JP2007316009A - アドレノメデュリン前駆体c末端ペプチドの濃度の上昇を指標として循環器疾患又は炎症性疾患を診断する方法 - Google Patents
アドレノメデュリン前駆体c末端ペプチドの濃度の上昇を指標として循環器疾患又は炎症性疾患を診断する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007316009A JP2007316009A JP2006148348A JP2006148348A JP2007316009A JP 2007316009 A JP2007316009 A JP 2007316009A JP 2006148348 A JP2006148348 A JP 2006148348A JP 2006148348 A JP2006148348 A JP 2006148348A JP 2007316009 A JP2007316009 A JP 2007316009A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- polypeptide
- amino acid
- proham
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Abstract
【解決手段】本発明は、循環器疾患又は炎症性疾患の診断方法であって、被検体から単離された試料中のProhAM(153-185)を定量し、定量されたProhAM(153-185)の量の上昇を指標として循環器疾患又は炎症性疾患を診断することを特徴とする方法。
【選択図】図4
Description
非特許文献2及び3にはProhAM(153-185)の活性について記載されている。
(1)循環器疾患又は炎症性疾患の診断方法であって、
被検体から単離された試料中の、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドを定量し、前記ポリペプチドの量の上昇を指標として循環器疾患又は炎症性疾患を診断することを特徴とする方法。
被検体から単離された試料中の、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドを定量する工程と、
被検体から単離された試料中の前記ポリペプチドの量が、健常検体から単離された試料中の前記ポリペプチドの量と対比して多いときに、被検体が循環器疾患又は炎症性疾患に罹患していると判断する工程とを含む方法。
(4)前記抗体が、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列のうち第170番〜第185番のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、(1)〜(3)のいずれか1項記載の方法。
(5)試料が血液である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(7)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドに結合し得る抗体を含む、循環器疾患又は炎症性疾患の診断薬。
(8)前記抗体が、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列のうち第170番〜第185番のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、(7)記載の診断薬。
(10)前記抗体が、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列のうち第170番〜第185番のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、(9)記載の診断用キット。
本発明において「被検体」とは哺乳類であれば特に限定されないが、ヒトが特に好ましい。
本発明で使用される「試料」とは具体的には被検体の血液、尿、髄液、唾液、母乳、組織抽出液が挙げられる。なかでも血液が好ましい。血液としては全血、血漿、血清、血球成分の抽出液など種々の形態のものを試料として使用できる。
本発明において疾患マーカーとして使用されるポリペプチドは、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドである。配列番号1は、ヒトAM・PAMPの前駆体タンパク質(ProhAM)の第153番〜第185番の部分ポリペプチド(ProhAM(153-185))のアミノ酸配列を示す。
マーカーポリペプチドの定量は、マーカーポリペプチドに結合し得る抗体を用いた免疫学的方法により行われることが好ましい。
上記の抗原を、動物に対して、抗原の投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。用いられる動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましい。抗血清中の抗体価の測定は常法により行うことができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、抗原とキャリアーとの複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から活性型ハプトグロビン対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。ポリクローナル抗体の作成に使用する抗原はモノクローナル抗体の作成におけるのと同様である。抗原とキャリアーとの複合体を形成する際に、キャリアーの種類および抗原とキャリアーとの混合比は、キャリアーに架橋させた抗原に対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい。キャリアーとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等が用いられる。また、抗原とキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
本発明により診断される疾患は循環器疾患又は炎症性疾患であり、具体的には特に心不全、高血圧症、敗血症、又は敗血症性ショックが挙げられる。高血圧症のなかでも特に腎機能障害を伴う高血圧症の診断に有効である。また、本発明のマーカーポリペプチドの血中濃度は、アドレノメデュリンの血中濃度と正の相関を示すことから、本発明の方法はアドレノメデュリンの血中濃度の上昇を伴う疾患(具体的には肺高血圧症、糖尿病、気管支炎、妊娠、動脈硬化症、心筋梗塞)の診断にも使用することができる。
