JP2007526330A - 多成分系生物学的輸送系 - Google Patents

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Abstract

インスリン、ボツリヌストキシン、抗体断片、及びＶＥＧＦを除いて、非タンパク質非核酸系治療薬やタンパク質ベースの治療薬など生物学的に活性な作用物質の経皮送達を含めて、送達に有用な組成物及び方法が提供される。これらの組成物及び方法は、抗真菌物質及び免疫化に適した抗原性物質の局所送達に特に有用である。或いは、組成物は、これらの組成物の送達を標的化するのに有用な成分、並びにイメージング成分と共に調製することができる。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０００年７月２１日に出願された米国仮出願第６０／２２０２４４号の優先権を主張する、２００１年７月２０日に出願された米国特許出願第０９／９１０４３２号の一部継続出願であり、これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究及び開発のもとで行われた発明に対する権利に関する記載
該当無し
遺伝子送達系は、大まかに２つのグループ、即ちウイルス系及び非ウイルス系に分類することができる。ウイルス系は、大きな毒性リスクを有し、臨床試験において重い合併症及び死亡をもたらした。非ウイルス系は、ウイルスの手法よりかなり効率が低いが、特異性を高め、毒性を潜在的に低減するように用途を調整できる可能性を提供する。非ウイルス系戦略は、大まかに脂質ベース、又は非脂質ベースに分類することができる。本発明で提示する戦略は、既存の非ウイルス系手法の任意のものに適用することができ、したがって、すべて本明細書で説明される。
最も簡易な非ウイルス系は、ＤＮＡの直接送達である。ＤＮＡの負電荷が原因で、ＤＮＡのごくわずかしか、実際には細胞内に入らず、大半は分解される。戦略において核標的配列は無く、事実上、ＤＮＡは全く核内に入らない。通常、エレクトロポレーション、超音波、「遺伝子銃」、直接のマイクロインジェクションなど機械的効果によって、又は電荷中和及びリン酸カルシウム、ポリリジン、リポソーム調製物などの作用物質を用いた化学的効果によって、遺伝子／産物送達（ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは、より最近ではタンパク質治療薬）の効率を高めるために、別の因子が使用される。後者の戦略では、電荷中和は、リポソーム調製物単独の同等の化学的／機械的効果よりも数倍大きい非特異的な効率を高めることが示されている。これら及び同様の結果に基づき、ＤＮＡの負電荷は、引き続いてリソソーム融合（他の作用物質の添加により逃れられる）を伴う原形質崩壊による場合を除いて輸送を本質的に妨げるため、ＤＮＡ及びＲＮＡは、細胞取込みの効率を上げるために電荷中和を必要とすると多くの研究者が結論づけた。大半のトランスフェクション剤は、実際には、正味のＤＮＡ負電荷の２〜４倍の比率で、過剰の正電荷を使用する。得られる正のハイブリッドは、負に帯電した細胞表面のプロテオグリカンにイオン結合し、その後の取込みを劇的に増進する。一部のトランスフェクション剤は、細胞向性を有しているようであり、これは、細胞型に特異的なパターンで変わる、個々のプロテオグリカンをより効果的に標的とする立体及び荷電パターンが寄与している可能性が最も高い。適切な作用物質（即ち、正確な向性）を用いても、単独又はリポソームと組み合わせた電荷中和は、ウイルス戦略に比べて、依然として極めて非効率的である。したがって、本団体（community）は、複合体が細胞中に、また任意のエンドリソソーム段階を過ぎて効率的に移行するのを促進するいくつかのペプチド及びペプチド断片を同定した。いくつかのこのような輸送因子は、効率的な核移行さえも可能にする。一方法では、輸送因子は、対象となる治療用生成物（小型の薬物、遺伝子、タンパク質など）に直接連結されている。この手法は、その輸送因子に結合した新しい薬物を作製し、精製し、試験することを必要とする。多くの場合、これらのハイブリッドは、実際には新しい薬物に相当し、十分な試験を必要とすると考えられる。このような方法により、かなりのリスク及び費用が追加される。或いは、いくつかの戦略は、薬物／ＤＮＡ／因子用の担体としてのリポソーム調製物中に非特異的に（さらには表面に特異的に）作用物質を混合することを使用するだけである。直接又はより簡易な様式よりは効率の点で改善されているが、これらの手法は依然として（ウイルスに比べて）非効率的であり、単純なウイルス戦略よりかなり有毒である。この非効率性の一部は、核移行が乏しいことに起因する。結果として、戦略は発展して、治療因子ハイブリッドの一部分として、又はリポソーム混合物の一部分として、上記に詳述した複合体に核移行シグナルを添加するようになった。追加の改善には、ＤＮＡ／ＲＮＡ／因子の分解を低減するための努力も含まれた。
おそらく、上記に提示した基本的な戦略において最も重要な改善は、治療因子と共に特異的リガンド又は他の標的物質を含んだことである。これらの戦略は、非特異的な毒性を大いに低減し、特に前述の効率物質（efficiency agent）と組み合わせた場合に、効率をかなり改善する可能性を与える。しかし、現在の戦略は、単一の担体への共有結合に依拠しており、したがって、（ある程度の置換スキームにおける立体的考慮が、他のものより単一の因子に有利とならないことを確実にするため、即ち、各効率因子（efficiency factor）及び各イメージング部分（imaging moiety）、並びに各標的（targeting）部分が主鎖上に存在していることを確実にするための）特異的な合成を必要とする。このため、いくつかの特異的構築物は実質的に存在し得ない（例えば、表面抗原に対するシアリルルイスＸ及びＦａｂフラグメント。立体的な制限が、大半のスキームにおいて１つ又は別のものの効率的な結合を妨げ、その結果として、効率因子を妨害すると考えられるためである。）。概念は有望であるものの、これらの手法は、この問題に対して、費用がかかり、（合成の点で）収率が非常に低く、実証されていない解決法である。
明らかなことには違いないが、非ウイルス系の遺伝子及び因子送達の開発の各段階に伴い、諸問題が発生し、これらは、次の段階で、複雑性の程度を増すことによって解決された。各改良は、以前の標準より漸進的なステップに相当した。しかし、複雑性の増大は、患者看護の観点からのリスク、並びに製造の観点からの非効率化及び費用増をもたらす。これらの障害により、他の点では有望なこれらの潜在的な治療法に対する興味は大きく損なわれる結果になった。
必要とされているのは、特定の部位への送達を最大化するために標的化又は画像化することができる多様な治療用又は薬用化粧（cosmeceutical）物質の組成物に広く適用可能な、新しい方法及び組成物である。驚くべきことに、本発明は、そのような組成物及び方法を提供する。
本発明はさらに、インスリンなどのタンパク質、また、より大型の治療用及び診断用物質、例えば、ボツリヌストキシンなどのタンパク質、或いは、例えば、インスリン、ボツリヌストキシン、治療的に血中グルコースレベル（血糖値）を変えない治療用タンパク質、核酸ベースの作用物質、ある種の抗真菌薬など非タンパク質非核酸系治療物質、又は免疫化用の作用物質など他の生物学的に活性な作用物質を含めて、５０，０００以上の分子量を有するような物質の経皮送達用の調製物にも関する。本発明は、詳細には、「治療的」又は「生物学的に活性なタンパク質」という用語を使用する場合、特定の抗原に結合するだけ以外に生物活性を有さない抗体断片を除外する。しかし、免疫化に適した抗原は、免疫応答を開始するなど他の生物活性を有するため、これらは、本発明の適切な態様に含まれたままである。さらに、特定の抗原に結合し、それによってリガンド結合を妨害し、又は抗原の構造を改変することによって生物活性又は治療効果を有する作用物質も、本発明に含まれる。
ボツリヌストキシン（ボツリヌス（botulin）毒素又はボツリヌス神経毒素としても公知である）は、グラム陽性細菌のボツリヌス菌（Clostridium botulinum）によって産生される神経毒素である。これらは、神経筋接合部を通過するアセチルコリンの総観的（synoptic）伝達又は放出を防止することによって、筋肉の麻痺を生じさせる作用を果たし、同様に他の方法でも作用すると考えられている。それらの作用は、本質的には、普通なら筋肉の痙攣又は収縮を引き起こして麻痺をもたらすはずであり、或いは、腺分泌又は多汗症や座瘡などの過排出を引き起こすはずである、シグナルを遮断する。
ボツリヌストキシンは、血清学的に関連しているが異なる、８種の神経毒素に分類されている。これらのうち、７種、即ち、ボツリヌス神経毒素の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧは、麻痺を引き起こすことができる。これらのそれぞれは、型特異的抗体による中和によって区別される。各型は、天然型、組換作製型、又はタンパク質融合など人工的に作り出された変種でよい。それでもなお、ボツリヌストキシンタンパク質分子の分子量は、これら天然の活性なボツリヌストキシン血清型の７種すべて又はそれらの組換型において、約１５０ｋＤである。細菌によって放出されるとき、ボツリヌストキシンは、結合した無毒性タンパク質と共に当該の１５０ｋＤボツリヌストキシンタンパク質分子を含む複合体である。Ａ型ボツリヌストキシン複合体は、９００ｋＤ、５００ｋＤ及び３００ｋＤ型として、クロストリジウム（Clostridia）属細菌によって産生され得る。Ｂ型及びＣ型ボツリヌストキシンは、７００ｋＤ又は５００ｋＤの複合体としてのみ産生されるようである。Ｄ型ボツリヌストキシンは、３００ｋＤ及び５００ｋＤの双方の複合体として産生される。Ｅ型及びＦ型ボツリヌストキシンは、約３００ｋＤの複合体としてのみ産生される。これらの複合体（即ち分子量が約１５０ｋＤより大きいもの）は、無毒素のヘマグルチニンタンパク質及び無毒素且つ無毒性の非ヘマグルチニン（nonhemaglutinin）タンパク質を含有すると考えられている。これら２種の無毒性タンパク質（ボツリヌストキシン分子と共に、当該の神経毒素複合体を含む）は、ボツリヌストキシン分子に対する変性に対抗する安定性、及びトキシンが経口摂取された場合の、消化酸からの保護を実現する役割を果たすことができる。さらに、より大型の（分子量が約１５０ｋＤより大きい）ボツリヌストキシン複合体は、ボツリヌストキシン複合体の筋肉内注射部位から離れた場所に、より遅い速度でボツリヌストキシンを拡散させることができる。
様々な血清型のボツリヌストキシンは、作用する動物種、並びに誘発する麻痺の重症度及び持続期間において異なる。例えば、ラットで生じる麻痺の速度で評価すると、Ａ型ボツリヌストキシンは、Ｂ型ボツリヌストキシンより５００倍強力であることが測定されている。さらに、Ｂ型ボツリヌストキシンは、Ａ型に対する霊長類のＬＤ５０の約１２倍である４８０Ｕ／ｋｇの用量では、霊長類において無毒性であることが確認されている。ボツリヌストキシンの分子サイズ及び分子構造が原因となって、ボツリヌストキシンは、角質層及びその下にある皮膚構造の複数の層を通過することができない。
Ａ型ボツリヌストキシンは、人類に知られている最も致死的な天然の生物学的作用物質であると言われている。ボツリヌス菌（C.botulinum）の胞子は土壌中に存在し、また、不適切に滅菌され、密封された食品容器中で増殖することができる。この細菌を経口摂取すると、致死的になることがあるボツリヌス中毒を引き起こし得る。同時に、ボツリヌストキシンの筋肉麻痺効果は、治療効果のためにも使用されている。ボツリヌストキシンの制御投与は、病態、例えば、機能亢進性の骨格筋を特徴とする神経筋障害を治療するために筋肉麻痺を与えるのに使用されている。ボツリヌストキシンで治療されている病態としては、片側顔面痙攣、成人発症型痙性斜頚、裂肛、眼瞼痙攣、脳性麻痺、頚部ジストニア、片頭痛、斜視、顎（temperomandibular）関節障害、並びに様々なタイプの筋痙攣及び痙攣が挙げられる。より最近では、ボツリヌストキシンの筋肉麻痺効果は、しわ、眉間のしわ、及び顔面筋肉の痙攣又は収縮による他の結果の治療など治療的及び美容的な顔への用途に利用されている。
ボツリヌス中毒、即ち、全身性のボツリヌストキシン暴露に起因する特徴的な症状群は、古代からヨーロッパで存在していた。１８９５年に、Emile P. van Ermengemは、ベルギーでボツリヌス中毒が原因で死んだ犠牲動物の死後組織から得た生の塩漬け豚肉から、嫌気性の胞子形成桿菌を初めて単離した。Van Ermengemは、彼がバチルス・ボツリヌス（Bacillus botulinus）と呼んだものによって産生される細胞外毒素によって疾患が引き起こされることを発見した（Van Ermengem, Z Hyyg Infektionskr, 26:1-56; Rev Infect (1897)）。この名称は、１９２２年にクロストリジウム・ボツリヌス（Clostridium botulinum）に変更された。クロストリジウムという名称は、その微生物の嫌気性の性質、また、その形態学的特徴を反映するために使用された（Carruthers and Carruthers, Can J Ophthalmol, 31:389-400 (1996)）。１９２０年代には、食中毒のさらなる集団発生後に、Ａ型ボツリヌストキシンの粗製の型が単離された。サンフランシスコ州カリフォルニア大学のHerman Sommer博士は、神経毒素を精製しようと初めて試みた（Borodic et al., Ophthalmic Plast Recostr Surg, 7:54-60 (1991)）。１９４６年に、Edward J. Schantz博士及び彼の同僚は、結晶型の神経毒素を単離した（Schantz et al., In: Jankovi J, Hallet M (Eds) Therapy with Botulinum Toxin, New York, NY: Marcel Dekker, 41-49 (1994)）。１９４９年までに、Burgen及び彼の共同研究者は、 ボツリヌストキシンが、神経筋接合部を通過するインパルスを遮断することを実証することに成功した（Burgen et al., J Physiol, 109:10-24 (1949)）。Allan B. Scottは、１９７３年に、サルでＡ型ボツリヌストキシン（ＢＴＸ−Ａ）を初めて使用した。Scottは、可逆性の眼筋麻痺が３ヶ月持続することを実証した（Lamanna, Science, 130:763-772 (1959)）。その後すぐに、ＢＴＸ−Ａは、ヒトの斜視、眼瞼痙攣、及び痙性斜頚の上出来の治療薬であることが報告された（Baron et al., In: Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM (Eds), Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, St. Louis, MO: Mosby Year Book, 504-523 (1994); Carruthers and Carruthers, Adv Dermatol, 12:325-348 (1997); Markowitz, In: Strickland GT (Eds) Hunters Tropical Medicine, 7th ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 441-444 (1991)）。１９８６年に、Jean及びAlastair Carruthers、即ち、眼科形成外科医及び皮膚科医からなる夫妻のチームは、眉間領域における動作に関連したしわを治療するためのＡ型ボツリヌストキシン（ＢＴＸ−Ａ）の美容用途を開発し始めた（Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York:Academic Press, 143-150 (1981)）。CarruthersはＢＴＸ−Ａをしわの治療用に使用し、１９９２年に彼らはこの手法に関する影響力の大きい論文を発表した。（Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)）。１９９４年までに、同チームは、動作に関連した顔面の他のしわを用いた経験を報告した（Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)）。これは、結果として、美容用のＢＴＸ−Ａ治療の時代の誕生をもたらした。
皮膚は、外部環境の脅威から身体の器官を保護し、身体の温度を維持するためのサーモスタットの役割を果たす。皮膚は、いくつかの異なる層からなり、それぞれは特殊な機能を有する。主要な層には、表皮、真皮、及び下皮が含まれる。表皮は、結合組織からなる、真皮の上に横たわる上皮細胞の層状の層である。表皮と真皮の双方とも、皮下組織、即ち脂肪組織の内層によってさらに支持されている。
表皮、即ち皮膚の最上層は、０．１〜１．５ミリメートルの厚さしかない（Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。表皮は、ケラチノサイトからなり、分化状態に基づいていくつかの層に分けられる。表皮は、角質層、並びに、顆粒メルピギー（melphigian）及び基底細胞からなる分裂可能な表皮にさらに分類することができる。角質層は吸湿性であり、その屈曲性及び柔軟性を維持するために少なくとも１０％重量の水分を必要とする。吸湿性は、ある程度は、ケラチンの保水力に起因し得る。角質層は、その柔軟性及び屈曲性を失うと、粗く且つ脆くなり、乾燥した皮膚を生じる。
表皮の真下に横たわる真皮は、１．５〜４ミリメートルの厚さである。これは、皮膚の３種の層のうちで最も厚い。さらに、真皮は、汗腺及び皮脂腺（孔（pore）と呼ばれる皮膚中の開口部、又は面ぽうを通して物質を分泌する）、毛穴、神経終末、並びに血管及びリンパ管を含めて、皮膚構造体の大部分が存在する場所でもある（Inlander, Skin, New York, NY:People's Medical Society, 1-7 (1998)）。しかし、真皮の主成分は、コラーゲン及びエラスチンである。
皮下組織は、皮膚の最下層である。皮下組織は、体温維持のための絶縁体としての役割と器官保護のための衝撃吸収材としての役割の両方を果たす（Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。さらに、皮下組織はまた、エネルギー備蓄のために脂肪を蓄える。皮膚のｐＨは、一般に５〜６である。この酸性度は、皮脂腺の分泌物に由来する両性のアミノ酸、乳酸、及び脂肪酸の存在に起因する。「酸外套（acid mantle）」という用語は、皮膚の大部分の領域に水溶性物質が存在することに関係する。皮膚の緩衝能は、一部には、皮膚の角質層で蓄積されているこれらの分泌物によるものである。
しわは、加齢の証拠となる徴候の１つであり、環境的損傷から蓄積する生化学的、組織学的、及び生理的変化によって引き起こされ得る（Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999)）。さらに、顔のしわの特徴的なひだ、溝、及び折り目を引き起こし得る他の２次因子もある（Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nded., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)）。これらの２次因子としては、重力の恒常的な引張り、皮膚に対する高頻度且つ恒常的な位置的圧力（即ち、就寝中）、及び顔筋の収縮によって生じる反復性の顔面運動が挙げられる（Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nded., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)）。加齢の徴候のうちのいくつかを潜在的に軽減するために、様々な技術が利用されている。これらの技術は、αヒドロキシ酸及びレチノールを含有する顔用保湿剤から、外科的処置及び神経毒素の注射にまで及ぶ。
皮膚の主要機能のうちの１つは、水及び正常な恒常性に対して潜在的に有害な物質の輸送に対する障壁を提供することである。丈夫な半透性の皮膚が無ければ、身体は急速に水分を失うはずである。皮膚は、有害物質の身体への進入を防止するのに寄与する。大半の物質は、この障壁を透過することができないが、皮膚の透過性を選択的に高めるためにいくつかの戦略が開発され、いくらか成功を収めている。
ＢＴＸは、皮膚を効率的に透過することができないため、ＢＴＸの治療効果を実現するためには、現在のところ、毒素を皮膚に注射しなければならない。連邦食品医薬品局は、しわ治療のためにそのような処置を承認し、ＢＴＸ製品は、この治療用に現在市販されている。このような治療では、ボツリヌストキシンは、注意深く管理され監視された注射により投与され、治療部位に毒素の大きな溜まり場（well）を作り出す。しかし、このような治療は不快感を与えることがあり、より一般には、いくらかの痛みを伴うことがある。
ボツリヌストキシンの局所適用は、適用が無痛性であること、包含され得る治療表面積がより大きいこと、より高い特異的活性を有する純粋な毒素を調製できること、ボツリヌス治療薬を使用するための訓練が軽減されること、効果を発揮するのに必要な用量がより少ないことによって、より安全でより望ましい治療の代替手段となり、また、治療的な臨床結果に達するために、大量の毒素の溜まり場が必要とされない。
他の治療薬の経皮投与も、例えば、患者の不快感が低減される可能性、血流中への治療薬の直接投与、並びに特別に作られた器具及び／又は制御放出製剤と技術の使用を通して監視された送達をする機会があるため、関心の非常に高い領域である。投与の容易さが望まれる１つの物質はインスリンであり、多くの場合、いまだに注射（自己注射を含む）によって投与しなければならない。投与が容易であることは、ボツリヌストキシンなどより大型のタンパク質にとっても有利なはずである。皮膚を容易に通過しないがインスリンより実質的に小さい他の作用物質は、様々な生理化学的諸特性を有し、したがって、この移動を促進する付加的な物質の有無に関わらず、皮膚を通過する速度及び能力が大きく異なる。各物質と移動を促進する物質とのさらなる相互作用は、各々について特有である。
Van Ermengem, Z Hyyg Infektionskr, 26:1-56; Rev Infect (1897) Carruthers and Carruthers, Can J Ophthalmol, 31:389-400 (1996) Borodic et al., Ophthalmic Plast Recostr Surg, 7:54-60 (1991) Schantz et al., In: Jankovi J, Hallet M (Eds) Therapy with Botulinum Toxin, New York, NY: Marcel Dekker, 41-49 (1994) Burgen et al., J Physiol, 109:10-24 (1949) Lamanna, Science, 130:763-772 (1959) Baron et al., In: Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM (Eds), Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, St. Louis, MO: Mosby Year Book, 504-523 (1994) Carruthers and Carruthers, Adv Dermatol, 12:325-348 (1997) Markowitz, In: Strickland GT (Eds) Hunters Tropical Medicine, 7th ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 441-444 (1991) Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York:Academic Press, 143-150 (1981) Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980) Inlander, Skin, New York, NY:People's Medical Society, 1-7 (1998) Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999) Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nded., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)
一態様では、本発明は、
ａ）正に帯電した主鎖と、
ｂ）ｉ）複数の結合されたイメージング部分を有する、負に帯電した第１の主鎖、或いは、負に帯電した複数のイメージング部分、
ii）複数の結合された標的物質を有する、負に帯電した第２の主鎖、或いは、負に帯電した複数の標的部分、
iii）ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイム、改変されたオリゴヌクレオチド、及び選択された導入遺伝子をコードするｃＤＮＡから選択される少なくとも１つのメンバー、
iv）少なくとも１つの持続因子（persistence factor）をコードするＤＮＡ、並びに
ｖ）複数の結合された生物学的作用物質を有する、負に帯電した第３の主鎖、又は負に帯電した１つの生物学的作用物質
からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーと
の非共有結合性複合体を含む組成物であって、
その複合体が正味の正電荷を有し、メンバーのうちの少なくとも１つがｉ）、ii）、iii）又はｖ）から選択される組成物を提供する。
本発明のこの態様では、生物学的作用物質は、治療物質又は薬用化粧物質でよい。本発明は、詳細には、「治療的」又は「生物学的に活性なタンパク質」という用語が使用される場合は、特定の抗原にただ結合すること以外に生物活性を有していない抗体断片を除外する。しかし、免疫化に適した抗原は、免疫応答を開始するなど他の生物活性を有するため、これらは、本発明の適切な態様に含まれたままである。さらに、特定の抗原に結合し、それによってリガンド結合を妨害し、又は抗原の構造を改変することによって生物活性又は治療効果を有する作用物質も、本発明に含まれる。或いは、候補物質を用いて、これらの非共有結合性複合体のインビボでの有効性を測定することもできる。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの結合された効率基（efficiency group）を有する、正に帯電した主鎖と、ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイム、改変されたオリゴヌクレオチド、及び選択された導入遺伝子をコードするｃＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの核酸メンバーとの非共有結合性複合体を含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、被験者の細胞表面に生物学的作用物質を送達するための方法であって、前記被験者に前述の組成物を投与することを含む方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、薬剤組成物又は薬用化粧組成物を調製するための方法であって、正に帯電した主鎖成分と、
ｉ）複数の結合されたイメージング部分を有する、負に帯電した第１の主鎖、或いは、複数の負に帯電したイメージング部分、
ii）複数の結合された標的物質を有する、負に帯電した第２の主鎖、或いは、複数の負に帯電した標的部分、
iii）ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイム、改変されたオリゴ核酸、及び選択された導入遺伝子をコードするｃＤＮＡから選択される少なくとも１つのメンバー、
iv）少なくとも１つの持続因子をコードするＤＮＡ、並びに
ｖ）複数の結合された生物学的作用物質又は薬用化粧物質を有する、負に帯電した第３の主鎖、或いは負に帯電した１つの生物学的作用物質又は薬用化粧物質、
からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーとを、
製薬上又は薬用化粧品用に許容される担体と組み合わせて、正味の正電荷を有する非共有結合性複合体を形成させることを含み、且つ、前記メンバーのうちの少なくとも１つがｉ）、ii）、iii）又はｖ）から選択されることを条件とする方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、薬剤送達組成物又は薬用化粧品送達組成物を調製するためのキットであって、正に帯電した主鎖成分と、上記のｉ）〜ｖ）の群から選択される少なくとも２つの成分とを、送達組成物を調製するための取扱い説明書と共に含むキットを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、インスリン、ボツリヌストキシン、治療的に血中グルコースレベルを変えない他のタンパク質、核酸ベースの作用物質、ある種の抗真菌薬など非タンパク質非核酸系治療物質、或いは免疫化用の作用物質など生物学的に活性な作用物質と、本明細書ですべて説明するような、結合された正に帯電した分枝又は「効率」基を持つ主鎖を有する、正に帯電した担体を含む担体とを含む組成物に関する。本発明は、詳細には、「治療的」又は「生物学的に活性なタンパク質」という用語が使用される場合は、特定の抗原にただ結合すること以外に生物活性を有していない抗体断片を除外する。しかし、免疫化に適した抗原は、免疫応答を開始するなど他の生物活性を有するため、これらは、本発明の適切な態様に含まれたままである。さらに、特定の抗原に結合し、それによってリガンド結合を妨害し、又は抗原の構造を改変することによって生物活性又は治療効果を有する作用物質も、本発明に含まれる。生物学的に活性な作用物質は、好ましくは、インスリン、ボツリヌストキシン（ＢＴＸ）、免疫化用の抗原、又はいくつかの抗真菌薬である。適切な抗真菌薬としては、例えば、アムホテリシンＢ、フルコナゾール、フルシトシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコノゾール（econozole）、グリセオフルビン、ミコナゾール、ナイスタチン、シクロピロクスなどが挙げられる。最も好ましくは、正に帯電した担体は、比較的短鎖又は中鎖の正に帯電したポリペプチド、又は正に帯電した非ペプチジルポリマー、例えばポリアルキレンイミンである。生物学的に活性な作用物質がボツリヌストキシンである場合、本発明はさらに、好ましくは、このような治療を必要とする被験者又は患者の皮膚に、有効量のボツリヌストキシンを含有する組成物を局所的に適用することによって、筋肉麻痺、過分泌若しくは発汗の低減、神経性の疼痛若しくは片頭痛の治療、筋肉痙攣の低減、座瘡の予防若しくは軽減、又は、免疫応答の低減若しくは増進などの生物学的効果を生み出すための方法に関する。本発明はまた、例えば、顔筋に注射する方法の代わりに、顔にボツリヌストキシンを局所適用することによって、美容効果及び／又は化粧効果を生み出すための方法にも関する。生物学的に活性な作用物質がインスリンである場合、本発明は、被験者の皮膚又は上皮に、インスリンを含有する組成物、又はインスリンと正に帯電した主鎖との組合せの有効量を適用することによって、被験者にインスリンを経皮的に送達する方法に関する。通常は、本発明の同じ作用物質と担体との複合体に比べて認め得るほどに、皮膚又は上皮を通過することができず、血中グルコースレベルの低下に対して治療効果を持たないタンパク質は、インスリンとは大きく異なる表面及び生理化学的諸特性を有しており、そのため、通常は、インスリンの経皮送達を可能にする技術が、他の任意のタンパク質に対して好ましい結果を生じるかどうかは不確かになっている。しかし、本明細書で記述するように、正に帯電した分枝基を有する正に帯電した主鎖を有する本発明の担体は、実に驚くべきことに、例えば、ボツリヌストキシンを含めて、このような他のタンパク質の経皮送達を実現することができる。個々のタンパク質の経皮送達に適した個々の担体は、実施例で説明するもののような試験によって、容易に特定することができる。このようなタンパク質は、例えば、５０，０００ｋＤ超又は２０，０００ｋＤ未満の分子量を有する大型タンパク質でよい。本明細書においては、血中グルコースレベルの文脈における「治療」という単語は、例えば糖尿病患者において、高血糖症の急性の症状又は徴候を軽減するのに十分な血中グルコースレベルの低下を意味する。本発明のすべての態様において、担体と生物学的に活性な作用物質との結合は、非共有結合性の相互作用によるものであり、例えば、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せを挙げることができる。本発明のいくつかの態様では、血中グルコースレベルの治療的変更を実現することができる治療用タンパク質の経皮送達は、詳細には除外される。本明細書において使用されるように、免疫化に適した抗原性物質は、血中グルコースレベルを治療的に変更しないタンパク質ベースの抗原、非タンパク質非核酸系作用物質、又はそれらのハイブリッドでよい。しかし、抗原をコードする核酸は、詳細には、本発明の組成物に適していない。したがって、含まれる作用物質は、それ自体が、免疫化に適した抗原である。適切な抗原としては、例えば、環境物質、病原体、又は生物学的有害物質に対するものが挙げられる。適切な作用物質としては、好ましくは、例えば、ボツリヌス中毒、マラリア、狂犬病、炭そ、結核に関係のある抗原、又は、Ｂ型肝炎、ジフテリア、百日咳、破傷風、ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、不活性化ポリオウイルス、はしか、おたふくかぜ、風疹、水痘、肺炎球菌、Ａ型肝炎、及びインフルエンザなど幼児期の免疫化に関係のある抗原が挙げられる。
