JP2007530048A - 標的ポリヌクレオチドを検出するためのコード化反応およびデコード反応 - Google Patents

標的ポリヌクレオチドを検出するためのコード化反応およびデコード反応 Download PDF

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Abstract

本発明は、コード化反応およびデコード反応を使用して少なくとも１つのサンプルにおける標的ポリヌクレオチド配列の存在または非存在を検出（または定量）するための方法、試薬およびキットに関する。特定の標的ポリヌクレオチドがサンプルに存在するとき、アドレス可能なプライマー部分を含む反応生成物がコード化反応において形成される。少なくとも１つの標識および少なくとも１つのアドレスプライマーがデコード増幅反応において用いられ、それにより、配列が存在するか、または非存在であるかに依存して、検出可能なシグナル値を提供する。いくつかの実施形態において、ユニバーサルな塩基と、プローブの縮小されたライブラリーとを、標的ポリヌクレオチドの非常に多重化された分析のために用いることができる。

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）のもと以下の出願からの優先権の利益を主張する：Ｃｈｅｎらの米国仮特許出願第６０／５５６，１５７号および第６０／６３０，６８１号、Ａｎｄｅｒｓｅｎらの米国仮特許出願第６０／５５６，２２４号、Ｌｉｖａｋらの米国仮特許出願６０／５５６，１６２号、およびＬａｏらの米国仮特許出願第６０／５５６，１６３号（これらは全て２００４年３月２４日に出願され、これらの全ては、本明細書によって明白に参考として援用される）。本出願は、Ｃｈｅｎらの関連する米国特許出願「Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｃｏｄｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」と同時出願される（この全ては、明白に参考として援用される）。
（分野）
本発明の教示は、一般には、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法、キットおよび組成物に関する。より具体的には、本発明の教示は、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法、キットおよび組成物を含むコード化反応およびデコード反応に関する。
（背景）
１つまたは複数の標的配列を含有するサンプルにおける１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在または非存在（または量）の検出が広く行われている。例えば、ガンおよび多くの感染性疾患（例えば、ＡＩＤＳおよび肝炎など）の検出では、生物学的サンプルを診断のための核酸配列の存在または非存在についてスクリーニングすることが日常的に含まれる。また、核酸配列の存在または非存在を検出することが、法医学的科学、親子鑑定、遺伝子カウンセリングおよび臓器移植においてしばしば使用される。
生物の遺伝子構成は、その生物のゲノムに含有される遺伝子によって決定される。遺伝子は、タンパク質を作るために必要とされる情報をコードする長い鎖、すなわち、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマーから構成される。生物の性質、能力および形質は、多くの場合、その生物によって産生されているか、または、産生されていないタンパク質のタイプおよび量に関連づけられる。
タンパク質は遺伝子から下記のように産生され得る。最初に、タンパク質（例えば、タンパク質「Ｘ」）をコードする遺伝子のＤＮＡを表す情報が、「転写」として知られているプロセスによってリボ核酸（ＲＮＡ）に変換される。転写の間、遺伝子の一本鎖になった相補的なＲＮＡコピーが作製される。次に、このＲＮＡコピー（これはタンパク質ＸのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる）が、タンパク質Ｘを作製するための細胞の生化学的装置によって使用される（「翻訳」と称されるプロセス）。基本的には、細胞のタンパク質製造装置がｍＲＮＡに結合し、そのＲＮＡコードを「読み取り」、それをタンパク質Ｘのアミノ酸配列に「翻訳」する。まとめると、ＤＮＡが、ｍＲＮＡを作製するために転写され、そのｍＲＮＡが、タンパク質を作製するために翻訳される。
細胞によって産生されるタンパク質Ｘの量は、多くの場合、細胞内に存在するタンパク質ＸのｍＲＮＡの量に大きく依存している。細胞内におけるタンパク質ＸのｍＲＮＡの量は、少なくとも部分的には、遺伝子Ｘが発現される程度に起因する。特定の遺伝子または遺伝子改変体が存在するかどうか、そして、もしそうであるならば、どのくらいのコピーが存在するかは、生物に対する著しい影響を有し得る。特定の遺伝子または遺伝子改変体が発現されるかどうか、そして、もしそうであるならば、どのようなレベルに発現されるかは、その生物に対する著しい影響を有し得る。
（要旨）
本発明の教示のいくつかの実施形態により、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法が提供され、この方法は、
サンプルと、少なくとも１つの第１のプローブおよび少なくとも１つの第２のプローブを含む第１の反応容器を提供する工程であって、この場合、少なくとも１つの第１のプローブは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、少なくとも１つの第２のプローブは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含む、工程；
コード化反応を行って、それにより、順方向のアドレス可能なプライマー部分と、標的特異的部分と、逆方向のアドレス可能なプライマー部分とを含む少なくとも１つのコード化反応生成物を形成する工程であって、それによって、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の正体が第１のプローブおよび第２のプローブによりコード化される、工程；
少なくとも１つの順方向アドレスプライマーと、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーと、標識とを含む少なくとも１つの第２の反応容器を提供する工程；
少なくとも１つのコード化反応生成物のアリコートを少なくとも１つの第２の反応容器に加え、それにより、少なくとも１つの第１のデコード増幅反応物を形成する工程；
デコード増幅反応を少なくとも１つの第２の反応容器において行う工程であって、この場合、少なくとも１つの順方向アドレスプライマーが、コード化反応の間に少なくとも１つのコード化反応生成物に取り込まれた少なくとも１つの順方向のアドレス可能なプライマー部分の相補体にハイブリダイズし、そして少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーが、コード化反応の間に少なくとも１つのコード化反応生成物に取り込まれた少なくとも１つの逆方向のアドレス可能なプライマー部分にハイブリダイズし、少なくとも１つのコード化反応生成物の増幅により、標識からのシグナルが生じる、工程；
標識からのシグナルの存在および量に基づいて少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出する工程
を包含する。
本発明の教示のいくつかの実施形態により、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法が提供され、この方法は、
サンプルと、少なくとも１つの第１のプローブと、少なくとも第２のプローブとを含む第１の反応容器を提供する工程であって、この場合、少なくとも１つの第１のプローブは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、少なくとも１つの第２のプローブは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、少なくとも１つのプローブが、同定部分をさらに含む、工程；
コード化反応を行って、それにより、少なくとも１つのコード化反応生成物を含むコード化生成物混合物を形成する工程であって、この場合、少なくとも１つのコード化反応生成物は、順方向のアドレス可能なプライマー部分と、同定部分と、標的特異的部分と、逆方向のアドレス可能なプライマー部分とを含み、それによって、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の正体が第１のプローブおよび第２のプローブによりコード化される、工程；
少なくとも１つの順方向アドレスプライマーと、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーと、少なくとも１つの標識化プローブとを含む少なくとも１つの第２の反応容器を提供する工程であって、この場合、少なくとも１つの標識化プローブは、少なくとも１つのコード化反応生成物の同定部分に対して相補的であるか、または、少なくとも１つのコード化反応生成物の同定部分の相補体に対して相補的である、工程；
コード化反応生成物混合物のアリコートを少なくとも１つの第２の反応容器に加え、それにより、少なくとも１つの第１のデコード増幅反応液を形成する工程；
デコード増幅反応を少なくとも１つの第２の反応容器において行う工程であって、この場合、少なくとも１つの順方向アドレスプライマーが、コード化反応の間に少なくとも１つのコード化反応生成物に取り込まれた少なくとも１つの順方向のアドレス可能なプライマー部分の相補体にハイブリダイズし、そして少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーが、コード化反応の間に少なくとも１つのコード化反応生成物に取り込まれた少なくとも１つの逆方向のアドレス可能なプライマー部分にハイブリダイズし、少なくとも１つのコード化反応生成物の増幅により、少なくとも１つの標識化プローブからのシグナルが生じる、工程；
少なくとも１つの標識化プローブからのシグナルの存在および量に基づいて少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出する工程
を包含する。
本発明の教示のいくつかの実施形態により、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を少なくとも２つのサンプルから検出するための方法が提供され、この方法は、
第１の反応容器１および第１の反応容器２を提供する工程、
この場合、第１の反応容器１は、第１のサンプルと、少なくとも１つの第１のプローブと、少なくとも１つの第２のプローブとを含み、この場合、少なくとも１つの第１のプローブは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、少なくとも１つの第２のプローブは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、少なくとも１つのプローブは第１の同定部分をさらに含み、
第１の反応容器２は、第２のサンプルと、少なくとも１つの第１のプローブと、少なくとも１つの第２のプローブを含み、この場合、少なくとも１つの第１のプローブは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、少なくとも１つの第２のプローブは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、少なくとも１つのプローブは第２の同定部分をさらに含む、工程；
第１のコード化反応を第１の反応容器１において行い、それにより、少なくとも１つの第１のコード化反応生成物を含む第１のコード化反応生成物混合物を形成する工程であって、この場合、少なくとも１つの第１のコード化反応生成物は、順方向のアドレス可能なプライマー部分と、同定部分と、標的特異的部分と、逆方向のアドレス可能なプライマー部分とを含み、それによって、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の正体が順方向のアドレス可能なプライマー部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして、それによって第１のコード化反応におけるサンプルの正体が第１の同定部分によってコード化される、工程；
第２のコード化反応を第１の反応容器２において行い、それにより、少なくとも１つの第２のコード化反応生成物を含む第２のコード化反応生成物混合物を形成する工程であって、この場合、少なくとも１つの第２のコード化反応生成物は、順方向のアドレス可能なプライマー部分と、同定部分と、標的特異的部分と、逆方向のアドレス可能なプライマー部分とを含み、それによって、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の正体が順方向のアドレス可能なプライマー部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして、それによって第２のコード化反応におけるサンプルの正体が第２の同定部分によってコード化される、工程；
第１の反応容器１からの第１のコード化反応生成物混合物を第１の反応容器２からの第２のコード化反応生成物混合物と合わせ、それにより、コード化反応生成物混合物を形成する工程；
少なくとも１つの第２の反応容器１および第２の反応容器２を提供する工程であって、
この場合、第２の反応容器１は、少なくとも１つの順方向アドレスプライマーと、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーと、少なくとも第１の標識化プローブ１と、少なくとも第２の標識化プローブ１とを含み、第１の標識化プローブ１が、第１の反応容器１からの少なくとも１つのコード化反応生成物の第１の同定部分に対して相補的であるか、または、第１の反応容器１からの少なくとも１つのコード化反応生成物の第１の同定部分の相補体に対して相補的であり、そして第２の標識化プローブ１が、第１の反応容器２からの少なくとも１つのコード化反応生成物の第２の同定部分に対して相補的であるか、または、第１の反応容器２からの少なくとも１つのコード化反応生成物の第２の同定部分の相補体に対して相補的であり、
第２の反応容器２は、少なくとも１つの順方向アドレスプライマーと、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーと、少なくとも第１の標識化プローブ１と、少なくとも１つの第２の標識化プローブ１を含み、第１の標識化プローブ１が、第１の反応容器１からの少なくとも１つのコード化反応生成物の第１の同定部分に対して相補的であるか、または、第１の反応容器１からの少なくとも１つのコード化反応生成物の第１の同定部分の相補体に対して相補的であり、そして第２の標識化プローブ１が、第１の反応容器２からの少なくとも１つのコード化反応生成物の第２の同定部分に対して相補的であるか、または、第１の反応容器２からの少なくとも１つのコード化反応生成物の第２の同定部分の相補体に対して相補的である、工程；
コード化反応生成物混合物のアリコートを少なくとも１つの第２の反応容器１に加え、それにより、第１のデコード増幅反応物を第２の反応容器１において形成する工程；
第１のデコード増幅反応を第２の反応容器１において行う工程であって、
この場合、第１のデコード増幅反応物は、第１のコード化反応および第２のコード化反応の間に少なくとも１つのコード化反応生成物に導入された少なくとも１つの順方向のアドレス可能なプライマー部分の相補体にハイブリダイズし得る少なくとも１つの異なった順方向アドレスプライマーを含み、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーが、第１のコード化反応および第２のコード化反応の間に少なくとも１つのコード化反応生成物に導入された少なくとも１つの逆方向のアドレス可能なプライマー部分にハイブリダイズし、コード化反応生成物が第１のコード化反応に由来する場合、少なくとも１つのコード化反応生成物の増幅は第１の標識化プローブ１からのシグナルを生じさせ、コード化反応生成物が第２のコード化反応に由来する場合、少なくとも１つのコード化反応生成物の増幅は第２の標識化プローブ１からのシグナルを生じさせる、工程；
少なくとも２つのサンプルにおける少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを、第１のデコード反応における第１の標識化プローブ１および第２の標識化プローブ１からのシグナルの存在および量に基づいて検出および定量する工程；
コード化反応生成物混合物のアリコートを少なくとも１つの第２の反応容器２に加え、それにより、第２のデコード増幅反応物を第２の反応容器２において形成する工程；
第２のデコード増幅反応を第２の反応容器２において行う工程、
この場合、第２のデコード増幅反応物は、第１のコード化反応および第２のコード化反応の間に少なくとも１つのコード化反応生成物に導入された少なくとも１つの順方向のアドレス可能なプライマー部分の相補体にハイブリダイズし得る少なくとも１つの異なった順方向アドレスプライマーを含み、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーが、第１のコード化反応および第２のコード化反応の間に少なくとも１つのコード化反応生成物に導入された少なくとも１つの逆方向のアドレス可能なプライマー部分にハイブリダイズし、コード化反応生成物が第１のコード化反応に由来する場合、少なくとも１つのコード化反応生成物の増幅は第１の標識化プローブ１からのシグナルを生じさせ、コード化反応生成物が第２のコード化反応に由来する場合、少なくとも１つのコード化反応生成物の増幅は第２の標識化プローブ１からのシグナルを生じさせる、工程；
少なくとも２つのサンプルにおける少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを、第１のデコード反応における第１の標識化プローブ１および第２の標識化プローブ１からのシグナルの存在および量に基づいて検出および定量する工程
を包含する。
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を少なくとも２つのサンプルから検出するための方法であって、この方法は、
少なくとも１つの第１の反応容器１および第１の反応容器２を提供する工程であって、
この場合、第１の反応容器１は、第１のサンプルと、少なくとも１つの第１のプローブと、少なくとも１つの第２のプローブとを含み、この場合、少なくとも１つの第１のプローブは、６ｍｅｒの標的特異的部分と、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）が８−アザ−７−デアザアデニンである４ｍｅｒのユニバーサル塩基部分と、同定部分と、ユニバーサルな順方向プライマー部分とを含み、少なくとも１つの第２のプローブは、６ｍｅｒの標的特異的部分と、ユニバーサル塩基が８−アザ−７−デアザアデニンである４ｍｅｒユニバーサルな塩基部分と、逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、ユニバーサルな逆方向プライマー部分とを含み、
第１の反応容器２は、第２のサンプルと、少なくとも１つの第１のプローブと、少なくとも１つの第２のプローブとを含み、この場合、少なくとも１つの第１のプローブは、６ｍｅｒの標的特異的部分と、ユニバーサル塩基が８−アザ−７−デアザアデニンである４ｍｅｒのユニバーサル塩基部分と、同定部分と、ユニバーサルな順方向プライマー部分とを含み、少なくとも１つの第２のプローブは、６ｍｅｒの標的特異的部分と、ユニバーサル塩基が８−アザ−７−デアザアデニンである４ｍｅｒのユニバーサルな塩基部分と、逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、ユニバーサルな逆方向プライマー部分とを含む、工程；
第１のコード化ライゲーション反応を第１の反応容器１において行い、それにより、少なくとも１つの第１のコード化ライゲーション反応生成物を含む第１のコード化ライゲーション反応生成物混合物を形成する工程であって、この場合、少なくとも１つの第１のコード化ライゲーション反応生成物は、ユニバーサルな順方向プライマー部分と、同定部分と、第１のプローブのユニバーサル塩基部分と、標的特異的部分と、第２のプローブのユニバーサル塩基部分と、逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、ユニバーサルな逆方向プライマー部分とを含み、それによって、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の正体が少なくとも部分的には逆方向のアドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして第１のコード化ライゲーション反応におけるサンプルの正体が第１の同定部分によってコード化される、工程；
第２のコード化ライゲーション反応を第１の反応容器２において行い、それにより、少なくとも１つの第２のコード化ライゲーション反応生成物を含む第２のコード化ライゲーション反応生成物混合物を形成する工程であって、この場合、少なくとも１つの第２のコード化ライゲーション反応生成物は、ユニバーサルな順方向プライマー部分と、同定部分と、ユニバーサル塩基部分と、標的特異的部分と、第２のプローブのユニバーサル塩基部分と、逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、ユニバーサルな逆方向プライマー部分とを含み、それによって、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の正体が少なくとも部分的には逆方向のアドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして、それによって第２のコード化ライゲーション反応におけるサンプルの正体が第２の同定部分によってコード化される、工程；
第１の反応容器１からの第１のコード化ライゲーション反応生成物混合物を第１の反応容器２からの第２のコード化ライゲーション反応生成物混合物と合わせ、それにより、コード化ライゲーション反応生成物混合物を形成する工程；
ユニバーサルな順方向プライマーおよびユニバーサルな逆方向プライマーを含むユニバーサルＰＣＲ増幅を、少なくとも１つの第１の反応容器において、または、必要に応じて、異なる反応容器において行う工程；
少なくとも１つの第２の反応容器１および第２の反応容器２を提供する工程であって、
この場合、第２の反応容器１は、少なくとも１つのユニバーサルな順方向プライマーと、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーと、少なくとも１つの第１の標識化プローブ１と少なくとも１つの第２の標識化プローブ１とを含み、第１の標識化プローブ１が、第１の反応容器１からの少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の第１の同定部分に対して相補的であるか、または、第１の反応容器１からの少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の第１の同定部分の相補体に対して相補的であり、そして第２の標識化プローブ１が、第１の反応容器２からの少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の第２の同定部分に対して相補的であるか、または、第１の反応容器２からの少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の第２の同定部分の相補体に対して相補的であり、
第２の反応容器２は、少なくとも１つのユニバーサルな順方向プライマーと、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーと、少なくとも１つの第１の標識化プローブ１と、少なくとも１つの第２の標識化プローブ１とを含み、第１の標識化プローブ１が、第１の反応容器１からの少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の第１の同定部分に対して相補的であるか、または、第１の反応容器１からの少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の第１の同定部分の相補体に対して相補的であり、そして第２の標識化プローブ１が、第１の反応容器２からの少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の第２の同定部分に対して相補的であるか、または、第１の反応容器２からの少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の第２の同定部分の相補体に対して相補的である、工程；
コード化ライゲーション反応生成物混合物のアリコートを少なくとも１つの第２の反応容器１に加え、それにより、第１のデコード増幅反応物を第２の反応容器１において形成する工程；
第１のデコード増幅反応を第２の反応容器１において行う工程であって、
この場合、第１のデコード増幅反応物は、第１のコード化ライゲーション反応および第２のコード化ライゲーション反応の間に少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物に導入された少なくとも１つのユニバーサルな順方向プライマー部分の相補体にハイブリダイズし得る少なくとも１つのユニバーサルな順方向プライマーを含み、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーが、第１のコード化ライゲーション反応および第２のコード化ライゲーション反応の間に少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物に導入された少なくとも１つの逆方向のアドレス可能なプライマー部分にハイブリダズし、コード化ライゲーション反応生成物が第１のコード化ライゲーション反応に由来する場合、少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の増幅は第１の標識化プローブ１からのシグナルを生じさせ、コード化ライゲーション反応生成物が第２のコード化反応に由来する場合、少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の増幅は第２の標識化プローブ１からのシグナルを生じさせる、工程；
少なくとも２つのサンプルにおける少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを、第１のデコード反応における第１の標識化プローブ１および第２の標識化プローブ１からのシグナルの存在および量に基づいて検出および定量する工程；
コード化ライゲーション反応生成物混合物のアリコートを少なくとも１つの第２の反応容器２に加え、それにより、第２のデコード増幅反応物を第２の反応容器２において形成する工程；
第２のデコード増幅反応を第２の反応容器２において行う工程であって、
この場合、第２のデコード増幅反応物は、第１のコード化ライゲーション反応および第２のコード化ライゲーション反応の間に少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物に導入された少なくとも１つのユニバーサルな順方向プライマー部分の相補体にハイブリダイズし得る少なくとも１つのユニバーサルな順方向プライマーを含み、少なくとも１つの逆方向アドレスプライマーが、第１のコード化ライゲーション反応および第２のコード化ライゲーション反応の間に少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物に導入された少なくとも１つの逆方向のアドレス可能なプライマー部分にハイブリダイズし、コード化ライゲーション反応生成物が第１のコード化ライゲーション反応に由来する場合、少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の増幅は第１の標識化プローブ１からのシグナルを生じさせ、コード化ライゲーション反応生成物が第２のコード化反応に由来する場合、少なくとも１つのコード化ライゲーション反応生成物の増幅は第２の標識化プローブ１からのシグナルを生じさせる、工程；
少なくとも２つのサンプルにおける少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを、第１のデコード反応における第１の標識化プローブ１および第２の標識化プローブ１からのシグナルの存在および量に基づいて検出および定量する工程
を包含する。
いくつかの実施形態において、本発明の教示は、プローブ組と、乾燥させたプライマーおよび必要に応じて少なくとも１つの標識化プローブを有する固体支持体と、マスターミックスとを含む、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列を検出するためのキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明の教示は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを少なくとも１つのサンプルにおいて検出するための方法を提供し、この方法は、
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを調べるための少なくとも１つの工程；
少なくとも１つのライゲーション生成物を生じさせるための少なくとも１つの工程；および
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出するための少なくとも１つの工程
を包含する。
いくつかの実施形態において、本発明の教示は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを少なくとも１つのサンプルにおいて検出するための方法を提供し、この方法は、
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを調べるための少なくとも１つの工程；
少なくとも１つのライゲーション生成物を生じさせるための少なくとも１つの工程；
少なくとも１つの増幅されたライゲーション生成物を生じさせるための少なくとも１つの工程；および
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出するための少なくとも１つの工程
を包含する。
いくつかの実施形態において、本発明の教示は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを少なくとも１つのサンプルにおいて検出するための方法を提供し、この方法は、
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを調べるための少なくとも１つの工程；
少なくとも１つのライゲーション生成物を生じさせるための少なくとも１つの工程；
取り込まれていない反応成分を除くための少なくとも１つの工程；および
少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出するための少なくとも１つの工程
を包含する。
いくつかの実施形態において、本発明の教示は、ライゲーションのための少なくとも１つの手段、増幅するための少なくとも１つの手段、除去するための少なくとも１つの手段、またはこれらの組合せを含む、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出するためのキットを提供する。
当業者は、下記に記載される図面が例示目的のためだけであることを理解する。図面は、いかなる点でも、本発明の教示の範囲を限定することが意図されない。
（例示的な実施形態の説明）
本明細書中で使用される節の見出しは構成上の目的のためだけであり、記載された主題を限定するとして決して解釈されるべきではない。特許、特許出願、論文、書籍、学術論文およびインターネットウェブページ（これらに限定されない）を含む本明細書において引用されるすべての文献および類似する資料は、明示的に、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。
前記の一般的な記載および下記の詳細な記載はともに単に例示および説明に過ぎず、本発明の教示の限定でないことが理解されなければならない。本出願において、単数形の使用は、別途具体的に言及されない限り、複数を包含する。例えば、「プローブ」は、２つ以上のプローブが存在し得ることを意味する。また、「または」の使用は、別途言及されない限り、「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「包含する（含む）（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定であることは意図されない。
（１．定義）
本明細書中で使用される場合、本発明の教示の「プローブ」、「プライマー」、「標的」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸塩基配列」および「オリゴマー」は、少なくとも１つのリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、改変リボヌクレオチド、改変デオキシリボヌクレオチド、改変されたリン酸−糖骨格のオリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および、これらの組合せから構成され得、そして、適切な場合、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、または二本鎖配列および一本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。いくつかのより詳細かつ非限定的な定義が下記に提供される。
本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド」は、下記で定義される下記の用語を一般に包含する：ヌクレオチド塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドアナログおよびユニバーサルヌクレオチド。
本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド塩基」は、置換または非置換の親芳香族環をいう。いくつかの実施形態において、上記芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を含有する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド塩基は、適切に相補的なヌクレオチド塩基とのワトソン・クリック型水素結合および／またはフーグスティーン型水素結合を形成し得る。例示的なヌクレオチド塩基およびそのアナログとしては、下記の化合物が挙げられるが、これらに限定されない：プリン、例えば、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、アデニン（Ａ）、エテノアデニン、Ｎ６−Δ２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−Δ２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ６−メチルアデニン、グアニン（Ｇ）、イソグアニン、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、２−チオピリミジン、６−チオグアニン（６ｓＧ）、ヒポキサンチンおよびＯ６−メチルグアニンなど；７−デアザプリン、例えば、７−デアザアデニン（７−デアザ−Ａ）および７−デアザグアニン（７−デアザ−Ｇ）など；ピリミジン、例えば、シトシン（Ｃ）、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、チミン（Ｔ）、４−チオチミン（４ｓＴ）、５，６−ジヒドロチミン、Ｏ４−メチルチミン、ウラシル（Ｕ）、４−チオウラシル（４ｓＵ）および５，６−ジヒドロウラシル（ジヒドロウラシル；Ｄ）など；インドール、例えば、ニトロインドールおよび４−メチルインドールなど；ピロール、例えば、ニトロピロールなど；ネブラリン；塩基（Ｙ）など。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド塩基は、ユニバーサルヌクレオチド塩基である。さらなる例示的なヌクレオチド塩基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｌｏｇｙ，ｐｐ．３８５−３９４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．およびそれにおける引用参考文献に見出され得る。ユニバーサル塩基のさらなる例が、例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎ．Ａ．Ｒ．，２００１，ｖｏｌ．２９：２４３７−２４４７および、Ｓｅｅｌａ Ｎ．Ａ．Ｒ．，２０００，ｖｏｌ．２８：３２２４−３２３２に見出され得る。
本明細書中で使用される用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチド塩基がペントース糖のＣ−１’炭素に共有結合的に連結している化合物をいう。いくつかの実施形態において、連結は複素環式芳香族環窒素を介してである。典型的なペントース糖には、炭素原子の１つまたは複数が、それぞれが独立して、同じかまたは異なる−−Ｒ基、−−ＯＲ基、−−ＮＲＲ基またはハロゲン基（式中、それぞれのＲは独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールである）の１つまたは複数により置換されるペントースが含まれるが、これらに限定されない。ペントース糖は、飽和であっても不飽和であってもよい。例示的なペントース糖およびそのアナログとしては、リボース、２’−デオキシリボース、２’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボースおよび２’−デオキシ−３’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボースが挙げられるが、これらに限定されない。また、例えば、２’−Ｏ−メチル，４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド（Ａｓｓｅｌｉｎｅ（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０６７−７４）、２’−４’−連結および３’−４’−連結ならびに他の「ロックされた」または「ＬＮＡ」、二環式の糖修飾（ＷＯ９８／２２４８９；ＷＯ９８／３９３５２；ＷＯ９９／１４２２６）もまた参照のこと。「ＬＮＡ」すなわち「ロックされた核酸」は、リボース環が２’−酸素と３’−炭素または４’−炭素との間でのメチレン連結によって制約されるように立体配座的にロックされるＤＮＡアナログである。上記連結によって強いられる立体配座制約は、多くの場合、相補的な配列について結合親和性を増大させ、そしてそのような二重鎖の熱安定性を増大させる。
ポリヌクレオチド内における例示的なＬＮＡ糖アナログは下記の構造を含む：
Figure 2007530048
Figure 2007530048
 式中、Ｂは任意の核酸塩基である。
糖は２’位または３’位において改変を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモなどを含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、Ｌ型立体配座異性体（Ｌ形態）と同様に、天然のＤ型立体配座異性体（Ｄ形態）を含む（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ、米国特許第６，２５１，６６６号；Ｃｈｕ、米国特許第５，７５３，７８９号；Ｓｈｕｄｏ、欧州特許第０５４０７４２号；Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０），Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４５３；Ｕｒａｔａ（１９９３），Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０）。核酸塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）であるとき、リボース糖は核酸塩基のＮ９位に結合する。核酸塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）であるとき、ペントース糖は核酸塩基のＮ１位に結合する（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
ヌクレオシドのペントース炭素の１つまたは複数を、下記の式を有するリン酸エステルにより置換することができる：
Figure 2007530048
 式中、αは０〜４の整数である。いくつかの実施形態において、αは２であり、リン酸エステルがペントースの３’位または５’位の炭素に結合する。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、ヌクレオチド塩基が、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、ユニバーサルヌクレオチド塩基、特定のヌクレオチド塩基、または、それらのアナログであるヌクレオシドである。
本明細書中で使用される用語「ヌクレオチドアナログ」は、ヌクレオシドのペントース糖および／またはヌクレオチド塩基および／または１つもしくは複数のリン酸エステルがそのそれぞれのアナログにより置換され得る実施形態をいう。いくつかの実施形態において、例示的なペントース糖アナログは上記のペントース糖アナログである。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、上記で記載されるようなヌクレオチド塩基アナログを有する。いくつかの実施形態において、例示的なリン酸エステルアナログは、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルホロセレノエート、ホルホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなど（これらに限定されない）を含み、また、関連した対イオンを含むことができる。他の核酸アナログおよび塩基には、例えば、インターカレーション核酸（ＩＮＡ、ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＰｅｄｅｒｓｅｎ（２００２）に記載されるような核酸）、および、ＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ、米国特許第５，４３２，２７２号）が含まれる。様々な核酸アナログのさらなる記載が、例えば、（Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４９（１０）：１９２５（１９９３）およびそれにおける参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら，Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号に見出され得る。他の核酸アナログは、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９）、０−メチルホスホロアミダイト連結（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、陽性の骨格を有するアナログ（Ｄｅｎｐｃｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７（１９９５））、非イオン性の骨格を有するアナログ（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号、Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７（１９４）：第２章および第３章，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ（編））；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら，Ｊ．Ｂｉｏｒｎｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、および、非リボース骨格を有するアナログ（米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびに、第６章および第７章，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ（編））に記載されるものを含む）を含む。１つまたは複数の炭素環糖を含有する核酸もまた核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）、１６９頁〜１７６頁を参照のこと）。いくつかの核酸アナログがまた、Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日、３５頁に記載される。
本明細書中で使用される用語「ユニバーサルヌクレオチド塩基」または「ユニバーサル塩基」は、窒素原子を含有してもしなくてもよい、芳香族環部分をいう。いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基は、ペントース糖のＣ−１’炭素に共有結合的に結合して、ユニバーサルなヌクレオチドを作製し得る。いくつかの実施形態において、ユニバーサルヌクレオチド塩基は、別のヌクレオチド塩基と特異的に水素結合しない。いくつかの実施形態において、ユニバーサルヌクレオチド塩基は、特定の標的ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド塩基およびすべてのヌクレオチド塩基を含むヌクレオチド塩基と水素結合する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド塩基は、疎水性スタッキングによって同じ核酸鎖上において隣接ヌクレオチド塩基と相互作用し得る。ユニバーサルヌクレオチドには、デオキシ−７−アザインドール三リン酸（ｄ７ＡＩＴＰ）、デオキシイソカルボスチリル三リン酸（ｄＩＣＳＴＰ）、デオキシプロピニルイソカルボスチリル三リン酸（ｄＰＩＣＳＴＰ）、デオキシメチル−７−アザインドール三リン酸（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、デオキシＩｍＰｙ三リン酸（ｄＩｍＰｙＴＰ）、デオキシＰＰ三リン酸（ｄＰＰＴＰ）またはデオキシプロピニル−７−アザインドール三リン酸（ｄＰ７ＡＩＴＰ）が含まれるが、これらに限定されない。このようなユニバーサル塩基のさらなる例が、とりわけ、公開された米国特許出願第１０／２９０６７２号および米国特許第６，４３３，１３４号に見出され得る。
本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は交換可能に使用され、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合の連結（例えば、３’−５’および２’−５’の逆になった連結、例えば、３’−３’および５’−５’の分岐型構造、または、ヌクレオチド間アナログ）によって連結されたヌクレオチドモノマー（２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む）の一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、関連した対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）を有する。ポリヌクレオチドは、全体がデオキシリボヌクレオチドから、または、全体がリボヌクレオチドから、または、それらのキメラな混合物から構成され得る。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間アナログ、核酸塩基アナログおよび／または糖アナログから構成され得る。ポリヌクレオチドは、典型的には、サイズにおいて、モノマーユニットが数個から、例えば、３個〜４０個（これらは、より一般には、しばしば、オリゴヌクレオチドとこの分野では呼ばれる）から、数千個のモノマーヌクレオチドユニットまでに及ぶ。別途示されない限り、ポリヌクレオチド配列が表されるときは常に、ヌクレオチドは、左から右に、５’から３’の順であり、かつ、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシトシンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」がチミジンを示すことが理解される。
本明細書中で使用される「核酸塩基」は、核酸技術を利用するか、または、ペプチド核酸技術を利用して、それにより、核酸に配列特異的に結合することができるポリマーを作製する当業者には一般に知られている、天然に存在する複素環部分および天然には存在しない複素環部分を意味する。好適な核酸塩基の非限定的な例には、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニルウラシル、２−チオ−５−プロピニルウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）が含まれる。好適な核酸塩基の他の非限定的な例には、Ｂｕｃｈａｒｄｔら，（ＷＯ９２／２０７０２またはＷＯ９２／２０７０３）の図２（Ａ）および図２（Ｂ）に例示される核酸塩基が含まれる。
本明細書中で使用される「核酸塩基配列」は、核酸塩基含有サブユニットを含むポリマーの任意のセグメント、または、そのようなポリマーの２つ以上のセグメントの集合体（例えば、２つ以上のオリゴマーブロックの集合した核酸塩基配列）を意味する。好適なポリマーまたはポリマーセグメントの非限定的な例には、オリゴデオキシリボヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡ組合せオリゴマー、核酸アナログおよび／または核酸模倣物が含まれる。
本明細書中で使用される「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基サブユニットを含む完全な一本鎖ポリマー鎖を意味する。例えば、二本鎖核酸の一本鎖核酸鎖はポリ核酸塩基鎖である。
本明細書中で使用される「核酸」は、ヌクレオチドまたはそのアナログから形成された骨格を有する核酸塩基配列含有ポリマーまたはポリマーセグメントである。好ましい核酸はＤＮＡおよびＲＮＡである。
本明細書中で使用される「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、核酸サブユニット（またはそのアナログ）ではなく、２つ以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含む任意のオリゴマーまたはポリマーセグメント（例えば、ブロックオリゴマー）を意味し、これには、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号および同第６，１０７，４７０号（これらのすべては参考として本明細書中に援用される）においてペプチド核酸といわれるか、または、ペプチド核酸として特許請求されるオリゴマーまたはポリマーセグメントのいずれか（これらに限定されない）が含まれる。用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」はまた、下記の刊行物に記載される核酸模倣物の２つ以上のサブユニットを含む任意のオリゴマーまたはポリマーセグメントにも適用するべきである：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１（１９９７）１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５５５〜５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．，３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，３：９１２〜９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（９）：１２６９−１２７２（２００１）；および、ＷＯ９６／０４０００に開示されるようなＳｈａｈらのペプチドベースの核酸模倣物（ＰＥＮＡＭ）。
いくつかの実施形態において、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、米国特許出願公開２００３／００７７６０８Ａ１の段落番号７６に見出される式の２つ以上の共有結合的に連結されたサブユニットを含むオリゴマーまたはポリマーのセグメントであり、この場合、各Ｊは同じかまたは異なり、Ｈ、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、ＮＲ１ ２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群より選択される。各Ｋは同じかまたは異なり、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１からなる群より選択される。各Ｒ１は同じかまたは異なり、ヘテロ原子または置換アリール基もしくは非置換アリール基を必要に応じて含有し得る１個〜５個の炭素原子を有するアルキル基である。各Ａは、単結合、式−（ＣＪ２）ｓ−の基および式−（ＣＪ２）ｓＣ（Ｏ）−の基からなる群より選択され、この場合、Ｊは上記で定義され、各ｓは１〜５の整数である。各ｔは１または２であり、各ｕは１または２である。各Ｌは同じかまたは異なり、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、他の天然に存在する核酸塩基アナログまたは他の天然には存在しない核酸塩基から独立して選択される。
いくつかの他の実施形態において、ＰＮＡサブユニットは、Ｎ−［２−（アミノエチル）］グリシン骨格のＮ−α−グリシン窒素にメチレンカルボニル連結を介して結合した天然に存在する核酸塩基または天然に存在しない核酸塩基からなる（これは現在、ペプチド核酸サブユニットの最も一般的に使用されている形態である）。
本明細書中で使用される「標的ポリヌクレオチド配列」は、決定されることが求められるポリ核酸塩基鎖の核酸塩基配列である。標的配列の性質は本発明の教示の限定でないことが理解されなければならない。標的配列を含むポリ核酸塩基鎖は任意の供給源から提供され得る。例えば、標的配列は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ＰＮＡ、核酸アナログまたは他の核酸模倣物の一部として存在し得る。標的は、メチル化されていても、メチル化されていなくても、または両方であってもよい。標的配列を含有するサンプルを任意の供給源から得ることができ、そのようなサンプルは本発明の教示の限定ではない。さらに、「標的」は「標的ポリヌクレオチド配列」ならびにその代用物（例えば、ライゲーション生成物、増幅生成物、および、それらにおいてコードされる配列）の両方をいい得ることが理解される。
本明細書中で使用される用語「プライマー部分」は、プライマーが、当該分野で公知の様々なプライマーヌクレオチド伸張反応のいずれか（例えば、ＰＣＲ）のためにアニーリングし得るテンプレートとして直接に役立ち得るか、または、その相補体によって役立ち得るポリヌクレオチド配列の領域をいう。２つのプライマー部分が１つのポリヌクレオチド（例えば、ＯＬＡ生成物、ＰＣＲ生成物など）に存在するとき、これら２つのプライマー部分の配向は一般に異なることが当業者によって理解される。例えば、１つのＰＣＲプライマーは第１のプライマー部分に直接にハイブリダイズし得、一方、もう一方のＰＣＲプライマーは第２のプライマー部分の相補体にハイブリダイズし得る。別の言い方をすれば、第１のプライマー部分はセンス配向であり得るし、第２のプライマー部分はアンチセンス配向であり得る。加えて、本明細書中で使用される「ユニバーサル」プライマーおよび「ユニバーサル」プライマー部分は、一般には、アッセイの特異性を確保するために、特定のアッセイおよび宿主ゲノムを考えた場合、できる限り特有であるように選ばれる。しかしながら、当業者によって理解されるように、異なる構成のプライマー部分を使用することができ、例えば、１つの反応で、第１のプライマー部分または一連のプライマー部分を有する５００個の上流側プローブ、および、第２のプライマー部分または一連のプライマー部分を有する５００個の下流側プローブを利用することができる。さらに、ユニバーサルプライマー部分のすべてを反応においてすべての標的について同じにすることができ、それにより、例えば、単一の上流側プライマーおよび単一の下流側プライマーにより、すべての標的を増幅することが可能になり、そして／または、単一のプライマーが、すべての標的を増幅するための上流側プライマーおよび下流側プライマーの両方として役立つことを可能にする。あるいは、「一連」のユニバーサルな上流側プライマー部分および一連のユニバーサルな下流側プライマー部分を同時または逐次的のいずれかで使用することができる。いくつかの実施形態において、プライマー部分の少なくとも１つはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ部位を含み得る。
本明細書中で使用される「順方向」および「逆方向」は、標的上におけるプローブの相対的な配向を示すために使用され、一般には、標的ポリヌクレオチドの「上部」鎖の３’末端にハイブリダイズされる５’から３’への「順方向」配向のプライマー、および、ポリヌクレオチド標的の下部鎖の３’末端にハイブリダイズされる５’から３’への「逆方向」配向のプライマーをいう。当業者によって認識されるように、これらの用語は、限定であることは意図されず、むしろ、任意の所定の実施形態において例示的な配向を提供する。
本明細書中で使用される用語「サンプル」は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列が得られる混合物をいい、そのような供給源には、生ウイルス、原核生物、原生生物、真核生物、植物、真菌および動物が含まれるが、これらに限定されない。これらのサンプル供給源には、全血、組織生検物、リンパ、骨髄、羊水、毛髪、皮膚、精液、生物戦争剤（ｂｉｏｗａｒｅｆａｒｅ ａｇｅｎｔ）および分泌物、膣分泌物、汗、様々な環境サンプル（例えば、農学的な水および土壌）、一般的な研究サンプル、一般的な精製サンプル、および、培養細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。核酸は、当該分野で公知の様々な手順のいずれかを使用して、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＴＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ、および、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ６７００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、Ｂｏｏｍらの米国特許第５，２３４，８０９号などを使用してサンプルから単離され得ることが理解される。核酸は、機械的な力、超音波、制限エンドヌクレアーゼ切断、または、当該分野で公知の任意の方法のような手順の使用を含めて、分析前に切断または剪断され得ることが理解される。
所定の標的ポリヌクレオチド配列を調べるためのプローブの選択、そしてどの標的ポリヌクレオチド配列を所定の反応においてプールすべきかの選択は、当該分野で一般に公知の手順を伴い、そして、最小限の二次構造および三次構造を有する配列、ゲノムの他の領域との最小限の配列冗長性を有する標的、望ましい熱力学的特性を有する標的領域、および手近な状況について望ましい他のパラメーターについて選択するためのアルゴリズムの使用を伴い得ることが理解される。いくつかの実施形態において、プローブはさらに、望ましい熱力学的特性をさらに提供するために、様々な改変（例えば、副溝結合因子（例えば、米国特許第６，４８６，３０８号を参照のこと）などを含むことができる。
本明細書中で使用される用語「またはその組合せ」は、この用語の前に置かれている列挙された項目のすべての順列および組合せを示す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣの少なくとも１つを含むことが意図され、そして、順序が特定の状況において重要であるならば、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣまたはＣＡＢもまた含むことが意図される。この例を続けると、１つまたは複数の項目または用語の反復を含有する組合せ、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどが明らかに含まれる。当業者は、状況から別途明らかでない限り、典型的には、任意の組合せにおける項目または用語の数に対する制限がないことを理解する。
本明細書中で使用される用語「標的特異的部分」は、標的ポリヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドの一部分をいう。
本明細書中で使用される用語「対応する」は、この用語が示す要素の間での少なくとも１つの特異的な関係をいう。例えば、ある特定の上流側プローブ組の少なくとも１つの第１のプローブは同じプローブ組の少なくとも１つの下流側プローブに対応し、そして、逆に、ある特定の下流側プローブ組の少なくとも１つの第１のプローブは同じプローブ組の少なくとも１つの上流側プローブに対応する。少なくとも１つのプライマーが、少なくとも１つの対応するプローブのプライマー部分と、少なくとも１つの対応するライゲーション生成物と、少なくとも１つの対応する増幅されたライゲーション生成物と、またはそれらの組合せとアニーリングするように設計される。ある特定のプローブ組の各プローブの標的特異的部分は、対応する標的核酸配列の相補的な領域または実質的に相補的な領域とハイブリダイズするように設計され得る。特定の親和性部分を、対応する親和性部分結合体（例えば、親和性部分ビオチンに結合する親和性部分結合体ストレプトアビジン（これに限定されない））に結合させることができる。特に可動性プローブは、対応する識別子部分相補体などとハイブリダイズし得る。
本明細書中で使用される用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は交換可能に使用され、二重鎖、三重鎖または他のより高次の構造の形成をもたらす、１つの核酸と別の核酸との相補的な塩基対形成相互作用を意味する。いくつかの実施形態において、一次相互作用はワトソン・クリック型水素結合形成およびフーグスティーン型水素結合形成によって塩基特異的である（例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃ）。いくつかの実施形態において、塩基スタッキングの相互作用および疎水性相互作用もまた二重鎖の安定性に寄与し得る。核酸のプローブおよびプライマーを、相補的な標的配列および実質的に相補的な標的配列にハイブリダイズさせるための様々な条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（編），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５））ならびにＪ．ＷｅｔｍｕｒおよびＮ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９略（１９６８）に記載されるように、周知である。一般に、そのようなアニーリングが生じるかどうかは、とりわけ、プローブおよび相補的な標的配列の長さ、ｐＨ、温度、一価カチオンおよび二価カチオンの存在、ハイブリダイゼーション領域におけるＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドの割合、媒体の粘度、ならびに、変性剤の存在によって影響される。このような変数は、ハイブリダイゼーションのために必要とされる時間に影響を及ぼす。従って、好ましいアニーリング条件は特定の適用に依存する。しかしながら、このような条件は、過度な実験を伴うことなく、当業者によって慣用的に決定され得る。さらに、一般に、本発明の教示のプローブおよびプライマーは、標的配列に対して相補的であるように設計され、その結果、標的およびプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーションが生じる。しかしながら、この相補性は完全である必要がないことが理解される。標的配列と本発明の教示の一本鎖核酸との間でのハイブリダイゼーションを妨げる、かなり多数の塩基対ミスマッチが存在し得る。しかしながら、塩基対ミスマッチの数が非常に多く、ハイブリダイゼーションが、少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとでさえ生じ得ないならば、その配列は相補的な標的配列ではない。従って、本明細書中における「実質的に相補的な」によって、プローブまたはプライマーが、選択された反応条件のもとでハイブリダイゼーションするために標的配列に対して十分に相補的であることが意味される。
本明細書中で使用される用語「標識」は、オリゴヌクレオチド、標識化プローブ、可動性プローブに結合することができるか、または、そうでない場合には、レポーターシステムにおいて使用することができ、それによりその分子を装置または方法によって検出可能にする検出可能な部分をいう。例えば、標識は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する任意の部分；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変する任意の部分；または（ｉｉｉ）捕獲機能（例えば、疎水性親和性、抗体／抗原、イオン的複合体形成）をもたらす任意の部分であり得る。当業者は、レポーター標識の多くの異なる化学種が、個々に、あるいは、１つまたは複数の異なる標識との組合せでのいずれかで本発明の教示において使用され得ることを理解する。例示的な標識には、フルオロフォア、放射性同位体、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ、色素原、Ｓｙｂｒ ＧｒｅｅｎＴＭ、酵素、抗原（これには、エピトープタグが含まれるが、これに限定されない）、重金属、色素、リン光基、化学発光基、電気化学的検出部分、親和性タグ、結合性タンパク質、リン光体、希土類キレート、近赤外色素（これには、「Ｃｙ．７．ＳＰｈ．ＮＣＳ」、「Ｃｙ．７．ＯｐｈＥｔ．ＮＣＳ」、「Ｃｙ７．ＯｐｈＥｔ．ＣＯ２Ｓｕ」および「ＩＲＤ８００」が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｊ．Ｆｌａｎａｇａｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，８：７５１−５６（１９９７）；および、ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ＩＲＤ８００ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ，ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃１１１，ＬＩ−ＣＯＲ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥを参照のこと）、電気化学発光標識（これには、トリス（ビピリダル）ルテニウム（ＩＩ）（これはまた、Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋として知られている）、Ｏｓ（１，１０−フェナントロリン）２ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン２＋（これはまた、Ｏｓ（ｐｈｅｎ）２（ｄｐｐｅｎｅ）２＋として知られている）、ルミノール／過酸化水素、Ａｌ（ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸）、９，１０−ジフェニルアントラセン−２−スルホネート、およびトリス（４−ビニル−４’−メチル−２，２’−ビピリダル）ルテニウム（ＩＩ）（これはまた、Ｒｕ（ｖ−ｂｐｙ３）２＋として知られている）などが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
ＥＣＬ部分および電気化学発光部分の詳細な記述は、とりわけ、Ａ．ＢａｒｄおよびＬ．Ｆａｕｌｋｎｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（２００１）；Ｍ．ＣｏｌｌｉｎｓｏｎおよびＭ．Ｗｉｇｈｔｍａｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６５：２５７６略（１９９３）；Ｄ．ＢｒｕｎｃｅおよびＭ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７４：３１５７略（２００２）；Ａ．Ｋｎｉｇｈｔ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１８：４７略（１９９９）；Ｂ．Ｍｕｅｇｇｅら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５：１１０２略（２００３）；Ｈ．Ａｂｒｕｎｄａら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：２６４１略（１９８２）；Ｋ．Ｍａｎｅｓｓら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１０６０９略（１９９６）；Ｍ．ＣｏｌｌｉｎｓｏｎおよびＲ．Ｗｉｇｈｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１８８３略（１９９５）；ならびに米国特許第６，４７９，２３３号に見出され得る。
本明細書中で使用される用語「フルオロフォア」は、光を第１の波長で吸収し、そしてその吸収事象に応答して蛍光性の光を第２の波長で放射する共鳴−非局在化系または芳香族環系を含む標識をいう。広範囲の様々なそのような色素分子が当該分野で公知である。例えば、蛍光性色素を、様々な種類の蛍光性化合物（例えば、キサンテン、ローダミン、フルオレセイン、シアニン、フタロシアニン、スクアレイン（ｓｑｕａｒａｉｎ）およびｂｏｄｉｐｙ色素など）のいずれかから選択することができる。いくつかの実施形態において、上記色素は、下記の形態の縮合三環系を含有するキサンテン型色素を含む：
Figure 2007530048
 この親キサンテン環は非置換であってもよく（すなわち、すべての置換基がＨである）か、あるいは、様々な同じかまたは異なる置換基（例えば、下記に記載されるような置換基）の１つまたは複数により置換され得る。いくつかの実施形態において、色素は、下記の一般式を有する親キサンテン環を含有する：
Figure 2007530048
 上記で示された親キサンテン環において、Ａ１はＯＨまたはＮＨ２であり、Ａ２はＯまたはＮＨ２ ＋である。Ａ１がＯＨであり、かつ、Ａ２がＯであるとき、親キサンテン環はフルオレセイン型のキサンテン環である。Ａ１がＮＨ２であり、かつ、Ａ２がＮＨ２ ＋であるとき、親キサンテン環はローダミン型のキサンテン環である。Ａ１がＮＨ２であり、かつ、Ａ２がＯであるとき、親キサンテン環はロードール（ｒｈｏｄｏｌ）型のキサンテン環である。上記で示された親キサンテン環において、Ａ１およびＡ２の一方または両方の窒素（存在するとき）、ならびに／あるいは、Ｃ１位、Ｃ２位、Ｃ４位、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ８位およびＣ９位における炭素原子の１つまたは複数は独立して、広範囲の様々な同じかまたは異なる置換基により置換され得る。いくつかの実施形態において、典型的な置換基には、−Ｘ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲＲ、ペルハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＣＸ３、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲおよび−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲ（式中、各Ｘは独立して、ハロゲン（好ましくは、−ＦまたはＣｌ）であり、各Ｒは独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルカニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２６）アリールアルキル、（Ｃ５〜Ｃ２０）アリールアリール、ヘテロアリール、６員〜２６員のヘテロアリールアルキル、５員〜２０員のヘテロアリールヘテロアリール、カルボキシ、アセチル、スルホニル、スルフィニル、スルホン、ホスファートまたはホスホネートである）が含まれ得るが、これらに限定されない。その上、Ｃ１およびＣ２の置換基ならびに／またはＣ７およびＣ８の置換基は一緒になって、置換または非置換のブタ［１，３］ジエノ架橋または（Ｃ５〜Ｃ２０）アリーレノ架橋を形成し得る。一般に、親キサンテン環の蛍光を消光する傾向がない置換基が好ましく、しかし、いくつかの実施形態では、消光性の置換基が望ましい場合がある。親キサンテン環の蛍光を消光する傾向がある置換基は電子求引性基であり、例えば、−ＮＯ２、−Ｂｒおよび−Ｉなどである。いくつかの実施形態において、Ｃ９は置換されない。いくつかの実施形態において、Ｃ９はフェニル基により置換される。いくつかの実施形態において、Ｃ９はフェニル以外の置換基により置換される。Ａ１がＮＨ２であり、かつ／または、Ａ２がＮＨ２ ＋であるとき、これらの窒素は、同じ窒素原子または隣接する炭素原子を伴う１つまたは複数の架橋（例えば、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルジイル架橋、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキレノ架橋、２員〜１２員のヘテロアルキルジイル架橋、および／または、２員〜１２員のヘテロアルキレノ架橋）に含まれ得る。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９の炭素ならびに／あるいはＣ３および／またはＣ６における窒素原子での置換基（存在するとき）はいずれも、同じかまたは異なる置換基の１つまたは複数によりさらに置換され得、この場合、そのような置換基は、典型的には、−Ｘ、−Ｒ’、＝Ｏ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、＝Ｓ、−ＮＲ’Ｒ’、＝ＮＲ’、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＮＨＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’および−Ｃ（ＮＲ）ＮＲ’Ｒ’（式中、各Ｘは独立して、ハロゲン（好ましくは、−Ｆまたは−Ｃｌ）であり、各Ｒ’は独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、２員〜６員のヘテロルキル、（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールまたはヘテロアリール、カルボキシ、アセチル、スルホニル、スルフィニル、スルホン、ホスフェートまたはホスホネートである）から選択される。
例示的な親キサンテン環には、ローダミン型の親キサンテン環、および、フルオレセイン型の親キサンテン環が含まれるが、これらに限定されない。
１つの実施形態において、色素は、下記の環系を含むローダミン型キサンテン色素を含有する：
Figure 2007530048
 上記で示された、ローダミン型キサンテン環において、一方または両方の窒素、ならびに／あるいは、Ｃ１位、Ｃ２位、Ｃ４位、Ｃ５位、Ｃ７位またはＣ８位における炭素の１つまたは複数は、独立して、例えば、親キサンテン環について記載されたように、広範囲の様々な同じかまたは異なる置換により置換され得る。Ｃ９は水素または他の置換基（例えば、オルトカルボキシフェニル基またはオルト（スルホン酸）フェニル基など）により置換され得る。例示的なローダミン型キサンテン色素には、米国特許第５，９３６，０８７号、同第５，７５０，４０９号、同第５，３６６，８６０号、同第５，２３１，１９１号、同第５，８４０，９９９号、同第５，８４７，１６２号および同第６，０８０，８５２号（Ｌｅｅら）；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９７／３６９６０および同ＷＯ９９／２７０２０；Ｓａｕｅｒら，Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ５（３）：２４７−２６１（１９９５）；Ａｒｄｅｎ−Ｊａｃｏｂ，Ｎｅｕｅ Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ Ｘａｎｔｈｅｎ−Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ ｆｕｅｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｓｏｎｄｅｎ ｕｎｄ Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ Ｌａｓｅｒ，Ｖｅｒｌａｇ Ｓｈａｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９９３）；ならびに、Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２４７１−２４８３（１９９２）に記載されるローダミン色素のキサンテン環が含まれ得るが、これらに限定されない。「ローダミン型キサンテン環」の定義にはまた、米国特許出願第０９／３２５，２４３号（１９９９年６月３日出願）に記載される拡張型ローダミン色素の拡張された共役キサンテン環が含まれる。
いくつかの実施形態において、色素は、下記の構造を有するフルオレセイン型の親キサンテン環を含む：
Figure 2007530048
 上記で記載されたフルオレセイン型の親キサンテン環において、Ｃ１位、Ｃ２位、Ｃ４位、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ８位およびＣ９位における炭素の１つまたは複数は、独立して、親キサンテン環について上記で記載されたように、広範囲の様々な同じかまたは異なる置換基により置換され得る。Ｃ９は水素または他の置換基（例えば、オルトカルボキシフェニル基またはオルト（スルホン酸）フェニル基など）により置換され得る。例示的なフルオレセイン型の親キサンテン環には、米国特許第４，４３９，３５６号、同第４，４８１，１３６号、同第４，９３３，４７１号（Ｌｅｅ）、同第５，０６６，５８０号（Ｌｅｅ）、同第５，１８８，９３４号、同第５，６５４，４４２号および同第５，８４０，９９９号；国際特許出願公開ＷＯ９９／１６８３２；ならびに欧州特許第０５０６８４号に記載されるフルオレセイン色素のキサンテン環が含まれるが、これらに限定されない。「フルオレセイン型の親キサンテン環」の定義にはまた、米国特許第５，７５０，４０９号および同第５，０６６，５８０号に記載されるフルオレセイン色素の拡張型キサンテン環が含まれる。
いくつかの実施形態において、色素はローダミン色素を含み、この色素は、Ｃ９炭素原子がオルトカルボキシフェニル置換基（ペンダントフェニル基）により置換されるローダミン型のキサンテン環を含むことができる。このような化合物はまた、本明細書中ではオルトカルボキシフルオレセインとして示される。いくつかの実施形態において、ローダミン色素のサブセットは、４，７−ジクロロローダミンである。典型的なローダミン色素には、ローダミンＢ、５−カルボキシローダミン、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、４，７−ジクロロローダミンＸ（ｄＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、４，７−ジクロロローダミン６Ｇ、ローダミン１１０（Ｒ１１０）、４，７−ジクロロローダミン１１０（ｄＲ１１０）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）および４，７−ジクロロ−テトラメチルローダミン（ｄＴＡＭＲＡ）が含まれ得るが、これらに限定されない。さらなるローダミン色素は、例えば、米国特許第５，３６６，８６０号（Ｂｅｒｇｏｔら）、同第５，８４７，１６２号（Ｌｅｅら）、同第６，０１７，７１２号（Ｌｅｅら）、同第６，０２５，５０５号（Ｌｅｅら）、同第６，０８０，８５２号（Ｌｅｅら）、同第５，９３６，０８７号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第６，１１１，１１６号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第６，０５１，７１９号（Ｂｅｎｓｏｎら）、同第５，７５０，４０９号、同第５，３６６，８６０号、同第５，２３１，１９１号、同第５，８４０，９９９号および同第５，８４７，１６２号、米国特許第６，２４８，８８４号（Ｌａｍら）；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９７／３６９６０および同第ＷＯ９９／２７０２０；Ｓａｕｅｒら，１９９５，Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ５（３）：２４７−２６１；Ａｒｄｅｎ−Ｊａｃｏｂ，１９９３，Ｎｅｕｅ Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ Ｘａｎｔｈｅｎ−Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ ｆｕｅｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｚｓｏｎｄｅｎ ｕｎｄ Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ Ｌａｓｅｒ，Ｖｅｒｌａｇ Ｓｈａｋｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ならびに、Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（１０）：２４７１−２４８３（１９９２）；Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２８１６−２８２２（１９９７）；および、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４５００−４５０４（１９９７）に見出され得る。いくつかの実施形態において、色素は４，７−ジクロロ−オルトカルボキシローダミンを含む。いくつかの実施形態において、色素はフルオレセイン色素を含み、この色素は、Ｃ９炭素原子がオルトカルボキシフェニル置換基（ペンダントフェニル基）により置換されるフルオレセイン型のキサンテン環を含む。フルオレセイン型色素の１つの典型的なサブセットが４，７−ジクロロフルオレセインである。典型的なフルオレセイン色素には、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）が含まれ得るが、これらに限定されない。さらなる典型的なフルオレセイン色素が、例えば、米国特許第５，７５０，４０９号、同第５，０６６，５８０号、同第４，４３９，３５６号、同第４，４８１，１３６号、同第４，９３３，４７１号（Ｌｅｅ）、同第５，０６６，５８０号（Ｌｅｅ）、同第５，１８８，９３４号（Ｍｅｎｃｈｅｎら）、同第５，６５４，４４２号（Ｍｅｎｃｈｅｎら）、同第６，００８，３７９号（Ｂｅｎｓｏｎら）および同第５，８４０，９９９号；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９９／１６８３２；および、欧州特許出願公開第０５０６８４号に見出され得る。いくつかの実施形態において、色素は４，７−ジクロロ−オルトカルボキシフルオレセインを含む。いくつかの実施形態において、色素はシアニン色素、フタロシアニン色素、スクアレイン色素またはｂｏｄｉｂｙ色素であり得、これらは、例えば、下記の参考文献およびそれらにおける引用参考文献に記載される：米国特許第５，８６３，７２７号（Ｌｅｅら）、同第５，８００，９９６号（Ｌｅｅら）、同第５，９４５，５２６号（Ｌｅｅら）、同第６，０８０，８６８号（Ｌｅｅら）、同第５，４３６，１３４号（Ｈａｕｇｌａｎｄら）、米国特許第５，８６３，７５３号（Ｈａｕｇｌａｎｄら）、同第６，００５，１１３号（Ｗｕら）およびＷＯ９６／０４４０５（Ｇｌａｚｅｒら）。
本明細書中で使用される用語「同定部分」は、特定のプローブ種を同定し、結果として、標的ポリヌクレオチド配列を決定するために使用され得る部分をいい、そして、様々な識別可能な部分（例えば、ジップコード、既知数の核酸塩基、またはそれらの組合せを含む）をいうことができる。いくつかの実施形態において、同定部分または同定部分相補体は標識化プローブにハイブリダイズし得、それにより、デコード反応において標的ポリヌクレオチド配列の検出を可能にする。いくつかの実施形態において、同定部分は、バルク分離（これに限定されない）を含む、同定部分が結合する要素を分離するために；同定部分が結合させられる要素を基質に固定または結合するために（この場合には、分離する工程は含んでも含まなくてもよい）；少なくとも１つの部分（例えば、可動性改変体、１つまたは複数の標識、およびそれらの組合せなど）を含み得る同定部分相補体をアニーリングするために、使用され得るオリゴヌクレオチド配列をいう。いくつかの実施形態において、同じ同定部分が、バルク分離、基質結合およびそれらの組合せを行うために多数の異なる要素とともに使用される。用語「同定部分相補体」は、典型的には、その対応する同定部分に対して少なくとも実質的に相補的であるか、または、その対応する同定部分とハイブリダイズする少なくとも１つの核酸塩基の配列を含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをいう。いくつかの実施形態において、同定部分相補体は、少なくとも１つの識別子部分：要素複合体を少なくとも１つの基質に結合させるための捕獲部分として役立つか、バルク分離手順のための「プルアウト（ｐｕｌｌ−ｏｕｔ）」配列として役立つか、または、捕獲部分およびプルアウト配列の両方として役立つ（例えば、Ｏ’Ｎｅｉｌら，米国特許第６，６３８，７６０号、同第６，５１４，６９９号、同第６，１４６，５１１号および同第６，１２４，０９２号を参照のこと）。典型的には、同定部分およびその対応する同定部分相補体は、内部の自己ハイブリダイゼーション；異なる同定部分種、反応組成物におけるヌクレオチド配列（ｇＤＮＡ（これに限定されない）を含む）、同定部分相補体の異なる種、または、プローブの標的特異的部分などとの交差ハイブリダイゼーションなどを最小限に抑えるように選択されるが、しかし、同定部分とその対応する同定部分相補体との間でのハイブリダイゼーションを容易にするようにしなければならない。同定部分の配列および同定部分相補体の配列は、任意の好適な方法によって選択され得る（例えば、コンピューターアルゴリズム、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９６／１２０１４および同ＷＯ９６／４１０１１、ならびに、欧州特許出願公開第７９９，８９７号に記載されるようなコンピューターアルゴリズムなど；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４６０−６５（１９９８））のアルゴリズムおよびパラメーターが挙げられるが、これらに限定されない）。同定部分の記載は、とりわけ、米国特許第６，３０９，８２９号（その特許では「タグセグメント」として示される）、同第６，４５１，５２５号（その特許では「タグセグメント」として示される）、同第６，３０９，８２９号（その特許では「タグセグメント」として示される）、同第５，９８１，１７６号（その特許では「グリッドオリゴヌクレオチド」として示される）、同第５，９３５，７９３号（その特許では「識別子タグ」として示される）、および、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ０１／９２５７９（その公報では「アドレス可能な支持体特異的配列」として示される）に見出され得る。
同定部分は、少なくとも１つのプローブ、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのライゲーション生成物、少なくとも１つのライゲーション生成物代用物、およびそれらの組合せのうちの少なくとも一方の端部に位置され得、あるいは、内部に位置され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの同定部分が、少なくとも１つのリンカーアームを介して、少なくとも１つのプローブ、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのライゲーション生成物、少なくとも１つのライゲーション生成物代用物、およびそれらの組合せに結合させられる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリンカーアームは切断可能である。いくつかの実施形態において、同定部分は上流側プローブの同定部分に位置する。いくつかの実施形態において、同定部分は、長さが少なくとも１２塩基であり、長さが少なくとも１５塩基であり、長さが１２塩基〜６０塩基であり、または長さが１５塩基〜３０塩基である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの同定部分は、長さが、１２塩基、１５塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、４５塩基または６０塩基である。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの同定部分：同定部分相補体二重鎖は、互いに最大でも１０℃であるΔＴｍ範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）に含まれる融解温度を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの同定部分：同定部分相補体二重鎖は、互いに５℃以下であるΔＴｍ範囲に含まれる融解温度を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの同定部分：同定部分相補体二重鎖は、互いに２℃以下であるΔＴｍ範囲に含まれる融解温度を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの同定部分または少なくとも１つの同定部分相補体は、同定部分または同定部分相補体が結合する要素を、ライゲーション反応組成物、消化反応組成物、増幅されたライゲーション反応組成物などの少なくとも１つの成分から分離するために使用される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのライゲーション生成物、少なくとも１つのライゲーション生成物代用物、またはそれらの組合せは同じ同定部分を含む。分離アプローチの例には、同じ同定部分相補体を使用して多数の異なる要素：同定部分種を分離する工程；同じ同定部分相補体を含む基質に多数の異なる要素：同定部分種を固定する工程；またはそれらの両方が包含されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、同定部分が、サンプルをコード化するために使用される。例えば、多重化されたコード化反応における多数の標的ポリヌクレオチドが、同じ同定部分によりコード化され得、それにより、所定の標的同定部分を用いて所定のサンプルからのポリヌクレオチドに印を付けることができる。
本明細書中で使用される用語「ライゲーション因子」は、本発明の教示によれば、かなり多数の酵素試薬または非酵素試薬を含み得る。例えば、リガーゼは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはハイブリッドの隣接ヌクレオチドの３’−ＯＨと５’−リン酸との間でのホスホジエステル結合を適切な条件のもとで形成する酵素ライゲーション試薬である。温度感受性リガーゼには、バクテリオファージＴ４リガーゼおよびＥ．ｃｏｌｉリガーゼが含まれるが、これらに限定されない。熱安定性のリガーゼには、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ ＨＢ８リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ種のＡＫ１６ＤリガーゼおよびＰｆｕリガーゼが含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ００／２６３８１；Ｗｕら，Ｇｅｎｅ，７６（２）：２４５−２５４（１９８９）；Ｌｕｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４（１５）：３０７１−３０７８（１９９６）を参照のこと）。当業者は、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼを含めて、かなり多数の熱安定性のリガーゼが、好熱性生物または超好熱性生物（例えば、真性細菌および古細菌の特定の種）から得られ得ること、ならびに、そのようなリガーゼが、開示された方法およびキットにおいて用いられ得ることを理解する。
化学的ライゲーション因子には、限定されないが、活性化剤、縮合剤および還元剤、例えば、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、Ｎ−シアノイミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および紫外光など含まれる。自己ライゲーション（すなわち、ライゲーション因子の非存在下での自発的ライゲーション）もまた、本明細書における教示の範囲内である。化学的ライゲーション方法についての詳細なプロトコル、および適切な反応基の記述は、とりわけ、Ｘｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２７：８７５−８１（１９９９）；ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１：１４０３−０８（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：２３６６−６９（１９９４）；ＫａｎａｙａおよびＹａｎａｇａｗａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：７４２３−３０（１９８６）；ＬｕｅｂｋｅおよびＤｅｒｖａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３００５−０９（１９９２）；Ｓｉｅｖｅｒｓおよびｖｏｎ Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：２２１−２４（１９９４）；ＬｉｕおよびＴａｙｌｏｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３３００−０４（１９９９）；ＷａｎｇおよびＫｏｏｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２３２６−３３（１９９４）；Ｐｕｒｍａｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３７１３−１９（１９９２）；ＡｓｈｌｅｙおよびＫｕｓｈｌａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：２９２７−３３（１９９１）；ＣｈｕおよびＯｒｇｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３６７１−９１（１９８８）；Ｓｏｋｏｌｏｖａら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３２：１５３−５５（１９８８）；ＮａｙｌｏｒおよびＧｉｌｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：２７２２−２８（１９６６）；および米国特許第５，４７６，９３０号に見出され得る。
適切な波長の光をライゲーション（ｐｈｏｔｏｌｉｇａｔｉｏｎ）因子として使用する光ライゲーションもまた本教示の範囲内である。いくつかの実施形態において、光ライゲーションは、４−チオチミジン（ｓ４Ｔ）、５−ビニルウラシルおよびその誘導体、またはそれらの組合せ（これらに限定されない）をはじめとするヌクレオチドアナログを含むプローブを含む。いくつかの実施形態において、ライゲーション因子は、（ａ）ＵＶ−Ａ範囲（約３２０ｎｍ〜約４００ｎｍ）の光、ＵＶ−Ｂ範囲（約２９０ｎｍ〜約３２０ｎｍ）の光、またはそれらの組合せ、（ｂ）波長が約３００ｎｍ〜約３７５ｎｍの間である光、（ｃ）波長が約３６０ｎｍ〜約３７０ｎｍである光、（ｄ）波長が約３６４ｎｍ〜約３６８ｎｍである光、または、（ｅ）波長が約３６６ｎｍである光を含む。いくつかの実施形態において、光ライゲーションは可逆的である。光ライゲーションの記述は、とりわけ、Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４２：３９−４０（１９９９）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．補遺１：１８５−８６（２００１）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ 補遺２：１５５−５６（２００２）；ＬｉｕおよびＴａｙｌｏｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６：３３００〜０４（１９９８）、およびワールドワイドウェブでｓｂｃｈｅｍ．ｋｙｏｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓａｉｔｏ−ｌａｂにおいて見出され得る。
本明細書中で使用される「標識化プローブ」は、典型的には定量的ＰＣＲ分析またはリアルタイムＰＣＲ分析のために、ならびに、エンドポイント分析のために、デコード反応において使用される分子を一般にいう。そのような標識化プローブは、標的ポリヌクレオチドの増幅をモニターするために使用され得る。いくつかの実施形態において、増幅反応において存在するオリゴヌクレオチドプローブは、生じたアンプリコンの量を時間の関数としてモニターするために好適である。そのようなオリゴヌクレオチドプローブには、下記が含まれるが、それらに限定されない：５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（本明細書中に記載されるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号もまた参照のこと）、様々なステム−ループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号および同第５，９２５，５１７号、ならびにＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８を参照のこと）、ステムレスまたは線状のビーコン（例えば、ＷＯ９９／２１８８１を参照のこと）、ＰＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎｓＴＭ（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および同第６，５９３，０９１号を参照のこと）、線状ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａら，２００１，ＳＰＩＥ ４２６４：５３−５８を参照のこと）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）、ステム−ループおよび二重鎖のＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭプローブ（Ｓｏｌｉｎａｓら，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：Ｅ９６、および米国特許第６，５８９，７４３号）、バルジループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１号）、シュードノットプローブ（米国特許第６，５８９，２５０号）、シクリコン（米国特許第６，３８３，７５２号）、ＭＧＢ ＥｃｌｉｐｓｅＴＭプローブ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ライトアッププローブ、自己集合型ナノ粒子プローブ、および、フェロセン改変プローブ、これらは、例えば、米国特許第６，４８５，９０１号；Ｍｈｌａｎｇａら，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３−４７１；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４−８０７；Ｉｓａｃｓｓｏｎら，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１−３２８；Ｓｖａｎｖｉｋら，２０００，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５；Ｗｏｌｆｆｓら，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７６６：７６９−７７１；Ｔｓｏｕｒｋａｓら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：４２０８−４２１５；Ｒｉｃｃｅｌｌｉら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：４０８８−４０９３；Ｚｈａｎｇら，２００２ Ｓｈａｎｇｈａｉ．３４：３２９−３３２；Ｍａｘｗｅｌｌら，２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６−９６１２；Ｂｒｏｕｄｅら，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９−５６；Ｈｕａｎｇら，２００２，Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８−１２６；およびＹｕら，２００１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １４：１１１５５〜１１１６１に記載される。標識化プローブはまた、ブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ならびに、ＤａｂｓｙｌおよびＤａｂｃｅｌのスルホネート／カルボキシレートクエンチャー（Ｅｐｏｃｈ）を含むことができる。標識化プローブはまた、２つのプローブを含むことができ、この場合、例えば、フローレ（ｆｌｏｒｅ）が一方のプローブに存在し、クエンチャーがもう一方のプローブに存在し、これら２つのプローブが標的上において一緒になってハイブリダイゼーションすることにより、シグナルが消滅するか、または、標的上でのハイブリダイゼーションにより、シグナルの形跡が蛍光の変化により変化する。標識化プローブはまた、カルボキシル基の代わりにＳＯ３を有するフルオレセイン色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホルアミダイト形態、ＣＹ５のホスホルアミダイト形態（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を含むことができる。いくつかの実施形態において、インターカレーション標識（例えば、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））が使用され、それにより、標識化プローブの非存在下での増幅生成物のリアルタイムまたはエンドポイントでの可視化を可能にする。
本明細書中で使用される「アドレス可能なプライマー部分」は、所定の標的ポリヌクレオチドの正体をコード化することができ、かつ、デコード反応におけるアドレスプライマーまたはアドレスプライマー組が、コード化反応において特定のアドレス可能なプライマー部分によりコード化された標的ポリヌクレオチドを選択的に増幅することを可能にすることができる、プローブまたはプローブ組の少なくとも１つの領域をいう。
本明細書中で使用される「アドレスプライマー」は、コード化反応の生成物における少なくとも１つのアドレス可能なプライマー部分にハイブリダイズし得るデコード増幅反応における少なくとも１つのプライマーをいう。いくつかの実施形態において、所定のデコード反応はアドレスプライマー組を含み得、この場合、そのアドレスプライマー組により、所定のコード化反応生成物が、コード化反応の間にそれに取り込まれたアドレス可能なプライマー部分の正体に基づいて増幅され得る。いくつかの実施形態において、複数のデコード反応を同じ固体支持体（例えば、９６ウエルマイクロタイタープレートまたは３８４マイクロタイタープレート、あるいは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ、Ｍｉｃｒｏｃａｒｄ）において行うことができ、この場合、それぞれのデコード反応は異なったアドレスプライマー組を含み、そのアドレスプライマー組により、所定のデコード反応における所定の標的ポリヌクレオチドが、デコード反応において標的および特定のアドレスプライマー組に存在するアドレス可能なプライマー部分に基づいて増幅され得る。
本明細書中で使用される「プライマー組」は、少なくとも１つのコード化反応の結果として所定の標的ポリヌクレオチドに含有されるアドレス可能なプライマー部分に基づいて所定の標的ポリヌクレオチドを選択的に増幅し得る少なくとも１つ（典型的には２つ）のプライマーをいう。様々なプライマー組、従って、用語「一連のプライマー組」が可能である。所定のプライマー組を、特定の標的ポリヌクレオチドをコード化するために１つの適用において使用することができ、そして異なる標的ポリヌクレオチドをコード化するために異なる適用において使用することができる。様々な一連のアドレスプライマー組の１つの例示的な例については、図１７を参照のこと。
本明細書中で使用される用語「一次ループ状リンカー」は、自己相補性部分、ループおよび一本鎖部分を含むオリゴヌクレオチドをいう。一例として、「ＡＳＯループ状リンカー」は、ＰＣＲ順方向プライミング部分、ブロック部分、および一本鎖部分を含む一次ループ状リンカーをいい、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドであるとみなされ得る。ＡＳＯループ状リンカーの一本鎖部分は、ＡＳＯの標的同定部分の領域（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、基本的には上流側のライゲーションプローブ）とハイブリダイズし得、それにより、ＡＳＯに対するＡＳＯループ状リンカーのライゲーションを可能にする。例示目的のために、本明細書中に示されるとき、ヌクレアーゼ抵抗性を付与し得るループに存在するブロック部分が示される。だが、本発明の教示は、ブロック部分が他の場所に存在する実施形態を企図することが理解される。いくつかの実施形態において、特に、多重化分析を伴う実施形態では、複数の一次ループ状リンカーの３’側のヌクレオチドが同じであり、これにより、複数の上流側のライゲーションプローブに対するライゲーション効率の変動を最小限に抑えることができる。
本明細書中で使用される用語「二次ループ状リンカー」は、自己相補性部分、ループおよび一本鎖部分を含むオリゴヌクレオチドをいう。一例として、「ＬＳＯループ状リンカー」は、ＰＣＲ逆方向プライミング部分、ブロック部分、および一本鎖部分を含む二次ループ状リンカーをいい、遺伝子座特異的なオリゴヌクレオチドであると見なすことができる。ＬＳＯループ状リンカーの一本鎖部分は、ＬＳＯの非標的特異的部分の領域（遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド、基本的にはＬＳＯ）とハイブリダイズし得、それにより、ＬＳＯに対するＬＳＯループ状リンカーのライゲーションを可能にする。本発明の教示のいくつかの実施形態において、二次ループ状リンカーは「ユニバーサルなループ状リンカー」ということができ、そしてＬＳＯの３’末端に存在するユニバーサルなスプリント（ＵＳ）による複数のライゲーションプローブのいずれか（例えば、ＬＳＯ）に対するそのライゲーションによって、配列情報を導入し、かつ／または、ヌクレアーゼ抵抗性を付与するために使用することができる（例えば、図１１Ｂを参照のこと）。
本明細書中で使用される用語「コード化反応」は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドがプローブ組により調べられる反応をいい、この場合、標的ポリヌクレオチドの正体が反応生成物にコード化される。例えば、「コード化ＰＣＲ」は、少なくとも１つのプローブが、標的特異的部分と、その標的特異的部分の５’末端に位置するアドレス可能なプライマー部分と、標的特異的部分およびその標的特異的部分の５’末端に位置するアドレス可能なプライマー部分を含む少なくとも１つの第２のプローブとを含むＰＣＲを包含し得る。コード化ＰＣＲにおけるプローブの一方または両方は、デコード反応においてシグナルを生じさせるために対応する標識化プローブによって使用され得る「同定部分」をさらに含むことができる。コード化ＰＣＲに適用可能なＰＣＲプロトコルの例示的な例については、係属中のＷＯ出願Ｕ０３／３７８０８、ならびに、米国特許第６，６０５，４５１号を参照のこと。また、コード化反応は、少なくとも１つのプローブが、標的特異的部分と、その標的特異的部分の５’末端に位置するアドレス可能なプライマー部分と、標的特異的部分およびその標的特異的部分の５’末端に位置するアドレス可能なプライマー部分を含む少なくとも１つの第２のプローブとを含むライゲーション反応を包含し得る「コード化ライゲーション」反応ということができる。コード化ＰＣＲにおけるプローブの一方または両方は、デコード反応においてシグナルを生じさせるために相補的な標識化プローブによって使用され得る「同定部分」をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、標識化プローブがコード化反応の生成物にハイブリダイズする位置は、すべての同定部分、同定部分の一部、同定部分の一部およびプライマー部分の一部を含むことができ、一般には、標識化プローブの配置をコード化反応生成物の生成物に対してずらすことが本発明の教示によって企図され、そして例えば、コード化反応においてプライマーまたはプローブの長さ（サイズ）を減少させるという一面を有し得ることが理解される。
本明細書中で使用される用語「デコード反応」は、少なくとも１つのアドレスプライマーまたはアドレスプライマー組を含む少なくとも１つの反応をいい、この場合、アドレスプライマーまたはアドレスプライマー組は、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド代用物を、コード化反応の間にプローブによって標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド代用物に取り込まれたアドレス可能なプライマー部分に基づいて増幅することができ、それにより、標的ポリヌクレオチドがサンプルに存在することを示すシグナルを生じさせることができる。デコード反応は少なくとも１つの標識化プローブをさらに含むことができ、この場合、標識化プローブは、所定の実施形態の状況において適切であるように、例えば、サンプルの正体または対立遺伝子改変体の正体を与えるためにコード化反応において導入される少なくとも１つの同定部分または同定部分相補体にハイブリダイズし得る。
本明細書中で使用される用語「決定する（「ｄｅｔｅｒｉｍｉｎｅ」および「ｄｅｔｅｒｉｍｉｎｉｎｇ」）は、検出すること、定量すること、同定すること、または、それらの組合せを含むことができる。
本明細書中で使用される用語「反応容器」は一般には、反応が本発明の教示に従って行われ得る任意の容器をいう。いくつかの実施形態において、第１の反応容器は、エッペンドルフチューブ、および、現代の分子生物学研究室において通常実施する際の他の容器の種類であり得る。いくつかの実施形態において、第２の反応容器は、マイクロタイタープレートにおけるウエル、ガラス製スライド上のスポット、または、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの低密度遺伝子発現アレイ（Ｍｉｃｒｏｃａｒｄ）におけるウエルであり得る。例えば、複数の第２の反応容器を同じ支持体上に存在させることができる。同様に、複数の第１の反応容器を同じ支持体上に存在させることができる。いくつかの実施形態において、第１の反応容器および第２の反応容器をラボ・オン・ア・チップ様デバイス（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ ａｎｄ Ｆｌｕｉｄｇｍから入手可能である）において同じ固体支持体上に存在させることができる。様々な反応容器が当該分野において入手可能であり、本発明の教示の範囲内であることが認識される。
本発明の教示による「アリコート」は、一般には、何かあるものと並んでそのすべてを含む、その一部をいう。例えば、コード化反応生成物のアリコートは、少なくとも１つの別個のデコード反応物中に配置することが可能である。
「ライゲーションプローブ組」は、本明細書中におけるいくつかの実施形態によれば、特異的な標的核酸配列における相補的な領域と、配列特異的な様式でハイブリダイズするように設計される標的特異的な部分を含む２つ以上のプローブを含む（例えば、図２におけるプローブ２およびプローブ３を参照のこと）。ライゲーションプローブ組のプローブはさらに、アドレス可能なプライマー部分、同定部分、または、これらのさらなる成分の組合せを含むことができる。いくつかの実施形態において、プローブの構成成分はいずれも、任意の他のプローブ構成成分と重複し得る。例えば、しかし、限定ではなく、標的特異的部分がアドレス可能なプライマー部分と重複し得る。同様に、限定ではないが、同定部分は標的特異的部分またはアドレス可能なプライマー部分またはそれらの両方と重複し得る。
本発明の教示のいくつかの実施形態によれば、ライゲーションプローブ組は、第１のプローブの標的特異的部分が下流側の標的領域とハイブリダイズし、そして第２のプローブの標的特異的部分が上流側の標的領域とハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態において、改変体塩基に対して相補的なヌクレオチド塩基（「識別用ヌクレオチド」または「識別用ヌクレオチド相補体」）がライゲーションプローブ組の第２のプローブの５’末端に存在する。いくつかの実施形態において、第１のプローブは、同定部分および識別用ヌクレオチドまたは識別用ヌクレオチド相補体を、第２のプローブではなく、その３’末端に含むことができる。当業者は、様々な実施形態において、識別用ヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにおいてどこにでも位置し得ること、および、同様に、識別用ヌクレオチド相補体がプローブの標的特異的部分においてどこにでも位置し得ることを理解する。例えば、様々な実施形態によれば、識別用ヌクレオチドを、プローブの３’末端に、プローブの５’末端に、または、プローブの３’末端と５’末端との間のどこにでも位置させることができる。
いくつかの実施形態において、ライゲーションプローブ組の第１のプローブおよび第２のプローブが適切な上流側および下流側の標的領域にハイブリダイズされるとき、そして識別用ヌクレオチドが一方のプローブの５’末端またはもう一方のプローブの３’末端に存在し、かつ、識別用ヌクレオチドが標的配列上の識別用ヌクレオチド相補体と塩基対形成するとき、ハイブリダイズした第１のプローブおよび第２のプローブが一緒になるようにライゲーションされて、ライゲーション生成物を形成する。しかしながら、さらに、たとえ、両方のプローブが他の方法でそれらのそれぞれの標的領域に対して完全にハイブリダイズする場合でさえ、識別用ヌクレオチドでのミスマッチした塩基はライゲーションを妨げる。
いくつかの実施形態において、他の機構が、正しい相補的なヌクレオチドを識別用ヌクレオチドに含まないプローブのライゲーションを避けるために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ミスマッチが識別用ヌクレオチドに存在するならば、ライゲーションプローブ組のプローブが、測定可能なほどに低下した程度に標的配列に対してハイブリダイズし得るような条件を用いることができる。従って、そのような実施形態において、そのようなハイブリダイズしていないプローブは、プローブ組におけるもう一方のプローブにライゲーションされない。
いくつかの実施形態において、ライゲーションプローブ組における第１のプローブおよび第２のプローブは、類似する融解温度（Ｔｍ）を有して設計される。プローブが識別用ヌクレオチドを含む場合、いくつかの実施形態では、求められる標的識別用ヌクレオチド相補体の識別用ヌクレオチドを含むプローブについてのＴｍは、プローブ組において識別用ヌクレオチドを含有しないもう一方のプローブよりも約４℃〜１５℃低い。いくつかのそのような実施形態において、識別用ヌクレオチドを含むプローブはまた、ライゲーション温度に近いＴｍを伴って設計され得る。従って、ミスマッチしたヌクレオチドを有するプローブはライゲーション温度において標的からより容易に解離する。従って、ライゲーション温度は、いくつかの実施形態では、例えば、標的における多数の潜在的な対立遺伝子を識別するための別の方法を提供する。
さらに、いくつかの実施形態において、ライゲーションプローブ組は第１のプローブおよび第２のプローブの端部（例えば、第１のプローブまたは第２のプローブの３’末端または５’末端）に識別用ヌクレオチドを含まない。むしろ、識別用ヌクレオチドは第１のプローブまたは第２のプローブの５’末端および３’末端の間のどこかに位置する。いくつかのそのような実施形態において、それらのそれぞれの標的領域に関して完全に相補的である標的特異的部分を有するプローブは、高いストリンジェンシーの条件のもとでハイブリダイズする。対照的に、１つまたは複数のミスマッチした塩基を標的特異的部分に有するプローブは、測定可能な程度に低下した程度でそれらのそれぞれの標的領域にハイブリダイズする。第１のプローブおよび第２のプローブはともに、ライゲーション生成物を生じさせるために標的にハイブリダイズしなければならない。
（２．技術）
（ライゲーション）
本発明の教示によるライゲーションは、ヌクレオチド間連結が、テンプレートに隣接してハイブリダイズされる核酸配列の向き合う末端の間で形成される、任意の酵素的手段または非酵素的手段を含む。典型的には、アニーリングされた核酸プローブの向き合う末端が、ライゲーションのために好適である（ライゲーションのための好適性は、用いられるライゲーション手段の関数である）。いくつかの実施形態において、ライゲーションはまた、少なくとも１つのギャップを充填する（ｇａｐ−ｆｉｌｌｉｎｇ）手順を含み、この場合、２つのプローブの末端は最初に隣接してハイブリダイズされないが、しかし、上流側プローブの３’末端が、典型的にはポリメラーゼによって、下流側プローブの５’末端に隣接するまで、１つまたは複数のヌクレオチドによって伸長される（例えば、米国特許第６，００４，８２６を参照のこと）。ヌクレオチド間連結には、ホスホジエステル結合の形成が含まれ得るが、これに限定されない。そのような結合形成は、限定されないが、可逆的に不活性化されたリガーゼ（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号を参照のこと）ならびにその酵素的に活性な変異体および改変体（これらに限定されない）を含めて、少なくとも１つのＤＮＡリガーゼまたは少なくとも１つのＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｔｓｃ）リガーゼ、ＴＳ２１２６（Ｔｓｃに感染する好熱性ファージ）ＲＮＡリガーゼ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｌｕｇｉｄｕｓ（Ａｆｕ）リガーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）リガーゼなど、これらに限定されない）によって酵素的に作製される結合形成が含まれ得る。
他のヌクレオチド間ライゲーションには、限定されないが、適切な反応基の間での共有結合的な結合形成、例えば、チオホスホリルアセチルアミノ基を形成するためのα−ハロアシル基とホスホチオエート基との間、５’−ホスホロチオエステル連結およびピロホスフェート連結を形成するためのホスホロチオエート基、トシレート基またはヨウ化基の間での共有結合的な結合形成などが含まれる。
化学的なライゲーションが、適切な条件のもとでは、例えば、自己ライゲーションなどによって自発的に生じ得る。あるいは、「活性化」剤または還元剤が使用され得る。活性化剤および還元剤の例には、限定されないが、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および紫外光（例えば、光ライゲーションのために使用される紫外光など）が含まれる。
ライゲーションは、一般には、少なくとも１回のライゲーションサイクル、すなわち、第１のプローブおよび対応する第２のプローブの標的特異的部分を、対応する標的核酸配列におけるそれらのそれぞれの相補的な領域にハイブリダイズする工程；上流側プローブの３’末端を下流側プローブの５’末端とライゲーションして、ライゲーション生成物を形成する工程；ならびに、核酸二重鎖を変性して、ライゲーション生成物をライゲーション生成物：標的核酸配列の二重鎖から遊離させる工程の逐次手順を包含する。このライゲーションサイクルは、例えば、限定されないが、（増幅されたライゲーション生成物を生じさせるためにプライマーおよびポリメラーゼを使用することとは異なるように）ライゲーションプローブを使用してライゲーション生成物を増幅するためにライゲーション反応を熱サイクル処理することによって繰り返してもよく、または、繰り返さなくてもよい。
本教示の範囲内にはまた、ギャップ充填ライゲーション（これには、限定されないが、ＯＬＡ、ＬＤＲ、およびＬＣＲのギャップ充填形態のＯＬＡ、ＬＤＲ、ＬＣＲ、ＦＥＮの切断媒介バージョンが含まれる）、架橋オリゴヌクレオチドライゲーション、補正ライゲーション、および、ループ状リンカーベースのコンカテマーライゲーションなどのライゲーション技術が含まれる。これらの技術の記載は、とりわけ、米国特許第５，１８５，２４３号および同第６，００４，８２６号、同第５，８３０，７１１号、同第６，５１１，８１０号、同第６，０２７，８８９号；欧州特許出願公開ＥＰ３２０３０８および同ＥＰ４３９１８２；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９０／０１０６９、同ＷＯ０１／５７２６８、同ＷＯ００５６９２７Ａ３、同ＷＯ９８０３６７３Ａ１、同ＷＯ２００１１７３２９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０（１９８８）；Ｄａｙら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９（１）：１５２−１６２（１９９５）；ｄｅ Ａｒｒｕｄａら，および米国特許出願第６０／５１７４７０号に見出され得る。いくつかの実施形態において、ライゲーションは、その後の増幅工程に先立つサンプル調製を提供し得る。いくつかの実施形態において、ライゲーションは、最初の増幅、それに続くその後の増幅を提供するだけでなく、それ自体での増幅を提供し得る。
本発明の教示のいくつかの実施形態において、生成物を、その後の下流側での反応（例えば、増幅など）のためのテンプレートとして作用できないようにするために、非通常型のヌクレオチド塩基が、ライゲーションプローブに導入され得、生じた生成物は酵素的手段（例えば、グリコシラーゼ）および／または物理化学的手段によって処理され得る。いくつかの実施形態において、ウラシルをライゲーション反応混合物において核酸塩基として含むことができ、それにより、その後の反応により、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの使用によって以前のウラシル含有生成物の持ち越しが除去されることを可能にする。グリコシラーゼなどを使用する混入物除去に対する様々のアプローチが、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２０１８１４Ａ２に見出され得る。
ハイブリダイズしていないプローブおよび／またはライゲーションしていないプローブをライゲーション反応後に除くための方法は、当該分野で公知であり、下記においてさらに議論される。そのような手順には、ヌクレアーゼ媒介によるアプローチ、希釈、サイズ排除アプローチ、親和性部分手順（例えば、米国仮特許出願第６０／５１７４７０号、米国仮特許出願第６０／４７７６１４号およびＰＣＴ出願２００３／３７２２７を参照のこと）、標的ポリヌクレオチドの固定化を伴う親和性部分手順（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ０３／００６６７７Ａ２を参照のこと）が含まれる。
（取り込まれなかった反応成分および／または所望されない反応成分の除去）
多数の反応工程が用いられる核酸の複雑な混合物を含む反応は、様々な取り込まれなかった反応成分を生じ得ること、そして様々な複雑性軽減手順のいずれかによるそのような取り込まれていない反応成分の除去は続いて行われる反応の効率および特異性を改善し得ることが理解される。
いくつかの実施形態において、複雑性軽減化には、標的核酸の選択的な固定化が含まれる。例えば、標的核酸を固体支持体に優先的に固定化することができる。いくつかの実施形態において、フォトビオチンを標的核酸に結合することができ、生じたビオチン標識核酸を、親和性部分結合因子（例えば、ストレプトアビジンなど）を含む固体支持体に固定化することができる。固定化された標的核酸はプローブを用いて調べることができ、ハイブリダイズしていないプローブおよび／またはライゲーションされていないプローブを洗浄によって除くことができる（そのような複雑性軽減化方法に関するさらなる詳細については、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ０３／００６６７７および米国特許出願番号第０９／９３１，２８５号を参照のこと）。様々な洗浄条件を、例えば、ＡｕｓｕｂｅｌらおよびＭａｎｉａｔｉｓらの最新版に記載されるように、用いることができる。
いくつかの実施形態において、取り込まれなかったプローブは、様々な酵素的手段によって除くことができ、この場合、例えば、保護されていない３’プローブ末端は、３’作用ヌクレアーゼにより消化され得、５’側のリン酸保有プローブ末端は、５’リン酸作用ヌクレアーゼ（例えば、Ｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ）により消化され得る。いくつかの実施形態において、取り込まれていない反応成分（例えば、ライゲーションプローブなど）の除去に対するそのようなヌクレアーゼ消化媒介アプローチはさらに、例えば、米国特許出願第６０／５１７，４７０号に記載されるように、ループ状リンカーベースのプローブ、および、一本鎖リンカーベースのプローブの使用を含むことができる。
いくつかの実施形態において、未反応のライゲーションプローブは、混合物から除かれ得、それにより、上流側プローブは標識を含むことができ、かつ、下流側プローブはその３’末端におけるエキソヌクレアーゼブロック部分によりブロックされ得る。ライゲーションおよびヌクレアーゼの導入の後、標識されているライゲーションされていない上流側プローブが消化され得、これにより、ライゲーション生成物および下流側プローブを残すことができる。しかしながら、下流側プローブは標識されていないので、下流側プローブはアッセイにおいて事実上、サイレントである。いくつかの実施形態において、標的核酸が固定化され、ライゲーション生成物が溶出および検出され得る。いくつかの実施形態において、下流側プローブの３’末端は親和性部分をさらに含み、ライゲーション生成物および取り込まれていない下流側プローブを親和性部分結合因子により固定化することができる。いくつかの実施形態において、上流側プローブの５’末端は親和性部分をさらに含み、ライゲーション生成物および取り込まれていない上流側プローブを親和性部分結合因子により固定化することができる。
いくつかの実施形態において、例えば、研究室の同じ作業空間で行われた以前の反応からの生成物により、目的とする反応が汚染される可能性がある。いくつかの実施形態において、ウラシルを、例えば、ＰＣＲ増幅工程に組み込むことができ、それにより、チミジンの代わりに、または、チミジンと一緒にウラシルを含む反応生成物を与えることができる。いくつかの実施形態において、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを、ウラシル含有混入物を分解するような様式でＯＬＡ反応混合物に含ませることができる。
（増幅）
本発明の教示による増幅は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部、ライゲーション生成物、少なくとも１つのライゲーション生成物代用物、またはそれらの組合せが、典型的には、核酸配列を直線的または指数的のいずれかで増幅するための広範囲の技術（これらに限定されない）を含めてテンプレート依存的様式で複製される任意の手段を包含する。増幅工程を行うための例示的な手段には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、Ｑレプリカーゼ増幅が続くライゲーション、ＰＣＲ、プライマー伸長、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、過分枝鎖置換増幅（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、２段階多重化増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などが含まれ、これらには、それらの多重バージョンおよび組合せ、例えば、ＯＬＡ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＯＬＡ、ＬＤＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＬＣＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＬＣＲ（これはまた混合連鎖反応（ＣＣＲ）として知られている）など（これらに限定されない）が含まれる。そのような技術の記載は、とりわけ以下に見出され得る：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ａｕｓｂｅｌら；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ（編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ，Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）（「Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ」）；Ｍｓｕｉｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１−０７（１９９６）；Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ（編），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）（「Ｒａｐｌｅｙ」）；Ａｂｒａｍｓｏｎら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３年２月；４（１）：４１−７，米国特許第６，０２７，９９８号；米国特許第６，６０５，４５１号；Ｂａｒａｎｙら，ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９７／３１２５６；Ｗｅｎｚら，ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ０１／９２５７９；Ｄａｙら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９（１）：１５２−１６２（１９９５），Ｅｈｒｌｉｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３−５０（１９９１）；Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｆａｖｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：５６１−６４（２０００）；およびＲａｂｅｎａｕら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２８：９７−１０２（２０００）；Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ，Ｂａｒａｎｙ，およびＬｕｂｉｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９９５（ワールドワイドウエブでｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅｔｉｃｉｄｐｒｏｃ／ｕｓｓｙｍｐ６ｐｒｏｃ／ｂｌｅｇｒａｄ．ｈｔｍｌにおいて入手可能）；ＬＣＲ Ｋｉｔ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｃａｔ．＃２００５２０，Ｒｅｖ．＃０５０００２，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，２００２；Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８８−９３（１９９１）；ＢｉおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２９２４−２９５１（１９９７）；Ｚｉｒｖｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７：ｅ４０ｉ−ｖｉｉｉ（１９９９）；Ｄｅａｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：５２６１−６６（２００２）；ＢａｒａｎｙおよびＧｅｌｆａｎｄ，Ｇｅｎｅ １０９：１−１１（１９９１）；Ｗａｌｋｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０：１６９１−９６（１９９２）；Ｐｏｌｓｔｒａら，ＢＭＣ Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．２：１８−（２００２）；Ｌａｇｅら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３年２月；１３（２）：２９４−３０７；ならびに、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０（１９８８）；Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００２ Ｎｏｖ；２（６）：５４２−８；Ｃｏｏｋら，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３年５月；５３（２）：１６５−７４，Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１年２月；１２（１）：２１−７；米国特許第５，８３０，７１１号、米国特許第６，０２７，８８９号、米国特許第５，６８６，２４３号、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ００５６９２７Ａ３およびＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９８０３６７３Ａ１。
いくつかの実施形態において、増幅は、少なくとも１つのプライマーを、少なくとも１つのライゲーション生成物、少なくとも１つのライゲーション生成物代用物、またはそれらの組合せにおける相補的な配列または実質的に相補的な配列とハイブリダイズする工程；ヌクレオチドの少なくとも１つの鎖を、ポリメラーゼを使用してテンプレート依存的な様式で合成する工程；および、新しく形成された核酸二重鎖を変性して、鎖を分離する工程の逐次手順の少なくとも１回のサイクルを包含する。このサイクルは繰り返しても、繰り返さなくてもよい。増幅は熱サイクル処理を含むことができ、または、等温で行うことができる。いくつかの実施形態において、新しく形成された核酸二重鎖は最初に変性されないが、１つまたは複数のその後の工程においてその二本鎖形態で使用される。
プライマー伸長は、テンプレートにアニーリングさせられる少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマーを、ポリメラーゼなどの増幅手段を使用して５’側から３’側の方向で伸長させる工程を含む増幅手段である。いくつかの実施形態によれば、適切な緩衝液、塩、ｐＨ、温度およびヌクレオチド三リン酸（そのアナログを含む）を用いて、すなわち、適切な条件のもとで、ポリメラーゼにより、テンプレート鎖に対して相補的なヌクレオチドが、アニーリングされたプローブまたはプライマーの３’末端から開始して取り込まれて、相補的な鎖を生じる。いくつかの実施形態において、プライマー伸長を、少なくとも１つの標的核酸配列の標的配列にハイブリダイズするプローブ組の２つのプローブの間でのギャップを埋めるために使用することができ、その結果、これら２つのプローブを、２つのプローブが一緒になるようにライゲーションすることができる。いくつかの実施形態において、プライマー伸長のために使用されるポリメラーゼは５’エキソヌクレアーゼ活性を有しないか、または実質的に有しない。