本発明では被検試料中のマーカーポリペプチド量の上昇を指標として循環器疾患又は炎症性疾患を診断する。
本発明はまた、マーカーポリペプチドに結合し得る抗体を含む、循環器疾患又は炎症性疾患の診断薬に関する。
抗ProhAM(170-185)抗体の調製(ProhAM(153-185)のC末認識抗体の調製)
ProhAM(170-185) (アミノ酸配列 AHGAPAPPSGSAPHFL)とウシサイログロブリンをグルタルアルデヒド法によりコンジュゲート(縮合)し免疫した。ProhAM(170-185)(8mg)とウシサイログロブリン(10mg)を2mlの0.1 Mリン酸バッファー(PH7.4)に溶解した。0℃で撹拌下、5%グルタルアルデヒド100μlを加え10分間反応した。生理食塩水、0.05Mリン酸バッファー(PH7.4, 0.08M NaCl入り)に対して透析後、同リン酸バッファーで11mlにし、NaN3を0.1%になるように加え凍結保存した。免疫は、ProhAM(170-185) とウシサイログロブリンとのコンジュゲートをTiter Max Gold (Sigma-Aldrich) adjuvantを当量まぜ、十分にエマルジョンし、コンジュゲート1ml分を兎(3匹)の背部数カ所に分けて皮下注射して行った。追加免疫は1ヶ月後から初回の1/2量を2週間おきに行った。採血は追加免疫の7日後に採取し、遠心により血清分離後、NaN3を0.1%になるように加え凍結保存した。
抗体価は125 Iでラベルしたトレーサーを用いて検討した。RIA と同一条件で抗血清の濃度のみを変化させ、50%のトレーサーを結合できる抗血清濃度を求め比較した。抗体価の上昇しないウサギは3回程度で免疫を中止し、上昇を続けるものには継続して免疫を行なった。耳動脈より1回に60ml程度まで採取可能で、高力価のものはくり返し採血した。
(1) トレーサーの調整
ペプチド(N-tyr-ProhAM(170-185), アミノ酸配列: YAHGAPAPPSGSAPHFL)の放射性ヨードラベルは、既報(Kitamura K, Matsui E, Kato J, Katoh F, Kita T, Tsuji T, Kangawa K, Eto T. Adrenomedullin (11-26): a novel endogenous hypertensive peptide isolated from bovine adrenal medulla. Peptides. 2001 Nov;22(11):1713-8. )に従いラクトパーオキシダーゼ法で行なった。25μlの0.4M酢酸ナトリウムバッファー(PH5.6)にペプチド(5μg)、NaI (125 I)1mci/10μl、ラクトパーオキシダーゼ20ng、H2O2 200ng(2回に分けて加える)を加え、37℃、20分間反応させた。
精製したトレーサーはBSAを0.25%〜0.5%になるように加え、分注して-20℃で凍結保存した。
RIAは既報(Kitamura K, Matsui E, Kato J, Katoh F, Kita T, Tsuji T, Kangawa K, Eto T. Adrenomedullin (11-26): a novel endogenous hypertensive peptide isolated from bovine adrenal medulla. Peptides. 2001 Nov;22(11):1713-8. )と同様の方法で行なった。RIA用標準バッファー(以下RIAバッファーと略す)には0.05Mリン酸ナトリウム(PH7.4)にBSA 0.25%、NaCl 0.08M、EDTA-2Na 0.025M、NaN3 0.05%を加えた溶液を用いた。また、RIA用チューブとしてはアクリルチューブ(10×78mm、セントラル貿易)を用いた。
200μl:標準ペプチド溶液、あるいは未知試料溶液
100μl:125Iで標識したトレーサー(17500〜18500 cpm)
100μl:抗血清(最終希釈の4倍濃度)
(以上のものは全てRIAバッファーに溶解、希釈したものである。)
抗血清の希釈度は抗体価の測定と全く同じように行なった。RIAと同一条件で抗血清濃度のみを変化させ、抗体と結合した放射活性を測定することにより希釈曲線を作製した。同時に抗原であるペプチドを過剰に加えた系でも希釈曲線を作製し、抗原の有無により結合した放射活性量の差が十分に大きく、かつ希釈度の最大となるような抗血清濃度を求め、RIAに用いた。
(1) ラジオイムノアッセイにおける交叉活性の検討
本ラジオイムノアッセイ系における各種ペプチドの交差活性を検討した。その結果、ProhAM(153-185)、N-tyr-ProhAM C-II(170-185)とは100%の交叉活性があり、ProhAM(153-167)、アドレノメデュリン、PAMPとは0%の交叉活性であることが確認された。これらの結果は、調製された抗血清はProhAMのC末端を認識する抗体を含んでいることを示す。
またアッセイ内誤差は3.5% であり、アッセイ間誤差は 10% であった。
4, 8, 32 fmolのProhAM(153-185)を加えた後に測定を行ったところ、回収率は 86-118% であり良好であった。
2種類の血漿サンプル(心不全患者、健常人からの血漿サンプル)をそれぞれ100μl、50μl、又は25μl使用してラジオイムノアッセイを行い、血漿サンプルの使用量(希釈倍率に対応する)とProhAM(153-185)の検出量との相関関係を確認した。結果を図2に示す。図2中、白丸は心不全患者からの血漿サンプルからのデータであり、黒丸は健常人からの血漿サンプルからのデータである。図2に示されるとおり、ほぼ良好な直線性が得られた。
検体採取から血漿分離凍結まで、8時間は安定であった。
凍結融解は4回まで繰り返しても値に有意な変動はないことが確認された。
凍結保存では6ヶ月以上は安定であった。
108mlの健常人血漿をSEPPACを用いて脱塩および除蛋白を行った(回収率:約60% )。HPLCで分析した。分析条件は次の通りである。
カラム:050412HPLC RP chemcosorb 7ODSH 0x250mm
溶出液:(A):(B)=100:0〜0:100, 直線グラジエント 2.0ml/fr,
(A) H20:CH3CN:10% TFA = 90:10:1 (v/v); (B) H20:CH3CN:10% TFA = 40:60:1 (v/v)
心不全患者(NYHA) の血漿中におけるProAM(153-185)濃度を、健常人と比較した。