本明細書において説明する、正に帯電した分枝基を有する正に帯電した担体又は主鎖は、それ自体が新規の化合物であり、本発明の別の態様となる。
本発明はまた、正に帯電したポリペプチド、又は長鎖ポリアルキレンイミンなど正に帯電した非ペプチジルポリマーを含み、そのポリペプチド又は非ペプチジルポリマーが、正に帯電した分枝基又は本明細書で定義する「効率」基を有している担体を、例えば、インスリン、ボツリヌストキシン、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、核酸ベースの作用物質、ある種の抗真菌薬など非タンパク質非核酸系治療物質、或いは免疫化用の作用物質など生物学的に活性な作用物質と組み合わせることを含む、薬剤組成物又は薬用化粧組成物を調製するための方法も提供する。本発明はまた、担体及び治療物質を含む組成物を調製又は配合するためのキット、並びに、使用可能な調製物を作製するのに必要な追加品目、又はそのような調製物を作製するのに次いで使用することができるプレミックスも提供する。このようなキットは、本発明の組成物又はその成分及び方法を適用するための、アプリケーター又は他の器具からなってよい。本明細書では、「器具」とは、例えば、送達若しくは混合用の器具若しくはアプリケーター、又は本発明の組成物及び方法を形成若しくは適用するための他の調製技術を指してよい。
本発明はまた、一実施形態では、正に帯電した好ましくは短鎖から中鎖長のポリペプチドを含む担体、又は正に帯電した分枝若しくは本明細書で定義する「効率」基を有するより長鎖の非ペプチジルポリマー担体、及び言及したばかりの治療物質を含む組成物内に含有される、例えば、インスリン、ボツリヌストキシン、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、核酸ベースの作用物質、ある種の抗真菌薬など非タンパク質非核酸系治療物質、或いは免疫化用の作用物質など生物学的に活性な作用物質の経皮送達用の器具も含む。このような器具は、皮膚パッチと同じくらい構造が単純なものでもよく、又は、組成物の投与及び投与の観察をするための手段、また、場合によっては、投与された物質に対する被験者の反応を観察することを含めて、１つ又は複数の態様において被験者の状態を観察するための手段を含む、より複雑な器具でもよい。本発明のすべての態様において、担体と生物学的に活性な作用物質との結合は、非共有結合性の相互作用によるものであり、例えば、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せを挙げることができる。
或いは、この器具は、治療用の生物学的に活性な作用物質、例えば、インスリン、ボツリヌストキシン、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、核酸ベースの作用物質、ある種の抗真菌薬など非タンパク質非核酸系治療物質、或いは免疫化用の作用物質のみを含んでもよく、担体を別に皮膚に適用してもよい。したがって、本発明は、皮膚を介して投与するための器具と正に帯電した担体又は主鎖を含む物質の双方を含み、被験者の皮膚又は上皮に適用するのに適したキットも含む。
一般に、本発明は、例えば、インスリン、ボツリヌストキシン、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、核酸ベースの作用物質、ある種の抗真菌薬など非タンパク質非核酸系治療物質、或いは免疫化用の作用物質など生物学的に活性な作用物質を、それらを必要とする被験者又は患者に投与するための方法であって、本明細書で説明するように、有効量の前記生物学的に活性な作用物質を正に帯電したポリペプチド、又は正に帯電した分枝基を有するポリアルキレンイミンなど非ポリペプチジルポリマーと組み合わせて局所投与することを含む方法も含む。「組み合わせて」とは、２種の成分、即ち、生物学的に活性な作用物質及び正に帯電した担体が、組み合わせた方法で投与されることを意味する。この方法は、それらを１つの組成物中で混合し、次いでそれを被験者に投与するものでもよく、或いは、別々ではあるが、それらが共に作用して、有効量の生物学的に活性な作用物質の必要な送達が実現するような様式でそれらを投与するものでもよい。例えば、正に帯電した担体を含有する組成物を最初に被験者の皮膚に適用し、続いて、生物学的に活性な作用物質を含有する皮膚パッチ又は他の器具を適用してもよい。
本発明は、例えば、インスリン、ボツリヌストキシン、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、核酸ベースの作用物質、ある種の抗真菌薬など非タンパク質非核酸系治療物質、或いは、本明細書で定義する免疫化用の作用物質など生物学的に活性な作用物質を、皮膚の上皮細胞以外のもの、例えば、眼上皮細胞又は胃腸管系の細胞を含めて、上皮細胞に適用する方法にも関する。
発明の説明
概要
本発明は、イメージング物質、遺伝子、又は他の治療物質を選択的且つ持続的に送達するための成分ベースの系を提供する。組成物の個々の特徴は、臨床用の（bedside）製剤において望ましい成分を指定することによって、選択することができる。さらに、一態様では、イメージング部分及び特異的な標的部分は、正に帯電した主鎖と非共有結合性イオン結合型複合体を形成する、負に帯電した別々の主鎖上で提供される。負に帯電した主鎖上にこれらの成分を配置することによって、本発明は、他の戦略（複雑性及び費用を増大し、立体的制約が原因で首尾良い組合せがまだ報告されていないレベルまで効率を低下させる）で使用される場合のように正に帯電した主鎖上の的確な位置に成分を結合させる必要性を回避する。
別の態様では、負に帯電した主鎖を含めることを必要とせずに、正に帯電したいくつかの担体を単独で使用することによって、いくつかの物質を経皮的に送達することができる。これらの事例では、その物質又はその誘導体は、本発明の正に帯電した担体と非共有結合的に結合するのに十分な負電荷を有する。この文脈における「十分な」という用語は、例えば、それらの成分単独に対する粒子測定又は機能的分光測定の変化によって測定することができる結合を意味する。
図１を参照すると、本発明がさらによく理解される。この図では、これらの成分は、（１）結合された正に帯電した基（薄い黒の線に結合した薄い黒の円として示される効率基とも呼ばれる）、例えば、（Ｇｌｙ）ｎ１−（Ａｒｇ）ｎ２（式中、下付き文字ｎ１は、３〜約５の整数であり、下付き文字ｎ２は、約７〜約１７の奇数である）又はＴＡＴドメインを有する濃い色の（solid）主鎖、（２）結合されたイメージング部分（薄い色の線に結合した白の三角形）を有する、負に帯電した短い主鎖、（３）結合された標的物質及び／又は治療物質（薄い色の線に結合した白の円）を有する、負に帯電した短い主鎖、（４）オリゴ核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はｃＤＮＡ（薄い色の網がけの線）、並びに、（５）持続因子をコードするＤＮＡ（黒い網がけの棒）として示されている。図２では、図１で示したように各基が表されている多成分系（multi-component）組成物の様々な例を例示する。例えば、図２では、正に帯電した主鎖が、イメージング成分、標的成分、オリゴ核酸、及び持続因子を結合している、第１の多成分系組成物が例示されている。
診断時／予後の画像化のために設計された第２の多成分系組成物が例示される。この組成物では、正に帯電した主鎖は、イメージング成分と標的成分の双方と複合体を形成している。最後に、遺伝子送達に有用な第３の多成分の系が例示される。この系では、複合体は、正に帯電した主鎖、標的成分、対象となる遺伝子、及び持続因子をコードしているＤＮＡの間で形成されている。本発明は、以下により詳細に説明されるが、治療及び診断プログラムにおいて有用ないくつかの追加の組成物を提供する。
組成物
上記の内容を考慮して、本発明は、一態様では、
ａ）正に帯電した主鎖と、
ｂ）ｉ）複数の結合されたイメージング部分を有する、負に帯電した第１の主鎖、或いは、負に帯電した複数のイメージング部分、
ii）複数の結合された標的物質を有する、負に帯電した第２の主鎖、或いは、負に帯電した複数の標的部分、
iii）ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイム、改変されたオリゴ核酸、及び選択された導入遺伝子をコードするｃＤＮＡから選択される少なくとも１つのメンバー、
iv）少なくとも１つの持続因子をコードするＤＮＡ、並びに
ｖ）複数の結合された生物学的作用物質を有する、負に帯電した第３の主鎖、又は負に帯電した１つの生物学的作用物質、
からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーとの
非共有結合性複合体を含む組成物であって、
その複合体が正味の正電荷を有し、メンバーのうちの少なくとも１つがｉ）、ii）、iii）又はｖ）から選択される組成物を提供する。
実施形態の１つの群では、組成物は、ｉ）〜ｖ）の群から選択される少なくとも３つのメンバーを含む。実施形態の別の群では、組成物は、ｉ）、ii）、iii）、又はiv）の各群から少なくとも１つのメンバーを含む。実施形態のさらに別の群では、組成物は、ｉ）及びii）の各群から少なくとも１つのメンバーを含む。実施形態の別の群では、組成物は、ii）、iii）、及びiv）の各群から少なくとも１つのメンバーを含む。
好ましくは、正に帯電した主鎖は、群ｂ）からのメンバーを合わせた長さの約１〜４倍の長さを有する。或いは、正に帯電した主鎖は、群ｂ）からのメンバーを合わせた電荷の約１〜４倍の電荷比を有する。いくつかの実施形態では、電荷密度は均一であり、長さ及び電荷の比は、ほぼ同じである。サイズ対サイズ（長さ）の比は、成分の分子調査に基づいて決定することができ、又は、成分の質量から決定することができる。
「正に帯電した(positively charged)」とは、その担体が、少なくともいくつかの液相条件下で、より好ましくは少なくとも、いくつかの生理学的に適合する条件下で正電荷を有することを意味する。より詳細には、本明細書で使用する「正に帯電した」とは、問題の基が、第４級アミンなど、すべてのｐＨ条件下で帯電している官能基を含むこと、又は、第１級アミンの場合のｐＨ変化など特定の液相条件下で正電荷を獲得することができる官能基を含むことを意味する。より好ましくは、本明細書で使用する「正に帯電した」とは、生理学的に適合する条件の間に、陰イオンと結合する挙動を起こすものを意味する。当業者には明らかであるように、正に帯電した部分を多数有するポリマーが、ホモポリマーである必要はない。当業者には明らかであるように、正に帯電した部分の他の例は従来技術で周知であり、容易に使用することができる。本発明で説明する、それ自体は治療活性を有さない正に帯電した担体は、例えば、本明細書で説明する組成物及び方法において有用である新規な化合物である。したがって、本発明の別の態様では、本発明者らは、本明細書で説明するような結合された正に帯電した分枝基を有する正に帯電した主鎖を含み、それ自体は治療的な生物活性を有していない任意の担体を含む、これらの新規な化合物を詳述する。本発明は、詳細には、「治療的」又は「生物学的に活性なタンパク質」という用語が使用される場合は、特定の抗原にただ結合すること以外に生物活性を有していない抗体断片を除外する。しかし、免疫化に適した抗原は、免疫応答を開始するなど他の生物活性を有するため、これらは、本発明の適切な態様に含まれたままである。さらに、特定の抗原に結合し、それによってリガンド結合を妨害し、又は抗原の構造を改変することによって生物活性又は治療効果を有する作用物質も、本発明に含まれる。
別の実施形態では、本発明は、一態様で、例えば、インスリン、ボツリヌストキシン、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、核酸ベースの作用物質、ある種の抗真菌薬など非タンパク質非核酸系治療物質、或いは免疫化用の作用物質など生物学的に活性な作用物質と、正に帯電した主鎖、例えば、正に帯電した分枝又は本明細書で定義する「効率」基を有する、正に帯電したポリペプチド、又はポリアルキレンイミンなど、ヘテロポリマーでもホモポリマーでもよい非ペプチジルポリマーを含む担体とを含む組成物を提供する。タンパク質ベースの治療薬及び非タンパク質非核酸系治療薬はそれぞれ、複合体全体の特徴を変える、異なる生理化学特性を有する。正に帯電した主鎖として後述する物質のうちに、このような正に帯電した担体がある。本発明はまた、本明細書で説明する治療有効量の生物学的に活性な作用物質を投与するための方法であって、被験者（ヒトでも他の哺乳動物でもよい）の皮膚又は上皮に、その生物学的に活性な作用物質と、生物学的に活性な作用物質の被験者への経皮送達を実現するのに有効な量の、分枝基を有する正に帯電した主鎖とを適用することを含む方法も提供する。この方法では、生物学的に活性な作用物質及び正に帯電した担体は、予め混合した組成物として適用してもよく、或いは、別々に皮膚又は上皮に適用してもよい（例えば、作用物質は皮膚パッチ又は他の器具中に存在してよく、担体は、液体、又は皮膚パッチを貼付する前に皮膚に適用される他のタイプの組成物中に含有されてもよい）。本明細書においては、血中グルコースレベルの文脈における「治療」という単語は、例えば糖尿病患者において、高血糖症の急性の症状又は徴候を軽減するのに十分な血中グルコースレベルの低下を意味する。本発明のいくつかの態様では、血中グルコースレベルの治療的変更を実現することができる治療用タンパク質の経皮送達は、詳細には除外される。本発明は、詳細には、「治療的」又は「生物学的に活性なタンパク質」という用語が使用される場合は、特定の抗原にただ結合すること以外に生物活性を有していない抗体断片を除外する。しかし、免疫化に適した抗原は、免疫応答を開始するなど他の生物活性を有するため、これらは、本発明の適切な態様に含まれたままである。さらに、特定の抗原に結合し、それによってリガンド結合を妨害し、又は抗原の構造を改変することによって生物活性又は治療効果を有する作用物質も、本発明に含まれる。本明細書において使用されるように、免疫化に適した抗原性物質は、血中グルコースレベルを治療的に変更しないタンパク質ベースの抗原、非タンパク質非核酸系作用物質、又はそれらのハイブリッドでよい。しかし、抗原をコードする核酸は、詳細には、本発明の組成物に適していない。したがって、含まれる作用物質は、それ自体が、免疫化に適した抗原である。適切な抗原としては、例えば、環境物質、病原体、又は生物学的有害物質に対するものが挙げられる。適切な作用物質としては、好ましくは、例えば、ボツリヌス中毒、マラリア、狂犬病、炭そ、結核に関係のある抗原、又は、Ｂ型肝炎、ジフテリア、百日咳、破傷風、ｂ型インフルエンザ菌、不活性化ポリオウイルス、はしか、おたふくかぜ、風疹、水痘、肺炎球菌、Ａ型肝炎、及びインフルエンザなど幼児期の免疫化に関係のある抗原が挙げられる。
正に帯電した主鎖（positively charged backbone）
正に帯電した主鎖（正に帯電した「担体」とも呼ぶ）は、典型的には、原子の直鎖であり、生理的ｐＨで正電荷を有する基を鎖中に含み、又は、主鎖から伸びた側鎖に結合された、正電荷を有する基を含む。好ましくは、正に帯電した主鎖それ自体は、所定の酵素活性又は生物活性を有していないと考えられる。直鎖状の主鎖は、炭化水素主鎖であり、いくつかの実施形態では、窒素、酸素、硫黄、ケイ素、及びリンから選択されるヘテロ原子が割り込んでいる。主鎖の原子の大半は、通常は、炭素である。さらに、主鎖は、しばしば、繰り返し単位（例えば、アミノ酸、ポリ（エチレンオキシ)、ポリ（プロピレンアミン）、ポリアルキレンイミンなど）のポリマーである。実施形態の１つの群では、正に帯電した主鎖は、いくつかのアミン窒素原子が、正電荷を有するアンモニウム基（４置換型）として存在するポリプロピレンアミンである。別の実施形態では、正に帯電した主鎖は、ポリアルキレンイミン、例えばポリエチレンイミン又はポリプロピレンイミンなど、約１０，０００〜約２，５００，０００、好ましくは約１００，０００〜約１，８００，０００、最も好ましくは約５００，０００〜１，４００，０００の分子量を有する、ヘテロポリマーでもホモポリマーでもよい非ペプチジルポリマーである。実施形態の別の群では、主鎖は、正に帯電した基（例えば、アンモニウム基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、スルホニウム基、グアニジウム基、アミジニウム基）を含む複数の側鎖部分を結合している。実施形態のこの群における側鎖部分は、主鎖に沿って、距離が一定又は様々である間隔で配置されていてよい。さらに、側鎖の長さは類似していても異なっていてもよい。例えば、実施形態の１つの群では、側鎖は、１〜２０個の炭素原子を有し、前述の正に帯電した基のうちの１つの（主鎖から離れた）末端で終わっている、直鎖状又は分枝状の炭化水素鎖でよい。本発明のすべての態様において、担体と生物学的に活性な作用物質との結合は、非共有結合性の相互作用によるものであり、例えば、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せを挙げることができる。
実施形態の１つの群では、正に帯電した主鎖は、正に帯電した複数の側鎖基（例えば、リジン、アルギニン、オルニチン、ホモアルギニンなど）を有するポリペプチドである。好ましくは、このポリペプチドは、約１０，０００〜約１，５００，０００、より好ましくは約２５，０００〜約１，２００，０００、最も好ましくは約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する。本発明のこの部分でアミノ酸が使用される場合、側鎖は、結合の中心においてＤ又はＬ型（立体配置Ｒ又はＳ）を形成してよいことが当業者には理解されよう。
或いは、主鎖は、ペプトイドなどポリペプチドの類似体でもよい。例えば、Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem. 4:80 (1992);及びSimon et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:9367 (1992)を参照されたい。手短に言えば、ペプトイドは、α炭素原子ではなく主鎖の窒素原子に側鎖が結合されているポリグリシンである。前述したように、側鎖の一部分は、通常、正に帯電した基で終結し、正に帯電した主鎖成分を構成すると考えられる。ペプトイドの合成は、例えば、米国特許第５８７７２７８号で記述されている。この用語を本明細書で使用する場合、ペプトイド主鎖構造を有する正に帯電した主鎖は、α炭素位置に天然に存在する側鎖を持つアミノ酸から構成されていないため、「非ペプチド」とみなされる。
例えば、ペプチドのアミド結合が、チオアミド（−ＣＳＮＨ−）、逆向きのチオアミド（−ＮＨＣＳ−）、アミノメチレン（−ＮＨＣＨ２−）若しくは逆向きのメチレンアミノ（−ＣＨ２ＮＨ−）基、ケト−メチレン（−ＣＯＣＨ２−）基、ホスフィナート（−ＰＯ２ＲＣＨ２−）、ホスホンアミダート及びホスホンアミド酸エステル（−ＰＯ２ＲＮＨ−）、逆向きのペプチド（−ＮＨＣＯ−）、トランス−アルケン（−ＣＲ＝ＣＨ−）、フルオロアルケン（−ＣＦ＝ＣＨ−）、ジメチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、チオエーテル（−ＣＨ２Ｓ−）、ヒドロキシエチレン（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）、メチレンオキシ（−ＣＨ２Ｏ−）、テトラゾール（ＣＮ４）、スルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、メチレンスルホンアミド（−ＣＨＲＳＯ２ＮＨ−）、逆向きのスルホンアミド（−ＮＨＳＯ２−）などの代用物によって置換されている、ポリペプチドの立体的又は電気的模倣物、並びに、例えば、Fletcher他（(1998) Chem. Rev. 98:763）に総説があり、また、その中で引用されている参考文献によって詳述されている、マロン酸及び／又はｇｅｍ−ジアミノ−アルキルサブユニットを有する主鎖を用いる、他の様々な主鎖を使用することができる。前述した置換の多くは、αアミノ酸から形成された主鎖に対してほぼ等配電子のポリマー主鎖を生じる。
上記に提供した各主鎖に、正に帯電した基を有する側鎖基を結合させることができる。例えば、スルホンアミド結合の主鎖（−ＳＯ２ＮＨ−及び−ＮＨＳＯ２−）は、窒素原子に結合された側鎖基を有することができる。同様に、ヒドロキシエチレン（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）結合は、ヒドロキシ置換基に結合された側鎖基を有することができる。当業者なら、標準の合成法によって、正に帯電した側鎖基を与えるように、他の結合化学反応を容易に適合させることができる。
特に好ましい実施形態では、正に帯電した主鎖は、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはその断片、又はアンテナペディアのタンパク質形質導入ドメイン、又はその断片若しくは混合物（式中、下付き文字ｎ１は、０〜２０、より好ましくは０〜８、さらにより好ましくは２〜５の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５、より好ましくは約７〜約１７、最も好ましくは約７〜約１３の奇数である）から独立に選択される分枝基（効率基とも呼ぶ）を有するポリペプチドである。ＨＩＶ−ＴＡＴ断片が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有し、この断片が、その断片のＣ末端又はＮ末端を介して主鎖に結合しているような実施形態が、さらにより好ましい。好ましいＨＩＶ−ＴＡＴ断片は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立に、０〜８、より好ましくは２〜５の整数であるものである。別の好ましい実施形態では、正に帯電した側鎖又は分枝基は、アンテナペディア（Ａｎｔｐ）タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、又は活性を保持しているその断片である。好ましくは、正に帯電した担体は、側鎖の正に帯電した分枝基を、担体の全重量に対するパーセンテージとして、少なくとも約０．０５％、好ましくは約０．０５〜４５重量％、最も好ましくは約０．１〜約３０重量％の量で含む。式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する正に帯電した分枝基の場合、最も好ましい量は、約０．１〜約２５％である。
別の特に好ましい実施形態では、主鎖部分はポリリジンであり、正に帯電した分枝基は、リジン側鎖のアミノ基に結合している。この特に好ましい実施形態で使用されるポリリジンは、約１０，０００〜約１，５００，０００、好ましくは約２５，０００〜約１，２００，０００、最も好ましくは約１００，０００〜１，０００，０００の分子量を有する。これは、例えば、分子量が７０，０００より大きいポリリジン、分子量７０，０００〜１５０，０００のポリリジン、分子量１５０，０００〜３００，０００のポリリジン、及び分子量が３００，０００より大きいポリリジンなど、市販されている（Sigma Chemical Company社製、セントルイス（St. Louis）、ミズーリ州、米国）ポリリジンのうちの任意のものでよい。ポリリジンの適切な選択は、組成物の残りの成分に応じて変わると考えられ、組成物に全体として正味の正電荷を与え、負に帯電した成分を合わせた長さの好ましくは１〜４倍の長さを与えるのに十分と考えられる。好ましい正に帯電した分枝基又は効率基としては、例えば、−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ（−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７）又はＨＩＶ−ＴＡＴが挙げられる。別の好ましい実施形態では、正に帯電した主鎖は、ポリエチレンイミン、例えば分子量が約１，０００，０００のものなどの長鎖ポリアルキレンイミンである。
ポリペプチド又はポリアルキレンイミンなどの非ペプチジルポリマー、及び前述の分枝基を有する前述の正に帯電した他の主鎖を含む、正に帯電した主鎖又は担体分子は、新規な化合物であり、本発明の一態様を構成する。
本発明の一実施形態では、正に帯電した分枝基を有する正に帯電した担体のみが、活性物質を経皮送達するのに必要である。この事例の一実施形態では、正に帯電した担体は、前述したように、正に帯電した複数の側鎖基を有するポリペプチド（例えば、リジン、アルギニン、オルニチン、ホモアルギニンなど）である。好ましくは、ポリペプチドの分子量は、少なくとも約１０，０００である。この事例の別の実施形態では、正に帯電した担体は、少なくとも約１００，０００の分子量を有する正に帯電した複数の側鎖基を有する、ポリアルキレンイミンなどの非ペプチジルポリマーである。このようなポリアルキレンイミンとしては、ポリエチレンイミン及びポリプロピレンイミンが挙げられる。いずれの場合も、経皮送達のために唯一必要な作用物質として使用するために、正に帯電した担体分子は、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２（式中、下付き文字ｎ１は、０〜２０、より好ましくは０〜８、さらにより好ましくは２〜５の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５、より好ましくは約７〜約１７、最も好ましくは約７〜約１３の奇数である）、ＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはその断片、又はアンテナペディアＰＴＤ若しくはその断片を含む、正に帯電した分枝基又は効率基を含む。好ましくは、側鎖又は分枝基は、前述した一般式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する。他の好ましい実施形態は、分枝基又は効率基が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有するＨＩＶ−ＴＡＴ断片であり、この断片が、その断片のＣ末端又はＮ末端を介して担体分子に結合しているような実施形態である。側鎖分枝基は、結合の中心においてＤ又はＬ型（立体配置Ｒ又はＳ）を形成してよい。好ましいＨＩＶ−ＴＡＴ断片は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立に、０〜８、より好ましくは２〜５の整数であるものである。他の好ましい実施形態は、分枝基がアンテナペディアＰＴＤ基、又はその基の活性を保持しているその断片であるものである。これらは、例えば、Console et al., J.Biol. Chem. 278:35109 (2003)により、当技術分野では公知である。
特に好ましい実施形態では、担体はポリリジンであり、正に帯電した分枝基は、リジン側鎖のアミノ基に結合している。この特に好ましい実施形態で使用されるポリリジンは、例えば、分子量が７０，０００より大きいポリリジン、分子量７０，０００〜１５０，０００のポリリジン、分子量１５０，０００〜３００，０００のポリリジン、及び分子量が３００，０００より大きいポリリジンなど、市販されている（例えば、Sigma Chemical Company社製、セントルイス、ミズーリ州、米国）ポリリジンのうちの任意のものでよい。しかし、好ましくは、ポリリジンの分子量は、少なくとも約１０，０００である。好ましい正に帯電した分枝基又は効率基としては、例えば、−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ（−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７）、ＨＩＶ−ＴＡＴ又はその断片、及びアンテナペディアＰＴＤ又はその断片が挙げられる。
他の成分
正に帯電した主鎖成分に加えて、本発明の多成分系組成物は、以下のもの、即ち、
ｉ）複数の結合されたイメージング部分を有する、負に帯電した第１の主鎖、或いは、複数の負に帯電したイメージング部分、
ii）複数の結合された標的物質を有する、負に帯電した第２の主鎖、或いは、複数の負に帯電した標的部分、
iii）ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイム、改変されたオリゴ核酸、及び選択された導入遺伝子をコードするｃＤＮＡから選択される少なくとも１つのメンバー、
iv）少なくとも１つの持続因子をコードするＤＮＡ、並びに
ｖ）複数の結合された生物学的作用物質を有する、負に帯電した第３の主鎖、又は負に帯電した１つの生物学的作用物質、
からなる群から少なくとも２つの成分を含む。
本明細書で説明するように、本発明のいくつかの実施形態又は組成物における関連した態様では、いくつかのタイプの物質の経皮送達を実現するために、正に帯電した主鎖又は担体を単独で使用してもよい。本明細書において説明する生物学的に活性な作用物質の組合せ、例えば、インスリン、ボツリヌストキシン、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、免疫化に適した抗原、又は非タンパク質非核酸系作用物質の組合せもこれらの組成物において使用することができる。
負に帯電した主鎖は、イメージング部分、標的部分、及び治療物質を担うために使用される場合、生理的ｐＨで負電荷を持つ複数の基を有する（前述したものに類似した）様々な主鎖でよい。或いは、当業者には容易に明らかとなるように、表面の負に帯電した部分を十分に有するイメージング部分、標的部分、及び治療物質は、正に帯電した主鎖とのイオン性複合体形成のために付加的な主鎖の結合を必要としない。この文脈における十分とは、適切な密度の負に帯電した基が、イメージング部分、標的部分、又は治療物質の表面上に存在して、正に帯電した前述の主鎖とのイオン性結合を生じることを意味する。これらの事例では、その物質又はその誘導体は、本発明の正に帯電した担体と非共有結合的に結合するのに十分な負電荷を有する。この文脈における「十分な」という用語は、例えば、それらの成分単独に対する粒子測定又は機能的分光測定の変化によって決定することができる。負に帯電した適切な基は、カルボン酸、ホスフィン酸、ホスホン酸若しくはリン酸、スルフィン酸若しくはスルホン酸などである。いくつかの実施形態では、負に帯電した主鎖は、オリゴヌクレオチドとなる。別の実施形態では、負に帯電した主鎖は、オリゴ糖（例えば、デキストラン）である。さらに別の実施形態では、負に帯電した主鎖は、ポリペプチド（例えば、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、又はグルタミン酸若しくはアスパラギン酸残基に非荷電アミノ酸が割り込んでいるポリペプチド）である。以下により詳細に説明する部分（イメージング部分、標的物質、及び治療物質）は、通常は、エステル結合を介して、これらのペンダント基を有する主鎖に結合することができる。或いは、負に帯電したアミノ酸に割り込み、又は負に帯電した主鎖の末端に結合するアミノ酸を用いて、例えば、ジスルフィド結合（システイン残基による）、アミド結合、エーテル結合（セリン又はトレオニンのヒドロキシル基による）などを介して、イメージング部分及び標的部分を結合することができる。或いは、負に帯電したポリマーが無い場合、イメージング部分及び標的部分それら自体が小型の陰イオンでもよい。或いは、当業者には容易に明らかとなるように、正に帯電した主鎖とのイオン性複合体形成のために表面に負に帯電した部分を十分に生じるように、イメージング部分、標的部分、及び治療物質それら自体を共有結合的に修飾することもできる。これらの双方の事例において、その物質又はその誘導体は、本発明の正に帯電した担体と非共有結合的に結合するのに十分な負電荷を有する。この文脈における「十分な」という用語は、例えば、それらの成分単独に対する粒子測定又は機能的分光測定の変化によって測定することができる結合を意味する。
イメージング部分
様々な診断用部分又はイメージング部分が本発明において有用であり、診断又は画像化される状態、投与経路、作用物質の感光度、作用物質の検出に使用される装置などに応じて変わると考えられる有効量で存在する。
適切なイメージング物質又は診断用物質の例としては、放射線不透過性の造影剤、常磁性造影剤、超常磁性造影剤、光学的イメージング部分、ＣＴ造影剤、及び他の造影剤が挙げられる。例えば、放射線不透過性造影剤（Ｘ線撮像用）としては、無機及び有機のヨウ素化合物（例えば、ジアトリゾ酸）、放射線不透過性の金属及びそれらの塩（例えば、銀、金、白金など）、並びに他の放射線不透過性化合物（例えば、カルシウム塩、硫酸バリウムなどのバリウム塩、タンタル及び酸化タンタル）が挙げられる。適切な常磁性造影剤（ＭＲ撮像用）としては、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）及びその誘導体、並びに、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＤＯ３Ａ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、ヒドロキシベンジルエチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）などとの複合体を含めて、他のガドリニウム、マンガン、鉄、ジスプロシウム、銅、ユウロピウム、エルビウム、クロム、ニッケル、及びコバルト複合体が挙げられる。適切な超常磁性造影剤（ＭＲ撮像用）としては、磁鉄鉱、超常磁性酸化鉄、単結晶の酸化鉄、特に、負に帯電した主鎖に結合できるこれらの各作用物質の複合した形態が挙げられる。さらに別の適切なイメージング物質は、ヨウ化及び非ヨウ化並びにイオン性及び非イオン性ＣＴ造影剤を含むＣＴ造影剤、並びにスピン標識や他の診断上有効な物質などの造影剤である。適切な光学的イメージング物質としては、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴン、グリーン５１４、緑色蛍光タンパク質、６−ＦＡＭ、テキサスレッド、Ｈｅｘ、ＴＥＴ、及びＨＡＭＲＡからなる群が挙げられる。
診断用物質の他の例としては、それだけには限らないが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、などを含めて、細胞で発現されたときに容易に検出可能なタンパク質をコードするマーカー遺伝子が挙げられる。放射性核種、蛍光体（fluor）、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害因子、リガンド（特にハプテン）など多種多様の標識を使用することができる。さらに別の有用な物質は、９９ｍＴｃグルコへプトン酸など放射性の化学種又は成分で標識されたものである。
負に帯電した主鎖にイメージング部分を結合させるための選択は、様々な条件に応じて変わると考えられる。いくつかのイメージング物質は、生理的ｐＨで中性であり、好ましくは、負に帯電した主鎖に結合され、又は、正に帯電した担体との複合体を保持するのに十分な上記の負に帯電した部分を含むように共有結合的に修飾される。他のイメージング物質は、負に帯電した主鎖が無い場合でも、正に帯電した担体との複合体を保持するのに十分な負電荷を有する。これらの事例では、その物質又はその誘導体は、本発明の正に帯電した担体と非共有結合的に結合するのに十分な負電荷を有する。この文脈における「十分な」という用語は、例えば、それらの成分単独に対する粒子測定又は機能的分光測定の変化によって測定することができる結合を意味する。このような負に帯電したイメージング部分の例としては、リン酸イオン（磁気共鳴画像法に有用）が挙げられる。
標的物質（targeting agents）
様々な標的物質が、本明細書で説明する組成物において有用である。通常、標的物質は、上記のイメージング部分に関して説明した負に帯電した主鎖に結合されている。いくつかの実施形態では、標的物質及びイメージング部分は、構造的に且つ／又は化学的に異なる。例えば、イメージング部分及び標的物質は、どちらもホスファートではない。一般に、標的物質は、核酸、治療物質、又は組成物の他の成分の移動を特定の部位に向けること、或いは標的物質を含まない複合体の向性に比べて、その複合体の向性を変えることを可能にする任意の成分でよい。標的物質は、例えば、特定のタイプの細胞又は特定の所望の組織（腫瘍細胞、肝臓細胞、造血細胞など）に核酸の移動を誘導することを可能にする、細胞外標的物質でもよい。このような作用物質は、特定の細胞区画（例えばミトコンドリア、核など）に治療物質を誘導することを可能にする、細胞内標的物質でもよい。作用物質は、最も単純には、正味電荷分布を変えることによって、複合体の向性を、より陰性度の高い細胞表面及び細胞外マトリクス成分から、より多様な細胞へ、さらには詳細には最も陰性の高い表面から離れるように変える、小型の陰イオンでよい。
標的物質又は作用物質は、好ましくは、共有結合的に又は非共有結合的に、本発明による負に帯電した主鎖に結合している。本発明の好ましい態様によれば、標的物質は、好ましくは連結基を介して、負に帯電した主鎖成分としての機能を果たすオリゴ核酸、ポリアスパラギン酸、硫酸化又はリン酸化デキストランなどに共有結合している。例えば、ヘテロ２官能性連結基（Pierce Chemical社のカタログを参照されたい）を用いて、標的物質（並びに他の生物学的作用物質）を核酸に結合する方法は、当業者には周知である。実施形態の１つの群では、標的物質は、細胞トランスフェクションを促進するため、即ち、組成物若しくはその多様な成分が膜を通って通過するのを促進するため、又は、エンドソームから出て行くのを助けるため、若しくは核膜を通過するための膜融合ペプチドである。標的物質は、例えば、糖、トランスフェリン、インスリン、又はアシアロ−オロソムコイドタンパク質など、細胞型の表面に存在する受容体に対する細胞受容体リガンドでもよい。このようなリガンドは、核内部でのトランスフェクトされたＤＮＡの蓄積を促進する核局在シグナル（ｎｌｓ）配列など、細胞内型の１つでもよい。
本発明の状況において有用な他の標的物質としては、糖、ペプチド、ホルモン、ビタミン、サイトカイン、オリゴ核酸、小型の陰イオン、脂質、又はこれらの成分に由来し、それらの対応する受容体との特異的な結合を可能にする配列若しくは断片が挙げられる。好ましくは、標的物質は、糖及び／又は抗体や抗体断片などのペプチド、細胞受容体リガンド又はその断片、受容体又は受容体断片などである。より好ましくは、標的物質は、増殖因子受容体、サイトカイン受容体、又は細胞レクチン受容体若しくは接着タンパク質受容体のリガンドである。標的物質は、アシアロ糖タンパク質受容体などのレクチンを標的とすることを可能にする糖でも、或いは、免疫グロブリンのＦｃ断片受容体を標的とすることを可能にする抗体Ｆａｂフラグメントでもよい。
さらに別の実施形態では、負に帯電した主鎖の不在下で標的物質を使用する。実施形態のこの群では、標的物質は、前述の正に帯電した担体とのイオン性複合体を保持するのに十分な負に帯電した部分を有する。これらの事例では、その物質又はその誘導体は、本発明の正に帯電した担体と非共有結合的に結合するのに十分な負電荷を有する。この文脈における「十分な」という用語は、例えば、それらの成分単独に対する粒子測定又は機能的分光測定の変化によって測定することができる結合を意味する。実施形態のこの群に適した、負に帯電した標的物質は、生理的ｐＨで正味の負電荷を持つタンパク質ベースの標的物質、並びに、例えば、標的とされる細胞の正味の表面電荷に基づいて標的を変えることができる、リン酸、アスパラギン酸、及びクエン酸を含む小型のポリアニオンなど、特定の細胞表面への接着を促進することができる標的物質である。
本発明の組成物において、核酸は、デオキシリボ核酸又はリボ核酸のいずれかでよく、また、天然又は人工起源の配列を含んでよい。より具体的には、本明細書において使用する核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列、又は合成若しくは半合成配列を挙げることができる。これらの核酸は、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどに由来するものでよい。さらに、これらの核酸は、当業者には公知の任意の技術によって、具体的には、バンクのスクリーニングによって、化学合成によって、又はバンクのスクリーニングによって得られる配列の化学的若しくは酵素的修飾を含む混合した方法によって、得ることができる。さらに、これらの核酸を、プラスミドベクターなどのベクター中に組み込むこともできる。
本発明で使用するデオキシリボ核酸は、１本鎖でも２本鎖でもよい。これらのデオキシリボ核酸は、治療用遺伝子、転写又は複製を調節するための配列、アンチセンス配列、他の細胞成分に結合するための領域をコードすることもできる。適切な治療用遺伝子は、治療効果を有するタンパク質生成物をコードする本質的に任意の遺伝子である。このようにしてコードされるタンパク質生成物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどでよい。いくつかの場合では、タンパク質生成物は、標的細胞に対して同種でよい（即ち、後者が病変を示さない場合、標的細胞で通常発現される生成物）。この方式では、適切な核酸を使用することにより、タンパク質の発現を増大させ、例えば、細胞での不十分な発現を克服することを可能にすることができる。或いは、本発明は、タンパク質の変異、或いは過剰発現が原因で不活性又は活性が弱いタンパク質を発現させるための組成物及び方法を提供する。したがって、治療用遺伝子は、増大した安定性、改変された活性などを有する細胞タンパク質の変異体をコードしてもよい。タンパク質生成物は、標的細胞に対して異種でもよい。この場合、発現されるタンパク質は、例えば、細胞で欠けている活性を構成又は提供し、病変に対抗すること又は免疫応答を促進することを可能にする。
より具体的には、本発明で有用な核酸は、酵素、血液派生物、ホルモン、リンフォカイン、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、増殖因子、神経伝達物質若しくはその前駆物質、又は合成酵素、又は栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−II、Ａ−IV、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−II、Ｃ−III、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、及びａｐｏ（ａ）から選択されるアポリポタンパク質型の、脂質の代謝に関与するタンパク質、例えば、リポタンパク質リパーゼ、肝臓リパーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、７−α−コレステロールヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼなどの代謝酵素、又はコレステロールエステル輸送タンパク質やリン脂質輸送タンパク質などの脂質輸送タンパク質、ＨＤＬに結合するためのタンパク質、又は、例えば、ＬＤＬ受容体、キロミクロンレムナント受容体及びスカベンジャー受容体から選択される受容体、ジストロフィン若しくはミニジストロフィン、ＧＡＸタンパク質、膵線維症に関連するＣＦＴＲタンパク質、腫瘍抑制遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ；凝固に関与するタンパク質因子：因子VII、VIII、IXをコードするものであり、或いは、これらの核酸は、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、トロンボモジュリン、α１−アンチトリプシン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、スーパーオキシドジスムターゼ、エラスターゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼなどをコードする遺伝子でもよい。
本発明において有用な治療用遺伝子は、アンチセンス配列、又は標的細胞で発現されることにより、遺伝子発現若しくは細胞ｍＲＮＡの転写の制御を可能にする遺伝子でもよい。特許ＥＰ１４０３０８で記載されている技術に従って、このような配列を、例えば、標的細胞において細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡへと転写させ、それによって、それらがタンパク質に翻訳されるのを阻止することができる。アンチセンス配列は、選択的に標的ＲＮＡを破壊することができるリボザイムをコードする配列も含んでよい（ＥＰ３２１２０１を参照されたい）。
先に示したように、生物学的に活性な作用物質は、ヒト又は動物において免疫応答を生じさせることができる１種又は複数の抗原性ペプチドも含んでもよい。この特定の実施形態では、本発明は、このようにして、特に微生物、ウイルス、又は癌に対する、ヒト又は動物に適用されるワクチン又は免疫療法治療薬を作製することを可能にする。それらは、具体的には、エプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus）、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５７３を参照されたい）、仮性狂犬病ウイルスに特異的な、或いは腫瘍に特異的な（ＥＰ２５９２１２を参照されたい）抗原性ペプチドでよい。
好ましくは、核酸は、治療用遺伝子及び／又は、所望の細胞若しくは器官において抗原性ペプチドをコードしている遺伝子の発現を可能にする配列も含んでよい。これらは、これらの配列が感染細胞において機能することができる場合に考慮される遺伝子の発現を本来担っている配列でよい。核酸は、（他のタンパク質、さらには合成タンパク質の発現を担っている）、起源の異なる配列でもよい。特に、核酸は、真核生物又はウイルスの遺伝子のプロモーター配列を含んでもよい。例えば、プロモーター配列は、感染が望まれる細胞のゲノムに由来するものでよい。同様に、プロモーター配列は、ウイルスのゲノムに由来するもの、例えば、遺伝子Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶなどのプロモーターでよい。さらに、これらの発現配列は、活性化配列、制御配列などの追加によって改変してもよい。
さらに、核酸は、特に治療用遺伝子の上流に、治療用生成物が標的細胞の分泌経路中に合成されるように指示するシグナル配列も含んでよい。このシグナル配列は、治療用生成物の天然のシグナル配列でよいが、他の任意の機能的シグナル配列又は人工シグナル配列でもよい。
少なくとも１つの持続因子をコードするＤＮＡ
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの持続因子をコードするＤＮＡも含むと考えられる。このようなＤＮＡの例は、アデノウイルスの前末端タンパク質（preterminal protein）１をコードするＤＮＡである（Lieber, et al. Nature Biotechnology 15(13):1383-1387 (1997)を参照されたい）。アデノウイルス前末端タンパク質１、又はそれをコードする核酸は、所望の治療用導入遺伝子をコードする核酸配列に対してシス又はトランスで提供することができる。この方式で提供される場合、前末端タンパク質１又は配列は、治療用核酸を安定な核エピソームとして維持し、それにより、治療用核酸の損失を防ぎ、治療用タンパク質発現の後期の低減を防止する。
生物学的作用物質
治療物質及び薬用化粧物質の双方を含めて、様々な生物学的作用物質が本発明において有用であり、予防的に又は別の方法で治療される状態、投与経路、作用物質の有効性、並びに患者の大きさ及び治療計画に対する感受性に応じて変わると考えられる有効量で存在する。
負に帯電した主鎖に結合されることができる適切な治療物質は、例えば、鎮痛薬、抗喘息薬、抗生物質、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗真菌薬、制吐薬、降圧薬、抗インポテンツ薬、抗炎症薬、抗悪性腫瘍薬、抗ＨＩＶ薬、抗ウイルス薬、抗不安薬、避妊薬、排卵促進薬、抗血栓薬、プロトロンビン物質（prothrombotic agent）、ホルモン、ワクチン、免疫抑制薬、ビタミンなどを含めて、本質的に任意のクラスの作用物質中に存在し得る。或いは、十分な負に帯電した基を、治療物質に導入して、正に帯電した前述の主鎖とのイオン性複合体を生じさせることもできる。当業者には容易に明らかとなるように、リン酸化や硫酸化など多くの適切な方法が存在する。
さらに、いくつかの作用物質は、それ自体が、正に帯電した前述の担体と結合するのに適した、負に帯電した部分を有し、負に帯電した主鎖への結合を必要としない。これらの事例では、その物質又はその誘導体は、本発明の正に帯電した担体と非共有結合的に結合するのに十分な負電荷を有する。この文脈における「十分な」という用語は、例えば、それらの成分単独に対する粒子測定又は機能的分光測定の変化によって測定することができる結合を意味する。
適切な薬用化粧物質としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、並びにヒト成長ホルモン、抗酸化薬、及びボツリヌストキシンが挙げられる。本発明の文脈においては、「ボツリヌストキシン」という用語は、ボツリヌスの血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧだけでなく、ボツリヌスの軽鎖の活性を有するその断片も含む。
より具体的には、本発明において有用な治療物質としては、リドカイン、ノボカイン、ブピバカイン、プロカイン、テトラカイン、ベンゾカイン、コカイン、メピバカイン、エチドカイン、プロパラカインロピバカイン、プリロカインなどのような鎮痛薬；アゼラスチン、ケトチフェン、トラキサノクス、コルチコステロイド、クロモリン、ネドクロミル、アルブテロール、メシル酸ビトルテロール、ピルブテロール、サルメテロール、テルブチリン（terbutyline）、テオフィリンなどの抗喘息薬；ネオマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、トリメトプリム、スルファメチルオキサゾール、βラクタム系抗生物質、テトラサイクリンなどの抗生物質；ネホパム、オキシペルチン、イミプラミン、トラザドン（trazadone）などの抗うつ薬；ビグアニジン、スルホニル尿素などの抗糖尿病薬；クロロプロマジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペラジン、プロメタジン、チエチルペラジン、トリフルプロマジン、ハロペリドール、スコポラミン、ジフェニドール、トリメトベンズアミドなどの制吐薬及び抗精神病薬；アトラクリウムミバクリウム、ロクロニウム、スクシニルコリン、ドキサクリウム、ツボクラリン、及びボツリヌストキシン（ＢＴＸ）などの神経筋作用物質；アムホテリジンＢ、ナイスタチン、カンジシジン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、クロトリマゾール、フルコナゾール、シクロピロクス、エコナゾール、ナフチフィン、テルビナフィン、グリセオフルビン、シクロピロクスなどの抗真菌薬；プロパノロール、プロパフェノン、オキシプレノロール、ニフェジピン、レセルピンなどの降圧薬；一酸化窒素供与体などの抗インポテンツ薬；コルチゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、フルアザコルトなどのステロイド性抗炎症薬、並びにインドメタシン、イブプロフェン、ラミフェニゾン（ramifenizone）、プリオキシカム（prioxicam）などの非ステロイド性抗炎症薬を含む、抗炎症薬；アドリアマイシン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ズアノルビシン（duanorubicin）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、ラパマイシン、メトトレキサート、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラスチン、エトポシド、インターフェロン、フェネステリン（phenesterine）、タキソール（類似体及び誘導体を含む）、カンプトセシン及びその誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの抗悪性腫瘍薬；抗ＨＩＶ薬（例えば、抗タンパク分解薬（antiproteolytics））；アマンタジン、メチサゾン、イドクスウリジン、シタラビン、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、フォスカーネット、ソリブジン、トリフルリジン、バラシクロビル、シドフォビル、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ジドブジン、リバビリン、リマンタチン（rimantatine）などの抗ウイルス薬；ダントロレン、ジアゼパムなどの抗不安薬；ＣＯＸ−２阻害物質；プロゲストーゲンなどの避妊薬；ＧＰIIｂ／IIIａ阻害物質、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ヘパリンなどの抗血栓薬；トロンビン、第Ｖ、VII、VIII因子などのプロトロンビン物質；インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、ＥＧＦ（上皮成長因子）などのホルモン；シクロスポリン、アザチオプリン、ミゾロビン（mizorobine）、ＦＫ５０６、プレドニゾンなどの免疫抑制薬、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）などの血管新生作用物質；Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋなどのビタミン；並びに他の治療的に又は医薬的に活性な作用物質が挙げられる。例えば、GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Ninth Ed. Hardman, et al., eds. McGraw-Hill, (1996)を参照されたい。
最も好ましい実施形態では、生物学的作用物質は、インスリン、ボツリヌストキシン、ＶＥＧＦ、免疫化用の抗原、及び抗真菌薬から選択される。
標的物質及びイメージング物質に関して前述したように、いくつかの生物学的物質又は薬用化粧物質は、負に帯電した主鎖の不在下で使用することができる。このような生物学的又は薬用化粧物質は、一般に、生理的ｐＨにおいて正味の負電荷を有して、正に帯電した担体との複合体を保持するものである。例としては、ボツリヌストキシン（分子量の大きなタンパク質）、インスリン（分子量の小さなタンパク質）、非常に小型から非常に大型のものでよく、通常、タンパク質又は糖タンパク質を含む免疫化用の抗原、及び多くの抗真菌薬が挙げられる。これらの事例では、その物質又はその誘導体は、本発明の正に帯電した担体と非共有結合的に結合するのに十分な負電荷を有する。この文脈における「十分な」という用語は、例えば、それらの成分単独に対する粒子測定又は機能的分光測定の変化によって測定することができる結合を意味する。
結合されたイメージング部分、標的物質、又は治療物質を有する、負に帯電した主鎖
イメージング部分、標的物質、及び治療物質を含めて、上記の群の成分の３つに関して、個々の化合物は、負に帯電した主鎖に結合されても、負に帯電した部分を導入するように共有結合的に修飾されても、又は、前述の正に帯電した主鎖へのイオン結合を与えるのに十分な負に帯電した部分をその化合物が含む場合は直接使用されてもよい。必要があれば、通常、その結合は、作用物質並びに主鎖上に存在する官能基を通じて、特定の作用物質を主鎖に共有結合させるのに使用される連結基を介している。様々な連結基が、本発明のこの態様において有用である。例えば、Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996)、Wong, S.S., Ed., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991)、Senter, et al., J. Org. Chem. 55:2975-78 (1990)、及びKoneko, et al., Bioconjugate Chem. 2:133-141 (1991)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、治療物質、診断用物質、又は標的物質は、連結基に結合するために利用可能な官能基を持たないと考えられ、最初に修飾して、例えば、ヒドロキシ、アミノ、又はチオール置換基を組み込むことができる。好ましくは、置換基は、作用物質の非干渉部分に与えられ、連結基を結合するのに使用されることができ、作用物質の機能に不利益な影響を及ぼさない。
さらに別の態様では、本発明は、少なくとも１つの結合された効率基を有する正に帯電した主鎖と、ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイム、改変されたオリゴ核酸、及び選択された導入遺伝子をコードするｃＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１つの核酸メンバーとの非共有結合性複合体を含む組成物を提供する。本発明のこの態様では、正に帯電した主鎖は、正に帯電した前述の主鎖のうちの本質的に任意のものでよく、また、（上記の選択された主鎖と同様に）少なくとも１つの結合された効率基も含むと考えられる。適切な効率基としては、例えば、（Ｇｌｙ）ｎ１−（Ａｒｇ）ｎ２（式中、下付き文字ｎ１は、３〜約５の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約７〜約１７の奇数である）又はＴＡＴドメインが挙げられる。さらに、本発明のこの態様において有用な核酸は、前述したものと同じものである。
インスリン及びいくつかの大型分子の経皮送達
上記の正に帯電した担体を、インスリン及び約５０，０００以上の分子量を有するタンパク質、例えば、ボツリヌストキシン（ＢＴＸ）など、治療的に血中グルコースレベルを変えないいくつかの他の生物学的に活性な作用物質、或いは、治療用の核酸ベースの作用物質、いくつかの抗真菌薬などの非タンパク質非核酸系治療物質、又は免疫化用の作用物質など他の生物学的に活性な作用物質の経皮送達のために使用できることが判明している。正に帯電した担体を使用すると、皮膚細胞の内外双方向へのタンパク質又はマーカー遺伝子の送達、及びその下の組織への有効量且つ活性型でのその送達が可能になる。例えば、インスリンは、注射を必要とせずに、皮膚を通してその下の毛細血管中に送達され、身体全体に輸送され得る。ボツリヌストキシンは、麻痺を生じ、弛緩を生じ、収縮を軽減し、痙攣を防止又は軽減し、腺分泌を低減させ、又は他の所望の効果を実現するのに有効な量で、その下の筋肉又は皮膚内の腺構造体に送達され得る。この方式の局所送達は、特にボツリヌストキシンの場合に、注射可能又は埋め込み可能な物質に比べて、投与量の減少をもたらし、毒性を低減し、所望の効果に対してより的確な投与量の最適化を可能にすることができる。この実施形態は、いくらかの好ましくは多価の小型陰イオン、例えば、リン酸、アスパラギン酸、又はクエン酸を含んでもよく、或いは、このようなポリアニオンが実質的に無い状況で実施してもよい。本発明のすべての態様において、担体と生物学的に活性な作用物質との結合は、非共有結合性の相互作用によるものであり、例えば、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せを挙げることができる。
本明細書では、「ボツリヌストキシン」という用語は、細菌によって産生されたものであれ組換え技術によって作製されたものであれ、公知の血清型のボツリヌストキシンのうちの任意のもの、並びに、人工的に作り出された変異体又は融合タンパク質を含めて、続いて発見される可能性のあるような任意の型を指すことを意図されている。前述したように、現在のところ、７種の免疫学的に異なるボツリヌス神経毒素、即ち、ボツリヌス神経毒素の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧが明らかにされており、これらのそれぞれは、型特異的抗体による中和によって区別される。これらのボツリヌストキシン血清型は、Sigma-Aldrich社及びMetabiologics社（マディソン、ウィスコンシン州）、並びに他の供給元から入手可能である。異なる血清型のボツリヌストキシンの、それらが影響を及ぼす動物種、並びにそれらが誘発する麻痺の重症度及び持続期間は様々である。少なくとも２種の型のボツリヌストキシン、即ちＡ型及びＢ型が、いくつかの病態の治療用の製剤に入れられて現在市販されている。例えば、Ａ型は、商標「ＢＯＴＯＸ（登録商標）」を有するAllergan社製の薬剤及び商標「ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）」を有するIpsen社製の薬剤中に含まれ、また、Ｂ型は、商標「ＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）」を有するElan社製の薬剤中に含まれる。
本発明の組成物中で使用されるボツリヌストキシンは、ボツリヌストキシン誘導体、即ち、ボツリヌストキシン活性を有するが、天然又は組換え天然ボツリヌストキシンに比べて、任意の部分又は任意の鎖上に１つ又は複数の化学的又は機能的改変を含む化合物でもよい。例えば、ボツリヌストキシンは、改変された神経毒素、即ち、天然のものと比較すると、そのアミノ酸のうちの少なくとも１つが欠失、改変、又は置換されている神経毒素でもよく、或いは、改変された神経毒素は、組換えにより作製された神経毒素又はその誘導体若しくは断片でもよい。例えば、ボツリヌストキシンは、例えば、その諸特性を増強し、又は、望ましくない副作用を低減するように改変されているが、所望のボツリヌストキシン活性をなお保持しているものでよい。ボツリヌストキシンは、前述のように、細菌によって産生されるボツリヌストキシン複合体のうちの任意のものでよい。或いは、ボツリヌストキシンは、組換え技術又は合成化学技術によって調製される毒素、例えば、組換えペプチド、融合タンパク質、又は、例えば、異なるボツリヌストキシン血清型のサブユニット若しくはドメインから調製されるハイブリッド神経毒素でもよい（例えば、米国特許第６４４４２０９号を参照されたい）。ボツリヌストキシンは、必要なボツリヌストキシン活性を有することが示されている分子全体の一部分でもよく、また、このような場合、それ自体で、又は組合せ若しくは複合分子、例えば融合タンパク質の一部として使用することができる。或いは、正に帯電した主鎖は、天然のＢＴＸ結合、標的、又は内在化ドメインの無い場合でも細胞内在化を可能にするため、標的部分の有無に関わらず、本明細書で説明する正に帯電した主鎖と共に毒素の一部分を直接使用してもよい。或いは、ボツリヌストキシンは、それ自体は無毒性でもよいボツリヌストキシン前駆体、例えば、タンパク質分解で切断されると毒性になる無毒性の亜鉛プロテアーゼの形態でもよい。
本発明はまた、ボツリヌストキシンの組合せ及び混合物の一般的使用も企図するが、ボツリヌストキシン血清型の混合物は、それらの性質及び諸特性が様々であるため、通常、現時点では投与されない。
同様に、「インスリン」という用語は、天然供給源から抽出されたインスリン、並びに、化学的又は組換え手段によって合成的に得ることができるインスリンも含む。インスリンは、改変型、又は、例えば組換えペプチド、融合タンパク質、若しくはハイブリッド分子の形態でもよく、或いは、特定の場合には、必要な活性を有するインスリン分子の一部分でもよい。同じことが、これらの個々の経皮組成物及び方法で使用できる他のタンパク質、特に生理化学的特性が大きく変動し得る免疫化用の抗原にも当てはまる。同様に、抗真菌薬を含めて、非タンパク質非核酸系治療物質は、天然供給源から得てもよく、又は合成してもよい。
本発明の組成物は、好ましくは、被験者又は患者、即ち、特定の治療を必要とするヒト又は他の哺乳動物の皮膚又は上皮に適用される製品の形態である。「必要とする」という用語は、医薬及び健康の双方に関連した必要性、並びに、より化粧的、美容的、又は主観的になる傾向がある必要性を含むことが意図されている。ボツリヌストキシン組成物は、例えば、顔組織の外観を変更又は改善するのに使用することもできる。
本発明の正に帯電した担体の使用によって、顔筋若しくは他の筋肉の望ましくない痙攣などの病態、多汗症、座瘡、又は、筋肉の疼痛若しくは痙攣の軽減が望まれる、身体の別の場所の病態を治療するために、被験者に経皮的にボツリヌストキシンを投与することができる。ボツリヌストキシンは、筋肉、又は皮膚に結合した他の構造体への経皮送達のために局所的に投与される。例えば、下肢、肩、下背部を含む背中、腋か、手掌、足、頚部、鼠径部、手又は足の甲、肘、上腕、膝、上脚、臀部、胴、骨盤、又はボツリヌストキシンの投与が望まれる身体の他の任意の部分に投与してよい。
神経性の疼痛の治療、片頭痛若しくは他の頭痛の疼痛の予防若しくは低減、座瘡の予防若しくは低減、自覚的若しくは臨床的に関わらずジストニア若しくはジストニアの収縮の予防若しくは低減、自覚的若しくは臨床的な多汗症に関連している症状の予防若しくは低減、過分泌若しくは発汗の低減、免疫応答の低減若しくは増進、又は、注射によるボツリヌストキシンの投与が提案若しくは実施されている他の状態の治療を含めて、他の状態を治療するために、ボツリヌストキシンの投与を実施してもよい。ボツリヌストキシン、血中グルコースレベルに対する治療効果を持たない他の治療用タンパク質、本明細書で説明する、免疫化に有用な他の抗原、又は、非核酸非タンパク質系治療物質、例えば、複合体を形成したボツリヌストキシンの投与は、免疫化に関連した目的のために実施してもよい。或いは、免疫応答を増強するために、例えば、例えば注射を用いない幼児期の免疫化又は様々な環境有害物質に対する免疫化のために、様々なタンパク質に対する免疫化を実現するために、複合体を調製し局所適用することもできる。驚くべきことに、本明細書で説明するボツリヌストキシン又は他の治療用タンパク質の投与は、免疫応答を低下させるために実施することもできる。本発明は、ＢＴＸ及び他のタンパク質が、変更された投与経路によって送達されることを可能にし、作用物質の複合抗原提示を変更し、したがって、そのタンパク質に対する抗原の免疫応答を低減させるのに有用となり、したがって、免疫に関連した活性低下を起こさない反復投与を容易にすることができる。
