JP2007534314A - 酵素の安定化 - Google Patents
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Abstract
Description
第2の液相中に分散した第1の液相の液滴のエマルジョンであって、片方の液相が親水相で他方の液相が親水相と混和しない疎水相であり、且つ液滴と第2の液相との境界面または境界面内に酵素分子が位置しているエマルジョンを用意する工程と、
各液滴の酵素分子を架橋化することで、個々の液滴から、酵素の活性部位の大部分が内部または外部のいずれかを向いた状態で酵素が固定化されている安定した酵素構造をそれぞれ形成する工程と、
を含んでいることを特徴とする方法が提供される。
油中水型エマルジョン(water−in−oil emulsion)からの架橋化され安定化されたリパーゼ球体(構造)
195gのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液(pH7.8)および5gの鉱油(カストロール)に対して、1gのAmano AKの酵素を加えた。次に、シルバーソンL4R試験室用ロータステータホモジナイザを用いて、6000rpmで5分間、この混合物を均質化した。そのエマルジョンに、1.5gのヘキサメチレンジイソシアネート(Merck Schuchardt)を加えた。このエマルジョンを室温で2時間撹拌した。その後、0.45μmの濾紙で濾過することによって架橋化された酵素構造を回収し、50mlのPBSでの洗浄を5回行った(合計250mlのPBS)。図1は、この方法によって得られた、代表的な安定化酵素球体または構造を示す。レーザー光散乱(Malvern Mastersizer 2000)により粒径を測定し、ザウター平均粒径の平均値49.4μmを得た(図2を参照)。
油中水型エマルジョンからの架橋化または安定化されたリパーゼ球体(構造)
100mMのTris−Cl(Tris (hydroxymethyl) aminomethane)緩衝液(pH8.0)中でカンジダ・ルゴサリパーゼ(Candida rugosa lipase)(アトラス・バイオロジクス社)を、最終濃度が100mg/mlとなるまで再懸濁することにより、リパーゼ溶液を調製した。アミコン限外濾過セルに10Kポリエーテルサルホン膜(マイクロセップ社:PO Box 391647,Bramley 2018,南アフリカ)を取り付けたものを用いて、この酵素試料を、3倍量の100mMのTris−Cl緩衝液(pH8.0)に対してダイアフィルトレーションした。
架橋剤としてのデキストランアルデヒド
使用した架橋剤が、平均分子量20kDa(dextrab aldehyde)の、リュコノストック(leuconstoc)種由来の活性デキストラン(activated dextran)であった点、油相が植物油であった点、リパーゼ溶液とTris緩衝液との比が1:1であった点、および界面活性剤を使用しなかった点を除き、実施例2と同じことを繰り返した。Hong,T.、Guo,W.、Yuan,H.、Li,J.、Liu,Y.、Ma,L.、Bai,Y.、およびLi,T.によってJournal of Magnetism and Magnetic Materials,269,95〜100の『Periodate oxidation of nanoscaled magnetic dextran composites』に記述されているように(2004)、デキストランを過度のメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることによって、デキストランアルデヒドを調製した。得られた活性度は、水溶液中で自由な状態であった最初の酵素と比較して、7.5%(p−ニトロフェニルパルミタートの場合)であった。
水中油型エマルジョンからの架橋化酵素球体
液相および界面活性剤の割合を変えることにより水中油型エマルジョンを生成した点を除き、実施例2と同じことを繰り返した。
別の酵素クラス(ラッカーゼ)
Jordaan,J.、Pletschke,B.I.、およびLeukes,W.D.によって、Enz Microb Technol.34,635〜641の『Purification and partial characterization of a thermostable laccase from an unidentified basidiomycete』に記述されているように(2004)、使用した酵素がUD4種のラッカーゼであった点、および、トリブチリンの替わりにシリンガ酸(エタノールにおける飽和溶液)を用いた点を除き、実施例3と同じことを繰り返した。
タンパク質濃度
実施例2におけるリパーゼの濃度を半分にすると(トリブチリンは加えない)、リパーゼの活性度が重量で100%超増加した。
沈殿剤の添加
実施例2のエマルジョン(トリブチリンは加えない)に、沈殿剤としてアセトンを加えると、活性度が114%増加する。
油相の選択
実施例2の工程(トリブチリンは加えない)において、鉱油に替えて植物油を用いると、活性度が4倍増加するが、生成物溶液からの回収がより困難になる。これは、おそらく加水分解油が存在するためである。
保護剤の添加
実施例2で議論したように、保護剤としてトリブチリンを加えると、カンジダ・ルゴサリパーゼの活性度が、最初の自由な状態であった酵素濃度と比較して0.14%から5%にまで増加した(p−ニトロフェニルパルミタートの場合)。この「保護剤の能力」は、すべての酵素に対して機能するわけではない。たとえば、リゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae)由来のリパーゼに保護剤としてトリブチリンを加えると、最初の自由な状態であった酵素と比較して、活性度が12倍減少し、4.17から0.35%(p−ニトロフェニルブチラートの場合)となった。
残留している遊離架橋剤群を結合して凝集を減らす
最終生成物にアミノ酸を加えると、球体の凝集が減少した。これは、球体表面に残留した架橋剤群にアミノ酸が結合したためであると考えられる。驚くべきことに、特にアミノ酸としてフェニルグリシンを使用した場合に、アミノ酸を用いない対照標準と比較して活性度の向上も確認された。実施例2(トリブチリンは加えない)における通常の方法と比較して、リパーゼ球体の活性度が100%向上したことが確認された(p−ニトロフェニルブチラートおよびp−ニトロフェニルパルミタートの両方に基づく)。
ラッカーゼ架橋化球体のリサイクル
実施例5における方法にしたがってラッカーゼ球体を調製した。球体を、基質としての2,2’−アジノ−ビス−(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)二アンモニウム塩(ABTS)と6度反応させた。各反応の間に回収及び洗浄を行った。この6度のリサイクル作業後のラッカーゼの活性度は、球体の元々の活性度と同等であった。
ナプロキセンエチルエステル(NEE)を用いたリパーゼ架橋化球体のリサイクル
実施例2における方法にしたがってリパーゼ球体を調製した。40℃で、基質としてのナプロキセンエチルエステル(NEE)と球体を3度反応させた。各反応の間に回収及び洗浄を行った。架橋化リパーゼ球体は、3度のリサイクル作業を経て、活性度が約70%低下した。(同じ酵素のCLECsにも同様の活性度の低下が見られた。Brady,D.、Steenkamp,L.、Skein,E.、Chaplin,J.A.およびReddy,S.(2004)によるEnz.Microb.Technol.34,283〜291の『Optimisation of the enantioselective biocatalytic hydrolysis of naproxen ethyl ester using ChiroCLEC−CR』。)
p−ニトロフェニルパルミタートを用いたリパーゼ架橋化球体のリサイクル
実施例2における方法にしたがってリパーゼ球体を調製した。球体を、基質としてのp−ニトロフェニルパルミタートと反応させた。各反応の間に回収及び洗浄を行った。最後のリサイクルにおいて、活性度が最初のリパーゼ球体の活性度の79.6%にまで低下した。
リパーゼ球体の活性度回収率の、CLEAとの比較
実施例2における方法にしたがってカンジダ・ルゴサリパーゼ球体を調製した。Cao,LおよびElzinga,J.による米国特許出願公開番号20030149172の実施例8にしたがって、グルタルアルデヒドとエチレンジアミンとの割合を1:7.88として、カンジダ・ルゴサリパーゼのCLEA’sを調製した。
水中油型エマルジョンと油中水型エマルジョンとの比較(リパーゼの配向)
実施例2の方法にしたがって、油中水型のカンジダ・ルゴサリパーゼ球体を調製した。実施例2の方法にしたがって、水中油型のカンジダ・ルゴサリパーゼ球体を調製した。ただし、油の体積は0.2mlに減らし、緩衝液の体積は5mlに増やした。基質としてp−ニトロフェニルブチラートを用いた場合、油中水型エマルジョンで得られた活性度は水中油型エマルジョンよりも136.0%高く、水中油型エマルジョンから油中水型エマルジョンにかけて、8.9から26.0U/mgに増加した。
機械的撹拌による球体の寸法の調節
実施例2の方法にしたがって、カンジダ・ルゴサリパーゼ球体を調製した。ただし、シルバーソンのホモジナイザは、攪拌するためではなくエマルジョンを生成するために使用した。ホモジナイザの速度設定のみを変えて、すなわち1000rpmおよび3000rpmで、2つの実験を行った。粒径分布を決定した結果、1000rpmおよび3000rpmで生成された球体の平均粒径がそれぞれ52.0μmおよび20.6μmであることが示された。また、基質としてp−ニトロフェニルパルミタートおよびp−ニトロフェニルブチラートを用いると、活性度がそれぞれ比較して28%および83%増加した
1.触媒(球状で中空のカプセル)の露出表面積が最大になる。
2.触媒の浮力を制御することができる。たとえば、反応媒体から浮遊粒子を容易に分離することができる。
3.エマルジョンの粒度分布を調節することにより、形成され固定化酵素粒子の平均寸法(径)を制御することができる。
4.多くのリパーゼ、そしていくつかの他の酵素が性質上有している溶媒界面における自己配向性を利用することで、活性部位の大部分が必要に応じて内腔または外部のいずれかに向かうように制御しつつ、固定化された酵素球体を生成できる。
5.親水性/疎水性界面の存在により、リパーゼ等の酵素を活性化状態で固定化することができる。
Claims (29)
- 酵素構造を生成する方法であって、
第2の液相中に分散した第1の液相の液滴のエマルジョンであって、片方の液相が親水相で他方の液相が親水相と混和しない疎水相であり、且つ液滴と第2の液相との境界面または境界面内に酵素分子が位置しているエマルジョンを用意する工程と、