心不全患者(NYHA)は3段階 (NYHA I-II, NYHA III, NYHA IV) に分類した。結果を表1及び図4に示す。
健常人および心不全患者におけるAMT検出値を横軸に、ProhAM (153-185)検出値を縦軸にしてプロットし、相関関係を確認した(図6)。相関係数は0.670であった。
高血圧症患者の血漿中におけるProAM(153-185)濃度を、健常人と比較した。
高血圧症患者は2段階 (臓器障害を伴っていない高血圧症患者、および、腎機能障害を伴う高血圧症患者) に分類した。結果を表3及び図7に示す。
重症敗血症・敗血症性ショック患者の血漿中におけるProAM(153-185)濃度を、健常人と比較した。また、比較のためにAMT濃度についても同様に測定を行った。結果を表4(ProAM(153-185)検出値)、表5(AMT検出値)および図8に示す。図8中、黒色カラムはAMT検出値を示し、白色カラムはProAM(153-185)検出値を示す。
Claims (10)
- 循環器疾患又は炎症性疾患の診断方法であって、
被検体から単離された試料中の、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドを定量し、前記ポリペプチドの量の上昇を指標として循環器疾患又は炎症性疾患を診断することを特徴とする方法。 - 請求項1記載の方法であって、
被検体から単離された試料中の、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドを定量する工程と、
被検体から単離された試料中の前記ポリペプチドの量が、健常検体から単離された試料中の前記ポリペプチドの量と対比して多いときに、被検体が循環器疾患又は炎症性疾患に罹患していると判断する工程とを含む方法。 - 前記ポリペプチドの定量が、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドに結合し得る抗体を用いて行われる、請求項1又は2記載の方法。
- 前記抗体が、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列のうち第170番〜第185番のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 試料が血液である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 循環器疾患又は炎症性疾患が心不全、高血圧症、敗血症、又は敗血症性ショックである、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドに結合し得る抗体を含む、循環器疾患又は炎症性疾患の診断薬。
- 前記抗体が、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列のうち第170番〜第185番のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、請求項7記載の診断薬。
- 配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドに結合し得る抗体を含む、循環器疾患又は炎症性疾患の診断用キット。
- 前記抗体が、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列のうち第170番〜第185番のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、請求項9記載の診断用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006148348A JP4423426B2 (ja) | 2006-05-29 | 2006-05-29 | アドレノメデュリン前駆体c末端ペプチドの濃度の上昇を循環器疾患又は炎症性疾患の指標とする方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006148348A JP4423426B2 (ja) | 2006-05-29 | 2006-05-29 | アドレノメデュリン前駆体c末端ペプチドの濃度の上昇を循環器疾患又は炎症性疾患の指標とする方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007316009A true JP2007316009A (ja) | 2007-12-06 |
JP4423426B2 JP4423426B2 (ja) | 2010-03-03 |
Family
ID=38849985
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006148348A Active JP4423426B2 (ja) | 2006-05-29 | 2006-05-29 | アドレノメデュリン前駆体c末端ペプチドの濃度の上昇を循環器疾患又は炎症性疾患の指標とする方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4423426B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008074315A2 (de) * | 2006-12-20 | 2008-06-26 | Brahms Aktiengesellschaft | Diagnose und risikostratifizierung mittels dem neuen marker ct-proadm |
-
2006
- 2006-05-29 JP JP2006148348A patent/JP4423426B2/ja active Active
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008074315A2 (de) * | 2006-12-20 | 2008-06-26 | Brahms Aktiengesellschaft | Diagnose und risikostratifizierung mittels dem neuen marker ct-proadm |
WO2008074315A3 (de) * | 2006-12-20 | 2008-09-12 | Brahms Ag | Diagnose und risikostratifizierung mittels dem neuen marker ct-proadm |
