JP2007525519A - エポチロン、その中間体、類似体の合成およびその使用 - Google Patents

エポチロン、その中間体、類似体の合成およびその使用 Download PDF

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カイダ・ウ
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Abstract

本発明は、一般的に記載される式、かつ本願明細書に記載の群および亜群に属する式(I)の化合物を提供する。さらに本発明は、式(I)の化合物を含有する医薬組成物を提供し、式(I)の化合物を投与することを含む癌を治療する方法を提供する。

Description

エポチロン、その中間体、類似体の合成およびその使用。
エポチロンAおよびB(スキーム1の2aおよび2b)は天然に生じる細胞毒マクロライドであり、これは、セルロース分解マイコバクテリウムSorangium cellulosumから単離された(Hoefleら、Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.1996,35,1567頁およびJ.Antibiot.1996,49,560頁;これらはそれぞれ、参照により本願明細書に援用される)。その非常に異なる構造にもかかわらず、エポチロンAおよびBは、チューブリンの重合および微小管アセンブリの安定化による腫瘍細胞の成長阻害を伴うパクリタクセル(タキソール(登録商標))と同じ作用メカニズムを共有している(Bollagら、Cancer Res.1995,55,2325頁;参照により援用される)。最先端の化学療法薬として疑う余地のない臨床的価値にもかかわらず、タキソール(登録商標)は、理想的な薬物には程遠い。かなり低い水溶性は、それ自体が危険性および管理の問題をもたらすクレモフォール(Cremophor)などの処方賦形剤に頼ることを必要とする(Essayanら、J.Allergy Clin.Immunol.1996,97,42頁;参照により本願明細書に援用される)。さらに、タキソール(登録商標)は、多剤耐性(MDR)による失活を受けやすい(Giannakakouら、J.Biol.Chem.1997,272,17118頁;参照により本願明細書に援用される)。しかしながら、エポチロンAおよびBは、MDR腫瘍細胞に対して顕著な効力を保持していることが、証明されている(Kowalskiら、Mol.Biol.Cell 1995,6,2137頁;参照により本願明細書に援用される)。加えて、パクリタクセルに比較して高い水溶性は、エポチロンの処方性に有用である。天然に生じる化合物エポチロンB(2b、EpoB、スキーム1)が、天然産物のエポチロン群の優勢なメンバーであるが、残念ながらこれは、少なくとも異種移植マウスでは、気になる狭い治療指数を示す(Suら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1997,36,1093頁;Harrisら、J.Org.Chem.1999,64,8434頁;これらはそれぞれ、参照により本願明細書に援用される)。
EpoBの治療指数は限られているので、他のエポチロン類似体、特に、12,13-デスオキシエポチロン(desoxyepothilone)が、改善された治療指数をもたらしうるか調査された(米国特許第6242469号、米国特許第6284781号、米国特許第6300355号、米国特許第6369234号、米国特許第6204388号、米国特許第6316630号参照;それぞれ参照により本願明細書に援用される)。様々なマウスモデルで行われたin vivo実験により、12,13-デスオキシエポチロンB(3b、dEpoB、スキーム2)は、マウス異種移植片中の様々な感受性および耐性ヒト腫瘍に対して治療ポテンシャルを有することが証明された(Chouら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,9642頁および15798頁;参照により本願明細書に援用)。最近では、徹底的な比較研究により、これらのデスオキシエポチロンは、他の抗癌剤よりも治療的に優れていることが決定的に証明された(Chouら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001,98,8113頁;参照により本願明細書に援用)。そのすばらしいin vivoプロファイルにより、dEpoBは、イヌでの毒性評価を通過して、現在では、抗癌剤としてヒト試験に掛けられている。
米国特許第6242469号 米国特許第6284781号 米国特許第6300355号 米国特許第6369234号 米国特許第6204388号 米国特許第6316630号 米国特許第6284781号 米国特許出願公開第09/797027号 米国特許出願公開第09/796959号 米国特許出願公開第10/236135号 国際公開第99/01124号 国際公開第99/43653号 国際公開第01/64650号 Hoefleら、Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.1996,35,1567頁 J.Antibiot.1996,49,560頁 Bollagら、Cancer Res.1995,55,2325頁 Essayanら、J.Allergy Clin.Immunol.1996,97,42頁 Giannakakouら、J.Biol.Chem.1997,272,17118頁 Kowalskiら、Mol.Biol.Cell 1995,6,2137頁 Suら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1997,36,1093頁 Harrisら、J.Org.Chem.1999,64,8434頁 Chouら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,9642頁および15798頁 Chouら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001,98,8113頁 Handbook of Chemistry and Physics,75thEd. 「Organic Chemistry」,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999 「Protective Groups in Organic Synthesis」Third Ed.Greene,T.W.and Wuts,P.G.,Eds.,John Wiley & Sons,New York:1999 Bayley,H.,Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology(1983),Elsevier,Amsterdam J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19(1977) T.Higuchi and V.Stella,Pro-drugs as Novel Delivery Systems,Vol.14 of the A.C.S.Symposium Series Edward B.Roche,ed.,Bioreversible Carriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987 Remington's Pharmaceutical Sciences,Fifteenth Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1975) T.-C.Chouら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001,98,8113-8118 T.C.Chouら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,15798-15802 Skehanら、J.Natl.Cancer.Inst.1990,82,1107-1112 D.A.Scudieroら、Cancer Res.1988,48,4827-4833 T.-C.Chou,M.Hayball.CalcuSyn for Windows,Multiple-drug dose effect analyzer and manual.Biosoft,Cambridge Place,Cambridge,UK(1997) Schiffら、(1979) Nature (London) 277,665頁-667頁 Mengら、(1997) J.Am.Chem.Soc. 119,2733頁-2734頁 Haarら、(1996) Biochemistry 35,243頁-250頁 Kowalskiら、(1997) J.Biol.Chem. 272,2534頁-2541頁 Chouら、(2003) Angew Chem.Int.Ed.Engl. 42, 4726頁-4767頁 Barlogieら、Treatment of multiple myeloma" Blood 2004; 103:20頁-32頁 Millerら、"Paclitaxel as the initial treatment of multiple myeloma: an Eastern Cooperative Oncology Group Study (E1A93)" Am.J.Clin.Oncol. 1998;21:553頁-556頁 Jazirehiら、"Resveratrol modifies the expression of apoptotic regulatory proteins and sensitizes non-Hodgkin’s lymphoma and multiple myeloma cell lines to paclitaxel-induced apoptosis" Mol.Cancer Ther. 2004;3:71頁-84頁 Wangら、"Active of a novel anti-folate (PDX, 10-propargyl-10-deazaaminopterin) against human lymphoma is superior to methotrexate and correlates with tumor RFC-1 gene expression" Leukemia & Lymphoma 2003, 44:1027頁-1035頁 Wangら、"Telomerase inhibition with an oligonucleotide telomerase template antagonist: in vitro and in vivo studies in multiple myeloma and lymphoma" Bllod 2004;103:258頁-66頁 Wangら、"Targeting autocrine and paracrine VEGF receptor pathways regresses human lymphoma xenographs in vivo" Blood, in press Baniら、"Gene expression correlating with response to paclitaxel in ovarian carcinoma xenografts" Mol.Cance Thera. 2004;3:111頁-121頁 Lukerら、"Overexpression of IRF9 confers resistance to antimicrotubule agents in breast cancer cells" Cancer Res. 2001;61:6540頁-7頁 Atadjaら、"Gene expression profiling of epothiloe A-resistant cells" Novartis Found Symp. 2002;243:119頁-32頁 Suomelaら、"Interferon alpha-inducible protein 27 (IFI27) is upregulated in Psoriatic skin and certain epithelial cancers" J Invest. 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12,13-デスオキシエポチロンの有望な治療的有用性を考慮すると、付加的な類似体、さらに現存するエポチロン、デスオキシエポチロンおよびその類似体ならびにそれらの新規類似体を合成するための付加的な合成方法論を調査することが望ましい。特に、この群の化合物の治療的有用性を考慮すると、臨床試験および大規模調製のために、前記のエポチロンまたはデスオキシエポチロンもしくは本願明細書に記載されているものを大量に提供しうる方法論を開発することが望ましい。
定義
本発明のいくつかの化合物および特定の官能基の定義を、下記でさらに詳述する。本発明では、化学元素を、元素周期表、CASバージョン、Handbook of Chemistry and Physics,75thEd.の内表紙に従い同定し、特定の官能基は通常、本願明細書に記載されているように定義する。加えて、有機化学の一般的な原則、さらに、特定の官能基および反応性は、「Organic Chemistry」,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999に記載されており、この内容を全て、参照により本願明細書に援用する。さらに、本願明細書に記載されている合成方法は、様々な保護基を利用することは、当技術分野の専門家であれば認めるであろう。本願明細書で使用する場合、「保護基」との用語は、特定の官能基、例えば、O、SまたはNが一時的にブロックされて、多官能可能化合物中のその他の反応部分での選択的に反応を実施することができることを意味する。好ましい実施形態では、保護基は、良好な収率で選択的に反応して、予定されている反応に対して安定な保護基質をもたらし;保護基は、容易に入手可能で他の官能基を攻撃しない(好ましくは非毒性の)試薬により、良好な収率で選択的に除去できなければならず;保護基は、容易に分離可能な誘導体を形成し(さらに好ましくは、新たな立体中心を生じることなく);保護基は、さらなる部位の反応を回避するために最低限の付加的官能性を有する。本願明細書で詳述するように、酸素、イオウ、窒素および炭素保護基を利用することができる。保護基の例を本願明細書で詳述するが、本願明細書は、これらの保護基に限定することを意図してなく;むしろ、前記の基準を使用して、様々な他の同等の保護基を容易に同定し、本発明の方法で利用することができることは認められるであろう。加えて、様々な保護基が「Protective Groups in Organic Synthesis」Third Ed.Greene,T.W.and Wuts,P.G.,Eds.,John Wiley & Sons,New York:1999に記載されており、その内容の全てを、参照により本願明細書に援用する。
本願明細書に記載されているように、化合物は、いくつかの置換基または官能基で置換されていてもよいことは認められるであろう。通常、「されていてもよい」との用語が先にあるかないかにかかわらず、また、置換基が本発明の式に含まれているかどうかにかかわらず、「置換されている」との用語は、特定の置換基の基での所定の構造中の水素基の置換に関する。所定の構造中の複数の位置が、記載の基から選択される複数の置換基で置換されていてもよい場合には、置換基は、各位置で同じか、異なってよい。本願明細書で使用する場合、「置換(されている)」との用語は、有機化合物の許容可能な置換基全てを含むと考えられる。広い態様では、許容可能な置換基には、有機化合物の非環式および環式、分枝鎖および非分枝鎖、炭素環および複素環、芳香族および非芳香族置換基が含まれる。本発明では、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および/またはヘテロ原子の原子価を満たす本願明細書に記載の有機化合物の許容可能な置換基を有してもよい。さらに、本発明は、有機化合物の許容可能な置換基により何ら限定されるものではない。本発明により構想される置換基および変数の組合せは好ましくは、例えば、これに限られないが癌を含む増殖性疾患を治療する際に有用な安定な化合物の形成をもたらすものである。本願明細書で使用する場合、「安定な」との用語は好ましくは、製造が可能であるような十分な安定性を有し、検出されるに十分な期間にわたって、好ましくは、本願明細書に詳述される目的に有用であるに十分な期間にわたって、化合物の完全性を維持する化合物に関する。
本願明細書で使用する場合、「脂肪族」との用語には、1個または複数の官能基で置換されていてもよい飽和および不飽和の、直鎖(即ち、非分枝鎖)、分枝鎖、環式または多環式脂肪族炭化水素が含まれる。当技術分野の専門家であれば認めるように、「脂肪族」には、これらに限られないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびシクロアルキニル基が含まれるものとする。したがって、本願明細書で使用する場合、「アルキル」との用語には、直鎖、分枝鎖および環式アルキル基が含まれる。同様の慣習が、「アルケニル」、「アルキニル」などの他の一般名にも当てはまる。さらに、本願明細書で使用する場合、「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」などには、置換または非置換の基が包含される。いくつかの実施形態では、本願明細書で使用する場合、「低級アルキル」が、1〜6個の炭素原子を有するアルキル基(環式、非環式、置換、非置換、分枝鎖または非分枝鎖)を指すために使用される。
いくつかの実施形態では、本発明で使用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜20個の脂肪族炭素原子を含有する。いくつかの他の実施形態では、本発明で使用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜10個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、本発明で使用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は1〜8個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、本発明で使用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜6個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、本発明で使用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜4個の炭素原子を含有する。したがって、脂肪族基の例には、これらに限られないが例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、-CH2-シクロプロピル、アリル、n-ブチル、s-ブチル、イソブチル、t-ブチル、シクロブチル、-CH2-シクロブチル、n-ペンチル、s-ペンチル、イソペンチル、t-ペンチル、シクロペンチル、-CH2-シクロペンチル、n-ヘキシル、s-ヘキシル、シクロヘキシル、-CH2-シクロヘキシル基などであり、これらはさらに、1個または複数の置換基を有してもよい。アルケニル基には、これらに限られないが例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、1-メチル-2-ブテン-1-イルなどが含まれる。アルキニル基の例には、これらに限られないが、エチニル、2-プロピニル(プロパルギル)、1-プロピニルなどが含まれる。
本願明細書で使用される「アルコキシ」または「チオアルキル」との用語は、酸素原子を介して、またはイオウ原子を介して親分子基に結合している前記で定義したようなアルキル基である。いくつかの実施形態では、アルキル基は、1〜20個の脂肪族炭素原子を含有する。いくつかの他の実施形態では、アルキル基は、1〜10個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、本発明で使用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜8個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、アルキル基は、1〜6個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、アルキル基は、1〜4個の脂肪族炭素原子を含有する。アルコキシの例には、これらに限られないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、t-ブトキシ、ネオペントキシおよびn-ヘキソキシが含まれる。チオアルキルの例には、これらに限られないが、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、n-ブチルチオなどが含まれる。
「アルキルアミノ」との用語は、構造-NHR'を有する基(R'は前記で定義されたアルキルである)である。いくつかの実施形態では、アルキル基は、1〜20個の脂肪族炭素原子を含有する。いくつかの他の実施形態では、アルキル基は、1〜10個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、本発明で使用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜8個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、アルキル基は、1〜6個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、アルキル基は、1〜4個の脂肪族炭素原子を含有する。アルキルアミノの例には、これらに限られないが、メチルアミノ、エチルアミノ、イソ-プロピルアミノなどが含まれる。
本発明の化合物の前記の脂肪族(および他の)基の置換基のいくつかの例には、これらに限られないが、脂肪族;複素脂肪族;アリール;ヘテロアリール;アリールアルキル;ヘテロアリールアルキル;アルコキシ;アリールオキシ;ヘテロアルコキシ;ヘテロアリールオキシ;アルキルチオ;アリールチオ;ヘテロアルキルチオ;ヘテロアリールチオ;F;Cl;Br;I;-OH;-NO2;-CN;-CF3;-CH2CF3;-CHCl2;-CH2OH;-CH2CH2OH;-CH2NH2;-CH2SO2CH3;-C(O)Rx;-CO2(Rx);-CON(Rx)2;-OC(O)Rx;-OCO2Rx;-OCON(Rx)2;-N(Rx)2;-S(O)2Rx;-NRx(CO)Rx;-NRx(CO)Rxが含まれ、ここで、Rxはそれぞれ独立に、これらに限られないが、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキルが含まれ、これらの前記または本願明細書に記載の脂肪族、複素脂肪族、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換、分枝鎖または非分枝鎖、環式または非環式であってよく、前記または本願明細書に記載のアリールまたはへテロアリール置換基は、置換または非置換であってよい。通常適用される置換基の付加的な例を、本願明細書に記載の実施例中に示されている特定の実施形態により詳述する。
通常、本願明細書で使用する場合、「アリール」および「ヘテロアリール」との用語は、好ましくは3〜14個の炭素原子を有する安定な単環式または多環式、複素環式、多環式および多複素環式不飽和基に関し、これらはそれぞれ、置換または非置換であってよい。置換基には、これらに限られないが、安定な化合物の形成をもたらす前記の置換基のいずれか、即ち、脂肪族基または本願明細書に開示されている他の基に関して列挙された置換基が含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、「アリール」は、1個または2個の芳香環を有する単環式または二環式炭素環系に関し、これらに限られないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、本願明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」との用語は、5〜10個の環原子を有し、そのうちの1個の環原子は、S、OおよびNから選択され;0、1または2個の環原子はS、OおよびNから独立に選択される付加的なヘテロ原子であり;残りの環原子は炭素である環式芳香族基に関し、この基は、環原子のいずれかを介して分子の他の部分に結合し、例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなどである。
アリールおよびへテロアリール基(二環式アリール基を含む)は、非置換または置換であってよく、ここで、置換には、1、2または3個の水素原子が独立に、これらに限られないが、脂肪族;複素脂肪族;アリール;ヘテロアリール;アリールアルキル;ヘテロアリールアルキル;アルコキシ;アリールオキシ;ヘテロアルコキシ;ヘテロアリールオキシ;アルキルチオ;アリールチオ;ヘテロアルキルチオ;ヘテロアリールチオ;F;Cl;Br;I;-OH;-NO2;-CN;-CF3;-CH2CF3;-CHCl2;-CH2OH;-CH2CH2OH;-CH2NH2;-CH2SO2CH3;-C(O)Rx;-CO2(Rx);-CON(Rx)2;-OC(O)Rx;-OCO2Rx;-OCON(Rx)2;-N(Rx)2;-S(O)2Rx;-NRx(CO)Rx(ここで、Rxはそれぞれ独立に、これらに限られないが、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキルが含まれ、これらの前記または本願明細書に記載の脂肪族、複素脂肪族、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換、分枝鎖または非分枝鎖、環式または非環式であってよく、前記または本願明細書に記載のアリールまたはへテロアリールは、置換または非置換であってよい)を含む1個または複数の次の基で置換されていることを含むことは理解されるであろう。通常適用される置換基の付加的な例を、本願明細書に記載の実施例中に示されている特定の実施形態により詳述する。
本願明細書で使用する場合、「シクロアルキル」との用語は特に、3から7個、好ましくは3〜10個の炭素原子を有する基に関する。適切なシクロアルキルには、これらに限られないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが含まれ、これらは、他の脂肪族、複素脂肪族または複素環基の場合と同様に、場合によって、これらに限られないが、脂肪族;複素脂肪族;アリール;ヘテロアリール;アリールアルキル;ヘテロアリールアルキル;アルコキシ;アリールオキシ;ヘテロアルコキシ;ヘテロアリールオキシ;アルキルチオ;アリールチオ;ヘテロアルキルチオ;ヘテロアリールチオ;F;Cl;Br;I;-OH;-NO2;-CN;-CF3;-CH2CF3;-CHCl2;-CH2OH;-CH2CH2OH;-CH2NH2;-CH2SO2CH3;-C(O)Rx;-CO2(Rx);-CON(Rx)2;-OC(O)Rx;-OCO2Rx;-OCON(Rx)2;-N(Rx)2;-S(O)2Rx;-NRx(CO)Rx;を含む置換基で置換されていてもよく、ここで、Rxの各存在はそれぞれ独立に、これらに限られないが、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキルが含まれ、これらの前記または本願明細書に記載の脂肪族、複素脂肪族、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換、分枝鎖または非分枝鎖、環式または非環式であってよく、前記または本願明細書に記載のアリールまたはへテロアリールは、置換または非置換であってよい。通常適用される置換基の付加的な例を、本願明細書に記載の実施例中に示されている特定の実施形態により詳述する。
本願明細書で使用される場合、「複素脂肪族」との用語は、例えば炭素原子の代わりに、1個または複数の酸素、イオウ、窒素、リンまたはケイ素原子を含有する脂肪族基に関する。複素脂肪族基は、分枝鎖、非分枝鎖、環式または非環式であってよく、モルホリノ、ピロリジニルなどの飽和および不飽和複素環が含まれうる。いくつかの実施形態では、複素脂肪族基は、その1個または複数の水素原子が、これらに限られないが、脂肪族;複素脂肪族;アリール;ヘテロアリール;アリールアルキル;ヘテロアリールアルキル;アルコキシ;アリールオキシ;ヘテロアルコキシ;ヘテロアリールオキシ;アルキルチオ;アリールチオ;ヘテロアルキルチオ;ヘテロアリールチオ;F;Cl;Br;I;-OH;-NO2;-CN;-CF3;-CH2CF3;-CHCl2;-CH2OH;-CH2CH2OH;-CH2NH2;-CH2SO2CH3;-C(O)Rx;-CO2(Rx);-CON(Rx)2;-OC(O)Rx;-OCO2Rx;-OCON(Rx)2;-N(Rx)2;-S(O)2Rx;-NRx(CO)Rxを含む1個または複数の基で独立に置換されていることにより、置換されており、ここで、存在するRxはそれぞれ独立に、これらに限られないが、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキルが含まれ、これらの前記または本願明細書に記載の脂肪族、複素脂肪族、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換、分枝鎖または非分枝鎖、環式または非環式であってよく、前記または本願明細書に記載のアリールまたはへテロアリール置換基は、置換または非置換であってよい。通常適用される置換基の付加的な例を、本願明細書に記載の実施例中に示されている特定の実施形態により詳述する。
本願明細書で使用する場合、「ハロ」および「ハロゲン」との用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される原子に関する。
「ハロアルキル」との用語は、1、2または3個のハロゲン原子が結合している前記で定義されたアルキル基を意味しており、クロロメチル、ブロモエチル、トリフルオロメチルなどの基が例示される。
本願明細書で使用する場合、「ヘテロシクロアルキル」または「ヘテロサイクル」との用語は、これらに限られないが、酸素、イオウおよび窒素から独立に選択される1から3個のヘテロ原子を有する縮合6員環を有する二環式または三環式基を含む非芳香族5員、6員または7員環または多環式基に関し、ここで、(i)各5員環は、0から1個の二重結合を有し、各6員環は、0から2個の二重結合を有し、(ii)窒素およびイオウへテロ原子は、場合によって酸化されていてもよく、(iii)窒素へテロ原子は場合によって、4級化されていてもよく;(iv)前記の複素環は、ベンゼン環に縮合していてもよい。代表的なヘテロサイクルには、これらに限られないが、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニルおよびテトラヒドロフリルが含まれる。いくつかの実施形態では、「置換へテロシクロアルキルまたはヘテロサイクル」基を使用し、本願明細書で使用する場合、これは、その1、2または3個の水素原子が、これらに限られないが、脂肪族;複素脂肪族;アリール;ヘテロアリール;アリールアルキル;ヘテロアリールアルキル;アルコキシ;アリールオキシ;ヘテロアルコキシ;ヘテロアリールオキシ;アルキルチオ;アリールチオ;ヘテロアルキルチオ;ヘテロアリールチオ;F;Cl;Br;I;-OH;-NO2;-CN;-CF3;-CH2CF3;-CHCl2;-CH2OH;-CH2CH2OH;-CH2NH2;-CH2SO2CH3;-C(O)Rx;-CO2(Rx);-CON(Rx)2;-OC(O)Rx;-OCO2Rx;-OCON(Rx)2;-N(Rx)2;-S(O)2Rx;-NRx(CO)Rxで独立に置換されている前記で定義されたヘテロシクロアルキルまたはヘテロサイクル基に関し、ここで、Rxはそれぞれ独立に、これらに限られないが、脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキルが含まれ、これらの前記または本願明細書に記載の脂肪族、複素脂肪族、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換、分枝鎖または非分枝鎖、環式または非環式であってよく、前記または本願明
細書に記載のアリールまたはへテロアリールは、置換または非置換であってよい。通常適用される置換基の付加的な例を、本願明細書に記載の実施例中に示されている特定の実施形態により詳述する。
「標識(された)」:本願明細書で使用する場合、「標識(された)」との用語は、化合物が、化合物の検出を可能にするために結合された少なくとも1個の元素、同位体または化学化合物を有することを意味するものである。通常、標識には、3種の群が該当する:a)これらに限られないが、2H、3H、32P、35S、67Ga、99mTc(Tc-99m)、111In、123I、125I、169Ybおよび186Reを含む放射性または重同位体であってよい同位体標識;b)検出可能な剤を産生する酵素(ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなど)に結合しててもよい抗体または抗原であってよい免疫標識;c)着色、発光、りん光または蛍光染料。検出されるべき化合物の生物学的活性または特性を妨げない位置で、標識を化合物に導入することができることは、認められるであろう。本発明のいくつかの実施形態では、生物系での分子間相互作用を直接的に解明するために(例えば、チューブリンダイマー中でのエポチロン結合部位を調べるために)、光アフィニティー標識を利用する。ニトレンまたはカルベンへのジアゾ化合物、アジ化物またはジアジリンの光変換に多くは応じて、様々な既知のフォトフォアを使用することができる(その内容が参照により本願明細書に援用されるBayley,H.,Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology(1983),Elsevier,Amsterdam参照)。本発明のいくつかの実施形態では、使用される光アフィニティー標識は、1個または複数のハロゲン成分で置換されているo-、m-およびp-アジドベンゾイルであり、これらに限られないが、4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸が含まれる。
「ポリマー」:本願明細書で使用する場合、「ポリマー」との用語は、同じか異なってよい繰り返し単位(モノマー)からなる開いているか、閉じているか、直鎖か、分枝鎖かまたは架橋であってよい鎖を含む構成体に関する。いくつかの実施形態では、ポリマーとの用語は、バイオポリマーに関し、これは、本願明細書で使用する場合、天然に見られるか、天然に存在する物質をベースとするポリマー材料に関し、これらに限られないが、核酸、ペプチドおよびこれらの模倣物質を含むことは認められるであろう。いくつかの他の実施形態では、ポリマーとの用語は、生分解性ポリマーまたは他のポリマー材料などの合成ポリマーに関する。ポリマー固体支持体も、本発明のポリマーに包含されることは認められるであろう。本発明の化合物を、ポリマー支持体に結合させて、この固体相上で、一定の合成改質を行うことができる。本願明細書で使用する場合、「固体支持体」との用語は、これらに限られないが、ペレット、ディスク、毛細管、中空繊維、ニードル、ピン、固体繊維、セルロースビーズ、細孔ガラスビーズ、シリカゲル、ジビニルベンゼンと場合によって架橋しているポリスチレンビーズ、グラフト化コポリビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、N,N'-ビス-アクリロイルエチレンジアミンと場合によって架橋しているジメチルアクリルアミドビーズおよび疎水性ポリマーでコーティングされているガラス粒子を含むことを意味する。当技術分野の専門家であれば、特定の固体支持体を選択することにより、支持体と利用される反応化学との相容性を限定しうることを理解するであろう。固体支持体の例は、Tentagelアミノ樹脂、1)ジビニルベンゼンと架橋しているポリスチレンビーズおよび2)PEG(ポリエチレングリコール)との複合材料である。Tentagelは、特に有用な固体支持体である。それというのも、これは、on-beadまたはoff-beadアッセイで使用するための多目的支持体をもたらし、さらに、トルエンから水にいたる溶剤で優れた膨潤を示すためである。
新規で有効な癌治療を開発する必要を認識して、本発明は、幅広い生物学的および薬理学的活性を有する大環状化合物を入手可能にする新規の合成方法論、さらにそのような活性を有する新規化合物、新規の治療組成物ならびにこれらの化合物および組成物を使用する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、癌の治療で使用することができる。本発明のいくつかの化合物は、癌細胞系に対して細胞毒および成長阻害効果を示し、チューブリンを重合化し、微小管アセンブリを安定化する能力を示し、および/または癌細胞異種移植片での腫瘍の縮小または消失をもたらす。いくつかの実施形態では、本化合物は、生体臓器への毒性、悪心、嘔吐、下痢、脱毛、体重低下、体重増加、肝臓毒性、皮膚障害などを含む副作用を減らすか、最小限にすることができる。本化合物はさらに、高い水溶性、低い毒性、高い治療幅、高い効力などにより、処方するのが容易である。
本発明の化合物の一般的な記載
本発明の化合物には、下記でさらに詳述する一般式(0)およびその薬学的に許容できる誘導体が含まれる:
[上式中、
R0は、置換または非置換のアリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニルまたはへテロアリールアルキニル基であり;いくつかの実施形態では、R0は、アリールアルキル、アリールアルケニル、ヘテロアリールアルキルまたはへテロアリールアルケニル基であり;他の実施形態では、R0は、ヘテロアリールアルケニル基であり;いくつかの実施形態では、R0は、ヘテロアリールアルキル基であり;他の実施形態では、R0は、5〜7員のアリールまたはへテロアリール基であり;さらに他の実施形態では、R0は、8〜12員の二環式アリールまたはへテロアリール基であり;さらに他の実施形態では、R0は、フェニル環がヘテロアリールまたはアリール基に縮合している二環式基であり;他の実施形態では、R0は、フェニル環がチアゾール、オキサゾールまたはイミダゾール基に縮合している二環式基であり;さらに他の実施形態では、R0は、置換または非置換のフェニル基であり;
R3およびR4はそれぞれ独立に、水素であるか;1個または複数のヒドロキシ、保護されているヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボキシアルデヒド、直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくは環式アセタール、フッ素、アミノ、保護されているアミノ、1個もしくは2個のアルキルもしくはアリール基で置換されているアミノ、N-ヒドロキシイミノまたはN-アルコキシイミノで置換されていてもよい置換または非置換の、直鎖または分枝鎖の、環式または非環式脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル基であり;いくつかの実施形態では、R3およびR4はそれぞれ独立に、水素、フッ素または低級アルキルであり;他の実施形態では、R3およびR4はそれぞれ独立に、水素またはメチルであり;さらに他の実施形態では、R3はメチルであり、R4は水素であり;
R5およびR6はそれぞれ独立に、水素または保護基であり;いくつかの実施形態では、R5およびR6は両方とも水素であり;
Xは、O、S、C(R7)2またはNR7であり、ここで、R7はそれぞれ独立に、水素または低級アルキルであり;いくつかの実施形態では、XはOであり;他の実施形態では、XはNHであり;
Yは、O、S、NH、C(R7)2、CH2、N(R7)またはNHであり、ここで、R7はそれぞれ独立に、水素または低級アルキルであり;いくつかの実施形態では、YはOであり;他の実施形態では、YはNHであり;さらに他の実施形態では、YはCH2であり;
R8はそれぞれ独立に、水素;ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミノ、フルオロ、シアノあるいは1個または複数のヒドロキシ、保護されているヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボキシアルデヒド、直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくは環式アセタール、フッ素、アミノ、保護されているアミノ、1個もしくは2個のアルキルもしくはアリール基で置換されているアミノ、N-ヒドロキシイミノまたはN-アルコキシイミノで置換されていてもよい置換または非置換の、直鎖または分枝鎖の、環式または非環式脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニルまたはへテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル基であり;いくつかの実施形態では、R8は水素であり;他の実施形態では、R8はヒドロキシであり;さらに他の実施形態では、R8はフッ素であり;さらに他の実施形態では、R8はメチルなどの低級アルキルであり;他の実施形態では、R8は、-CF3、-CF2Hまたは-CFH2であり;他の実施形態では、R8は過フッ化またはフッ化アルキル基であり;さらに他の実施形態では、R8はハロゲン化または過ハロゲン化アルキル基であり;
R9およびR10はそれぞれ独立に、水素;または1個または複数のヒドロキシ、保護されているヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボキシアルデヒド、直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくは環式アセタール、フッ素、アミノ、保護されているアミノ、1個もしくは2個のアルキルもしくはアリール基で置換されているアミノ、N-ヒドロキシイミノまたはN-アルコキシイミノで置換されていてもよい置換または非置換の、直鎖または分枝鎖の、環式または非環式脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニルまたはへテロアリールアルキニル基であり;いくつかの実施形態では、R9およびR10の一方は、メチルであり;他の実施形態では、R9およびR10は両方ともメチルであり;さらに他の実施形態では、R9およびR10の一方は、メチルであり、他方は水素であり;他の実施形態では、R9およびR10は両方とも水素であり;
A-Bは、CRA=CRB-、C(RA)2-C(RB)2-、または
を表し;
C-Dは、CRC=CRD-、C(RC)2-C(RD)2-、または
を表し;
(上式中、
RAは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORA';-SRA';-N(RA')2;-C(O)ORA';-C(O)RA';-CONHRA';-O(C=O)RA';-O(C=O)ORA';-NRA'(C=O)RA';N3;N2RA';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORA';-SRA';-N(RA')2;-C(O)ORA';-C(O)RA';-CONHRA';-O(C=O)RA';-O(C=O)ORA';-NRA'(C=O)RA';N3;N2RA';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;
RBは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;いくつかの実施形態では、RBは、それぞれ非置換か、1個または複数のハロゲン、-OH、-ORB'、NH2またはN(RB')2またはこれらの組合せで置換されていてもよい水素、
メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルであり、ここで、RB'はそれぞれ独立に、水素、アルキル、アリールまたは保護基であり、他の実施形態では、RBは水素、メチルまたはエチルであり、さらに他の実施形態では、RBはメチルであり、他の実施形態では、-CY3、-CHY2、-CH2Yであり、ここで、Yは、F、Br、Cl、I、ORB'、NHRB'、N(RB')2またはSRB'であり;さらに他の実施形態では、RBは、-CF3、-CH2FまたはCHF2であり;他の実施形態では、RBは過フッ化またはフッ化アルキル基であり、さらに他の実施形態では、RBは、ハロゲン化または過ハロゲン化アルキル基であり;
RCは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORC';-SRC';-N(RC')2;-C(O)ORC';-C(O)RC';-CONHRC';-O(C=O)RC';-O(C=O)ORC';-NRC'(C=O)RC';N3;N2RC';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORC';-SRC';-N(RC')2;-C(O)ORC';-C(O)RC';-CONHRC';-O(C=O)RC';-O(C=O)ORC';-NRC'(C=O)RC';N3;N2RC';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;いくつかの実施形態では、RCは、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシまたはアミノであり;他の実施形態では、RCはフッ素であり;さらに他の実施形態では、RCはヒドロキシであり;
RDは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORD';-SRD';-N(RD')2;-C(O)ORD';-C(O)RD';-CONHRD';-O(C=O)RD';-O(C=O)ORD';-NRD'(C=O)RD';N3;N2RD';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORD';-SRD';-N(RD')2;-C(O)ORD';-C(O)RD';-CONHRD';-O(C=O)RD';-O(C=O)ORD';-NRD'(C=O)RD';N3;N2RD';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;
RA、RB、RCまたはRDのいずれか2つが、共同して環式基を形成し、酸素、イオウ、炭素もしくは窒素原子を介して結合することができ、または、2つの隣接するRA、RB、RCまたはRD基のいずれかがが、共同して、3から6員の置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはヘテロアリール環を形成することができ;いくつかの実施形態では、RAおよびRBが、共同して、酸素、イオウ、炭素もしくは窒素原子を介して結合した3員環を形成し;他の実施形態では、RCおよびRDが、共同して、酸素、イオウ、炭素もしくは窒素原子を介して結合した3員環を形成し;
RA'、RB'、RC'またはRD'はそれぞれ独立に、水素;保護基;直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、環式または非環式脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、またはヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、へテロアリールアルキニル基である)]。
本発明の化合物には、下記でさらに詳述する一般式(I)が含まれる:
[上式中、
R1は、水素または低級アルキルであり;いくつかの実施形態では、R1は、メチルであり;いくつかの実施形態では、R1は、-CF3、-CF2HまたはCH2Fであり;他の実施形態では、R1は、過フッ化またはフッ化アルキル基であり;さらに他の実施形態では、R1は、ハロゲン化または過ハロゲン化アルキル基であり;
R2は置換または非置換のアリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル基であり;いくつかの実施形態では、R2は置換または非置換のオキサゾールであり;他の実施形態では、R2は置換または非置換のチアゾールであり;
A、B、C、D、R3、R4、R5、R6およびXは前記と同様に定義される]。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物には、次式のように定義される立体化学を有する一般式(II)の化合物が含まれる:
[上式中、A、B、C、D、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびXは前記と同様に定義される]。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物には、次式のように示される一般式(III)の化合物が含まれる:
[上式中、
Zは、酸素原子、イオウ原子、-NRZ-または-C(RZ)2-であり;A、B、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびXは前記と同様に定義される]。
いくつかの好ましい実施形態では、Zは-CH2-である。他の実施形態では、RZは水素、アルキル、ハロゲンまたはアシルである。いくつかの実施形態では、RZはフッ素である。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物には、次式のように定義される立体化学を有する一般式(IV)の化合物が含まれる:
[上式中、A、B、R1、R2、R3、R4、R5、R6、XおよびZは前記と同様に定義される]。
いくつかの実施形態においては、RBはメチルである。他の実施形態においては、RBは-CF3である。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物には、次式のように示される一般式(V)または(VI)の化合物が含まれる:
[上式中、
Zは、酸素原子、イオウ原子、-NRZ-または-C(RZ)2-であり;A、B、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびXは前記と同様に定義される]。
いくつかの好ましい実施形態では、Zは酸素である。他の実施形態では、Zは-NH-である。他の更なる実施形態では、Zは-CH2-である。他の実施形態では、RZは水素、アルキル、ハロゲンまたはアシルである。いくつかの実施形態では、RZはフッ素である。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物には、次式のように示される一般式(VII)の化合物が含まれる:
[上式中、A、B、RC、RD、R1、R2、R3、R4、R5、R6、XおよびZは前記と同様に定義される]。 いくつかの好ましい実施形態では、RCは、独立に水素、ハロゲンまたは低級アルキルである。他の実施形態では、それぞれのRDが、独立に水素、ハロゲンまたは低級アルキルである。
いくつかの実施形態では、Xは、Oである。他の実施形態では、Xは、NHである。他の実施形態では、Xは、CH2である。
いくつかの実施形態では、R2は、置換または非置換のチアゾールである。いくつかの実施形態では、R2は、2-メチル-チアゾ-4-イルである。他の実施形態では、R2は、2-ヒドロキシメチル-チアゾ-4-イルである。さらに他の実施形態では、R2は、2-アミノメチル-チアゾ-4-イルである。他の実施形態では、R2は、2-チオールメチル-チアゾ-4-イルである。
いくつかの実施形態では、R2は、置換または非置換のオキサゾールである。いくつかの実施形態では、R2は、2-メチル-オキサゾ-4-イルである。他の実施形態では、R2は2-ヒドロキシルメチル-オキサゾ-4-イルである。さらに他の実施形態では、R2は、2-アミノメチル-オキサゾ-4-イルである。他の実施形態では、R2は、2-チオールメチル-オキサゾ-4-イルである。
いくつかの実施形態では、RBは、水素、メチル、エチル、-CF3、-CH2Fまたは-CF2Hである。いくつかの実施形態では、RBは、メチルである。さらに他の実施形態では、RBは、-CF3である。いくつかの実施形態では、RBは、水素である。他の実施形態では、RBは、エチルである。
いくつかの好ましい化合物には、例えば、以下のものが含まれる:
本発明の化合物には、特に前記したものおよび本願明細書に記載されているものが含まれ、これらを、本願明細書中のいずれかで開示されている様々な群、亜群および種により個別に詳述する。如何なる特定の理論に拘束されることを望むわけではないが、本発明のいくつかの化合物は、C9-C10部位における炭素-炭素二重結合と同じ方法で分子の構造を制限するように、C9およびC10で改質されている。この構造的な制限を生じさせるために、電子作用、立体作用、水素結合、双極子作用、またはそれらの組み合わせを使用することができる。例えば、オキシラン、シクロプロピルおよびアジリジンなどの環状環システムは、分子の構造を制限するのに使用することができる。他の実施形態では、4、5または6員環を、同じ作用を達成するのに使用する。この作用は、また、エステル、チオエステルまたはアミドなどで見られる共役したp-軌道システムによっても達成することができる。この作用は、また、芳香族環システムにおいて見られるシステムなどの拡張した非局在化piシステムによっても達成することができる。他の実施形態では、C9およびC10部位近近辺での置換基の立体作用は、その分子がC9-C10炭素-炭素二重結合によって制限されるのと同じ方法で、分子の構造を制限するのに使用される。
本発明の化合物には、不斉中心が存在しうることは、当技術分野の専門家であれば認めるであろう。したがって、本発明の化合物およびその医薬組成物は、個々の鏡像異性体、ジアステレオ異性体または幾何異性体の形態であってもよいし、立体異性体の混合物の形態であってもよい。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、鏡像純粋な化合物である。いくつかの他の実施形態では、立体異性体またはジアステレオ異性体の混合物を提供する。
化合物の前記の群および亜群のうちのいくつかは、様々な異性体形で存在しうることは認められるであろう。本発明は、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体として、もしくは、様々な異性体の混合物、例えば、立体異性体のラセミ混合物としての化合物を包含する。加えて、本発明は、特に指示がなければ、(Z)および(E)2重結合異性体の両方を包含する。したがって、本明細書の構造で通常は示される本発明の化合物は、二重結合が(Z)または(E)である構造を包含する。いくつかの好ましい実施形態では、C12-C13位の二重結合は、シスまたはZ配置である。いくつかの実施形態では、C9-C10位の二重結合は、トランスまたはE配置である。さらに他の実施形態では、C12-C13位の二重結合は、シスまたはZ配置であり、C9-C10位の二重結合は、トランスまたはE配置である。さらに本発明は、前記の特定の化合物の互変異性体も包含する。
加えて、本発明は、本発明の化合物の薬学的に許容できる誘導体を、およびこれらの化合物、その医薬組成物もしくは1種または複数の追加の治療薬と組み合わされたこれらのいずれかを使用して、患者を治療する方法を提供する。本願明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる誘導体」との語句は、このような化合物の薬学的に許容できる塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、そのような化合物の塩、または、患者に投与されると、本願明細書に記載の化合物またはその代謝産物または残留物を(直接または間接に)もたらしうる他の付加生成物または誘導体を意味する。それゆえ、薬学的に許容できる誘導体には、他のプロドラッグが含まれる。プロドラッグは、付加的な基を有し、これがin vivoで除去されると、薬理活性種としての親分子をもたらす、通常は、かなり低い薬理活性を有する化合物の誘導体である。プロドラッグの例は、in vivoで分離されて、該当する化合物をもたらすエステルである。様々な化合物のプロドラッグおよびプロドラッグを生じさせるために親化合物を誘導体化する材料および方法が知られていて、本発明に適用することができる。医薬組成物および薬学的に許容できる誘導体のいくつかの例を、下記でさらに詳細に検討する。
特に重要な本発明の化合物には、
・科学的に許容できる癌細胞異種移植片モデルを使用するin vitroまたは動物研究で保持されている癌細胞系に対して、細胞毒または成長阻害効果を示し;
・チューブリンを重合させ、微小管アセンブリを安定化する能力を示し;
・生体臓器に対して、最低レベルの毒性を示し;
・科学的に許容できる癌細胞異種移植片モデルで、腫瘍消失をもたらし;
・科学的に許容できる癌細胞異種移植片モデルで、腫瘍縮小をもたらし;
・科学的に許容できる癌細胞異種移植片モデルで、腫瘍消失をもたらし、治療を止めた後にも、腫瘍の再発を遅らせるか、再発をもたらさず;
・一時的および可逆的体重低下を示し、科学的に許容できる癌細胞異種移植片モデルで治療効果を示し;
・エポチロンA、B、CまたはDもしくはパクリタクセルを上回る高い水溶性を示すか、それに加えて、またはその代わりに、低い割合のクレモフォールを使用すれば、水性媒体に処方するに十分な可溶性を示し;かつ/または
・エポチロンB、エポチロンDまたはパクリタクセルの治療プロファイルよりも優れた治療プロファイル(例えば、最適な安全および治療効果)を示す
ものが含まれる。本願明細書に例示されているように、前記の様々なエポチロン類似体が、調製、同定および試験されている。9,10-デヒドロ-エポチロン類似体は、癌の治療で有用であることが判明しており、特に、それらの化合物は調製されていて、前記の1つまたは複数の望ましい特性を有することが判明している。
合成方法論
いくつかのエポチロン、デスオキシエポチロンおよびこれらの類似体の合成は、既に記載されている(米国特許第6242469号、米国特許第6284781号、米国特許第6300355号、米国特許第6204388号、米国特許第6316630号、米国特許第6369234号、米国特許出願公開第09/797027号、米国特許出願公開第09/796959号、米国特許出願公開第10/236135号;および国際公開第99/01124号、国際公開第99/43653号および国際公開第01/64650号参照;これらの内容は全て、参照により本願明細書に援用される)。エポチロン、デスオキシエポチロンおよびその類似体を大量に効率的に生じさせるために、改善合成方法論または付加的合成方法論が必要であることを認識して、本発明は、エポチロン、デスオキシエポチロンおよびその類似体を合成するための効率的な組み立て経路を提供する。いくつかの化合物例の合成を、本願明細書の実施例に記載するが、この方法論を、本願明細書に記載の各群および亜群に関して前記で検討した類似体および結合体を生じさせるために一般に適用することができることは、認められるであろう。
特に、本発明の9,10-デヒドロエポチロン化合物は、エポチロンの合成で使用することができる合成方法論を使用して、様々に調製することができる。いくつかの実施形態では、集束合成経路を使用して、この化合物を調製する。例えば、2種または3種の中間体を調製し、これらを一緒にして、所望の化合物を得ることにより、エポチロンを合成することができる。1実施形態では、中間体のうちの1種は、1〜9個の炭素を含有するアシル部であり、他の中間体は、10〜15個の炭素を有し、さらに、チアゾール側鎖を有してもよい。C-1とC-15からの酸素とのエステル化反応とを使用して、エポチロンのこれら2つのほぼ同じ部分を初めて一緒にすることができる。次いで、スズキカップリングまたは閉環複分解反応などの炭素-炭素カップリング反応を使用して、この大環状化合物を閉環することができる。1実施形態では、閉環複分解反応を使用して、9,10-二重結合を生じさせ、大環状化合物を閉じることにより、最終閉環工程を行う。下記のスキーム8に示されているようなGrubbs触媒などの有機金属触媒を使用して、閉環複分解反応を行う。いくつかの実施形態では、9,10-二重結合を還元または酸化するか、9,10-二重結合をさらに官能化して、付加的なエポチロン誘導体を調製することができる。いくつかの実施形態では、9,10-二重結合は、CH2N2などのカルベンまたはカルベノイド試薬を用いた9,10-二重結合の処理によって、シクロプロピル基へと転換される。
いくつかの実施形態では、9,10-デヒドロエポチロン化合物を、10,11-部位(例えばEpo490)から9,10-部位へと二重結合を異性化することによって調製される。この異性化は、パラジウムなどの遷移金属の存在によって触媒することができる。
他の実施形態では、閉環複分解反応を使用して、12,13の二重結合を生じさせ、大環状化合物を閉じることにより、最終的な閉環工程を行う。いくつかの実施形態では、12,13-二重結合を還元または酸化させる。他の実施形態では、マクロアルドール化(macroaldolization)またはマクロラクトン化(macrolactonization)反応を使用して、大環状化合物を生じさせることができる。
本発明の化合物のいくつかの合成例を、図面および実施例で示す。当技術分野の専門家であれば認めるように、本願明細書に記載の合成手順を使用して、様々な類似体および誘導体を調製することができる。例えば、16員環で様々な保護基または様々な置換基を用いて、多くの合成工程を達成することができる。
医薬組成物
本発明はさらに、癌細胞の成長を阻害するか、それを死滅させうるか、特に重要ないくつかの実施形態では、多剤耐性癌細胞の成長を阻害するか、それを死滅させうる前記および本願明細書に記載の少なくとも1種の化合物またはその薬学的に許容できる誘導体を含有する医薬品を提供する。いくつかの実施形態では、この医薬品はさらに、クレモフォール(ポリオキシル35ヒマシ油)またはソルトール(ポリエチレングリコール660 12-ヒドロキシステアレート)などの可溶化剤または乳化剤を含有する。
前記で検討したように、本発明は、抗腫瘍活性および抗増殖活性を有する新規の化合物を提供し、したがって、本発明の化合物は、癌の治療で使用することができる。したがって、本発明の他の態様では、医薬組成物を提供するが、この際、これらの組成物は、本願明細書に記載の化合物いずれか1種を含有し、場合によって、薬学的に許容できる担体を含有する。いくつかの実施形態では、これらの組成物は場合によって、1種または複数の付加的な治療剤をさらに含有する。いくつかの他の実施形態では、付加的な治療剤は、本願明細書でさらに検討される抗癌剤である。
本発明の化合物のうちのいくつかは、治療のための遊離形態で存在してよいか、または適切な場合には、その薬学的に許容できる誘導体として存在してよい。本発明では、薬学的に許容できる誘導体には、これらに限られないが、薬学的に許容できる塩、エステル、このエステルの塩または、それを必要とする患者に投与されると、本願明細書に記載の化合物またはその代謝産物または残留物を直接または間接にもたらしうる他の付加生成物または誘導体、例えばプロドラッグが含まれる。
本願明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる塩」との用語は、確実な医学的判定の範囲内で、不当な毒性、刺激、アレルギー応答などを伴うことなく、ヒトおよび下級動物の組織と接触させて使用するために適していて、合理的な損益比に見合う塩に関する。薬学的に許容できる塩は、当技術分野でよく知られている。例えば、S.M.Bergeらは、参照により本願明細書に援用されるJ.Pharmaceutical Sciences,66:1-19(1977)に、薬学的に許容できる塩を詳細に記載している。これらの塩は、本発明の化合物を最終的に単離および精製する際にその場で、または遊離塩基官能基と適切な有機酸とを反応させることにより別に調製することができる。薬学的に許容できる非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸と、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸と生じるか、イオン交換などの当技術分野で使用される他の方法によるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容できる塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル流酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプト酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘルニ硫酸(hernisulfate)、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。他の薬学的に許容できる塩には、適切ならば、ハリド、ヒドロキシド、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ニトレート、低級アルキルスルホネートおよびアリールスルホネートなどの対イオンを使用すると生じる非毒性アンモニウム、4級アンモニウムおよびアミンカチオンが含まれる。
加えて、本願明細書で使用する場合、「薬学的に許容できるエステル」とは、in vivoで加水分解されるエステルに関し、これには、ヒトの体内で容易に分解して、親化合物またはその塩を放出するものが含まれる。適切なエステル基には例えば、各アルキルまたはアルケニル基が有利には、6個以下の炭素原子を有する薬学的に許容できる脂肪族カルボン酸、特に、アルカノール酸、アルケノン酸、シクロアルカノン酸およびアルカンジオン酸に由来するものが含まれる。特定のエステルの例には、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルが含まれる。
さらに、「薬学的に許容できるプロドラッグ」との用語は本願明細書で使用する場合、確実な医学的判定の範囲内で、不当な毒性、刺激、アレルギー応答などを伴うことなく、ヒトおよび下級動物の組織と接触させて使用するために適していて、合理的な損益比に見合い、所定の使用に有効な本発明の化合物のプロドラッグ、さらに、可能ならば、本発明の化合物の両性イオン形態に関する。「プロドラッグ」との用語は、例えば、血中での加水分解により、in vivoで迅速に変換されて、前記の式の親化合物をもたらす化合物のことである。いずれも参照により本願明細書に援用されるT.Higuchi and V.Stella,Pro-drugs as Novel Delivery Systems,Vol.14 of the A.C.S.Symposium SeriesおよびEdward B.Roche,ed.,Bioreversible Carriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987に徹底的な検討が示されている。
前記のように、本発明の医薬組成物は、本願明細書で使用する場合には、所望の特定の剤形に合わせてあらゆる溶剤、希釈剤または他の液体賦形剤、分散剤または懸濁剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑剤などを含む薬学的に許容できる担体を付加的に含有する。Remington's Pharmaceutical Sciences,Fifteenth Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1975)は、医薬組成物を処方する際に使用される様々な担体および調製に関して知られている技術を開示している。望ましくない生物学的効果が生じたり、さもなければ、医薬組成物の他の成分と有害に相互作用するなど、慣用の担体媒体が本発明の抗癌化合物と非相容性である場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内であると考えられる。薬学的に許容できる担体として役立つ物質のいくつかの例には、これらに限られないが、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖;トウモロコシデンプンおよび馬鈴薯デンプンなどのデンプン;カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体;粉末トラガカント;麦芽;ゼラチン;タルク;クレモフォール;ソルトール;カカオバターおよび座薬用ろうなどの賦形剤;落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油;プロピレングリコールなどのグリコール;オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル;寒天;水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤;アルギン酸;発熱物質不含水;等張性食塩水;リンガー液;エチルアルコールおよびリン酸緩衝液が含まれ、さらに、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性相容性滑剤、さらに、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香料および着香剤、防腐剤および酸化防止剤が、処方者の判断によって組成物中に存在してもよい。
化合物および医薬組成物の使用
本発明はさらに、腫瘍成長および/または腫瘍転移を阻害する方法を提供する。該当するいくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍の多剤耐性癌細胞で、腫瘍成長および/または腫瘍転移を阻害することにより、癌を治療する方法を提供する。この方法は、治療有効量の化合物またはその薬学的に許容できる誘導体を、それを必要とする患者(これらに限られないが、ヒトまたは動物を含む)に投与することを含む。いくつかの実施形態では、特に多剤耐性癌細胞を含む癌を治療するためには、治療有効量は、多剤耐性癌細胞系を死滅またはその成長を阻害するに十分な量である。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、充実性腫瘍を治療するためにも役立つ。
本発明の化合物および医薬組成物は、増殖性疾患(例えば、癌)、自己免疫疾患(例えば、慢性関節リウマチ)および感染症(例えば、細菌、真菌など)を含む疾患または状態を治療または予防する際に使用することができる。化合物および医薬組成物は、動物、好ましくは哺乳動物(例えば、家畜、ネコ、イヌ、マウス、ラット)、さらに好ましくはヒトに投与することができる。どのような投与方法を使用しても、医薬組成物の化合物を動物に輸送することができる。いくつかの実施形態では、化合物または医薬組成物を、非経口的に投与する。
さらに他の態様では、本発明の治療方法により、本願明細書に記載されているように腫瘍細胞と本発明の化合物または組成物とを接触させることにより、腫瘍細胞を死滅させるか、その成長を阻害する。したがって、本発明のさらに他の態様では、癌を治療する方法を提供するが、これは、治療有効量の本発明の化合物または本発明の化合物を含有する医薬組成物を、所望の結果を達成するに必要な量および期間にわたって、それを必要とする患者に投与することを含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の化合物または医薬組成物の「治療有効量」は、腫瘍細胞を死滅させるか、その成長を阻害するに有効な量である。本発明の方法による化合物および組成物は、腫瘍細胞を死滅させるかまたはその成長を阻害するに有効な投与量および投与経路を使用して、投与することができる。したがって、「腫瘍細胞を死滅させるか、その成長を阻害するに有効な量」との表現は、本願明細書で使用する場合には、腫瘍細胞を死滅させるか、その成長を阻害するに十分な薬剤量のことである。必要な正確な量は、種、年齢および患者の全身状態、感染の重度、特定の抗癌剤、投与方法などに応じて、患者によって変動する。本発明の抗癌化合物は好ましくは、投与の簡便さおよび用量の均一性のために、単位剤形で処方される。本願明細書で使用される場合、「単位剤形」との表現は、治療される患者に適した抗癌剤の物理的に別々な単位に関する。しかしながら、本発明の化合物および組成物の全1日用量は、的確な医学的判断の範囲内で担当医師により決定されることは理解されるであろう。特定の患者または臓器に対する個々の治療有効用量レベルは、治療される疾患および疾患の重度;使用される個々の化合物の活性;使用される個々の組成物;患者の年齢、体重、全身健康、性別および食事;使用される特定の化合物の投与時間、投与経路排出速度;治療期間;使用される個々の化合物と組み合わせて、または同時に使用される薬物;および医学分野でよく知られている同様の因子を含む様々な因子に左右される。
さらに、所望の用量に適切な薬学的に許容できる担体を用いて処方した後に、本発明の医薬組成物をヒトおよび他の動物に、治療される感染症の重度に応じて、経口で、直腸で、非経口で、槽内で、膣内で、腹腔内で、局所で(粉末、軟膏またはドロップとして)、経口または鼻腔スプレーとして頬内などで投与することができる。本発明のいくつかの実施形態では、本願明細書に記載の本発明の化合物を、その全ての内容が参照により本願明細書に援用される米国特許第5977163号に記載されているような水溶性キレート化剤またはポリエチレングリコールなど、ポリ(1-グルタミン酸)またはポリ(1-アスパラギン酸)などの水溶性ポリマーと組み合わせて処方する。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、経口または非経口で、1日当たり患者の体重1kg当たり約0.001mg/kgから約100mg/kg、約0.01mg/kgから約50mg/kg、好ましくは約0.1mg/kgから約40mg/kg、好ましくは約0.5mg/kgから約30mg/kg、約0.01mg/kgから約10mg/kg、約0.1mg/kgから約10mg/kg、さらに好ましくは約1mg/kgから約25mg/kg輸送するに十分な用量レベルで、1日1回から複数回投与して、望ましい治療効果を得ることができる。所望の用量を、1日おきに、3日おきに、1週間おきに、2週間おきに、3週間おきに、4週間おきに輸送することができる。いくつかの実施形態では、望ましい用量を、複数回投与を使用して輸送することができる(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回または10回投与)。
経口投与のための液体剤形には、これらに限られないが、薬学的に許容できるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶剤などの当技術分野で通常使用される不活性な希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル(特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油)、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルおよびこれらの混合物などの可溶化剤および乳化剤を含有する。不活性希釈剤の他に、経口組成物はさらに、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤、着香剤、香料などの補助剤を含有してもよい。非経口投与のためのいくつかの実施形態では、本発明の化合物を、Cremophor、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルビテート、シクロデキストリン、ポリマーおよびこれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合させる。いくつかの実施形態では、化合物を、エタノールなどのアルコールおよびCremophor(ポリエチレン化ヒマシ油)と混合させる。
適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の技術により、注射可能な製剤、例えば、注射可能な無菌水性または疎水性懸濁液を処方することができる。注射可能な無菌製剤はさらに、例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液などの、非経口許容の非毒性の希釈剤または溶剤中の注射可能な無菌溶液、懸濁液またはエマルジョンであってよい。使用することができる許容できる賦形剤および溶剤は特に、水、リンガー液、U.S.P.および等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の不揮発性油が、溶剤または懸濁媒体として慣用的に使用される。このためには、合成モノ-またはジグリセリドを含む無菌の不揮発性油を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を、注射可能な製剤中で使用することができる。
例えば、細菌保持フィルターで濾過するか、使用前に無菌水または他の注射可能な無菌媒体に溶解または分散させることができる無菌固体組成物の形態に、滅菌剤を加えることにより、注射可能な処方物を滅菌することができる。
薬物の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅くすることが往々にして望ましい。このことは、水溶性の低い結晶または非晶質物質の液体懸濁液を使用することにより達成することができる。薬物の吸収速度は、その溶解速度に左右され、翻ってこのことは、結晶サイズおよび結晶形態に左右されうる。もしくは、油賦形剤中に薬物を溶解または懸濁させることにより、非経口投与される薬物形態の遅い吸収を達成することができる。ポリラクチド-ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で薬物のマイクロカプセルマトリックスを生じさせることにより、注射可能なデポー形態を製造する。薬物対ポリマーの比および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が含まれる。さらに、体の組織と相容性なリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することにより、注射可能なデポー処方物を調製する。
直腸または膣内投与のための組成物は好ましくは、本発明の化合物と、周囲温度では固体であるが、体温では液体であるので、直腸または膣腔内で溶けて、活性化合物を放出するカカオバター、ポリエチレングリコールまたは座薬用ろうなどの適切な非刺激性賦形剤または担体とを混合することにより調製することができる座薬である。
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉末および顆粒が含まれる。このような固体剤形中では、活性化合物は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムおよび/またはa)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などの充填剤または増量剤、b)例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアラビアゴムなどの結合剤、c)グリセリンなどの湿潤剤、d)寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯またはタピオカデンプン、アルギン酸、一定のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、e)パラフィンなどの溶解遅延剤、f)4級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、g)例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセリンなどの湿潤剤、h)カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤およびi)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑剤およびこれらの混合物などの少なくとも1種の薬学的に許容できる不活性な賦形剤または担体と混合されている。カプセル、錠剤および丸薬の場合には、剤形はさらに、緩衝剤を含有してもよい。
ラクトースまたは乳糖、さらに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、同様のタイプの固体組成物を、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することもできる。薬剤処方分野でよく知られている腸溶コーティングおよび他のコーティングなどのコーティングおよび殻を用いて、錠剤、糖衣丸、カプセル、丸薬および顆粒の固体剤形を調製することができる。これらは場合によって、乳白剤を含有してもよく、さらに、一定の腸管部分でのみ、またはそこで優先的に、活性成分を、場合によって遅延して放出する組成物であってもよい。使用することができる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびろうが含まれる。ラクトースまたは乳糖、さらに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、同様のタイプの固体組成物を、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することもできる。
前記の1種または複数の賦形剤を用いて、活性化合物をマイクロカプセル封入形態にすることもできる。薬剤処方分野でよく知られている腸溶コーティング、放出制御コーティングおよび他のコーティングなどのコーティングおよび殻を用いて、錠剤、糖衣丸、カプセル、丸薬および顆粒の固体剤形を調製することができる。このような固体剤形では、活性化合物を、スクロース、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも1種の不活性希釈剤と混合していてもよい。このような剤形はさらに、通常の実施と同様に、不活性希釈剤以外の付加的な物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなどの錠剤化滑剤および他の錠剤化助剤を含有してもよい。カプセル、錠剤および丸薬の場合には、剤形はさらに、緩衝剤を含有してもよい。これらは場合によって、乳白剤を含有してもよく、さらに、一定の腸管部分でのみ、またはそこで優先的に、活性成分を場合によって遅延して放出する組成物であってもよい。使用することができる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびろうが含まれる。
本発明の化合物の局所または経皮投与のための剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチが含まれる。無菌条件下で、活性成分を、薬学的に許容できる担体および必要な防腐剤または必要ならば緩衝剤と混合する。眼科用処方物、点耳薬および点眼薬も、本発明の範囲内と考える。加えて、本発明は、体への化合物の制御輸送をもたらすという付加的な利点を有する経皮パッチを使用することも考えている。適切な媒体に化合物を溶解または分散させることにより、このような剤形を製造することができる。吸収増強剤を使用して、皮膚を介しての化合物の流入を高めることもできる。速度制御膜を用意するか、化合物をポリマーマトリックスまたはゲルに分散させることにより、この速度を制御することができる。
前記で検討したように、本発明の化合物は、抗癌剤として有用であるので、腫瘍細胞を死滅し、腫瘍細胞の成長を阻害することにより、癌の治療で使用することができる。通常、本発明の抗癌剤は、これらに限られないが、幾つか挙げると、乳癌、脳腫瘍(brain cancer)、皮膚癌、子宮頚癌、大腸および直腸癌、白血病、肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、すい臓癌、前立腺癌および胃癌を含む癌および他の増殖性障害の治療で使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗癌剤は、白血病細胞および黒色腫細胞に対して活性であるので、白血病(例えば、球性または慢性形態の骨髄性、リンパ性、前骨髄球性、骨髄急性およびリンパ芽球性白血病)および悪性黒色腫の治療で使用することができる。さらに他の実施形態では、本発明の抗癌剤は、充実性腫瘍に対して活性であり、さらに、多剤耐性細胞(MDR細胞)を死滅させるか、かつ/またはその成長を阻害する。いくつかの実施形態では、本発明の抗癌剤は、他の知られている抗新生物剤に対して耐性があるか、他の知られている抗新生物剤に臨床的に応答しないことが判明している癌に治して活性である。他の実施形態では、本発明の抗癌剤は、他の抗新生物微小管安定化剤(例えば、パクリタクセル)に耐性がある癌に対して活性である。
本発明の化合物および医薬組成物は、併用療法で使用することができる、即ち、本化合物および医薬組成物を、1種または複数の他の望ましい療法または医学的手順と同時に、その前に、それに続いて投与することができることは、認められるであろう。組合せ法で使用するための治療(療法または手順)の特定の組合せは、望ましい療法および/または手順の相容性および達成される望ましい治療効果を考慮する。使用される複数の治療が、同じ障害に関して望ましい効果を達成してもよいし(例えば、本発明の化合物を、他の抗癌剤と同時に投与することができる)、異なる効果を達成してもよい(例えば、副作用の制御)ことは、認められるであろう。
例えば、本発明の本発明による抗癌剤と組み合わせて使用することができる他の治療または抗癌剤には、手術、放射線(いくつか挙げると、少ない例ではあるが、γ線、中性子ビーム放射線療法、電子線療法、プロトン療法、密封小線源療法および全身放射線同位元素)、内分泌療法、生体応答調節(いくつか挙げると、インターフェロン、インターロイキンおよび腫瘍壊死因子(TNF))、過高熱および凍結療法、副作用を和らげる薬剤(例えば、制吐薬)および、これらに限られないが、いくつか挙げると、アルキル化剤(メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イフォスファミド)、代謝拮抗物質(メトトレキセート)、プリンアンタゴニストおよびピリミジンアンタゴニスト(6-メルカプトプリン、5-フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン)、紡錘体阻害剤(ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタクセル、ドセタキセル)、ポドフィロトキシン(エトポシド、イリノテカン、トポテカン)、抗生物質(ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン)、ニトロソウレア(カルムスチン、ロムスチン)、無機イオン(シスプラチン、カルボプラチン)、酵素(アスパラギナーゼ)およびホルモン(タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミドおよびメゲストロール)を含む他の認められている化学療法薬が含まれる。最新の癌治療に関するさらに包括的な検討に関しては、その内容が全て、参照により本願明細書に援用されるhttp://www.nci.nih.gov/、http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htmのFDA承認腫瘍薬リストおよびThe Merck Manual,Seventeenth Ed.1999参照。
さらに他の態様では、本発明はさらに、本発明の医薬組成物の1種または複数の成分を充填された1個または複数個の容器を備えた薬剤パックまたはキットを提供し、いくつかの実施形態では、これは、併用療法として使用するための付加的に認められる治療剤を含む。場合によって、このような容器には、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形態の注意書きが備えられており、この注意書きは、人に投与するための製造、使用または販売に関する政府機関による承認を反映している。
以下の代表的な実施例は、本発明を詳述することを意図したものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、そのように解釈されるべきものでもない。実際に、本願明細書に示され、記載されているものに加えて、本発明の様々な変更および多くの他の実施形態が、以下の実施例を含む本文献の内容全ておよび本願明細書で引用された科学および特許文献の参照から、当技術分野の専門家には明らかであろう。さらに、先行技術を詳述するために、引用されている参照文献の内容を、参照により援用することは、認められるべきである。次の実施例は、様々なその実施形態およびその同等の形態で本発明を実施する際に適用することができる重要な付加的情報、例示および指針を含んでいる。
(実施例1:ヌードマウスに移植したヒト腫瘍の治療における26-トリフルオロ-9,10-トランス-デヒドロ-エポチロンDの経口および非経口投与)
本実施例においては、6時間i.v.注入または経口によって投与した場合に、構造的にデザインした16員環マクロライド微小管安定化剤、26-トリフルオロ-9,10-トランス-デヒドロ-エポチロンDが、腫瘍を縮小し、腫瘍を消失させ、および、長期間再発しないことが達成されることを求める。大きなサイズの腫瘍を有するマウス(図6)またはタキソール耐性腫瘍異種移植片を有するマウス(図7)が、単剤療法としての26-トリフルオロ-9,10-トランス-デヒドロ-エポチロンDを用いて治療できることを示す。治療可能な範囲は、白血病だけでなく、乳癌、大腸癌、および肺癌を含む(図6、9および13)。本明細書において報告する全てのin vivo化学療法薬実験は、免疫欠損ヌードマウスでヒト腫瘍異種移植片を用いて実施した。この動物モデルは、癌患者の臨床試験の前に、抗癌化合物を評価するのに一般的に使用される。
MX-1およびHCT-116実験を、それぞれ5.5ヶ月および6.5ヶ月続けた(図6および9)。両方の実験において、治療の休止後に、それぞれ3.8および5.2ヶ月間腫瘍が存在せず、如何なる腫瘍の再発も見られなかった。HCT-116での実験については(図9)、20mg/kgでのパクリタクセルおよび26-トリフルオロ-9,10-トランス-デヒドロ-エポチロンDの両方を使用し、腫瘍の消失が両方で達成された。しかしながら、治療後に、パクリタクセル治療群では1.1ヶ月後に再発したのに対して、26-トリフルオロ-9,10-トランス-デヒドロ-エポチロンDを用いて治療した動物は、5.2ヶ月を超えて腫瘍が存在しなかった。腫瘍が二倍になる時間が4日であることを考慮すると(賦形剤で処理したコントロールに基づく)、パクリタクセルで処理したHCT-116腫瘍は、99.7%の腫瘍抑制または2.56-logの細胞死滅をもたらしたのに対して、実験を終了させた時、MX-1およびHCT-116実験における26-トリフルオロ-9,10-トランス-デヒドロ-エポチロンDによる細胞死滅は、それぞれ、>8.5-logおよび>11.6 logであった。治療前のレベルに体重が戻った治療マウスの健康で活性な状態に基づけば、更なる治療または付加的な治療サイクルを実施するならば、マウスの2年の寿命にわたって「治癒」を保障することができることが予期される。「治癒」は、完全な免疫を有するマウスよりも免疫不全マウスにおいて達成することがより困難であるという事実にもかかわらず、この結果は、達成することができるであろう。我々の知識によれば、これは、生医学文献におけるヌードマウスで実施された最も長い異種移植片を用いた研究であり、単独の抗腫瘍剤についての非経口または経口投与のいずれかを用いて報告された最も長く完全な鎮静である。腫瘍増殖を抑制する化合物を見出すことが比較的容易であると言及することは的を得ている。しかし、腫瘍を縮小させる化合物を見出すことは比較的珍しいことである。全てのマウスにおいて、5.2ヶ月もの長期間の間、再発すること無しに完全な腫瘍消失を達成し、治療薬開発についての優れた潜在力を示す我々の化合物、26-トリフルオロ-9,10-トランス-デヒドロ-エポチロンDを用いた知見は、我々の知識によれば、以前に全く報告されていない。
経口治療の更なる重要な利益は、重篤なアレルギー反応を引き起こすクレモフォール処方物の使用を避けることができることである。タキソール、desoxy-EpoB、および15-aza-Epo13の処方物におけるクレモフォールの使用が、煩わしいアレルギー応答を誘導し、このアレルギー応答には、抗ヒスタミン剤および/またはステロイド剤を用いた全治療を必要とすることが知られている。
26-トリフルオロ-9,10-トランス-デヒドロ-エポチロンDの経口有効性は、in vitroでのマウス血漿およびヒト肝臓ミクロソームS9フラクションにおける顕著な代謝安定性と一致する。この代謝安定性は、エポチロン分子のC-26部位での三フッ素化が原因である(図14)。C9-C10に二重結合を導入することによっても、代謝安定性を増大する(図14)。i.v.注入(20-30mg/kg, Q2D)および経口投与(20mg/kg, QDまたは30mg/kg Q2D)についての26-トリフルオロ-9,10-トランス-デヒドロ-エポチロンDの適した投与量が近似していることは、この化合物が良く吸収され、in vivoでの優れた生物学的利用能を有することを示唆する。
異種移植片に対するFludeloneの我々のin vivo治療研究の多く(図13、7、9、10、11および16)が、病院において現在使用されている最も重要な癌治療剤の1つであるタキソールと並行して実施したことは、着目する価値がある。タキソールと比較したFludeloneを用いた高度な知見は、癌治療についてのこの化合物の前途有望な可能性を示す。
材料および方法
化学.全てのエポチロンを本願明細書で示すように合成した。パクリタクセル(タキソール(登録商標))および硫酸ビンブラスチン(VBL)は、Sigmaから購入した。これらの化合物を全て、in vitroアッセイのためにジメチルスルホキシドに溶かした(生理用食塩水に溶かしたVBLを除く)。in vivo研究のために、全てのエポチロンおよびパクリタクセルを、クレモフォール/エタノール(1:1)賦形剤に溶かし、次いで、生理食塩水で希釈して、カスタムデザインのミニカテーテルを使用して尾静脈を介して6時間iv注入した(T.-C.Chouら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001,98,8113-8118;T.C.Chouら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,15798-15802;それぞれ、参照により本願明細書に援用される)。薬剤の経口投与は、化合物をエタノールに溶かして、等容量のTween-80を用いて懸濁して調製し、この懸濁液を、ヌードマウスへの投与前に5倍容量の生理食塩水で希釈した。チューブによる注入は、1mlのシリンジおよびゲージ#22のボールチップ動物飼育用針(Popper&Sons, Inc. New Hyde Park, NY)を用いて実施した。
腫瘍および細胞系.CCRF-CEMヒトリンパ芽球性白血病細胞およびそのビンブラスチン耐性サブライン(CCRF-CEM/VAL100, 720倍耐性)を、Illinois大学(Chicago)のDr.William Beckから得て、CCRF-CEM/タキソール(44倍耐性)は、CCRF-CEM細胞を、増加させた致死濃度(IC50-IC90)のパクリタクセルに6ヶ月曝して調製した。耐性の程度を図14に示す。ヒト乳癌(MX-1)、ヒト肺癌細胞(A549)およびヒト大腸癌(HCT-116)は、American Type Culture Collection(ATCC,Rockville,MD)から得た。
動物. nu/nu遺伝子を有する無胸腺マウスを、NCI,Frederick,MDから得て、全てのヒト腫瘍異種移植片のために使用した。20〜22g重量以上、6週齢以上のオスのヌードマウスを使用した。薬物は、手作りの注入ミニカテーテルおよび保持管を使用して、尾静脈を介してiv注入により6時間で投与した。マルチトラックを備えたプログラム可能なHarvard PHD2000シリンジポンプをiv注入のために使用した。クレモフォール/エタノール(1:1)中の各薬物での通常の6時間注入容量は、生理食塩水2.0mL中100μlであった。経口投与については、Fludeloneおよびタキソールの両方をエタノールに溶かし、Tween-80で5倍希釈した。タキソール溶液は、沈殿を避けるために5分以内に使用するべきである。キャリパーを使用して、長さ×幅×高さ(または幅)を測定することにより、腫瘍容量を評価した。実験の間の腫瘍保持ヌードマウスでは、体重とは、全重量-腫瘍重量のことである。National Institute of Health Guide for the Care and Use of Animalsに関するガイドラインおよびMemorial Sloan-Kettering Cancer Center's Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコルに従い、全ての動物実験を行った。
細胞毒アッセイ. in vitro細胞毒アッセイを調製する際に、細胞を1ミリリットル当り2〜5×104細胞の当初密度で培養した。これらを、5%CO2-加湿大気中、37℃で、ペニシリン(100単位/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL、GIBCO/BRL)および5%熱不活性化FBSを含有するRPMI培地1640(GIBCO/BRL)に保持した。単層で成長する充実性腫瘍細胞では(HCT-116およびA549など)、スルホロダミンB法を使用することにより、96ウェルマイクロタイタープレート中で、薬物の細胞毒性を決定した(Skehanら、J.Natl.Cancer.Inst.1990,82,1107-1112;参照により本願明細書に援用される)。懸濁液中で成長させた細胞では(CCRF-CEMおよびその亜系など)、2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-カルボキサニリド)-2H-テラゾジウムヒドロキシド(XTT)微小培養法(D.A.Scudieroら、Cancer Res.1988,48,4827-4833;参照により本願明細書に援用される)を使用して、96ウェルマイクロタイタープレート中で、細胞毒性を二重に測定した。いずれの方法でも、各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーで測定した(Power Wave XS,Bio-Tek,Winooski,VT)。各薬物の6から7種の濃度からの用量効果関係データを、コンピュータープログラムを使用することにより50%有効プロットで二重に分析した(T.-C.Chou,M.Hayball.CalcuSyn for Windows,Multiple-drug dose effect analyzer and manual.Biosoft,Cambridge Place,Cambridge,UK(1997);参照により本願明細書に援用される)。
マウスおよびヒト肝臓S9フラクションでのエポチロンの安定性. Prospekt-2(Spark Holland,オランダ)試料調製システムおよびAgilent 1100 HPLCシステムから構成された、十分に自動化されたHPLCシステムを用いて安定性研究を実施した。簡単には、Prospekt2は、C8抽出カートリッジを備え、これをアセトニトリルおよび水で洗浄する。37℃に設定されたAgilentオートサンプラーは、サンプル20μlを取り出し、これを、カートリッジに載せ、水で洗浄し、次いでProspekt-2は、移動相流を抽出カートリッジを介して、ガードカラムを備えた分析カラムReliance Stable Bond C8 4×80mm(MacMod,Chadds Ford,PA)の上に移し、溶離剤を250nmでモニターした。移動相は、0.4ml/分で53または65%のアセトニトリル/0.1%のギ酸からなるので、該当する化合物の保持時間は、約6分間であった。試料調製は、全容量400μlで等容量の血漿をPBSに加え、濾過し、基質(20mM)の0.5〜2μLを加えて、HPLC分析中250nmで約30〜50mAUを達成することを必要とした。プールしたヒト肝臓ミクロソームS9フラクション(Xeno Tech,Lenex,KS)では、S9フラクション20μl(400μg)をPBS280μlと混合し、次いで、前記のように処理した。サンプリング期間を、オートサンプラーにより制御し、ピーク面積データを、親化合物の消失速度と比較して補正した。
(結果)
ヒト白血病細胞、タキソール-およびビンブラスチン-耐性白血病細胞、ならびに充実性腫瘍細胞に対するin vitroでの構造活性相関
ヒト白血病細胞CCRF-CEM、ならびにそのビンブラスチン耐性亜系CCRF-CEM/VALおよびパクリタクセル耐性亜系CCRF-CEM/Taxolの増殖に対する12の代表的なエポチロンのIC50(μM)の観点による有効性を、図17の表に示す。また、ヒトの2つの充実性腫瘍細胞系:肺癌A549および大腸癌HCT-116についてのIC50値も示す。deH-EpoBは、最も潜在的なエポチロンとしてEpoBに取って代わることが示された。また、i)dEpoB、dEpoF、またはF3-dEpoFの9,10-デヒドロ-修飾は、常に有効性の顕著な増加を示すのに対して、C-26部位での三フッ素化は、幾分有効性を減じさせたが、代謝安定性は三フッ素化によって非常に増加すること(図14);およびii)大部分のエポチロンは、多剤抵抗性(MDR)のP-糖タンパク質についての典型的な基質であるビンブラスチンと交差耐性を示さず、タキソールとも交差耐性を示さないことが示された。タキソールは、MDR表現型にとって良好な素材であるが、タキソール耐性は、チューブリン遺伝子における変異によって生じさせることができる。例外は、ビンブラスチンおよびパクリタクセルの両方に相当な交差耐性を示す15-aza-EpoB、15-aza-deH-dEpoBである。dEpoFおよびその誘導体は、ビンブラスチンと幾分かの交差耐性を示すが、パクリタクセルと交差耐性を示さない。iii)白血病細胞CCRF-CEMおよび充実性腫瘍細胞A549およびHCT-116は、エポチロンに対してほとんど等しく感受性である。iv) 更なる薬理学的評価ための我々の新規のリード化合物であるF3-deH-dEpoB、deH-dEpoBおよびdeH-EpoBは、ビンブラスチンに対してほとんど交差耐性を示さず、パクリタクセルに対してもほとんど交差耐性を示さない。
初期の研究においては(Schiffら、(1979) Nature (London) 277,665頁-667頁; Mengら、(1997): J.Am.Chem.Soc. 119,2733頁-2734頁;それぞれは、参照により本願明細書に援用される)、エポチロン分子が、3つの領域に分けることができることが結論付けられた。それゆえ、C-1〜8アシル領域においては、構造的な変化は、in vitro細胞毒性および微小管安定化能の観点からは容認されない。このことは、構造のかなりの修飾が容認されるC-9〜15 O-アルキル領域およびC-15ペンダントアリール領域とは対照的である(Haarら、(1996) Biochemistry 35,243頁-250頁;Kowalskiら、(1997)J.Biol. Chem. 272,2534頁-2541頁;それぞれは、参照により本願明細書に援用される)。
EpoBおよびdeH-EpoBなどの12,13-エポキシ部分を有するエポチロンをエポチロンシリーズの中で最も有効な薬剤であるが、最大許容用量でかなり芳しくない治療指数を有する。この仮説は、図14の表に示す治療データで例証される。
エポチロン誘導体の物理化学的、代謝的、薬学的特性および治療結果
エポチロンシリーズの間接的に関連した異なる特性によって、リード化合物のための治療における最終結果の一因となる要因の理解が容易になる。図14における表は、9つのエポチロン誘導体のプロファイルを要約する。in vitroでの構造-細胞毒性活性相関によって、有効性に基づく最初の評価を提供する。例えば、新規のクラス9,10-デヒドロ修飾は、in vitroおよびin vivoでの有効性を非常に増大させた。これらの前もって選んだ化合物において、構造-微小管安定性の有効性を相関させることはより困難である。なぜならば、その有効性は全て、非常に高いからである(すなわち、パクリタクセル有効性と類似している)。水可溶性および脂溶性は、治療効果において様々な役割を果たし、処方物のデザインにとって重要であろう。DeH-dEpoF、F3-deH-dEpoFおよびdeH-dEpoBは、他のエポチロンと比較して、非常に水溶解性が増加した。F3-deH-dEpoFが経口で有効であるという知見によって、薬剤処方物における水-不溶性の心配が減少し、クレモフォールが引き起こすアレルギーでの使用を避けることができる。
in vitroにおいて、deH-EpoB、deH-dEpoF、EpoBおよびdeH-dEpoBは、この順番で、ナノモル濃度以下のIC50を有するのに対して、F3-deH-dEpoF、dEpoF、F3-deH-dEpoB、dEpoBおよびF3-dEpoBは、この順番で、1.3から9.3nMの範囲のIC50を有する(図17)。deH-EpoBおよびEpoBは、in vitroおよびin vivoで最も有効なエポチロンであるが、最も良好な治療指数を示すわけではない。死をもたらさない最大-体重の低下パーセントにおけるより低い値から明らかなように、明らかに、EpoBおよびdeH-EpoBのC-12〜13のエポキシ部分が、宿主に対する毒性に非常に貢献している(図14)。対照的に、F3-deH-dEpoBおよびdEpoBは、最も高い体重低下を示し、全ての動物において完全な腫瘍緩和などの優れた治療結果を示した。一般的に、in vitro有効性および適した治療用量により、6hr-i.v.注入での治療の良好な相関関係は明らかである。特に興味がもたれるのは、リストされたエポチロンの中で、F3-deH-dEpoB(Fludelone)は、最も広い治癒的な治療用量範囲(10-30mg/kg)(Chouら、(2003) Angew Chem.Int.Ed.Engl. 42, 4726頁-4767頁;参照により本願明細書に援用される)、優れた代謝安定性および最も良好な総合的な治療結果を有することである(図14)。更にその上、F3-deH-dEpoBは、経口投与経路を介して治癒的な治療効果を提供する。最も有効なエポチロンは、必ずしも、抗腫瘍剤としてより良好に作用しなくともよく、F3-deH-dEpoBが、治療的な開発のためのリード候補物であることを結論付ける。
非常に大きなMX-1腫瘍異種移植片の治療
図6Aに示すように、体重の3.4%に相当するMX-1異種移植片の、腫瘍移植後22日目から開始したF3-deH-dEpoBを25mg/kg、Q3Dx5、6hr-i.v.注入を用いた治療によって、顕著な腫瘍の縮小(>97.4%)をもたらした。治療をしなかった9日間の休憩期間(34日目〜43日目)の間は、腫瘍サイズが縮小し続け(>99.3%)、研究した5匹のマウスのうち2匹で腫瘍が消失したのに対して、治療群の体重は、同じ休憩期間の間に治療前のレベルに回復した(図6B)。43日目の治療再開(Q3Dx4)によって、50日、50日および51日目に残った3匹のマウスにおいても腫瘍の消失がもたらされた。52日目後に(すなわち最後の投与の日)、実験が終了する165日目まで、3日ごとにマウスを観察した。全ての5匹のマウスにおいて、165日目まで(すなわち、治療の休止後3.7ヶ月にわたって)腫瘍の再発は見られなかった。
25日、31日、37日、43日および52日目に撮影した、この実験のヌードマウス(対照群および治療群のマウスを1匹ずつ)の写真を図6Bに示す。
経口投与を介したFludeloneによるMX-1異種移植片の治癒的癌治療
図13Aに示すように、2日間ごとに30mg/kgで経口的に7回投与したF3-deH-dEpoBによって、4匹のマウスのうちの2匹で、MX-1腫瘍縮小および腫瘍消失がもたらされた。更なる二回の投与(投与をとばした後の)によって、4匹のマウスのうちの4匹で腫瘍消失がもたらされた。対照的に、同じ投与および同じスケジュールでのタキソールの経口投与によっては、MX-1腫瘍増殖は抑制したが、腫瘍縮小はもたらされなかった。タキソールの最後の投与後の二日間(36日目)で、66.9%の腫瘍抑制が誘導された。F3-deH-dEpoB治療によっては、穏やかではあるが永続的な体重減少がもたらされ、最大で15%の体重減少がもたらされた(図13B)。タキソール治療によっては、ほとんど体重変化がもたらされず、タキソールの経口投与は、薬剤代謝不活性または乏しい生体利用能が原因で、明らかに適した治療ではないことが示唆された。経口投与と対照的に、我々の以前の研究で(Chouら、(2001) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 98, 8113頁-8118頁;参照により本願明細書に援用される)、MX-1腫瘍に対する、6hr i.v.注入を介した20mg/kgでのタキソール治療によって、腫瘍縮小および腫瘍消失をもたらすことができた。
タキソール耐性CCRF-CEM/Taxol異種移植片に対するFludeloneの治癒的な治療効果
我々の最近の報告においては、(Chouら、(2003) Angew Chem.Int.Ed.Engl. 42, 4762頁-4767頁;参照により本願明細書に援用される)、我々は、タキソール耐性ヒト肺癌A549/Taxol(in vitroではパクリタクセルに対して44倍耐性)に対して、20mg/kg、Q2Dx7、6hr-i.v.注入したF3-deH-dEpoBによって、完全に腫瘍増殖抑制をもたらしたが、腫瘍消失にはいたらなかったことを示した。この度、我々は、他のパクリタクセル耐性異種移植片CCRF-CEM/Taxol(in vitroではパクリタクセルに対して44倍耐性)を使用した。図7に示すように、30mg/kg、Q2Dx7、6hr-i.v.注入したFludeloneによって、4匹のマウス中の2匹について、腫瘍消失がもたらされた。更なるQ2Dx5(1回投与をとばした後の)によって、4匹のマウス中の3匹で腫瘍消失がもたらされ、最終的な腫瘍抑制は99.8%であった(図7A)。投与量を15mg/kgに減少させると、2サイクルの治療後の5日目に、4匹のマウスのうち1匹のみで腫瘍消失が生じた。34日目での最終的な腫瘍抑制は、98.8%であった。20mg/kgのタキソールを用いた並行して行った実験によっては、腫瘍増殖抑制がもたらされたが、少しだけ腫瘍縮小がもたらされるか、全く腫瘍縮小がもたらされなかった。34日目での最終的な腫瘍抑制は、75.6%であった。
F3-deH-dEpoB(15mg/kgおよび30mg/kg)およびタキソール(20mg/kg)の両方で、一日おきの6hr-i.v.注入を介した7回の治療の最初のサイクルの間に、持続的に体重減少がもたらされた。22日目の治療をとばすことによって、全てのマウスにおいて直接的な体重増加がもたらされた。Q2Dx5での再度の治療の第二のサイクルによって、持続的に体重を減少させたが、試験した全てのマウスに死をもたらさなかった(図7B)。
Fludeloneによるヒト大腸癌HCT-116異種移植片に対する治癒的治療
図9Aに示すように、3サイクルの間、F3-deH-dEpoBを20mg/kgおよび30mg/kgまたはタキソールを20mg/kg、Q2Dx4、6hr-i.v.注入することによって、4匹のマウスのうち4匹で腫瘍消失した。治療を、腫瘍移植後9日目に開始した。1回目と2回目のサイクルの間の17日目に一回の投与をとばし、2回目と3回目のサイクルの間の27日目と29日目に二回の投与をとばした。9日目から37日目を3サイクル治療期間とし、37日目から200日目をフォローアップ期間とした。実験を、マウスの平均寿命の四分の一より長い200日間続けた。
30mg/kgのF3-deH-dEpoBについては、21日目、23日目、33日目および41日目に腫瘍が消失し、20mg/kgのF3-deH-dEpoBについては、31日目、35日目、41日目および45日目に腫瘍が消失した。両方のF3-deH-dEpoB投与については、実験を終了した200日目では、4匹のマウスのうち4匹ともに腫瘍の再発が見られなかった。20mg/kgのタキソールについては、20mg/kgのF3-deH-dEpoBでの観察と同じように、33日目、33日目、41日目および45日目に腫瘍が消失した。しかしながら、タキソール治療群では、腫瘍再発が、71日目、75日目、81日目および81日目に生じた。
休息時間を含む治療のスケジュールは、マウスの体重減少および健康状態によって影響を受ける。30mg/kgのF3-deH-dEpoB治療については、最大の体重減少は、治療の2回目のサイクルの最後で生じた(すなわち、29日目)30%であるが、死はもたらさなかった(図9B)。20mg/kgのタキソールと20mg/kgのF3-deH-dEpoBについての体重減少および回復は、似たパターンおよび規模を示した。
(実施例2:Fluedelone(F3-deH-dEpoB)の作用メカニズムの決定およびEpoDの作用メカニズムとの違い;これら差異の治療的意味)
ヒトの多発性骨髄腫(MM)および非ホジキンリンパ腫(NHL)腫瘍細胞系における薬剤感受性
MMは、2002年には15,500の新たな診断ケースと>15,000の死亡をもたらし、全ての癌の1%および血液学的悪性腫瘍の10%の割合を示す。伝統的な化学的療法を用いたMMの治療は治癒的ではなく、約3年間の平均生存期間である(Barlogieら、“Treatment of multiple myeloma” Blood 2004; 103:20頁-32頁;参照により本願明細書に援用される)。造血肝細胞を用いた高投与量の化学療法では、完全な鎮静化速度および無症候生存率の増加をもたらすが、ほとんどの患者が再発し、サルベージ治療のオプションの重要な必要性が要求される。パクリタクセルは、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫を治療するために使用されている(Millerら、“Paclitaxel as the initial treatment of multiple myeloma: an Eastern Cooperative Oncology Group Study (E1A93)” Am.J.Clin.Oncol. 1998;21:553頁-556頁;Jazirehiら、“Resveratrol modifies the expression of apoptotic regulatory proteins and sensitizes non-Hodgkin’s lymphoma and multiple myeloma cell lines to paclitaxel-induced apoptosis” Mol.Cancer Ther. 2004;3:71頁-84頁;これらはそれぞれ、参照により本願明細書に援用される)。しかしながら、この適用は、その高い毒性および多剤耐性が原因で、制限されていた。我々は、10-プロパルギル-10-デアザアミノプテリン(PDX)(Wangら、“Active of a novel anti-folate (PDX, 10-propargyl-10-deazaaminopterin) against human lymphoma is superior to methotrexate and correlates with tumor RFC-1 gene expression” Leukemia & Lymphoma 2003, 44:1027頁-1035頁)、抗-テロメアーゼ(Wangら、“Telomerase inhibition with an oligonucleotide telomerase template antagonist: in vitro and in vivo studies in multiple myeloma and lymphoma” Bllod 2004;103:258頁-66頁;参照により本願明細書に援用される)および抗-VEGFR Mab(Wangら、“Targeting autocrine and paracrine VEGF receptor pathways regresses human lymphoma xenographs in vivo” Blood, in press;参照により本願明細書に援用される)を含む、新規の治療の評価のためのNOD/SCID異種移植片モデルにおける多くの最近の研究で使用されているヒトMMおよびNHL系に対して、FludeloneおよびdEpoBを評価した。FludeloneおよびdEpoBの療法は、骨髄腫およびリンパ腫細胞増殖を顕著に阻害することができた。骨髄腫細胞系は、FludeloneおよびdEpoBに非常に感受性であって、非常に低いIC50を有するのに対して、2つのNHL系は、Fudaloneの投与で阻害され、これは、MMでの効果よりも5-10倍高かった(表2-1)。
正常な骨髄基質細胞(HS-27AおよびHS-5系)では、これらの化合物に対して相対的な耐性を示し、このことはFludeloneおよびdEpoBがMMにおいて安全な治療濃度域を有することを示す(表2-1)。Fludeloneは、MM細胞系に対してdEpoBよりも〜5倍有効であるのに対して、両方の薬剤は、正常な骨髄基質細胞に対しては適応できる毒性を有していた。ヒト胎児肺繊維芽細胞(MRC-5)は、dEpoBおよびFluに対して感受性であるが、これらの非常に感受的な細胞を用いても、Fluを用いた明確な治療濃度域は明らかである。FludeloneおよびdEpoBは骨髄腫およびリンパ腫細胞を、G2M期で停止させ(図18)、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する(図19および20)。我々は、骨髄腫において、アポトーシスを誘導するのに必要なin vitroでの薬剤曝露時間を評価した。1、2、4、8および24時間のパルス曝露を行い、薬剤を洗い流し、48時間までインキュベーションを続けた。FludeloneまたはdEpoBのいずれかへ細胞を24時間曝露することによって、48時間までに全ての細胞が死滅した(図21)。dEpoBの場合、4-8時間の曝露では、細胞がゆるやかに増加したが、Fludeloneへの曝露では、同じ時間で、インプットからの細胞の数が〜50%まで減少した。dEpoBへの1時間の曝露では減少させることができたが、48時間にわたって腫瘍細胞増殖を防ぐことはできなかったのに対して、Fluの場合は、腫瘍数を50%まで減少させることができた(図21)。FludeloneおよびdEpoBは、パクリタクセルとともに、短い間の曝露後に、細胞内の微小管の質量を明らかには変えることなく、腫瘍細胞における微小管束の形成を増大する能力を有する(図22)。その後に(〜24時間)、微小管を分裂させ、細胞アポトーシスを引き起こす。患者の骨髄から得た一次CD138MM細胞に対するFludeloneおよびdEpoBの比較において、我々は、dEpoBではなくFludaloneが、24時間以内に腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することを見出した。
ヒトの充実性腫瘍細胞系の薬剤感受性
FludeloneおよびdEpoBのIC50を、ヒトの充実性腫瘍系(大腸、乳腺および卵巣)の一団について求めた(表2-1)。あらゆる場合に、FludeloneのIC50は、dEpoBのIC50よりも低かった。特に、卵巣癌系ではFludeloneに感受性であり、卵巣系の4/5が1.6nMの平均IC50を有していたのと比較して、dEpoBを用いた場合の平均IC50は16.5nMであった。両方の薬剤は、腫瘍細胞をG2M期に停止させ(図23)、迅速にアポトーシスを誘導した(図24および25)。
それぞれのIC50の×10でdEpoBまたはFludeloneを用いた処理後6および8時間でのRPMI-8226骨髄腫細胞系の全体的な遺伝子発現
RPMI-8226ヒト多発性骨髄種細胞系におけるディシャレンシャルな遺伝子発現の全体的な遺伝子発現(Affymetric chip-AU133 2.0)比較を、dEpoBおよびFludeloneを用いた処理後(×10 IC50投与量)6または18時間で実施した。対照である非処理細胞とFludelone-処理RPMI-08226の比較において、6時間で5つの遺伝子が上方制御され(表2-2)、18時間で48の遺伝子が上方制御された(表2-3)。JUNは、両方の時間で上方制御された(+3.25、+2.64)。6時間で3つの遺伝子が下方制御され(表2-2)、18時間で6つの遺伝子が下方制御された(表2-3)。HNRPD(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like)は、両方の時間で下方制御された(-2.46、-3.25)。対照である非処理細胞とdEpoB-処理RPMI-08226の比較において、6時間で21の遺伝子が上方制御され(表2-2)、18時間で26の遺伝子が上方制御された(表2-3)。JUN(+5.66、+3.77)およびTublin α3(+2.64、+2.30)は、両方の時間で上方制御された。6時間で、3つの遺伝子が下方制御され(表2-2)、18時間で16の遺伝子が下方制御された(表2-3)。HNRPDは両方の時間で下方制御された(-4.92、-2.00)。その後、我々は、Fludelone対dEpoBによって変更した遺伝子発現を比較した(表2-2および2-3)。
6時間で、Fludeloneによって5つの遺伝子が、dEpoBによっては21の遺伝子が上方制御され、3つの遺伝子が両方で上方制御されたのに対して、Fludeloneによって3つの遺伝子が、dEpoBによっては4つの遺伝子が下方制御され、両方で下方制御された遺伝子は存在しなかった。18時間で、Fludeloneによって48の遺伝子が、dEpoBによっては26の遺伝子が上方制御され、18の遺伝子が両方で上方制御されたのに対して、Fludeloneによって16の遺伝子が、dEpoBによっては7つの遺伝子が下方制御され、6つの遺伝子が両方で下方制御された。dEpoBおよびより初期のエピセロンを超えるFludeloneの増加した抗腫瘍効果は、微小管安定化に加えて更なる付加的な幾つかの腫瘍標的化メカニズムが原因であるという仮説を試験するという提案がなされた。それゆえ、我々は、どの遺伝子が、dEpoBで処理したMM細胞と比較した場合に、Fluによってディファレンシャルに上方制御または下方制御されるかを求めた(表2-4)。
6時間で、2つの遺伝子が上方制御され、18時間で、1つの遺伝子が上方制御された。6時間で、10の遺伝子が下方制御され、18時間で、7つの遺伝子が下方制御され、両方の時間で4つの遺伝子が下方制御された(IFI27(-7.46、-5.28)、GIP3(-6.06、-5.28)、IFTMI(-4.00、-3.25)、MX-1(-2.00、-2.30))。これらは、全て、インターフェロン-誘導性遺伝子である。卵巣1A9および1A9PTX22卵巣異種移植片の遺伝子発現プロファイルについて、パクリタクセル処理後24時間で、IFN応答遺伝子(G1P3、IFI27、IFITM1、IFII6、ISG15)の減少した発現を示すことが報告されている(Baniら、“Gene expression correlating with response to paclitaxel in ovarian carcinoma xenografts” Mol.Cance Thera. 2004;3:111頁-121頁;参照により本願明細書に援用される)。これらの遺伝子のうちの3つ(G1P3、IFI27、IFITM1)は、RPMI-8226細胞のdEpoB処理後6時間で強力に過剰発現したが、Fludeloneでは発現せず、そして、これらは、また、その発現がFludelone遺伝子プロファイルとdEpoB遺伝子プロファイルを最も良く区別する遺伝子でもある。最近、IFN-応答性遺伝子(例えばIFR9)の過剰発現が、腫瘍細胞系におけるパクリタクセルに対する耐性と関連付けされており、この知見は、パクリタクセルへの応答において、IFNそれ自身以外のIFNシグナルのメディエイターが関与している可能性を支持する(Lukerら、“Overexpression of IRF9 confers resistance to antimicrotubule agents in breast cancer cells” Cancer Res. 2001;61:6540頁-7頁;参照により本願明細書に援用される)。抗微小管形成剤への耐性の発達におけるIRF9の新規なIFN-非依存的役割は、乳癌および子宮癌の半分で明らかに報告されている(Lukerら、“Overexpression of IRF9 confers resistance to antimicrotubule agents in breast cancer cells” Cancer Res. 2001;61:6540頁-7頁;参照により本願明細書に援用される)。eEpoAまたはタキソール-耐性である腫瘍系のマイクロアレイ分析によって、タキソール-耐性腫瘍ではなくてEpoA-耐性腫瘍において高く発現している遺伝子の大部分は、インターフェロン-誘導性遺伝子をコードしていることが示された(Atadjaら、“Gene expression profiling of epothiloe A-resistant cells” Novartis Found Symp. 2002;243:119頁-32頁;参照により本願明細書に援用される)。著しいことに、我々は、RPMI-8226のdEpoB処理に続いて上方制御された全ての遺伝子の8/21(38%)が、IFN-誘導性であり、これらの全てがFlu処理によっては変化しないことを見出した(表2-2から2-4)。
以下のIFN-誘導性遺伝子は、dEpoBでの6時間または18時間処理後において8226MM細胞で上方制御されたが、Fludelone処理では変化しなかったことが示された。dEpoBに続く上方制御の程度の順番で、以下にそれらの遺伝子を示す。
1.)インターフェロン(IFN)α-誘導性IFI27(+18.83増加)。この遺伝子は、炎症性皮膚疾患、上皮性癌および創傷修復において上方制御される未知の機能のスモールインターフェロン-α-誘導性遺伝子のファミリーに属する(Suomelaら、“Interferon alpha-inducible protein 27 (IFI27) is upregulated in Psoriatic skin and certain epithelial cancers” J Invest. Dermatol. 2004;122:717頁-721頁;参照により本願明細書に援用される)。
2.)IFNα-誘導性タンパク質(クローンIFI-6-16)GIP3(Baniら、“Gene expression correlating with response to paclitaxel in ovarian carcinoma xenografts” Mol.Cance Thera. 2004;3:111頁-121頁;参照により本願明細書に援用される)(+5.28増加)。
3.)IFN-誘導性膜貫通タンパク質-1、IFTM1(Baniら)。
4.)ミクソウイルス耐性、IFN誘導性、MX1(6時間で+2増加、18時間で+2.3増加)。MX1遺伝子は、インフルエンザウイルスに対して先天性の耐性を付与する(Staeheli、Ad.Viral Res. 38:147頁、1990;参照により本願明細書に援用される)。これらは、また、恐らくはGTP-結合タンパク質として、基本的細胞機能をもたらす(Arnheiter HおよびMeier E. “Mx proteins: antiviral proteins by chance or necessity?” New Biol. 1990;90 851頁;参照により本願明細書に援用される)。
5.)リン脂質スクランブラーゼ1遺伝子PLSCR1.この遺伝子の転写制御は、完全に、最初のエキソンに位置する1つのIFN-刺激性応答エレメントによって制御される(Zhouら、“Transcriptional control of the human plasma membrane phospholipid scramplase 1 gene is mediated by interferon-alpha” Blood 2000;95:2593頁-2599頁;参照により本願明細書に援用される)。PLSCR1は、プラズマ細胞膜リン脂質のリモデリングおよびホスファチジルセリンの細胞表面への移動に関与していると考えられている。上昇した細胞内Ca++に曝露された損傷したまたはアポトーシス細胞において見出されるプラズマ細胞膜リン脂質の迅速な二膜横断移動に貢献しているかもしれない。研究により、細胞核へ転移でき、転写因子として作用することができることも示されている(Ben-Efraimら、“Phospholipid Scramblase 1 is imported into the nucleus by a receptor-mediated pathway and interacts with DNA” Biochem. 2004;43:35181頁;参照により本願明細書に援用される)。
6.)テトラコペプチドリピートを有するインターフェロン-誘導性タンパク質、IFITI(+2.3増加)。この遺伝子は、全身性エリトマトーデスと関連しており、タンパク質-タンパク質研究により、Rho/Racグナニンヌクレオチド交換因子と相互作用することによってRhoタンパク質が活性化することができることが示された(Yeら、“Protein interaction for an interferon-inducible syste-3526mic lupus associated gene, IFIT1” Rheumatology 2003;42:1155頁-63頁;参照により本願明細書に援用される)。
7.)2’-5’-オリゴアデニル化シンテターゼ-2、OAS2(+2増加)。インターフェロン-誘導性遺伝子のこのファミリー(OAS1、OAS2、OAS3、OAS4)は、ストレス応答に関与していると考えられ、感染の抗-ウイルス活性にとって重要である(Chebath、Nature 330:587頁、1987;Meursら、J.Virol. 66:5804頁、1992;これらのそれぞれは、参照により本願明細書に援用される)。OAS2は、アデノシンオリゴマーの合成を触媒する(2-5A)。そのあと、これらがRNase L、大部分の哺乳類細胞が潜在的に存在するエンドリボヌクレアーゼを活性化し、次々に、ウイルス(ピコルノウイルス、例えば、メンゴウイルス)および細胞RNAを不活性する(Andersonら、J.Biochem. 2004;271:628頁-36頁;参照により本願明細書に援用される)。
8.)組織適合性クラスII DPα1、HLA-DPA1(+2増加)。MHC-クラスIIは、IFNの生物学的機能のメディエーターとして知られている(Tissotら、“Molecular cloning of a new Interferon-induced factor that represses human immunodeficiency virus Type 1 long terminal repeat expression” J.Biol.Chem. 1995;270:14891頁-14898頁;参照により本願明細書に援用される)。
まとめ
CAG骨髄腫細胞系は、両方の表現型(CD38+CD138+CD45-)およびin vivo移植を有する臨床的に多発性の骨髄腫の多くの特徴を呈する。異種移植片NOD-SCID骨髄腫マウスモデルは、融合HSV-TK-eGFP-ルシフェラーゼ遺伝子で組み替えた一千万〜一千五百万のCAG細胞の静脈内注入によって確立した。それゆえ、ルシフェラーゼのバイオルミネスセンスによるマウス全体のイメージングによって、生きたマウスで非侵入的にリアルタイムで腫瘍の量および薬剤の効果を評価することができる。骨髄腫マウスは、腫瘍注入してから7から20日後に、骨髄炎症および病的な溶骨性骨病変を示す。腫瘍細胞の移植後には、マウスを無作為に選び、賦形剤対照、dEpoBおよびFludelone処理群に分けた。dEpoBおよびFludeloneの両方の投与は、20mg/kgであり、薬剤を、腹腔内経路で投与した。投与回数の平均は、処理の最初の30日の間で、dEpoBについては10回であり、Fludeloneについては12回であった。加えて、Velcade(6.25ug/マウス、i.v)の5回の投与を、35から45日の間に、Fludeloneで最初に処理した7匹のマウスのうち3匹に行なった。結果は、Fludeloneで処理した骨髄腫マウスは、バイオルミネスセンスによるイメージングを用いた評価では、dEpoBで処理したマウスおよび対照に対して、顕著に腫瘍量が減少していた。全ての対照マウスは、処理開始後30日間で死滅したが、Fludelone処理マウスは、対照よりも少なくとも二倍の生存期間を有していた。対照とdEpoB処理マウスの間の生存に差異は存在しなかった。プロテアソーム阻害剤Velcadeとの組み合わせにより、脊柱および大腿に位置する腫瘍が、大幅に減少することができ、このことは、この組み合わせが、骨髄の微小環境保護下であっても骨髄腫細胞を攻撃することができることを示す。
以前のデータでは、エポチロンで処理した骨髄腫細胞が典型的なアポトーシス特徴を呈することが示されていた。カスパーゼがこの過程に関与しているかどうかは明らかではない。第一に、我々は、骨髄腫細胞において、ウェスタンブロットにより、カスパーゼ3(カスパーゼ経路でのエフェクターカスパーゼ)の活性化を調べた。dEpoBまたはFludelone処理のいずれかを用いると、骨髄腫細胞は、その活性と関連する17kdの切断カスパーゼ3が増加することが示された。切断カスパーゼ3に特異的な抗体を使用したCAG骨髄腫細胞の免疫組織染色を、アポトーシス細胞における、細胞質および核周囲での局在化特性を示すのに使用した。これらのデータによって、カスパーゼがエポチロン処理細胞において活性化されることが確認された。第二に、我々は、蛍光分析によって、カスパーゼ8および9(カスパーゼ経路でのイニシエーターカスパーゼ)の活性のアッセイを試みた。再度、カスパーゼ8および9の両方が、骨髄腫細胞において増大することが見出された。増加したカスパーゼ9の活性は、カスパーゼ8よりも顕著であったことに着目せよ。カスパーゼ8または9の活性化を誘導するシグナルが、活発に研究されている。
造血幹細胞に対する薬剤毒性は、常に、重大な関心事項である。ヒトのCD34+幹細胞を臍帯血から単離し、dEpoBまたはFludelone単独のいずれかで24時間インキュベートした。薬剤を洗浄後、アポトーシスアッセイおよび2週間のprogenitor assayを行なって、幹細胞へのエポチロンの影響を評価した。我々のデータは、non-cycling幹細胞に対してdEpoBおよびFludeloneは顕著な毒性を有さないことを示した。
(実施例3:(E)-9,10-デヒドロエポチロン:マウス異種移植片モデルにおいて非常に有望な特性を有する新規のクラスの微小管安定化抗腫瘍剤)
通常の16員環を含む26-F3[16]dEpoB(2)を、27-F3[17]ddEpoB(19)の合成で使用した方法に関連した高度に集中的な方法を介して達成することができる。この方法は、以下に示す閉環複分解反応を介した9,10-オレフィンの形成が予期される(RCMを介した複雑なセッティングにおける複素環化の早期の例としては、Sinha, S.C.;Sun, J.Angew.Chem.Int.Ed.2002, 41,1381頁を参照せよ;参照により本願明細書に援用される)。我々は、28および29のE-9,10-オレフィンの化学選択的還元がdEpoB(1)および望む26-F3-dEpoB(2)をもたらすであろうことを予想した。RCM前駆体は、エステル化反応を介して2つのフラグメント(21または24)と123の結合によって調製した。カップリングパートナーである123は、C8位の二級メチル基の間の(化合物18の我々の早期の経路に見られる)メチレンスペーサー基の除去によって構築した。前記したように、スキップしたジエン配置を含む17員環のエポチロン(18を参照)が有するin vitroレベルの知見から、類似の16員環のラクトンセッティングのこのようなジエンの生物学的結果の対応する研究の必要性が強調される。dEpoBにおけるcis 12,13-オレフィンの存在を考えると、このようなスキップしたジエンは、9,10-二重結合を必ず含む。
容易に合成された三フッ素およびメチルアリルヨウ化物(それぞれ、8および124)を用いたオキサゾリジノン7のアルキル化(Leeら、J.Am.Chem.Soc. 2001, 123, 5249頁;参照により本願明細書に援用される)によって、高いジアステレオマー過剰率で、適切な絶対配置となるC15立体中心が得られる(生成物9または125を参照)(Evans, D.A.; Mrrissery, M.M.; Dorow, R.L. J.Am.chem.Soc. 1985,107,4346頁;Paterson, I.; Bower, S.; McLeod, M.D. Tetrahedron Lett. 1995,26,175頁;これらそれぞれは、参照により本願明細書に援用される)。後者は、求核的メチル化(MeMgBr)および適切なHorner Wittigオレフィン化によって、24および21への途中で、対応するWeinrebアミド(Nahmら、Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815頁;Levinら、Synth.Commun. 1982, 12, 989頁;これらそれぞれは、参照により本願明細書に援用される)、それゆえ、126および42へと変換される(Lythgoeら、Tetrahedron Lett. 1975, 40, 3863頁;Lythgoe, Chem.Soc.Rev. 1981, 449頁;Tohら、J.Org.Chem. 1983, 48, 1414頁;Baggioliniら、J.Org.Chem. 1986, 51, 3098頁;これらそれぞれは、参照により本願明細書に援用される)。キラル補助基のようなオキサゾリジノンの使用が、Evansらが先駆けであるのに対して(Evansら、J.Am.Chem.Soc. 1985, 107, 4346頁;Patersonら、Tetrahedron Lett. 1995, 36, 175頁;これらそれぞれは、参照により本願明細書に援用される)、アルキル化(水酸化よりもむしろ)による、光学的に活性なグリコレートの合成への適用は、いまだ開発されていなかった。
ポリプロピオネートフラグメント25の合成は、C3、C6およびC7立体中心の相対配置を確立する2つの重要なアルドール反応によって可能であった。第一のアルドール反応は、Rocheアルデヒド31と、エチルケトンのZ-エノレート30との反応を含み(Cohenら、Org.Chem. 1976, 41, 3505頁;Nagaokaら、Tetrahedron 1981, 37, 3873頁;Roushら、J.Am.Chem.Soc. 1990, 112, 6348頁;これらそれぞれは、参照により本願明細書に援用される)、高いジアステレオ選択性で、望む32が得られる。この合成によって可能となった、31に頼ることは、鏡像純粋な開始物質の獲得の解決に必要であった初期のアルデヒドの使用を超える、重要な利点である。
C7-アルコールの保護に続くアセタールの加水分解により、望むアルデヒド34が得られ、第二のアルドール反応の段階へと進む。DuthalerのDAG(ジアセトングルコース)Ti-エノレート(Duthalerら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 1989, 28, 495頁;参照により本願明細書に援用される)と34の反応により、非常に高い(>95%)ジアステレオ選択性で、望むヒドロキシ tert ブチルエステル35が得られる。後者は、その後、直接的な工程において、望む酸25へと変換される。
アリルアルコール24、21およびC1-C9酸フラグメント25を、EDCIエステル化プロトコールを介して結合し、RCM前駆体26および27をぞれぞれ供給した。26および27の閉環複分解反応を、トルエン中でRCM触媒を使用して実施した(Schollら、Tetrahedron Lett. 1999, 40, 2247; Grubbsら、Acc.Chem.Res. 1995, 28, 446; Trnkaら、Acc.Chem.Res. 2001, 34, 18; Alkene Metathesis in Organic Chemistry編集:Furstner, A.; Springer, Berlin, 1998; Furstner, A. Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 2000, 39, 3012; Schrock, Top.Organomet.Chem. 1998, 1, 1;これらはそれぞれ、参照により本願明細書に援用される)。これらの反応は、実際に、トランス異性体39aおよび40aを提供する。しかしながら、主要な産生物は、明らかな代替的RCM経路から生じた39aおよび40bであった。これら望ましくないRCM異性体は、約3:1の比率で、望む39aおよび40aを超えて有意を占めていた。最後に、HF-ピリジンを用いた39aおよび40aのシリルエーテルの保護により、望むE-9,10-デヒドロ-エポチロン28へと誘導した(Whiteら、J.Am.Chem.Soc. 2001, 123, 5407; Whiteら、J.Am.Chem.Soc (Addition/Correction) 2003, 125, 3190;これらはそれぞれ、参照により本願明細書に援用される)。厳格に証明された構造の化合物28を用いて、驚くべきことに、そのスペクトル特性は、同じ化合物であると予期された化合物で以前に報告されたスペクトル特性と一致しないことを見出した。以前に28とアサインした化合物の実際の構造を、新たに再評価した。思い返せば、28は以前に調製できていなかったことは明らかであり、実際に、本願明細書で報告する(E)-9,10-デヒドロエポチロン全体のファミリーは、新規の属である。計画通り、後者を、E-9,10-オレフィンのジイミド還元を介して、dEpoB(1)および26-トリフルオロ-dEpoB(2)へと変換した(Coreyら、Tetrahedron Lett. 1961, 347; Pastoら、Org.React. 1991, 40, 91;これらはそれぞれ、参照により本願明細書に援用される)。
対応する方法によって、我々は、9,10-デヒドロ-dEpoF(57)を合成した。以下を参照せよ。E-9,10-オレフィンの選択的ジイミド還元により、前記した様々な合成中間対の構造が確認され、これにより、文献における以前のアサイメントの再評価を進めた。
細胞培養セッティング(Supplemental Edition参照)における合成類自体(28、29および57)の試験によって、これらが、様々な感受性腫瘍細胞系およびMDR腫瘍細胞系において、我々の最新の臨床候補物dEpoB(1)によって示される有効性よりも、より強い有効性を有することが明らかになった。一連の様々な薬剤耐性腫瘍にわたるエポチロン28、29および57によって示される目覚しい細胞増殖阻害により、これら(E)-9,10同属体の血漿安定性を測定することが促された。(E)-10,11-デヒドロ-dEpoB(Epo490)が非常に乏しい血漿安定性を示したことが思い出された。実際に、Epo490(6)の更なる開発が行き詰ったのは、この血漿不安定性のためである。対照的に、マウス血漿への28、29および57の暴露により、我々はdEpoB(1)と比較して非常に遅い薬剤分解であることを見出した(約7倍)。この安定性は、epo490(6)は言うに及ばずdEpoB(1)と比較しても、薬剤の生体利用性の側面から、実質的に有用な性質である。(E)-9,10-デヒドロ誘導体28および29の予備細胞培養および薬物動態解析に基づけば、これらをin vivo試験に進めることは適切であろう。このような研究は、当然に、in vitro測定よりも、より強度な薬剤生体利用性が必要である(Rivkinら、J.Am.Chem.Soc. 2003, 125, 2899; Chouら、Angew.Chem.Int.Ed. 2003, 42, 4761-4767; Yoshimuraら、Angew.Chem.Int.Ed. 2003, 42, 2518-2531;これらはそれぞれ、参照により本願明細書に援用される。代替的な有効なエポチロン類自体は以下を参照せよ:Altmannら、Bioorg.Med.Chem.Lett. 2000, 10, 2765; Nicolaouら、Chem.Biol., 2000, 7, 593;これらはそれぞれ、参照により本願明細書に援用される)。
この必要性、および、数グラム量の9,10-デヒドロ誘導体の調製についての更なる開発のための実際に起こり得る最終的な必要性により、我々の合成経路全体の重要な再構成が促された。当然のことながら、1つ最も重要な問題は、マイナーな生成物として39b、40bおよび56をもたらす26、27および54のRCM反応であった。主要経路は、26、27および54のO-アルキル部分に厳密に制限されるRCM反応を含み、主として望まない39bおよび40bに導かれる。したがって、RCMに続いて、(オレフィンによって)チアゾールの導入を引き伸ばすことを試みることに決めた(下記参照)。
数グラムスケールで最終的に調製可能となることを我々のゴールとして、RCM反応へと導入するアルキルおよびアシルフラグメントの合成を再構築した。以下に示すように、化合物86は容易に合成された。この化合物は、高いジアステレオマー過剰率で、オキサゾリジノン7をアルカリ化するために使用した。OTES基の脱保護および求核性メチル化に続き、化合物90を得た。このα-ヒドロキシケトンは、全ての重要なRCMを調製するための、中心のエステルの形成におけるアシル基アクセプターとして機能するであろう。明らかに心配なのは、アシルアクセプターとしての、部分的なラセミ化または位置異性体α-ケトール転換への、このようなヒドロキシケトンの攻撃の受けやすさであった。
酸フラグメント25の我々の早期の合成における重大な問題は、非常に費用がかかり、C3位で望むS-立体配置を産生するために、Duthaler chemistry(Duthalerら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 1989, 28, 495:参照により、本願明細書に援用される)が技術的に要求された。この問題を回避するために、如何なるキラル助剤も存在しない状況でアルドール反応を実施し、対応するβ-ヒドロキシケトンの1:1混合物を提供した。Noyori条件(Noyoriら、J.Am.Chem.Soc. 1987, 109, 5856;参照により本願明細書に援用される)を使用して、得られたケト官能基(化合物69参照)の非対称な還元を制御する試薬によって、高いジアステレオマー過剰率で、C3位に望むS立体配置を産生した。新たに利用可能なβ-ヒドロキシエステル70を、より初期のプロトコールに従ったいくつかの工程を経て、酸25へと転換した(Chouら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2001, 98, 8113;参照により本願明細書に援用される)。
得られたヒドロキシケトン43および44の、C1-C9酸フラグメント25を用いたエステル化によって、C15位での顕著なラセミ化は生じることなく、対応するRCM環状化前駆体45および46を提供し、または、最初のα-ケトール結合の完全性が喪失する。45および46の閉環複分解反応を、トルエン中でRCM触媒を使用して実施した(Schollら、Tetrahedron Lett. 1999, 40, 2247; Grubbsら、Acc.Chem.Res. 1995, 28, 446; Trnkaら、Acc.Chem.Res. 2001, 34, 18; Alkene Metathesis in Organic Chemistry編集:Furstner, A.; Springer, Berlin, 1998; Furstner, A. Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 2000, 39, 3012; Schrock, Top.Organomet.Chem. 1998, 1, 1;これらはそれぞれ、参照により本願明細書に援用される)。これらの反応は、今や代替的な複分解経路によって複雑ではなくなり、トランス異性体47および48のみが高収率で提供された。Wittig反応を介したチアゾール部分の導入は、高いE/Z選択性と収率で進行し、2つのシリルエステルの脱保護を介して、28および29が提供された(Hindupurら、Tetrahedron Lett. 2000, 2, 7341;参照により本願明細書に援用される。チアゾールの導入についてAveryの方法の適用の試みはによっては、望む生成物が、低い収率および乏しいE/Z選択性で得られた)。この経路は、ラージスケール合成に適する。