各液滴の酵素分子を架橋化することで、個々の液滴から、酵素の活性部位の大部分が内部または外部のいずれかを向いた状態で酵素が固定化されている安定した酵素構造をそれぞれ形成する工程と、
を含んでいることを特徴とする方法。 - 個々の構造が開口を有しており、これによって液相が構造を出入りできることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 個々の構造が液体不透過性であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 親水相および/または疎水相および/またはエマルジョンに対して、疎水度および/または酵素の電荷を変えるための改質剤(modifier)を加える工程を含んでいることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素がリパーゼであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- リパーゼが、シュードモナス・セパシアリパーゼ(Pseudomonas cepacia lipase)、シュードモナス・フルオレッセンスリパーゼ(Pseudomonas fluorescens lipase)、シュードモナス・アルカリゲネスリパーゼ(Pseudomonas alcaligenes lipase)、カンジダ・ルゴサリパーゼ(Candida rugosa lipase)、カンジダ・アンタークチカリパーゼA(Candida antarctica lipase A)、カンジダ・アンタークチカリパーゼB(Candida antarctica lipase B)、カンジダ・ウチリスリパーゼ(Candida utilis lipase)、サーモマイセス・ラヌギノサリパーゼ(Thermomyces lanuginosus lipase)、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ(Rhizomucor miehei lipase)、アスペルギルス・ニガーリパーゼ(Aspergillus niger lipase)、アスペルギルス・オリゼリパーゼ(Aspergillus oryzae lipase)、ペニシリウム種リパーゼ(Penicillium sp lipase)、ムコール・ジャバニカスリパーゼ(Mucor javanicus lipase)、ムコール・ミエヘイリパーゼ(Mucor miehei lipase)、リゾプス・アルヒザスリパーゼ(Rhizopus arrhizus lipase)、リゾプス・デレマーリパーゼ(Rhizopus delemer lipase)、リゾプス・ジャポニクスリパーゼ(Rhizopus japonicus lipase)、リゾプス・ニベウスリパーゼ(Rhizopus niveus lipase)、および豚膵臓リパーゼ(Porcine Pancreatic lipase)から選ばれることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- エマルジョンを用意する工程は、酵素を親水相またはW相中に溶解させ、親水相を含んだ酵素を疎水相またはO相と混合してエマルジョンを形成するという方法で実行されることを特徴とする請求項5または6に記載の方法。
- エマルジョンが連続した親水相中に疎水相の液滴が分散しているO/W型エマルジョンである場合、界面に酵素を強制的に沈殿させ、エマルジョンが連続した疎水相中に親水相の液滴が分散しているW/O型エマルジョンである場合、酵素を液滴容量内に強制的に沈殿させるということを、選択的に行う工程を含んでいることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 酵素分子を架橋化する工程は、親水相および/または疎水相および/またはエマルジョンに加えられる架橋剤を用いて実行されることを特徴とする請求項7または8に記載の方法。
- 架橋化中に酵素の活性部位を占拠する一時的な保護剤を親水相および/または疎水相および/またはエマルジョンに加え、これによって架橋化剤による占拠または活性部位との反応を阻止する工程を含んでいることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- エマルジョンにアミノ酸を加えて、個々の酵素構造の凝集を阻止する工程を含んでいることを特徴とする請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の液相から酵素構造を回収する工程を含んでいることを特徴とする請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素構造から第1の液相を抜く工程を含んでいることを特徴とする請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 親水相が、水、および任意で水中の緩衝剤から構成されることを特徴とする請求項7〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 親水相が、ポリエチレングリコール、および任意でポリエチレングリコールと混合された水から構成されることを特徴とする請求項7〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 疎水相が、油、炭化水素、エーテル、またはエステルから構成されることを特徴とする請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。