本発明の教示のいくつかの実施形態において、生成物を、その後の増幅のためのテンプレートとして作用できないようにするために、非通常型のヌクレオチド塩基が、増幅反応生成物に導入され得、その生成物は、酵素的手段（例えば、グリコシラーゼ）および／または物理化学的手段によって処理され得る。いくつかの実施形態において、ウラシルを反応混合物において核酸塩基として含むことができ、それにより、その後の反応により、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの使用によって以前のウラシル含有生成物の持ち越しが除かれることを可能にする（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２０１８１４Ａ２を参照のこと）。本発明の教示のいくつかの実施形態において、様々な技術はどれも、例えば、Ｒａｄｓｔｒｏｍら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４年２月；２６（２）：１３３−４６に記載されるように、増幅の成功を容易にするために増幅に先立って用いることができる。いくつかの実施形態において、増幅を、例えば、米国特許第６，１５３，４２５号および同第６，６４９，３７８号に記載されるように、サンプルの調製および検出を含む独立した一体化されたアプローチで達成することができる。
（検出）
ドナー部分およびシグナル部分を用いるいくつかの実施形態において、特定のエネルギー転移蛍光色素を使用することができる。ドナー（ドナー部分）およびアクセプター（シグナル部分）の特定の非限定的な例示的な対が、例えば、米国特許第５，８６３，７２７号、同第５，８００，９９６号および同第５，９４５，５２６号に例示される。ドナーおよびアクセプターのいくつかのそのような組合せの使用はまた、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）と呼ばれている。いくつかの実施形態において、シグナル伝達プローブとして使用することができる蛍光団には、ローダミン、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）、フルオレセイン、ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、６−ＦａｍＴＭおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない（ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭおよび６−ＦａｍＴＭ、これらはすべてが、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能である）。
いくつかの実施形態において、蛍光シグナルを励起光に応答して与える標識化プローブの量は、典型的には、増幅反応で生じた核酸の量に関係する。従って、いくつかの実施形態において、蛍光シグナルの量が、増幅反応で生じた生成物の量に関係づけられる。そのような実施形態において、蛍光性指示体からの蛍光シグナルの強度を測定することによって増幅生成物の量を測定することができる。いくつかの実施形態によれば、内部標準を、蛍光シグナルによって示される増幅生成物を定量するために用いることができる。例えば、米国特許第５，７３６，３３３を参照のこと。
蛍光性指示体を含有する組成物とともに熱サイクル処理反応を行い、指定された波長の光ビームを放射し、蛍光性色素の強度を読み取り、かつ、各サイクルの後での蛍光強度を表示することができる様々なデバイスが開発されている。サーマルサイクラー、光ビーム放射装置および蛍光シグナル検出器を含むデバイスが、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号、同第６，０１５，６７４号および同第６，１７４，６７０号に記載されており、また、そのようなデバイスには、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７３００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、これらの機能のそれぞれを別個のデバイスによって行うことができる。例えば、Ｑβレプリカーゼ反応が増幅のために用いられるならば、反応がサーマルサイクラーにおいて行われない場合があり、しかし、反応は、指定された波長で放射された光ビーム、蛍光シグナルの検出、ならびに、増幅生成物の量の計算および表示を含むことができる。
いくつかの実施形態において、熱サイクル処理および蛍光検出を行うための統合されたデバイスを、サンプル中の標的核酸配列の精密な定量化のために使用することができる。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルを１回または複数回の熱サイクルの期間中および／またはその後で検出および表示することができ、従って、これにより、反応が生じているときの増幅生成物の「リアルタイム」でのモニターリングが可能になる。いくつかの実施形態において、増幅生成物の量および増幅サイクルの数を使用して、どのくらいの標的核酸配列が増幅前のサンプルに存在していたかを計算することができる。
いくつかの実施形態によれば、増幅生成物の量を、サンプルにおける標的核酸配列の存在を示すために十分な所定数のサイクルの後で単にモニターすることができる。当業者は、任意の所定のサンプルタイプ、プライマー配列および反応条件について、どのくらいのサイクルが、所定の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するために十分であるかを容易に決定することができる。
いくつかの実施形態によれば、増幅生成物は、所定のサイクル数が完了するとすぐに、陽性または陰性としてスコア化することができる。いくつかの実施形態において、結果をデータタベースに直接に電子的に伝送し、表にすることができる。従って、いくつかの実施形態において、非常に多数のサンプルを、より少ない必要とされる時間および労力で処理および分析することができる。
いくつかの実施形態によれば、異なる標識化プローブにより、種々の標的核酸配列を識別し得る。そのようなプローブの非限定的な例には、５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ分子など）があり、この場合、蛍光性分子がオリゴヌクレオチド連結エレメントを介して蛍光消光分子に結合している。いくつかの実施形態において、５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブのオリゴヌクレオチド連結エレメントが同定部分の特異的な配列またはその相補体に結合する。いくつかの実施形態において、異なる波長で蛍光をそれぞれが発する異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブにより、種々の増幅生成物を同じ増幅反応液において識別することができる。例えば、いくつかの実施形態において、２つの異なる波長（ＷＬＡおよびＷＬＢ）で蛍光を発し、かつ、２つの異なるライゲーション生成物（それぞれ、Ａ’およびＢ’）の２つの異なる同定部分に対して特異的である２つの異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プローブを使用することができる。標的核酸配列Ａがサンプルに存在するならば、ライゲーション生成物Ａ’が形成され、標的核酸配列Ｂがサンプルに存在するならば、ライゲーション生成物Ｂ’が形成される。いくつかの実施形態において、適切な標的核酸配列がサンプルに存在しない場合でさえ、ライゲーション生成物Ａ’および／またはライゲーション生成物Ｂ’が形成される場合があり、しかし、そのようなライゲーションは、適切な標的核酸配列がサンプルに存在するときよりも測定可能なほどに小さい程度で生じる。増幅後、どの特定の標的核酸配列がサンプルに存在しているかを、検出されたシグナルの波長に基づいて決定することができる。従って、波長ＷＬＡのみの適切な検出可能なシグナル値が検出されるならば、そのサンプルは標的核酸配列Ａを含み、標的核酸配列Ｂを含まないことが分かる。両方の波長（ＷＬＡおよびＷＬＢ）の適切な検出可能なシグナル値が検出されるならば、そのサンプルは標的核酸配列Ａおよび標的核酸配列Ｂの両方を含むことが分かる。
本発明の教示の様々な態様を下記の実施例を考慮してさらに理解することができ、しかし、下記の実施例は、いかなる点でも、本教示の範囲を限定するとして解釈してはならない。
（３．例示的な実施形態）
本発明は、コード化反応およびデコード反応を使用して、少なくとも１つのサンプルにおける標的ポリヌクレオチド配列の存在または非存在を検出する（あるいは、少なくとも１つのサンプルにおける標的ポリヌクレオチド配列を定量する）ための方法、試薬およびキットに関する。特定の標的核酸配列がサンプルに存在するとき、反応生成物が、アドレス可能なプライマー部分を含むコード化反応において形成される。少なくとも１つの標識が、配列が存在するか、または非存在であるかどうかに依存して検出可能なシグナル値を提供することができるデコード増幅反応において用いられる。
非限定的な例示的概略図を図１Ａに示す。この場合、目的とする所定の標的ポリヌクレオチドＸを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ（ＰＰＡ）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂ（ＰＰＢ）を含む第２のプローブとを用いてコード化ライゲーション反応において調べることができる。第１のコード化ライゲーション反応ではまた、目的とする所定の標的ポリヌクレオチドＹを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ（ＰＰＣ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄ（ＰＰＤ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第１のコード化ライゲーション反応ではまた、目的とする所定の標的ポリヌクレオチドＮ（これは、標的ポリヌクレオチドＮがサンプル中に存在しないことを示すために点線で示される）を、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｅ（ＰＰＥ）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｆ（ＰＰＦ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。そのようなスキームにおいて、所定の標的ポリヌクレオチドの正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができる。
コード化ライゲーション反応が行われた後、反応生成物を分割して少なくとも３つのデコード増幅反応液（この場合、ＰＣＲ増幅反応液）に入れることができる。第１のデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ（ＰＡ）、アドレスプライマーＢ（ＰＢ）および標識（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなど）を含み、第２のデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＣ（ＰＣ）、アドレスプライマーＤ（ＰＤ）および標識を含み、第３のデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＥ（ＰＥ）、アドレスプライマーＦ（ＰＦ）および標識を含む。それぞれのデコード増幅反応により、標識からのシグナルの生成がもたらされ得る。いずれかの所定のデコード増幅反応において標識によって生じたシグナルの量は、所定のデコード反応における所定のアドレスプライマーによって与えられるように、サンプルにおける所定の標的ポリヌクレオチドの量の定量可能な基準を提供し得る。この実施形態において、第１のデコード増幅反応は、標識からのシグナルの量に基づいてサンプルにおける遺伝子Ｘを定量することを可能にする。第２のデコード増幅反応は、標識からのシグナルの量に基づいてサンプルにおける遺伝子Ｙを定量することを可能にする。第３のデコード増幅反応は、標識からのシグナルの相対的な非存在に基づいてサンプルにおける標的ポリヌクレオチドＮの非存在を明らかにすることを可能にする。そのようなスキームにおいて、所定の発現した遺伝子の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができ、また、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出および定量するための能力を、単一の標識に由来するシグナルによって評価することができる。
いくつかの実施形態においては、反応生成物が、アドレス可能なプライマー部分に加えて同定部分を含むコード化反応において形成され、また、標識化プローブが、対応する同定部分配列がデコード増幅反応のときに存在するか、または非存在であるかどうかに依存して異なる検出可能なシグナル値を提供するデコード増幅反応において用いられる（図１Ｂにおける例示的概略図を参照のこと）。
図１Ｂに示されるように、目的とする所定の標的ポリヌクレオチドＸを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ（ＰＰＡ）、同定部分１（ＩＰ１）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂ（ＰＰＢ）を含む第２のプローブとを用いてコード化ライゲーション反応において調べることができる。第１のコード化ライゲーション反応ではまた、目的とする所定の標的ポリヌクレオチドＹを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ（ＰＰＣ）および同定部分１（ＩＰ１）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄ（ＰＰＤ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第１のコード化ライゲーション反応ではまた、目的とする所定の標的ポリヌクレオチドＺを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｅ（ＰＰＥ）および同定部分１（ＩＰ１）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄ（ＰＰＦ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第１のコード化ライゲーション反応ではまた、目的とする所定の標的ポリヌクレオチドＮ（これは、標的ポリヌクレオチドＮがサンプル中に存在しないことを示すために点線で示される）を、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ（ＰＰＧ）および同定部分１（ＩＰ１）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｈ（ＰＰＨ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。そのようなスキームにおいて、所定の標的ポリヌクレオチド自身をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができる。
コード化ライゲーション反応が行われた後、反応生成物を分割して少なくとも３つのデコード増幅反応液（この場合、ＰＣＲ増幅反応液）に入れることができる。第１のデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ（ＰＡ）、アドレスプライマーＢ（ＰＢ）および標識化プローブ（この場合、切断可能なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブなど）を含み、第２のデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＣ（ＰＣ）、アドレスプライマーＤ（ＰＤ）および標識化プローブを含み、第３のデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＥ（ＰＥ）、アドレスプライマーＦ（ＰＦ）および標識化プローブを含む。それぞれのデコード増幅反応液は同じ標識化プローブを含み、標識化プローブからのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応において標識化プローブによって生じたシグナルの量は、所定のデコード反応における所定のアドレスプライマーによって与えられるように、サンプルにおける所定の標的ポリヌクレオチドの量の定量可能な基準を提供し得る。この実施形態において、第１のデコード増幅反応は、標識化プローブからのシグナルの量に基づいてサンプルにおける遺伝子Ｘを定量することを可能にする。第２のデコード増幅反応は、標識化プローブからのシグナルの量に基づいてサンプルにおける遺伝子Ｙを定量することを可能にする。第３のデコード増幅反応は、標識化プローブからのシグナルの相対的な非存在に基づいてサンプルにおける標的ポリヌクレオチドＮの非存在を明らかにすることを可能にする。そのようなスキームにおいて、所定の発現した遺伝子の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができ、また、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出および定量するための能力を、単一のシグナル標識化プローブに由来するシグナルによって評価することができる。
いくつかの実施形態においては、少なくとも２つのサンプルが少なくとも２つのコード化反応によって分析され、この場合、各サンプルが同定部分によりコード化され、かつ、各標的ポリヌクレオチドがアドレス可能なプライマー部分によりコード化される。標識化プローブを、所定の標的ポリヌクレオチド配列が所定のサンプルに由来するかどうかに依存して異なる検出可能なシグナル値を提供するために、デコード増幅反応において用いることができる（図１Ｃにおける例示的概略図を参照のこと）。
図１Ｃに示されるように、サンプル１における目的とする所定の遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ（ＰＰＡ）、同定部分１（ＩＰ１）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂ（ＰＰＢ）を含む第２のプローブとを用いて第１のコード化反応において調べることができる。第１のコード化反応ではまた、目的とする所定の遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分１（ＩＰ１）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄ（ＰＰＤ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第１のコード化反応ではまた、目的とする所定の遺伝子Ｚ（これは、遺伝子Ｚがサンプル１に存在しないことを示すために点線で示される）を、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｅ（ＰＰＥ）、同定部分１（ＩＰ１）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｆ（ＰＰＦ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第１のコード化反応ではまた、目的とする所定の遺伝子Ｎ（これは、遺伝子Ｎがサンプル１に存在しないことを示すために点線で示される）を、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｇ（ＰＰＧ）、同定部分１（ＩＰ１）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｈ（ＰＰＨ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。
サンプル２についての第２のコード化反応においては、サンプル２における目的とする所定の遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ（ＰＰＡ）、同定部分２（ＩＰ２）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂ（ＰＰＢ）を含む第２のプローブとを用いて第２のコード化反応において調べることができる。第２のコード化反応ではまた、目的とする所定の遺伝子Ｙ（これは、遺伝子Ｙがサンプル２に存在しないことを示すために点線で示される）を、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ（ＰＰＣ）、同定部分２（ＩＰ２）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄ（ＰＰＤ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第２のコード化反応ではまた、目的とする所定の遺伝子Ｚを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｅ（ＰＰＥ）、同定部分２（ＩＰ２）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｆ（ＰＰＦ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第２のコード化反応ではまた、目的とする所定の遺伝子Ｎ（これは、遺伝子Ｎがサンプル２中に存在しないことを示すために点線で示される）を、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｇ（ＰＰＧ）、同定部分２（ＩＰ２）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｈ（ＰＰＨ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。
第１および第２のコード化ライゲーション反応が行われた後、反応液を一緒にすることができる。一緒にされたコード化反応液は、その後、分割されて、少なくとも４つのデコード増幅反応液に入れることができる（図１Ｃ（続き））。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ（ＰＡ）、アドレスプライマーＢ（ＰＢ）、標識化プローブ１（ＬＰ１）、標識化プローブ２（ＬＰ２）を含む第１のデコード増幅反応液と、アドレスプライマーＣ（ＰＣ）、アドレスプライマーＤ（ＰＤ）、標識化プローブ１（ＬＰ１）および標識化プローブ２（ＬＰ２）を含む第２のデコード増幅反応液と、アドレスプライマーＥ（ＰＥ）、アドレスプライマーＦ（ＰＦ）、標識化プローブ１（ＬＰ１）および標識化プローブ２（ＬＰ２）を含む第３のデコード増幅反応液と、アドレスプライマーＧ（ＰＧ）、アドレスプライマーＨ（ＰＨ）、標識化プローブ１（ＬＰ１）および標識化プローブ２（ＬＰ２）を含む第４のデコード増幅反応液とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は標識化プローブ１および標識化プローブ２からのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応液における標識化プローブ１対標識化プローブ２の比率は、２つのサンプルの間における所定の標的ポリヌクレオチドについての量における違いの基準を提供し得る。この実施形態において、第１のデコード増幅反応は、標識化プローブ２に対する標識化プローブ１からのシグナルの比率に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間における標的ポリヌクレオチドＸを定量することを可能にする。第２のデコード増幅反応は、標識化プローブ２に対する標識化プローブ１からのシグナルの比率に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間における標的ポリヌクレオチドＹを定量することを可能にする。第３のデコード増幅反応は、標識化プローブ２に対する標識化プローブ１からのシグナルの比率に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間における標的ポリヌクレオチドＺを定量することを可能にする。第４のデコード増幅反応は、標識化プローブ２に対する標識化プローブ１からのシグナルの比率に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間における標的ポリヌクレオチドＮを定量することを可能にする。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドが、直接に、または、中間体（例えば、ｍＲＮＡから逆転写によって得られたｃＤＮＡ標的など）を介して、そのいずれかでコード化ライゲーション反応およびデコード増幅反応に供される。いくつかの実施形態において、最初の標的ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを含み、逆転写反応を、少なくとも１つのｃＤＮＡを生じさせるために行うことができ、その後、少なくとも１つのコード化ライゲーション反応および少なくとも１つのデコード増幅反応を行うことができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡライゲーションプローブが標的ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡリガーゼがライゲーション反応において用いられ、その後、デコード増幅反応が行われる。ライゲーション生成物および増幅生成物を、標識化プローブを使用して検出（または定量）することができる。
（コード化ライゲーション反応を用いた単一のサンプルにおける発現遺伝子の比較）
コード化反応のライゲーションプローブのアドレス可能なプライマー部分およびデコード増幅反応のアドレスプライマーは、複数の標的ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出、あるいは、複数の標的ポリヌクレオチドの定量を提供し得る。前記の例示的な実施形態の教示はまた、少なくとも１つの発現した遺伝子の比較がコード化ライゲーション反応を用いて行われるこれらの非限定的な前述の実施形態に関連して適用され得ることが理解される。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分は、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、非常に多数の標的ポリヌクレオチドまでの増大した検出を提供し得る。
この教示の例示的な概略が図４Ａに示され、ここで、発現した遺伝子の単一のサンプルを逆転写することができ、コード化反応をそれに対して行うことができる。取り込まれていない反応成分を必要に応じて除いた後、コード化反応生成物を分割して少なくとも２つのデコード反応液に入れることができる。
図４Ｂに示されるように、目的とする所定の遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａおよび同定部分１を含む第１のプローブと、３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いてコード化ライゲーション反応において調べることができる。第１のコード化ライゲーション反応ではまた、目的とする所定の遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃおよび同定部分１を含む第１のプローブと、３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。そのようなスキームにおいて、所定の標的ポリヌクレオチド（この場合、所定の発現した遺伝子）の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができる。
コード化ライゲーション反応が行われた後、反応生成物を分割して少なくとも２つのデコード増幅反応液に入れることができる。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ、アドレスプライマーＢおよび標識化プローブ１を含む第１のデコード増幅反応液と、アドレスプライマーＣ、アドレスプライマーＤおよび標識化プローブ１を含む第２のデコード増幅反応液とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は標識化プローブ１からのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応における標識化プローブ１のシグナルの量は、所定のデコード反応における所定のアドレスプライマーによって与えられるように、所定のサンプルにおける異なる発現した遺伝子についての発現レベルにおける違いの基準を提供し得る。この実施形態において、第１のデコード増幅反応は、標識化プローブ１からのシグナルの量に基づいてサンプルにおける遺伝子Ｘを定量することを可能にする。第２のデコード増幅反応は、標識プローブ１からのシグナルの量に基づいてサンプルにおける遺伝子Ｙを定量することを可能にする。そのようなスキームにおいて、所定の発現した遺伝子の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができ、また、同じ同定部分によりコード化されたサンプル中の発現した遺伝子を検出および定量するための能力を、単一の標識化プローブに由来するシグナルによって評価することができる。
（ライゲーションコード化反応を用いた発現遺伝子の多サンプル比較）
本発明の教示のいくつかの実施形態は、少なくとも２つのサンプルの間における少なくとも１つの所定の発現した標的ポリヌクレオチドの比較分析を提供する。コード化反応のライゲーションプローブのアドレス可能なプライマー部分およびデコード増幅反応のアドレスプライマーは、２つのサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出、あるいは、２つのサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの定量を提供し得る。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分は、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、非常に多数の標的ポリヌクレオチドまでの増大した検出を提供し得る。
本発明の教示のいくつかの実施形態においては、コード化ライゲーション反応を少なくとも２つのサンプルに対して並行して行うことができる（例えば、図５を参照のこと）。例えば、ｍＲＮＡサンプル、または、それから作製されたｃＤＮＡサンプルを第１の供給源から取得することができる。さらに、ｍＲＮＡサンプル、または、それから作製されたｃＤＮＡサンプルを第２の供給源から取得することができる。その後、コード化反応をこれら２つのサンプルのそれぞれに対して個々に行うことができる。個々に行われたコード化反応は、その後、１つの混合物に一緒にすることができ、そして、少なくとも１つのデコード増幅反応を行うことができる。デコード反応は、これら２つのサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルの比較を可能にし得る。
図６Ａに示される１つの非限定的な実施形態では、目的とする所定の遺伝子Ｘ（図６Ａの上側半分）を、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ（ＰＰＡ）、同定部分１（ＩＰ１）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂ（ＰＰＢ）を含む第２のプローブとを用いて第１のコード化ライゲーション反応において調べることができる。第１のコード化ライゲーション反応ではまた、目的とする所定の遺伝子Ｙ（図６Ａの下側半分）を、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ（ＰＰＣ）、同定部分１（ＩＰ１）および標的特異的部分（ＴＳＰ）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄ（ＰＰＤ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。
さらに、第２のコード化ライゲーション反応（例えば、図６Ｂを参照のこと）において、目的とする遺伝子Ｘ（図６Ｂの上側半分）を、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ（ＰＰＡ）および同定部分３（ＩＰ３）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂ（ＰＰＢ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。目的とする遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ（ＰＰＣ）および同定部分３（ＩＰ３）を含む第１のプローブと、標的特異的部分（ＴＳＰ）および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄ（ＰＰＤ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。
そのようなスキームにおいて、所定の発現した遺伝子種についての起源サンプルを同定部分によりコード化することができ、また、所定の発現した遺伝子種の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができる。
第１および第２のコード化ライゲーション反応が行われた後、反応生成物を一緒にすることができる。一緒にされたコード化反応生成物は、その後、分割して少なくとも２つのデコード増幅反応液に入れることができる。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ、アドレスプライマーＢ、標識化プローブ１および標識化プローブ３を含む第１のデコード増幅反応液（図６Ｃ）と、アドレスプライマーＣ、アドレスプライマーＤ、標識化プローブ１および標識化プローブ３を含む第２のデコード増幅反応液（図６Ｄ）とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は標識化プローブ１および標識化プローブ３からのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応における、標識化プローブ３に対する標識化プローブ１からのシグナルの比率は、これら２つのサンプルの間における所定の遺伝子についての発現レベルにおける違いの基準を提供し得る。この実施形態において、第１のデコード増幅反応は、標識化プローブ３に対する標識化プローブ１からのシグナルの比率に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間で遺伝子Ｘを定量することを可能にする。第２のデコード増幅反応は、標識化プローブ３に対する標識プローブ１からのシグナルの比率に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間で遺伝子Ｙを定量することを可能にする。