一般に、インスリン、ボツリヌストキシン、或いは、例えば、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、治療用の核酸ベースの作用物質、非タンパク質非核酸系治療物質、又は、免疫化用に投与される作用物質など他の生物学的に活性な作用物質を、通常は、１種又は複数の付加的な製薬上許容される担体又は賦形剤と共に、正に帯電した担体と混合することによって、組成物を調製する。最も単純な形態では、それらは、緩衝化してもよい生理食塩水など、製薬上許容される単純な水性の担体又は希釈剤を含有してよい。しかし、これらの組成物は、局所用の薬剤組成物又は薬用化粧組成物において一般的な他の成分、即ち、皮膚科学的に又は製薬上許容される担体、媒体、又は培地、即ち、それらが適用される組織に適合性のある担体、媒体、又は培地を含有してよい。本明細書では、「皮膚科学的に又は製薬上許容される」という用語は、そのように説明された組成物又はその成分が、これらの組織と接触して使用するのに、又は、通常は、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応などを起こさずに、患者に使用するのに適していることを意味する。必要に応じて、本発明の組成物は、考察中の分野、特に化粧品及び皮膚科学の分野で従来使用されている任意の成分を含んでよい。本発明のすべての態様において、担体と生物学的に活性な作用物質との結合は、非共有結合性の相互作用によるものであり、例えば、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せを挙げることができる。
組成物は、予め調製しても、或いは、例えば、投与時点又は投与前に構築するためのキットを提供することによって、投与時に調製してもよい。或いは、前述したように、例えば、治療用タンパク質と、正に帯電した担体（及び場合によっては他の成分）を含有する液体、ゲル、クリームなどとを含む、皮膚パッチ又は他の分配器具を含むキットを提供することによって、ボツリヌストキシン又は他の治療用タンパク質、並びに正に帯電した主鎖又は担体を別々の形態で患者に投与してもよい。この特定の実施形態では、担体を含む液体又は他の組成物を皮膚に適用し、続いて、皮膚パッチ又は他の器具を適用することによって、この組合せを投与する。
本発明の組成物は、有効量のインスリン、ボツリヌストキシン、又は他の有益な物質を投与するために適用される。経皮送達の場合、「有効量」という用語は、担体が無い場合の作用物質に比べて、生物学的に活性な作用物質のより多くの経皮送達を実現する、任意の組成物又は方法を意味する。ボツリヌストキシンの場合、本明細書では、「有効量」という用語は、所望の筋肉麻痺又は他の効果を生じるのに十分であるが、暗黙のうちに安全な量、即ち、重大な副作用を回避するのに十分な少なさの量である、上記に定義したボツリヌストキシンの量を意味する。所望の効果としては、例えば、特に顔の細い線及び／又はしわの出現を低減させること、又は、目の拡大、口角の持ち上げ、若しくは上唇から扇形に広がる線の平滑化など他の方法で顔の外観を調整することを目的として特定の筋肉を弛緩させること、或いは、筋肉の緊張の全般的な軽減が挙げられる。最後に述べた効果、即ち筋肉の緊張の全般的な軽減は、顔又は別の場所、例えば、背中若しくは下肢において実現することができる。インスリンの場合、「有効量」という用語は、同様に、所望の効果、即ち、患者又は被験者の血液中のグルコースの低下をもたらすのに十分な量を意味する。抗原の場合、「有効量」とは、抗原を１回又は連続して適用した後に、その抗原に対する免疫応答を被験者に開始させることができるのに十分な量を意味する。抗真菌薬の場合、「有効量」とは、真菌感染の症状又は徴候を軽減するのに十分な量を意味する。治療的に血中グルコースレベルを変えない他の生物学的に活性な作用物質の場合、「有効量」とは、著しい毒性を引き起こすことなく、例えば、Physicians' Desk Referenceなどでその作用物質について特徴づけられている所定の生物学的又は治療的効果を発揮するのに十分な量を意味する。本発明は、詳細には、「治療的」又は「生物学的に活性なタンパク質」という用語を使用する場合、特定の抗原に結合するだけ以外に生物活性を有さない抗体断片を除外する。しかし、免疫化に適した抗原は、免疫応答を開始するなど他の生物活性を有するため、これらは、本発明の適切な態様に含まれたままである。さらに、特定の抗原に結合し、それによってリガンド結合を妨害し、又は抗原の構造を改変することによって生物活性又は治療効果を有する作用物質も、本発明に含まれる。
これらの組成物は、単回投与による治療として適用するために、インスリン、ボツリヌストキシン、或いは、例えば、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、治療用の核酸ベースの作用物質、非タンパク質非核酸系治療物質、又は免疫化用の作用物質など他の生物学的に活性な作用物質の適切な有効量を含有してもよく、或いは、投与箇所で希釈するため、又は、複数回適用で使用するために、より濃く濃縮してもよい。通常、ボツリヌストキシン、又は、例えば、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質や治療用の核酸ベースの作用物質など他の生物学的に活性な作用物質を含有する組成物は、約１×１０−２０〜約２５重量％の生物学的に活性な作用物質、及び約１×１０−１９〜約３０重量％の正に帯電した担体を含有する。通常、非タンパク質非核酸系治療物質、或いは免疫化用の作用物質を含有する組成物は、約１×１０−１０〜約４９．９重量％の抗原、及び約１×１０−９〜約５０重量％の正に帯電した担体を含有する。通常、被験者への適用に適した形態では、本発明の組成物は、約０．００１〜約１０，０００、好ましくは、約０．０１〜１，０００ＩＵ／ｇの、ボツリヌストキシン及び本明細書で説明する正に帯電した担体分子を含む組成物を含有する。担体：ボツリヌストキシンの比は、それぞれ、好ましくは、約１０：１〜約１．０１：１、より好ましくは約６：１〜約１．５：１の範囲である。担体分子の量、又はボツリヌストキシンに対するその比は、問題の組成物において使用するためにどの担体が選択されるかによって変わると考えられる。所与の事例における担体分子の適切な量又は比は、例えば、以下に説明するもののような１種又は複数の実験を行うことによって、容易に決定することができる。
本発明の組成物は、潜在的に改善された薬物動態を示すより高い特異的活性を有する、より多くの純粋なボツリヌストキシンの送達を可能にする。さらに、正に帯電した担体は、外来の補助的タンパク質（例えば、４００〜６００ｍｇの範囲のヒト血清アルブミン、又は２５０〜５００ｍｇの範囲の組換型血清アルブミン）及び多糖類系安定化剤の必要性を軽減し、ＢＴＸに対する免疫応答の有益な低下をもたらすことができる。さらに、これらの組成物は、４．５〜６．３の範囲のｐＨを有する生理的環境において使用するのに適し、したがって、このようなｐＨを有してよい。これらの組成物は、好ましくは、室温又は冷却条件下で保存してよい。
ボツリヌストキシンを含有する組成物又は器具は、通常、１回の適用当たり皮膚１ｃｍ２当たり、約１Ｕ〜約２０，０００Ｕ、好ましくは約１Ｕ〜約１０，０００Ｕのボツリヌストキシンの用量でボツリヌストキシンを提供するように、適用される。これらの範囲内のより多い投与量は、好ましくは、例えば、制御放出物質と組み合わせて使用し、又は、除去する前の、皮膚上での存在時間をより短くさせる。
インスリンの場合、本発明の組成物は、約０．０１１Ｕ〜約５０００Ｕ、好ましくは約０．１Ｕ〜約５００Ｕ／グラムを含有する。ある形態のインスリンと本明細書で説明する正に帯電した担体分子を含む組成物は、好ましくは、それぞれ、約３０：１〜約１．０１：１、より好ましくは約６：１〜約１．２５：１のインスリン：担体の範囲である。同様に、担体分子の量、又はインスリンに対するその比は、問題の組成物において使用するためにどの担体が選択されるかによって変わると考えられる。
その形態の点で、本発明の組成物としては、液剤、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）、懸濁剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、或いは、皮膚及び組成物を使用し得る他の組織に適用するために使用される他の一般的な固体又は液体組成物を挙げることができる。このような組成物は、ボツリヌストキシン、インスリン又は他の生物学的に活性な作用物質、及び担体分子に加えて、場合によっては麻酔薬、かゆみ止め活性剤、植物エキス、コンディショニング剤、濃色化剤若しくは淡色化剤、光輝顔料、湿潤剤、マイカ、鉱物、ポリフェノール、シリコン若しくはその誘導体、日焼け止め、ビタミン、及び植物薬（phytomedicinal）を含めて、抗菌薬、保湿剤及び水和剤、浸透剤、保存剤、乳化剤、天然油又は合成油、溶剤、界面活性剤、洗浄剤、ゲル化剤、皮膚軟化剤、抗酸化剤、芳香剤、増量剤、増粘剤、ワックス、臭気吸収剤、染料、着色剤、散剤、粘度調節剤及び水など、このような製品において一般に使用される他の成分を含有してもよい。本発明のすべての態様において、担体と生物学的に活性な作用物質との結合は、非共有結合性の相互作用によるものであり、例えば、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せを挙げることができる。
本発明による組成物は、インスリン、ボツリヌストキシン、又は送達しようとする他の物質と担体とが、それらが制御された方式で時間をかけて皮膚上に放出されるように、ある物質内にカプセル化又は別の方法で含有されている、制御放出組成物又は持続放出組成物の形態でよい。送達しようとする物質と担体は、マトリックス、リポソーム、小胞、マイクロカプセル、マイクロスフェアなどの内部に、又は、固体粒子物質内部に含有されてよく、これらはすべて、１種又は複数の物質を時間をかけて放出するように選択及び／又は構築される。治療物質及び担体は、一緒に（例えば、同じカプセル内に）、又は別々に（別々のカプセル内に）カプセル化されてよい。
本発明の組成物を被験者に投与することは、当然、本発明の別の態様である。ボツリヌストキシンの場合、最も好ましくは、医師又は他の医療従事者によって、又はその指示のもとで組成物を投与する。１回の治療で、又は、長期に渡る一連の定期的治療においてそれらを投与してよい。前述の目的のためにボツリヌストキシンを経皮送達するために、効果が望まれる皮膚の１つ又は複数の位置に前述の組成物を局所的に適用する。その性質が原因となって、最も好ましくは、適用するボツリヌストキシンの量は、いかなる有害又は望ましくない結果ももたらさずに所望の結果を生み出すと考えられる適用速度及び適用頻度で、注意して使用すべきである。
インスリンの場合、入院患者又は院内治療（in-office treatment）のために、医療従事者によって、又はその指示のもとで投与を実施することになるが、さもなければ、患者によって実施される可能性がある。制御放出及び／又は観察を伴う、皮膚パッチなどによる投与は、一般的な方法であるらしく、したがって、本発明のインスリン含有組成物は、しばしば、皮膚パッチ又は他の器具に含有されて提供されることになる。免疫化に適した抗原の場合、最も好ましくは、医師又は他の医療従事者によって、又はその指示のもとで組成物を投与する。１回の治療で、又は、長期に渡る一連の定期的治療においてそれらを投与してよい。したがって、持続放出組成物も、本発明によって企図される。前述の目的のために免疫化に適した抗原を経皮送達するために、皮膚、又は爪体及び周囲の皮膚に前述の組成物を局所的に適用する。抗真菌薬などの非タンパク質非核酸系治療薬の場合、好ましくは、医師又は他の医療従事者の指示のもとで組成物を投与する。１回の治療で、又は、長期に渡る一連の定期的治療においてそれらを投与してよい。持続放出組成物は、非タンパク質非核酸系治療薬についても企図される。抗真菌薬は、例えば、人工爪体、ラッカー（lacquer）、着色剤を含むマニキュア液、ゲル、又はこれらのうちの任意のもの又はすべての組合せを使用して、指の爪若しくは足指の爪体又は周囲の解剖的構造体に投与してよい。前述の目的のためにボツリヌストキシンを経皮送達するために、前述の組成物を局所的に皮膚に適用する。
医療従事者の指示のもとで、又は患者若しくは被験者によって、本発明の組成物を投与するためのキットは、この目的に適する特別仕様の（custom）アプリケーターも含んでよい。「特別仕様のアプリケーター」という用語は、抗真菌薬を投与するための、言及した手段を含むことを意図している。
別の態様では、本発明は、前述の正に帯電した担体と、インスリン、ボツリヌストキシン、免疫化に適した抗原、抗真菌薬、又は、例えば、一般に、治療的に血中グルコースレベルを変えない治療用タンパク質、治療用の核酸ベースの作用物質、若しくは、非タンパク質非核酸系治療物質など他の生物学的に活性な作用物質の有効量との組合せを局所適用するための方法に関する。前述したように、適切なタイプ及び量のこれら２種の物質、具体的には担体及び生物学的に活性な作用物質を含有する本発明の組成物を使用することによって、投与を実施することができる。しかし、本発明は、必ずしも同じ組成物中ではないが、これら２種の物質を一緒に投与することも含む。例えば、治療物質又は生物学的に活性な物質を、乾燥した形態で皮膚パッチ又は他の分配器具に組み入れてよく、また、それら２種が一緒に作用して所望の経皮送達をもたらすように、パッチを適用する前に皮膚表面に正に帯電した担体を適用してもよい。したがって、この点で、２種の物質、具体的には担体及び生物学的に活性な作用物質は、一緒に若しくは協同して作用し、又は、おそらくは相互作用してインサイチュで組成物又は組合せを形成する。
組成物の調製方法
別の態様では、本発明は、薬剤組成物を調製するための方法であって、正に帯電した主鎖成分と、
ｉ）複数の結合されたイメージング部分を有する、負に帯電した第１の主鎖、或いは、複数の負に帯電したイメージング部分、
ii）複数の結合された標的物質を有する、負に帯電した第２の主鎖、或いは、複数の負に帯電した標的部分、
iii）ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイム、改変されたオリゴ核酸、及び選択された導入遺伝子をコードするｃＤＮＡから選択される少なくとも１つのメンバー、
iv）少なくとも１つの持続因子をコードするＤＮＡ、並びに
ｖ）複数の結合された生物学的作用物質を有する、負に帯電した第３の主鎖、又は負に帯電した１つの生物学的作用物質、
からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーとを、
製薬上許容される担体と組み合わせて、正味の正電荷を有する非共有結合性複合体を形成させることを含み、且つ、メンバーのうちの少なくとも１つがｉ）、ii）、iii）又はｖ）から選択されることを条件とする方法を提供する。
本明細書で説明するように、本発明のいくつかの実施形態又は組成物における関連した態様では、いくつかのタイプの物質の経皮送達を実現するために、正に帯電した主鎖又は担体を単独で使用してもよい。この場合、約１×１０−２０〜約２５重量％の生物学的に活性な作用物質、及び約１×１０−１９〜約３０重量％の正に帯電した担体を含有する、ボツリヌストキシンや血中グルコースレベルを低減しない他の治療用タンパク質など生物学的に活性な作用物質を含む組成物及び方法が好ましい。１×１０−１０〜約４９．９重量％の抗原、及び約１×１０−９〜約５０重量％の正に帯電した担体を含有する、抗真菌薬や免疫化に適した抗原などの非核酸非タンパク質系治療物質を含む組成物及び方法も好ましい。本発明のすべての態様において、担体と生物学的に活性な作用物質との結合は、非共有結合性の相互作用によるものであり、例えば、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せを挙げることができる。
本発明の広範な適用範囲は、様々な薬剤組成物を調製できる容易さによって示される。通常、組成物は、様々な正味の正電荷を有する組成物を得るための比及び順序で、正に帯電した主鎖成分を対象となる所望の成分（例えば、ＤＮＡ、標的部分、イメージング部分、若しくは治療成分）と混合することによって調製される。多くの実施形態で、組成物を投与するための製薬上許容される担体及び希釈剤を用いることによって、例えば枕元で、組成物を調製することができる。或いは、組成物は、諸成分を適切に混合することによって調製し、次いで、凍結乾燥し、使用又は適切な送達媒体中に配合するまで、（通常は室温以下で）保存することもできる。
局所投与、皮膚投与、経口投与、直腸投与、膣投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、経皮投与などに適した混合物を構成するように、組成物を調製することができる。本発明の薬剤組成物は、好ましくは、注射剤、特に所望の器官への直接注射、又は（皮膚及び／若しくは粘膜への)局所投与用に製薬上許容されている媒体を含有する。これらは、具体的には、無菌の等張性溶液又は乾燥組成物、特に、状況に応じて滅菌水又は生理食塩水を加えることによって、注射液剤を調製できる、凍結乾燥させた組成物でよい。例えば、注射用に使用する核酸の用量、及び投与回数は、様々な条件に応じて、特に、使用する投与方式、該当する病状、発現される遺伝子、或いは所望の治療持続期間に応じて、適合させることができる。
或いは、組成物を局所的に適用すべき場合、例えば、経皮送達が望まれる場合、例えば、正に帯電した主鎖又は担体で皮膚が別々に処置される皮膚パッチを用いることによって、対象となる１種又は複数の成分を乾燥した形態で皮膚に適用することができる。この方式では、組成物全体は、インサイチュで本質的に形成され、患者又は被験者に投与される。
組成物の使用方法
送達方法
様々な方法を用いて、インビボ又はエックスビボで、被験者、細胞、又は標的部位に本発明の組成物を送達することができる。実際には、治療すべき組織に最終的に組成物を接触させるのに通常使用される経路のうちの任意のものを使用することができる。好ましくは、組成物は、製薬上許容される担体と共に投与される。このような化合物を投与する適切な方法は、当業者にとって利用可能且つ周知であり、個々の組成物を投与するのに複数の経路を使用できるが、しばしば、特定の経路が、別の経路と比べてより即時的且つより効果的な反応をもたらし得る。製薬上許容される担体は、１つには、投与される個々の組成物によって、並びに、その組成物を投与するのに使用される個々の方法によって、決定される。したがって、本発明の薬剤組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed.1985を参照されたい）。
投与は、例えば、静脈内、局所、腹腔内、真皮下、皮下、経皮、筋肉内、経口、関節内、非経口、鼻腔内、又は吸入によってでよい。したがって、投与に適した部位としては、それだけには限らないが、皮膚、気管支、胃腸管、眼、及び耳が挙げられる。これらの組成物は、通常、従来の薬剤用担体又は賦形剤を含み、また、他の医薬品物質、担体、補助剤などをさらに含むことができる。好ましくは、製剤は、本発明の組成物の約５重量％〜７５重量％となり、残りの部分は、適切な医薬品賦形剤からなる。当技術分野で周知の方法によって、適切な賦形剤を、個々の組成物及び投与経路に合わせることができる（例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)を参照されたい）。
製剤は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン、坐剤、停留浣腸（retention enema）、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、エアロゾルなど、固体、半固体、凍結乾燥した粉末、又は液体剤形の形態をとることができる。薬剤組成物が、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態をとる実施形態では、製剤は、生物学的に活性な組成物と共に、以下のもの、即ち、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなどの希釈剤；デンプンやその誘導体などの崩壊剤（distintegrant）；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；並びに、デンプン、アカシアガム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース及びその誘導体などの結合剤のうちの任意のものを含有してよい。組成物は、アンプルやバイアルなどの、単位投与又は多回投与用の密閉容器に入れて提供され得る。患者に投与される用量は、時間の経過と共に患者の有益な治療応答を実現するのに十分な量でなくてはならない。本発明は、詳細には、「治療的」又は「生物学的に活性なタンパク質」という用語を使用する場合、特定の抗原に結合するだけ以外に生物活性を有さない抗体断片を除外する。しかし、免疫化に適した抗原は、免疫応答を開始するなど他の生物活性を有するため、これらは、本発明の適切な態様に含まれたままである。さらに、特定の抗原に結合し、それによってリガンド結合を妨害し、又は抗原の構造を改変することによって生物活性又は治療効果を有する作用物質も、本発明に含まれる。
いくつかの実施形態では、持続放出又は制御放出製剤は、生物又は培養中の細胞に投与することができ、また、これらは、所望の組成物を含むことができる。例えば、注射によって、生物の組織に持続放出組成物を投与することができる。「持続放出」とは、その組成物、好ましくは、対象となる導入遺伝子をコードするもの、又は生物学的物質若しくは治療物質が、粘性がより低い媒体、例えば、生理食塩水溶液中のその組成物を投与することによって実現されると考えられるよりも長い期間、周辺組織又は培養中の細胞によって取込まれるのに利用可能とされていることを意味する。
単独で又は他の適切な成分と組み合わせて、組成物を、吸入によって投与され得る、エアロゾル製剤（即ち、「噴霧される」ことができる）に調製することができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオルメタン、プロパン、窒素など加圧された許容される高圧ガス中に入れてよい。吸入による送達のために、乾燥粉末（例えば、Nektar Therapeutics社製、サンカルロス、カリフォルニア州)としてこれらの組成物を送達することもできる。
例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下の経路によるものなど非経口投与に適した製剤としては、抗酸化薬、緩衝剤、静菌薬、及び製剤を所期の受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張性無菌注射液、並びに、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁剤が挙げられる。
他の投与方法としては、それだけには限らないが、血管形成バルーン、カテーテル、及びゲル形成を用いた投与が挙げられる。血管形成バルーン、カテーテル、及びゲル形成による送達の方法は、当技術分野で周知である。
イメージング法
当業者には、様々なイメージング用途に合わせて本発明の組成物を調整できることが理解されよう。一実施形態では、成分ベースの系をイメージングに用いて、仮想結腸鏡検査を実施することができる。現在のところ、仮想結腸鏡検査は、本質的には、結腸に造影剤を注入し、ＣＴ上で画像を可視化し、次いで、３Ｄ画像を復元するものである。ＭＲに対しても同様の技術を使用することができる。しかし、大便、粘液、及び空気はすべて造影剤の妨害物となり、結腸壁の復元物に偽の表面を与えることがある。細胞標的の造影剤の添加は、これらの妨害物に打ち勝って真の壁復元物を実現するのに寄与し、また、偽陽性及び偽陰性の双方を回避するのに寄与すると考えられる。この場合に成分ベースの系を適用することができるいくつかの方法がある。最も単純には、陽イオン性の効率主鎖を、単一の造影剤、例えば、ＣＴ、ＭＲ、又は光学的なものと共に適用することができる。このようにして、細胞表面の層を可視化し、異常又は妨害物があれば、画像復元物の中で詳細にすることができる。しかし、成分ベースの系は、特異的な第２の作用物質の添加という追加の選択肢を提供する。この作用物質は、陽イオン性の効率主鎖、異なるイメージング部分、及び標的成分、例えば、結腸癌に特徴的な２種の抗原を標的とする成分からなり得た。単純なものから診断用までのイメージング部分は、１種がＣＴ造影剤で、もう一方がＭＲ造影剤となるように、又は、両方がＭＲ造影剤で、１種がＴ２剤でもう一方がＴ１剤であるように、選択することができる。この方式では、以前のとおりに表面を復元することができ、また、腫瘍抗原に特異的な任意の領域を可視化し、元の復元物に重ねることができる。さらに、標的化診断システムにも同様に治療物質を組み入れることができる。（また一方では治療と組み合わせて）同様の戦略を限局性腸炎及び潰瘍性大腸炎に適用することができる。或いは、例えば、黒色腫を診断又は管理する場合に、好ましくは蛍光性イメージング部分と併用して、光学的なイメージング部分及び検出法を使用することができる。光学的イメージング物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴン、グリーン５１４、緑色蛍光タンパク質、６−ＦＡＭ、テキサスレッド、Ｈｅｘ、ＴＥＴ、及びＨＡＭＲＡから選択することができる。
本実施例は、本発明の正に帯電した主鎖又は担体を用いて、極めて大型の複合体、即ち青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）導入遺伝子を含むプラスミドを経皮送達するのに適した組成物を例示する。
主鎖の選択
リジン側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に１８個が−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７に共有結合している）、分子量１５０，０００のポリリジンに−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７を共有結合させることによって、正に帯電した主鎖を構築した。第２のサイズのペプチジル担体を示すために、修飾された主鎖を「ＫＮＲ２」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のポリリジン（「Ｋ２」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。別の対照ポリカチオン、即ち、活性化されたデンドリマーベースの作用物質である「スーパーフェクトSuperfect（登録商標）」（Qiagen社製）を、高いインビトロトランスフェクション速度の基準として選択した（即ち、同時に陽性対照及びインビトロの毒性に対する現況技術の効率の基準となる）。
治療物質の選択
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）の導入遺伝子全体及びフランキング配列の一部分を含む８キロベースのプラスミド（ｐＳｐｏｒｔベースの鋳型、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を使用した。ＢＦＰは、トランスフェクトされ、その後、その遺伝子を転写及び翻訳する細胞に対する同定可能なマーカーとしての機能を果たし、蛍光顕微鏡下で直接（即ち、さらに染色せずに）可視化することができる。したがって、有効搭載量（payload）の送達前に、複合体が原形質膜と核膜の双方を通過した細胞のみが、導入遺伝子を発現することができる。この特有のプラスミドは、約２６４万の分子量を有し、したがって、これらの複合体を介する極めて大型の治療薬の送達を評価するために選択された。
試料の調製
各事例において、過剰なポリカチオンを使用して、過剰な正電荷を有する最終複合体を構築した。電荷密度の増加によりサイズは大きくなる（即ち、より多くの主鎖が複合体１つにつき存在する）が、複合体当たりの効率因子密度の増加が、これらの変化を相殺することができる。したがって、最良の結果は、低い比率（即ち、大きさに基づいて）又は高い比率（即ち、効率因子密度に基づいて）で起こり得、ここでは、ＫＮＲ２についてどちらも評価する。Ｋ２効率及びスーパーフェクト効率の最適な比は、製造業者の推奨及び最大効率に関する以前の報告に基づいて選択した。細胞培養において評価される組成物の合計体積及び最終ｐＨと同様に、核酸治療薬の用量を全グループにわたって標準化した。
以下の混合物を調製した。
１）ＣＭＶプロモーターによって駆動される、青色蛍光タンパク質を発現するプラスミドの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液に対して４：１の電荷比のＫ２。
２）ＣＭＶプロモーターによって駆動される、青色蛍光タンパク質を発現するプラスミドの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液に対して１５：１の比のＫＮＲ２。
３）ＣＭＶプロモーターによって駆動される、青色蛍光タンパク質を発現するプラスミドの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液に対して１０：１の比のＫＮＲ２。
４）ＣＭＶプロモーターによって駆動される、青色蛍光タンパク質を発現するプラスミドの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液に対して４：１の比のＫＮＲ２。
５）ＣＭＶプロモーターによって駆動される、青色蛍光タンパク質を発現するプラスミドの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液に対して１．２５：１の比のＫＮＲ２。
６）ＣＭＶプロモーターによって駆動される、青色蛍光タンパク質を発現するプラスミドの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液に対して５：１の電荷比の、製造業者の推奨によるスーパーフェクト。
細胞培養手順
細胞培養実験はすべて、処置群の正体について盲検化された観察者によって実施された。６ウェルプレートで、７０％コンフルエントなＨＡ−ＶＳＭＣ初代ヒト大動脈平滑筋細胞（２１継代；ＡＴＣＣ、ロックビル（Rockville）、メリーランド州）に各溶液１．０ｍＬを加え、１０％血清を含むＭ−１９９中で、摂氏３７度、１０％ＣＯ２で４８時間増殖させた。未処置の対照ウェルも同様に評価し、１群につきｎ＝５ウェルで各群を評価した。
効率分析
盲検化された観察者は、ＢＦＰフィルター及び平面アポクロマートレンズの付いたNikon E600エピ蛍光顕微鏡を用いて、各ウェルの表面から６０度、１８０度、及び２００度で、未処置の細胞プレートの低倍率写真（全体で１０倍）を撮影した。Image Pro Plus 3.0画像解析セット（Media Cybernetics社製、シルバースプリング（SilverSpring）、メリーランド州）を用いて、陽性の細胞領域全体に対するパーセントを測定した。この結果をそれぞれについて細胞領域全体に標準化し、遺伝子送達の効率（検出可能なレベルで導入遺伝子を発現する全細胞の比率）として報告した。
毒性分析
続いて、盲検化された観察者は、色素排除アッセイ（生細胞は色素を排除するが、生育不能な細胞は排除できない）、続いて、リン酸緩衝化生理食塩水中の０．４％ＳＤＳへの可溶化で各ウェルを評価した。トランスフェクション剤の毒性の直接的な尺度として生育不能な細胞を定量的に評価するために、Spectronic Genesys 5 UV/VIS分光光度計により、５９５ｎｍ（青色）の波長で試料を評価した。ＯＤ５９５測定に先立って、一致するＯＤ２８０値に濃度を調整することによって、細胞数が同一になるように試料を標準化した。
データ処理及び統計分析
盲検化された観察者は、Image Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics社製、シルバースプリング、メリーランド州）を用いて、バッチ式（batch）画像解析によって陽性染色の総量を測定し、それぞれについて陽性染色のパーセントを決定するために、横断面領域全体にそれを標準化した。続いて、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー（Berkeley）、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を測定した。
結果
効率：
効率性の結果は以下のとおりであった（平均値±標準誤差）
１）０．１６３±０．１０６％
２）１０．６４２±２．１９５％
３）８．７９７±３．８３９％
４）１５．０３５±１．０９８％
５）１７．５７４±６．８０７％
６）１．１９９±０．５７３％
第４回及び第５回の試験は、ポリリジン単独及びスーパーフェクトの双方と比べて、統計学的に有意な（Fisher PLSD及びＴＵＫＥＹ−Ａ事後試験を用いる１因子反復測定分散分析によってＰ＜０．０５）遺伝子送達効率の向上を示している。
毒性
平均毒性データは以下のとおりである（ＯＤ５９５でのＡＵで示されている。生理食塩水単独の場合に示されるような低い値は、低い毒性と相関があり、条件１で示されるようなより高い値は、高い細胞毒性を示唆する。
生理食塩水−０．０５７Ａ、
１）３．４６０Ａ、
２）０．２５１Ａ、
３）０．２９１Ａ、
４）０．２４３Ａ、
５）０．２９７Ａ、
６）０．３３７Ａ。
結論
対照、さらには現在の基準であるスーパーフェクトのものより、より毒性が低くより効率的な遺伝子送達を、１．２５対４．０の比率のＫＮＲ２及びＤＮＡを用いて実現することができる。この実験は、この担体を用いて、極めて大型の治療用複合体を膜を通過して送達できる可能性を裏付ける。
本実施例は、単回投与後の、本発明の担体による皮膚を通過しての大型核酸の輸送を例示する。
主鎖の選択
リジン側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に１８個が−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７に共有結合している）、分子量１５０，０００のポリリジンに−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７を共有結合させることによって、正に帯電した主鎖を構築した。修飾された主鎖を先と同様に「ＫＮＲ２」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のポリリジン（「Ｋ２」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。別の対照ポリカチオン、即ち、活性化されたデンドリマーベースの作用物質であるSuperfect（Qiagen社製）を、高いトランスフェクション速度の基準として選択した（即ち、同時に陽性対照及びインビトロの毒性に対する現況技術の効率の基準となる）。
治療物質の選択
本実験のために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される、大腸菌βガラクトシダーゼ（βｇａｌ）の導入遺伝子全体及びフランキング配列の一部分を含む８．５キロベースのプラスミド（ｐＳｐｏｒｔベースの鋳型、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を使用した。この場合、βｇａｌは、トランスフェクトされ、その後、その遺伝子を転写及び翻訳する細胞に対する同定可能なマーカーとしての機能を果たし、外来酵素に対する特異的染色後に直接可視化することができる。したがって、複合体が皮膚を通過し、次いで標的細胞に到達し、有効搭載量の送達前に、原形質膜と核膜の双方を通過した細胞のみが、導入遺伝子を発現することができる。この特有のプラスミドは、約２，８０５，０００の分子量を有する。
試料の調製
各事例において、過剰なポリカチオンを使用して、過剰な正電荷を有する最終複合体を構築する。製造業者の推奨に基づき、最大効率を決定するインビトロ実験の前に、Ｋ２効率、ＫＮＲ２効率、及びスーパーフェクト効率の最適な比を選択した。局所適用される組成物の合計体積及び最終ｐＨと同様に、核酸治療薬の用量を全グループにわたって標準化した。以下のように試料を調製した。
ＡＫ１と名づけた群：最終アリコート当たり８マイクログラムのβgalプラスミド（p/CMV-sport-βgal）（即ち、合計８０マイクログラム）及びペプチジル担体ＫＮＲ２を電荷比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で２００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を１．８ｍｌのセタフィル（Setaphil）保湿剤と混合して均質にし、インビボ実験のために２００マイクロリットルずつ分取した。
ＡＬ１と名づけた群：最終アリコート当たり８マイクログラムのβgalプラスミド（p/CMV-sport-βgal）（即ち、合計８０マイクログラム）及びＫ２を電荷比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で２００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を１．８ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、インビボ実験のために２００マイクロリットルずつ分取した。
ＡＭ１と名づけた群：最終アリコート当たり８マイクログラムのβgalプラスミド（p/CMV-sport-βgal）（即ち、合計８０マイクログラム）及びスーパーフェクトを電荷比５：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で２００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を１．８ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、インビボ実験のために２００マイクロリットルずつ分取した。
ペプチジル担体及び核酸治療薬を用いた１回の処置後の経皮送達効率を測定するための動物実験
処置を施す間、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。麻酔をかけた後、C57 black 6マウス（１群当たりｎ＝４）は、計量した用量２００マイクロリットルの適切な処置を、背部（dorsal back）皮膚の頭側部分（マウスの口や肢がこの領域に届かないために選択された）に適用された。動物は、脱毛処理は受けなかった。低体温を防止するために管理された熱環境において動物を回復させ、応答するようになった後、一晩、食物及び水を自由に与えた。処置の２４時間後に、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させ、盲検化された観察者が、処置した皮膚部分の全層を採取した。処置部分を３つの部分に等分し、頭側部分を１０％中性緩衝ホルマリン中で１２〜１６時間固定し、次いで、パラフィン包埋するまで７０％エタノール中で保存した。中央部分は、急速凍結し、以前に説明されているような切片上での摂氏３７度のβ−ガラクトシダーゼ染色に直接使用した（Waugh, J.M., M. Kattash, J. Li, E. Yuksel, M.D. Kuo, M. Lussier, A.B. Weinfeld, R. Saxena, E.D. Rabinovsky, S. Thung, S.L.C. Woo, and S.M. Shenaq. Local Overexpression of Tissue Plasminogen Activator to Prevent Arterial Thrombosis in an in vivo Rabbit Model. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 96(3): 1065-1070. 同様に、Elkins CJ, Waugh JM, Amabile PG, Minamiguchi H, Uy M, Sugimoto K, Do YS, Ganaha F, Razavi MK, Dake MD. Development of a platform to evaluate and limit in-stent restenosis. Tissue Engineering 2002. Jun;8(3): 395-407）。尾側の処置部分は、可溶化調査のために急速凍結した。
毒性
上記の効率に関して分析したものに対する毒性を、対にした切片での色素排除によって評価した。これらの方法を併用することは確実ではないため、切片は、効率性又は毒性のいずれかについてのみ染色を受けた。毒性分析の場合、これらの切片を排除色素に５分間浸し、次いで、摂氏３７度、１０％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。この期間中に色素を排除しなかった細胞はすべて、生育不能とみなした。
データ処理及び統計分析
データ収集及び画像解析は、盲検化された観察者が実施した。前述したように染色した切片の全体を、平面アポクロマートレンズの付いたNikon E600顕微鏡で撮影した。得られた画像を、β−ガラクトシダーゼ酵素活性（ここで使用した基質法では青色）又は細胞毒性に関して陽性の数を決定するために、マニュアルを確認しながら前述のImage Pro Plusソフトウェアを用いて、バッチ式画像解析処理にかけた。各々に対するヌクレアファーストレッド染色によって、これらの結果を横断面全体の細胞数に標準化し、横断面の陽性染色のパーセントとして表にした。次いで、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー（Berkeley）、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を続いて測定した。
結果
結果を以下の表にまとめ、図３に示す。正に帯電したペプチジル経皮送達担体は、Ｋ２（本質的には陰性対照）及び効率のベンチマーク標準のスーパーフェクトの双方に対して、送達効率及び導入遺伝子発現の統計学的に有意な上昇を実現した。スーパーフェクトは、Ｋ２よりも統計学的に有意な改善を達成したが、ＫＮＲ２は、このモデルの系のスーパーフェクトよりも１桁以上大きな送達効率の改善を示した。
実施例２：各処置群の全数に対するパーセントとしての、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞の平均値及び標準誤差
Figure 2007526330
毒性についての結果を図４に示す。この図は、処置の２４時間後に生育不能のままであった領域全体のパーセントを示す。この場合、Ｋ２は、以前に説明されているように（Amabile, P.G., J.M.Waugh, T. Lewis, C.J. Elkins, T. Janus, M.D. Kuo, and M.D. Dake. Intravascular Ultrasound Enhances in vivo Vascular Gene Delivery. J.Am.Col.Cardiol. 2001 June; 37(7):1975-80）Ｋ２の輸送効率が低い用量でさえ、ＫＮＲ２又はスーパーフェクトに比べて統計学的に有意な、細胞毒性を示している。
結論
ペプチジル経皮担体は、特に、先に考察した導入遺伝子発現及び複合体全体の大きさの制約を考慮すれば、高効率で、大型の複合体を皮膚を通過して輸送することができる。（１）方法が非常に簡略化されており、画像解析がより正確であること、（２）効率の点レベルの実証（point demonstration）が、すでにII.Bで結論的に与えられていたこと、（３）非細胞性成分が断面のかなりの部分を占めるため、領域測定が、インビボの結果を理解するためのより広い範囲を提供すること、（４）さらに大きな非ペプチジル担体複合体に対する比較が容易になることを理由として、ここでは、陽性の数ではなく陽性領域を分析に使用した。
本実施例は、本発明の正に帯電したペプチジル担体を７日間連続して適用することによる、皮膚を通過しての大型核酸ベースの治療薬の経皮送達を例示する。
主鎖の選択
リジン側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に１８個が−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７に共有結合している）、分子量１５０，０００のポリリジンに−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７を共有結合させることによって、正に帯電したペプチジル主鎖を構築した。修飾された主鎖を「ＫＮＲ２」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のポリリジン（「Ｋ２」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。
治療物質の選択
本実験のために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される、大腸菌βガラクトシダーゼ（βｇａｌ）の導入遺伝子全体及びフランキング配列の一部分を含む８．５キロベースのプラスミド（ｐＳｐｏｒｔベースの鋳型、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を使用した。この特有のプラスミドは、約２，８０５，０００の分子量を有し、したがって、ペプチジル担体を介する、皮膚を通過しての極めて大型の治療薬の送達を評価するために選択された。
試料の調製
各事例において、過剰なポリカチオンを使用して、過剰な正電荷を有する最終複合体を構築した。実験の比は、先の実験で示した単回投与実験に対応するように選択した。局所適用される組成物の合計体積及び最終ｐＨと同様に、核酸治療薬の用量を全グループにわたって標準化した。以下のように試料を調製した。
ＡＫ１と名づけた群：最終アリコート当たり８マイクログラムのβgalプラスミド（p/CMV-sport-βgal）（即ち、合計２４０マイクログラム）及びペプチジル担体ＫＮＲ２を電荷比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、インビボ実験のために２００マイクロリットルずつ分取した。
ＡＬ１と名づけた群：最終アリコート当たり８マイクログラムのβgalプラスミド（p/CMV-sport-βgal）（即ち、合計２４０マイクログラム）及びＫ２を電荷比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、インビボ実験のために２００マイクロリットルずつ分取した。
ペプチジル担体及び核酸治療薬による１日１回の処置を７回受けた後の累積的な経皮送達効率を測定するための動物実験
処置を施す間、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。麻酔をかけた後、C57 black6マウス（１群当たりｎ＝４）は、計量した用量２００マイクロリットルの適切な処置を、背部皮膚の頭側部分（マウスの口や肢がこの領域に届かないために選択された）に適用された。動物は、脱毛処理は受けなかった。低体温を防止するために管理された熱環境において動物を回復させ、応答するようになった後、一晩、食物及び水を自由に与えた。この手順を１日のうちのほぼ同じ時間に１日１回、７日間繰り返した。７日間の処置後に、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させ、盲検化された観察者が、処置した皮膚部分の全層を採取した。処置部分を３つの部分に等分し、頭側部分を１０％中性緩衝ホルマリン中で１２〜１６時間固定し、次いで、パラフィン包埋するまで７０％エタノール中で保存した。中央部分は、急速凍結し、以前に説明されているような切片上での摂氏３７度のβ−ガラクトシダーゼ染色に直接使用した。尾側の処置部分は、可溶化調査のために急速凍結した。
データ処理及び統計分析
データ収集及び画像解析は、盲検化された観察者が実施した。前述したように染色した切片の全体を、平面アポクロマートレンズの付いたNikon E600顕微鏡で撮影した。得られた画像を、β−ガラクトシダーゼ酵素活性に関して陽性の領域を決定するために、マニュアルを確認しながら前述のImage Pro Plusソフトウェアを用いて、バッチ式画像解析処理にかけた。これらの結果をそれぞれについて細胞の横断面領域全体に標準化し、横断面の陽性染色のパーセントとして表にした。次いで、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を続いて測定した。
結果
結果を以下の表にまとめ、図５に示す。ペプチジル経皮送達担体は、Ｋ２に対して、送達効率及び導入遺伝子発現の統計学的に有意な増大を実現した。
実施例３．各処置群に対して１日１回、計７回適用後の、全領域に対するパーセントとしての、β−ガラクトシダーゼの累積的導入遺伝子発現の平均値及び標準誤差
Figure 2007526330
非ペプチジル担体
本実施例は、７日間連続の適用において本発明の正に帯電した非ペプチジル担体を用いることによる、皮膚を通過しての大型核酸ベースの治療薬の経皮送達を例示する。
主鎖の選択
ＰＥＩ側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、３０％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に３０個が−ＧＩｙ３Ａｒｇ７に共有結合している）、分子量１，０００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７を共有結合させることによって、正に帯電した主鎖を構築した。大型の非ペプチジル担体を示すために、修飾された主鎖を「ＰＥＩＲ」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のＰＥＩ（「ＰＥＩ」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。
治療物質の選択
本実験のために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される、大腸菌βガラクトシダーゼ（βｇａｌ）の導入遺伝子全体及びフランキング配列の一部分を含む８．５キロベースのプラスミド（ｐＳｐｏｒｔベースの鋳型、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を使用した。この特有のプラスミドは、約２，８０５，０００の分子量を有する。
試料の調製
各事例において、過剰なポリカチオンを使用して、過剰な正電荷を有する最終複合体を構築した。局所適用される組成物の合計体積及び最終ｐＨと同様に、核酸治療薬の用量を全グループにわたって標準化した。以下のように試料を調製した。
ＡＳと名づけた群：最終アリコート当たり８マイクログラムのβgalプラスミド（p/CMV-sport-βgal）（即ち、合計２４０マイクログラム）及び対照ＰＥＩを電荷比５：１で混合して均質にし、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために２００マイクロリットルずつ分取した。
ＡＴと名づけた群：最終アリコート当たり８マイクログラムのβgalプラスミド（p/CMV-sport-βgal）（即ち、合計２４０マイクログラム）及び複合体非ペプチジル担体ＰＥＩＲ（「ＰＥＩＲ」）を電荷比５：１で混合して均質にし、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、インビボ実験のために２００マイクロリットルずつ分取した。
ＡＵと名づけた群：最終アリコート当たり８マイクログラムのβgalプラスミド（p/CMV-sport-βgal）（即ち、合計２４０マイクログラム）及び高度に精製されたEssentia非ペプチジル担体ＰＥＩＲ（「純粋なＰＥＩＲ」）を電荷比５：１で混合して均質にし、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、インビボ実験のために２００マイクロリットルずつ分取した。
非ペプチジル担体及び核酸治療薬による１日１回の処置を７回受けた後の累積的な経皮送達効率を測定するための動物実験
処置を施す間、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。麻酔をかけた後、C57 black6マウス（１群当たりｎ＝３）は、計量した用量２００マイクロリットルの適切な処置を、背部皮膚の頭側部分（マウスの口や肢がこの領域に届かないために選択された）に適用された。動物は、脱毛処理は受けなかった。低体温を防止するために管理された熱環境において動物を回復させ、応答するようになった後、一晩、食物及び水を自由に与えた。この手順を１日のうちのほぼ同じ時間に１日１回、７日間繰り返した。７日間の処置後に、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させ、盲検化された観察者が、処置した皮膚部分の全層を採取した。処置部分を３つの部分に等分し、頭側部分を１０％中性緩衝ホルマリン中で１２〜１６時間固定し、次いで、パラフィン包埋するまで７０％エタノール中で保存した。中央部分は、急速凍結し、以前に説明されているような切片上での摂氏３７度のβ−ガラクトシダーゼ染色に直接使用した。尾側の処置部分は、可溶化調査のために急速凍結した。
データ処理及び統計分析
データ収集及び画像解析は、盲検化された観察者が実施した。前述したように染色した切片の全体を、平面アポクロマートレンズの付いたNikon E600顕微鏡で撮影した。得られた画像を、β−ガラクトシダーゼ酵素活性に関して陽性の領域を決定するために、マニュアルを確認しながらImage Pro Plusソフトウェアを用いて、バッチ式画像解析処理にかけた。これらの結果をそれぞれについて細胞の横断面領域全体に標準化し、横断面の陽性染色のパーセントとして表にした。次いで、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を続いて測定した。
結果
結果を以下の表にまとめ、図６に示す。非ペプチジル経皮送達担体は、複合型でも超高純度型でも、ＰＥＩに対して、送達効率及び導入遺伝子発現の統計学的に有意な増大を実現した。ＰＥＩＲの超高純度型は、算出される試薬の特異的活性がより高いことと一致して、標準のＰＥＩＲより高い効率になる傾向を示した。
実施例４．各処置群に対して１日１回、計７回適用後の、全領域に対するパーセントとしての、β−ガラクトシダーゼの累積的導入遺伝子発現の平均値及び標準誤差
Figure 2007526330
結論
非ペプチジル経皮担体は、特に、先に考察した導入遺伝子発現及び複合体全体の大きさの制約を考慮すれば、高効率で、大型の複合体を皮膚を通過して輸送することができる。効率は、ペプチジル担体のより小型の複合体で得られたものほど高くはなかったが、著しい増加が実現された。注目すべきことに、大型非ペプチジル複合体による導入遺伝子発現の分布は、ほとんど専ら毛包に位置していたのに対し、ペプチジル担体に対する結果は、断面の全体にわたって広がっていた。したがって、サイズ及び主鎖の向性は、送達のナノ力学的な標的化に使用することができる。
本実験は、１回の投与後に、標識した完全なタンパク質ボツリヌストキシンを含有する大型複合体を無傷の皮膚を通して輸送するためのペプチジル担体の使用を対照と比べて実証する。
主鎖の選択
リジン側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に１８個が−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７に共有結合している）、分子量１１２，０００のポリリジンに−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７を共有結合させることによって、正に帯電した主鎖を構築した。修飾した主鎖を「ＫＮＲ」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のポリリジン（「Ｋ」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。
治療物質
ボツリヌストキシンＡの「Botox（登録商標）」ブランド（Allergan社製）を本実験のために選択した。その分子量は、約１５０，０００である。
試料の調製
製造業者の取扱い説明書に従って、ボツリヌストキシンに水を加えて元に戻した。計算上１２倍モル過剰のスルホＮＨＳ−ＬＣビオチン（Pierce Chemical社製）を用いて、一定分量のタンパク質をビオチン標識した。標識した生成物を「Btox-b」と呼んだ。
各事例において、陰性度の高い大型核酸複合体の送達の際のように、過剰なポリカチオンを使用して、過剰な正電荷を有する最終複合体を構築した。正味の中性又は正電荷は、陰性度の高い細胞表面プロテオグリカン及び細胞外基質からタンパク質複合体が反発するのを防止する。局所適用される組成物の合計体積及び最終ｐＨと同様に、Btox-bの用量を全グループにわたって標準化した。以下のように試料を調製した。
「ＪＭＷ−７」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのBtox-b（即ち、合計２０Ｕ）及びペプチジル担体ＫＮＲを計算上の分子量比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で２００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を１．８ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
「ＪＭＷ−８」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのBtox-b（即ち、合計２０Ｕ）及びＫを電荷比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で２００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を１．８ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
ペプチジル担体及び標識したボツリヌストキシンを用いた１回の処置後の経皮送達効率を測定するための動物実験
処置を施す間、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。麻酔をかけた後、C57 black6マウス（１群当たりｎ＝４）は、背部皮膚の頭側部分（マウスの口や肢がこの領域に届かないために選択された）に適用される、計量した用量２００マイクロリットルの適切な処置の局所適用を受けた。動物は、脱毛処理は受けなかった。初回の処置の３０分後に、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させ、盲検化された観察者が、処置した皮膚部分の全層を採取した。処置部分を３つの部分に等分し、頭側部分を１０％中性緩衝ホルマリン中で１２〜１６時間固定し、次いで、パラフィン包埋するまで７０％エタノール中で保存した。中央部分は急速凍結し、以下に要約するような、盲検化された観察者によるビオチン可視化に直接使用した。尾側の処置部分は、可溶化調査のために急速凍結した。
以下のようにしてビオチン可視化を行った。手短に言えば、各切片を「NeutrAvidin（登録商標）」緩衝溶液に１時間浸した。アルカリホスファターゼ活性を可視化するために、断面を生理食塩水中で４回洗浄し、次いで、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Pierce Scientific社製）に１時間浸した。次いで、切片を生理食塩水中ですすぎ、平面アポクロマートレンズの付いたNikon E600顕微鏡で全体を撮影した。
データ処理及び統計分析
盲検化された観察者は、Image Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics社製、シルバースプリング、メリーランド州）を用いて、バッチ式画像解析によって陽性染色の総量を測定し、それぞれについて陽性染色のパーセントを決定するために、横断面領域全体にそれを標準化した。続いて、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を測定した。
結果
ビオチン標識したボツリヌストキシンに対して陽性な断面領域の平均を、ＫＮＲ（「EB-Btox」）又はＫ（「ｎｌ」）のいずれかと共にBtox-bを１回局所投与した後の全領域に対するパーセントとして報告した。これらの結果を以下の表に示し、図７に例示する。図７では、標識に対して陽性の領域を、Btox-b及びペプチジル担体ＫＮＲを含む「EB-Btox」、並びに対照としてのポリカチオンＫと共にBtoxbを含む「ｎｌ」による１日１回の処置を３日間行った後の全領域に対するパーセントとして決定した。各群について平均及び標準誤差を示す。
実施例５．ＫＮＲ（ＪＭＷ−７）又はＫ（ＪＭＷ−８）と共にBtox-bを３０分間、１回局所投与した後の、全断面に対するパーセントとしての、標識されたボツリヌストキシン領域の平均値及び標準誤差
Figure 2007526330
実施例５は、ペプチジル経皮担体が、無傷の皮膚のマウスモデルにおける局所適用後の効率的なボツリヌストキシン輸送を可能にすることを実証した。しかし、本実験は、皮膚を通過して移動した後に、タンパク質ボツリヌストキシン複合体が機能的な形態で放出されるかどうかは示さなかった。したがって、このペプチジル担体を用いて（さらに、タンパク質を共有結合で修飾せずに）、無傷の皮膚を通って、ボツリヌストキシンを局所薬として治療的に送達させることができるかどうかを評価するために、以下の実験を構成した。
リジン側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に１８個が−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７に共有結合している）、分子量１１２，０００のポリリジンに−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７を共有結合させることによって、正に帯電した主鎖を再び構築した。修飾された主鎖を「ＫＮＲ」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のポリリジン（「Ｋ」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。実施例５の場合と同じボツリヌストキシン治療物質を使用し、同じ方法で調製した。以下のように試料を調製した。
「ＪＭＷ−９」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）及びペプチジル担体ＫＮＲを計算上の分子量比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
「ＪＭＷ−１０」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）及びＫを電荷比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのCetaphilと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
「ＪＭＷ−１１」と名づけた群：ポリカチオン無しの、アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）をリン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
ペプチジル担体及びボツリヌストキシンを用いた１回の処置後の治療効率を測定するための動物実験
処置を施す間、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。麻酔をかけた後、C57 black6マウス（１群当たりｎ＝４）は、つま先から大腿中央まで均一に適用される適切な処置の計量した用量４００マイクロリットルの局所適用を受けた。両方の肢に処置し、両側に無作為に処置を施した。動物は、脱毛処理は受けなかった。初回の処置の３０分後に、公表されているボツリヌストキシン投与後の足の可動性に関する指外転スコア（Aoki, KR.. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon. 2001 Dec; 39(12): 1815-20）に従って、マウスの指の外転能力を評価した。マウスの可動性も主観的に評価した。
データ処理及び統計分析
２名の盲検化された観察者が、それぞれ独立に、指外転スコアを表にした。続いて、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を測定した。
結果
ＫＮＲ（「ＪＭＷ−９」）、Ｋ（「ＪＭＷ−１０」）、又はポリカチオン無しの希釈剤（「ＪＭＷ−１１」）と共にボツリヌストキシンを１回局所投与した後の平均指外転スコアを以下の表に示し、図８の代表的な顕微鏡写真において例示する。ペプチジル担体ＫＮＲは、互いに同等である両方の対照と比べて、統計学的に有意な、皮膚を通過してのボツリヌストキシンの機能的送達をもたらした。本実験をさらに独立して反復することにより（合計３回の独立した実験の全てで、ＫＮＲを伴う局所的ボツリヌストキシンから統計学的に有意な麻痺が起こり対照では起こらないという同一の結論が得られた）、本発明の研究結果が確認され、Ｋのある場合又は無い場合（即ち、双方の対照）に局所的ボツリヌストキシンの間で有意な差は明らかにされなかった。興味深いことに、マウスは、一貫して、麻痺した肢の方へ移動した（処置された動物の１００％、並びに両対照群の対照の０％で起こった）。図８で示すように、対照のポリカチオンを加えたボツリヌストキシン、又はポリカチオン無しのボツリヌストキシン（「Btox単独」）で処置された肢は、（持ち上げられたときの防衛機構として）指を動かすことができるが、ペプチジル担体ＫＮＲを加えたボツリヌストキシン（「Essentia Btoxローション剤」）で処置された肢は動かすことができなかった。
実施例６．ペプチジル担体ＫＮＲ（「ＪＭＷ−９」）と共に、対照のポリカチオンＫ（「ＪＭＷ−１０」）と共に、又は単独（「ＪＭＷ−１１」）でボツリヌストキシンを１回局所適用した３０分後の指外転スコア
Figure 2007526330
結論
本実験は、ペプチジル経皮担体が、治療薬を共有結合で修飾せずに、治療有効量のボツリヌス治療薬を皮膚を通過して輸送できることを実証するのに役立つ。本実験はまた、対照において局所適用された場合はボツリヌストキシンが機能しないことも裏付ける。
本実験は、本発明の非ペプチジル担体の能力を実証する。
主鎖の選択
ＰＥＩ側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、３０％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に３０個が−ＧＩｙ３Ａｒｇ７に共有結合している）、分子量１，０００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７を共有結合させることによって、正に帯電した主鎖を構築した。修飾された主鎖は、大型の非ペプチジル担体を示すために「ＰＥＩＲ」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のＰＥＩ（「ＰＥＩ」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。実施例５と同じボツリヌストキシン治療物質を使用した。
製造業者の取扱い説明書に従って、「BOTOX（登録商標）」製品からボツリヌストキシンを元に戻した。各事例において、陰性度の高い大型核酸複合体の送達の際のように、過剰なポリカチオンを使用して、過剰な正電荷を有する最終複合体を構築した。正味の中性又は正電荷は、陰性度の高い細胞表面プロテオグリカン及び細胞外基質からタンパク質複合体が反発するのを防止する。局所適用される組成物の合計体積及び最終ｐＨと同様に、ボツリヌストキシンの用量を全グループにわたって標準化した。以下のように試料を調製した。
「ＡＺ」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）及び超高純度型の非ペプチジル担体ＰＥＩＲを計算上の分子量比５：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
「ＢＡ」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）及びＰＥＩを電荷比５：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのセタフィルと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
１回処置後の治療効率を測定するための動物実験
処置を施す間、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。麻酔をかけた後、C57 black6マウス（１群当たりｎ＝３）は、つま先から大腿中央まで均一に適用される適切な処置の計量した用量４００マイクロリットルの局所適用を受けた。両方の肢に処置し、両側に無作為に処置を施した。動物は、脱毛処理は受けなかった。初回の処置の30分後に、公表されているボツリヌストキシン投与後の足の可動性に関する指外転スコア（Aoki, KR.. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon. 2001 Dec; 39(12): 1815-20）に従って、マウスの指の外転能力を評価した。マウスの可動性も主観的に評価した。
データ処理及び統計分析
２名の盲検化された観察者が、それぞれ独立に、指外転スコアを表にした。続いて、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を測定した。
結果
超高純度ＰＥＩＲ（「ＡＺ」）、又は対照のポリカチオンＰＥＩ（「ＢＡ」）と共に行うボツリヌストキシンの１回局所投与、及び再現（本実験の１回の独立した再現）後の平均の指外転スコアを以下の表に示す。非ペプチジル担体ＰＥＩＲは、対照と比べて、統計学的に有意な、皮膚を通過してのボツリヌストキシンの機能的送達をもたらした。先と同様に、動物は、麻痺した肢の方向へ同じ所をめぐりながら歩くのが観察された。
実施例７．再現１。超高純度ＰＥＩＲ（「ＡＺ」）、又は対照のポリカチオンＰＥＩ（「ＢＡ」）と共にボツリヌストキシンを１回局所投与した３０分後の指外転スコア。平均値及び標準誤差を示す。
Figure 2007526330
 実施例７．再現２。超高純度ＰＥＩＲ（「ＡＺ１」）、又は対照のポリカチオンＰＥＩ（「ＢＡ１」）と共にボツリヌストキシンを１回局所投与した３０分後の指外転スコア。平均値及び標準誤差を示す。
Figure 2007526330
結論
本実験は、非ペプチジル経皮担体が、ボツリヌストキシンを事前に共有結合で修飾せずに、治療量のボツリヌストキシンを皮膚を通過して輸送できることを実証した。これらの研究結果は、ペプチジル輸送物質によるものを補完する。治療効果を得るために非ペプチジル又はペプチジル担体の使用を選択できることにより、個々の状況、環境、及び適用方法に合わせることが可能になり、本発明の経皮送達の場の幅が広げられる。
これらの実施例では、担体無しの局所的ボツリヌストキシンに対する、ペプチジル又は非ペプチジル担体を用いたボツリヌストキシン浸透が、免疫化用の抗原の経皮浸透に対する、特にボツリヌスなど他の方法では皮膚をあまり通らない抗原を用いた免疫化に対する有用性をさらに証明する。機能的ボツリヌストキシンの送達は、少なくとも４つの異なる抗原決定基が完全な状態で経皮送達されることを確実にする。いずれの実施例でも担体が無い場合は機能的ボツリヌストキシンが送達されなかったという事実は、担体が、担体が無い場合の作用物質と比べて、著しい免疫化能力を与えることを裏付ける。免疫化は、免疫応答を開始するのに十分な量の抗原が皮膚を通過することを必要とするため、この手法は、免疫化用の抗原の経皮送達を可能にする。この手法は抗原の共有結合的修飾を必要とせず、ウイルス遺伝子の導入を伴う必要がないため、安全性、安定性、及び効率の点でいくつかの利点が生じる。
本実施例は、ＴＡＴ効率因子を有するペプチジル及び非ペプチジル担体、並びにボツリヌストキシンとこれらの担体の構築物の作製を詳述する。
ＴＡＴ断片ＧＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲへのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の結合
側鎖保護基をすべて欠いているＴＡＴ断片ＧＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（６ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、Sigma Genosys社製、ヒューストン（Houston）、テキサス州）を１ｍｌの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液に溶解した。これに、ＥＤＣ（３ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）、続いてＰＥＩ ４００ｋ分子量の水中５０％溶液（ｗ：ｖ）（約０．０２ｍｌ、約２．５×１０−５ｍｍｏｌ）を加えた。試験紙によって、ｐＨが７．５であることが測定された。さらに１ｍｌ分の０．１Ｍ ＭＥＳを加え、ＨＣｌを添加してｐＨを約５に調整した。さらにＥＤＣ（５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨ約５の反応物を一晩攪拌した。翌朝、反応混合物を凍結し、凍結乾燥した。
SephadexG-25（Amersham Biosciences社製、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）のカラム（直径１ｃｍ×高さ１４ｃｍ）を滅菌１×ＰＢＳ中でスラリー状にした。分子量１９ｋＤのＦＩＴＣデキストラン（Sigma社製、セントルイス、ミズーリ州）の溶出によって、カラムを標準化した。標準は、５ｍｌ ＰＢＳで最初に溶出し、６ｍｌで中央ピークを示し、７ｍｌで次第に消えた。前述のものに由来する凍結乾燥された反応混合物を、少量のＰＢＳ中に溶解させ、カラムに加えた。１ｍｌ ＰＢＳを連続的に適用して、これを溶出させた。画分を回収した。最初の画分は、反応体積を含めて、溶出された最初の３ｍｌからなった。その後の各画分は１ｍｌであった。
溶出された画分の２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を分析した。５〜７ｍｌに対応する画分３、４、及び５は、中程度の吸光度ピークを示した。すべての画分を凍結乾燥し、ＩＲスペクトルを測定した。ＴＡＴ断片の特徴的なグラニジンの３重のピーク（２８００〜３０００ｃｍ−１）が、画分４〜６で認められた。これらの各群は、１７００ｃｍ−１でアミドの伸びも示し、したがって、ＴＡＴ断片及びＰＥＩの結合体が確認された。
ＴＡＴ断片ＧＧＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（１１．６ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を用いてもう１回繰り返しを行った。この量は、ＰＥＩアミンの３０個のうち１つがＴＡＴ断片と反応することが予期されるように計算した。これは、前述の元のポリリジン−オリゴアルギニン（ＫＮＲ）効率因子の組成に近い。ＴＡＴ断片のＰＥＩアミンへの共有結合の成功が前述のＩＲによって確認された。
ＴＡＴ断片へのポリリジンの結合
１ｍｌの０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ約４．５に溶かしたポリリジン（１０ｍｇ １．１×１０−４ｍｍｏｌ; Sigma社製）の溶液に、ＴＡＴ断片（４ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）、次いでＥＤＣ（３．５ｍｇ、０．０１８３ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物（ｐＨ約４．５）を室温で攪拌した。反応物を−７８℃で一晩凍結させた。翌日、反応混合物を室温まで解凍し、飽和炭酸水素ナトリウムの添加によってｐＨを約８に調整した。前述したように構成し標準化したSephadex G-25カラムに、反応混合物を直接添加した。これは、５ｍｌ後から始まる７つの１ｍｌ画分に溶出された。ＵＶ２８０吸光度を測定し、画分２、３、及び４において対応するピークが明らかになった。凍結乾燥された画分のＩＲでは、画分１〜７における特徴的なグアニジンピーク（２８００〜３０００ｃｍ−１）が明らかになった。画分１は１７３０ｃｍ−１に強いピークを生じ、１６００ｃｍ−１ではピークが無かったのに対し、画分２〜６の場合は反対の結果が当てはまった。したがって、ペプチジル担体、ポリリジンに対するＴＡＴ断片の共有結合の成功が確認された。
続いて、共有結合されたＴＡＴ断片及びＰＥＩ（ＰＥＩＴ）、並びに共有結合されたＴＡＴ断片及びポリリジン（ＫＮＴ）をボツリヌストキシンと混合して以下のような非共有結合性複合体を形成させた。
「ＪＬ−１」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのBtox-b（即ち、合計２０Ｕ）及びＰＥＩＴを電荷比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で２００マイクロリットルに希釈した。
「ＪＬ−２」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのBtox-b（即ち、合計２０Ｕ）及びＫＮＴを電荷比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で２００マイクロリットルに希釈した。
非共有結合性複合体の形成後、回転式微量遠心機中で１２，０００×ｇで５分間、粒子を遠心分離し、次いで、２０マイクロリットルの脱イオン水中に再懸濁させ、ＩＲ用のゲルマニム減衰全反射セル上で蒸発させた。このようにして、複合体中のBtox-bの存在を確認した。全体として、本実験は、合成スキームを他の効率因子に適用できたこと、並びに、オリゴアルギニンの正に帯電した分枝又は効率基を含む担体を用いた先の実施例の場合と同様に、得られた担体は、生物学的に活性な作用物質―この場合ボツリヌストキシン―と複合体を形成できることを確認した。
本実験は、特定の抗原を画像化するためのペプチジル担体の能力を実証する。本実施例では、Essentiaペプチジル担体のうちの１つ、ＫＮＲ２と、光学的イメージング部分、及び黒色腫を標的とする改変された抗体との複合体が、黒色腫の局所的検出に適している。
主鎖の選択
リジン側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に１８個が−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７に共有結合している）、分子量１５０，０００のポリリジンに−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７を共有結合させることによって、正に帯電したペプチジル主鎖を構築した。修飾された主鎖を「ＫＮＲ２」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のポリリジン（「Ｋ２」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。
保存されているヒト黒色腫領域、ガングリオシド２に対するマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ３、US Biologicals社製、スワンプスコット（Swampscott）（マサチューセッツ州）を、前述のＥＤＣ結合を介してポリアスパラギン酸アニオン短鎖鎖（ＭＷ３，０００）に共有結合させて、「Gang2Asp」と呼ばれる誘導体化抗体を作製した。さらに、配列がＡＴＧＣ−Ｊ（今後「ＡＴＧＣ−Ｊ」と呼ぶ）であり、「Ｊ」は共有結合したテキサスレッド蛍光を示す、オリゴ核酸（Sigma Genosys社製、ウッドランドズ（Woodlands）、テキサス州）をポリアニオンとして用いて陰イオン性のイメージング物質を設計した。本実験のために、６．３５マイクログラムのGang2Aspを、０．１７１２マイクログラムのＡＴＧＣ−Ｊと組み合わせ、次いで、総体積２００マイクロリットルの脱イオン水中で１７．５マイクログラムのＫＮＲ２と複合体を形成させ、ＫＮＲ２：ＡＴＧＣ−Ｊ：Gang2Aspの最終比を５：１：１とした。この混合物を２分間ボルテックスした。得られた複合体を、水和したCellTekヒト黒色腫スライド、及び対照のCellTekサイトケラチンスライド（ＳＤＬ社製、デスプレーンズ（Des Plaines）、イリノイ州）に塗布し、５分間インキュベートした後、同じ視野における黒色腫色素の明視野分布に対する蛍光分布の写真評価をした。ＡＴＧＣ−Ｊ無し、又はGang2Asp無しの付加的な対照も使用した。
結果
非共有結合性複合体は、抗体が無い場合の複合体の分布ではなく、抗体誘導体の向性に従う、光学的イメージング物質の分布を与えた。より注目すべきことには、これらの複合体は、図９に示されるように、着色された黒色腫細胞の分布に一致する分布に従った。
結論
本実験は、局所送達に適した担体を用いる、皮膚を通過して輸送するための存続可能な複合体の作製、及び光学的技術による黒色腫の可視化を実証する。このような手法は、例えば、外科的な辺縁設定と組み合わせて使用することができ、又は、定期的な黒色腫観察で使用することができる。当業者には明らかであるように、他の皮膚関連障害の局所診断にも同様に、類似した戦略を容易に使用することができる。光学的イメージング部分の極めて高い感度を前提とすると、これらの非共有結合性複合体によって、これらの障害の検出改善がかなり有望になり得る。
本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示するためのものにすぎないこと、並びにそれらを踏まえた様々な修正及び変更が当業者に示唆され、且つそれらが、本出願の精神及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲の内に含まれることを理解されたい。本明細書に引用したすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明で使用する成分の概略図である。 本発明のいくつかの実施形態の概略図である。 実施例２で説明した、大腸菌β−ガラクトシダーゼの導入遺伝子を含むプラスミドの経皮送達の結果を示すグラフである。 実施例３で説明した、大腸菌β−ガラクトシダーゼの導入遺伝子を含むプラスミドの経皮送達の結果を示すグラフである。 実施例４で説明した、大腸菌β−ガラクトシダーゼの導入遺伝子を含むプラスミドの経皮送達の結果を示すグラフである。 実施例５で説明した、ボツリヌストキシンの経皮送達の結果を示すグラフである。 実施例６で説明した、ボツリヌストキシンの経皮送達の結果を示す写真である。 実施例９のイメージング複合体について、黒色腫色素が沈着した細胞の明視野分布（パネルａ及びｃ）の後に蛍光性の光学的イメージング物質（パネルｂ及びｄ）を示す、２種の異なる視野及び異なる拡大率（パネルａ及びｂの１０倍に対し、パネルｃ及びｄは拡大率４０倍）の写真である。

Claims (240)

  1. 治療的に血中グルコースレベルを変えない生物学的に活性なタンパク質と、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含み、経皮送達に有効な量で存在する担体とを含む組成物であって、担体と生物学的に活性なタンパク質との結合が非共有結合性である組成物。
  2. 担体が無い場合の作用物質に比べて、生物学的に活性なタンパク質のより多くの経皮送達を実現する、請求項１に記載の組成物。
  3. 生物学的に活性なタンパク質が治療活性を有する、請求項２に記載の組成物。
  4. 非タンパク質非核酸系の生物学的に活性な作用物質と、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含み、経皮送達に有効な量で存在する担体とを含む組成物であって、担体と生物学的に活性な作用物質との結合が非共有結合性である組成物。
  5. 担体が無い場合の作用物質に比べて、生物学的に活性な作用物質のより多くの経皮送達を実現する、請求項４に記載の組成物。
  6. 生物学的に活性な作用物質が治療活性を有する、請求項５に記載の組成物。
  7. 治療用タンパク質が少なくとも５０，０００ｋＤの分子量を有する、請求項３に記載の組成物。
  8. 主鎖が、正に帯電したポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  9. 主鎖が、約１０，０００〜約１，５００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項８に記載の組成物。
  10. 主鎖が、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項８に記載の組成物。
  11. 主鎖が、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項８に記載の組成物。
  12. 主鎖が、正に帯電したポリリジンを含む、請求項８に記載の組成物。
  13. 主鎖が、約１０，０００〜約１，５００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 主鎖が、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項１２に記載の組成物。
  15. 主鎖が、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項１２に記載の組成物。
  16. 主鎖が、正に帯電した非ペプチジルポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
  17. 非ペプチジルポリマー主鎖が、正に帯電したポリアルキレンイミンを含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項１７に記載の組成物。
  19. ポリエチレンイミンが、約１０，０００〜約２，５００，０００の分子量を有する、請求項１８に記載の組成物。
  20. ポリエチレンイミンが、約１００，０００〜約１，８００，０００の分子量を有する、請求項１８に記載の組成物。
  21. ポリエチレンイミンが、約５００，０００〜約１，４００，０００の分子量を有する、請求項１８に記載の組成物。
  22. 担体が、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片、並びにアンテナペディアＰＴＤ及びその断片若しくは混合物（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から独立に選択される正に帯電した分枝基を結合した正に帯電したポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
  23. 正に帯電した分枝基が、式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する基から独立に選択される、請求項２２に記載の組成物。
  24. 下付き文字ｎ１が、約１〜約８の整数である、請求項２３に記載の組成物。
  25. 下付き文字ｎ１が、約２〜約５の整数である、請求項２３に記載の組成物。
  26. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１７の奇数である、請求項２３に記載の組成物。
  27. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１３の奇数である、請求項２３に記載の組成物。
  28. 分枝基が、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片から選択される、請求項２２に記載の組成物。
  29. 結合された正に帯電した分枝基が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（式中、下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有するＨＩＶ−ＴＡＴ断片である、請求項２８に記載の組成物。
  30. 分枝基が、アンテナペディアＰＴＤ基又はその断片である、請求項２２に記載の組成物。
  31. 正に帯電したポリマーがポリペプチドを含む、請求項２２に記載の組成物。
  32. ポリペプチドが、ポリリジン、ポリアルギニン、及びポリオルニチンから選択される、請求項３１に記載の組成物。
  33. ポリペプチドがポリリジンである、請求項３２に記載の組成物。
  34. ポリマーが、正に帯電した非ペプチジルポリマーを含む、請求項２２に記載の組成物。
  35. 非ペプチジルポリマーが、正に帯電したポリアルキレンイミン含む、請求項３４に記載の組成物。
  36. ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 主鎖が、正に帯電したポリペプチドを含む、請求項４に記載の組成物。
  38. 主鎖が、約１０，０００〜約１，５００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項３７に記載の組成物。
  39. 主鎖が、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項３７に記載の組成物。
  40. 主鎖が、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項３７に記載の組成物。
  41. 主鎖が、正に帯電したポリリジンを含む、請求項３７に記載の組成物。
  42. 主鎖が、約１０，０００〜約１，５００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項４１に記載の組成物。
  43. 主鎖が、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項４１に記載の組成物。
  44. 主鎖が、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項４１に記載の組成物。
  45. 主鎖が、正に帯電した非ペプチジルポリマーを含む、請求項４に記載の組成物。
  46. 非ペプチジルポリマー主鎖が、正に帯電したポリアルキレンイミンを含む、請求項４５に記載の組成物。
  47. ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項４６に記載の組成物。
  48. ポリエチレンイミンが、約１０，０００〜約２，５００，０００の分子量を有する、請求項４７に記載の組成物。
  49. ポリエチレンイミンが、約１００，０００〜約１，８００，０００の分子量を有する、請求項４７に記載の組成物。
  50. ポリエチレンイミンが、約５００，０００〜約１，４００，０００の分子量を有する、請求項４７に記載の組成物。
  51. 担体が、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片、並びにアンテナペディアＰＴＤ及びその断片若しくは混合物（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から独立に選択される正に帯電した分枝基を結合した正に帯電したポリマーを含む、請求項４に記載の組成物。
  52. 正に帯電した分枝基が、式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する基から独立に選択される、請求項５１に記載の組成物。
  53. 下付き文字ｎ１が、約１〜約８の整数である、請求項５２に記載の組成物。
  54. 下付き文字ｎ１が、約２〜約５の整数である、請求項５２に記載の組成物。
  55. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１７の奇数である、請求項５２に記載の組成物。
  56. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１３の奇数である、請求項５２に記載の組成物。
  57. 分枝基が、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片から選択される、請求項５１に記載の組成物。
  58. 結合された正に帯電した分枝基が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（式中、下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有するＨＩＶ−ＴＡＴ断片である、請求項５７に記載の組成物。
  59. 分枝基が、アンテナペディアＰＴＤ基又はその断片である、請求項５１に記載の組成物。
  60. 正に帯電したポリマーがポリペプチドを含む、請求項５１に記載の組成物。
  61. ポリペプチドが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、及びポリホモアルギニンから選択される、請求項６０に記載の組成物。
  62. ポリペプチドがポリリジンである、請求項６１に記載の組成物。
  63. ポリマーが、正に帯電した非ペプチジルポリマーを含む、請求項５１に記載の組成物。
  64. 非ペプチジルポリマーが、正に帯電したポリアルキレンイミンを含む、請求項６３に記載の組成物。
  65. ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項６４に記載の組成物。
  66. 約１×１０−２０〜約２５重量％の生物学的に活性な作用物質、及び約１×１０−１９〜約３０重量％の正に帯電した担体を含有する、請求項４に記載の組成物。
  67. 請求項４に記載の制御放出組成物。
  68. 生物学的に活性なタンパク質がボツリヌストキシンである、請求項１に記載の組成物。
  69. ボツリヌストキシンが、ボツリヌストキシンの血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧから選択される、請求項６８に記載の組成物。
  70. ボツリヌストキシンがボツリヌストキシン誘導体を含む、請求項６８に記載の組成物。
  71. ボツリヌストキシンが組換型ボツリヌストキシンを含む、請求項６８に記載の組成物。
  72. 生物学的に活性な作用物質を送達するための器具と、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含み、経皮送達に有効な量で存在する担体とを含む、請求項１に記載の組成物を被験者に投与するためのキット。
  73. 生物学的に活性な作用物質がボツリヌストキシンである、請求項７２に記載のキット。
  74. 組成物が、生物学的に活性なタンパク質を皮膚又は上皮を介して被験者に投与するための器具に含まれる、請求項７２に記載のキット。
  75. 器具が皮膚パッチである、請求項７４に記載のキット。
  76. 生物学的に活性なタンパク質を皮膚又は上皮に送達するための器具と、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片、並びにアンテナペディアＰＴＤ及びその断片若しくは混合物（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から独立に選択される、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した担体を含む組成物とを含む、生物学的に活性なタンパク質を被験者に投与するためのキットであって、担体と生物学的に活性なタンパク質との結合は非共有結合性であるキット。
  77. 器具が皮膚パッチである、請求項７６に記載のキット。
  78. 正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含む有効量の正に帯電した担体と共に、タンパク質を被験者の皮膚又は上皮に局所的に適用することを含む、治療的に血中グルコースレベルを変えない生物学的に活性なタンパク質を被験者に投与する方法であって、担体と生物学的に活性なタンパク質との結合は非共有結合性である方法。
  79. 組成物が、担体が無い場合の作用物質に比べて、生物学的に活性なタンパク質のより多くの経皮送達を実現する、請求項７８に記載の方法。
  80. 生物学的に活性なタンパク質が治療活性を有する、請求項７９に記載の方法。
  81. 正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含む有効量の正に帯電した担体と共に、生物学的に活性な作用物質を被験者の皮膚又は上皮に局所的に適用することを含む、非タンパク質非核酸系の生物学的に活性な作用物質を被験者に投与する方法であって、担体と生物学的に活性な作用物質との結合が非共有結合性である方法。
  82. 組成物が、担体が無い場合の作用物質に比べて、生物学的に活性な作用物質のより多くの経皮送達を実現する、請求項８１に記載の方法。
  83. 生物学的に活性な作用物質が治療活性を有する、請求項８２に記載の方法。
  84. 生物学的に活性なタンパク質及び担体が、双方の成分を含有する組成物の状態で被験者に投与される、請求項８０に記載の方法。
  85. 生物学的に活性なタンパク質及び担体が、被験者に別々に投与される、請求項８０に記載の方法。
  86. 生物学的に活性なタンパク質及び担体が、双方の成分を含有する組成物の状態で被験者に投与される、請求項８３に記載の方法。
  87. 生物学的に活性な作用物質及び担体が、被験者に別々に投与される、請求項８３に記載の方法。
  88. 組成物が、制御放出組成物又は持続放出組成物である、請求項８０に記載の方法。
  89. 組成物が、制御放出組成物又は持続放出組成物である、請求項８３に記載の方法。
  90. 治療用タンパク質がボツリヌストキシンである、請求項８０に記載の方法。
  91. ボツリヌストキシンが、ボツリヌストキシンの血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧから選択される、請求項９０に記載の方法。
  92. ボツリヌストキシンがボツリヌストキシン誘導体を含む、請求項９０に記載の方法。
  93. ボツリヌストキシンが組換型ボツリヌストキシンを含む、請求項９０に記載の方法。
  94. 被験者に美容的及び／又は化粧的な利点を与えるためにボツリヌストキシンが投与される、請求項９０に記載の方法。
  95. 筋肉痙攣又は痙攣を伴う症状を予防又は軽減するために、被験者にボツリヌストキシンが投与される、請求項９０に記載の方法。
  96. ボツリヌストキシン及び正に帯電した担体が、被験者の顔の部位に局所的に投与される、請求項９０に記載の方法。
  97. ボツリヌストキシン及び正に帯電した担体が、被験者の顔以外の部位に局所的に投与される、請求項９０に記載の方法。
  98. 免疫化に適した抗原と、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含み、経皮送達に有効な量で存在する担体とを含む組成物であって、担体と抗原との結合が非共有結合性である組成物。
  99. 主鎖が、正に帯電したポリペプチドを含む、請求項９８に記載の組成物。
  100. 主鎖が、約１０，０００〜約１，５００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項９９に記載の組成物。
  101. 主鎖が、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項９９に記載の組成物。
  102. 主鎖が、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項９９に記載の組成物。
  103. 主鎖が、正に帯電したポリリジンを含む、請求項９９に記載の組成物。
  104. 主鎖が、約１０，０００〜約１，５００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項１０３に記載の組成物。
  105. 主鎖が、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項１０３に記載の組成物。
  106. 主鎖が、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項１０３に記載の組成物。
  107. 主鎖が、正に帯電した非ペプチジルポリマーを含む、請求項９８に記載の組成物。
  108. 非ペプチジルポリマー主鎖が、正に帯電したポリアルキレンイミンを含む、請求項１０７に記載の組成物。
  109. ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項１０８に記載の組成物。
  110. ポリエチレンイミンが、約１０，０００〜約２，５００，０００の分子量を有する、請求項１０９に記載の組成物。
  111. ポリエチレンイミンが、約１００，０００〜約１，８００，０００の分子量を有する、請求項１０９に記載の組成物。
  112. ポリエチレンイミンが、約５００，０００〜約１，４００，０００の分子量を有する、請求項１０９に記載の組成物。
  113. 担体が、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片、並びにアンテナペディアＰＴＤ及びその断片及び混合物（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から独立に選択される、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電したポリマーを含む、請求項９８に記載の組成物。
  114. 正に帯電した分枝基が、式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する基から独立に選択される、請求項１１３に記載の組成物。
  115. 下付き文字ｎ１が、約１〜約８の整数である、請求項１１４に記載の組成物。
  116. 下付き文字ｎ１が、約２〜約５の整数である、請求項１１４に記載の組成物。
  117. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１７の奇数である、請求項１１４に記載の組成物。
  118. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１３の奇数である、請求項１１４に記載の組成物。
  119. 分枝基が、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片から選択される、請求項１１３に記載の組成物。
  120. 結合された正に帯電した分枝基が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（式中、下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有するＨＩＶ−ＴＡＴ断片である、請求項１１９に記載の組成物。
  121. 分枝基が、アンテナペディアＰＴＤ基である、請求項１１３に記載の組成物。
  122. 正に帯電したポリマーがポリペプチドを含む、請求項１１３に記載の組成物。
  123. ポリペプチドが、ポリリジン、ポリアルギニン、及びポリオルニチンから選択される、請求項１２２に記載の組成物。
  124. ポリペプチドがポリリジンである、請求項１２３に記載の組成物。
  125. ポリマーが、正に帯電した非ペプチジルポリマーを含む、請求項１１３に記載の組成物。
  126. 非ペプチジルポリマーが、正に帯電したポリアルキレンイミンを含む、請求項１２５に記載の組成物。
  127. ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項１２６に記載の組成物。
  128. 約１×１０−１０〜約４９．９重量％の抗原、及び約１×１０−９〜約５０重量％の正に帯電した担体を含有する、請求項９８に記載の組成物。
  129. 請求項９８に記載の制御放出組成物。
  130. 抗原がボツリヌストキシンである、請求項９８に記載の組成物。
  131. ボツリヌストキシンが、ボツリヌストキシンの血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧから選択される、請求項１３０に記載の組成物。
  132. ボツリヌストキシンがボツリヌストキシン誘導体を含む、請求項１３０に記載の組成物。
  133. ボツリヌストキシンが組換型ボツリヌストキシンを含む、請求項１３０に記載の組成物。
  134. 抗原が小児期の免疫化に適している、請求項９８に記載の組成物。
  135. 皮膚又は上皮に抗原を送達するための器具、及び請求項９８に記載の組成物を含む、免疫化に適した抗原を被験者に投与するためのキット。
  136. 特別仕様でつくられたアプリケーターをさらに含む、請求項１３５に記載のキット。
  137. 組成物が、免疫化に適した抗原を皮膚又は上皮を介して被験者に投与するための器具に含まれる、請求項１３５に記載のキット。
  138. 器具が皮膚パッチである、請求項１３７に記載のキット。
  139. 免疫化に適した抗原を皮膚又は上皮に送達するための器具と、（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片、並びにアンテナペディアＰＴＤ及びその断片及び混合物（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から独立に選択される、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した担体を含む組成物とを含む、免疫化に適した抗原を被験者に投与するためのキットであって、担体と抗原との結合は非共有結合性であるキット。
  140. 器具が皮膚パッチである、請求項１３９に記載のキット。
  141. 正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含む有効量の正に帯電した担体と共に、免疫化に適した抗原を被験者の皮膚又は上皮に局所的に適用することを含む、免疫化に適した抗原を被験者に投与する方法であって、担体と抗原との結合は非共有結合性である方法。
  142. 免疫化に適した抗原及び担体が、双方の成分を含有する組成物の状態で被験者に投与される、請求項１４１に記載の方法。
  143. 免疫化に適した抗原及び担体が、被験者に別々に投与される、請求項１４１に記載の方法。
  144. 主鎖が、正に帯電したポリペプチドを含む、請求項１４１に記載の方法。
  145. 主鎖が、約１０，０００〜約１，５００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項１４４に記載の方法。
  146. 主鎖が、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項１４４に記載の方法。
  147. 主鎖が、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する正に帯電したポリペプチドを含む、請求項１４４に記載の方法。
  148. 主鎖が、正に帯電したポリリジンを含む、請求項１４４に記載の方法。
  149. 主鎖が、約１０，０００〜約１，５００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項１４８に記載の方法。
  150. 主鎖が、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項１４８に記載の方法。
  151. 主鎖が、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する正に帯電したポリリジンを含む、請求項１４８に記載の方法。
  152. 主鎖が、正に帯電した非ペプチジルポリマーを含む、請求項１４１に記載の方法。
  153. 非ペプチジルポリマー主鎖が、正に帯電したポリアルキレンイミンを含む、請求項１５２に記載の方法。
  154. ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項１５３に記載の方法。
  155. ポリエチレンイミンが、約１０，０００〜約２，５００，０００の分子量を有する、請求項１５４に記載の方法。
  156. ポリエチレンイミンが、約１００，０００〜約１，８００，０００の分子量を有する、請求項１５４に記載の方法。
  157. ポリエチレンイミンが、約５００，０００〜約１，４００，０００の分子量を有する、請求項１５４に記載の方法。
  158. 担体が、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片、並びにアンテナペディアＰＴＤ及びその断片若しくは混合物（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から独立に選択される、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電したポリマーを含む、請求項１４１に記載の方法。
  159. 正に帯電した分枝基が、式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する基から独立に選択される、請求項１５８に記載の方法。
  160. 下付き文字ｎ１が、約１〜約８の整数である、請求項１５９に記載の方法。
  161. 下付き文字ｎ１が、約２〜約５の整数である、請求項１５９に記載の方法。
  162. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１７の奇数である、請求項１５９に記載の方法。
  163. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１３の奇数である、請求項１５９に記載の方法。
  164. 分枝基が、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片から選択される、請求項１５８に記載の方法。
  165. 結合された正に帯電した分枝基が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有するＨＩＶ−ＴＡＴ断片である、請求項１６４に記載の方法。
  166. 分枝基が、アンテナペディアＰＴＤ基である、請求項１５８に記載の方法。
  167. 正に帯電したポリマーがポリペプチドを含む、請求項１５８に記載の方法。
  168. ポリペプチドが、ポリリジン、ポリアルギニン、及びポリオルニチンから選択される、請求項１６７に記載の方法。
  169. ポリペプチドがポリリジンである、請求項１６８に記載の方法。
  170. ポリマーが、正に帯電した非ペプチジルポリマーを含む、請求項１５８に記載の方法。
  171. 非ペプチジルポリマーが、正に帯電したポリアルキレンイミンを含む、請求項１７０に記載の方法。
  172. ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項１７１に記載の方法。
  173. 組成物が制御放出組成物である、請求項１４１に記載の方法。
  174. 免疫化に適した抗原がボツリヌストキシンである、請求項１４１に記載の方法。
  175. ボツリヌストキシンが、ボツリヌストキシンの血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧから選択される、請求項１７４に記載の方法。
  176. ボツリヌストキシンがボツリヌストキシン誘導体を含む、請求項１７４に記載の方法。
  177. ボツリヌストキシンが組換型ボツリヌストキシンを含む、請求項１７４に記載の方法。
  178. 抗原が小児期の免疫化に適している、請求項１４１に記載の方法。
  179. 環境抗原に対する抵抗性を付与するために、免疫化に適した抗原が投与される、請求項１４１に記載の方法。
  180. 潜在的病原体に対する抵抗性を付与するために、免疫化に適した抗原が投与される、請求項１４１に記載の方法。
  181. 潜在的バイオハザードに対する抵抗性を付与するために、免疫化に適した抗原が投与される、請求項１４１に記載の方法。
  182. 生物学的に活性な作用物質が抗真菌薬である、請求項４に記載の組成物。
  183. 約１×１０−１０〜約４９．９重量％の生物学的に活性な作用物質、及び約１×１０−９〜約５０重量％の正に帯電した担体を含有する、請求項１８２に記載の組成物。
  184. 請求項１８２に記載の制御放出組成物。
  185. 抗真菌薬が、アムホテリジンＢ、フルコナゾール、フルシトシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコノゾール、グリセオフルビン、ミコナゾール、ナイスタチン、及びシクロピロクスから選択される、請求項１８２に記載の組成物。
  186. 被験者の皮膚又は上皮に抗真菌薬を送達するための器具、及び請求項１８２に記載の組成物を含む、抗真菌薬を被験者に投与するためのキット。
  187. 特別仕様のアプリケーターをさらに含む、請求項１８６に記載のキット。
  188. 組成物が、爪体又は隣接した解剖構造を介して被験者に抗真菌薬を投与するための器具に含まれる、請求項１８６に記載のキット。
  189. 器具が人工爪体又はラッカーである、請求項１８６に記載のキット。
  190. 生物学的に活性な作用物質が抗真菌薬である、請求項８１に記載の方法。
  191. 抗真菌薬及び担体が、双方の成分を含有する組成物の状態で被験者に投与される、請求項１９０に記載の方法。
  192. 抗真菌薬及び担体が、被験者に別々に投与される、請求項１９０に記載の方法。
  193. 組成物が制御放出組成物である、請求項１９０に記載の方法。
  194. 抗真菌薬が、アムホテリジンＢ、フルコナゾール、フルシトシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコノゾール、グリセオフルビン、ミコナゾール、ナイスタチン、及びシクロピロクスから選択される、請求項１９０に記載の方法。
  195. 真菌感染の症状及び徴候を治療するために抗真菌薬が投与される、請求項１９０に記載の方法。
  196. 爪体又は爪床の真菌感染の症状又は徴候を改善するために抗真菌薬が投与される、請求項１９０に記載の方法。
  197. −（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片、並びにアンテナペディアＰＴＤ及びその断片及び混合物（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から独立に選択される正に帯電した分枝基を結合した、正に帯電したポリペプチド又は非ペプチジルポリマー。
  198. 正に帯電した分枝基が、式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する基から独立に選択される、請求項１９７に記載の正に帯電したポリペプチド又は非ペプチジルポリマー。
  199. 下付き文字ｎ１が、約１〜約８の整数である、請求項１９８に記載の正に帯電したポリペプチド又は非ペプチジルポリマー。
  200. 下付き文字ｎ１が、約２〜約５の整数である、請求項１９８に記載の正に帯電したポリペプチド又は非ペプチジルポリマー。
  201. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１７の奇数である、請求項１９８に記載の正に帯電したポリペプチド又は非ペプチジルポリマー。
  202. 下付き文字ｎ２が、約７〜約１３の奇数である、請求項１９８に記載の正に帯電したポリペプチド又は非ペプチジルポリマー。
  203. 分枝基が、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片から選択される、請求項１９７に記載の正に帯電したポリペプチド又は非ペプチジルポリマー。
  204. 結合された正に帯電した分枝基が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有するＨＩＶ−ＴＡＴ断片である、請求項２０３に記載の正に帯電したポリペプチド又は非ペプチジルポリマー。
  205. 分枝基が、アンテナペディアＰＴＤ基又はその断片である、請求項１９７に記載の正に帯電したポリペプチド又は非ペプチジルポリマー。
  206. 正に帯電した担体がポリペプチドを含む、請求項１９７に記載の正に帯電したポリマー。
  207. ポリペプチドが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、及びポリホモアルギニンから選択される、請求項２０６に記載の正に帯電したポリマー。
  208. ポリペプチドがポリリジンである、請求項２０７に記載の正に帯電したポリマー。
  209. 正に帯電した担体が正に帯電した非ペプチジルポリマーを含む、請求項１９７に記載の正に帯電したポリマー。
  210. 非ペプチジルポリマーが、正に帯電したポリアルキレンイミンを含む、請求項２０９に記載の正に帯電したポリマー。
  211. ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項２１０に記載の正に帯電したポリマー。
  212. ａ）正に帯電した主鎖と、
    ｂ）ｉ）複数の結合されたイメージング部分を有する、負に帯電した主鎖、或いは、複数の負に帯電したイメージング部分、
    ii）複数の結合された標的物質を有する、負に帯電した主鎖、或いは、複数の負に帯電した標的部分、
    iii）ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイム、改変されたオリゴヌクレオチド、及び選択された導入遺伝子をコードするｃＤＮＡから選択される少なくとも１つのメンバー、
    iv）少なくとも１つの持続因子をコードするＤＮＡ、並びに
    ｖ）複数の結合された生物学的作用物質を有する、負に帯電した主鎖、或いは負に帯電した生物学的作用物質
    からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーと
    の非共有結合性複合体を含む組成物であって、
    複合体が正味の正電荷を有し、メンバーのうちの少なくとも１つが、ｉ）、ii）、iii）又はｖ）から選択される組成物。
  213. 薬剤組成物又は薬用化粧組成物を調製するための方法であって、正に帯電した主鎖成分と、
    ｉ）複数の結合されたイメージング部分を有する、負に帯電した主鎖、或いは、複数の負に帯電したイメージング部分、
    ii）複数の結合された標的物質を有する、負に帯電した主鎖、或いは、複数の負に帯電した標的部分、
    iii）ＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイム、改変されたオリゴヌクレオチド、及び選択された導入遺伝子をコードするｃＤＮＡから選択される少なくとも１つのメンバー、
    iv）少なくとも１つの持続因子をコードするＤＮＡ、並びに
    ｖ）複数の結合された生物学的作用物質又は薬用化粧物質を有する、負に帯電した主鎖、又は負に帯電した生物学的作用物質又は薬用化粧物質
    からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーと
    を、製薬用又は薬用化粧品用に許容される担体と組み合わせて、正味の正電荷を有する非共有結合性複合体を形成させることを含み、且つ、それらのメンバーのうちの少なくとも１つがｉ）、ii）、iii）又はｖ）から選択される方法。
  214. インスリンと、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含む、インスリンの経皮送達に有効な量の担体とを含む組成物であって、担体とインスリンとの結合が非共有結合性である組成物。
  215. インスリンと正に帯電した担体とを約３０：１〜約１．０１：１の重量比で含有する、請求項２１４に記載の組成物。
  216. 請求項２１４に記載の制御放出組成物。
  217. インスリンと、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含み、経皮送達に有効な量で存在する担体とを含む、被験者にインスリンを投与するためのキットであって、担体とインスリンとの結合が非共有結合性であるキット。
  218. 組成物が、インスリンを皮膚又は上皮を介して被験者に投与するための器具に含まれる、請求項２１７に記載のキット。
  219. 正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含む有効量の正に帯電した担体と共に、インスリンを被験者の皮膚又は上皮に局所的に適用することを含む、インスリンを被験者に投与する方法であって、担体とインスリンとの結合が非共有結合性である方法。
  220. 組成物が制御放出組成物である、請求項２１９に記載の方法。
  221. イメージング部分及び標的物質と、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含み、経皮送達に有効な量で存在する担体とを含む組成物であって、担体と生物学的に活性なタンパク質との結合が非共有結合性である組成物。
  222. イメージング部分及び標的物質が物理的又は化学的に異なる、請求項２２１に記載の組成物。
  223. イメージング部分及び標的物質の両方ともがホスファートであるとは限らない、請求項２２１に記載の組成物。
  224. イメージング物質が光学的イメージング物質である、請求項２２１に記載の組成物。
  225. イメージング物質が、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴン、グリーン５１４、緑色蛍光タンパク質、６−ＦＡＭ、テキサスレッド、Ｈｅｘ、ＴＥＴ、及びＨＡＭＲＡから選択される、請求項２２４に記載の組成物。
  226. イメージング物質が磁気共鳴画像法に適している、請求項２２１に記載の組成物。
  227. 標的物質が黒色腫を認識する、請求項２２１に記載の組成物。
  228. イメージング部分及び標的部分を送達するための器具と、正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含み、経皮送達に有効な量で存在する担体とを含む、請求項２２１に記載の組成物を被験者に投与するためのキット。
  229. 正に帯電した分枝基を結合した正に帯電した主鎖を含む有効量の正に帯電した担体と共に、イメージング部分及び標的物質を被験者の皮膚又は上皮に局所的に適用することを含む、イメージング部分及び標的物質を被験者に投与する方法であって、担体と生物学的に活性なタンパク質との結合が非共有結合性である方法。
  230. イメージング部分及び標的物質が物理的又は化学的に異なる、請求項２２９に記載の方法。
  231. イメージング部分及び標的物質の両方ともがホスファートであるとは限らない、請求項２２９に記載の方法。
  232. イメージング物質が光学的イメージング物質である、請求項２２９に記載の方法。
  233. イメージング物質が、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴン、グリーン５１４、緑色蛍光タンパク質、６−ＦＡＭ、テキサスレッド、Ｈｅｘ、ＴＥＴ、及びＨＡＭＲＡから選択される、請求項２３２に記載の方法。
  234. イメージング物質が磁気共鳴画像法に適している、請求項２２９に記載の方法。
  235. 標的物質が黒色腫を認識する、請求項２２９に記載の方法。
  236. 黒色腫の危険性のある患者をスクリーニングするために組成物が使用される、請求項２２９に記載の方法。
  237. 黒色腫の外科的切除を補助するために組成物が使用される、請求項２２９に記載の方法。
  238. 写真技術又は画像解析技術と共に組成物が使用される、請求項２２９に記載の方法。
  239. ａ）正に帯電した主鎖と、
    ｂ）ｉ）複数の結合されたイメージング部分を有する、負に帯電した主鎖、又は複数の負に帯電したイメージング部分、
    ii）複数の結合された標的物質を有する、負に帯電した主鎖、又は複数の負に帯電した標的部分、及び
    iii）複数の結合された生物学的作用物質を有する負に帯電した主鎖、又は負に帯電した生物学的作用物質
    からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーと
    の非共有結合性複合体を含む組成物であって、
    その複合体が正味の正電荷を有し、メンバーのうちの少なくとも１つがｉ）、ii）、iii）又はｖ）から選択される組成物。
  240. 薬剤組成物又は薬用化粧組成物を調製する方法であって、
    正に帯電した主鎖成分と、
    ｉ）複数の結合されたイメージング部分を有する、負に帯電した主鎖、或いは、複数の負に帯電したイメージング部分、
    ii）複数の結合された標的物質を有する、負に帯電した主鎖、或いは、複数の負に帯電した標的部分、及び
    iii）複数の結合された生物学的作用物質又は薬用化粧物質を有する、負に帯電した主鎖、又は負に帯電した１つの生物学的作用物質又は薬用化粧物質
    からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーと
    を、製薬用又は薬用化粧品用に許容される担体と組み合わせて、正味の正電荷を有する非共有結合性複合体を形成させることを含み、且つ、メンバーのうちの少なくとも１つが、ｉ）、ii）、iii）又はｖ）から選択されることを条件とする方法。
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Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL103558A0 (en) 1991-10-30 1993-03-15 Schering Corp Tri-substituted tetrahydrofuran antifungals
US7563874B2 (en) 1998-08-31 2009-07-21 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
US20050214327A1 (en) * 2000-06-02 2005-09-29 Allergan, Inc. Neurotoxin-containing suppositories and related methods
US20040220100A1 (en) * 2000-07-21 2004-11-04 Essentia Biosystems, Inc. Multi-component biological transport systems
PT1301213T (pt) * 2000-07-21 2017-04-19 Revance Therapeutics Inc Sistemas de transporte biológico de múltiplos componentes
US7220422B2 (en) 2003-05-20 2007-05-22 Allergan, Inc. Methods and compositions for treating eye disorders
US8871224B2 (en) 2003-12-09 2014-10-28 Allergan, Inc. Botulinum toxin therapy for skin disorders
JP2007527431A (ja) * 2004-03-03 2007-09-27 ルバンス セラピュティックス 局所的診断及び治療用の輸送のための組成物及び方法
US9211248B2 (en) * 2004-03-03 2015-12-15 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins
WO2005084410A2 (en) * 2004-03-03 2005-09-15 Essentia Biosystems, Inc. Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins
US20050220734A1 (en) * 2004-04-02 2005-10-06 Allergan, Inc. Therapy for melanin related afflictions
DE102004035606A1 (de) * 2004-07-22 2006-03-30 Biotecon Therapeutics Gmbh Carrier für Arzneimittel zur Gewinnung der oralen Bioverfügbarkeit
US20060073208A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-06 Allergan, Inc. Cosmetic neurotoxin compositions and methods
FR2879462B1 (fr) * 2004-12-21 2008-12-26 Sod Conseils Rech Applic Utilisation de toxine botulique pour une insensibilisation locale prolongee
EP2153848A3 (en) 2005-01-27 2010-07-21 The Regents of the University of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinium neurotoxins
AU2013201374B2 (en) * 2005-03-03 2015-05-21 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins
JP2008531725A (ja) * 2005-03-03 2008-08-14 ルバンス セラピュティックス インク． オリゴペプチドの局所適用及び経皮送達のための組成物及び方法
BRPI0608249A2 (pt) 2005-03-03 2009-12-08 Revance Therapeutics Inc formulação, método para aplicação tópica e kit para distribuição transdérmica de toxina botulìnica
US20060222692A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Fairfield Clinical Trials Llc Method and compositions for transdermal administration of antimicrobial medications
WO2006116065A1 (en) * 2005-04-21 2006-11-02 The Trustees Of Boston College Methods for molecular delivery into cells using nanotube spearing
CN103315954A (zh) 2005-07-18 2013-09-25 麻萨诸塞州洛厄尔大学 制备与使用纳米乳剂的组合物和方法
AU2006315117A1 (en) * 2005-11-17 2007-05-24 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods of topical application and transdermal delivery of botulinum toxins with reduced non-toxin proteins
MX2008006750A (es) * 2005-12-01 2008-09-03 Univ Massachusetts Lowell Nanoemulsiones de botulinum.
US9486408B2 (en) 2005-12-01 2016-11-08 University Of Massachusetts Lowell Botulinum nanoemulsions
DK1968648T3 (en) * 2005-12-16 2015-07-27 Amit Shachaf Diagnostic system for the detection and diagnosis of skin cancer
US7897800B2 (en) 2006-02-03 2011-03-01 Jr Chem, Llc Chemical compositions and methods of making them
US7687650B2 (en) 2006-02-03 2010-03-30 Jr Chem, Llc Chemical compositions and methods of making them
EP1993569B1 (en) 2006-02-03 2014-07-23 OMP, Inc. Anti-aging treatment using copper and zinc compositions
CN101074935B (zh) * 2006-05-19 2011-03-23 清华大学 探测器阵列及设备
US7867522B2 (en) 2006-09-28 2011-01-11 Jr Chem, Llc Method of wound/burn healing using copper-zinc compositions
WO2008140594A2 (en) 2006-12-01 2008-11-20 Anterios, Inc. Peptide nanoparticles and uses therefor
CA2671447A1 (en) 2006-12-01 2008-06-12 Anterios, Inc. Amphiphilic entity nanoparticles
CA2672886C (en) * 2006-12-29 2015-02-10 Revance Therapeutics, Inc. Transport molecules using reverse sequence hiv-tat polypeptides
EP2114426A4 (en) * 2006-12-29 2010-07-21 Revance Therapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TOPICAL APPLICATION AND TRANSDERMAL ADMINISTRATION OF STABILIZED BOTULINUM TOXINS WITH POLYPEPTIDE FRAGMENTS DERIVED FROM HIV-TAT
CA2680741A1 (en) 2007-03-22 2009-01-15 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
WO2008151022A2 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Anterios, Inc. Nucleic acid nanoparticles and uses therefor
JP5401457B2 (ja) * 2007-07-26 2014-01-29 ルバンス セラピュティックス インク． 抗菌ペプチド、組成物及びその使用方法
US8586081B2 (en) * 2007-09-20 2013-11-19 University Of Massachusetts Detoxified recombinant botulinum neurotoxin
US8273791B2 (en) 2008-01-04 2012-09-25 Jr Chem, Llc Compositions, kits and regimens for the treatment of skin, especially décolletage
SI2271670T1 (sl) 2008-03-14 2015-01-30 Allergan, Inc. Preizkusi aktivnosti serotipa A botulin toksina na podlagi imunosti
WO2010014854A2 (en) 2008-07-31 2010-02-04 The Regents Of The University Of California Antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
CN101671388B (zh) * 2008-09-09 2013-01-02 曹国栋 血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用
CN102292126B (zh) * 2008-12-31 2016-10-12 雷文斯治疗公司 用于治疗色素沉着过度的组合物和方法
PL2379104T3 (pl) * 2008-12-31 2018-07-31 Revance Therapeutics, Inc. Preparaty toksyny botulinowej do wstrzykiwania
US20160184354A1 (en) 2009-01-23 2016-06-30 Jr Chem, Llc Rosacea treatments and kits for performing them
JP6140445B2 (ja) 2009-04-01 2017-05-31 ルバンス セラピュティックス インク．Ｒｅｖａｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 血管の過敏反応と関連した皮膚状態を治療する方法および組成物
AU2010265888A1 (en) 2009-06-25 2012-01-19 Revance Therapeutics, Inc. Albumin-free botulinum toxin formulations
MX365496B (es) * 2009-10-21 2019-06-05 Revance Therapeutics Inc Metodos y sistemas para purificar la neurotoxina botulinica no acomplejada.
US9243057B2 (en) 2010-08-31 2016-01-26 The Regents Of The University Of California Antibodies for botulinum neurotoxins
US8952057B2 (en) 2011-01-11 2015-02-10 Jr Chem, Llc Compositions for anorectal use and methods for treating anorectal disorders
US20120189677A1 (en) * 2011-01-20 2012-07-26 Stephen Tonge Formulations
US9623117B2 (en) * 2011-04-04 2017-04-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for selective targeting and entry of bacterial toxins to cells
US20130123647A1 (en) 2011-05-03 2013-05-16 The Research Foundation Of State University Of New York Methods Useful in Optimizing the Treatment of Neuropathies and Targeting Tissues with Cosmetic Botulinum Injections
US20140120077A1 (en) 2012-10-28 2014-05-01 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and Methods for Safe Treatment of Rhinitis
US20140242110A1 (en) * 2013-02-28 2014-08-28 Dt Scimed, Llc Dose, localization, and formulation of botulinum toxins in skin and muscle
US11484580B2 (en) 2014-07-18 2022-11-01 Revance Therapeutics, Inc. Topical ocular preparation of botulinum toxin for use in ocular surface disease
FR3030524B1 (fr) * 2014-12-17 2017-01-20 Hydro-Fill Utilisation de pll pour ameliorer la stabilite de molecules en solution
JP6880526B2 (ja) * 2015-02-27 2021-06-02 学校法人常翔学園 膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子化合物
KR101666934B1 (ko) * 2015-03-05 2016-10-17 한국유니온제약 주식회사 개량형 TAT 펩타이드가 융합된 EGF, 티모신β4, hGH 단백질의 생산방법 및 이들 단백질을 포함하는 화장료 조성물
KR101993844B1 (ko) * 2016-07-20 2019-06-27 한국유니온제약 주식회사 개량형 TAT 펩타이드가 융합된 EGF 또는 hGH 단백질의 생산방법 및 이들 단백질을 포함하는 화장료 조성물
EP3541358A1 (en) 2016-11-21 2019-09-25 Eirion Therapeutics, Inc. Transdermal delivery of large agents
KR102479847B1 (ko) * 2020-05-13 2022-12-21 주식회사 젠센 새로운 단백질 수송 도메인, 이를 포함하는 융합 화합물 및 이 융합 화합물을 포함하는 약학 조성물
KR102556731B1 (ko) * 2020-09-29 2023-07-21 주식회사 젠센 단백질 수송 도메인, 이를 포함하는 융합 화합물 및 이 융합 화합물을 포함하는 약학 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002007773A2 (en) * 2000-07-21 2002-01-31 Essentia Biosystems, Inc. Multi-component biological transport systems
WO2003072049A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Essentia Biosystems, Inc. Induction of hair growth with vascular endothelial growth factor
JP2007526340A (ja) * 2004-03-03 2007-09-13 ルバンス セラピュティックス ボツリヌストキシンの局所適用及び経皮送達のための組成物及び方法

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4078060A (en) * 1976-05-10 1978-03-07 Richardson-Merrell Inc. Method of inducing an estrogenic response
US4434228A (en) * 1982-04-20 1984-02-28 Genex Corporation Immobilization of biological materials in condensed polyalkyleneimine polymers
US4816568A (en) * 1986-05-16 1989-03-28 International Minerals & Chemical Corp. Stabilization of growth hormones
US5420105A (en) * 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5252713A (en) * 1988-09-23 1993-10-12 Neorx Corporation Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5744166A (en) * 1989-02-25 1998-04-28 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions
US5804604A (en) * 1989-12-21 1998-09-08 Biogen, Inc. Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins
US5674980A (en) * 1989-12-21 1997-10-07 Biogen Inc Fusion protein comprising tat-derived transport moiety
US5629020A (en) * 1994-04-22 1997-05-13 Emisphere Technologies, Inc. Modified amino acids for drug delivery
GB9120306D0 (en) * 1991-09-24 1991-11-06 Graham Herbert K Method and compositions for the treatment of cerebral palsy
US5607691A (en) * 1992-06-12 1997-03-04 Affymax Technologies N.V. Compositions and methods for enhanced drug delivery
US5877278A (en) * 1992-09-24 1999-03-02 Chiron Corporation Synthesis of N-substituted oligomers
US5709861A (en) * 1993-04-22 1998-01-20 Emisphere Technologies, Inc. Compositions for the delivery of antigens
US6974578B1 (en) * 1993-12-28 2005-12-13 Allergan, Inc. Method for treating secretions and glands using botulinum toxin
US6986893B2 (en) * 1993-12-28 2006-01-17 Allergan, Inc. Method for treating a mucus secretion
US5766605A (en) * 1994-04-15 1998-06-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Treatment of autonomic nerve dysfunction with botulinum toxin
NO180167C (no) * 1994-09-08 1997-02-26 Photocure As Fotokjemisk fremgangsmåte til å innföre molekyler i cellers cytosol
US5512547A (en) * 1994-10-13 1996-04-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Pharmaceutical composition of botulinum neurotoxin and method of preparation
US5756468A (en) * 1994-10-13 1998-05-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Pharmaceutical compositions of botulinum toxin or botulinum neurotoxin and methods of preparation
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
GB9600272D0 (en) * 1996-01-06 1996-03-06 Univ Nottingham Polymers
AU734827B2 (en) * 1997-05-21 2001-06-21 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Composition and method for enhancing transport across biological membranes
US5985434A (en) * 1997-11-25 1999-11-16 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Absorbent foam
WO1999029721A1 (en) * 1997-12-10 1999-06-17 Washington University Anti-pathogen system and methods of use thereof
WO1999042091A2 (en) * 1998-02-19 1999-08-26 Massachusetts Institute Of Technology Use of polycations as endosomolytic agents
US6261679B1 (en) * 1998-05-22 2001-07-17 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Fibrous absorbent material and methods of making the same
WO2000002950A1 (en) * 1998-07-13 2000-01-20 Expression Genetics, Inc. Polyester analogue of poly-l-lysine as a soluble, biodegradable gene delivery carrier
AU756008B2 (en) * 1998-07-27 2003-01-02 Johns Hopkins University, The Methods for treating conditions modulated by lactosylceramide
US6280937B1 (en) * 1998-08-14 2001-08-28 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Shuttle vectors
US6958147B1 (en) * 1998-10-26 2005-10-25 Licentia Ltd Use of VEGF-C to prevent restenosis
KR20010089347A (ko) * 1998-10-27 2001-10-06 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 상처 치료 증진 방법
WO2000032764A1 (en) * 1998-12-02 2000-06-08 I.D.M. Immuno-Designed Molecules New oligomeric conjugates liable to transfer biological molecules into cells
EP1137664A2 (en) * 1998-12-10 2001-10-04 Washington University Protein transduction system and methods of use thereof
US6627632B2 (en) * 1998-12-14 2003-09-30 Cellegy Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of anorectal disorders
US7056656B1 (en) * 1999-01-25 2006-06-06 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Tat-derived oligourea and its method of production and use in high affinity and specific binding HIV-1 TAR RNA
US20030236214A1 (en) * 1999-06-09 2003-12-25 Wolff Jon A. Charge reversal of polyion complexes and treatment of peripheral occlusive disease
US7008924B1 (en) * 1999-07-21 2006-03-07 Amgen, Inc. VGF fusion polypeptides
EP1210121A2 (en) * 1999-08-24 2002-06-05 Cellgate Inc. Enhancing drug delivery across and into epithelial tissues using oligo arginine moieties
US6669951B2 (en) * 1999-08-24 2003-12-30 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
US6730293B1 (en) * 1999-08-24 2004-05-04 Cellgate, Inc. Compositions and methods for treating inflammatory diseases of the skin
US7229961B2 (en) * 1999-08-24 2007-06-12 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
US20030104622A1 (en) * 1999-09-01 2003-06-05 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US6544548B1 (en) * 1999-09-13 2003-04-08 Keraplast Technologies, Ltd. Keratin-based powders and hydrogel for pharmaceutical applications
US6458763B1 (en) * 1999-09-17 2002-10-01 Depuy Orthopeadics Bone sialoprotein-based compositions for enhancing connective tissue repair
US6610820B1 (en) * 1999-10-12 2003-08-26 University Of Lausanne Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US6511676B1 (en) * 1999-11-05 2003-01-28 Teni Boulikas Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes
US6844324B1 (en) * 1999-11-12 2005-01-18 Massachusetts Institute Of Technology Modular peptide mediated intracellular delivery system and uses therefore
US7070807B2 (en) * 1999-12-29 2006-07-04 Mixson A James Branched histidine copolymers and methods for using same
US20040109871A1 (en) * 2000-01-06 2004-06-10 Pascual David W. M cell directed vaccines
US20030118598A1 (en) * 2000-02-08 2003-06-26 Allergan, Inc. Clostridial toxin pharmaceutical compositions
US7780967B2 (en) * 2000-02-08 2010-08-24 Allergan, Inc. Reduced toxicity Clostridial toxin pharmaceutical compositions
US20020009491A1 (en) * 2000-02-14 2002-01-24 Rothbard Jonathan B. Compositions and methods for enhancing drug delivery across biological membranes and tissues
US6670322B2 (en) * 2000-06-01 2003-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of targeting pharmaceuticals to motor neurons
US6306423B1 (en) * 2000-06-02 2001-10-23 Allergan Sales, Inc. Neurotoxin implant
US20040033241A1 (en) * 2000-06-02 2004-02-19 Allergan, Inc. Controlled release botulinum toxin system
US20040220100A1 (en) * 2000-07-21 2004-11-04 Essentia Biosystems, Inc. Multi-component biological transport systems
US6903187B1 (en) * 2000-07-21 2005-06-07 Allergan, Inc. Leucine-based motif and clostridial neurotoxins
US7491799B2 (en) * 2000-07-21 2009-02-17 Allergan, Inc. Modified botulinum neurotoxins
US20030219462A1 (en) * 2000-07-21 2003-11-27 Allergan Sales, Inc Clostridial neurotoxin compositions and modified clostridial neurotoxins
US20030215412A1 (en) * 2000-07-21 2003-11-20 Essentia Biosystems, Inc. Induction of hair growth with vascular endothelial growth factor
US6696038B1 (en) * 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
US20020127247A1 (en) * 2000-11-17 2002-09-12 Allergen Sales, Inc. Modified clostridial neurotoxins with altered biological persistence
US7255865B2 (en) * 2000-12-05 2007-08-14 Allergan, Inc. Methods of administering botulinum toxin
US20020086036A1 (en) * 2000-12-05 2002-07-04 Allergan Sales, Inc. Methods for treating hyperhidrosis
ATE437647T1 (de) * 2001-02-16 2009-08-15 Cellgate Inc Transporter mit beabstandeten arginin-teilchen
CA2367636C (en) * 2001-04-12 2010-05-04 Lisa Mckerracher Fusion proteins
US20030109448A1 (en) * 2001-11-07 2003-06-12 Crowley Kathleen S. Methods of promoting uptake and nuclear accumulation of polyamides in eukaryotic cells
US7060498B1 (en) * 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US7169814B2 (en) * 2001-12-11 2007-01-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Guanidinium transport reagents and conjugates
US20030113349A1 (en) * 2001-12-18 2003-06-19 Coleman William P. Topically applied clostridium botulinum toxin compositions and treatment methods
US7803749B2 (en) * 2002-01-09 2010-09-28 Xigen Sa Peptide inhibitors of MKK7 kinase binding to insulin binding proteins
KR100468316B1 (ko) * 2002-01-29 2005-01-27 주식회사 웰진 Ｄｎａ의 세포 또는 조직 내 전달 효율을 높이는 펩타이드
EP1572941A4 (en) * 2002-02-26 2009-03-18 Maxygen Inc NEW FLAVIVIRUS ANTIGENES
JP2005524657A (ja) * 2002-02-27 2005-08-18 ファーメイン， エルティーディー． 治療剤及び他の物質を送達するための組成物、及び、前記組成物を作製し使用する方法
US6688311B2 (en) * 2002-03-14 2004-02-10 Allergan, Inc. Method for determining effect of a clostridial toxin upon a muscle
CN1659187A (zh) * 2002-05-10 2005-08-24 新世纪药品有限公司 融合铁蛋白在疫苗和其他方面的应用
US20030215395A1 (en) * 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
US7459164B2 (en) * 2002-05-28 2008-12-02 Botulinum Toxin Research Associates, Inc. Composition for therapeutic and cosmetic botulinum toxin
AU2003237346A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-19 Thomas Jefferson University Compositions and methods for transepithelial molecular transport
US20040009180A1 (en) * 2002-07-11 2004-01-15 Allergan, Inc. Transdermal botulinum toxin compositions
US7071167B2 (en) * 2002-11-13 2006-07-04 L'oreal Use of a combination of components with an inhibitory synergistic effect on calcium channels to prevent or treat wrinkles and fine lines
US6866856B2 (en) * 2002-12-31 2005-03-15 Avon Products, Inc. Compositions and delivery methods for the treatment of wrinkles, fine lines and hyperhidrosis
US7482016B2 (en) * 2003-03-19 2009-01-27 The J. David Gladstone Institutes Immunogenic compositions comprising HIV-1 acetylated Tat polypeptides
US20040192754A1 (en) * 2003-03-24 2004-09-30 Shapira Nathan Andrew Methods for treating idiopathic hyperhidrosis and associated conditions
US20040247623A1 (en) * 2003-03-24 2004-12-09 Roger Cady Method and article for treatment of sensory neuron related disorders through transdermal application of botulinum toxin
US7341843B2 (en) * 2003-04-11 2008-03-11 Allergan, Inc. Botulinum toxin A peptides and methods of predicting and reducing immunoresistance to botulinum toxin therapy
JP2007527431A (ja) * 2004-03-03 2007-09-27 ルバンス セラピュティックス 局所的診断及び治療用の輸送のための組成物及び方法
US7691381B2 (en) * 2004-04-15 2010-04-06 Allergan, Inc. Stabilized biodegradable neurotoxin implants
US20060040882A1 (en) * 2004-05-04 2006-02-23 Lishan Chen Compostions and methods for enhancing delivery of nucleic acids into cells and for modifying expression of target genes in cells
ES2479515T3 (es) * 2004-07-26 2014-07-24 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Composición terapéutica con una neurotoxina botulínica
US20060024331A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-02 Ester Fernandez-Salas Toxin compounds with enhanced membrane translocation characteristics
BRPI0608249A2 (pt) * 2005-03-03 2009-12-08 Revance Therapeutics Inc formulação, método para aplicação tópica e kit para distribuição transdérmica de toxina botulìnica

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002007773A2 (en) * 2000-07-21 2002-01-31 Essentia Biosystems, Inc. Multi-component biological transport systems
WO2003072049A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Essentia Biosystems, Inc. Induction of hair growth with vascular endothelial growth factor
JP2007526340A (ja) * 2004-03-03 2007-09-13 ルバンス セラピュティックス ボツリヌストキシンの局所適用及び経皮送達のための組成物及び方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6009040733; Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖｏｌ．１９, 2001, ｐｐ．１１７３-６ *
JPN6012034908; Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ Ｖｏｌ．９１, 1994, ｐｐ．６６４-８ *
JPN6012034910; Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ Ｖｏｌ．２７２, 1997, ｐｐ．１６０１０-７ *

Also Published As

Publication number Publication date
US20040220100A1 (en) 2004-11-04
KR20070027526A (ko) 2007-03-09
CA2558379A1 (en) 2005-09-15
CN1950100B (zh) 2012-10-03
BRPI0508421A (pt) 2007-07-24
KR101474880B1 (ko) 2014-12-19
SG150569A1 (en) 2009-03-30
IL177814A0 (en) 2006-12-31
CN102836438A (zh) 2012-12-26
CR8600A (es) 2008-01-21
AU2005218606A1 (en) 2005-09-15
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KR20130027563A (ko) 2013-03-15
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EP1732584A4 (en) 2009-07-15
EP1732584A2 (en) 2006-12-20
JP2015108005A (ja) 2015-06-11
JP2017149742A (ja) 2017-08-31
US20080200373A1 (en) 2008-08-21
WO2005084361A3 (en) 2006-03-16
JP2017149741A (ja) 2017-08-31
WO2005084361A2 (en) 2005-09-15

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Chauhan et al. Dendrimer-based marketed formulations and miscellaneous applications in cosmetics, veterinary, and agriculture
AU2011253597B2 (en) Multi-component biological transport systems
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Bhawani et al. Polymeric micelles in biomedical science
Richard “MINIMALLY INVASIVE” TECHNOLOGIES FOR TRANS-DERMAL DELIVERY AND CLINICAL CHEMISTRY

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