRデバイスは面積1cm2あたりの流体単離物において100反応より多い反応密度を有する、使用。
- 前記反応密度は250より多い、請求項61に記載の使用。
- 前記反応密度は500より多い、請求項61に記載の使用。
- 前記反応密度は750より多い、請求項61に記載の使用。
- 前記反応密度は1000より多い、請求項61に記載の使用。
- 前記反応密度は1250より多い、請求項61に記載の使用。
- 前記反応密度は1500より多い、請求項61に記載の使用。
- PCR反応を含む微小流体デバイスを撮像するための、1.5より小さいNAを有する対称性の光学システムの、使用。
- 前記NAが1.0よりも小さい、請求項68に記載の使用。
- コントロールラインの流体としてのグリセロールの、使用。
- 前記グリセロールは溶液の一部である、請求項70に記載の使用。
- コントロールラインの流体としてのPEGの、使用。
- 微小流体デバイスにおいてPCR反応を制御するための自動駆動デバイスの、使用。
- 前記駆動デバイスがバルブを制御する、請求項73に記載の使用。
- 前記微小流体デバイスがエラストマーブロックを備える、請求項73に記載の使用。
- 前記自動バルブ駆動デバイスが、熱制御デバイスを使用するシステムにおいて使用される、請求項73に記載の使用。
- 前記熱制御デバイスが、前記微小流体デバイスとの熱的接触の生成を補助するために、真空を用いる、請求項76に記載の使用。
- 自動バルブ駆動デバイスは、PCRのために使用される前記微小流体デバイスの駆動の制御のためのコンピューターを備える、請求項73に記載の使用。
- 前記バルブは湾曲可能な膜を備える、請求項74に記載の使用。
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