（ライゲーションコード化反応を用いた、プールされたサンプルからの発現遺伝子の多サンプル比較）
本発明の教示のいくつかの実施形態は、少なくとも２つのサンプルの間における少なくとも１つの所定の発現した標的ポリヌクレオチドの比較分析を提供し、この場合、少なくとも２つのサンプルのうちの少なくとも１つが１つ以上の供給源からプールされる。コード化反応のライゲーションプローブのアドレス可能なプライマー部分およびデコード増幅反応のアドレスプライマーは、２つの異なるサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出、あるいは、２つの異なるサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの定量を提供し得る。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分および一連の対応するアドレスプライマーは、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、非常に多数の標的ポリヌクレオチドまでの増大した検出を提供し得る。
本発明の教示のいくつかの実施形態においては、コード化ライゲーション反応を少なくとも２つのサンプルに対して並行して行うことができ、この場合、少なくとも２つのサンプルのうちの少なくとも１つが少なくとも２つの供給源からプールされる（例えば、図７の概略図を参照のこと）。例えば、ｍＲＮＡサンプル、または、それから作製されたｃＤＮＡサンプルを少なくとも２つの第１の供給源から取得することができる。さらに、ｍＲＮＡサンプル、または、それから作製されたｃＤＮＡサンプルを少なくとも２つの第２の供給源から取得することができる。その後、コード化反応をこれら２つのプールされたサンプルのそれぞれに対して個々に行うことができる。個々に行われたコード化反応は、その後、１つの混合物に一緒にすることができ、そして、少なくとも１つのデコード増幅反応を行うことができる。デコード反応は、これら２つのプールされたサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルの比較を可能にし得る。
例えば、（プールされていないサンプルについて図６Ａおよび図６Ｂに示される様式と同様な様式で）、目的とする所定の遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分１および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いて第１のコード化ライゲーション反応において調べることができる。第１のコード化ライゲーション反応ではまた、目的とする所定の遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分１および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第１のコード化反応における遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙの量は少なくとも２つのプールされたサンプルの結果である；例えば、少なくとも２つの正常な組織が一緒になるようにプールされ、第１のコード化反応における遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙの量はこのプール化の反映である。
第２のコード化ライゲーション反応において、目的とする遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分３および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。目的とする遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分３および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第２のコード化反応における遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙの量は少なくとも２つのプールされたサンプルの結果である；例えば、少なくとも２つの疾患組織が一緒になるようにプールされ、第２のコード化反応における遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙの量はこのプール化の反映である。そのようなスキームにおいて、所定の発現した遺伝子種についてのプールされたサンプルの正体を同定部分によりコード化することができ、また、所定の発現した遺伝子種の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができる。
第１および第２のコード化ライゲーション反応が行われた後、これらの反応の生成物を一緒にすることができる。一緒にされたコード化反応液は、その後、（プールされていないサンプルについて図６Ｃ〜図６Ｄに示される様式と同様な様式で）分割して少なくとも２つのデコード増幅反応液に入れることができる。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ、アドレスプライマーＢ、標識化プローブ１および標識化プローブ３を含む第１のデコード増幅反応液と、アドレスプライマーＣ、アドレスプライマーＤ、標識化プローブ１および標識化プローブ３を含む第２のデコード増幅反応液とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は標識化プローブ１および標識化プローブ３からのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応における標識化プローブ１対標識化プローブ３の比率は、２つのプールされたサンプルの間における所定の遺伝子についての発現レベルにおける違いの基準を提供し得る。この実施形態において、第１のデコード増幅反応は、標識化プローブ３に対する標識化プローブ１からのシグナルの比率に基づいて、第１のプールされたサンプルおよび第２のプールされたサンプルの間で遺伝子Ｘを定量することを可能にする。第２のデコード増幅反応は、標識化プローブ３に対する標識プローブ１からのシグナルの比率に基づいて、第１のプールされたサンプルおよび第２のプールされたサンプルの間で遺伝子Ｙを定量することを可能にする。
プール化は多数のサンプルを伴う必要がないことが理解される。例えば、単一のプールされたサンプルを、プール化を伴わない単一のサンプルについて図４Ａおよび図４Ｂに示される様式と同様な様式で本発明の教示に従って分析することができる。
（ＰＣＲコード化反応を用いた単一のサンプルにおける発現遺伝子の比較）
いくつかの実施形態において、コード化反応はまた、ＰＣＲを含むことができる。ＰＣＲコード化反応を含むいくつかの実施形態において、アドレス可能なプライマー部分は、コード化反応におけるＰＣＲプライマーの標的特異的部分の５’末端の伸張物である。デコード増幅反応のアドレスプライマーは、それらのアドレス可能なプライマー部分に基づくコード化ＰＣＲの生成物を増幅することによって、複数の標的ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出、あるいは、複数の標的ポリヌクレオチドの定量を提供し得る。前記の例示的な実施形態の教示はまた、発現した遺伝子の比較がＰＣＲコード化反応を用いて行われるこれらの非限定的な前記実施形態に関連して適用され得ることが理解される。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分および一連の対応するアドレスプライマーは、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、非常に多数の標的ポリヌクレオチドまでの増大した検出を提供し得る。
例えば、目的とする所定の遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分１および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いて第１のコード化ＰＣＲにおいて調べることができる。第１のコード化ＰＣＲではまた、目的とする所定の遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分１および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。そのようなスキームにおいて、例えば、図８に示されるように、所定の発現した遺伝子種の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができる。図８において、アドレス可能なプライマー部分は、目的とする所定の遺伝子についてのデコード反応における単一のアドレスプライマーの使用をもたらす。（他の実施形態が、例えば、第１のアドレス可能なプライマー部分および第２のアドレス可能なプライマー部分が、所定の標的遺伝子を調べるために、第１のプローブおよび第２のプローブにおいて使用され、それにより、その所定の遺伝子についての最終的なデコード反応における２つのアドレスプライマーをもたらしたコード化ライゲーション反応に関して下記で議論されるように、意図されることが理解される。１対のアドレスプライマーと同様に、単一のアドレスプライマーを含む実施形態が任意の所定のデコード反応のために企図されることは本発明の教示の一般的な特徴である。いずれの場合でも、所定のデコード反応におけるアドレスプライマー（１つまたは複数）を、ユニバーサルな一連のプライマーから選ぶことができ、それにより、多重化された実施形態での規模のより大きな経済性を提供し、それにより、例えば、特有のプライマーを最小限に抑えることができ、かつ、従って、全体的なコストを低下させることができる）。
コード化ＰＣＲが行われた後、反応生成物を分割して少なくとも２つのデコード増幅反応液に入れることができる。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡおよび標識化プローブ１を含む第１のデコード増幅反応液と、アドレスプライマーＢおよび標識化プローブ１を含む第２のデコード増幅反応液とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は標識化プローブ１からのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応における標識化プローブ１のシグナルの量は、所定のサンプルにおける種々の発現した遺伝子についての発現レベルにおける違いの基準を提供し得る。この実施形態において、第１のデコード増幅反応は、標識化プローブ１からのシグナルの量に基づいてサンプルにおける遺伝子Ｘを定量することを可能にする。第２のデコード増幅反応は、標識プローブ１からのシグナルの量に基づいてサンプルにおける遺伝子Ｙを定量することを可能にする。そのようなスキームにおいて、例えば、図８に示されるように、所定の発現した遺伝子種の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができ、また、同じ同定部分によりコード化されたサンプル中の発現した遺伝子を検出および定量するための能力を、単一の標識化プローブに由来するシグナルによって評価することができる。
（ＰＣＲコード化反応を用いた発現遺伝子の多サンプル比較）
本発明の教示のいくつかの実施形態は、少なくとも２つのサンプルの間における少なくとも１つの所定の発現した標的ポリヌクレオチドの比較分析を提供する。コード化反応のＰＣＲプローブのアドレス可能なプライマー部分およびデコード増幅反応のアドレスプライマーは、２つのサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出、あるいは、２つのサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの定量を提供し得る。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分および一連の対応するアドレスプライマーは、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、非常に多数の標的ポリヌクレオチドまでの増大した検出を提供し得る。
本発明の教示のいくつかの実施形態においては、コード化ＰＣＲを少なくとも２つのサンプルに対して並行して行うことができる（図９に概略的に示される）。例えば、ｍＲＮＡサンプル、または、それから作製されたｃＤＮＡサンプルを第１の供給源から取得することができる。さらに、ｍＲＮＡサンプル、または、それから作製されたｃＤＮＡサンプルを第２の供給源から取得することができる。その後、コード化反応をこれら２つのサンプルのそれぞれに対して個々に行うことができる。個々に行われたコード化反応は、その後、単一の混合物に一緒にすることができ、そして、少なくとも１つのデコード増幅反応を行うことができる。デコード反応は、これら２つのサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルの比較を可能にし得る。
例えば、目的とする所定の遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分１および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いて第１のコード化ＰＣＲにおいて調べることができる。第１のコード化ＰＣＲではまた、目的とする所定の遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、標的特異的部分および同定部分１を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。
第２のコード化ＰＣＲにおいて、目的とする遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分２、標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。目的とする遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分２および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。そのようなスキームにおいて、例えば、図９に示されるように、所定の発現した遺伝子種についての起源サンプルを同定部分によりコード化することができ、また、所定の発現した遺伝子種の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができる。
第１および第２のコード化ＰＣＲが行われた後、反応生成物を一緒にすることができる。一緒にされたコード化反応液は、その後、分割して少なくとも２つのデコード増幅反応液に入れることができる。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ、アドレスプライマーＢ、標識化プローブ１および標識化プローブ２を含む第１のデコード増幅反応液（アッセイ＃１として図９に示される）と、アドレスプライマーＣ、アドレスプライマーＤ、標識化プローブ１および標識化プローブ２を含む第２のデコード増幅反応液（アッセイ＃２４として図９に示される）とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は標識化プローブ１および標識化プローブ２からのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応における標識化プローブ１対標識化プローブ２の比率は、２つのサンプルの間における所定の遺伝子についての発現レベルにおける違いの基準を提供し得る。この実施形態において、第１のデコード増幅反応は、標識化プローブ２に対する標識化プローブ１からのシグナルの比率に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間で遺伝子Ｘを定量することを可能にする。第２のデコード増幅反応は、標識化プローブ２に対する標識プローブ１からのシグナルの比率に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間で遺伝子Ｙを定量することを可能にする。
（ＰＣＲコード化反応を用いた、プールされたサンプルからの発現遺伝子の多サンプル比較）
本発明の教示のいくつかの実施形態は、少なくとも２つのサンプルの間における少なくとも１つの所定の発現した標的ポリヌクレオチドの比較分析を提供し、この場合、少なくとも２つのサンプルのうちの少なくとも１つが１つ以上の供給源からプールされる。コード化反応のプローブのアドレス可能なプライマー部分およびデコード増幅反応のアドレスプライマーは、２つのサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出、あるいは、２つのサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドの定量を提供し得る。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分および一連の対応するアドレスプライマーは、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、標的ポリヌクレオチドの増大した検出を提供し得る。
本発明の教示のいくつかの実施形態においては、コード化ＰＣＲを少なくとも２つのサンプルに対して並行して行うことができ、この場合、２つのサンプルのうちの少なくとも１つが少なくとも２つの供給源からプールされる。例えば、ｍＲＮＡサンプル、または、それから作製されたｃＤＮＡサンプルを少なくとも２つの第１の供給源から取得することができる。さらに、ｍＲＮＡサンプル、または、それから作製されたｃＤＮＡサンプルを少なくとも２つの第２の供給源から取得することができる。その後、ＰＣＲコード化反応をこれら２つのプールされたサンプルのそれぞれに対して個々に行うことができる。個々に行われたＰＣＲコード化反応は、その後、単一の混合物に一緒にすることができ、そして、少なくとも１つのデコード増幅反応を行うことができる。デコード反応は、これら２つのプールされたサンプルの間における少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列の発現レベルの比較を可能にし得る（例示的な概略図については、例えば、図１０を参照のこと）。
例えば、（プールされていないサンプルについて図９に示される様式とおおまかには同様な様式で）、目的とする所定の遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分１および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いて第１のコード化ＰＣＲにおいて調べることができる。第１のコード化ＰＣＲではまた、目的とする所定の遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分１および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第１のコード化ＰＣＲにおける遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙの量は少なくとも２つのプールされたサンプルの結果である；例えば、少なくとも２つの正常な組織が一緒になるようにプールされ、第１のコード化反応における遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙの量はこのプール化の反映である。
第２のコード化ＰＣＲにおいて、目的とする遺伝子Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分２および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。目的とする遺伝子Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分２および標的特異的部分を含む第１のプローブと、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。そのようなスキームにおいて、（プールされていないサンプルについて図９に示される様式と同様な様式で）、所定の発現した遺伝子種についてのプールされたサンプルの正体を同定部分によりコード化することができ、また、所定の発現した遺伝子種の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができる。第２のコード化反応における遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙの量は少なくとも２つのプールされたサンプルの結果である；例えば、少なくとも２つの疾患組織が一緒になるようにプールされ、第２のコード化反応における遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙの量はこのプール化の反映である。
第１および第２のコード化ＰＣＲが行われた後、反応生成物を一緒にすることができる。一緒にされたコード化ＰＣＲ反応液は分割して少なくとも２つのデコード増幅反応液に入れることができる。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ、アドレスプライマーＢ、標識化プローブ１および標識化プローブ２を含む第１のデコード増幅反応液と、アドレスプライマーＣ、アドレスプライマーＤ、標識化プローブ１および標識化プローブ２を含む第２のデコード増幅反応液とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は標識化プローブ１および標識化プローブ２からのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応における標識化プローブ１対標識化プローブ２の比率は、２つのプールされたサンプルの間における所定の遺伝子についての発現レベルにおける違いの基準を提供し得る。この実施形態において、第１のデコード増幅反応は、標識化プローブ２に対する標識化プローブ１からのシグナルの比率に基づいて、第１のプールされたサンプルおよび第２のプールされたサンプルの間で遺伝子Ｘを定量することを可能にする。第２のデコード増幅反応は、標識化プローブ２に対する標識プローブ１からのシグナルの比率に基づいて、第１のプールされたサンプルおよび第２のプールされたサンプルの間で遺伝子Ｙを定量することを可能にする。
プール化は多数のサンプルを伴う必要がないことが理解される。例えば、単一のプールされたサンプルを、単一のサンプルについて図８と同様な様式で本発明の教示に従って分析することができる。
（ライゲーションコード化反応を用いた単一のサンプルにおけるＳＮＰの比較）
コード化反応のライゲーションプローブのアドレス可能なプライマー部分およびデコード増幅反応のアドレスプライマーは、複数の標的ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出、あるいは、複数の標的ポリヌクレオチドの定量を提供し得る。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分および一連の対応するアドレスプライマーは、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、非常に多数の標的ポリヌクレオチドまでの増大した検出を提供し得る。
例えば、図１１Ａに概略的に示されるように、少なくとも２つの対立遺伝子改変体を含む所定のＳＮＰ遺伝子座Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分１および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別子ヌクレオチド１（この場合、Ｇ）を含む第１のプローブ１と、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分２および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別子ヌクレオチド２（この場合、Ａ）を含む第１のプローブ２と、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いてコード化ライゲーション反応において調べることができる。
少なくとも２つの対立遺伝子改変体を含む所定のＳＮＰ遺伝子座Ｙを、ＳＮＰ遺伝子座Ｘと同じコード化ライゲーション反応において調べることができる。ＳＮＰ遺伝子座Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分１および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド１（この場合、Ｔ）を含む第１のプローブ１と、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。第１のコード化反応ではまた、ＳＮＰ遺伝子座Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分２および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別子ヌクレオチド２（この場合、Ｃ）を含む第１のプローブ２と、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。
そのようなスキームにおいて、所定のＳＮＰ遺伝子座の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができ、また、所定のＳＮＰ遺伝子座における所定の改変体の正体（例えば、識別用ヌクレオチド）を同定部分によりコード化することができる。コード化ライゲーション反応が行われた後、反応生成物を分割して少なくとも２つのデコード増幅反応液に入れることができる。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ、アドレスプライマーＢ、標識化プローブ１および標識化プローブ２を含む第１のデコード増幅反応液（示される）と、アドレスプライマーＣ、アドレスプライマーＤ、標識化プローブ１および標識化プローブ２を含む第２のデコード増幅反応液（示されず）とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は標識化プローブ１および／または標識化プローブ２からのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応における標識化プローブ１および／または標識化プローブ２のシグナルの量は、所定のサンプルにおける所定のＳＮＰ遺伝子座でのＳＮＰ改変体の検出を提供し得る。
この実施形態では、第１のデコード増幅反応（示される）は、アドレスプライマーＡおよびアドレスプライマーＢによる増幅に基づいてサンプルにおけるＳＮＰ遺伝子座Ｘを検出することを可能にする。標識化プローブ１からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＸにおけるＳＮＰ改変体１の存在が示される。標識化プローブ２からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＸにおけるＳＮＰ改変体２の存在が示される。標識化プローブ１および標識化プローブ２の両方からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＸにおけるＳＮＰ改変体１およびＳＮＰ改変体２の両方の存在が示され得る。ＳＮＰ遺伝子座Ｘにおける対立遺伝子改変体に関連して、例えば、この様式での標識化プローブの検出は、ＳＮＰ遺伝子座Ｘにおけるホモ接合体のＳＮＰ改変体１の決定、ＳＮＰ遺伝子座Ｘにおけるホモ接合体のＳＮＰ改変体２の決定、または、ＳＮＰ遺伝子座Ｘにおけるヘテロ接合体のＳＮＰ改変体１およびＳＮＰ改変体２の決定を可能にし得る。
この実施形態では、第２のデコード増幅反応（示されず）は、アドレスプライマーＣおよびアドレスプライマーＤによる増幅に基づいてサンプルにおけるＳＮＰ遺伝子座Ｙを検出することを可能にする。標識化プローブ１からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＹにおけるＳＮＰ改変体１の存在が示される。標識化プローブ２からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＹにおけるＳＮＰ改変体２の存在が示され得る。標識化プローブ１および標識化プローブ２の両方からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＹにおけるＳＮＰ改変体１およびＳＮＰ改変体２の両方の存在が示され得る。ＳＮＰ遺伝子座Ｙにおける対立遺伝子改変体に関連して、例えば、この様式での標識化プローブの検出は、ＳＮＰ遺伝子座Ｙにおけるホモ接合体のＳＮＰ改変体１の決定、ＳＮＰ遺伝子座Ｙにおけるホモ接合体のＳＮＰ改変体２の決定、または、ＳＮＰ遺伝子座Ｙにおけるヘテロ接合体のＳＮＰ改変体１およびＳＮＰ改変体２の決定を可能にし得る。
この実施形態においては、また、一般には本発明の教示においては、識別用ヌクレオチド「１」または識別用ヌクレオチド「２」などの具体的な正体は限定でないことが理解される。図１１Ａに示されるこの実施形態の関連での例示目的のために、ＳＮＰ遺伝子座Ｘを調べる第１のプローブ１の標的特異的部分の識別用ヌクレオチド１は、例えば、シトシンであり得、それにより、グアニンヌクレオチドをＳＮＰ遺伝子座Ｘのヌクレオチド改変体として決定することを可能にする。ＳＮＰ遺伝子座Ｘを調べる第１のプローブ２の標的特異的部分の識別用ヌクレオチド２は、例えば、アデニンであり得、それにより、チミンをＳＮＰ遺伝子座Ｘのヌクレオチド改変体として決定することを可能にする。ＳＮＰ遺伝子座Ｙを調べる第１のプローブ１の標的特異的部分の識別用ヌクレオチド１は、例えば、チミンであり得、それにより、アデニンヌクレオチドをＳＮＰ遺伝子座Ｙのヌクレオチド改変体として決定することを可能にする。ＳＮＰ遺伝子座Ｙを調べる第１のプローブ２の標的特異的部分の識別用ヌクレオチド２は、例えば、シトシンであり得、それにより、グアニンヌクレオチドをＳＮＰ遺伝子座Ｙのヌクレオチド改変体として決定することを可能にする。従って、「識別用ヌクレオチド１」の具体的な正体が実施形態の状況に従って変化し得ること、および、用語「識別用ヌクレオチド１」などは、本発明の教示の様々な実施形態において適するように、特定のプローブに対して特定の同定部分に対する識別用ヌクレオチドの関係を例示するという好都合な方法であることが理解される。
（ループ状リンカーライゲーションコード化反応を用いた単一のサンプルにおけるＳＮＰの比較）
コード化反応のライゲーションプローブのアドレス可能なプライマー部分およびデコード増幅反応のアドレスプライマーは、複数の標的ポリヌクレオチドの存在または非存在の検出、あるいは、複数の標的ポリヌクレオチドの定量を提供し得る。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分および一連の対応するアドレスプライマーは、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用、ならびに、潜在的にはプローブループ状リンカーの余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、非常に多数の標的ポリヌクレオチドまでの増大した検出を提供し得る。
例えば、図１１Ｂに示されるように、少なくとも２つの対立遺伝子改変体を含む所定のＳＮＰ遺伝子座Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分１および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別子ヌクレオチド１（この場合、Ｇ）を含む第１のプローブ１と、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分２および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別子ヌクレオチド２（この場合、Ａ）を含む第１のプローブ２と、標的特異的部分、３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂおよびユニバーサルなスプリント部分（ＵＳ）を含む第２のプローブとを用いてコード化ライゲーション反応において調べることができる。
ユニバーサルなスプリントは、ループ状リンカーにおけるその相補的な領域にハイブリダイズすることができ、それにより、ループ状リンカーの５’末端リン酸基（この場合、Ｐ）を第２のプローブとライゲーションすることを可能にする。そのようなアプローチは、組み込まれていないプローブのヌクレアーゼ媒介による除去を容易にし得る。さらに、いくつかの実施形態において、ユニバーサルな逆方向リンカーを使用することによって、同じループ状リンカーにおける同じブロッキング基をまとめて作製することができるので、ブロッキング基（黒塗りの丸として示される）に関連する費用を最小限に抑えることができる。いくつかの実施形態において、ループ状リンカーに対するブロッキング基は２’メトキシウラシルである。だが、所望されるヌクレアーゼ抵抗性を付与する任意の好適な阻止因子を用いることができ（例えば、Ｃ１８スペーサー、および他のヌクレアーゼ抵抗性の修飾ヌクレオチド、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＴＥＧなど）、また、そのような阻止因子は本発明の教示の範囲内であることが理解される。
少なくとも２つの対立遺伝子改変体を含む所定のＳＮＰ遺伝子座Ｙを、ＳＮＰ遺伝子座Ｘと同じコード化ライゲーション反応において調べることができる。ＳＮＰ遺伝子座Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分１および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド１（この場合、Ｔ）を含む第１のプローブ１と、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分２および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド２（この場合、Ｃ）を含む第１のプローブ２と、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄならびにユニバーサルなスプリント部分（ＵＳ）を含む第２のプローブとを用いて調べることができる。
そのようなスキームにおいて、所定のＳＮＰ遺伝子座の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができ、また、所定のＳＮＰ遺伝子座における所定の改変体の正体（例えば、識別用ヌクレオチド）を同定部分によりコード化することができる。
コード化ライゲーション反応が行われた後、反応混合物を５’作用ヌクレアーゼおよび３’作用ヌクレアーゼにより処理することができ、ライゲーションされていない反応成分を分解することができる（これは点線により図１１に示される）。ライゲーションされていない反応プローブのヌクレアーゼ媒介による清浄化に関するさらなる情報、ならびに、ループ状リンカー組成物および非ループ状リンカー組成物の使用については、米国仮特許出願第６０／５１７，４７０号を参照のこと。
コード化ライゲーション反応が行われ、そして、場合により、望ましくない反応成分のヌクレアーゼ媒介による除去が行われた後、反応生成物を分割して少なくとも２つのデコード増幅反応液に入れることができる（コード化反応液を一緒にすることができ、清浄化をまとめて行うことができることもまた理解される）。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ、アドレスプライマーＢ、標識化プローブ１および標識化プローブ２を含む第１のデコード増幅反応液と、アドレスプライマーＣ、アドレスプライマーＤ、標識化プローブ１および標識化プローブ２を含む第２のデコード増幅反応液とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は標識化プローブ１および／または標識化プローブ２からのシグナルの生成をもたらし得る。いずれかの所定のデコード増幅反応における標識化プローブ１および／または標識化プローブ２のシグナルの量は、所定のサンプルにおける所定のＳＮＰ遺伝子座におけるＳＮＰ改変体の検出を提供し得る。
この実施形態では、第１のデコード増幅反応（図１２Ｂに示される）は、アドレスプライマーＡおよびアドレスプライマーＢによる増幅に基づいてサンプルにおけるＳＮＰ遺伝子座Ｘを検出することを可能にする。標識化プローブ１からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座Ｘにおける、シトシン塩基を含むＳＮＰ改変体１の存在が示される。標識化プローブ２からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＸにおけるＳＮＰ改変体２の存在が示され得る。標識化プローブ１および標識化プローブ２の両方からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＸにおけるＳＮＰ改変体１およびＳＮＰ改変体２の両方の存在が示され得る。ＳＮＰ遺伝子座Ｘにおける対立遺伝子改変体に関連して、この様式での標識化プローブの検出は、ＳＮＰ遺伝子座Ｘにおけるホモ接合体のＳＮＰ改変体１の決定、ＳＮＰ遺伝子座Ｘにおけるホモ接合体のＳＮＰ改変体２の決定、または、ＳＮＰ遺伝子座Ｘにおけるヘテロ接合体のＳＮＰ改変体１およびＳＮＰ改変体２の決定を可能にし得る。この実施形態でのＳＮＰ遺伝子座Ｘにおける対立遺伝子改変体に関連して、図１２Ａに示されるように、標識化プローブ１からのシグナルの存在により、サンプルが、シトシンを有する対立遺伝子改変体をＳＮＰ遺伝子座Ｘに含むこと、従って、ホモ接合体が示される。
図１２Ｂに示されるこの実施形態では、第２のデコード増幅反応は、アドレスプライマーＣおよびアドレスプライマーＤによる増幅に基づいてサンプルにおけるＳＮＰ遺伝子座Ｙを検出することを可能にする。標識化プローブ１からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＹにおけるＳＮＰ改変体１の存在が示される。標識化プローブ２からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＹにおけるＳＮＰ改変体２の存在が示され得る。標識化プローブ１および標識化プローブ２の両方からのシグナルの検出により、ＳＮＰ遺伝子座ＹにおけるＳＮＰ改変体１およびＳＮＰ改変体２の両方の存在が示され得る。ＳＮＰ遺伝子座Ｙにおける対立遺伝子改変体に関連して、例えば、この様式での標識化プローブの検出は、ＳＮＰ遺伝子座Ｙにおけるホモ接合体のＳＮＰ改変体１の決定、ＳＮＰ遺伝子座Ｙにおけるホモ接合体のＳＮＰ改変体２の決定、または、ＳＮＰ遺伝子座Ｙにおけるヘテロ接合体のＳＮＰ改変体１およびＳＮＰ改変体２の決定を可能にし得る。この実施形態でのＳＮＰ遺伝子座Ｙにおける対立遺伝子改変体に関連して、図１２Ｂに示されるように、標識化プローブ１からのシグナルの存在により、サンプルが、アデニンを有する対立遺伝子改変体をＳＮＰ遺伝子座Ｙに含むこと、従って、ホモ接合体が示される。
この実施形態においては、また、一般には本発明の教示においては、識別用ヌクレオチド「１」または識別用ヌクレオチド「２」などの具体的な正体は限定でないことが理解される。この実施形態の関連での例示目的のために、ＳＮＰ遺伝子座Ｘを調べる第１のプローブ１の標的特異的部分の識別用ヌクレオチド１は、例えば、グアニンであり得、それにより、シトシンヌクレオチドをＳＮＰ遺伝子座Ｘのヌクレオチド改変体として決定することを可能にする。ＳＮＰ遺伝子座Ｘを調べる第１のプローブ２の標的特異的部分の識別用ヌクレオチド２は、例えば、アデニンであり得、それにより、チミンをＳＮＰ遺伝子座Ｘのヌクレオチド改変体として決定することを可能にする。ＳＮＰ遺伝子座Ｙを調べる第１のプローブ１の標的特異的部分の識別用ヌクレオチド１は、例えば、チミンであり得、それにより、アデニンヌクレオチドをＳＮＰ遺伝子座Ｙのヌクレオチド改変体として決定することを可能にする。ＳＮＰ遺伝子座Ｙを調べる第１のプローブ２の標的特異的部分の識別用ヌクレオチド２は、例えば、シトシンであり得、それにより、グアニンヌクレオチドをＳＮＰ遺伝子座Ｙのヌクレオチド改変体として決定することを可能にする。従って、「識別用ヌクレオチド１」の具体的な正体が実施形態の状況に従って変化し得ること、および、用語「識別用ヌクレオチド１」などは、本発明の教示の様々な実施形態において適するように、特定のプローブに対して特定の同定部分に対する識別用ヌクレオチドの関係を例示するという好都合な方法であることが理解される。
（ライゲーションコード化反応を用いたＳＮＰの多サンプル比較）
本発明の教示のいくつかの実施形態は、少なくとも２つのサンプルの間における少なくとも１つの所定のＳＮＰ遺伝子座の比較分析を提供する。コード化反応のライゲーションプローブのアドレス可能なプライマー部分およびデコード増幅反応のアドレスプライマーは、２つのサンプルの間における少なくとも１つの所定のＳＮＰ遺伝子座の存在または非存在の検出、あるいは、２つのサンプルの間における少なくとも１つの所定のＳＮＰ遺伝子座の定量を提供し得る。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分および一連の対応するアドレスプライマーは、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、標的ポリヌクレオチドの増大した検出を提供し得る。
本発明の教示のいくつかの実施形態においては、コード化ライゲーション反応を少なくとも２つのサンプルに対して並行して行うことができる。例えば、ゲノムＤＮＡを第１の供給源から取得することができる。さらに、ゲノムＤＮＡを第２の供給源から取得することができる。その後、コード化反応をこれら２つのサンプルのそれぞれに対して個々に行うことができる。個々に行われたコード化反応は、その後、１つの混合物に一緒にすることができ、そして、少なくとも１つのデコード増幅反応を行うことができる。デコード反応は、これら２つのサンプルの間における少なくとも１つのＳＮＰ遺伝子座の間でのＳＮＰ遺伝子座改変体の比較を可能にし得る。
例えば、図１３Ａ（上段）に示されるように、所定のＳＮＰ遺伝子座Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分１および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド１（この場合、Ｔ）を含む第１のプローブ１と、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分２および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド２（この場合、Ｇ）を含む第１のプローブ２と、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いて第１のコード化ライゲーション反応において調べることができる。
図１３Ａ（下段）に示される第１のコード化ライゲーション反応ではまた、所定のＳＮＰ遺伝子座Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分１および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド１（この場合、Ｔ）を含む第１のプローブ１と、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分２および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド２（この場合、Ｃ）を含む第１のプローブ２と、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。
所定のＳＮＰ遺伝子座Ｘを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分３および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド１（この場合、Ｔ）を含む第１のプローブ１と、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ａ、同定部分４および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド２（この場合、Ｇ）を含む第１のプローブ２と、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｂを含む第２のプローブとを用いて（図１３Ｂに示されるような）第２のコード化ライゲーション反応において調べることができる。
図１３Ｂに示される第２のコード化ライゲーション反応ではまた、所定の遺伝子座Ｙを、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分３および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド１（この場合、Ｔ）を含む第１のプローブ１と、５’側のアドレス可能なプライマー部分Ｃ、同定部分４および標的特異的部分を含み、標的特異的部分が識別用ヌクレオチド２（この場合、Ｃ）を含む第１のプローブ２と、標的特異的部分および３’側のアドレス可能なプライマー部分Ｄを含む第２のプローブとを用いて調べることができる。
そのようなスキームにおいて、図１３Ａおよび図１３Ｂに示されるように、所定のＳＮＰ遺伝子座の正体をアドレス可能なプライマー部分によりコード化することができ、また、ＳＮＰ遺伝子座についての所定のＳＮＰ改変体の起源サンプルを同定部分によりコード化することができる。
第１および第２のコード化ライゲーション反応が行われた後、反応生成物を一緒にすることができる。一緒にされたコード化反応生成物は、その後、分割して少なくとも２つのデコード増幅反応液に入れることができる。これらのデコード増幅反応液は、アドレスプライマーＡ、アドレスプライマーＢ、標識化プローブ１、標識化プローブ２、標識化プローブ３および標識化プローブ４を含む第１のデコード増幅反応液と、アドレスプライマーＣ、アドレスプライマーＤ、標識化プローブ１、標識化プローブ２、標識化プローブ３および標識化プローブ４を含む第２のデコード増幅反応液とを含むことができる。それぞれのデコード増幅反応は、適切なアドレスプライマーが、所定の標識化プローブのための結合部位（例えば、同定部分または同定部分相補体）を有する適切な標的を増幅するために存在するならば、標識化プローブ１〜標識化プローブ４のいずれかからのシグナルの生成をもたらし得る。所定のデコード増幅反応における所定の標識化プローブからのシグナルの存在は、２つのサンプルの間におけるＳＮＰ改変体の違いの存在の検出を提供し得る。
この実施形態では、第１のデコード増幅反応（図１４Ａに示されるようなデコード増幅反応）は、標識化プローブ１および標識化プローブ３からのシグナルの存在に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間で遺伝子座Ｘの改変体を検出することを可能にする。（アドレスプライマーＣおよびアドレスプライマーＤではなく）アドレスプライマーＡおよびアドレスプライマーＢのみが第１のデコード増幅反応において存在するので、遺伝子座Ｘに由来するライゲーション生成物のみが増幅され得るライゲーションコード化反応において、存在していた遺伝子座Ｘの改変体が同定部分１および同定部分３によりコード化されていた。従って、第１のデコード増幅反応において、標識プローブ１および標識化プローブ３がそれらの対応する同定部分にハイブリダイズし、アドレスプライマーＡおよびアドレスプライマーＢによるライゲーション生成物の増幅により、シグナルが標識プローブ１および標識プローブ３についてもたらされる。この実施形態では、ＳＮＰ遺伝子座Ｘについての対立遺伝子改変体に関連して、標識プローブ１からのシグナルを、第１のサンプルにおけるホモ接合体のアデニン対立遺伝子の存在を示すために使用することができ、標識プローブ３からのシグナルを、第２のサンプルにおけるホモ接合体のアデニン対立遺伝子の存在を示すために使用することができる。
この実施形態では、第２のデコード増幅反応（図１４Ｂに示されるようなデコード増幅反応）は、標識化プローブ１および標識化プローブ３からのシグナルの存在に基づいて第１のサンプルおよび第２のサンプルの間で遺伝子座Ｙの改変体を検出することを可能にする。（アドレスプライマーＡおよびアドレスプライマーＢではなく）アドレスプライマーＣおよびアドレスプライマーＤのみが第２のデコード増幅反応において存在するので、遺伝子座Ｙに由来するライゲーション生成物のみが増幅され得る。ライゲーションコード化反応において、存在していた遺伝子座Ｙの改変体が同定部分１および同定部分３によりコード化されていた。従って、第１のデコード増幅反応において、標識プローブ１および標識化プローブ３がそれらの対応する同定部分にハイブリダイズし、アドレスプライマーＣおよびアドレスプライマーＤによるライゲーション生成物の増幅により、シグナルが標識プローブ１および標識プローブ３についてもたらされる。この実施形態では、ＳＮＰ遺伝子座Ｙについての対立遺伝子改変体に関連して、標識プローブ１からのシグナルを、第１のサンプルにおけるホモ接合体のアデニン対立遺伝子の存在を示すために使用することができ、標識プローブ３からのシグナルを、第２のサンプルにおけるホモ接合体のアデニン対立遺伝子の存在を示すために使用することができる。
図１３および図１４は、図１１および図１２に示されるユニバーサルなループ状リンカーのような、ユニバーサルなループ状リンカーの非存在下で提示されることが理解される。本発明の教示は、ユニバーサルなループ状リンカー、非ユニバーサルなループ状リンカー、ユニバーサルな非ループ状リンカーおよび非ユニバーサルな非ループ状リンカーの、任意のコード化ライゲーション反応における使用、ならびに、潜在的にはコード化ＰＣＲ反応における使用を企図し、また、同様に、任意のコード化ライゲーション反応における通常型の一本鎖プローブの使用を企図する。さらに、ユニバーサルなループ状リンカーは、図１１および図１２に示されるように、下流側プローブにおいてだけでなく、上流側プローブにおいても存在させることができることが理解される。さらに、ユニバーサルなループ状リンカーは、下流側プローブではなく、上流側プローブにおいてだけ存在させることができる。サンプル内ならびにサンプル間での異なる標的ポリヌクレオチドについての上流側プローブおよび／または下流側プローブにおけるループ形成体リンカーおよび非ループ状リンカー、ユニバーサルなリンカーおよび非ユニバーサルなリンカーの様々な並び換えもまた企図され、本発明の教示の範囲内である。ループ状リンカー組成物および非ループ状リンカー組成物に関するさらなる情報については、例えば、米国仮特許出願第６０／５１７，４７０号、ならびに、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＮＰｌｅｘＴＭ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｇｕｉｄｅを参照のこと。
（ライゲーションコード化反応を用いた、プールされたサンプルからのＳＮＰ遺伝子座の多サンプル比較）
本発明の教示のいくつかの実施形態は、少なくとも２つのサンプルの間における少なくとも１つの所定のＳＮＰ遺伝子座の比較分析を提供し、この場合、少なくとも２つのサンプルのうちの少なくとも１つが１つ以上の供給源からプールされる。コード化反応のライゲーションプローブのアドレス可能なプライマー部分およびデコード増幅反応のアドレスプライマーは、２つのサンプルの間における少なくとも１つのＳＮＰ遺伝子座の存在または非存在の検出、あるいは、２つのサンプルの間における少なくとも１つのＳＮＰ遺伝子座の定量を提供し得る。本発明の教示のアドレス可能なプライマー部分および一連の対応するアドレスプライマーは、下記の例示的な実施形態においてより明確になるように、一連のアドレスプライマー組の余剰な使用を見込んで、特有の試薬組成物を最小限にしながら、標的ポリヌクレオチドの増大した検出を提供し得る。
本発明の教示のいくつかの実施形態においては、コード化ライゲーション反応を少なくとも２つのサンプルに対して並行して行うことができ、この場合、２つのサンプルのうちの少なくとも１つが少なくとも２つの供給源からプールされる。例えば、ｇＤＮＡを少なくとも２つの第１の供給源から取得することができる。さらに、ｇＤＮＡを少なくとも２つの第２の供給源から取得することができる。第１のコード化ライゲーション反応を第１のプールされたサンプルに対して行うことができ、第２のコード化ライゲーション反応を第２のプールされたサンプルに対して行うことができる。個々に行われたコード化反応から生じた生成物を、その後、単一の混合物に一緒にすることができ、そして、少なくとも１つのデコード増幅反応を行うことができる。デコード反応は、これら２つのプールされたサンプルの間における少なくとも１つのＳＮＰ遺伝子座のＳＮＰ遺伝子座改変体の比較を可能にし得る。このプロセスの概略については、例えば、図１５を参照のこと。この場合、このプロセスは、プールされていないサンプルについての図１３および図１４の場合と同様な様式で行うことができる。
プール化は多数のサンプルを伴う必要がないことが理解される。例えば、単一のプールされたサンプルを、単一のサンプルについて図１１および図１２と類似する様式で本発明の教示に従って分析することができる。
（本発明の教示のいくつかの実施形態による例示的キット）
特定の実施形態において、本発明の教示はまた、特定の方法を行うことを促進させるために設計されたキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本発明の方法を行う際に使用される２つ以上の構成要素を組み立てることによって目的とする方法の実施を促進させるために役立つ。いくつかの実施形態において、キットは、エンドユーザーによる測定の必要性を最小限にするために、構成要素を事前に測定された単位量で含有し得る。いくつかの実施形態において、キットは、本発明の教示の１つまたは複数の方法を行うための説明書を備え得る。特定の実施形態において、キットの構成要素は、互いに関連して機能するために最適化される。
特定の実施形態において、サンプルにおける少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを検出するためのキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、（ａ）標的特異的部分および５’側のアドレス可能なプライマー部分を含む少なくとも１つの第１のプローブと、（ｂ）標的特異的部分および３’側のプライマー特異的部分を含む少なくとも１つの第２のプローブとを含む、それぞれの標的ポリヌクレオチドについて１組のライゲーションプローブを含む。それぞれの組におけるプローブは、相補的な標的ポリヌクレオチドにおいて互い隣接してハイブリダイズしたとき、一緒になるようにライゲーションするために好適である。それぞれのプローブ組における１つのプローブはさらに、アドレス可能なプライマー部分と標的特異的部分との間に位置する同定部分を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットはさらに、同定部分の配列を含むか、または、同定部分の配列に対して相補的な配列を含む少なくとも１つの標識化プローブを含む。
いくつかの実施形態において、キットは、相補的な配列にハイブリダイズしていないときに第１の検出可能なシグナル値を有する標識化プローブを含み、標識されたプローブの第２の検出可能なシグナル値を増幅反応の期間中および増幅反応の後の少なくとも１つで検出することができる。いくつかの実施形態において、第１の検出可能なシグナル値と、第２の検出可能なシグナル値との間での閾値の差により、標的ポリヌクレオチドの存在が示され、また、第１の検出可能なシグナル値と、第２の検出可能なシグナル値との間での閾値の差がないことにより、標的ポリヌクレオチドの非存在が示される。
いくつかの実施形態において、キットはさらに、第２の反応容器に取り付けられたアドレスプライマーを含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、（ｉ）少なくとも１つの第１のプローブの５’側のアドレス可能なプライマー部分の配列を含む少なくとも１つの第１のプライマーと、（ｉｉ）少なくとも１つの第２のプローブの３’側のアドレス可能なプライマー部分の配列に対して相補的な配列を含む少なくとも１つの第２のプライマーとを含む少なくとも１つのアドレスプライマー組を含む。
デコード反応容器が３８４ウエルマイクロプレートを含み、かつ、適用が単一のサンプルのＳＮＰ遺伝子座分析を含むいくつかの実施形態では、アドレスプライマーを各ウエルにおいて提供することができ、この場合、例えば、２つのアドレスプライマーがＳＮＰ遺伝子座あたり用いられ、それにより、３８４個のアドレスプライマー組（合計で７６８個のアドレスプライマーについて）をもたらす。
デコード反応容器が３８４ウエルマイクロプレートを含み、かつ、適用が単一のサンプルのＳＮＰ遺伝子座分析を含むいくつかの実施形態では、アドレスプライマーを各ウエルにおいて提供することができ、この場合、例えば、１つのアドレスプライマーが、単一のサンプルのＳＮＰ遺伝子座分析を含む適用のためにＳＮＰ遺伝子座あたり用いられ、それにより、３８４個のアドレスプライマー（合計で３８４個のアドレスプライマーについて）をもたらす。
デコード反応容器が３８４ウエルマイクロプレートを含み、かつ、適用が単一のサンプルのＳＮＰ遺伝子座分析を含むいくつかの実施形態では、異なったアドレスプライマーを横の列に沿って各ウエルにおいて提供することができ、それにより、２４個の特有の「横列」プライマーをもたらす。さらに、異なったアドレスプライマーを縦の列に沿って各ウエルにおいて提供することができ、それにより、１６個の特有の「縦列」プライマーをもたらす。この分野におけるそのような実施形態はＮＸＭスキームと呼ばれる。いくつかのそのような実施形態において、２つのアドレスプライマーがＳＮＰ遺伝子座あたり用いられ、それにより、３８４個のアドレスプライマー組（合計で４０個のアドレスプライマーについて）をもたらす。いくつかのさらなる非限定的なキット構成については、例えば、図１７を参照のこと。これらの構成および他の構成が、他の反応容器を用いて、例えば、９６ウエルマイクロタイタープレート、ならびに、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ（以前ではＭｉｃｒｏｃａｒｄ）を用いて同様に可能であることが理解される。
特定の実施形態において、キットは１つまたは複数のさらなる構成要素を含み、そのような構成要素には、限定されないが、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つの転写酵素、少なくとも１つのライゲーション因子、少なくとも１つのキナーゼ、少なくとも１つのウラシルＮ−グリコシラーゼ、オリゴヌクレオチド三リン酸、ヌクレオチドアナログ、反応緩衝液、塩、イオンおよび安定化剤の少なくとも１つが含まれる。特定の実施形態において、キットは、ライゲーション生成物を精製するための１つまたは複数の試薬を含み、そのような試薬には、限定されないが、少なくとも１つの透析膜、クロマトグラフィー化合物、支持体、ヌクレアーゼおよびオリゴヌクレオチドが含まれる。
いくつかの実施形態において、様々なキット構成が、例えば、ユニバーサルなループ状リンカー組成物を含むＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＮＰｌｅｘＴＭ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｇｕｉｄｅに従うように意図される。
（本発明の教示のいくつかのさらなる実施形態）
いくつかの実施形態において、目的とするｃＤＮＡはさらにＳＮＰを含むことができる。いくつかのそのような実施形態において、少なくとも１つのコード化反応におけるプローブは、所定の遺伝子の発現した対立遺伝子改変体を識別するような様式で設計することができる。いくつかのそのような実施形態において、少なくとも１つのコード化反応におけるプローブは、所定の遺伝子の発現した対立遺伝子改変体を識別しないような様式で、ユニバーサルなヌクレオチドを用いて設計することができる。
いくつかの実施形態において、識別用ヌクレオチドはＬＮＡである。いくつかの実施形態において、識別用ＬＮＡヌクレオチドはプローブの３’末端部分に位置する。
いくつかの実施形態において、コード化反応のプローブは、望ましくないＳＮＰを隠すためにユニバーサルな塩基を含むことができる（Ｌｏａｋｅｓ，Ｎ．Ａ．Ｒ，２９：１２：２４３７−２４４７，および米国特許出願第１０／９８２６１９号（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、デコード反応は増幅反応であるが、ＰＣＲではない。他の例示的な増幅手法については、上記を参照のこと。
いくつかの実施形態において、コード化反応はライゲーション反応でなく、また、コード化反応はＰＣＲでもなく、しかし、アドレス可能なプライマー部分、同定部分、または、アドレス可能なプライマー部分および同定部分を含む（上記で記載されたような）他の種類の増幅反応であり得る。
いくつかの実施形態において、コード化反応は、この分野では知られているように、例えば、米国特許第５，８７１，９２１号において知られているように、単一のオリゴヌクレオチドを自身にライゲーションすることを含み、この場合、ライゲーションされた環状体（ｃｉｒｃｌｅ）は切れ目を有し得、増幅することができる。アドレス可能なプライマー部分を単一のオリゴヌクレオチドに導入することができ、それにより、本発明の教示に従ったＰＣＲデコード化を可能にする。いくつかの実施形態において、単一のアドレス可能なプライマー部分を、ライゲーションしたときに環状体がローリングサークル機構で自身を複製し得るオリゴヌクレオチドに含むことができる。
いくつかの実施形態において、サンプルにおける１つの標的ポリヌクレオチドが調べられる。いくつかの実施形態では、サンプルにおける１個〜４８個の標的ポリヌクレオチドが調べられる。いくつかの実施形態では、４９個〜９６個の標的ポリヌクレオチドが調べられる。いくつかの実施形態では、９６個〜１９２個の標的ポリヌクレオチドが調べられる。いくつかの実施形態では、１９３個〜３８４個の標的ポリヌクレオチドが調べられる。いくつかの実施形態では、３８５個〜７６８個の標的ポリヌクレオチドが調べられる。いくつかの実施形態では、７６９個〜１５３６個の標的ポリヌクレオチドが調べられる。いくつかの実施形態では、１５３６個を超える標的ポリヌクレオチドが調べられる。上記範囲が、単一のサンプルに存在する標的ポリヌクレオチド、少なくとも２つのサンプルに存在する標的ポリヌクレオチド、および、少なくとも２つのサンプルに存在する標的ポリヌクレオチドで、少なくとも２つのサンプルのうちの少なくとも１つが、プールされたサンプルを含む場合の標的ポリヌクレオチドのいずれにも対応することが理解される。標的ポリヌクレオチドの前記範囲は、標的の発現した遺伝子、標的ＳＮＰ遺伝子座、標的遺伝子のコピー数、標的のメチル化ゲノム領域のいずれにも対応し、また、一般には、標的ポリヌクレオチドの性質は本発明の教示の限定でないこともまた理解される。
本発明の教示のいくつかの実施形態においては、少なくとも１つのＳＮＰ遺伝子座を、少なくとも１つのＰＣＲコード化反応、その後、少なくとも１つのＰＣＲデコード反応を用いて調べることができる。ＰＣＲコード化反応により、単一のＳＮＰ遺伝子座を増幅することができ、また、同様に、２つ以上のＳＮＰ遺伝子座をおそらくは増幅することができることが理解される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのコード化ＰＣＲで増幅された２つ以上のＳＮＰ遺伝子座を続いて、少なくとも２つのデコード増幅反応において調べることができる。
コード化ＰＣＲを含むいくつかの実施形態において（ＳＮＰ遺伝子座の場合において、同様に発現遺伝子などの場合についても）、コード化ＰＣＲは２回〜５回のサイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、コード化ＰＣＲは６回〜１０回のサイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、コード化ＰＣＲは１１回〜１５回のサイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、コード化ＰＣＲは１６回〜２０回のサイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、コード化ＰＣＲは１１回〜２０回のサイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、コード化ＰＣＲは２０回を超えるサイクルを含むことができる。
本発明の教示の範囲において意図される、コード化ＰＣＲ増幅を行うための様々な教示が、例えば、米国特許第６，６０５，４５１号（Ｘｔｒａｎａ）および米国特許出願第１０／７２３，５２０号（Ａｎｄｅｒｓｅｎら）に見出され得る。例えば、多重化されたＰＣＲコード化反応を行うことができ（「予備増幅反応」）、この場合、反応部分が枯渇し、また、プラトー効果が生じる前に反応を終わらせることができる。いくつかの実施形態においては、そのような予備増幅反応において存在するプライマーは、標的特異的部分、アドレス可能なプライマー部分、および同定部分を含むことができ、続いて、複数の下流側デコード反応を用いることができ、この場合、それぞれのデコード反応がアドレスプライマーおよび標識化プローブを含む。いくつかの実施形態において、そのような予備増幅反応において存在するプライマーは標的特異的部分のみを含むことができ、アドレス可能なプライマー部分または同定部分を含まない場合がある。続いて、上記で教示されるように、コード化ライゲーション反応を予備増幅反応の生成物に対して行うことができ、それにより、アドレス可能なプライマー部分および同定部分が導入され得るコード化反応を提供することができる。その後、デコード反応を本発明の教示の方法に従って行うことができる。
コード化ＰＣＲを含むいくつかの実施形態において、様々な非同調的戦略および非対称的戦略を、所望するシグナルを生じさせるために用いることができる（例えば、係属中のＰＣＴ国際特許出願ＵＳ０３／２９６９３における議論を参照のこと）。
コード化ＰＣＲを含むいくつかの実施形態において（ＳＮＰ遺伝子座の場合において、同様に発現遺伝子などの場合についても）、アドレス可能なプライマー部分は、少なくとも１つのデコード反応における２つのアドレスプライマーの最終的な使用をもたらし得る。コード化ＰＣＲを含むいくつかの実施形態において、アドレス可能なプライマー部分は、少なくとも１つのデコード反応における単一のアドレスプライマーの最終的な使用をもたらし得る。コード化ライゲーション反応を含むいくつかの実施形態において（ＳＮＰ遺伝子座の場合において、同様に発現遺伝子などの場合についても）、アドレス可能なプライマー部分は、少なくとも１つのデコード反応における２つのアドレスプライマーの最終的な使用をもたらし得る。コード化ライゲーション反応を含むいくつかの実施形態において、アドレス可能なプライマー部分は、少なくとも１つのデコード反応における単一のアドレスプライマーの最終的な使用をもたらし得る。様々なプライマー構成に関するさらなる情報については、キットのところでの記載、ならびに、図１７を参照のこと。
プライマーおよびプローブの設計ソフトウエアプログラムもまた市販されていることが理解される；例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ａｎｄ Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ４，Ｓｃｉ−Ｅｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ；Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ，ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｏｌｉｇｏ ｓｏｆｔｗｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ；ｉＯｌｉｇｏ，Ｃａｅｓａｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ；およびＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ（ワールドワイドウエブでｒｅａｌｔｉｍｅｐｒｉｍｅｒｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔ．ｓｔまたはｍｅｄｇｅｎ３１．ｕｒｇｅｎｔ．ｂｅ／ｐｒｉｍｅｒｄａｔａｂａｓｅ／ｉｎｄｅｘにおいて）。Ｐａｔｔｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：１２２−２３（２００３）もまた参照のこと。
当業者は、開示されたプローブ配列、標的配列およびプライマー配列またはそれらの組合せの相補体が本発明の教示のいくつかの実施形態において用いられ得ることを理解する。例えば、限定ではないが、ゲノムＤＮＡサンプルは標的配列およびその相補体の両方を含むことができる。従って、いくつかの実施形態において、ゲノムサンプルが変性させられるとき、標的配列およびその相補体の両方が一本鎖配列としてサンプルに存在する。いくつかの実施形態においては、ライゲーションプローブを、適切な配列（標的配列およびその相補体のいずれか）に特異的にハイブリダイゼーションするように設計することができる。
いくつかの実施形態において、副溝結合因子を少なくとも１つ標識化プローブに取り付けることができる。いくつかの例示的な副溝結合因子、および、副溝結合因子をオリゴヌクレオチドに結合するためのいくつかの例示的な方法が、例えば、米国特許第５，８０１，１５５号および同第６，０８４，１０２号で議論されている。いくつかの例示的な副溝結合因子は、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎから入手可能である副溝結合因子である。
いくつかの実施形態において、少なくとも２つのコード化反応の少なくとも２つの同定部分は２個の核酸塩基により異なる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのコード化反応の少なくとも２つの同定部分は１個の核酸塩基により異なる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのコード化反応の少なくとも２つの同定部分は３個の核酸塩基により異なる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのコード化反応の少なくとも２つの同定部分は、３個を超える核酸塩基により異なる。
いくつかの実施形態において、連結に対するＦＥＮ−ＬＣＲアプローチを用いることができる（例えば、米国特許第６，５１１，８１０号を参照のこと）。いくつかの実施形態において、同定部分を、Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼによって、または、切断活性を含む他の因子によって切断することができる。その後、切断された同定部分の検出により、標的ポリヌクレオチドを同定することができる。例えば、アドレス可能なプライマー部分を同定部分に（例えば、５’末端および３’末端において）含めることができ、そして、取り込まれたアドレス可能なプライマー部分に対応するアドレスプライマーを含む少なくとも１つのデコード反応を行うことができる。いくつかの実施形態において、切断された同定部分は、その末端におけるアドレス可能なプライマー部分と、アドレス可能なプライマー部分の間に位置する内側の同定部分とを含むことができる。デコード反応は、同定部分に対して相補的な対応する標識化プローブ、または、同定部分の相補体に対して相補的な対応する標識化プローブを含むことができ、それにより、標的ポリヌクレオチド配列の検出を可能にする。
いくつかの実施形態において、本発明の教示は、事前に満たされたデバイスを提供し、この場合、例えば、デバイスの各ウエルが特定のアドレスプライマーまたはアドレスプライマー組を含むことができる。例えば、事前にスポットされた９６ウエルディッシュは、ウエル１がアドレスプライマーＡおよびアドレスプライマーＢを含み、ウエル２がアドレスプライマーＣおよびアドレスプライマーＤを含み、ウエル３がアドレスプライマーＥおよびアドレスプライマーＦを含む９６個のウエルを含むことができる。そのようなデバイスには、様々なサイズおよび形状のマイクロタイタープレート、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｍｉｃｒｏｃａｒｄ）、ならびに、この分野で一般に認められている他のデバイスおよび固体支持体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、事前に満たされたデバイスはさらに、少なくとも１つの標識化プローブを含むことができる。
いくつかの実施形態において、例えば、係属中のＰＣＴ国際特許出願ＵＳ０３／２９８６７に記載されるように、プローブのライブラリーをコード化反応において用いることができる。いくつかの実施形態において、プローブを、例えば、係属中のＰＣＴ国際特許出願ＵＳ０３／２９８６７に記載されるように、発現遺伝子の特定のスプライス改変体を調べるために設計することができる。いくつかの実施形態において、プローブは、例えば、係属中のＰＣＴ国際特許出願ＵＳ０３／２９８６７に記載されるように、同定部分を第１のプローブおよび第２のプローブの両方に含むことができる。
いくつかの実施形態において、所定の標的ポリヌクレオチドＸをアドレス可能なプライマー部分Ａおよびアドレス可能なプライマー部分Ｂによりコード化することができ、その一方で、所定の標的ポリヌクレオチドＹをアドレス可能なプライマー部分Ｃおよびアドレス可能なプライマー部分Ｄによりコード化することができる。標的ポリヌクレオチドはアドレス可能なプライマー部分の完全に特定の１組によりコード化される必要がないことが理解される。例えば、所定の標的ポリヌクレオチドＸをアドレス可能なプライマー部分Ａおよびアドレス可能なプライマー部分Ｂによりコード化することができ、その一方で、所定の標的ポリヌクレオチドＹをアドレス可能なプライマー部分Ａおよびアドレス可能なプライマー部分Ｃによりコード化することができる。本発明の教示により企図される様々なプライマー構成に関するいくつかのさらなる教示については図１７もまた参照のこと。
本発明の教示のいくつかの実施形態において、複雑な不均一反応混合物における希な、数の少ない標的ポリヌクレオチドを、例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９８０３６７３Ａ１で議論されるように、ライゲーションコード化反応を用いて検出することができる。
図１８Ａ〜図１８Ｋに示される本発明の教示のいくつかの実施形態において、複数のアレイからなるアレイが用いられ、それにより、スポッティング効率における増大を可能にし、かつ、限定されたサンプルの予備増幅を行うこともまた可能にしている。
例えば、限定されたｃＤＮＡサンプルを分割して（分けて）３０，０００個のウエルに入れるために、ｃＤＮＡの総量は、各遺伝子について、３００，０００コピー未満、または、ウエルあたり１０コピー未満である。
図１８Ａにおいて、特定のプローブ（ｚＴＳＯ）を、特有のジップコードをそれぞれが含有し得る１００個のｐｚＴＳＯオリゴのいずれかに連結することができる。ｚＴＳＯプローブは、ユニバーサルな順方向プライマーと、ジップコードされた配列と、特異的な６ｍｅｒと、Ｔｍおよびリガーゼフットプリントの要件を満たすいくつかのランダムな塩基（Ｎとして示される）とを含む。ｐｚＴＳＯは、５’末端におけるリン酸基、ランダムな塩基が続く特異的な６ｍｅｒ、ジップコードされた逆方向プライマー、および、ユニバーサルな逆方向プライマー配列を有する。２つのｚＴＳＯおよびｐｚＴＳＯのオリゴがｃＤＮＡ配列と一致するとき、リガーゼは、それらが一緒になるようにそれらを連結することができる。ユニバーサルな順方向プライマー（ＵＦ）およびユニバーサルな逆方向プライマー（ＵＲ）により、連結されたテンプレートが増幅される。いくつかの実施形態においては、サイクルが、サンプルにおける各遺伝子の相対的な比率を維持するために、１５回以下のＰＣＲサイクルに制限される。それぞれの予備増幅反応は、異なるｚＴＳＯを除いて、同じ１００個のｐｚＴＳＯオリゴを有し得る。３８４ウエルプレートについて、３８，４００個の可能な組合せが存在する。
バイオインフォマティクス法（この分野での妥当な能力の範囲内で、ヒトをはじめとする様々なゲノムの、公開されて入手可能な配列が得られる）により、どの遺伝子がどの６ｍｅｒの組合せによって検出されるかを事前に明らかにすることができる。統計学的には、組合せのいくつかはどの遺伝子にも対応せず、また、組合せのいくつかが多数の遺伝子を標的とし得る。ゲノム全体を単一のカードで１００％取り扱うことはできず、しかし、他の３８４プレートを異なる組のｚＴＳＯにより処理することによって、最終的には３０，０００個の遺伝子のすべてが一意的に決定される。このショットガン法は、ゲノム全体を取り扱うために要求される特有のオリゴの数を大きく減少させる。
図１８Ｂは、ユニバーサルなＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイがどのように機能し得るかを示す。１色型形態および多色型形態の両方のユニバーサルなＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイが存在し得る。最初の１００−ｐｌｅｘのＯＬＡ−ＰＣＲの生成物を分割し、ユニバーサルな順方向プライマー、ユニバーサルなジップコードされたプローブ、および特異的なジップコードされた逆方向プライマーと混合することができる。特異的なジップコードされた逆方向プライマーは、１００−ｐｌｅｘの反応に由来する１００個の生成物のうちの１つを伸張させることができるだけである。それぞれのユニバーサルなＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、ｐｚＴＳＯに対して相補的である特有のジップコードされた逆方向プライマーを有することができる。多色型形態のユニバーサルなＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは多数のユニバーサルなジップコードされたプローブを有する。単一のｚＴＳＯを第１のｍｕｌｔｉ−ｐｌｅｘにおいて使用する代わりに、特有のジップコードを有する４つのｚＴＳＯを使用することができる。これは、４つの色を伴う４つの一意的にジップコードされたプローブが使用されることを可能にする。
あるいは、図１８Ｃにおいて、６ｍｅｒのｚＴＳＯおよびｐｚＴＳＯを特定のオリゴによって置き換えることができる。この場合、１００個の一致した組のオリゴが３８４ウエルプレートの各ウエルに置かれる。ｚＴＳＯプローブは、ユニバーサルな順方向プライマー、ジップコードされた配列、および、遺伝子特異的領域を含むことができる。ｐｚＴＳＯは、５’末端におけるリン酸基、および、ジップコードされた逆方向プライマーが続く遺伝子特異的領域、ならびにユニバーサルな逆方向プライマー配列を有する。再度ではあるが、２つのｚＴＳＯおよびｐｚＴＳＯがｃＤＮＡ配列と一致するとき、リガーゼは、それらが一緒になるようにそれらを連結することができる。ユニバーサルな順方向プライマー（ＵＦ）およびユニバーサルな逆方向プライマー（ＵＲ）により、連結されたテンプレートを増幅することができる。下流側のすべてのものがこの場合、同じである。ゲノム全体を単一のカードで取り扱うことができ、しかし、６０，０００個の特有のオリゴが必要であると考えられる。
特異的なｍｕｌｔｉ−ｐｌｅｘ ＯＬＡ−ＰＣＲからの生成物を分割し、図１８Ｄに示されるような単一の特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイと混合することができる。単一のプローブのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、ユニバーサルなジップコードされたプローブ、ユニバーサルな順方向プライマー、および、特異的なジップコードされた逆方向プライマーを有することができる。特異的なジップコードされた逆方向プライマーにより、相補的なジップ配列を有するＯＬＡ−ＰＣＲの生成物のみを伸張させることができる。相補的な鎖が伸張したとき、プローブを切り離すことができる。ユニバーサルな順方向プライマーが反応に存在し得るので、ＯＬＡ−ＰＣＲからのそれ以外の９９個の生成物が直線的に増幅される。とりわけ、あるいは、バックグラウンド上昇のために、特異的なジップコードされたプローブを加えることができる。各ｚＴＳＯについて単一のジップコードを有するのではなく、特有のジップコードを各ｚＴＳＯについて存在させることができる。これは、特異的なジップコードされたプローブが使用されることを可能にする。この場合、ＯＬＡ−ＰＣＲのそれ以外の９９個の生成物が依然として直線的に増幅され得るが、しかし、プローブの切断がほとんどないと考えられる。これは、さらなる特異性をアッセイに与える。ユニバーサルなジップコードされたプローブのこの考え方は、必要なプローブの量を１００から１に低下させる。
図１８Ｅに示される別の代替的なアッセイはＰＣＲのみに依拠し得る。この場合、ＯＬＡプローブが、特異的な順方向プライマーおよび逆方向プライマーにより置き換えられる。順方向プライマーは、ジップコードされたプローブ領域と、ユニバーサルな順方向プライマー配列とを含有するテールを有する。逆方向プライマーは、ジップコードされた逆方向プライマー配列を含有するテールを有する。これら２つのプライマーは、特異性を増大させるために、高いＴｍについて設計することができる。また、これらのプライマーは低い濃度（約５ｎＭ〜５０ｎＭ）で使用することができる。１００−ｐｌｅｘのＰＣＲ反応を、遺伝子の相対的な比率を保つために１５回未満のサイクルにわたって行うことができる。
図１８ＥにおけるＰＣＲ反応からの生成物を、この場合、１００個のウエルの中で分割することができる。図１８Ｅに示されるような各ウエルは、ユニバーサルな順方向プライマー、ジップコードされたプローブ、および、ジップコードされた逆方向プライマーを含有する。特異的なジップコードされた逆方向プライマーにより、相補的なジップコードされた配列を有する第１のＰＣＲ反応の生成物のみを伸張させることができる。以前に示されたように、ユニバーサルなプローブまたは特有のジップコードされたプローブを使用することができる。
次に、複数のアレイからなるアレイの概念のいくつかの考えられ得る実行が記載される。図１８Ｆに示されるマイクロカードは、４８の異なるアッセイを有することができる８個のポートを有する。４８個のウエルのそれぞれにおいて、ユニバーサルな順方向プライマー、ジップコードされたプローブ、および、ジップコードされた逆方向プライマーの混合物を負荷することができる。以前に記載されたように、それぞれのウエルについて１個〜４個のユニバーサルなジップコードされたプローブまたは特有のジップコードされたプローブが存在し得る。使用者は８つの４８−ｐｌｅｘのＯＬＡ−ＰＣＲ反応を操作することができる。８つのＯＬＡ−ＰＣＲ反応の生成物をマイクロカードの８個のポートに負荷することができる。その後、カードを密封し、サイクル処理することができる。
あるいは、図１８Ｇに示されるような高密度カードを使用することができる。この場合、６４個の横列および９６個の縦列を有するカードに、ユニバーサルな順方向プライマー、ジップコードされたプローブ、および、ジップコードされた逆方向プライマーから構成される９６個のＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイをスポットすることができる。この同じパターンの９６個のアッセイが６４個のすべての横列について繰り返される。再度ではあるが、プローブはユニバーサルなジップコードまたは特異的なジップコードを有することができる。使用者は６４の９６−ｐｌｅｘのＯＬＡ−ＰＣＲ反応を操作する。６４のＯＬＡ−ＰＣＲ反応の各生成物がそれぞれの横列において９６個のウエルの中で分割される。プレートを密封し、サイクル処理することができる。
いくつかの実施形態において、２５個のウエルからなるアレイが３８４ウエルプレートの各ウエルの内側に存在する。２５個のウエルのそれぞれにおいて、ユニバーサルな順方向プライマー、ジップコードされたプローブ、および、ジップコードされた逆方向プライマーの混合物がスポットされる。３８４のＯＬＡ−ＰＣＲ反応のそれぞれの生成物が３８４個のウエルのそれぞれに加えられる。小さい刻み目がウエルの内側の２５個のウエルの上部に存在する。このような刻み目はすべてのウエルの等しい充填を容易にする。オイルの薄い層が３８４個のウエルのそれぞれに加えられる。再度ではあるが、これは、熱サイクル処理期間中の蒸発を防止することを助けることができる。
図１８Ａに示されるアッセイにおいて、３８４ウエルプレートは特有のｚＴＳＯを各ウエルに有することができる。サンプルおよびマスターミックスを３８４ウエルプレートの各ウエルに負荷することができる。このマスターミックスは、リガーゼ、リガーゼ緩衝液、および、１００個のｐｚＴＳＯからなる共通する１組を含むことができる。各ウエルは、１００個の特有の１２ｍｅｒの組合せを有することができ、それぞれの３８４ウエルプレートは３８，４００個の特有の１２ｍｅｒを有することができる。４０９６個の可能なｚＴＳＯが存在する。従って、１１枚の３８４ウエルプレートが操作されるならば、４０９，６００の特有のアッセイが行われる。４つの特有のｚＴＳＯを３８４プレートの各ウエルに置くことができる。１２ｍｅｒの４００個の特有の組合せが各ウエルに存在し、従って、それぞれの３８４ウエルプレートは１５３，６００の特有のアッセイを有する。すべての可能な組合せがこの構成では３枚のプレートで取り扱われる。
いくつかの実施形態において、本発明の教示では、例えば、図１８Ｉ、図１８Ｊおよび図１８Ｋに示されるように、ユニバーサルな核酸塩基が用いられる、ＦＥＮ−ＬＣＲに基づく方法が意図される。ＦＥＮが媒介するライゲーションアプローチが米国特許第６，５１１，８１０号（Ｂｉら）においてより詳しく議論されている。
本発明の教示がこれらの例示的な実施形態に関して記載されているが、当業者は、これらの例示的な実施形態の無数の変化および改変が、過度な実験を行うことなく可能であることを容易に理解する。そのような変化および改変のすべてが本教示の範囲内である。
図１は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図２は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図３は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図３は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図４は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従ったフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図４は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従ったフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図５は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従ったフローチャートを示す。 図６は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図６は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図６は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図６は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図７は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従ったフローチャートを示す。 図８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従ったフローチャートを示す。 図９は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従ったフローチャートを示す。 図１０は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従ったフローチャートを示す。 図１１は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１１は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１２は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１２は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１３は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１３は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１４は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１４は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１５は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従ったフローチャートを示す。 図１６は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従ったフローチャートを示す。 図１７は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のプライマー構成を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。 図１８は、本発明の教示のいくつかの実施形態に従った特定のフローチャートならびに特定の組成物および反応相互作用を示す。

Claims (15)

  1. 標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較するための方法であって、該方法は、
    第１の反応容器１および第１の反応容器２を提供する工程であって、
    ここで該第１の反応容器１は、第１のサンプルと順方向プライマーと逆方向プライマーとを含み、ここで該順方向プライマーは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、該逆方向プライマーは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、ここで該順方向プライマーまたは該逆方向プライマーは、第１の同定部分をさらに含み、
    ここで該第１の反応容器２は、第２のサンプルと順方向プライマーと逆方向プライマーとを含み、ここで該順方向プライマーは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、該逆方向プライマーは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含み、ここで該順方向プライマーまたは該逆方向プライマーは、第２の同定部分をさらに含む、工程；
    第１のコード化ＰＣＲを該第１の反応容器１において行い、それにより、第１のコード化ＰＣＲ生成物を含む第１のコード化ＰＣＲ生成物混合物を形成させる工程であって、ここで該第１のコード化ＰＣＲ生成物は、該順方向のアドレス可能なプライマー部分と、該第１の同定部分と、該標的特異的部分と、該逆方向のアドレス可能なプライマー部分とを含み、ここで標的ポリヌクレオチド配列の正体が、該順方向のアドレス可能なプライマー部分および該逆方向のアドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして該第１のコード化ＰＣＲにおけるサンプルの正体が、該第１の同定部分によってコード化される、工程；
    第２のコード化ＰＣＲを該第１の反応容器２において行い、それにより、第２のコード化ＰＣＲ生成物を含む第２のコード化ＰＣＲ生成物混合物を形成させる工程であって、ここで該第２のコード化ＰＣＲ生成物は、該順方向のアドレス可能なプライマー部分と、該第２の同定部分と、該標的特異的部分と、該逆方向のアドレス可能なプライマー部分とを含み、ここで該標的ポリヌクレオチド配列の正体は、該順方向のアドレス可能なプライマー部分および該逆方向のアドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして該第２のコード化ＰＣＲにおけるサンプルの正体は、該第２の同定部分によってコード化される、工程；
    該第１の反応容器１からの該第１のコード化ＰＣＲ生成物混合物を該第１の反応容器２からの該第２のコード化ＰＣＲ生成物混合物と合わせ、合わせたコード化ＰＣＲ生成物混合物を形成する工程；
    第２の反応容器を提供する工程であって、ここで該第２の反応容器は、順方向アドレスプライマー、逆方向アドレスプライマー、第１の標識化プローブおよび第２の標識化プローブを含み、ここで該第１の標識化プローブ１は、該第１の反応容器１からのコード化ＰＣＲ生成物の第１の同定部分に対して相補的であるか、または該第１の反応容器１からのコード化ＰＣＲ生成物の第１の同定部分の相補体に対して相補的であり、そして該第２の標識化プローブ１は、該第１の反応容器２からのコード化ＰＣＲ生成物の第２の同定部分に対して相補的であるか、または該第１の反応容器２からのコード化ＰＣＲ生成物の第２の同定部分の相補体に対して相補的である、工程；
    該合わされたコード化ＰＣＲ生成物混合物のアリコートを該第２の反応容器に加え、それにより、デコード増幅反応物を該第２の反応容器において形成する工程；
    デコード増幅反応を該第２の反応容器において行う工程であって、ここで該順方向アドレスプライマーは、該第１のコード化ＰＣＲおよび該第２のコード化ＰＣＲの間に該コード化ＰＣＲ生成物に導入された順方向のアドレス可能なプライマー部分の相補体にハイブリダイズし、ここで該逆方向アドレスプライマーは、該第１のコード化ＰＣＲおよび該第２のコード化ＰＣＲの間に該コード化ＰＣＲ生成物に導入された逆方向のアドレス可能なプライマー部分にハイブリダイズし、ここで該コード化ＰＣＲ生成物が該第１のコード化ＰＣＲに由来する場合、該コード化ＰＣＲ生成物の増幅は、該第１の標識化プローブからのシグナルを生じさせ、該コード化ＰＣＲ生成物が該第２のコード化ＰＣＲに由来する場合、該コード化ＰＣＲ生成物の増幅は、該第２の標識化プローブからのシグナルを生じさせる、工程；
    ２つのサンプルにおける標的ポリヌクレオチドを、該デコード反応における該第１の標識化プローブおよび該第２の標識化プローブからのシグナルの存在および量に基づいて検出および定量する工程；ならびに
    該標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較する工程
    を包含する、方法。
  2. 複数の標的ポリヌクレオチド配列が２つのサンプルの間で比較される、請求項１に記載の方法であって、該方法は、
    該複数の標的ポリヌクレオチド配列について特異的である、第１のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマー；
    該複数の標的ポリヌクレオチド配列について特異的である、第２のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマー；
    ここで該第１のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分と、異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、同じ第１の同定部分とを含み；
    ここで該第２のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分と、異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、同じ第２の同定部分とを含み；
    ここで該異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分および異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分は、該２つのサンプルの間で所定の標的ポリヌクレオチドについて同じである、プライマーを含み、
    複数のデコード増幅反応を複数の第２の反応容器において行う工程；
    それぞれのデコード反応における第１の標識化プローブおよび第２の標識化プローブからのシグナルの存在および量に基づいて該２つのサンプルにおける複数の標的ポリヌクレオチドを検出および定量する工程；ならびに
    複数の標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較する工程
    をさらに包含する、方法。
  3. 前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方が、ＰＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方が、５’ヌクレアーゼ切断可能なプローブを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記標的ポリヌクレオチド配列が、メッセンジャーＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  6. 標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較するための方法であって、該方法は、
    第１のコード化反応を標的ポリヌクレオチド配列に対して行って、第１のコード化反応生成物を形成させる工程であって、ここで該標的ポリヌクレオチド配列の正体は、アドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして該サンプルの正体は、第１の同定部分によりコード化される、工程；
    第２のコード化反応を標的ポリヌクレオチドに対して行って、第２のコード化反応生成物を形成させる工程であって、ここで該標的ポリヌクレオチド配列の正体は、アドレス可能なプライマー部分によりコード化され、そして該サンプルの正体は、第２の同定部分によりコード化される、工程；
    該第１のコード化反応生成物を該第２のコード化反応生成物と合わせる工程；
    デコード増幅反応を行う工程であって、ここで該デコード増幅反応は、第１の標識化プローブおよび第２の標識化プローブを含むＰＣＲを含み、ここで第１の標識化プローブは、該第１の同定部分に対して相補的であるか、または該第１の同定部分の相補体に対して相補的であり、そして第２の標識化プローブは、該第２の同定部分に対して相補的であるか、または該第２の同定部分の相補体に対して相補的である、工程；ならびに
    該標的ポリヌクレオチド配列の量を該２つのサンプルの間で比較する工程
    を包含する、方法。
  7. 前記第１のコード化反応がＰＣＲであり、そして前記第２のコード化反応がＰＣＲである、請求項６に記載の方法。
  8. 複数の標的ポリヌクレオチド配列が２つのサンプルの間で比較される、請求項７に記載の方法であって、該方法は、
    該複数の標的ポリヌクレオチド配列について特異的である、第１のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマー；
    該複数の標的ポリヌクレオチド配列について特異的である、第２のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマー；
    ここで該第１のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分と、異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、同じ第１の同定部分とを含み；
    ここで該第２のコード化ＰＣＲにおける複数の異なる順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分と、異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分と、同じ第２の同定部分とを含み；
    ここで該異なった順方向のアドレス可能なプライマー部分および異なった逆方向のアドレス可能なプライマー部分は、該２つのサンプルの間で所定の標的ポリヌクレオチドについて同じである、プライマーを含み、
    複数のデコード増幅反応を複数の第２の反応容器において行う工程；
    それぞれのデコード反応における第１の標識化プローブおよび第２の標識化プローブからのシグナルの存在および量に基づいて該２つのサンプルにおける複数の標的ポリヌクレオチドを検出および定量する工程；ならびに
    複数の標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較する工程
    をさらに包含する、方法。
  9. 前記第１のコード化反応がライゲーション反応であり、そして前記第２のコード化反応がライゲーション反応である、請求項６に記載の方法。
  10. 前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方がＰＮＡを含む、請求項６に記載の方法。
  11. 前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方が５’ヌクレアーゼ切断可能である、請求項６に記載の方法。
  12. 前記標的ポリヌクレオチド配列がメッセンジャーＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
  13. 標的ポリヌクレオチド配列の量を２つのサンプルの間で比較するためのキットであって、該キットは、
    順方向プライマーであって、該順方向プライマーは、標的特異的部分および順方向のアドレス可能なプライマー部分を含む、順方向プライマー；
    逆方向プライマーであって、該逆方向プライマーは、標的特異的部分および逆方向のアドレス可能なプライマー部分を含む、逆方向プライマー；
    ここで該順方向プライマー、該逆方向プライマー、または両方は同定部分をさらに含む；
    順方向アドレスプライマーと、逆方向アドレスプライマーと、標識化プローブとを含む反応容器であって、該標識化プローブは、該同定部分に対して相補的であるか、または該同定部分の相補体に対して相補的である、反応容器；ならびに
    ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むＰＣＲマスターミックス
    を含む、キット。
  14. 前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方がＰＮＡを含む、請求項１３に記載のキット。
  15. 前記第１の標識化プローブ、前記第２の標識化プローブ、または両方が５’ヌクレアーゼ切断可能である、請求項１３に記載のキット。
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