- エマルジョンが、連続した疎水相中に親水相の液滴が分散しているW/O型エマルジョンであって、第2の酵素、補助因子(co factor)、および/または媒介物質が親水相中に存在していることを特徴とする請求項7〜16のいずれか一項に記載の方法。
- リパーゼにより加水分解可能なトリグリセリドを疎水相として使用して、連続した親水相中に疎水相の液滴が分散しているO/W型エマルジョンを形成し、且つ、架橋化構造内に含まれている分散した疎水相を、架橋化反応の最中またはその後にリパーゼによって加水分解することを特徴とする請求項5〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 連続した親水相中に疎水相の液滴が分散している初期O/W型エマルジョンを形成し、架橋化が行われる前に、エマルジョンを遠心して濃縮エマルジョンと希釈親水相とを分離することでリパーゼの純度を高める工程と、より低いHLB値を有する界面活性剤を加えることによりエマルジョンを転化して、連続した疎水相中に親水相の液滴が分散しているW/O型エマルジョンを形成する工程と、を含んでいることを特徴とする請求項7〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素構造に特定の性質をもたせるため、親水相および/または疎水相および/またはエマルジョンに改質剤(modifier)を加えることを特徴とする請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 改質剤が、酵素の活性度を高め、エマルジョンの安定性を向上させるための界面活性剤であることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 改質剤が、エマルジョン界面上に酵素を沈殿させるための沈殿剤であることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 改質剤が、エマルジョンおよび/または酵素構造の、pH、イオン強度、粘度、磁気的性質、凝集傾向、および/またはゼータ電位を変えるための添加剤であることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 架橋化された酵素分子を備えることで安定した中空の酵素構造であって、酵素の活性部位の大部分が内部または外部のいずれかを向いた状態で酵素が固定化されていることを特徴とする酵素構造。
- 球体状であることを特徴とする請求項24に記載の酵素構造。
- その内腔に液体を含んでいることを特徴とする請求項24または25に記載の酵素構造。
- 酵素がリパーゼであることを特徴とする請求項24〜26のいずれか一項に記載の酵素構造。
- リパーゼが、シュードモナス・セパシアリパーゼ(Pseudomonas cepacia lipase)、シュードモナス・フルオレッセンスリパーゼ(Pseudomonas fluorescens lipase)、シュードモナス・アルカリゲネスリパーゼ(Pseudomonas alcaligenes lipase)、カンジダ・ルゴサリパーゼ(Candida rugosa lipase)、カンジダ・アンタークチカリパーゼA(Candida antarctica lipase A)、カンジダ・アンタークチカリパーゼB(Candida antarctica lipase B)、カンジダ・ウチリスリパーゼ(Candida utilis lipase)、サーモマイセス・ラヌギノサリパーゼ(Thermomyces lanuginosus lipase)、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ(Rhizomucor miehei lipase)、アスペルギルス・ニガーリパーゼ(Aspergillus niger lipase)、アスペルギルス・オリゼリパーゼ(Aspergillus oryzae lipase)、ペニシリウム種リパーゼ(Penicillium sp lipase)、ムコール・ジャバニカスリパーゼ(Mucor javanicus lipase)、ムコール・ミエヘイリパーゼ(Mucor miehei lipase)、リゾプス・アルヒザスリパーゼ(Rhizopus arrhizus lipase)、リゾプス・デレマーリパーゼ(Rhizopus delemer lipase)、リゾプス・ジャポニクスリパーゼ(Rhizopus japonicus lipase)、リゾプス・ニベウスリパーゼ(Rhizopus niveus lipase)、および豚膵臓リパーゼ(Porcine Pancreatic lipase)から選ばれることを特徴とする請求項27に記載の酵素構造。
- 請求項24〜28のいずれか一項に記載の酵素構造が複数存在している状態で反応媒体に反応を起こして、当該反応が酵素構造による触媒作用を受けるようにする工程を含んでいることを特徴とする、反応の実施方法。
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