US20100035289A1 (en) * | 2006-12-20 | 2010-02-11 | Brahms Aktiengesellschaft | Diagnosis and risk stratification by means of the novel marker ct-proadm |
JP2010513879A (ja) * | 2006-12-20 | 2010-04-30 | ブラームズ アクチェンゲゼルシャフト | 新規な診断マーカーであるct−プロadmによる診断および危険性の層化 |
US8436135B2 (en) | 2006-12-20 | 2013-05-07 | Brahms Gmbh | Diagnosis and risk stratification by determining the marker CT-proADM |
CN101611314B (zh) * | 2006-12-20 | 2014-03-05 | 布拉姆斯股份公司 | 利用新颖标志物CT-proADM进行诊断和危险分层 |
CN103884841A (zh) * | 2006-12-20 | 2014-06-25 | 布拉姆斯股份公司 | 利用新颖标志物CT-proADM进行诊断和危险分层 |
US8853355B2 (en) | 2006-12-20 | 2014-10-07 | B.R.A.H.M.S Gmbh | Diagnosis and risk stratification by determining the marker CT-proADM |
US20150011017A1 (en) * | 2006-12-20 | 2015-01-08 | Brahms Gmbh | Diagnosis and risk stratification by means of the novel marker ct-proadm |
US9726675B2 (en) | 2006-12-20 | 2017-08-08 | B.R.A.H.M.S. Gmbh | Diagnosis and risk stratification by determining the marker CT-proADM |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4423426B2 (ja) | 2010-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20050244904A1 (en) | Diagnostics based on signal peptide detection | |
JP2008513536A (ja) | プロガストリンに対するモノクローナル抗体 | |
US20050244902A1 (en) | Methods for determining levels of human b-type natriuretic peptide precursors | |
JP2008512685A (ja) | ナトリウム利尿ペプチドを測定するための方法および組成物並びにその使用 | |
WO2013132347A2 (en) | Improved elisa immunoassay for calprotectin | |
WO2009091023A1 (ja) | 腎癌の診断又は検出のための組成物及び方法 | |
US11719697B2 (en) | Immunoassay and antibodies for the detection of chromogranin A | |
US20190100576A1 (en) | Signal biomarkers | |
JP2006521569A (ja) | ガストリンホルモン免疫アッセイ | |
PT1664769E (pt) | Ensaio para a detecção das pro-hormonas peptídicas natriuréticas auricular e cerebral | |
RU2607588C2 (ru) | Способ получения агента, связывающегося с препро-вазопрессином или с его фрагментами | |
JP2000515854A (ja) | 脳タンパク質s―100の存在の測定方法 | |
Nakamura et al. | Generation of monoclonal antibodies against a soluble form of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 and development of a sensitive chemiluminescent enzyme immunoassay | |
JPH1080272A (ja) | 雑種細胞系の使用方法 | |
JP4423426B2 (ja) | アドレノメデュリン前駆体c末端ペプチドの濃度の上昇を循環器疾患又は炎症性疾患の指標とする方法 | |
JP5861870B2 (ja) | 終末期腎不全の検出方法 | |
JP5354158B2 (ja) | 抗デカン酸修飾型グレリン抗体、デカン酸修飾型グレリン測定方法、およびデカン酸修飾型グレリン分離回収方法 | |
JP6183920B2 (ja) | 腎炎の病変部位の検査方法およびそのための試薬 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090423 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20090423 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20090526 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090602 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090730 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090825 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091019 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091110 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |