JP2007528850A - 副甲状腺ホルモンの検出のための方法、キット、および抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、哺乳動物サンプル中の生理学的レベルの全副甲状腺ホルモンおよび副甲状腺フラグメントの検出に有用な新規の方法および組成物に関する。このような検出は、被験体の疾患または障害（副甲状腺機能亢進症および関連骨疾患など）と正常または非疾患状態とを区別するのに有用であり得る。生体サンプル中の全または非断片化（１〜８４）副甲状腺ホルモンおよび任意選択的に副甲状腺ホルモンアンタゴニストとして機能しても機能しなくても良い１つまたは複数の非全副甲状腺ホルモンペプチドフラグメントの選択物が検出される。１つまたは複数の非全副甲状腺ホルモンペプチドフラグメントの選択物の値、全副甲状腺ホルモンの値、またはこれらの値の組み合わせの比較値または独立した使用により、副甲状腺ホルモンと骨関連疾患病態とを区別し、このような病態と正常な状態とを区別することができる。
Description
［Ｉ．関連出願の相互参照］
本出願は、現在特許許可されている1999年1月14日提出の米国特許出願第09/231,422号の一部係属出願である、現在特許許可されている1999年6月26日提出の米国特許出願第09/344,639号の一部係属出願である。
本出願は、現在特許許可されている1999年1月14日提出の米国特許出願第09/231,422号の一部係属出願である、現在特許許可されている1999年6月26日提出の米国特許出願第09/344,639号の一部係属出願である。
［ＩＩ．技術分野］
本発明は、被験体における副甲状腺疾患を区別するための新規の組成物、方法、およびキットに関する。これらの組成物、方法、およびキットを使用して、例えば、副甲状腺機能亢進症、高骨代謝回転、および無形成骨症(adynamic bone disease)と正常または非疾患状態とを区別することができる。
本発明は、被験体における副甲状腺疾患を区別するための新規の組成物、方法、およびキットに関する。これらの組成物、方法、およびキットを使用して、例えば、副甲状腺機能亢進症、高骨代謝回転、および無形成骨症(adynamic bone disease)と正常または非疾患状態とを区別することができる。
［ＩＩＩ．発明の背景］
カルシウムは、細胞透過性、骨および歯の形成、血液凝固、神経パルスの伝達、および正常な筋収縮で不可欠な役割を果たす。血中カルシウムイオン濃度は、カルシトールおよびカルシトニンと共に、主に副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）によって調節される。カルシウムの取り込みおよび排出は変化し得るにもかかわらず、ＰＴＨは、フィードバック機構を介して、細胞および周辺流動物中の安定なカルシウム濃度の維持に役割を果たす。血清カルシウムが低下する場合、副甲状腺はＰＴＨを分泌し、貯蔵カルシウムの放出に影響を与える。血清カルシウムが増加した場合、ＰＴＨ分泌の低下によって貯蔵カルシウムの放出が遅延する。
カルシウムは、細胞透過性、骨および歯の形成、血液凝固、神経パルスの伝達、および正常な筋収縮で不可欠な役割を果たす。血中カルシウムイオン濃度は、カルシトールおよびカルシトニンと共に、主に副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）によって調節される。カルシウムの取り込みおよび排出は変化し得るにもかかわらず、ＰＴＨは、フィードバック機構を介して、細胞および周辺流動物中の安定なカルシウム濃度の維持に役割を果たす。血清カルシウムが低下する場合、副甲状腺はＰＴＨを分泌し、貯蔵カルシウムの放出に影響を与える。血清カルシウムが増加した場合、ＰＴＨ分泌の低下によって貯蔵カルシウムの放出が遅延する。
図１に示すように、ヒトＰＴＨ（ｈＰＴＨ）の完全な形態は、固有の８４アミノ酸ペプチド（配列番号１）である。研究者によってタンパク質キナーゼＣ活性化ドメイン（アミノ酸残基２８〜３４）およびアデニル酸シクラーゼ活性化ドメイン（アミノ酸残基１〜７）を含むこのペプチドが骨に対する同化作用を有することが見出された。しかし、循環中に腺内または末梢代謝によって形成される可能性が最も高い短縮または断片化されたＰＴＨペプチドの種々の異化形態も見出された。例えば、全ＰＴＨを、アミノ酸３４〜３５との間で切断して（１〜３４）ＰＴＨのＮ末端フラグメントおよび（３５〜８４）ＰＴＨのＣ末端フラグメントを産生することができる。同様に、アミノ酸３６〜３７との間または３７〜３８との間で短縮が起こり得る。最近、ＰＴＨのＮ末端のより近くで短縮された「非（１〜８４）ＰＴＨ」と呼ばれる巨大なＰＴＨフラグメントが開示された(LePage,R.,et al.,Clin.Chem.44:805-810(1998)を参照のこと)。
ＰＴＨを正確に測定することが臨床的に必要であることは十分に証明されている。血清ＰＴＨレベルは、以下の疾患を罹患した患者の最も重要な指標の１つである。家族性高カルシウム血症；多発性内分泌腫瘍Ｉ型およびＩＩ型；骨粗鬆症；骨パジェット病；原発性副甲状腺亢進症（原発性過形成または副甲状腺腫によって発症）；偽性副甲状腺機能亢進症；および続発性副甲状腺機能亢進症に起因し得る腎不全。
ＰＴＨは、慢性腎不全患者における一連の疾患で役割を果たす。腎性骨形成異常症（ＲＯ）は、嚢胞性線維性骨炎（ＰＴＨ過剰に起因する）；骨軟化症−非鉱化骨基質（ビタミンＤ欠乏症に起因する）；骨外性石灰化／骨化（異常なカルシウムおよびリン代謝に起因する）、および無形成骨症（ＰＴＨ抑制に寄与する）を含む骨合併症である。慢性腎不全患者はＲＯを発症し得る。腎不全により血清中リンが増加し（高リン血症(hyperphosphoremia)）、腎臓による１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５−Ｄ）産生が減少する。前者により、胃腸のカルシウム吸収の減少に起因した続発性副甲状腺機能亢進症を発症し、血清中リンの増加に応答したＰＴＨの増加に起因した嚢胞性線維性骨炎を発症する。後者により、低カルシウム血症および骨軟化症を発症する。続発性副甲状腺機能亢進症が発症し始めると、そのカルシウムおよびビタミンＤ受容体の発現の減少のために副甲状腺はそのホルモンレギュレーターに対する応答が低くなる。血清カルシウムは低下する。ＲＯは、指の壊瘢、骨痛、骨折、および筋力低下を引き起こし得る。
ヒトにおける循環生物活性ＰＴＨレベルの決定は困難である。１つの主な問題は、ＰＴＨが低レベル（通常、１０ｐｇ／ｍＬ〜４０ｐｇ／ｍＬ（すなわち、１ｐｍｏｌ／Ｌ〜４ｐｍｏｌ／Ｌ））で見出されることである。非常に低い循環レベルと相まって、ＰＴＨが不均一であることおよび循環断片が多くなることが問題である。多くの場合、免疫アッセイは、循環ＰＴＨフラグメント由来の実質的および有意な障害に直面している。例えば、いくつかの市販されているＰＴＨキットは、非（１〜８４）ＰＴＨフラグメントとほぼ１００％交差反応性を示す。LePageの論文（前出）を参照のこと。
ＰＴＨ免疫アッセイは年月を重ねるにつれて変化している。１つの初期のアプローチは、Amold W.Lindall et aliaに付与された米国特許第4,369,138号で見出された二重抗体沈降免疫アッセイである。第１の抗体は、（６５〜８４）ＰＴＨフラグメントに対して高い親和性を有する。非標識ペプチドについて競合するために、放射性標識（６５〜８４）ＰＴＨペプチドを第１の抗体と共にサンプルに添加する。任意の第１の抗体および放射性標識ＰＴＨフラグメント複合体に結合する第２の抗体を添加し、それにより沈殿が形成される。沈殿および上清の放射能を測定することができ、これらからＰＴＨレベルを計算することができる。
ＰＴＨフラグメントの干渉を克服するために、Nichols Institute(San Juan Capistrano,California)のAllegro(登録商標)Intact PTHアッセイなどのインタクトなＰＴＨ（Ｉ−ＰＴＨ）についての免疫放射測定二部位アッセイ(immunoradiometric two-site assay)を導入した。一方では、捕捉抗体がｈＰＴＨのＣ末端部分に特異的に結合する一方で、標識された抗体は捕捉されたｈＰＴＨのＮ末端部分に特異的に結合する。他方では、共にｈＰＴＨのＮ末端に付着する２つのモノクローナル抗体を使用した。（本開示の目的のために、完全なヒトＰＴＨ形態を「全ＰＴＨ」または「ｗＰＴＨ」といい、ｗＰＴＨだけでなく、約アミノ酸５〜８で切断された巨大ＰＴＨフラグメントも含み得る「インタクトなＰＴＨ」または「Ｉ−ＰＴＨ」と区別する。）不運なことに、これらのアッセイは、測定するが、ｗ−ＰＴＨとＩ−ＰＴＨが区別されないという点で問題である。この不能さは有意な内因性巨大な非全ＰＨＴフラグメント濃度を有する副甲状腺機能亢進症患者および腎不全患者で顕著になる。
最近、研究者は、巨大Ｎ末端ＰＴＨフラグメントを対象とする特異的結合アッセイを行った。Gao,P.,et al.,Clinica Chimica Acta 245:39-59(1996)を参照のこと。この免疫化学発光測定アッセイは、Ｎ末端（１〜３４）ＰＴＨフラグメントだけでなく中間部分のＰＴＨフラグメントまたはＣ末端ＰＴＨフラグメントを検出するための２つのモノクローナル抗体を使用する。これらのアッセイのデザインにおける重要な要因は、Ｃ末端ＰＴＨフラグメントとのいかなる反応も排除することである。
それにも関わらず、特異的全ＰＴＨアッセイは、生理学的レベルで全ＰＴＨを測定することができない。例えば、Magerlein,M.,et al.,Drug Res.48:197-204(1998)を参照のこと。本発明は、これらのニーズおよび当分野の他のニーズを満たすことが意図される。
本発明に至る重要な発見は、無力性骨(adynamic bone)は、骨が機能停止するにつれてカルシウムおよびリン酸塩を格納する(buffer)能力を喪失することである。このような病態を罹患した被験体では、食事によって体内に侵入したカルシウムを有効に格納することができない。このカルシウムは血流に侵入し、その後軟組織を往復する。副甲状腺は、特に、このカルシウムの流入に支配されて劇的に影響を受け、それによってＰＴＨの活性形態よりもむしろ、またはそれに加えて、ＰＴＨフラグメントを産生する。したがって、無力性骨を有する被験体では、ＰＴＨフラグメントの濃度および産生が増加する。このことおよび他の関連する情報を考慮すると、特に全ＰＴＨの測定と組み合わせたＰＴＨフラグメントレベルの測定を使用して、無力性骨を有する被験体と正常な骨および高骨代謝回転率を有する被験体とを有効に区別することができる。
ＡＤＮ透析患者の過剰治療を回避するために、透析ＡＤＮ患者と高骨代謝回転を罹患した患者とを非浸襲性に分類することができる必要が非常にある。ＡＤＮ透析患者の過剰治療(over treatment)は、現在使用されている方法で現在最も頻繁に起こっている。例えば、Zemplar(登録商標)およびCalcijex(登録商標)(Abbott Laboratories)の使用を禁止する添付文書は、例えば、循環総ＰＴＨフラグメントレベルを把握してない禁止プロトコール下での過剰治療が非常に危険である何千もの透析患者を治療するために使用されている。本発明は、これらのニーズおよび当分野の他のニーズに取り組む。
［ＩＶ．発明の開示］
１つの実施形態では、本開示は、全副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のＮ末端配列に特異的に結合し、哺乳動物サンプル中の前記全ＰＴＨを生理学的レベルで検出することができる単離された抗体であって、前記単離抗体が非全ＰＴＨフラグメントへの結合を回避する単離抗体を提供する。頻繁に、単離抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。頻繁に、抗体と前記全ＰＴＨのＮ末端配列との間の結合は、ＰＴＨのアミノ酸残基２〜５または３〜６の存在にも依存する。
１つの実施形態では、本開示は、全副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のＮ末端配列に特異的に結合し、哺乳動物サンプル中の前記全ＰＴＨを生理学的レベルで検出することができる単離された抗体であって、前記単離抗体が非全ＰＴＨフラグメントへの結合を回避する単離抗体を提供する。頻繁に、単離抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。頻繁に、抗体と前記全ＰＴＨのＮ末端配列との間の結合は、ＰＴＨのアミノ酸残基２〜５または３〜６の存在にも依存する。
１つの態様では、本開示の単離抗体は、ＰＴＨ1〜6、ＰＴＨ1〜8、ＰＴＨ1〜9、ＰＴＨ1〜12、またはＰＴＨ3〜12に含まれるエピトープに特異的に結合する。頻繁に、本開示の単離抗体は、副甲状腺ホルモンペプチドであるＰＴＨ1〜15またはＰＴＨ1〜8に特異的に結合し、ペプチド配列中の少なくとも４つのアミノ酸が抗体との反応部分の一部である。時折、本開示の単離抗体は、ＰＴＨ1〜5、ＰＴＨ1〜7、ＰＴＨ1〜8、ＰＴＨ1〜10、ＰＴＨ1〜11、ＰＴＨ1〜13、ＰＴＨ1〜14、ＰＴＨ1〜15、ＰＴＨ1〜16、ＰＴＨ1〜17、ＰＴＨ1〜18、ＰＴＨ1〜19、ＰＴＨ1〜20、ＰＴＨ1〜21、ＰＴＨ1〜22、ＰＴＨ1〜23、ＰＴＨ1〜24、ＰＴＨ1〜25、ＰＴＨ1〜26、ｈＰＴＨ1〜27、ＰＴＨ1〜28、ＰＴＨ1〜29、ＰＴＨ1〜30、ＰＴＨ1〜31、ＰＴＨ1〜32、ＰＴＨ1〜33、ＰＴＨ1〜34、ＰＴＨ1〜35、ＰＴＨ1〜36、ＰＴＨ1〜37、ＰＴＨ2〜5、ＰＴＨ2〜6、ＰＴＨ2〜7、ＰＴＨ2〜8、ＰＴＨ2〜9、ＰＴＨ2〜10、ＰＴＨ2〜11、ＰＴＨ2〜12、ＰＴＨ2〜13、ＰＴＨ2〜14、ＰＴＨ2〜15、ＰＴＨ2〜16、ＰＴＨ2〜17、ＰＴＨ2〜18、ＰＴＨ2〜19、ＰＴＨ2〜20、ＰＴＨ2〜21、ＰＴＨ2〜22、ＰＴＨ2〜23、ＰＴＨ2〜24、ＰＴＨ2〜25、ＰＴＨ2〜26、ＰＴＨ2〜27、ＰＴＨ2〜28、ＰＴＨ2〜29、ＰＴＨ2〜30、ＰＴＨ2〜31、ＰＴＨ2〜32、ＰＴＨ2〜33、ＰＴＨ2〜34、ＰＴＨ2〜35、ＰＴＨ2〜36、ＰＴＨ2〜37、ＰＴＨ3〜6、ＰＴＨ3〜7、ＰＴＨ3〜8、ＰＴＨ3〜9、ＰＴＨ3〜10、ＰＴＨ3〜11、ＰＴＨ3〜13、ＰＴＨ3〜14、ＰＴＨ3〜15、ＰＴＨ3〜16、ＰＴＨ3〜17、ＰＴＨ3〜18、ＰＴＨ3〜19、ＰＴＨ3〜20、ＰＴＨ3〜21、ＰＴＨ3〜22、ＰＴＨ3〜23、ＰＴＨ3〜24、ＰＴＨ3〜25、ＰＴＨ3〜26、ＰＴＨ3〜27、ＰＴＨ3〜28、ＰＴＨ3〜29、ＰＴＨ3〜30、ＰＴＨ3〜31、ＰＴＨ3〜32、ＰＴＨ3〜33、ＰＴＨ3〜34、ＰＴＨ3〜35、ＰＴＨ3〜36、ＰＴＨ3〜37、ＰＴＨ4〜7、ＰＴＨ4〜8、ＰＴＨ4〜9、ＰＴＨ4〜10、ＰＴＨ4〜11、ＰＴＨ4〜12、ＰＴＨ4〜13、ＰＴＨ4〜14、ＰＴＨ4〜15、ＰＴＨ4〜16、ＰＴＨ4〜17、ＰＴＨ4〜18、ＰＴＨ4〜19、ＰＴＨ4〜20、ＰＴＨ4〜21、ＰＴＨ4〜22、ＰＴＨ4〜23、ＰＴＨ4〜24、ＰＴＨ4〜25、ＰＴＨ4〜26、ＰＴＨ4〜27、ＰＴＨ4〜28、ＰＴＨ4〜29、ＰＴＨ4〜30、ＰＴＨ4〜31、ＰＴＨ4〜32、ＰＴＨ4〜33、ＰＴＨ4〜34、ＰＴＨ4〜35、ＰＴＨ4〜36、ＰＴＨ4〜37、ＰＴＨ5〜8、ＰＴＨ5〜9、ＰＴＨ5〜10、ＰＴＨ5〜11、ＰＴＨ5〜12、ＰＴＨ5〜13、ＰＴＨ5〜14、ＰＴＨ5〜15、ＰＴＨ5〜16、ＰＴＨ5〜17、ＰＴＨ5〜18、ＰＴＨ5〜19、ＰＴＨ5〜20、ＰＴＨ5〜21、ＰＴＨ5〜22、ＰＴＨ5〜23、ＰＴＨ5〜24、ＰＴＨ5〜25、ＰＴＨ5〜26、ＰＴＨ5〜27、ＰＴＨ5〜28、ＰＴＨ5〜29、ＰＴＨ5〜30、ＰＴＨ5〜31、ＰＴＨ5〜32、ＰＴＨ5〜33、ＰＴＨ5〜34、ＰＴＨ5〜35、ＰＴＨ5〜36、またはＰＴＨ5〜37に含まれるエピトープに特異的に結合する。しかし、頻繁に、非全ＰＴＨフラグメントは、ＰＴＨ3〜84とＰＴＨ34〜84との間のアミノ酸配列を有するペプチドである。
さらなる実施形態では、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）であって、ＭＡＰが複数の本明細書中に記載のＰＴＨペプチドに抱合した分岐オリゴリジンコアを含む、ＭＡＰを提供する。時折、分岐オリゴリジンコアは、３、７、または１５個のリジン残基を含み、時折、ＭＡＰは、４、８、または１６個のＰＴＨペプチドのコピーを含む。複数のＰＴＨペプチドは、同一または異なるＰＴＨペプチドを含む。１つの態様では、複数のＰＴＨペプチドは、スペーサーを介して分岐オリゴリジンコアに抱合する。頻繁に、スペーサーはアミノ酸残基である。多重抗原ペプチドは、一般に公知のテクノロジーを含む。例えば、Adermann,K.,et al.,Innovations and Perspectives in Solid Phase Synthesis 429-32(R.Epton,ed.,Mayflower Worldwide 1994)を参照のこと。
別の実施形態では、本開示は、哺乳動物サンプル中の生理学的レベルの全副甲状腺ホルモンを測定する方法であって、ａ）試験すべき哺乳動物からサンプルを得るステップと、ｂ）前記サンプルを全ＰＴＨのＮ末端配列に特異的に結合し、前記哺乳動物サンプル中の前記全ＰＴＨを生理学的レベルで検出することができる単離された抗体であって、前記単離抗体が非全ＰＴＨフラグメントへの結合を回避する単離抗体に接触させるステップと、ｃ）前記哺乳動物サンプル中の生理学的レベルの全副甲状腺ホルモンを測定するために、前記サンプル中に存在する場合、前記全副甲状腺ホルモンと前記抗体との間で形成された複合体を評価するステップとを含む方法を提供する。本発明の方法にしたがって、血清、血漿、および血液のサンプルを含む種々のサンプル型を使用することができる。頻繁に、サンプルは臨床サンプルであり、哺乳動物はヒトである。非全ＰＴＨフラグメントは、本明細書中に記載の任意の種々の非全ＰＴＨフラグメントであり得る。
１つの態様では、抗体は、ＰＴＨ1〜6、ＰＴＨ1〜8、ＰＴＨ1〜9、ＰＴＨ1〜12、またはＰＴＨ3〜12および／またはＰＴＨペプチドＰＴＨ1〜15に含まれるエピトープに特異的に結合する。頻繁に、抗体は、本明細書中で考察したＰＴＨエピトープに特異的に結合する。時折、抗体と全ＰＴＨのＮ末端配列との間の結合は、ＰＴＨのアミノ酸残基２〜５または３〜６の存在に依存する。
種々のアッセイ型を考慮するにも関わらず、本発明の方法は、頻繁に、サンドイッチアッセイ形式または競合アッセイ形式によって全副甲状腺ホルモンと抗体との間に形成された複合体を評価する。時折、複合体を同種アッセイ形式または異種アッセイ形式で評価する。頻繁に、複合体を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロッティング、免疫沈降、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫染色、ラテックス凝集、間接赤血球凝集アッセイ（ＩＨＡ）、補体結合、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、比濁法、フローサイトメトリーアッセイ、プララズモン共鳴アッセイ、化学発光アッセイ、側方流動免疫アッセイ、ｕ−キャプチャーアッセイ(u-capture assay)、阻害アッセイ、およびアビディティアッセイからなる群より選択される形式によって評価する。サンドイッチアッセイ形式では、全ＰＴＨのＮ末端配列に特異的に結合する抗体を第１の抗体として使用し、第１の抗体に結合するＮ末端配列以外の全ＰＴＨの一部に結合することができる抗体を第２の抗体として使用する。頻繁に、第１の抗体または第２の抗体のいずれかが表面に付着して捕捉抗体として機能する。付着は、直接または間接的であり得る。好ましい実施形態では、ビオチン−アビジン（またはストレプトアビジン）連結対を介して付着する。
別の態様では、全副甲状腺ホルモンの生理学的レベルは４ｐｍｏｌ／Ｌ未満である。頻繁に、全副甲状腺ホルモンの生理学的レベルは約０．２ｐｍｏｌ／Ｌ〜約４ｐｍｏｌ／Ｌである。頻繁に、全ＰＴＨの生理学的範囲は約２ｐｇｍ／Ｌ〜約４０ｐｇｍ／Ｌの範囲である。時折、全ＰＴＨの生理学的範囲は約７ｐｇｍ／Ｌ〜約３９ｐｇｍ／Ｌの範囲である。
さらなる実施形態では、本発明の方法を使用して、全ＰＴＨレベルに加えて、非全ＰＴＨペプチドフラグメントレベルおよび／または総ＰＴＨレベルなどの多重ＰＴＨペプチド成分を測定することができる。このような実施形態では、本方法は、頻繁に、全ＰＴＨレベル（ｗＰＴＨ）、総ＰＴＨレベル、総ＰＴＨペプチドフラグメントレベル、Ｃ末端ＰＴＨフラグメントレベル（ｃＰＴＨ）、Ｎ末端ＰＴＨフラグメントレベル、および中末端(mid-terminal)ＰＴＨフラグメント（ｍＰＴＨ）レベルからなる群より選択される少なくとも２つのパラメーターを比較するステップをさらに含む。パラメーターの比較は、一般に、比または比率の形態である。頻繁に、比較の結果を使用して、哺乳動物（しばしばヒト患者を含む）が骨代謝回転関連障害を罹患しているかどうかを決定するか、骨障害関連治療をモニタリングする。頻繁に、本発明の方法を使用して、哺乳動物が無形成骨症または重症副甲状腺機能亢進症を罹患しているかこれらのリスクがあるかどうかを決定または診断する。頻繁に、本発明の方法を、腎疾患被験体および骨粗鬆症を罹患した被験体（透析患者を含む）の臨床管理に使用する。また頻繁に、本発明の方法を、原発性副甲状腺機能亢進症の診断に使用する。さらに、本発明の方法は、一部には、不適切な治療プロトコールの実施によって誘導された、無形成骨症被験体の臨床診断および臨床管理に有用である。
本発明の好ましい実施形態では、比較は多くの形態を取る。例えば、比較は、全ＰＴＨレベルと総ＰＴＨレベルとの間（すなわち、以下の式で示される。ｗＰＴＨ／総ＰＴＨ）；全ＰＴＨレベルとｃＰＴＨおよびｍＰＴＨフラグメントの組み合わせのレベルとの間（すなわち、以下の式で示される。ｗＰＴＨ／（ｃＰＴＨ＋ｍＰＴＨ））；全ＰＴＨレベルとｃＰＴＨおよびｍＰＴＨフラグメントの組み合わせのレベルであって、全ＰＴＨレベルの２倍をｃＰＴＨおよびｍＰＴＨフラグメントの組み合わせレベルから差し引いたレベルとの間（すなわち、以下の式で示される。ｗＰＴＨ／（（ｃＰＴＨ−ｗＰＴＨ）＋（ｍＰＴＨ−ｗＰＴＨ）））；全ＰＴＨレベルとｃＰＴＨおよびｍＰＴＨフラグメントレベルの合計から全ＰＴＨレベルを差し引いた値との間（すなわち、以下の式で示される。ｗＰＴＨ／（ｃＰＴＨ＋ｍＰＴＨ−ｗＰＴＨ））；全ＰＴＨレベルと全ＰＴＨレベル、ｃＰＴＨ、およびｍＰＴＨフラグメントの組み合わせのレベルとの間（すなわち、以下の式で示される。ｗＰＴＨ／（ｗＰＴＨ＋ｃＰＴＨ＋ｍＰＴＨ））；全ＰＴＨレベルとｃＰＴＨフラグメントレベルとの間（すなわち、以下の式で示される。ｗＰＴＨ／ｃＰＴＨ）；全ＰＴＨレベルとｍＰＴＨフラグメントレベルとの間（すなわち、以下の式で示される。ｗＰＴＨ／ｍＰＴＨ）；全ＰＴＨレベルと総ＰＴＨレベル−全ＰＴＨレベルとの間（すなわち、以下の式で示される。ｗＰＴＨ／（総ＰＴＨ−ｗＰＴＨ））の比もしくは比率の形態または開示のパラメーターの他の組み合わせ（各比較の逆が含まれるが、これに限定されない）であり得る。さらに、制限なく、１つの態様では、総ＰＴＨレベルを決定し、全ＰＴＨレベルからこのレベルを差し引くことで得られた値により、サンプル／被験体中の総ＰＴＨレベルが得られる。これらの各比較のカットオフ範囲は、特定の骨代謝回転、治療、疾患、または障害に関連するので、本明細書中に記載のように変化する（例えば、表２および添付の考察を参照のこと）。
頻繁に、本発明の方法では、サンプルを１つまたは複数の単離抗体であって、前記１つまたは複数の各単離抗体が、ＰＴＨ39〜84、ＰＴＨ1〜34、ＰＴＨ43〜68、ＰＴＨ7〜84、ＰＴＨ39〜68、ＰＴＨ53〜84、ＰＴＨ65〜84、ＰＴＨ44〜68、ＰＴＨ19〜84、ＰＴＨ23〜84、ＰＴＨ1〜38、ＰＴＨ1〜48、ＰＴＨ1〜58、ＰＴＨ1〜68、およびＰＴＨ1〜78からなる群より選択される１つまたは複数のＰＴＨペプチドフラグメントに特異的に結合する単離抗体に接触させる。
複数のＰＴＨ成分の測定方法は、種々の用途を提供する。例えば、実質的に正常な副甲状腺機能を有する者と副甲状腺機能亢進症（例えば、原発性副甲状腺機能亢進症）を有する者との区別；副甲状腺関連骨疾患のモニタリングおよび治療；副甲状腺機能亢進症の治療上の処置の効果のモニタリング；副甲状腺関連骨疾患の診断；腎疾患被験体および腎疾患関連治療ならびに骨粗鬆症被験体および骨粗鬆症関連治療の臨床管理にこのような方法を使用する。
本開示は、本明細書中に記載の方法を実施するためおよび本明細書中に記載のペプチドおよび抗体を利用するためのキットをさらに提供する。１つの実施形態では、哺乳動物サンプル中の生理学的レベルの全副甲状腺ホルモンを測定するためのキットであって、全副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のＮ末端配列に特異的に結合し、哺乳動物サンプル中の前記全ＰＴＨを生理学的レベルで検出することができる単離された抗体であって、非全ＰＴＨフラグメントへの結合を回避する単離抗体をコンテナ中に含むキット。
別の実施形態では、本開示は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生のためのキットであって、ａ）単離ＰＴＨペプチドと、ｂ）前記単離ＰＴＨペプチドを前記単離ＰＴＨペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入する手段と、ｃ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するための手段とを含むキットをさらに提供する。さらなる実施形態では、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生のためのキットであって、ａ）ＭＡＰと、ｂ）前記ＭＡＰを前記ＭＡＰに含まれるＰＴＨペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入する手段と、ｃ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するための手段とを含むキットを提供する。なおさらなる実施形態では、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生のためのキットであって、ａ）ＰＴＨ1〜34とＰＴＨ1〜84との間のＰＴＨタンパク質またはペプチドと、ｂ）前記ＰＴＨ1〜34とＰＴＨ1〜84との間のＰＴＨタンパク質またはペプチドを前記ＰＴＨタンパク質またはペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入する手段と、ｃ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するための手段と、ｃ）別の特異的ＰＴＨペプチドとを含むキットを提供する。
このようなキット中の単離ＰＴＨペプチドは、本明細書中に記載の任意の種々のＰＴＨペプチドであり得る。頻繁に、ＰＴＨペプチドを、ＰＴＨペプチドの免疫原性を増強するためのキャリア（例えば、キャリアタンパク質）に抱合して、融合タンパク質を形成することができる。例えば、このようなＰＴＨペプチドは、ＰＴＨ1〜11、ＰＴＨ1〜13、ＰＴＨ1〜14、ＰＴＨ1〜15、ＰＴＨ1〜16、ＰＴＨ1〜17、ＰＴＨ1〜18、ＰＴＨ1〜19、ＰＴＨ1〜20、ＰＴＨ1〜21、ＰＴＨ1〜22、ＰＴＨ1〜23、ＰＴＨ1〜24、ＰＴＨ1〜25、ＰＴＨ1〜26、ｈＰＴＨ1〜27、ＰＴＨ1〜28、ＰＴＨ1〜29、ＰＴＨ1〜30、ＰＴＨ1〜31、ＰＴＨ1〜32、ＰＴＨ1〜33、ＰＴＨ1〜34、ＰＴＨ1〜35、ＰＴＨ1〜36、ＰＴＨ2〜5、ＰＴＨ2〜6、ＰＴＨ2〜8、ＰＴＨ2〜9、ＰＴＨ2〜10、ＰＴＨ2〜11、ＰＴＨ2〜12、ＰＴＨ2〜13、ＰＴＨ2〜14、ＰＴＨ2〜15、ＰＴＨ2〜16、ＰＴＨ2〜17、ＰＴＨ2〜18、ＰＴＨ2〜19、ＰＴＨ2〜20、ＰＴＨ2〜21、ＰＴＨ2〜22、ＰＴＨ2〜23、ＰＴＨ2〜24、ＰＴＨ2〜25、ＰＴＨ2〜26、ＰＴＨ2〜27、ＰＴＨ2〜28、ＰＴＨ2〜29、ＰＴＨ2〜30、ＰＴＨ2〜31、ＰＴＨ2〜32、ＰＴＨ2〜33、ＰＴＨ2〜34、ＰＴＨ2〜35、ＰＴＨ2〜36、ＰＴＨ3〜6、ＰＴＨ3〜7、ＰＴＨ3〜9、ＰＴＨ3〜10、ＰＴＨ3〜11、ＰＴＨ3〜12、ＰＴＨ3〜13、ＰＴＨ3〜14、ＰＴＨ3〜15、ＰＴＨ3〜16、ＰＴＨ3〜17、ＰＴＨ3〜18、ＰＴＨ3〜19、ＰＴＨ3〜20、ＰＴＨ3〜21、ＰＴＨ3〜22、ＰＴＨ3〜23、ＰＴＨ3〜24、ＰＴＨ3〜25、ＰＴＨ3〜26、ＰＴＨ3〜27、ＰＴＨ3〜28、ＰＴＨ3〜29、ＰＴＨ3〜30、ＰＴＨ3〜31、ＰＴＨ3〜32、ＰＴＨ3〜33、ＰＴＨ3〜34、ＰＴＨ3〜35、ＰＴＨ3〜36、ＰＴＨ4〜7、ＰＴＨ4〜8、ＰＴＨ4〜9、ＰＴＨ4〜10、ＰＴＨ4〜11、ＰＴＨ4〜13、ＰＴＨ4〜14、ＰＴＨ4〜15、ＰＴＨ4〜16、ＰＴＨ4〜17、ＰＴＨ4〜18、ＰＴＨ4〜19、ＰＴＨ4〜20、ＰＴＨ4〜21、ＰＴＨ4〜22、ＰＴＨ4〜23、ＰＴＨ4〜24、ＰＴＨ4〜25、ＰＴＨ4〜26、ＰＴＨ4〜27、ＰＴＨ4〜28、ＰＴＨ4〜29、ＰＴＨ4〜30、ＰＴＨ4〜31、ＰＴＨ4〜32、ＰＴＨ4〜33、ＰＴＨ4〜34、ＰＴＨ4〜35、ＰＴＨ4〜36、ＰＴＨ5〜8、ＰＴＨ5〜9、ＰＴＨ5〜11、ＰＴＨ5〜12、ＰＴＨ5〜13、ＰＴＨ5〜14、ＰＴＨ5〜15、ＰＴＨ5〜16、ＰＴＨ5〜17、ＰＴＨ5〜18、ＰＴＨ5〜19、ＰＴＨ5〜20、ＰＴＨ5〜21、ＰＴＨ5〜22、ＰＴＨ5〜23、ＰＴＨ5〜24、ＰＴＨ5〜25、ＰＴＨ5〜26、ＰＴＨ5〜27、ＰＴＨ5〜28、ＰＴＨ5〜29、ＰＴＨ5〜30、ＰＴＨ5〜31、ＰＴＨ5〜32、ＰＴＨ5〜33、ＰＴＨ5〜34、ＰＴＨ5〜35、ＰＴＨ5〜36、およびＰＴＨ5〜37からなる群より選択される。
本発明で意図されるキットはまた、免疫応答増強物質(immune response poteniator)と共に本明細書中に記載のＰＴＨペプチドを含む免疫原を提供することができる。時折、免疫応答増強物質は、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルブム、ウシ流産菌抽出物、グルカン、レバミゾール、チロロン、酵素、および非ビルレントウイルスからなる群より選択される。
本開示は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生方法をさらに提供する。１つの実施形態では、このような方法は、ａ）単離ＰＴＨペプチドを前記ＰＴＨペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入するステップと、ｂ）前記哺乳動物から抗体を回収するステップとを含む。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の別の頻繁な産生方法は、ａ）ＭＡＰを前記ＭＡＰに含まれるＰＴＨペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入するステップと、ｂ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するステップとを含む。１つの態様では、本開示は、これらの方法によって産生されたＰＴＨまたはＰＴＨペプチドに対する抗体を提供する。関連する実施形態では、本方法は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生方法であって、ａ）ＰＴＨタンパク質またはＰＴＨ1〜34とＰＴＨ1〜84との間のペプチドを前記ＰＴＨタンパク質またはペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入するステップと、ｂ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するステップと、ｃ）ＰＴＨペプチドに含まれるエピトープに特異的に結合するＰＴＨ抗体を、前記ＰＴＨペプチドを使用してアフィニティ精製するステップとを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、このような方法によって産生されたＰＴＨまたはＰＴＨペプチドに対する抗体を提供する。
［ＶＩ．発明の詳細な説明］
〔Ａ．定義〕
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されている意味と同一である。本明細書中で言及されている全ての特許、特許出願（公開または非公開）、および他の刊行物は、本明細書に引用することで組み込まれる。この節で記載された定義が、本明細書に引用することで組み込まれる特許、出願、公開出願、および他の刊行物に記載された定義に反するか一致しない場合、本節に記載の定義を、本明細書に引用することで組み込まれる定義よりも優先する。
〔Ａ．定義〕
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されている意味と同一である。本明細書中で言及されている全ての特許、特許出願（公開または非公開）、および他の刊行物は、本明細書に引用することで組み込まれる。この節で記載された定義が、本明細書に引用することで組み込まれる特許、出願、公開出願、および他の刊行物に記載された定義に反するか一致しない場合、本節に記載の定義を、本明細書に引用することで組み込まれる定義よりも優先する。
本明細書中で使用される、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。
本明細書中で使用される、「抗体」を、最も広い意味で使用する。したがって、「抗体」は、天然に存在するか従来のハイブリドーマテクノロジーによって産生されたモノクローナル抗体などの合成された抗体および／またはその機能的フラグメントであり得る。本発明の抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに抗原結合ドメインおよび／またはこれらの抗体の１つまたは複数の相補性決定領域を含むフラグメントを含む。
本明細書中で使用される、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団（すなわち、この集団を含む抗体は、天然に存在する変異体が少量存在する可能性があること以外は同一である）から得た抗体をいう。本明細書中で使用される、「モノクローナル抗体」は、さらに、モノクローナル抗体の機能的フラグメントをいう。
本明細書中で使用される、「哺乳動物」は、種の任意の哺乳動物クラスをいう。頻繁に、本明細書中で使用される、用語「哺乳動物」は、ヒト、ヒト被験体、またはヒト患者をいう。
本明細書中で使用される、「全副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）」または「ｗＰＴＨ」は、ＰＴＨの完全な分子をいう。この用語は、他で示さない限り種特異的ではない。本明細書中の目的のために、名称「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）」を本明細書中で使用するが、全ての他の名称が意図される。その生物活性が実質的に変化しない保存的アミノ酸置換を行った全ＰＴＨを含むことが意図される。適切な保存的アミノ酸置換は当業者に公知であり、一般に、得られた分子の生物活性を変化させることなく行うことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の１つのアミノ酸置換では生物活性は実質的に変化しないことを認識している(例えば、Watson et al.,MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE,4th Edition,1987,The Bejamin/Cummings Pub.Co.,p.224を参照のこと)。
本明細書中で使用される、「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）アゴニスト」、「シクラーゼ活性化ＰＴＨ」、または「ＣＡＰ」は、破骨細胞形成および骨代謝回転を刺激して血中カルシウムレベルを増加させるＰＴＨの完全な分子またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログをいう。ＰＴＨアゴニストは、さらに、ＰＴＨアゴニスト特性を有するペプチドをいう。ＰＴＨの他の名称には、パラトルモンおよびパラサイリン(parathyrin)が含まれる。本明細書中の目的のために、名称「副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）」を使用するが、全ての他の名称が意図される。その生物活性が実質的に変化しない保存的アミノ酸置換を行ったＰＴＨアゴニストを含むことが意図される。適切な保存的アミノ酸置換は当業者に公知であり、一般に、得られた分子の生物活性を変化させることなく行うことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域中の１つのアミノ酸置換では生物活性は実質的に変化しないことを認識している(例えば、Watson et al.,MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE,4th Edition,1987,The Bejamin/Cummings Pub.co.,p.224を参照のこと)。Scantibodies Whole PTHアッセイ、Scantibodies CAPアッセイ、第３世代ＰＴＨアッセイ、Nichols BioIntact PTHアッセイ、またはImmutopics Human Bioactive PTHアッセイを使用したサンプルの測定によってＰＴＨアゴニストのアッセイ値を得ることができる。
本明細書中で使用される、用語「総ＰＴＨ」は、ＰＴＨフラグメントレベルを加えた全ＰＴＨレベルの総数をいう。さらに、この用語は、他で示さない限り種特異的ではない。
本明細書中で使用される、用語「ＰＩＮ」は、ＰＴＨ拮抗性または阻害性を有するＰＴＨフラグメントをいう。したがって、時折同一範囲であるにもかかわらず、本明細書中で言及するＰＴＨフラグメントはＰＩＮに制限されることを意図しない。
本明細書中で使用される、「ＰＴＨフラグメント」は、完全なＰＴＨタンパク質の非全連続部分を含むＰＴＨペプチドである。本明細書中で言及するＰＴＨフラグメントには、他で示さない限り、Ｃ末端、中末端フラグメント、およびＰＩＮが含まれる。さらに、この用語は、他で示さない限り、種特異的ではない。
本明細書中で使用される、「治療」は、病態、障害、または疾患の症状が改善または有利に変化する任意の様式を意味する。治療は、本明細書中の組成物の任意の薬学的使用も含む。
本明細書中で使用される、「疾患または障害」は、例えば、感染または遺伝的欠陥に起因し、同定可能な症状によって特徴づけられる生物の病的状態をいう。
本明細書中で使用される、「高骨代謝回転」は、被験体の正常な骨代謝回転を超える骨代謝回転をいい、副甲状腺機能亢進症を有する被験体で現れる症状の１つである。理論に拘束されないが、重症副甲状腺機能亢進症を罹患した被験体は、軽度副甲状腺機能亢進症を罹患した被験体よりも骨代謝回転率が高いが、両者は正常な被験体および無形成骨症を罹患した被験体と比較して高い骨代謝回転率を有する。
本明細書中で使用される、用語「被験体」は、特定の種またはサンプル型に制限されない。例えば、用語「被験体」は、患者、頻繁に、ヒト患者をいうことができる。しかし、この用語はヒトに制限されないので、種々の哺乳動物種を含む。
本明細書中で使用される、疾患または障害に関する「罹患した」は、指定した疾患または障害を有するか直接影響を受けた被験体をいう。
本明細書中で使用される、用語「サンプル」は、分析物をアッセイすることが望ましい分析物を含み得る全てのものをいう。サンプルは、生体液または生体組織などの生体サンプルであり得る。生体液の例には、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、排泄物、痰、脳脊髄液、涙、粘液、または羊水などが含まれる。生体組織は、通常、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、またはウイルス構造の構造物質（結合組織、上皮組織、筋肉組織、および神経組織が含まれる）の１つを形成するその細胞内物質を含む特定の種細胞凝集体である。生体組織の例には、器官、腫瘍、リンパ節、動脈、および各細胞も含まれる。
本明細書中で使用される、用語「結合を回避する」は、特定の抗体または別のフラグメントの特異性をいう。特定の部分への結合を回避する抗体または抗体フラグメントは、一般に、大部分の特定の部分がこのような抗体または抗体フラグメントによって結合されないような特異性を含む。この比率は、一般に、特定の標的の検出を対象とする抗体を使用したアッセイの妨害部分との許容可能な交差反応性の範囲内である。頻繁に、本開示の抗体または抗体フラグメントは、約９０％を超える妨害部分との結合を回避するにもかかわらず、より高い比率が明確に意図され、且つ好ましい。例えば、本開示の抗体または抗体フラグメントは、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および約９９％またはそれ以上の妨害部分への結合を回避する。あまり頻繁ではないが、本開示の抗体または抗体フラグメントは、約７０％を超えるか、約７５％を超えるか、約８０％を超えるか、または約８５％を超える妨害部分への結合を回避する。理論に拘束されないが、本明細書中で意図されるように、妨害部分は非全ＰＴＨフラグメントを含み得る。
本明細書中で使用される、用語「全ＰＴＨの生理学的レベル」は、一般に、ｐｍｏｌ／Ｌまたは別の適切な測定単位（例えば、ｐｇｍ／ｍｌ）で示される哺乳動物（例えば、ヒト）中に存在する全ＰＴＨの平均濃度をいう。例えば、Woodhead,J.S.,Clin.Biochem.23,17(1990)を参照のこと。１つの態様では、全ＰＴＨの生理学的範囲は、約０．２ｐｍｏｌ／Ｌ〜約４ｐｍｏｌ／Ｌまたは約２ｐｇｍ／ｍｌ〜約４０ｐｇｍ／ｍｌの範囲である。時折、全ＰＴＨの生理学的範囲は、約７ｐｇｍ／ｍｌ〜約３９ｐｇｍ／ｍｌの範囲であり得る。代表的な生理学的範囲として特定の範囲を本明細書中に記載しているが、当業者は、全ＰＴＨの生理学的レベルは、一定の被験体において本発明で開示されている範囲外であり得ることを理解している。それにも関わらず、本明細書中に提供した組成物および方法は、全ＰＴＨの控え目な濃度の検出に有用であり、本明細書中に提供した生理学的範囲の範囲内で感受性を示す。
本明細書中で使用される、用語「Ｎ末端」は、遊離アミノ基を有するＰＴＨポリペプチドのアミノ末端をいう。ＰＴＨフラグメントに関して、Ｎ末端ＰＴＨフラグメントは、インタクトなＮ末端を有するＰＴＨの非全連続部分をいう。本明細書中で使用される、「インタクトなＮ末端」は、ＰＴＨ1〜84のインタクトな１番目の部分を有するＰＴＨまたはＰＴＨフラグメントをいう。この１番目の部分を、本明細書中で「元のＮ終端(terminus)」または「元のＮ末端」ともいう。
本明細書中で使用される、用語「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基を有するＰＴＨポリペプチドのカルボキシル末端をいう。ＰＴＨフラグメントに関して、Ｃ末端ＰＴＨフラグメントは、インタクトなＣ末端を有するＰＴＨの非全連続部分をいう。本明細書中で使用される、「インタクトなＣ末端」は、ＰＴＨ1〜84のインタクトな８４番目の部分を有するＰＴＨまたはＰＴＨフラグメントをいう。この８４番目の部分を、本明細書中で「元のＣ終端(terminus)」または「元のＣ末端」ともいう。
本明細書中で使用される、用語「中末端ＰＴＨフラグメント」は、インタクトなＮ末端やインタクトなＣ末端を含まないＰＴＨの非全連続部分をいう。これらのＰＴＨフラグメント型を、本明細書中で「中末端フラグメント」ということもできる。
本明細書中で使用される、用語「特異的に結合する」は、定義の標的に優先的に結合するような抗体の特異性をいう。他の潜在的標的の存在下での特定の標的の抗体による認識は、このような結合の１つの特徴である。特定のＰＴＨ標的に対する本発明で意図される抗体の特異的結合を、本明細書中で提供したツールを使用した公知の方法によって測定する。
本明細書中で使用される、ハイブリッド形成反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、一般に、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、プローブの長さが長いほど適切なアニーリングのための温度が高くなる一方で、プローブが短いほど低い温度が必要である。ハイブリッド形成は、一般に、その融解温度未満の環境下で相補鎖が存在する場合の変性核酸配列の再アニーリング能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の程度が高いほど、使用することができる相対温度が高くなる。結果として、相対温度が高いほど反応条件がよりストリンジェントになる傾向がある一方で、この温度が低いほどストリンジェンシーが低くなることに従う。ハイブリッド形成反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.eds.,Wiley Interscience Publishers,1995);Molecular Cloning:A Laboratory Manual(J.Sambrook,E.Fritsch,T.Maniatis eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2d ed.1989);Wood et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:1585-1588(1985)を参照のこと。
本明細書中で使用される、用語「単離された」は、その元の環境から取り出された物質をいい、その天然の状態と異なる。例えば、単離ポリペプチドは、キャリアに結合することができ、その元の環境下でポリペプチドではないので、依然として「単離されている」。
本開示は、一連または他の特定のアミノ酸残基もしくは複数のアミノ酸残基を含む標的タンパク質および／またはペプチドに特定の特異性を有する抗原、抗体、ならびに抗体の産生方法を含む。特異的アミノ酸残基を、タンパク質もしくはペプチドのＮ末端領域またはＣ末端領域中に配置することができる。さらに、特異的アミノ酸残基を、タンパク質またはペプチドのＮ末端領域とＣ末端領域との間の領域中に配置することができる。時折、１つを超える特異的アミノ酸残基が存在する場合、このような残基は、任意の１つまたは複数のＮ末端、Ｃ末端、これらの２領域の間、および／またはこれらの全領域中に分散させることができる。
本発明の開示では、ＰＴＨの多数の密接に類似した種依存性形態が存在することを念頭におくべきである。ｈＰＴＨのアミノ酸配列を、図１に示す。しかし、ラットＰＴＨ、マウスＰＴＨ、ウシＰＴＨ、イヌＰＴＨ、ウマＰＴＨ、またはブタＰＴＨでは、例えば、ｈＰＴＨ配列中のいくつかのアミノ酸置換が認められる。本発明の目的のために、これらのＰＴＨを形成するために抗体または抗体フラグメントを交換可能に使用することができるにもかかわらず、ＰＴＨが測定される種に適合する配列を有するＰＴＨに特異性を有する抗体を使用することが好ましい。
〔Ｂ．副甲状腺ホルモンフラグメント〕
一般に、本発明のＰＴＨフラグメントは、配列番号１、２、３、４、５、６、および／または７（ＰＴＨ1〜84）に記載のアミノ酸配列を有するＰＴＨの非全連続部分またはこのＰＴＨ部分をコードする核酸を含む。ＰＴＨフラグメントは、以下の特徴を有し得る。ａ）ＰＴＨフラグメントのＮ末端アミノ酸残基がＰＴＨ1〜84の１位〜８０位にわたる任意の位置から始まること；ｂ）ＰＴＨフラグメントのＣ末端アミノ酸残基が、ＰＴＨ1〜84の４位〜８４位にわたる任意の位置で終結すること；およびｃ）ＰＴＨフラグメントが３アミノ酸残基の最小の長さを有すること。好ましくは、ＰＴＨフラグメントは、薬学的組成物の形態である。
一般に、本発明のＰＴＨフラグメントは、配列番号１、２、３、４、５、６、および／または７（ＰＴＨ1〜84）に記載のアミノ酸配列を有するＰＴＨの非全連続部分またはこのＰＴＨ部分をコードする核酸を含む。ＰＴＨフラグメントは、以下の特徴を有し得る。ａ）ＰＴＨフラグメントのＮ末端アミノ酸残基がＰＴＨ1〜84の１位〜８０位にわたる任意の位置から始まること；ｂ）ＰＴＨフラグメントのＣ末端アミノ酸残基が、ＰＴＨ1〜84の４位〜８４位にわたる任意の位置で終結すること；およびｃ）ＰＴＨフラグメントが３アミノ酸残基の最小の長さを有すること。好ましくは、ＰＴＨフラグメントは、薬学的組成物の形態である。
本発明のＰＴＨフラグメントを、以下の３つのカテゴリーに組織化する。Ｎ末端、Ｃ末端、および中末端のＰＴＨフラグメント。本明細書中でさらに記載するように、Ｎ末端フラグメントは、インタクトなＮ末端を含むが、インタクトな元のＣ末端を含まないＰＴＨの非全連続部分を含む。本明細書中にも記載されるように、Ｃ末端フラグメントは、インタクトなＣ末端を含むが、インタクトな元のＮ末端を含まないＰＴＨの非全連続部分を含む。さらに、本明細書中にさらに記載されるように、中末端フラグメントは、インタクトな元のＣ末端やインタクトな元のＮ末端のいずれも含まないＰＴＨの非全連続部分を含む。ＰＴＨの全ての哺乳動物供給源／配列が意図される。
１つの実施形態では、ＰＴＨフラグメントは、シクラーゼ不活性ＰＴＨのサブセットを含む。しかし、本記載を考慮すると、種々の他のＰＴＨフラグメントは、本発明の組成物、キット、および方法で意図され、確認可能であり、且つ有用である。重要には、ＰＴＨ7〜84は、本発明で意図されるＰＴＨフラグメント群のメンバーを示す。本開示は、ＰＴＨフラグメントの記載における巨大な不活性ＰＴＨフラグメントをさらに意図する。
１つの実施形態では、ＰＴＨフラグメントのＮ末端アミノ酸残基は、ＰＴＨ1〜84の２位〜７０位にわたる任意の定義の位置で始まる。ＰＴＨフラグメントのＣ末端アミノ酸残基は、ＰＴＨ1〜84の３５位〜８４位にわたる任意の定義の位置で終結する。したがって、例えば、ＰＴＨ2〜84、ＰＴＨ34〜84、またはＰＴＨ70〜84までの範囲のフラグメントは、Ｃ末端フラグメントとして含まれる。例えば、ＰＴＨ39〜68またはＰＴＨ44〜68の範囲内の中末端ＰＴＨフラグメントも意図される。例えば、ＰＴＨ1〜84の約４４位から始まるＮ末端およびＰＴＨ1〜84の約６８位で終結するＣ末端を有する中末端ＰＴＨフラグメントは本記載に含まれる。理論に拘束されないが、中末端ＰＴＨフラグメントは、ＰＴＨ1〜84の１位や８４位を含まないが、むしろこれらの位置の範囲内に含まれる。
特定の実施形態では、ＰＴＨフラグメントは、ＰＴＨ2〜84、ＰＴＨ3〜84、ＰＴＨ4〜84、ＰＴＨ5〜84、ＰＴＨ6〜84、ＰＴＨ7〜84、ＰＴＨ8〜84、ＰＴＨ9〜84、ＰＴＨ10〜84、ＰＴＨ11〜84、ＰＴＨ12〜84、ＰＴＨ13〜84、ＰＴＨ14〜84、ＰＴＨ15〜84、ＰＴＨ16〜84、ＰＴＨ17〜84、ＰＴＨ18〜84、ＰＴＨ19〜84、ＰＴＨ20〜84、ＰＴＨ21〜84、ＰＴＨ22〜84、ＰＴＨ23〜84、ＰＴＨ24〜84、ＰＴＨ25〜84、ＰＴＨ26〜84、ＰＴＨ27〜84、ＰＴＨ28〜84、ＰＴＨ29〜84、ＰＴＨ30〜84、ＰＴＨ31〜84、ＰＴＨ32〜84、およびＰＴＨ33〜84からなる群より選択されるタンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸である。別の特定の実施形態では、ＰＴＨフラグメントは、ＰＴＨ7〜69、ＰＴＨ7〜70、ＰＴＨ7〜71、ＰＴＨ7〜72、ＰＴＨ7〜73、ＰＴＨ7〜74、ＰＴＨ7〜75、ＰＴＨ7〜76、ＰＴＨ7〜77、ＰＴＨ7〜78、ＰＴＨ7〜79、ＰＴＨ7〜80、ＰＴＨ7〜81、ＰＴＨ7〜82、ＰＴＨ7〜83、およびＰＴＨ7〜84からなる群より選択されるタンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質またはペプチドをコードする核酸である。
別の実施形態では、ＰＴＨフラグメントは、ＰＴＨ34〜84、ＰＴＨ35〜84、ＰＴＨ36〜84、ＰＴＨ37〜84、ＰＴＨ38〜84、ＰＴＨ39〜84、ＰＴＨ40〜84、ＰＴＨ41〜84、ＰＴＨ42〜84、ＰＴＨ43〜84、ＰＴＨ44〜84、ＰＴＨ45〜84、ＰＴＨ46〜84、ＰＴＨ47〜84、ＰＴＨ48〜84、ＰＴＨ49〜84、ＰＴＨ50〜84、ＰＴＨ51〜84、ＰＴＨ52〜84、ＰＴＨ53〜84、ＰＴＨ54〜84、ＰＴＨ55〜84、ＰＴＨ56〜84、ＰＴＨ57〜84、ＰＴＨ58〜84、ＰＴＨ59〜84、ＰＴＨ60〜84、ＰＴＨ61〜84、ＰＴＨ62〜84、ＰＴＨ63〜84、ＰＴＨ64〜84、ＰＴＨ65〜84、ＰＴＨ66〜84、ＰＴＨ67〜84、ＰＴＨ68〜84、ＰＴＨ69〜84、およびＰＴＨ70〜84からなる群より選択されるタンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質またはペプチドをコードする核酸である。
さらなる実施形態では、ＰＴＨフラグメントは、ＰＴＨ7〜60、ＰＴＨ8〜60、ＰＴＨ9〜60、ＰＴＨ10〜60、ＰＴＨ11〜60、ＰＴＨ12〜60、ＰＴＨ13〜60、ＰＴＨ14〜60、ＰＴＨ15〜60、ＰＴＨ16〜60、ＰＴＨ17〜60、ＰＴＨ18〜60、ＰＴＨ19〜60、ＰＴＨ20〜60、ＰＴＨ21〜60、ＰＴＨ22〜60、ＰＴＨ23〜60、ＰＴＨ24〜60、ＰＴＨ25〜60、ＰＴＨ26〜60、ＰＴＨ27〜60、ＰＴＨ28〜60、ＰＴＨ29〜60、ＰＴＨ30〜60、ＰＴＨ31〜60、ＰＴＨ32〜60、ＰＴＨ33〜60、ＰＴＨ34〜60、ＰＴＨ35〜60、ＰＴＨ36〜60、ＰＴＨ37〜60、およびＰＴＨ38〜60、ＰＴＨ39〜60、ＰＴＨ40〜60、ＰＴＨ41〜60、ＰＴＨ42〜60、ＰＴＨ43〜60、ＰＴＨ44〜59、ＰＴＨ44〜60、ＰＴＨ45〜60、ＰＴＨ46〜60、ＰＴＨ47〜60、およびＰＴＨ48〜60からなる群より選択されるタンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質またはペプチドをコードする核酸ならびに本明細書中に記載の他の中末端ＰＴＨフラグメントである。別の特定の実施形態では、ＰＴＨフラグメントは、ＰＴＨ13〜34、ＰＴＨ7〜53、ＰＴＨ8〜53、ＰＴＨ9〜53、ＰＴＨ10〜53、ＰＴＨ11〜53、ＰＴＨ12〜53、ＰＴＨ13〜53、ＰＴＨ14〜53、ＰＴＨ15〜53、ＰＴＨ16〜53、ＰＴＨ17〜53、ＰＴＨ18〜53、ＰＴＨ19〜53、ＰＴＨ20〜53、ＰＴＨ21〜53、ＰＴＨ22〜53、ＰＴＨ23〜53、ＰＴＨ24〜53、ＰＴＨ25〜53、ＰＴＨ26〜53、ＰＴＨ27〜53、ＰＴＨ28〜53、ＰＴＨ29〜53、ＰＴＨ30〜53、ＰＴＨ31〜53、ＰＴＨ32〜53、ＰＴＨ33〜53、ＰＴＨ34〜53、ＰＴＨ35〜53、ＰＴＨ6〜53、ＰＴＨ37〜53、およびＰＴＨ38〜53からなる群より選択されるタンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質またはペプチドをコードする核酸ならびに本明細書中に記載の他の中末端ＰＴＨフラグメントである。
別の好ましい実施形態では、ＰＴＨフラグメントは、ＰＴＨ39〜84、ＰＴＨ1〜34、ＰＴＨ43〜68、ＰＴＨ7〜84、ＰＴＨ39〜68、ＰＴＨ53〜84、ＰＴＨ65〜84、ＰＴＨ44〜68、ＰＴＨ19〜84、ＰＴＨ23〜84、ＰＴＨ1〜68、またはこの群由来の２つまたはそれ以上の組み合わせからなる群より選択されるＰＴＨペプチドフラグメントを含むか、抗体がこれらの特異的に結合する。この群は、ＰＴＨ1〜84の３９位〜６５位から始まるＮ末端およびＰＴＨ1〜84の８４位で終結するＣ末端位置を有するＰＴＨペプチドフラグメントをさらに含み得る。特に好ましい実施形態では、ＰＴＨペプチドフラグメントは、天然に存在するか検出可能なＰＴＨフラグメントを含む。
別の実施形態では、ＰＴＨフラグメントは、他のインタクトなＮ末端ＰＴＨフラグメントもあるが、インタクトなＮ末端（例えば、ＰＴＨ1〜38、ＰＴＨ1〜48、ＰＴＨ1〜58、ＰＴＨ1〜68、ＰＴＨ1〜78が含まれるが、これらに限定されない）を有するタンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質またはペプチドをコードする核酸である。
ＰＴＨフラグメントは、任意の適切な長さを有し、ＰＴＨ作動活性または拮抗活性を有し得るにもかかわらず、ＰＴＨの作動活性または拮抗活性は、本発明のＰＴＨフラグメントに必要ない。例えば、ＰＴＨフラグメントは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、または８３アミノ酸残基長を有し得る。
〔Ｃ．ＰＴＨ比−全ＰＴＨおよびＰＴＨフラグメント〕
本発明に至る重要な発見は、無力性骨(adynamic bone)は、骨が機能停止するにつれてカルシウムおよびリン酸塩を格納する(buffer)能力を喪失することである。このような病態を罹患した被験体では、食事によって体内に侵入したカルシウムを有効に格納することができない。このカルシウムは血流に侵入し、その後軟組織を往復する。副甲状腺は、特に、このカルシウムの流入に支配されて劇的に影響を受け、それによってＰＴＨの活性形態よりもむしろ、またはそれに加えて、ＰＴＨフラグメントを産生する。例えば、Mayer GP,et al.,Endocrinology 104:1778-1784(1979);D'Amour P,et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.74:525-532(1992);D'Amour P,et al.,J.Bone Miner.Res.11:1075-1085(1996);Cardinal,H.,et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.83:3839-44(1998)を参照のこと。したがって、無力性骨を有する被験体では、ＰＴＨフラグメントの濃度および産生が増加する。このことおよび他の関連する情報を考慮すると、特に全ＰＴＨの測定と組み合わせたＰＴＨフラグメントレベルの測定を使用して、無力性骨を有する被験体と正常な骨および高骨代謝回転率を有する被験体とを有効に区別することができる。
本発明に至る重要な発見は、無力性骨(adynamic bone)は、骨が機能停止するにつれてカルシウムおよびリン酸塩を格納する(buffer)能力を喪失することである。このような病態を罹患した被験体では、食事によって体内に侵入したカルシウムを有効に格納することができない。このカルシウムは血流に侵入し、その後軟組織を往復する。副甲状腺は、特に、このカルシウムの流入に支配されて劇的に影響を受け、それによってＰＴＨの活性形態よりもむしろ、またはそれに加えて、ＰＴＨフラグメントを産生する。例えば、Mayer GP,et al.,Endocrinology 104:1778-1784(1979);D'Amour P,et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.74:525-532(1992);D'Amour P,et al.,J.Bone Miner.Res.11:1075-1085(1996);Cardinal,H.,et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.83:3839-44(1998)を参照のこと。したがって、無力性骨を有する被験体では、ＰＴＨフラグメントの濃度および産生が増加する。このことおよび他の関連する情報を考慮すると、特に全ＰＴＨの測定と組み合わせたＰＴＨフラグメントレベルの測定を使用して、無力性骨を有する被験体と正常な骨および高骨代謝回転率を有する被験体とを有効に区別することができる。
本開示は、ＰＴＨレベルを測定するためのペプチド、抗体、方法、およびキットの提示におけるこれらの発見を含む。１つの好ましい実施形態では、本方法は、全ＰＴＨレベルと総ＰＴＨレベルとの比（総ＰＴＨレベルが、全ＰＴＨと、ＰＴＨ7〜84に加えて、ＰＴＨフラグメント（本明細書中に記載の他のＰＴＨフラグメントなど）とを含む）（すなわち、全ＰＴＨ／総ＰＴＨ比）を使用する。この比は、ＰＴＨ7〜84ペプチドから作製した抗体に特異的に結合する全ＰＴＨと、ＰＴＨフラグメントの測定を反映する総ＰＴＨレベルとを含むＰＴＨ比と比較して、総ＰＴＨ濃度の増加を含む。したがって、ＣＡＰ／ＰＴＨフラグメント比は、一般に、ＣＡＰ／（ＣＡＰ＋ＰＴＨ7〜84）比よりも低い。現在まで、ＰＴＨ比の予想される効果および治療効果は認識されていなかった。例えば、Martine-Esther Cohen Solal,et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.73:516-524(1991)（全ＰＴＨの測定が、「組織学型骨疾患の予想のためのＣ末端および中間領域アッセイよりも優れている」と結論づけている）を参照のこと。
１つの実施形態では、総ＰＴＨレベルを決定するための他の潜在的抗体に加えてＰＴＨ52〜84に特異的な抗体に加えてＰＴＨ44〜68に特異的な抗体を使用する総ＰＴＨアッセイを使用する。
本開示は、ＰＴＨレベル、ＰＴＨフラグメントレベル、および時折総ＰＴＨレベルを含むより治療的に予想されるＰＴＨ比も提供する。この比における総ＰＴＨレベルには、ＰＴＨ7〜84などの巨大なＰＴＨ Ｎ末端フラグメントに加えてＰＴＨフラグメントが含まれる。これらのＰＴＨフラグメントには、巨大な不活性フラグメントとして本開示のいずれかで言及されているＰＴＨフラグメントのカテゴリーが含まれるが、必ずしも本明細書中に記載のＣ末端およびＮ末端ＰＴＨフラグメントではない。本明細書中で提供されるように、本発明の総ＰＴＨ測定に含まれるＰＴＨフラグメントには、他のＰＴＨフラグメントに加えてＰＴＨ7〜84が含まれる。したがって、本発明のＰＴＨ比の増大の重要な態様は、総ＰＴＨアッセイがＮ末端、Ｃ末端、および中末端のＰＴＨフラグメントを測定するように被験体中の循環ＰＴＨフラグメントの大部分、より好ましくは全てのモニタリングを含む。関連する態様では、増大した比で測定されたフラグメントには、本明細書中に記載の他のＰＴＨフラグメントに加えてＰＴＨ7〜84が含まれる。
例えば、総ＰＴＨに対する全ＰＴＨから構成されるＰＴＨ比の増加（全ＰＴＨに加えてほとんどまたは全ての循環ＰＴＨフラグメントを測定）は、一般に、「総」ＰＴＨ（全ＰＴＨ＋ＰＴＨ7〜84などの巨大なＮ末端ＰＴＨフラグメントからなる）に対する全ＰＴＨを含む総ＰＴＨ比を測定するＰＴＨ比と比較して割合が低い。このより低い割合は、総ＰＴＨを含むＰＴＨ7〜84に加えたさらなるフラグメントの測定に起因する。以前のＰＴＨ総数は、一般に、ＰＴＨ7〜84に加えてＰＴＨフラグメントを含むＰＴＨ総数よりも少なかった。巨大なＮ末端フラグメント以外のＰＴＨフラグメントが認識されていないので、これらの総数は少ない。本発明は、循環Ｎ末端フラグメントに加えてＰＴＨフラグメントの測定に由来する比の予想および治療上の利点の増加に加えてＰＴＨの総数においてこの以前の欠点を認めている。
本発明で意図されるＰＴＨ比は、被験体が無形成骨症（ＡＤＮ）、軽度副甲状腺機能亢進症（軽度ＨＰＴ）、または重症副甲状腺機能亢進症（重症ＨＰＴ）に罹患しているかどうかを決定するためのカットオフ評価値を得るのに有用である。頻繁に、本発明の比は、初期診断に有用である。しかし、これらの比は、被験体治療のモニタリングおよび誘導に等しく有用であり得る。１つの好ましい実施形態では、本発明の比を、ＣＡＰおよび／または全ＰＴＨレベルの測定と組み合わせて使用する。以下の表１は、全ＰＴＨレベルおよびＰＴＨ1〜84対ＰＴＨ7〜84からなるＰＴＨ比に関する骨代謝回転率についての基準表を提供する。
理論に拘束されないが、現在の基準および実務を考慮すると、さらなるデータ（例えば、骨の組織学的情報および／またはさらなるフラグメント関連情報（本明細書中で提供する）が含まれる）と無関係には、３つの列挙した骨代謝回転率のカテゴリー間の決定および区別のための表１中の値および比のみに対する信頼性は根拠がない。
例示的比には、全ＰＴＨ（ｗＰＴＨ）、Ｃ末端ＰＴＨ（ｃＰＴＨ）、および中末端ＰＴＨフラグメント（ｍＰＴＨ）から構成されるＰＴＨパラメーターの変動物(variation)が含まれる。使用する抗体に依存して、これらのパラメーター間の交差反応性を証明することができる（そして修正することができる）。本開示の例示的比の非限定的なリストには、ｗＰＴＨ／ｃＰＴＨ、ｗＰＴＨ／ｍＰＴＨ、ｗＰＴＨ／（ｃＰＴＨ＋ｍＰＴＨ）、ｗＰＴＨ／（ｃＰＴＨ−ｗＰＴＨ）＋（ｍＰＴＨ−ｗＰＴＨ）、ｗＰＴＨ／（ｃＰＴＨ＋ｍＰＴＨ−ｗＰＴＨ）、ｗＰＴＨ／（ｗＰＴＨ＋ｍＰＴＨ＋ｃＰＴＨ）、ｃＰＴＨ／ｍＰＴＨ、ｍＰＴＨ／ｃＰＴＨ、ｃＰＴＨ／ｗＰＴＨ、ｍＰＴＨ／ｗＰＴＨなどが含まれる。当業者は、ＰＴＨ比の逆数およびこれらのパラメーターの他の組み合わせは、本発明の方法で等しく適切であることを認識する。さらに、ＣＡＰをＰＴＨ比パラメーターとして使用し、意図する比でＰＴＨレベル、総ＰＴＨレベル、および／またはＰＴＨフラグメントレベルと組み合わせて使用することができる。
例えば、以下の表２は、一連のＰＴＨ比カットオフ値を提供する。全ＰＴＨ（ｗＰＴＨ）、中末端ＰＴＨフラグメント（ｍＰＴＨ）、およびＣ末端ＰＴＨ（ｃＰＴＨ）フラグメントに特異的な抗体ならびに対応する組織学データを使用して、比カットオフの基準値を提供するＰＴＨレベルの生データを作成する。示すように、以下に示す各比を、ｃＰＴＨ、ｍＰＴＨ、および／またはｗＰＴＨに基づいて作成する。
表２が３つの各臨床指標のカットオフ範囲を示す一方で、それぞれの変動物も存在し得る。用語「約」は、カットオフ点も含み得る幾らか固有の変動物を有する特に好ましい値の範囲として各カットオフと共に使用する。当業者は、カットオフ点が上記値と異なり得るようにＰＴＨアッセイパラメーターを変化させることができる（このような変動物は本開示の範囲内に含まれる）と理解する。１つの実施形態では、カットオフ点は、指標についてのカットオフ中央値を示す。好ましい実施形態では、カットオフ点は、特定の指標を有する被験体の大部分または全てが含まれる範囲未満または範囲以上の範囲を示す。
ＡＤＮ透析患者の過剰治療を回避するために、透析ＡＤＮ患者と高骨代謝回転を罹患した患者とを非浸襲性に分類することができる必要が非常にある。ＡＤＮ透析患者の過剰治療(over treatment)は、現在使用されている方法で現在最も頻繁に起こっている。例えば、Zemplar(登録商標)およびCalcijex(登録商標)(Abbott Laboratories)を使用して、例えば、透析患者を治療している。使用および推奨されている治療プロトコール下で、これらの患者は、ＰＴＨレベル（ｗＰＴＨおよびＰＴＨフラグメントレベルが含まれる）の不正確な測定によって過剰治療のリスクが高い。例えば、ＡＤＮを罹患するようになるカルシウムベースのリン酸塩結合剤を使用して治療した透析患者の比率は、1995年から2000年の間にこのような患者の１２％から４８％に急増している。例えば、Malluche,H.H.,The Importance of Bone Health in ESRD:Out of the Frying Pan,Into the Fire?,World Congress on Nephrology,Berlin,Germany(June 2003)（未発表データに基づく）を参照のこと。この増加は、主に、透析患者の過剰治療に起因し、透析患者のこの過剰治療は、同様に、無効なＰＴＨレベル（全ＰＴＨレベルおよびＰＴＨフラグメントレベルが含まれる）のモニタリングに起因することを前提とする。さらに、Ｋ／ＤＯＱＩは、ＡＤＮ透析患者とＨＢＴ透析患者との分類に有用な唯一のマーカーとして全ＰＴＨを推奨する。K/DOQI Clinical Practice Guidelines for Bone Metabolism and Disease in Chronic Kidney Disease,Draft Guideline Statements and Treatment Algorithms(February 2003)を参照のこと。しかし、全ＰＴＨレベルは、一貫してＡＤＮ透析患者とＨＢＴ透析患者とを分類できない。Qi,Q,et al.,Am.J.Kidney Dis.26:622-31(1995);Quarles,LD,et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.75:145-150(1992)を参照のこと。このようなガイドラインは過剰治療現象を広めるようであることが本明細書中で認識される。したがって、本発明の組成物および方法は、全ＰＴＨレベルのみの測定によるよりもむしろＰＴＨ比の結果によるＡＤＮ透析患者とＨＢＴ透析患者との区別の有効性ならびに腎疾患、骨粗鬆症、および／または透析患者の通常の臨床管理のためのその使用を例示する。
〔Ｄ．ＰＴＨアッセイの場所〕
本発明で意図される方法を、種々の施設および種々の事業体で行うことができる。しかし、一般に、本発明の方法および材料は、医療施設で供することができる。頻繁に、本発明の方法（例えば、本明細書中に記載のＰＴＨレベルおよび比の決定およびモニタリング）を、介護施設(care provider)または臨床検査室によって被験体の疾患または障害の臨床管理で使用する。本明細書中で使用される、「医療施設」には、臨床検査室、診療所、病院、健康管理組織の施設、および外来診療施設、介護および被験体の試験に有用な種々の他の非伝統的施設のうちの１つが含まれる。
本発明で意図される方法を、種々の施設および種々の事業体で行うことができる。しかし、一般に、本発明の方法および材料は、医療施設で供することができる。頻繁に、本発明の方法（例えば、本明細書中に記載のＰＴＨレベルおよび比の決定およびモニタリング）を、介護施設(care provider)または臨床検査室によって被験体の疾患または障害の臨床管理で使用する。本明細書中で使用される、「医療施設」には、臨床検査室、診療所、病院、健康管理組織の施設、および外来診療施設、介護および被験体の試験に有用な種々の他の非伝統的施設のうちの１つが含まれる。
〔Ｅ．ＰＴＨ配列〕
本開示は、種々の哺乳動物起源の副甲状腺ホルモンのペプチド、ペプチドフラグメント、ＰＴＨまたはＰＴＨフラグメントペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに全ＰＴＨおよび／またはＰＴＨフラグメントに特異的に結合する抗体の使用を意図する。例えば、Caetano,A.R.,et al.,Equus Genome Res.9(12):1239-1249(1999)（ウマ）、米国特許出願公開US 2002/0110871 A1（ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ）、米国特許出願番号09/344,639号、および同第09/231,422号（ヒト）を参照のこと。非限定的な例のために、以下の供給源に由来し、且つ以下のペプチド配列を有するＰＴＨを本明細書中で意図する。
本開示は、種々の哺乳動物起源の副甲状腺ホルモンのペプチド、ペプチドフラグメント、ＰＴＨまたはＰＴＨフラグメントペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに全ＰＴＨおよび／またはＰＴＨフラグメントに特異的に結合する抗体の使用を意図する。例えば、Caetano,A.R.,et al.,Equus Genome Res.9(12):1239-1249(1999)（ウマ）、米国特許出願公開US 2002/0110871 A1（ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ）、米国特許出願番号09/344,639号、および同第09/231,422号（ヒト）を参照のこと。非限定的な例のために、以下の供給源に由来し、且つ以下のペプチド配列を有するＰＴＨを本明細書中で意図する。
ヒトＰＴＨ1〜84（配列番号１）：ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＮ−ＬＥＵ−ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＡＳＮ−ＳＥＲ−ＭＥＴ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬＮ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＰＨＥ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＧＬＹ−ＳＥＲ−ＧＬＮ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＡＳＰ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＨＩＳ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＴＨＲ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＧＬＮ。
ラットヒトＰＴＨ1〜84（配列番号２）：ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＮ−ＬＥＵ−ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＡＬＡ−ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＭＥＴ−ＧＬＮ−ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬＮ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＰＨＥ−ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＶＡＬ−ＧＬＮ−ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＧＬＵ−ＧＬＹ−ＳＥＲ−ＴＹＲ−ＧＬＮ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＴＨＲ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＡＳＰ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＧＬＹ−ＡＳＮ−ＳＥＲ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＧＬＹ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＧＬＮ。
マウスヒトＰＴＨ1〜84（配列番号３）：ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＮ−ＬＥＵ−ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＡＬＡ−ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＭＥＴ−ＧＬＮ−ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬＮ−ＡＳＰ−ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＰＨＥ−ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＶＡＬ−ＧＬＮ−ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＧＬＹ−ＳＥＲ−ＨＩＳ−ＧＬＮ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−ＴＨＲ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＧＬＵ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＧＬＹ−ＡＳＮ−ＰＲＯ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＧＬＹ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＧＬＮ。
ウシヒトＰＴＨ1〜84（配列番号４）：ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＮ−ＰＨＥ−ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＭＥＴ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬＮ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＰＨＥ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＡＬＡ−ＳＥＲ−ＩＬＥ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＧＬＹ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＧＬＮ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＡＳＰ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＨＩＳ−ＧＬＮ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＩＬＥ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−ＧＬＮ。
イヌヒトＰＴＨ1〜84（配列番号５）：ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＮ−ＰＨＥ−ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＭＥＴ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬＮ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＰＨＥ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＡＬＡ−ＨＩＳ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＧＬＹ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＧＬＮ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＡＳＰ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＴＹＲ−ＧＬＮ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＴＨＲ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＧＬＮ。
ブタヒトＰＴＨ1〜84（配列番号６）：ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＮ−ＰＨＥ−ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬＮ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＰＨＥ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＡＬＡ−ＳＥＲ−ＩＬＥ−ＶＡＬ−ＨＩＳ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＳＥＲ−ＧＬＮ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＡＳＰ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＨＩＳ−ＧＬＮ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＩＬＥ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−ＧＬＮ。
ウマＰＴＨ1〜86（配列番号７）：ＬＹＳ−ＡＲＧ−ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＳＥＲ−ＧＬＵ−ＩＬＥ−ＧＬＮ−ＬＥＵ−ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＡＳＮ−ＳＥＲ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＡＲＧ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＬＥＵ−ＧＬＮ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＰＨＥ−ＩＬＥ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＩＬＥ−ＰＨＥ−ＨＩＳ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＳＥＲ−ＧＬＮ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＡＳＰ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＩＬＥ−ＧＬＵ−ＳＥＲ−ＨＩＳ−ＧＬＮ−ＸＸＸ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＳＥＲ−ＬＹＳ−ＴＨＲ−ＬＹＳ−ＳＥＲ−ＧＬＮ。
［ＶＩＩ．本発明実施の例示的形態］
本発明の開示では、ＰＴＨの多数の密接に類似した種依存性形態が存在することを念頭におくべきである（上記を参照のこと）。ｈＰＴＨのアミノ酸配列を、図１に示す。しかし、ラットＰＴＨ、ウシＰＴＨ、またはブタＰＴＨでは、例えば、ｈＰＴＨ配列中のいくつかのアミノ酸置換が認められる（例えば、配列番号１〜７を参照のこと）。本発明の目的のために、これらのＰＴＨを形成するために抗体または抗体フラグメントを交換可能に使用することができるにもかかわらず、ＰＴＨが測定される種に適合する配列を有するＰＴＨに特異性を有する抗体を使用することが好ましい。
本発明の開示では、ＰＴＨの多数の密接に類似した種依存性形態が存在することを念頭におくべきである（上記を参照のこと）。ｈＰＴＨのアミノ酸配列を、図１に示す。しかし、ラットＰＴＨ、ウシＰＴＨ、またはブタＰＴＨでは、例えば、ｈＰＴＨ配列中のいくつかのアミノ酸置換が認められる（例えば、配列番号１〜７を参照のこと）。本発明の目的のために、これらのＰＴＨを形成するために抗体または抗体フラグメントを交換可能に使用することができるにもかかわらず、ＰＴＨが測定される種に適合する配列を有するＰＴＨに特異性を有する抗体を使用することが好ましい。
〔Ａ．全ＰＴＨ免疫アッセイ〕
本発明の好ましい実施形態は、図２および３に示す、しばしばサンドイッチアッセイと呼ばれる免疫放射測定アッセイ１５（ＩＲＭＡ）である。このようなアッセイ（１０）で使用される要素は、固体支持体（１４）に付着した捕捉抗体（１２）、および（２０）に付着した、標識（１８）を有するシグナル抗体（１６）を含む。典型的には、図２に示すように、Ｃ末端ＰＴＨフラグメント（２２）に特異的な捕捉抗体を選択する一方で、標識抗体は、アデニルシクラーゼ活性ドメイン（２４）を含むイニシャル(initial)ｗＰＴＨペプチド配列に特異的である。しかし、図３に示すように、これらの抗体の特異性を逆にすることができる。
本発明の好ましい実施形態は、図２および３に示す、しばしばサンドイッチアッセイと呼ばれる免疫放射測定アッセイ１５（ＩＲＭＡ）である。このようなアッセイ（１０）で使用される要素は、固体支持体（１４）に付着した捕捉抗体（１２）、および（２０）に付着した、標識（１８）を有するシグナル抗体（１６）を含む。典型的には、図２に示すように、Ｃ末端ＰＴＨフラグメント（２２）に特異的な捕捉抗体を選択する一方で、標識抗体は、アデニルシクラーゼ活性ドメイン（２４）を含むイニシャル(initial)ｗＰＴＨペプチド配列に特異的である。しかし、図３に示すように、これらの抗体の特異性を逆にすることができる。
あるいは、従来の沈殿アッセイまたは濁度測定アッセイなどのｗＰＴＨが溶液から沈殿するか溶液中で識別される免疫アッセイを作製することができる。例えば、沈殿塊を形成するために少なくとも３つの抗体を使用することができる。イニシャルｗＰＴＨ配列抗体およびＣ末端抗体に加えて、Ｐｍの中間部分に付着する少なくとも第３の抗体を使用することができる。ｗＰＴＨと少なくとも３つの抗体との組み合わせ塊により、従来の技術によって測定することができる標識沈殿塊が形成される。
別の方法は、イニシャルｗＰＴＨ配列抗体をラテックス粒子などのコロイド状の固体支持体に結合させる。より詳細には、クロラミンＴでの酸化、１ｍＣｉの125Ｉ放射性同位体との室温で２５秒間のインキュベーション、およびメタ重硫酸ナトリウムとの反応により５０μｇのアフィニティ精製ヤギ抗（１〜６）ＰＴＨ抗体(Scantibodies Laboratory,Inc.,Santee California,U.S.A.)のヨード化によってシグナル抗体を作製することができる。製造者の説明書に従ったＰＤ−１０脱塩カラム(Pharmacia,Uppsala,Sweden)へのヨード化混合物の通過によって非組み込み125Ｉ放射性同位体を１２５−１−ヤギ抗（１〜６）ＰＴＨシグナル抗体から分離する。脱塩カラムから回収した画分を、ガンマカウンターで測定し、１２５−１−ヤギ抗（１〜６）ＰＴＨ抗体を示す画分をプールし、約３００，０００ＤＰＭ（壊変毎分）／１００μｌの濃度に希釈する。この溶液は、全ＰＴＨ ＩＲＭＡで使用される追跡溶液である。
当業者に公知の受動的吸収技術を用いたアフィニティ精製ヤギ抗ＰＴＨ３９〜８４抗体(Scantibodies Laboratory,Inc.,Santee,California,U.S.A.)と１２×７５ｍｍポリスチレンチューブ(Nunc,Denmark)への付着によって捕捉抗体コーティングチューブを作製することができる。チューブを空にして乾燥させ、２０個の固相抗体コーティングチューブを作製する。
サンプルの全ＰＴＨアッセイを行うために、２００μｌのヒト血清サンプルを固相抗体コーティングチューブに添加する。各チューブに、１００μｌのトレーサー溶液（標識ヤギ抗（１〜６）ＰＴＨシグナル抗体）を添加する。チューブ２５を、１７０ｒｐｍで２０〜２２時間浸透しながら室温でインキュベートする。この間に、｛固相ヤギ抗（３９−８４）ＰＴＨ抗体｝−−｛全ＰＴＨ｝−−｛１２５−１−ヤギ抗（１〜６）ＰＴＨ抗体｝のサンドイッチを形成する免疫化学反応が起こる。このインキュベーション後、試験管を蒸留水で洗浄する。固相の放射能（その量がｗＰＴＨの存在量に対応する）を、ガンマカウンターを使用して測定する。サンプルの放射能データを、サンプル中の全ＰＴＨ濃度を確認することができるように、標準およびコントロール由来の結果ならびにコンピュータソフトウェアの使用による従来の分析によって処理する。図４は、このようなアッセイの検量線を示す。
〔Ｂ．イニシャル全ＰＴＨ配列ペプチド〕
上記アッセイでシグナル抗体を作製するために、最初に、ヒトＰＴＨ1〜8、ラットＰＴＨ1〜8、マウスＰＴＨ1〜8、ウシＰＴＨ1〜8、イヌＰＴＨ1〜8、ブタＰＴＨ1〜8、ウマＰＴＨ1〜8、ヒトＰＴＨ1〜15、ラットＰＴＨ1〜15、マウスＰＴＨ1〜15、ウシＰＴＨ1〜15、イヌＰＴＨ1〜15、ブタＰＴＨ1〜15、またはウマＰＴＨ1〜15のいずれかに対応する合成ＰＴＨペプチドまたは共通配列中の少なくとも４つのアミノ酸を作製する。理論に拘束されないが、適切な合成ＰＴＨペプチドは、上記例示のＰＴＨ1〜8を超えて、すなわち、ＰＴＨ1〜84の８４位まで伸張し得る。例えば、任意の種々のＰＴＨのＮ末端フラグメントは、この態様のための適切なイニシャルペプチド配列である。選択されたペプチドは、アッセイの作製において２つの役割（第１に、シグナル抗体または捕捉抗体のためのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の供給源の作製のための特異的供給源として、第２に、所望のシグナル抗体または捕捉抗体の単離のためのアフィニティ精製手段の一部として）を果たすことができる。
上記アッセイでシグナル抗体を作製するために、最初に、ヒトＰＴＨ1〜8、ラットＰＴＨ1〜8、マウスＰＴＨ1〜8、ウシＰＴＨ1〜8、イヌＰＴＨ1〜8、ブタＰＴＨ1〜8、ウマＰＴＨ1〜8、ヒトＰＴＨ1〜15、ラットＰＴＨ1〜15、マウスＰＴＨ1〜15、ウシＰＴＨ1〜15、イヌＰＴＨ1〜15、ブタＰＴＨ1〜15、またはウマＰＴＨ1〜15のいずれかに対応する合成ＰＴＨペプチドまたは共通配列中の少なくとも４つのアミノ酸を作製する。理論に拘束されないが、適切な合成ＰＴＨペプチドは、上記例示のＰＴＨ1〜8を超えて、すなわち、ＰＴＨ1〜84の８４位まで伸張し得る。例えば、任意の種々のＰＴＨのＮ末端フラグメントは、この態様のための適切なイニシャルペプチド配列である。選択されたペプチドは、アッセイの作製において２つの役割（第１に、シグナル抗体または捕捉抗体のためのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の供給源の作製のための特異的供給源として、第２に、所望のシグナル抗体または捕捉抗体の単離のためのアフィニティ精製手段の一部として）を果たすことができる。
簡単に述べれば、このようなペプチドを、αアミノ保護基としてＦｍｏｃ（９−フルオロニルメトキシカルボニル）を使用したApplied Biosystems,Inc.(Foster City,California,U.S.A.)モデル４３１自動化ペプチド合成機で合成することができる。全てのアミノ酸および溶媒は、Applied Biosystemsから入手し、これらは合成グレードである。合成後、ペプチドを樹脂から切断し、６．６７％フェノール、４．４％（ｖ／ｖ）チオアニソール、および８．８％エタンジチオールを含むトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む切断カクテル２０を使用して側鎖を脱ブロッキングする。切断ペプチドを沈殿させ、冷ジエチルエーテルで数回洗浄する。次いで、これを水に溶解し、凍結乾燥させる。粗ペプチドを、アミノ酸分析(Waters PICO-TAG System,Boston,Massachusetts,U.S.A.)および移動緩衝液として０．１％ＴＦＡ水溶液および２５ ９９．９％アセトニトリルの０．１％ＴＦＡ溶液を使用したＶＹＤＡＣ（商標）Ｃ８カラムを使用した逆相ＨＰＬＣに供する。ペプチドがさらなる使用に適切であるということの証拠として、適切なアミノ酸組成物と共に１つの主要なピークが存在する。
次いで、製造者の説明書にしたがって、得られたペプチドを架橋アガロースビーズ(Pharmacia,Uppsala,Swedenの活性化Sepharose4B)に付着させる。ビーズ上にイニシャルペプチド配列を準備して、ｗＰＴＨ免疫アッセイのためのイニシャル配列抗体を単離するためにポリクローナル抗体血清供給源をアフィニティ精製することができる。
特に好ましい実施形態では、イニシャル配列ＰＴＨ抗体は、イニシャルＰＴＨペプチド、Ｃ末端、および中末端のＰＴＨペプチドを首尾よく区別し、その結果イニシャル配列ＰＴＨペプチドに特異的に結合する。
別の好ましい実施形態では、上記方法を使用して、中末端およびＣ末端のＰＴＨペプチドフラグメントを合成する。これらのペプチドの合成後、上記方法を使用して、中末端ＰＴＨ抗体および／またはＣ末端ＰＴＨ抗体を作製および単離する。好ましい実施形態では、中末端ＰＴＨ抗体は、中末端ＰＴＨペプチドフラグメントに特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、Ｃ末端ＰＴＨ抗体は、Ｃ末端ＰＴＨペプチドフラグメントに特異的に結合する。
〔Ｃ．イニシャル配列の全ＰＴＨ抗体〕
別の実施形態では、アフィニティ精製イニシャル配列全ＰＴＨ抗体を作製するために、最初に、ヤギへの注射のための免疫原の一部として上記のインタクトなＮ末端を有するＰＴＨ配列ペプチドを使用する。例えば、ＰＴＨ1〜34からＰＴＨ1〜84までの範囲のＰＴＨペプチドを使用することができる。ペプチドを、注射用免疫原として単独で使用するか、典型的には約５，０００〜１０，０００，０００との間の分子量を有する非ＰＴＨペプチドに組み込むか、ｗＰＴＨ完全配列の一部として使用することができる。免疫原を、軽油、Arlacel界面活性剤、および不活化マイコバクテリウムである結核菌の混合物である同体積のフロイント完全アジュバントと混合する。得られた混合物をホモジナイズして水／油乳濁液を作製し、これを一次免疫のために動物（典型的には、ヤギ）に注射する。免疫原の用量は、約５０〜４００μｇである。これらのその後の注射でマイコバクテリウムである結核菌を使用しないこと以外は、同用量の免疫原複合体を毎月ヤギに注射する。２０の一次免疫から約３ヵ月後にヤギを毎日採血する。血清（または抗血清）は、遠心分離およびイニシャル配列ＰＴＨ抗体中で豊富な抗血清の取り出しによる血液由来の赤血球の分離による各採血に由来する。
別の実施形態では、アフィニティ精製イニシャル配列全ＰＴＨ抗体を作製するために、最初に、ヤギへの注射のための免疫原の一部として上記のインタクトなＮ末端を有するＰＴＨ配列ペプチドを使用する。例えば、ＰＴＨ1〜34からＰＴＨ1〜84までの範囲のＰＴＨペプチドを使用することができる。ペプチドを、注射用免疫原として単独で使用するか、典型的には約５，０００〜１０，０００，０００との間の分子量を有する非ＰＴＨペプチドに組み込むか、ｗＰＴＨ完全配列の一部として使用することができる。免疫原を、軽油、Arlacel界面活性剤、および不活化マイコバクテリウムである結核菌の混合物である同体積のフロイント完全アジュバントと混合する。得られた混合物をホモジナイズして水／油乳濁液を作製し、これを一次免疫のために動物（典型的には、ヤギ）に注射する。免疫原の用量は、約５０〜４００μｇである。これらのその後の注射でマイコバクテリウムである結核菌を使用しないこと以外は、同用量の免疫原複合体を毎月ヤギに注射する。２０の一次免疫から約３ヵ月後にヤギを毎日採血する。血清（または抗血清）は、遠心分離およびイニシャル配列ＰＴＨ抗体中で豊富な抗血清の取り出しによる血液由来の赤血球の分離による各採血に由来する。
所望のイニシャル配列全ＰＴＨ抗体の抗血清を精製するために、ＰＴＨ配列ペプチド（例えば、ＰＴＨ1〜5からＰＴＨ1〜15までの範囲のＰＴＨペプチド）に結合した上記ビーズと共に分離カラムを充填し、カラムを洗浄し、０．０１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化する。抗血清をカラムにロードし、イニシャル配列ＰＴＨ特異性を示さない抗体を除去するために０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄する。結合した特異的ヤギイニシャル配列ＰＴＨポリクローナル抗体を、０．１Ｍグリシンヒドロクロリド緩衝液（ｐＨ２．５）溶離液のカラム通過によって任意選択的にカラム中にＰＴＨ1〜5〜ＰＴＨ1〜15を含む固相から溶離する。当業者に公知のように、１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の添加または０．０１Ｍ ＰＢＳとの緩衝液の交換のいずれかを使用してカラムから遊離した後に、溶離したポリクローナル抗体を中和する。ポリクローナル抗体を、２〜８℃で保存する。
別の実施形態では、アフィニティ精製抗（１〜６）ＰＴＨ抗体を作製するために、最初に、ヤギへの注射のための免疫原の一部として上記のように選択されたイニシャルＰＴＨ配列ペプチドを使用する。ペプチドを、典型的には約５，０００〜１０，０００，０００との間の分子量を有する非ＰＴＨペプチドに組み込まれた注射用免疫原またはｗＰＴＨ完全配列の一部のいずれかとして使用することができる。免疫原を、軽油、Arlacel界面活性剤、および不活化マイコバクテリウムである結核菌の混合物である同体積のフロイント完全アジュバントと混合する。得られた混合物をホモジナイズして水／油乳濁液を作製し、これを一次免疫のために動物（典型的には、ヤギ）に注射する。免疫原の用量は、約５０〜４００μｇである。これらのその後の注射でマイコバクテリウムである結核菌を使用しないこと以外は、同用量の免疫原複合体を毎月ヤギに注射する。２０の一次免疫から約３ヵ月後にヤギを毎日採血する。血清（または抗血清）は、遠心分離および（１〜６）ＰＴＨ抗体中で豊富な抗血清の取り出しによる血液由来の赤血球の分離による各採血に由来する。
所望の（１〜６）ＰＴＨ抗体の抗血清を精製するために、イニシャルＰＴＨ配列ペプチドに結合した上記ビーズと共に分離カラムを充填し、カラムを洗浄し、０．０１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化する。抗血清をカラムにロードし、（１〜６）ＰＴＨ特異性を示さない抗体を除去するために０．０１ＭＰＢＳで洗浄する。結合した特異的ヤギ抗（１〜６）ＰＴＨポリクローナル抗体を、０．１Ｍグリシンヒドロクロリド緩衝液（ｐＨ２．５）溶離液のカラム通過によってカラム中にＰＴＨ1〜6を含む固相から溶離する。当業者に公知のように、１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の添加または０．０１ＭＰＢＳとの緩衝液の交換のいずれかを使用してカラムから遊離した後に、溶離したポリクローナル抗体を中和する。ポリクローナル抗体を、２〜８℃で保存する。
当業者は、上記実施には許容可能な変形形態が存在することを理解している。例えば、Harlow E,Lane D:Antibodies:A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1988;Kohler & Milstein,Nature,256:495-7(1975)を参照のこと。理論に束縛されないが、上記実施は、本明細書中に記載の選択されたＮ末端ＰＴＨ配列ペプチドを使用した他のＰＴＨ Ｎ末端抗体の産生に適切である。
特に好ましい実施形態では、イニシャル配列ＰＴＨ抗体は、イニシャルＰＴＨペプチド、Ｃ末端、および中末端のＰＴＨペプチドを首尾よく区別し、その結果イニシャル配列ＰＴＨペプチドに特異的に結合する。
〔Ｄ．Ｃ末端配列ＰＴＨ抗体〕
アフィニティ精製抗（６０〜８４）ＰＴＨ抗体を作製するために、最初に、ヤギへの注射のための免疫原の一部として上記のように選択されたＣ末端配列ペプチドを使用する。別の実施形態では、免疫原は、全ＰＴＨペプチド（例えば、ＰＴＨ1〜84）を含む。ペプチドを、典型的には、注射用免疫原として単独で使用するか、約５，０００〜１０，０００，０００との間の分子量を有する非ＰＴＨペプチドに組み込むことができる。免疫原を、軽油、Arlacel界面活性剤、および不活化マイコバクテリウムである結核菌の混合物である同体積のフロイント完全アジュバントと混合する。得られた混合物をホモジナイズして水／油乳濁液を作製し、これを一次免疫のために動物（典型的には、ヤギ）に注射する。免疫原の用量は、約５０〜４００μｇである。これらのその後の注射でマイコバクテリウムである結核菌を使用しないこと以外は、同用量の免疫原複合体を毎月ヤギに注射する。２０の一次免疫から約３ヵ月後にヤギを毎日採血する。血清（または抗血清）は、遠心分離および（６０〜８４）ＰＴＨ抗体を含む抗血清の取り出しによる血液由来の赤血球の分離による各採血に由来する。別の実施形態では、他のＰＴＨ抗体（例えば、全ＰＴＨ抗体）に加えて、（６０〜８４）ＰＴＨ抗体を含む抗血清を取り出す。
アフィニティ精製抗（６０〜８４）ＰＴＨ抗体を作製するために、最初に、ヤギへの注射のための免疫原の一部として上記のように選択されたＣ末端配列ペプチドを使用する。別の実施形態では、免疫原は、全ＰＴＨペプチド（例えば、ＰＴＨ1〜84）を含む。ペプチドを、典型的には、注射用免疫原として単独で使用するか、約５，０００〜１０，０００，０００との間の分子量を有する非ＰＴＨペプチドに組み込むことができる。免疫原を、軽油、Arlacel界面活性剤、および不活化マイコバクテリウムである結核菌の混合物である同体積のフロイント完全アジュバントと混合する。得られた混合物をホモジナイズして水／油乳濁液を作製し、これを一次免疫のために動物（典型的には、ヤギ）に注射する。免疫原の用量は、約５０〜４００μｇである。これらのその後の注射でマイコバクテリウムである結核菌を使用しないこと以外は、同用量の免疫原複合体を毎月ヤギに注射する。２０の一次免疫から約３ヵ月後にヤギを毎日採血する。血清（または抗血清）は、遠心分離および（６０〜８４）ＰＴＨ抗体を含む抗血清の取り出しによる血液由来の赤血球の分離による各採血に由来する。別の実施形態では、他のＰＴＨ抗体（例えば、全ＰＴＨ抗体）に加えて、（６０〜８４）ＰＴＨ抗体を含む抗血清を取り出す。
所望の（６０〜８４）ＰＴＨ抗体の抗血清を精製するために、Ｃ末端ＰＴＨ配列ペプチドに結合した上記ビーズと共に分離カラムを充填し、カラムを洗浄し、０．０１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化する。抗血清をカラムにロードし、（６０〜８４）ＰＴＨ特異性を示さない抗体を除去するために０．０１ＭＰＢＳで洗浄する。結合した特異的ヤギ抗（６０〜８４）ＰＴＨポリクローナル抗体を、０．１Ｍグリシンヒドロクロリド緩衝液（ｐＨ２．５）溶離液のカラム通過によってカラム中にＰＴＨ1〜6を含む固相から溶離する。当業者に公知のように、１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の添加または０．０１ＭＰＢＳとの緩衝液の交換のいずれかを使用してカラムから遊離した後に、溶離したポリクローナル抗体を中和する。ポリクローナル抗体を、２〜８℃で保存する。
当業者は、上記実施には許容可能な変形形態が存在することを理解している。例えば、Harlow E,Lane D:Antibodies:A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1988;Kohler & Milstein,Nature,256:495-7(1975)を参照のこと。理論に束縛されないが、上記実施は、本明細書中に記載の選択されたＣ末端ＰＴＨ配列ペプチドを使用した他のＰＴＨ Ｃ末端抗体の産生に適切である。例えば、上記のＰＴＨ53〜84、ＰＴＨ60〜84、ＰＴＨ64〜84、ＰＴＨ65〜84、ＰＴＨ39〜84、ＰＴＨ23〜84、ＰＴＨ19〜84などのＰＴＨペプチドおよび他のＣ末端ＰＴＨペプチド。
特に好ましい実施形態では、Ｃ末端ＰＴＨ抗体は、Ｃ末端ペプチド、両イニシャル配列、および中末端のＰＴＨペプチドを首尾よく区別し、その結果Ｃ末端ＰＴＨペプチドに特異的に結合する。
〔Ｅ．中末端配列ＰＴＨ抗体〕
アフィニティ精製抗（４４〜６８）ＰＴＨ抗体を作製するために、最初に、ヤギへの注射のための免疫原の一部として上記のように選択された中末端ＰＴＨ配列ペプチドを使用する。別の実施形態では、免疫原は、全ＰＴＨペプチド（例えば、ＰＴＨ1〜84）を含む。ペプチドを、典型的には、注射用免疫原として単独で使用するか、約５，０００〜１０，０００，０００との間の分子量を有する非ＰＴＨペプチドに組み込むことができる。免疫原を、軽油、Arlacel界面活性剤、および不活化マイコバクテリウムである結核菌の混合物である同体積のフロイント完全アジュバントと混合する。得られた混合物をホモジナイズして水／油乳濁液を作製し、これを一次免疫のために動物（典型的には、ヤギ）に注射する。免疫原の用量は、約５０〜４００μｇである。これらのその後の注射でマイコバクテリウムである結核菌を使用しないこと以外は、同用量の免疫原複合体を毎月ヤギに注射する。２０の一次免疫から約３ヵ月後にヤギを毎日採血する。血清（または抗血清）は、遠心分離および（４４〜６８）ＰＴＨ抗体を含む抗血清の取り出しによる血液由来の赤血球の分離による各採血に由来する。別の実施形態では、他のＰＴＨ抗体（例えば、全ＰＴＨ抗体）に加えて、（４４〜６８）ＰＴＨ抗体を含む抗血清を取り出す。
アフィニティ精製抗（４４〜６８）ＰＴＨ抗体を作製するために、最初に、ヤギへの注射のための免疫原の一部として上記のように選択された中末端ＰＴＨ配列ペプチドを使用する。別の実施形態では、免疫原は、全ＰＴＨペプチド（例えば、ＰＴＨ1〜84）を含む。ペプチドを、典型的には、注射用免疫原として単独で使用するか、約５，０００〜１０，０００，０００との間の分子量を有する非ＰＴＨペプチドに組み込むことができる。免疫原を、軽油、Arlacel界面活性剤、および不活化マイコバクテリウムである結核菌の混合物である同体積のフロイント完全アジュバントと混合する。得られた混合物をホモジナイズして水／油乳濁液を作製し、これを一次免疫のために動物（典型的には、ヤギ）に注射する。免疫原の用量は、約５０〜４００μｇである。これらのその後の注射でマイコバクテリウムである結核菌を使用しないこと以外は、同用量の免疫原複合体を毎月ヤギに注射する。２０の一次免疫から約３ヵ月後にヤギを毎日採血する。血清（または抗血清）は、遠心分離および（４４〜６８）ＰＴＨ抗体を含む抗血清の取り出しによる血液由来の赤血球の分離による各採血に由来する。別の実施形態では、他のＰＴＨ抗体（例えば、全ＰＴＨ抗体）に加えて、（４４〜６８）ＰＴＨ抗体を含む抗血清を取り出す。
所望の（４４〜６８）ＰＴＨ抗体の抗血清を精製するために、中末端ＰＴＨ配列ペプチドに結合した上記ビーズと共に分離カラムを充填し、カラムを洗浄し、０．０１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化する。抗血清をカラムにロードし、（４４〜６８）ＰＴＨ特異性を示さない抗体を除去するために０．０１ＭＰＢＳで洗浄する。結合した特異的ヤギ抗（４４〜６８）ＰＴＨポリクローナル抗体を、０．１Ｍグリシンヒドロクロリド緩衝液（ｐＨ２．５）溶離液のカラム通過によってカラム中にＰＴＨ1〜6を含む固相から溶離する。当業者に公知のように、１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の添加または０．０１ＭＰＢＳとの緩衝液の交換のいずれかを使用してカラムから遊離した後に、溶離したポリクローナル抗体を中和する。ポリクローナル抗体を、２〜８℃で保存する。
当業者は、上記実施には許容可能な変形形態が存在することを理解している。例えば、Harlow E,Lane D:Antibodies:A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1988;Kohler & Milstein,Nature,256:495-7(1975)を参照のこと。理論に束縛されないが、上記実施は、本明細書中に記載の選択された中末端ＰＴＨ配列ペプチドを使用した他のＰＴＨ中末端抗体の産生に適切である。例えば、上記のＰＴＨ44〜60、ＰＴＨ7〜53、ＰＴＨ12〜53、ＰＴＨ17〜53、ＰＴＨ22〜53、ＰＴＨ27〜53、ＰＴＨ30〜35、ＰＴＨ32〜53、ＰＴＨ32〜53、ＰＴＨ37〜53、ＰＴＨ42〜53、ＰＴＨ47〜53などのＰＴＨペプチドおよび他の中末端ＰＴＨペプチド。
特に好ましい実施形態では、中末端ＰＴＨ抗体は、中末端ペプチド、両イニシャル配列、およびＣ末端のＰＴＨペプチドを首尾よく区別し、その結果中末端ＰＴＨペプチドに特異的に結合する。
〔Ｆ．第２世代全ＰＴＨと総ＰＴＨとの比較アッセイ〕
ＰＴＨ正常者および慢性尿毒症を罹患した者の両方において、本発明の全ＩＲＭＡアッセイを、従来のインタクトなＰＴＨまたはＩ−ＰＴＨ免疫アッセイ（Allegro NicholsインタクトＰＴＨアッセイ（市販されており、Nichols Institute Diagnostics of San Juan Capistrano,California,U.S.A.によって作製される））と比較した。このＩ−ＰＴＨ免疫アッセイは、ＰＴＨ7〜84およびｗＰＴＨの両方を検出する（図１０を参照のこと）。
ＰＴＨ正常者および慢性尿毒症を罹患した者の両方において、本発明の全ＩＲＭＡアッセイを、従来のインタクトなＰＴＨまたはＩ−ＰＴＨ免疫アッセイ（Allegro NicholsインタクトＰＴＨアッセイ（市販されており、Nichols Institute Diagnostics of San Juan Capistrano,California,U.S.A.によって作製される））と比較した。このＩ−ＰＴＨ免疫アッセイは、ＰＴＨ7〜84およびｗＰＴＨの両方を検出する（図１０を参照のこと）。
図５は、本発明のｗＰＴＨ ＩＲＭＡおよび上記Ｉ−ＰＴＨアッセイの両方によってアッセイした健常被験体由来の３４の正常ヒト血清サンプルの結果を示す。どの場合においても、ＩＲＭＡによって検出されたｗｐｍレベルはＩ−ＰＴＨアッセイによって報告されたレベルよりも低く、Ｉ−ｐｍアッセイによって検出された妨害巨大非（１〜８４）ＰＴＨフラグメントの検出を回避する本発明のＩＲＭＡの能力を証明する（図１１を参照のこと）。図６は、どのようにしてこのような妨害が起こり得るのかを例示する。本発明のイニシャルＰＴＨペプチド配列に特異的ではないＮ末端ＰＴＨ特異的シグナル抗体は、ｗＰＴＨ（図６の上部）だけでなく、ＰＩＮ（巨大非（１〜８４）ＰＴＨフラグメント）（図６の下部）も検出することができる。
１５７人の慢性尿毒症慰患者のアッセイ結果の比較を、図７に示す。これらの患者由来の血清サンプルを、ｗＰＴＨ ＩＲＭＡおよび上記Ｉ−ＰＴＨアッセイを使用して測定した。どの場合においても、ｗＰＴＨレベルはＩ−ＰＴＨレベルよりも低い。
〔Ｇ．シクラーゼ活性ＰＴＨ／ＰＴＨフラグメント比アッセイ〕
本発明の別の好ましい実施形態は、しばしばサンドイッチアッセイと呼ばれる免疫放射測定アッセイ（ＩＲＭＡ）である。本明細書中に記載するように、このようなアッセイで使用される要素は、固体支持体に付着した捕捉抗体およびこれに付着した標識を有するシグナル抗体を含む。典型的には、本明細書中に記載のように、Ｃ末端ＰＴＨフラグメントに特異的な捕捉抗体を選択する一方で、標識抗体は中末端ＰＴＨペプチド配列に特異的である。しかし、これらの抗体の特異性を逆にすることができる。
本発明の別の好ましい実施形態は、しばしばサンドイッチアッセイと呼ばれる免疫放射測定アッセイ（ＩＲＭＡ）である。本明細書中に記載するように、このようなアッセイで使用される要素は、固体支持体に付着した捕捉抗体およびこれに付着した標識を有するシグナル抗体を含む。典型的には、本明細書中に記載のように、Ｃ末端ＰＴＨフラグメントに特異的な捕捉抗体を選択する一方で、標識抗体は中末端ＰＴＨペプチド配列に特異的である。しかし、これらの抗体の特異性を逆にすることができる。
あるいは、従来の沈殿アッセイまたは濁度測定アッセイなどのＰＴＨフラグメントが溶液から沈殿するか溶液中で識別される免疫アッセイを作製することができる。例えば、沈殿塊を形成するために少なくとも２つまたはそれ以上の抗体を使用することができる。これらの抗体は、ＰＴＨのＮ末端、Ｃ末端、および／または中末端部分を特異的に有する。ＰＴＨフラグメントと抗体との組み合わせ塊により、従来の技術によって測定することができる標識沈殿塊が形成される。
別の方法は、Ｃ末端ＰＴＨ配列抗体をラテックス粒子などのコロイド状の固体支持体に結合させる。さらに、クロラミンＴでの酸化、１ｍＣｉの125Ｉ放射性同位体との室温で２５秒間のインキュベーション、およびメタ重硫酸ナトリウムとの反応により５０μｇのアフィニティ精製ヤギ抗（７〜５３）ＰＴＨ抗体のヨード化によってシグナル抗体を作製することができる。製造者の説明書に従ったＰＤ−１０脱塩カラム(Pharmacia,Uppsala,Sweden)へのヨード化混合物の通過によって非組み込み125Ｉ放射性同位体を１２５−１−ヤギ抗（７〜５３）ＰＴＨシグナル抗体から分離する。脱塩カラムから回収した画分を、ガンマカウンターで測定し、１２５−１−ヤギ抗（７〜５３）ＰＴＨ抗体を示す画分をプールし、約３００，０００ＤＰＭ（壊変毎分）／１００μｌの濃度に希釈する。この溶液は、ＰＴＨアッセイで使用される追跡溶液である。
アフィニティ精製ヤギ抗（１２−５３）ＰＴＨ抗体、精製ヤギ抗（１７−５３）ＰＴＨ抗体、精製ヤギ抗（２２−５３）ＰＴＨ抗体、精製ヤギ抗（２７−５３）ＰＴＨ抗体、精製ヤギ抗（３２−５３）ＰＴＨ抗体、精製ヤギ抗（３７−５３）ＰＴＨ抗体、精製ヤギ抗（４２−５３）ＰＴＨ抗体、および精製ヤギ抗（４７−５３）ＰＴＨ抗体などを使用して、他のシグナル抗体を提供することもできる。本明細書中に記載の他の中末端ＰＴＨペプチドフラグメントおよびエピトープに特異的な抗体も意図される。任意選択的に、異なるＰＴＨ部分に特異的な抗体フラグメントを、異なるヤギを使用して獲得し、ＥＬＩＳＡ方法を使用して、最適な抗体の作製および使用を決定することができる。例えば、Harlow E,Lane D:Antibodies:A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1988を参照のこと。
当業者に公知の受動的吸収技術を用いたアフィニティ精製ヤギ抗（３９〜８４）ＰＴＨ抗体と１２×７５ｍｍポリスチレンチューブ(Nunc,Denmark)への付着によって捕捉抗体コーティングチューブを作製することができる。チューブを空にして乾燥させ、２０個の固相抗体コーティングチューブを作製する。本発明の方法は、任意の種々のＣ末端ＰＴＨ抗体を有する固相抗体コーティングチューブの作製にも有用である。例えば、ＰＴＨ40〜84に特異的な作製された抗体（ＰＴＨ60〜84およびＰＴＨ65〜84に特異的な抗体の範囲）は、本発明で有用である。当業者は、捕捉抗体および標識／シグナル抗体に対する特異性を逆にすることができると理解している。
これらの特異的抗体の選択を使用して、無力性骨代謝回転を有する患者由来のサンプルをアッセイすることができる。１つの例では、５０〜１００ｍｌの血液サンプルを、無力性低骨代謝回転を罹患した被験体から採取する。次いで、サンプルを、上記の捕捉抗体および標識抗体を使用した多重サンドイッチアッセイに供する。各アッセイは、サンプル中に存在する１つまたは複数のＰＴＨフラグメントに加えて、全ＰＴＨレベルを決定する。次いで、全ＰＴＨレベルを、ＰＴＨフラグメントレベルおよび総ＰＴＨレベルの種々の順列と比較する。次いで、比較の結果を、患者の対応する骨組織学データに照らして考慮して、骨代謝回転率を予想する１つまたは複数の比較スキームを決定する。このアッセイの実施によって得られた比の結果を表１に示し、上文にさらに記載する。
ＰＴＨ比により、被験体の一定の骨代謝回転率が予想される。本開示は、さらなるＰＴＨフラグメントがＰＴＨ7〜84を超えてサンプル中に存在し、しばしば骨代謝回転率に影響を与え得ることを認識する。したがって、本発明の組成物、キット、および方法は、被験体の治療および予想上の利点に関連する、ＰＴＨ7〜84に加えてＰＴＨフラグメントの計上に特に有用である。理論に拘束されないが、この発見の１つの構成要素は、循環巨大ＰＴＨフラグメントの一部が不活性であるにも関わらず、他方は全ＰＴＨによって示された骨代謝回転率に対する拮抗効果を示すという所見に一部例示される。したがって、特定のアッセイにおける循環ＰＴＨフラグメントの全部または大部分は結果のばらつきを減少させ、その治療、診断、および予想での利用可能性が増大する。
〔Ｈ．臨床用途〕
本発明のｗＰＴＨおよびＰＩＮアッセイを、１８８人の臨床状況で使用した。群は、正常な健常副甲状腺を有する３１人および継続的に透析を受けている慢性尿毒症を罹患した１５７人を含んでいた。各患者から血液サンプルを採取し、Scantibodies Laboratory,Inc.のｗＰＴＨアッセイおよび総ＰＴＨ値が得られるNichols InstituteのＩ−ＰＴＨアッセイを使用してアッセイした。
本発明のｗＰＴＨおよびＰＩＮアッセイを、１８８人の臨床状況で使用した。群は、正常な健常副甲状腺を有する３１人および継続的に透析を受けている慢性尿毒症を罹患した１５７人を含んでいた。各患者から血液サンプルを採取し、Scantibodies Laboratory,Inc.のｗＰＴＨアッセイおよび総ＰＴＨ値が得られるNichols InstituteのＩ−ＰＴＨアッセイを使用してアッセイした。
表３は、透析を受けている慢性尿毒症患者由来のｗＰＴＨ、ＰＩＮ、および１０回の総ＰＴＨアッセイの個別および比較した結果を示す。
表４は、健常者由来のｗＰＴＨアッセイ、ＰＩＮアッセイ、および総ＰＴＨアッセイの個別および比較の結果を示す。
明確に、これらの２群の中央値における統計的有意差は、これらのアッセイの単独使用またはその各値の比較によって２群を区別することができることを証明する。
〔Ｉ．「全」ＰＴＨ ＩＲＭＡアッセイの特徴づけ〕
この新規の全ＰＴＨ二部位アッセイ(Scantibodies, Laboratories,Santee,CA,USA)およびＰＴＨ分子の３９〜８４領域を認識する抗体を最初に使用する。ヤギから産生してアフィニティ精製したこの抗体は、相対的に過剰に存在し、ポリスチレンコーティングチューブに固定させる。第２の抗体（これもヤギから産生した）もアフィニティ精製し、これはヒトＰＴＨ分子の最初の６アミノ酸（１〜６；Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ）のみを認識する（図１）。この抗ｈＰＴＨアッセイは、標準として合成ヒトＰＴＨ１〜８４を使用し、検出下限は約１〜２ｐｇ／ｍＬである。正常値は、５から３５ｐｇ／ｍＬまでの範囲である。変動のアッセイ間およびアッセイ内の係数は、２％〜７％との間であることが見出され、回収率は９６％から１００％までであった。全ＰＴＨアッセイを、Nichols Institute(I-Nichols,San Jan Capistrano,CA.USA)から購入したインタクトなＰＴＨアッセイと比較した。合成ヒトＰＴＨ１〜８４および７〜８４を、Bachem(Torrance,CA USA)から購入した。ｈＰＴＨ１〜８４および非（１〜８４）ＰＴＨの循環レベルを評価するために、透析前のヘパリン処理血液サンプルを、１．２年〜７．５年の長期血液透析を継続している２８人の患者および１４人の腎移植患者（１〜６年）から得た。
この新規の全ＰＴＨ二部位アッセイ(Scantibodies, Laboratories,Santee,CA,USA)およびＰＴＨ分子の３９〜８４領域を認識する抗体を最初に使用する。ヤギから産生してアフィニティ精製したこの抗体は、相対的に過剰に存在し、ポリスチレンコーティングチューブに固定させる。第２の抗体（これもヤギから産生した）もアフィニティ精製し、これはヒトＰＴＨ分子の最初の６アミノ酸（１〜６；Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ）のみを認識する（図１）。この抗ｈＰＴＨアッセイは、標準として合成ヒトＰＴＨ１〜８４を使用し、検出下限は約１〜２ｐｇ／ｍＬである。正常値は、５から３５ｐｇ／ｍＬまでの範囲である。変動のアッセイ間およびアッセイ内の係数は、２％〜７％との間であることが見出され、回収率は９６％から１００％までであった。全ＰＴＨアッセイを、Nichols Institute(I-Nichols,San Jan Capistrano,CA.USA)から購入したインタクトなＰＴＨアッセイと比較した。合成ヒトＰＴＨ１〜８４および７〜８４を、Bachem(Torrance,CA USA)から購入した。ｈＰＴＨ１〜８４および非（１〜８４）ＰＴＨの循環レベルを評価するために、透析前のヘパリン処理血液サンプルを、１．２年〜７．５年の長期血液透析を継続している２８人の患者および１４人の腎移植患者（１〜６年）から得た。
（１．インビトロ研究）
骨芽細胞株。２つのペプチド（ＨＰＴＨ１〜８４および７〜８４）の生物学的結果を比較するために、骨芽細胞表現型を有し、且つＰＴＨに応答してｃＡＭＰ産生が増加することが公知のラット(rate)骨肉種細胞株ＲＯＳ／１７．２において細胞内ｃＡＭＰ産生を測定した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ Ｆ１２培地で培養した。細胞を、３０，０００細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートにプレートし、コンフルエンスまで成長させた。細胞を３７℃のＫＨＭＳ緩衝液（ＫＣＩ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ2 １．２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ4 １．２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ １００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨＣＯ3 ３７ｍｍｏｌ／Ｌ、およびグルコース１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．５））で３回洗浄した。イソブチル−１メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）１．０ｍｍｏｌ／Ｌおよび種々の濃度（１０-11〜１０-8ｍｏｌ／Ｌ）のｈＰＴＨ１〜８４またはｈＰＴＨ７〜８４を含む５００μＬのＫＨＭＳ緩衝液（３７℃）を使用して、ｃＡＭＰ産生を測定した。５分間のインキュベーション後、１００μＬの１．８ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸(pechloric acid)を添加した。室温で５分間のさらなるインキュベーション後、１００μＬの３ｍｏｌ／ＫＨＣＯ3を添加して酸を中和した。サンプルを３００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清ｃＡＭＰについてアッセイした（２６）。
骨芽細胞株。２つのペプチド（ＨＰＴＨ１〜８４および７〜８４）の生物学的結果を比較するために、骨芽細胞表現型を有し、且つＰＴＨに応答してｃＡＭＰ産生が増加することが公知のラット(rate)骨肉種細胞株ＲＯＳ／１７．２において細胞内ｃＡＭＰ産生を測定した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ Ｆ１２培地で培養した。細胞を、３０，０００細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートにプレートし、コンフルエンスまで成長させた。細胞を３７℃のＫＨＭＳ緩衝液（ＫＣＩ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ2 １．２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ4 １．２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 １．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ １００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨＣＯ3 ３７ｍｍｏｌ／Ｌ、およびグルコース１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．５））で３回洗浄した。イソブチル−１メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）１．０ｍｍｏｌ／Ｌおよび種々の濃度（１０-11〜１０-8ｍｏｌ／Ｌ）のｈＰＴＨ１〜８４またはｈＰＴＨ７〜８４を含む５００μＬのＫＨＭＳ緩衝液（３７℃）を使用して、ｃＡＭＰ産生を測定した。５分間のインキュベーション後、１００μＬの１．８ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸(pechloric acid)を添加した。室温で５分間のさらなるインキュベーション後、１００μＬの３ｍｏｌ／ＫＨＣＯ3を添加して酸を中和した。サンプルを３００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清ｃＡＭＰについてアッセイした（２６）。
ヒト副甲状腺中のＰＴＨの分析。ヒト副甲状腺を、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水中に入れ、副甲状腺切除術の３０分以内に処理した。副甲状腺組織のアリコートを切断し、秤量し、１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｏｌ／Ｌ ＤＬ−ジチオスレイトール、および完全なＴＭプロテアーゼインヒビターカクテル(Boehringer-Mannheim,Mannheim,Germany)を含む５００μＬの緩衝液中でホモジナイズした。ホモジネートを、それぞれ０℃で３０秒間にて３回超音波処理し、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。１〜８４ＰＴＨ、非（１〜８４）ＰＴＨ、および総タンパク質の測定を行うまで、上清を−７０℃で維持した。
（２．インビボ研究）
血漿カルシウム上昇性応答。体重が２２５ｇ〜２５０ｇの正常な雌Sprague-Dawleyラット(Harlan,Indianapolis,IN,USA)の副甲状腺を切除し（ＰＴＸ）、０．０２％カルシウム食を与えた。一晩の絶食後の血漿カルシウムが７．０ｍｇ／ｄＬ未満のラットが研究に含まれた。２０μｇの用量のｈＰＴＨ１〜８４または７〜８４を、ＰＴＸラットを、各３０分間隔で５μｇを４回（０、３０、６０、および９０分）ＰＴＸラットに腹腔内投与した。コントロール研究のために、ラットに賦形剤（生理食塩水）のみを投与した。０、６０、９０、および１２０分後に尾静脈から血液を採取した。競合実験のために、ｈＰＴＨ１〜８４の各注射前にラットにｈＰＴＨ７〜８４を１０分間注射した。ｈＰＴＨ７〜８４／ｈＰＴＨ１〜８４のモル比は１：１であった。
血漿カルシウム上昇性応答。体重が２２５ｇ〜２５０ｇの正常な雌Sprague-Dawleyラット(Harlan,Indianapolis,IN,USA)の副甲状腺を切除し（ＰＴＸ）、０．０２％カルシウム食を与えた。一晩の絶食後の血漿カルシウムが７．０ｍｇ／ｄＬ未満のラットが研究に含まれた。２０μｇの用量のｈＰＴＨ１〜８４または７〜８４を、ＰＴＸラットを、各３０分間隔で５μｇを４回（０、３０、６０、および９０分）ＰＴＸラットに腹腔内投与した。コントロール研究のために、ラットに賦形剤（生理食塩水）のみを投与した。０、６０、９０、および１２０分後に尾静脈から血液を採取した。競合実験のために、ｈＰＴＨ１〜８４の各注射前にラットにｈＰＴＨ７〜８４を１０分間注射した。ｈＰＴＨ７〜８４／ｈＰＴＨ１〜８４のモル比は１：１であった。
リン酸尿症応答。軽い麻酔下でのクリアランス研究のために、２２５ｇ〜２５０ｇの正常な雌Sprague-Dawleyラットを準備した。ポリエチレンカテーテル（ＰＥ５０）を、採血および血圧測定(Blood Pressure Analyzer;Micro-Medic,Inc.,Louisville,KY,USA)のために大腿動脈(femoeral artery)に挿入し、注入のために大腿静脈に挿入し、採尿のために膀胱に挿入した。ラットをPlexiglas（登録商標）ホルダーに入れ、１時間麻酔の影響から回復させた。５０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬとの間の血漿イヌリンレベルを達成するために、３分間にわたりプライミング用量（０．６ｍＬ）の化学イヌリンを含む生理食塩水を投与した。このレベルを維持するためのイヌリンおよび０．５ｍｇのカルシウムを送達するためのグルコン酸カルシウムを含む生理食塩水を、０．０３ｍＬ／分の速度で注入した。平衡化後、全部で４つの３０分間の尿回収物を得た。
リン酸排泄に対するｈＰＴＨ１〜８４を評価するために、２つのコントロール期間中に採尿し、その後ラットに１．８μｇのｈＰＴＨ１〜８４のプライミングボーラスを投与し、全部で８．２μｇのＩ−ＰＴＨを送達させる持続的注入を行った。２０分間の平衡化後、３０分の採尿を２回行った。競合実験では、ｈＰＴＨ１〜８４の前に４：１のモル比でｈＰＴＨ７〜８４を５分間投与した。
ベースライン期間の開始および終了時（ＰＴＨ注入の開始時および研究の終了時）に血液サンプルおよび血圧の測定値を記録した。Fuehr,Kaczmarczyk,およびKruttgen,Klin Wochenschr,33:729-730(1955)の方法によって血漿中および尿中のイヌリン濃度を決定した。イヌリンクリアランスおよび部分リン尿排泄率（ＦＥP04）の計算による糸球体濾過率（ＧＦＲ）の評価を標準的な様式で行った。血液サンプルを遠心分離し、血漿中のリン濃度およびカルシウム濃度を測定した。
（３．血清化学）
自動吸収分光計（モデル１１００Ｂ；Perkin Elmer,Norwalk,CT,USA）を使用して総血漿カルシウムレベルを決定した。オートアナライザー(COBAS MIRA Plus;Roche,Newark,NJ,USA)を使用して血漿リンレベルを決定した。
自動吸収分光計（モデル１１００Ｂ；Perkin Elmer,Norwalk,CT,USA）を使用して総血漿カルシウムレベルを決定した。オートアナライザー(COBAS MIRA Plus;Roche,Newark,NJ,USA)を使用して血漿リンレベルを決定した。
（４．統計分析）
結果を平均±ＳＥＭで示す。Ｎは、サンプル数を示す。他で示さない限り、ペアードｔ検定を使用して統計的有意性を試験した。
結果を平均±ＳＥＭで示す。Ｎは、サンプル数を示す。他で示さない限り、ペアードｔ検定を使用して統計的有意性を試験した。
〔Ｊ．ｈＰＴＨ１〜８４についてのＩＲＭＡアッセイの特異性〕
最初の研究は、ｈＰＴＨ１〜８４分子とｈＰＴＨ７〜８４分子とを区別するためにNicholsインタクト(I-Nichols)ＰＴＨアッセイの能力および新規の全ＰＴＨアッセイの能力を比較した。図１３は、Nichols「インタクトな」ＰＴＨアッセイはヒトＰＴＨ１〜８４と７〜８４を区別できないことを示す。しかし、図１４に示すように、全ＰＴＨアッセイを使用して行った研究は、ｈＰＴＨ１〜８４が高感度で検出されるのに対して、ｈＰＴＨ７〜８４は１０，００ｐｇ／ｍＬの濃度でさえも検出不可能であることを示す。
最初の研究は、ｈＰＴＨ１〜８４分子とｈＰＴＨ７〜８４分子とを区別するためにNicholsインタクト(I-Nichols)ＰＴＨアッセイの能力および新規の全ＰＴＨアッセイの能力を比較した。図１３は、Nichols「インタクトな」ＰＴＨアッセイはヒトＰＴＨ１〜８４と７〜８４を区別できないことを示す。しかし、図１４に示すように、全ＰＴＨアッセイを使用して行った研究は、ｈＰＴＨ１〜８４が高感度で検出されるのに対して、ｈＰＴＨ７〜８４は１０，００ｐｇ／ｍＬの濃度でさえも検出不可能であることを示す。
（１．インビトロ研究）
ｈＰＴＨ１〜８４またはｈＰＴＨ７〜８４に曝露したＲＯＳ／１７．２細胞によるｃＡＭＰ産生の結果を、図１５に示す。ｈＰＴＨ７〜８４と異なり、ｈＰＴＨ１〜８４により、用量依存様式でｃＡＭＰ産生が増加した。ｈＰＴＨ１〜８４（１０-8ｍｏｌ／Ｌ）により、１８．１±１．２５ｎｍｏｌ／ウェルから７３８±４．１３ｎｍｏｌ／ウェルまで細胞内ｃＡＭＰが増加した。他方では、同一濃度のｈＰＴＨ７〜８４ではｃＡＭＰに効果がなかった（Ｎ＝６）。
ｈＰＴＨ１〜８４またはｈＰＴＨ７〜８４に曝露したＲＯＳ／１７．２細胞によるｃＡＭＰ産生の結果を、図１５に示す。ｈＰＴＨ７〜８４と異なり、ｈＰＴＨ１〜８４により、用量依存様式でｃＡＭＰ産生が増加した。ｈＰＴＨ１〜８４（１０-8ｍｏｌ／Ｌ）により、１８．１±１．２５ｎｍｏｌ／ウェルから７３８±４．１３ｎｍｏｌ／ウェルまで細胞内ｃＡＭＰが増加した。他方では、同一濃度のｈＰＴＨ７〜８４ではｃＡＭＰに効果がなかった（Ｎ＝６）。
（２．ラットにおけるインビボ研究）
本発明者らは、次に、ＰＴＸラットの血清カルシウム変化の測定によって骨中のｈＰＴＨ１〜８４の潜在的な競合インヒビターとしてｈＰＴＨ７〜８４フラグメントを試験した。図１２は、０．０２％カルシウム食を与えたＰＴＸラットへのｈＰＴＨ１〜８４の投与によって血漿カルシウムが０．６５±０．１０ｍｇ／ｄＬに増加することを示す（Ｎ＝９、Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。賦形剤のみの投与では、血漿カルシウムは、ＰＴＸに一致してわずかに変化した（−０．１７±０．１０ｍｇ／ｄＬ、Ｎ＝５）。ｈＰＴＨ７〜８４を投与したラットでわずかではあるが有意な減少が認められた（０．３０±０．０８ｍｇ／ｄＬ、Ｎ＝５、Ｐ＜０．０５）。両ペプチドを、互いに１：１のモル比で投与した場合、ｈＰＴＨ１〜８４のみの投与によって誘導された血漿カルシウム上昇性応答は、９４％まで減少した（Ｎ＝６、Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。したがって、このモデルでは、ｈＰＴＨ７〜８４はわずかに骨カルシウム代謝のｈＰＴＨ１〜８４誘導を有意に阻害する。
本発明者らは、次に、ＰＴＸラットの血清カルシウム変化の測定によって骨中のｈＰＴＨ１〜８４の潜在的な競合インヒビターとしてｈＰＴＨ７〜８４フラグメントを試験した。図１２は、０．０２％カルシウム食を与えたＰＴＸラットへのｈＰＴＨ１〜８４の投与によって血漿カルシウムが０．６５±０．１０ｍｇ／ｄＬに増加することを示す（Ｎ＝９、Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。賦形剤のみの投与では、血漿カルシウムは、ＰＴＸに一致してわずかに変化した（−０．１７±０．１０ｍｇ／ｄＬ、Ｎ＝５）。ｈＰＴＨ７〜８４を投与したラットでわずかではあるが有意な減少が認められた（０．３０±０．０８ｍｇ／ｄＬ、Ｎ＝５、Ｐ＜０．０５）。両ペプチドを、互いに１：１のモル比で投与した場合、ｈＰＴＨ１〜８４のみの投与によって誘導された血漿カルシウム上昇性応答は、９４％まで減少した（Ｎ＝６、Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。したがって、このモデルでは、ｈＰＴＨ７〜８４はわずかに骨カルシウム代謝のｈＰＴＨ１〜８４誘導を有意に阻害する。
これらの２つのペプチドのリン酸尿症効果を評価した（図１６）。ＧＦＲは、ｈＰＴＨ１〜８４を注入したラットで変化しなかったのに対して（１．８±０．３ｍＬ／分に対して１．８±０．１ｍＬ／分）、リン酸塩の部分排出（ＦＥP04）は１１．９±２．４％から２７．７±２．４％（Ｎ＝１０、Ｐ＜０．００１）に増加した。ｈＰＴＨ７〜８４をｈＰＴＨ１〜８４と同時に投与した場合、ＧＦＲは２．１±０．１ｍＬ／分から２．６±０．２ｍＬ／分に増加した（Ｎ＝８、Ｐ＜０．０５）。しかし、ＧＦＲのこの増加にも関わらず、ｈＰＴＨ１〜８４での処置によって誘導されたＦＥP04の増加は、ｈＰＴＨ７〜８４の同時投与によって５０．２％（Ｐ＜０．０１）まで有意に減少した。
（３．ヒトでの研究）
図１７は、血漿ＰＴＨ値は、全アッセイと比較したI-Nicholsアッセイで測定した場合、長期透析を受けている２８人の患者全員でより高いことを示す。ＰＴＨの中央値はそれぞれ５２３に対して３４４ｐｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．００１）であった。これらのデータの回帰分析を図７に示す。
図１７は、血漿ＰＴＨ値は、全アッセイと比較したI-Nicholsアッセイで測定した場合、長期透析を受けている２８人の患者全員でより高いことを示す。ＰＴＨの中央値はそれぞれ５２３に対して３４４ｐｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．００１）であった。これらのデータの回帰分析を図７に示す。
次に、非（１〜８４）ＰＴＨ（「おそらく」ｈＰＴＨ７〜８４）の血漿レベルと血漿カルシウムおよびリンとの間の関連を、長期透析を維持している２０人の患者で試験した（図１８）。非（１〜８４）ＰＴＨと血清カルシウムとの割合の間に正相関が存在するが（Ｐ＜０．００２）、血漿リンとは相関しなかった（データ示さず）。同一の血液サンプルでカルシウム、リン、およびＰＴＨが存在する患者のみでこれらの研究を行った（２０）。
１４人の腎移植患者群では、I-Nicholsアッセイおよび全ＰＴＨアッセイで測定したところ、非（１〜８４）ＰＴＨの割合は全ＰＴＨの４４．１±３．１％であることが見出された（図１９）。I-Nicholsアッセイを使用した絶対ＰＴＨ値は、全ＰＴＨアッセイを使用した７９．８±２４．８ｐｇ／ｍＬ（Ｐ＜０．００５）と比較して１３２．９±３９．９であった。
最後に、副甲状腺でｈＰＴＨ１〜８４分子の細胞内クリアランスが起こり、それによって非（１〜８４）ＰＴＨフラグメントを産生されるかどうかを試験した。長期透析を維持している６人の尿毒症患者から手術によって切除した副甲状腺を研究した。図２０は、非（１〜８４）ＰＴＨフラグメントがこれらの副甲状腺由来の細胞溶解物中に存在し、「インタクトな」ＰＴＨアッセイ（すなわち、１〜８４ＰＴＨ、おそらく７〜８４ＰＴＨ）によって測定したところ、全細胞内ＰＴＨの４１．８±３．２％（Ｐ＜０．０５）であることを示す。
当業者は、本発明が上記の任意の数の好ましい特徴を組み込むことができることを認識することができる。
上記実施例は例示のみを目的として含まれ、本発明の範囲を制限することを意図しない。上記実施例の多数の変形形態が可能である。上記実施例の修正形態および変形形態が当業者に明らかであるので、本発明は添付の特許請求の範囲のみに制限されることが意図される。
上記刊行物または書類の引用は、いずれも適切な先行技術であると承認されることを意図せず、これらの刊行物または書類の内容または日付に関して承認されていることも意図しない。
Claims (81)
- 全副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のＮ末端配列に特異的に結合し、哺乳動物サンプル中の前記全ＰＴＨを生理学的レベルで検出することができる単離された抗体であって、前記単離抗体が非全ＰＴＨフラグメントへの結合を回避する、単離抗体。
- モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または抗体フラグメントである、請求項１に記載の単離抗体。
- ＰＴＨ1〜6、ＰＴＨ1〜8、ＰＴＨ1〜9、ＰＴＨ1〜12、ＰＴＨ1〜15、またはＰＴＨ3〜12に含まれるエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の単離抗体。
- 副甲状腺ホルモンペプチドであるヒトＰＴＨ1〜8、ラットＰＴＨ1〜8、マウスＰＴＨ1〜8、ウシＰＴＨ1〜8、イヌＰＴＨ1〜8、ブタＰＴＨ1〜8、ウマＰＴＨ1〜8、ヒトＰＴＨ1〜15、ラットＰＴＨ1〜15、マウスＰＴＨ1〜15、ウシＰＴＨ1〜15、イヌＰＴＨ1〜15、ブタＰＴＨ1〜15、またはウマＰＴＨ1〜15であって、前記ペプチド配列の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体との反応部分の一部である副甲状腺ホルモンペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の単離抗体。
- ＰＴＨ1〜5、ＰＴＨ1〜7、ＰＴＨ1〜8、ＰＴＨ1〜10、ＰＴＨ1〜11、ＰＴＨ1〜13、ＰＴＨ1〜14、ＰＴＨ1〜15、ＰＴＨ1〜16、ＰＴＨ1〜17、ＰＴＨ1〜18、ＰＴＨ1〜19、ＰＴＨ1〜20、ＰＴＨ1〜21、ＰＴＨ1〜22、ＰＴＨ1〜23、ＰＴＨ1〜24、ＰＴＨ1〜25、ＰＴＨ1〜26、ｈＰＴＨ1〜27、ＰＴＨ1〜28、ＰＴＨ1〜29、ＰＴＨ1〜30、ＰＴＨ1〜31、ＰＴＨ1〜32、ＰＴＨ1〜33、ＰＴＨ1〜34、ＰＴＨ1〜35、ＰＴＨ1〜36、ＰＴＨ1〜37、ＰＴＨ2〜5、ＰＴＨ2〜6、ＰＴＨ2〜7、ＰＴＨ2〜8、ＰＴＨ2〜9、ＰＴＨ2〜10、ＰＴＨ2〜11、ＰＴＨ2〜12、ＰＴＨ2〜13、ＰＴＨ2〜14、ＰＴＨ2〜15、ＰＴＨ2〜16、ＰＴＨ2〜17、ＰＴＨ2〜18、ＰＴＨ2〜19、ＰＴＨ2〜20、ＰＴＨ2〜21、ＰＴＨ2〜22、ＰＴＨ2〜23、ＰＴＨ2〜24、ＰＴＨ2〜25、ＰＴＨ2〜26、ＰＴＨ2〜27、ＰＴＨ2〜28、ＰＴＨ2〜29、ＰＴＨ2〜30、ＰＴＨ2〜31、ＰＴＨ2〜32、ＰＴＨ2〜33、ＰＴＨ2〜34、ＰＴＨ2〜35、ＰＴＨ2〜36、ＰＴＨ2〜37、ＰＴＨ3〜6、ＰＴＨ3〜7、ＰＴＨ3〜8、ＰＴＨ3〜9、ＰＴＨ3〜10、ＰＴＨ3〜11、ＰＴＨ3〜13、ＰＴＨ3〜14、ＰＴＨ3〜15、ＰＴＨ3〜16、ＰＴＨ3〜17、ＰＴＨ3〜18、ＰＴＨ3〜19、ＰＴＨ3〜20、ＰＴＨ3〜21、ＰＴＨ3〜22、ＰＴＨ3〜23、ＰＴＨ3〜24、ＰＴＨ3〜25、ＰＴＨ3〜26、ＰＴＨ3〜27、ＰＴＨ3〜28、ＰＴＨ3〜29、ＰＴＨ3〜30、ＰＴＨ3〜31、ＰＴＨ3〜32、ＰＴＨ3〜33、ＰＴＨ3〜34、ＰＴＨ3〜35、ＰＴＨ3〜36、ＰＴＨ3〜37、ＰＴＨ4〜7、ＰＴＨ4〜8、ＰＴＨ4〜9、ＰＴＨ4〜10、ＰＴＨ4〜11、ＰＴＨ4〜12、ＰＴＨ4〜13、ＰＴＨ4〜14、ＰＴＨ4〜15、ＰＴＨ4〜16、ＰＴＨ4〜17、ＰＴＨ4〜18、ＰＴＨ4〜19、ＰＴＨ4〜20、ＰＴＨ4〜21、ＰＴＨ4〜22、ＰＴＨ4〜23、ＰＴＨ4〜24、ＰＴＨ4〜25、ＰＴＨ4〜26、ＰＴＨ4〜27、ＰＴＨ4〜28、ＰＴＨ4〜29、ＰＴＨ4〜30、ＰＴＨ4〜31、ＰＴＨ4〜32、ＰＴＨ4〜33、ＰＴＨ4〜34、ＰＴＨ4〜35、ＰＴＨ4〜36、ＰＴＨ4〜37、ＰＴＨ5〜8、ＰＴＨ5〜9、ＰＴＨ5〜10、ＰＴＨ5〜11、ＰＴＨ5〜12、ＰＴＨ5〜13、ＰＴＨ5〜14、ＰＴＨ5〜15、ＰＴＨ5〜16、ＰＴＨ5〜17、ＰＴＨ5〜18、ＰＴＨ5〜19、ＰＴＨ5〜20、ＰＴＨ5〜21、ＰＴＨ5〜22、ＰＴＨ5〜23、ＰＴＨ5〜24、ＰＴＨ5〜25、ＰＴＨ5〜26、ＰＴＨ5〜27、ＰＴＨ5〜28、ＰＴＨ5〜29、ＰＴＨ5〜30、ＰＴＨ5〜31、ＰＴＨ5〜32、ＰＴＨ5〜33、ＰＴＨ5〜34、ＰＴＨ5〜35、ＰＴＨ5〜36、またはＰＴＨ5〜37に含まれるエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の単離抗体。
- 前記抗体と前記全ＰＴＨのＮ末端配列との間の結合が、ｈＰＴＨのアミノ酸残基２〜５の存在に依存する、請求項１に記載の単離抗体。
- 前記抗体と前記全ＰＴＨのＮ末端配列との間の結合が、ｈＰＴＨのアミノ酸残基３〜６の存在に依存する、請求項１に記載の単離抗体。
- 前記非全ＰＴＨフラグメントが、ＰＴＨ3〜84とＰＴＨ34〜84との間のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１に記載の単離抗体または抗体フラグメント。
- 前記非全ＰＴＨフラグメントが、ヒトＰＴＨ7〜84のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１に記載の単離抗体。
- 哺乳動物サンプル中の生理学的レベルの全副甲状腺ホルモンを測定する方法であって、
ａ）試験すべき哺乳動物からサンプルを得るステップと、
ｂ）全ＰＴＨのＮ末端配列に特異的に結合し、前記哺乳動物サンプル中の前記全ＰＴＨを生理学的レベルで検出することができる単離された抗体であって、前記単離抗体が非全ＰＴＨフラグメントへの結合を回避する単離抗体に、前記サンプルを接触させるステップと、
ｃ）前記哺乳動物サンプル中の生理学的レベルの全副甲状腺ホルモンを測定するために、前記サンプル中に存在する場合、前記全副甲状腺ホルモンと前記抗体との間で形成された複合体を評価するステップと
を含む方法。 - 前記サンプルが、血清、血漿、および血液のサンプルからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
- 前記サンプルが臨床サンプルである、請求項１０に記載の方法。
- 腎疾患被験体、骨粗鬆症被験体の臨床管理、または原発性副甲状腺機能亢進症の診断に使用される、請求項１０に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項１０に記載の方法。
- 前記サンプルがヒト臨床サンプルである、請求項１４に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または抗体フラグメントである、請求項１０に記載の方法。
- 前記抗体が、ＰＴＨ1〜6、ＰＴＨ1〜8、ＰＴＨ1〜9、ＰＴＨ1〜12、ＰＴＨ1〜15、またはＰＴＨ3〜12に含まれるエピトープに特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。
- 前記抗体が、副甲状腺ホルモンペプチドであるヒトＰＴＨ1〜8、ラットＰＴＨ1〜8、マウスＰＴＨ1〜8、ウシＰＴＨ1〜8、イヌＰＴＨ1〜8、ブタＰＴＨ1〜8、ウマＰＴＨ1〜8、ヒトＰＴＨ1〜15、ラットＰＴＨ1〜15、マウスＰＴＨ1〜15、ウシＰＴＨ1〜15、イヌＰＴＨ1〜15、ブタＰＴＨ1〜15、またはウマＰＴＨ1〜15であって、前記ペプチド配列の少なくとも４つのアミノ酸が前記抗体との反応部分の一部である副甲状腺ホルモンペプチドに特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。
- 前記抗体が、ＰＴＨ1〜5、ＰＴＨ1〜7、ＰＴＨ1〜8、ＰＴＨ1〜10、ＰＴＨ1〜11、ＰＴＨ1〜13、ＰＴＨ1〜14、ＰＴＨ1〜15、ＰＴＨ1〜16、ＰＴＨ1〜17、ＰＴＨ1〜18、ＰＴＨ1〜19、ＰＴＨ1〜20、ＰＴＨ1〜21、ＰＴＨ1〜22、ＰＴＨ1〜23、ＰＴＨ1〜24、ＰＴＨ1〜25、ＰＴＨ1〜26、ｈＰＴＨ1〜27、ＰＴＨ1〜28、ＰＴＨ1〜29、ＰＴＨ1〜30、ＰＴＨ1〜31、ＰＴＨ1〜32、ＰＴＨ1〜33、ＰＴＨ1〜34、ＰＴＨ1〜35、ＰＴＨ1〜36、ＰＴＨ1〜37、ＰＴＨ2〜5、ＰＴＨ2〜6、ＰＴＨ2〜7、ＰＴＨ2〜8、ＰＴＨ2〜9、ＰＴＨ2〜10、ＰＴＨ2〜11、ＰＴＨ2〜12、ＰＴＨ2〜13、ＰＴＨ2〜14、ＰＴＨ2〜15、ＰＴＨ2〜16、ＰＴＨ2〜17、ＰＴＨ2〜18、ＰＴＨ2〜19、ＰＴＨ2〜20、ＰＴＨ2〜21、ＰＴＨ2〜22、ＰＴＨ2〜23、ＰＴＨ2〜24、ＰＴＨ2〜25、ＰＴＨ2〜26、ＰＴＨ2〜27、ＰＴＨ2〜28、ＰＴＨ2〜29、ＰＴＨ2〜30、ＰＴＨ2〜31、ＰＴＨ2〜32、ＰＴＨ2〜33、ＰＴＨ2〜34、ＰＴＨ2〜35、ＰＴＨ2〜36、ＰＴＨ2〜37、ＰＴＨ3〜6、ＰＴＨ3〜7、ＰＴＨ3〜8、ＰＴＨ3〜9、ＰＴＨ3〜10、ＰＴＨ3〜11、ＰＴＨ3〜13、ＰＴＨ3〜14、ＰＴＨ3〜15、ＰＴＨ3〜16、ＰＴＨ3〜17、ＰＴＨ3〜18、ＰＴＨ3〜19、ＰＴＨ3〜20、ＰＴＨ3〜21、ＰＴＨ3〜22、ＰＴＨ3〜23、ＰＴＨ3〜24、ＰＴＨ3〜25、ＰＴＨ3〜26、ＰＴＨ3〜27、ＰＴＨ3〜28、ＰＴＨ3〜29、ＰＴＨ3〜30、ＰＴＨ3〜31、ＰＴＨ3〜32、ＰＴＨ3〜33、ＰＴＨ3〜34、ＰＴＨ3〜35、ＰＴＨ3〜36、ＰＴＨ3〜37、ＰＴＨ4〜7、ＰＴＨ4〜8、ＰＴＨ4〜9、ＰＴＨ4〜10、ＰＴＨ4〜11、ＰＴＨ4〜12、ＰＴＨ4〜13、ＰＴＨ4〜14、ＰＴＨ4〜15、ＰＴＨ4〜16、ＰＴＨ4〜17、ＰＴＨ4〜18、ＰＴＨ4〜19、ＰＴＨ4〜20、ＰＴＨ4〜21、ＰＴＨ4〜22、ＰＴＨ4〜23、ＰＴＨ4〜24、ＰＴＨ4〜25、ＰＴＨ4〜26、ＰＴＨ4〜27、ＰＴＨ4〜28、ＰＴＨ4〜29、ＰＴＨ4〜30、ＰＴＨ4〜31、ＰＴＨ4〜32、ＰＴＨ4〜33、ＰＴＨ4〜34、ＰＴＨ4〜35、ＰＴＨ4〜36、ＰＴＨ4〜37、ＰＴＨ5〜8、ＰＴＨ5〜9、ＰＴＨ5〜10、ＰＴＨ5〜11、ＰＴＨ5〜12、ＰＴＨ5〜13、ＰＴＨ5〜14、ＰＴＨ5〜15、ＰＴＨ5〜16、ＰＴＨ5〜17、ＰＴＨ5〜18、ＰＴＨ5〜19、ＰＴＨ5〜20、ＰＴＨ5〜21、ＰＴＨ5〜22、ＰＴＨ5〜23、ＰＴＨ5〜24、ＰＴＨ5〜25、ＰＴＨ5〜26、ＰＴＨ5〜27、ＰＴＨ5〜28、ＰＴＨ5〜29、ＰＴＨ5〜30、ＰＴＨ5〜31、ＰＴＨ5〜32、ＰＴＨ5〜33、ＰＴＨ5〜34、ＰＴＨ5〜35、ＰＴＨ5〜36、またはＰＴＨ5〜37に含まれるエピトープに特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。
- 前記抗体と前記全ＰＴＨのＮ末端配列との間の結合が、ｈＰＴＨのアミノ酸残基２〜５の存在に依存する、請求項１９に記載の方法。
- 前記抗体と前記全ＰＴＨのＮ末端配列との間の結合が、ｈＰＴＨのアミノ酸残基３〜６の存在に依存する、請求項１９に記載の方法。
- 前記非全ＰＴＨフラグメントが、ＰＴＨ3〜84とＰＴＨ34〜84との間のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１０に記載の方法。
- 前記非全ＰＴＨフラグメントが、ヒトＰＴＨ7〜84のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１０に記載の方法。
- 前記複合体が、サンドイッチアッセイ形式または競合アッセイ形式によって評価される、請求項１０に記載の方法。
- サンドイッチアッセイ形式において、全ＰＴＨのＮ末端配列に特異的に結合する前記抗体を第１の抗体として使用し、前記第１の抗体に結合する前記Ｎ末端配列以外の全ＰＴＨの一部に結合することができる抗体を第２の抗体として使用する、請求項２４に記載の方法。
- 前記第１の抗体または第２の抗体のいずれかが表面に付着して捕捉抗体として機能する、請求項２５に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、前記表面に直接または間接的に付着する、請求項２６に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、ビオチン−アビジン（またはストレプトアビジン）連結対を介して前記表面に付着する、請求項２６に記載の方法。
- 前記複合体を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロッティング、免疫沈降、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫染色、ラテックス凝集、間接赤血球凝集アッセイ（ＩＨＡ）、補体結合、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、比濁法、フローサイトメトリーアッセイ、プララズモン共鳴アッセイ、化学発光アッセイ、側方流動免疫アッセイ、ｕ−キャプチャーアッセイ、阻害アッセイ、およびアビディティアッセイからなる群より選択される形式によって評価する、請求項１０に記載の方法。
- 前記複合体を、同種アッセイ形式または異種アッセイ形式で評価する、請求項１０に記載の方法。
- 前記全副甲状腺ホルモンの生理学的レベルが、４ｐｍｏ／Ｌ未満である、請求項１０に記載の方法。
- 前記全副甲状腺ホルモンの生理学的レベルが、約０．２ｐｍｏｌ／Ｌ〜約４ｐｍｏｌ／Ｌである、請求項１０に記載の方法。
- ＰＴＨペプチドフラグメントレベルおよび／または総ＰＴＨレベルを測定するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記サンプルを、１つまたは複数の単離抗体であって、前記１つまたは複数の各単離抗体が、ＰＴＨ39〜84、ＰＴＨ1〜34、ＰＴＨ43〜68、ＰＴＨ7〜84、ＰＴＨ39〜68、ＰＴＨ53〜84、ＰＴＨ65〜84、ＰＴＨ44〜68、ＰＴＨ19〜84、ＰＴＨ23〜84、ＰＴＨ1〜38、ＰＴＨ1〜48、ＰＴＨ1〜58、ＰＴＨ1〜68、およびＰＴＨ1〜78からなる群より選択される１つまたは複数のＰＴＨペプチドフラグメントに特異的に結合する単離抗体に接触させる、請求項３３に記載の方法。
- 全ＰＴＨレベル、総ＰＴＨペプチドフラグメントレベル、総ＰＴＨレベル、Ｃ末端ＰＴＨフラグメント（ｃＰＴＨ）レベル、Ｎ末端ＰＴＨフラグメントレベル、および中末端(mid-terminal)ＰＴＨフラグメント（ｍＰＴＨ）レベルからなる群より選択される少なくとも２つのパラメーターを比較するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記比較の結果を使用して、哺乳動物が骨代謝回転関連障害を罹患しているかどうかを決定するか、骨疾患または骨障害関連治療をモニタリングする、請求項３５に記載の方法。
- 無形成骨症（ＡＤＮ）または重症副甲状腺機能亢進症の診断または治療のモニタリングで使用される、請求項３６に記載の方法。
- 前記比較が、全ＰＴＨレベルと総ＰＴＨレベルとの間の比または比率の形態である、請求項３５に記載の方法。
- 前記比較が、全ＰＴＨレベルと総ＰＴＨレベル−全ＰＴＨレベルの組み合わせの合計との間の比または比率の形態である、請求項３５に記載の方法。
- 前記比較が、ｗＰＴＨレベルとｃＰＴＨレベルおよびｍＰＴＨフラグメントの組み合わせのレベルとの間の比または比率の形態である、請求項３５に記載の方法。
- 前記比較が約０．０２０未満の値を有する比であり、前記哺乳動物が無形成骨症を罹患していると決定される、請求項４０に記載の方法。
- 前記比較が約０．０２０を超える値を有する比であり、前記哺乳動物が重症副甲状腺機能亢進症を罹患していると決定される、請求項４０に記載の方法。
- 前記比較が、式：ｗＰＴＨ／（（ｃＰＴＨ−ｗＰＴＨ）＋（ｍＰＴＨ−ｗＰＴＨ））によって示される比または比率の形態である、請求項３５に記載の方法。
- 前記比較が約０．０１８５未満の値を有する比であり、前記哺乳動物が無形成骨症を罹患していると決定される、請求項４３に記載の方法。
- 前記比較が約０．０１８５を超える値を有する比であり、前記哺乳動物が重症副甲状腺機能亢進症を罹患していると決定される、請求項４３に記載の方法。
- 前記比較が、全ＰＴＨレベルとｃＰＴＨレベルおよびｍＰＴＨフラグメントの組み合わせのレベルの合計から全ＰＴＨレベルを引いた値との間の比または比率の形態である、請求項３５に記載の方法。
- 前記比較が約０．０２０未満の値を有する比であり、前記哺乳動物が無形成骨症を罹患していると決定される、請求項４６に記載の方法。
- 前記比較が約０．０２０を超える値を有する比であり、前記哺乳動物が重症副甲状腺機能亢進症を罹患していると決定される、請求項４６に記載の方法。
- 前記比較が、全ＰＴＨレベルと全ＰＴＨレベル、ｃＰＴＨレベル、およびｍＰＴＨフラグメントの組み合わせのレベルとの間の比または比率の形態である、請求項３５に記載の方法。
- 前記比較が約０．０１７５未満の値を有する比であり、前記哺乳動物が無形成骨症を罹患していると決定される、請求項４９に記載の方法。
- 前記比較が約０．０１７５を超える値を有する比であり、前記哺乳動物が重症副甲状腺機能亢進症を罹患していると決定される、請求項４９に記載の方法。
- 前記比較が、全ＰＴＨレベルとｃＰＴＨフラグメントレベルとの間の比または比率の形態である、請求項３５に記載の方法。
- 前記比較が約０．１０３未満の値を有する比であり、前記哺乳動物が無形成骨症を罹患していると決定される、請求項５２に記載の方法。
- 前記比較が約０．１０３を超える値を有する比であり、前記哺乳動物が重症副甲状腺機能亢進症を罹患していると決定される、請求項５２に記載の方法。
- 前記比較が、全ＰＴＨレベルとｍＰＴＨフラグメントレベルとの間の比または比率の形態である、請求項３５に記載の方法。
- 前記比較が約０．０２２５未満の値を有する比であり、前記哺乳動物が無形成骨症を罹患していると決定される、請求項５５に記載の方法。
- 前記比較が約０．０２２５を超える値を有する比であり、前記哺乳動物が重症副甲状腺機能亢進症を罹患していると決定される、請求項５５に記載の方法。
- ａ）実質的に正常な副甲状腺機能を有する者と副甲状腺機能亢進症を有する者との区別、
ｂ）副甲状腺関連骨疾患および治療のモニタリング、
ｃ）副甲状腺機能亢進症の治療上の処置の効果のモニタリング、または
ｄ）副甲状腺関連骨疾患の診断
のために使用される、請求項１０に記載の方法。 - 哺乳動物サンプル中の生理学的レベルの全副甲状腺ホルモンを測定するためのキットであって、全副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のＮ末端配列に特異的に結合し、哺乳動物サンプル中の前記全ＰＴＨを生理学的レベルで検出することができる単離された抗体であって、非全ＰＴＨフラグメントへの結合を回避する単離抗体をコンテナ中に含む、キット。
- ＰＴＨ1〜11、ＰＴＨ1〜13、ＰＴＨ1〜14、ＰＴＨ1〜15、ＰＴＨ1〜16、ＰＴＨ1〜17、ＰＴＨ1〜18、ＰＴＨ1〜19、ＰＴＨ1〜20、ＰＴＨ1〜21、ＰＴＨ1〜22、ＰＴＨ1〜23、ＰＴＨ1〜24、ＰＴＨ1〜25、ＰＴＨ1〜26、ｈＰＴＨ1〜27、ＰＴＨ1〜28、ＰＴＨ1〜29、ＰＴＨ1〜30、ＰＴＨ1〜31、ＰＴＨ1〜32、ＰＴＨ1〜33、ＰＴＨ1〜34、ＰＴＨ1〜35、ＰＴＨ1〜36、ＰＴＨ2〜5、ＰＴＨ2〜6、ＰＴＨ2〜8、ＰＴＨ2〜9、ＰＴＨ2〜10、ＰＴＨ2〜11、ＰＴＨ2〜12、ＰＴＨ2〜13、ＰＴＨ2〜14、ＰＴＨ2〜15、ＰＴＨ2〜16、ＰＴＨ2〜17、ＰＴＨ2〜18、ＰＴＨ2〜19、ＰＴＨ2〜20、ＰＴＨ2〜21、ＰＴＨ2〜22、ＰＴＨ2〜23、ＰＴＨ2〜24、ＰＴＨ2〜25、ＰＴＨ2〜26、ＰＴＨ2〜27、ＰＴＨ2〜28、ＰＴＨ2〜29、ＰＴＨ2〜30、ＰＴＨ2〜31、ＰＴＨ2〜32、ＰＴＨ2〜33、ＰＴＨ2〜34、ＰＴＨ2〜35、ＰＴＨ2〜36、ＰＴＨ3〜6、ＰＴＨ3〜7、ＰＴＨ3〜9、ＰＴＨ3〜10、ＰＴＨ3〜11、ＰＴＨ3〜12、ＰＴＨ3〜13、ＰＴＨ3〜14、ＰＴＨ3〜15、ＰＴＨ3〜16、ＰＴＨ3〜17、ＰＴＨ3〜18、ＰＴＨ3〜19、ＰＴＨ3〜20、ＰＴＨ3〜21、ＰＴＨ3〜22、ＰＴＨ3〜23、ＰＴＨ3〜24、ＰＴＨ3〜25、ＰＴＨ3〜26、ＰＴＨ3〜27、ＰＴＨ3〜28、ＰＴＨ3〜29、ＰＴＨ3〜30、ＰＴＨ3〜31、ＰＴＨ3〜32、ＰＴＨ3〜33、ＰＴＨ3〜34、ＰＴＨ3〜35、ＰＴＨ3〜36、ＰＴＨ4〜7、ＰＴＨ4〜8、ＰＴＨ4〜9、ＰＴＨ4〜10、ＰＴＨ4〜11、ＰＴＨ4〜13、ＰＴＨ4〜14、ＰＴＨ4〜15、ＰＴＨ4〜16、ＰＴＨ4〜17、ＰＴＨ4〜18、ＰＴＨ4〜19、ＰＴＨ4〜20、ＰＴＨ4〜21、ＰＴＨ4〜22、ＰＴＨ4〜23、ＰＴＨ4〜24、ＰＴＨ4〜25、ＰＴＨ4〜26、ＰＴＨ4〜27、ＰＴＨ4〜28、ＰＴＨ4〜29、ＰＴＨ4〜30、ＰＴＨ4〜31、ＰＴＨ4〜32、ＰＴＨ4〜33、ＰＴＨ4〜34、ＰＴＨ4〜35、ＰＴＨ4〜36、ＰＴＨ5〜8、ＰＴＨ5〜9、ＰＴＨ5〜11、ＰＴＨ5〜12、ＰＴＨ5〜13、ＰＴＨ5〜14、ＰＴＨ5〜15、ＰＴＨ5〜16、ＰＴＨ5〜17、ＰＴＨ5〜18、ＰＴＨ5〜19、ＰＴＨ5〜20、ＰＴＨ5〜21、ＰＴＨ5〜22、ＰＴＨ5〜23、ＰＴＨ5〜24、ＰＴＨ5〜25、ＰＴＨ5〜26、ＰＴＨ5〜27、ＰＴＨ5〜28、ＰＴＨ5〜29、ＰＴＨ5〜30、ＰＴＨ5〜31、ＰＴＨ5〜32、ＰＴＨ5〜33、ＰＴＨ5〜34、ＰＴＨ5〜35、ＰＴＨ5〜36、およびＰＴＨ5〜37からなる群より選択される、単離された副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ペプチド。
- ＰＴＨペプチドの免疫原性を増強するキャリアに抱合された、請求項６０に記載の単離ＰＴＨペプチド。
- 前記キャリアがキャリアタンパク質である、請求項６１に記載の単離ＰＴＨペプチド。
- 前記ＰＴＨペプチドおよび前記キャリアタンパク質が、融合タンパク質の一部である、請求項６２に記載の単離ＰＴＨペプチド。
- ａ）請求項６０に記載のＰＴＨペプチド；および
ｂ）免疫応答増強物質
を含む、免疫原。 - 前記免疫応答増強物質が、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム・パルブム、ウシ流産菌抽出物、グルカン、レバミゾール、チロロン、酵素、および非ビルレントウイルスからなる群より選択される、請求項６４に記載の免疫原。
- 複数の請求項６０に記載のＰＴＨペプチドに抱合した分岐オリゴリジンコアを含む、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）。
- 前記分岐オリゴリジンコアが、３、７、または１５個のリジン残基を含む、請求項６６に記載のＭＡＰ。
- 前記複数のＰＴＨペプチドが、スペーサーを介して前記分岐オリゴリジンコアに抱合している、請求項６６に記載のＭＡＰ。
- 前記スペーサーがアミノ酸残基である、請求項６８に記載のＭＡＰ。
- ４、８、または１６個のＰＴＨペプチドのコピーを含む、請求項６８に記載のＭＡＰ。
- 前記複数のＰＴＨペプチドが、同一または異なるＰＴＨペプチドを含む、請求項６６に記載のＭＡＰ。
- 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生方法であって、前記方法は、
ａ）請求項６０に記載の単離ＰＴＨペプチドを前記ＰＴＨペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入するステップと、
ｂ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するステップと、
を含む、方法。 - 請求項７２に記載の方法によって産生された、ＰＴＨまたはＰＴＨペプチドに対する抗体。
- 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生のためのキットであって、前記キットは、
ａ）請求項６０に記載の単離ＰＴＨペプチドと、
ｂ）前記単離ＰＴＨペプチドを前記ＰＴＨペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入する手段と、
ｃ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するための手段と、
を含む、キット。 - 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生方法であって、前記方法は、
ａ）請求項６６に記載のＭＡＰを前記ＭＡＰに含まれるＰＴＨペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入するステップと、
ｂ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するステップと、
を含む、方法。 - 請求項７５に記載の方法によって産生されたＰＴＨまたはＰＴＨペプチドに対する抗体。
- 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生のためのキットであって、前記キットは、
ａ）請求項６６に記載のＭＡＰと、
ｂ）前記ＭＡＰを前記ＭＡＰに含まれるＰＴＨペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入する手段と、
ｃ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するための手段と、
を含む、キット。 - 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生方法であって、前記方法は、
ａ）ＰＴＨ1〜34とＰＴＨ1〜84との間のＰＴＨタンパク質またはペプチドを前記ＰＴＨタンパク質またはペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入するステップと、
ｂ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するステップと、
ｃ）請求項６０に記載のＰＴＨペプチドに含まれるエピトープに特異的に結合するＰＴＨ抗体を、前記ＰＴＨペプチドを使用してアフィニティ精製するステップと、
を含む、方法。 - 請求項７８に記載の方法によって産生されたＰＴＨまたはＰＴＨペプチドに対する抗体。
- 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはＰＴＨペプチドに対する抗体の産生のためのキットであって、前記キットは、
ａ）ＰＴＨ1〜34とＰＴＨ1〜84との間のＰＴＨタンパク質またはペプチドと、
ｂ）前記ＰＴＨ1〜34とＰＴＨ1〜84との間のＰＴＨタンパク質またはペプチドを前記ＰＴＨタンパク質またはペプチドに対する抗体の産生に十分な量で哺乳動物に導入する手段と、
ｃ）前記哺乳動物から前記抗体を回収するための手段と、
ｄ）請求項６０に記載のＰＴＨペプチドと、
を含む、キット。 - 前記全副甲状腺ホルモンの生理学的レベルが、約７ｐｇｍ／ｍｌから約３９ｐｇｍ／ｍｌまでである、請求項１０に記載の方法。
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