我々は、エポチロンB(51、EpoB)のC9-C10オレフィンの導入が、12,13デスオキシのように、同じ方向に、その生物学的プロファイルを変更するかどうかを検討した。この目的に向けて、我々は、2,2’-ジメチルジオキシラン(DMDO)を用いた28のエポキシド化を研究した。その反応は、実際に、より置換されたC12-C13オレフィンで、高度に化学選択的に進行した。(E)-9,10-デヒドロエポチロンB(49)およびα-12,13-オキシランを有するそのジアステレオマー(構造は示さない)が、比率1:2.6、87%の収率で得られた。49(C12およびC13での立体配置は、EpoBを提供する反応によって構築される)を用いたin vitro研究によって、様々な細胞系で、現存のEpoB(51)よりも約2-4倍有効であることが明らかになった。化合物49が最も有効なエポチロンであると証明されたにも関わらず、我々は、計画において、異種移植片における狭い治療指数だけではなく、更なる前臨床開発を断念させた困難な入手性(上記参照)に直面した。興味深いことに、天然に存在しないα-オキシランは実質的に活性を有していなかった。
再構築した前記(第二産生)合成の更なる利点は、様々な複素環を、ケトン中間体39aおよび40aを介して導入することができることである。この点は、9,10-デヒドロ-dEpoFの合成によって浮き彫りになる。適切なホスホニウムイリドを用いたケトンのWittig反応により、望む9,10-デヒドロ-dEpoB化合物57および59が、高収率および高いE/Z選択性を持って得られた。更にその上、我々は、以下に示す幾つかの工程で、21-ヒドロキシ59を、C21位にアミノ官能基を含むタイプ96および96誘導体へと効率的に変換することができた。
完全に合成したエポチロン類似体を、それらの抗腫瘍有効性を求めるために、様々な細胞タイプに対して評価した。
我々の知見の最も顕著な特徴を以下に記す:C12-C13 β-エポキシドのE-12,13二重結合による置換によって、約10分の1の損失が予期される(感受性CCRF-CEM細胞系におけるEpoBおよびdEpoBの比較)。他の予期としては、Z12,13-オレフィンに加えてE-9,10二重結合の導入により、幾つかの細胞系にわたって、細胞毒性が顕著に増加することが挙げられる。
更なる他の有益な傾向を、12-トリフルオロ-E-9,10-デヒドロ-dEpoB(29)(Fludelone)と、対応するE-9,10-デヒドロ化合物28との比較において見出した。C26位への3つのフッ素原子の導入により、(1)に比較して、4倍まで細胞毒性を減少させた。12-トリフルオロメチル官能基の減少効果は、また、9,10-不飽和が欠如した化合物においても見出せる(dEpoB(1)および12-トリフルオロ-dEpoB(2)を比較)。
これらのデータ、および化学合成を介したこれら9,10-デヒドロ化合物(12-トリフルオロ同属体を含む)を考慮し、我々の最も前途有望な化合物でin vivo実験を開始する立場にあった。我々は、本明細書において、化合物29(Fludelone)を用いた特に著しく前途有望な結果を記載する。この結果は、臨床評価への進展に最も期待できる可能性として現れた。in vivo実験を、免疫欠損ヌードマウスにおけるヒトの腫瘍異種移植片を使用して実施した。全ての不完全性のために、腫瘍学におけるこのようなモデルは、臨床開発への途上における、抗腫瘍リード化合物の有効性を評価するのに広く使用されている(Fiebig, H.H.; Berger, D.P.; Preclinical Phase II trial. In: Boven, E. and Winograd, B., Editors, The Nude Mouse In Oncology Research, CRC Press, Boca Raton (1995), 318;参照により本願明細書に援用される)。
顕著なことに、30mg/kgのFludelone投与によるMX-1異種移植片の処理によって、完全に腫瘍が消失し、治療の中止後2ヶ月にわたり、如何なる再発も生じなかった(図6A参照)。最も重要なことに、これらの治療的成功は、6hr-i.v.注入または経口投与の何れかで達成することができた(図6Aおよび10Aを参照)。一方、タキソールの経口投与によるMX-1異種移植変の治療では、腫瘍に影響を及ぼさなかった(図6Bおよび10Aを参照)。ヒトの臨床セッティングへと移行するならば、経口活性の達成が極めて有用であることは言うまでも無い。
タキソール-耐性腫瘍異種移植片(図7A)およびヒト大腸癌(HCT-116、図9A)は、i.v.注入により、Fludeloneを用いて治療することができる。ヌードマウスにおけるヒト乳癌(MX-1)およびヒト大腸癌(HCT-116)異種移植片を使用した実験を、それぞれ6.0ヶ月および6.6ヶ月続けた。治療終了後、それぞれ、4.3ヶ月および5.3ヶ月の間、実験中に腫瘍の再発は見られなかった。HCT-116実験については、20mg/kgでタキソールおよびFludeloneを比較し、両方で腫瘍の消失が達成された。タキソール処理群は、処理終了後、1.1ヶ月で再発したのに対して、Fludelone処理マウスは5.3ヶ月にわたり、腫瘍は存在しなかった。
これらの結果には、異種移植変の使用した特に長く綿密な治療研究が含まれ、1つの抗腫瘍剤の非経口および経口投与により、顕著に長い期間の完全な緩和が報告された。
実験:
一般的な薬学的方法:
腫瘍および細胞系.CCRF-CEMヒトリンパ芽球性白血病細胞およびそのビンブラスチン耐性サブライン(CCRF-CEM/VAL100, 720倍耐性)を、Illinois大学(Chicago)のDr.William Beckから得て、CCRF-CEM/タキソール(44倍耐性)は、CCRF-CEM細胞を、増加させた致死濃度(IC50-IC90)のパクリタクセルに6ヶ月曝して調製した。ヒト乳癌(MX-1)、ヒト肺癌細胞(A549)およびヒト大腸癌(HCT-116)は、American Type Culture Collection(ATCC,Rockville,MD)から得た。
動物.無胸腺マウスを、NCI,Frederick,MDから得て、全てのヒト腫瘍異種移植片のために使用した。メスのヌードマウスについて指摘する以外は、20〜22g重量以上、6週齢以上のオスのヌードマウスを使用した。薬物は、手作りの注入ミニカテーテルおよび保持管を使用して、尾静脈を介してiv注入により6時間で投与した。マルチトラックを備えたプログラム可能なHarvard PHD2000シリンジポンプをiv注入のために使用した。クレモフォール/エタノール(1:1)中の各薬物での通常の6時間注入容量は、生理食塩水2.0mL中100μlであった。経口投与については、Fludeloneおよびタキソールの両方をエタノールに溶かし、Tween-80で5倍希釈した。タキソール溶液は、沈殿を避けるために5分以内に使用するべきである。キャリパーを使用して、長さ×幅×高さ(または幅)を測定することにより、腫瘍容量を評価した。腫瘍保持ヌードマウスでは、実験の間の体重とは、全重量-腫瘍重量のことである。National Institute of Health Guide for the Care and Use of Animalsに関するガイドラインおよびMemorial Sloan-Kettering Cancer Center's Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコルに従い、全ての動物実験を行った。
細胞毒アッセイ. in vitro細胞毒アッセイを調製する際に、細胞を1ミリリットル当り2〜5×104細胞の当初密度で培養した。これらを、5%CO2-加湿大気中、37℃で、ペニシリン(100単位/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL、GIBCO/BRL)および5%熱不活性化FBSを含有するRPMI培地1640(GIBCO/BRL)に保持した。単層で成長する充実性腫瘍細胞では(HCT-116およびA549など)、スルホロダミンB法を使用することにより、96ウェルマイクロタイタープレート中で、薬物の細胞毒性を決定した(Skehanら、J.Natl.Cancer.Inst.1990,82,1107-1112;参照により本願明細書に援用される)。懸濁液中で成長させた細胞では(CCRF-CEMおよびその亜系など)、2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-カルボキサニリド)-2H-テラゾジウムヒドロキシド(XTT)微小培養法(D.A.Scudieroら、Cancer Res.1988,48,4827-4833;参照により本願明細書に援用される)を使用して、96ウェルマイクロタイタープレート中で、細胞毒性を二重に測定した。いずれの方法でも、各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダーで測定した(Power Wave XS,Bio-Tek,Winooski,VT)。各薬物の6から7種の濃度からの用量効果関係データを、コンピュータープログラムを使用することにより50%有効プロットで二重に分析した(T.-C.Chou,M.Hayball.CalcuSyn for Windows,Multiple-drug dose effect analyzer and manual.Biosoft,Cambridge Place,Cambridge,UK(1997);参照により本願明細書に援用される)。
一般的方法: 特に記載のない限り、さらに精製することなく、市場供給者から得た試薬を使用した。以下の溶媒を、無水溶剤系(予め充填されたアルミナカラムを通過させた)から得て、さらに乾燥させることなく使用した:テトラヒドロフラン、塩化メチレン、ジエチルエーテル、ベンゼンおよびトルエン。トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジンおよび2,6-ルチジンは、水素化カルシウムから蒸留した。空気および水過敏性反応は全て、予め精製された窒素ガスまたはアルゴンガスの正圧下に火炎乾燥させたガラス製品中で行った。NMR(1Hおよび13C)スペクトルは、CDCl3(1Hでは7.27ppmおよび13Cでは77.0ppm)を参照して、それぞれ記載されているようにBruker AMX-400MHzまたはBruker Advance DRX-500MHzで記録した。赤外スペクトルは、Perkin-Elmer FT-IRモデル1600分光計で得た。旋光性は、JASCOモデルDIP-370デジタル偏光計で得た。低分解能(エレクトロスプレー)マススペクトルは、PESCIEX API 100で記録した。分析薄層クロマトグラフィーを、E.Merckシリカゲル60F254プレート上で行った。プレートをパラ-アニスアルデヒド溶液、エタノール溶解リンモリブデン酸、または硝酸アンモニウムモリブデン酸に浸漬させ、加熱することにより、UV活性を有さない化合物を可視化した。Whatman(登録商標)(LK6Fシリカゲル60A)TLCプレート上で記載の溶剤を使用して、分取薄層クロマトグラフィーを行った。シリカゲルクロマトグラフィーは、Davisil(登録商標)(grade 1740, type 60A, 170-400mesh)シリカゲルを用いて、指示されたように実施した。
ケミカルシフトは、クロロホルム(プロトンNMRではδ 7.24およびカーボンNMRではδ 77.0)に相対的なδ値で表す。
エチル4,4,4-トリフルオロアセトアセテート(24.0mL, 0.164mol)のTHF-水(3:1=V:V, 320mL)溶液に、室温で、臭化アリル(20.0mL, 1.4equiv)を添加し、その後、インジウム(粉末、-100mesh, 25g, 1.3equiv)を添加し、得られた混合物を48℃で15時間攪拌した。反応混合物を室温に冷却し、2N aq. HCl(400mL)でクエンチし、CH2Cl2(400mL, 2×200mL)で抽出した。混合した有機層を乾燥し(MgSO4)、ろ過し、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると(ヘキサン→ヘキサン-エーテル 10:1→8:1→6:1→4:1)、アルコールが、透明なオイルとして得られた(31.64g、収率85%)。
アルコールを揮発する。カラムクロマトグラフィー後、アルコールは完全には濃縮されなかった。収率を総重量から求め、生成物と溶媒の比率をNMRの積分値によって求めた。
アルコール(16.71g,0.07386mol)とピリジン(15.0mL, 2.5equiv)の混合物を-10℃に冷却し、塩化チオニル(11.3mL, 2.1equiv)でゆるやかに11分間に渡って処理した(黄色の沈殿物)。得られた混合物を55℃に加熱し(75℃で17時間加熱により、塩素化生成物の複雑な混合物が得られた)、12時間攪拌した。反応混合物を-5℃に冷却し、水(200mL)でクエンチし、CH2Cl2(2×200mL, 2×150mL)で抽出した。混合した有機層を、飽和NaHCO3(2×200mL)およびブライン(200mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると(ペンタン:エーテル 15:1)、エステルが、黄色のオイルとして得られた(11.90g、収率77%)。
エステルを揮発する。カラムクロマトグラフィー後、エステルは完全には濃縮しなかった。
冷却した(-75℃)エステル(7.12g, 0.0342mol)のCH2Cl2(120mL)溶液に、DIBAL-H(75mL, 2.2equiv)のCH2Cl2(1.0M)溶液を35分間かけて添加し、得られた混合物を室温に3時間加熱した。反応混合物を0℃に冷却し、飽和NaH4Cl(12mL)でクエンチし、室温で20分間攪拌した。反応混合物をエーテル(200mL)で希釈し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると(ペンタン:エーテル 3:1→1:1)、アルコールが、透明なオイルとして得られた(5.68g、収率99%)。
アルコール56を揮発する。カラムクロマトグラフィー後、56は完全には濃縮しなかった。
冷却した(0℃)アルコール(5.97g, 0.0358mol)のCH2Cl2(50mL)溶液を、PPh3(11.17g, 1.2equiv)、イミダゾール(3.55, 1.5equiv)およびI2(9.10g, 1.1equiv)で処理し(I2添加を最後にした)、得られた(黄色の濁った)混合物を0℃で10分間攪拌した。反応混合物を、飽和NaS2O3-飽和NaHCO3(1:1=V:V, 200mL)でクエンチし、ペンタン(3×200ml)で抽出した。混合した有機層を、飽和NaS2O3-飽和NaHCO3(1:1=V:V, 200mL)およびブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると(ペンタン)、ヨウ化物が、淡い赤色のオイルとして得られた(-78℃冷凍庫に保存)(6.69g、収率68%)。
ヨウ化アリルを揮発する。カラムクロマトグラフィー後、ヨウ化アリルは完全には濃縮しなかった。
α-ヒドロキシオキサゾリジノン.
冷却した(-78℃)TESで保護した4-ベンジル-3-ヒドロキシアセチル-オキサゾリジン-2-オン(16.28g, 1.92equiv)のTHF(160mL)溶液に、LHMDS(42.0mL, 1.73equiv)のTHF(1.0M)溶液を51分間かけて滴下し、得られた混合物を-78℃で35分間攪拌した。反応混合物をヨウ化アリル(6.69g, 24.2mmol)のTHF(10mL)溶液で15分間処理し、得られた混合物を一晩ゆるやかに室温に加温した。反応混合物をNaHCO3(200mL)でクエンチし、EtOAc(3×200mL)で抽出した。混合した有機層を、飽和NaH4Cl(150mL)、ブライン(150mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると(ヘキサン:EtOAc 6:1→3:1)、更なる精製無しに次の反応のために使用したアルキル化生成物(13.6g)の混合物を得た(ジアステレオマーはこの段階では分けなかった)。アルキル化生成物のHOAc-水-THF(3:1:1=V:V:V, 200mL)溶液を室温で4時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してHOAcを取り除き、飽和NaHCO3(400mL)で洗浄し、EtOAc(3×200mL)で抽出した。混合した有機層を乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると(ヘキサン:EtOAc 3:1→2:1)、α-ヒドロキシオキサゾリジノンが、透明なオイルとして得られた(二段階で7.55g、収率81%)。
α-ヒドロキシアミド.
(MeO)NHMe・HCl(10.1g, 5.25equiv)のTHF(100mL)懸濁液を、0℃で、AlMe3(50mL, 5.1equiv)のトルエン(2.0M)溶液を滴下して処理し、得られた透明な溶液を室温で34分間攪拌し、その後、冷却した(0℃)したα-ヒドロキシオキサゾリジノン(7.55g, 19.7mmol)のTHF(70mL)溶液にゆっくりと添加した(濁り→透明な薄い黄色)。得られた混合物を室温に加温し、12時間攪拌した。反応混合物を0℃に冷却し、1N aq.の酒石酸(100mL)をゆっくりと添加することによってクエンチし、室温で25分間攪拌し、EtOAc(3×200mL)で抽出した。混合した有機層を乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると(ヘキサン:EtOAc 2:1→1:1)、α-ヒドロキシアミドが、透明なオイルとして得られた(5.12g、収率97%)。
α-ヒドロキシケトン.
冷却した(0℃)α-ヒドロキシアミド(4.87g, 18.2mmol)のTHF(150mL)溶液に、MeMgBr(75mL, 12equiv)のエーテル(3.0M)溶液を添加した。5分後、反応混合物を飽和NH4Cl(250mL)でクエンチし、EtOAc(5×200mL)で抽出した。混合した有機層を乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると(ヘキサン:EtOAc 4:1→2:1→1:2)、透明なオイルとしてα-ヒドロキシケトン(2.16g、収率53%、回収した開始物質に基づいた収率73%)と、開始物質α-ヒドロキシアミド(1.30g、収率27%)が得られた。
この反応は、過剰量のMeMgBrにもかかわらず、完全ではなかった。
炭酸 1-(2-ベンジルオキシ-1-メチルエチル)-5,5-ジイソプロポキシ-2,4,4-トリメチル-3-オキソペンチルエステル 2,2,2-トリクロロエチルエステル.
7-ベンジルオキシ-5-ヒドロキシ-1,1-ジイソプロポキシ-2,2,4,6-テトラメチル-ヘプタン-3-オン(1.0g、2.4mmol)およびピリジン(0.8mL、7.3mmol)からなるCH2Cl2(10.0mL)中の溶液に0℃で、クロロギ酸2,2,2-トリクロロエチル(668.0μL、4.9mmol)を加え、次いで、この混合物を放置して、室温まで加温した。1時間後に、反応混合物をブラインでクエンチし、次いで、CH2Cl2で抽出した。混合した有機層をMgSO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサンからヘキサン/EtOAc 93:7へグラジエント)により精製すると、望む生成物(1.285g、92%)が澄明なオイルとして得られた。
炭酸 1-(2-ベンジルオキシ-1-メチルエチル)-2,4,4-トリメチル-3,5-ジオキソペンチルエステル 2,2,2-トリクロロエチルエステル.
開始物質(1.28g、2.25mmol)の4:1THF/H2O(25mL)溶液に、p-TsOH(111.0mg、0.6mmol)を加えた。70℃に5時間加熱した後に、反応混合物を、冷(0℃)飽和NaHCO3水溶液(12mL)に注ぎ、次いで、EtOAcで抽出した。混合した有機層をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサンからヘキサン/EtOAc 84:16へグラジエント)により精製すると、生成物(793.2mg、76%)が澄明なオイルとして得られた。
9-ベンジルオキシ-4,4,6,8-テトラメチル-3,5-ジオキソ-7-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルオキシ)ノナン酸tert-ブチルエステル.
LDAの溶液(1.17mmol、Et2O中0.3M)に-78℃で、酢酸t-ブチル(1.0mmol、135.0μL)を加えた。30分後に、開始物質(464.0mg、1mmol)のEt2O(2mL)溶液を15分かけて徐々に加えた。1時間攪拌した後に、反応を飽和NH4Cl水溶液でクエンチし、次いで、EtOAcで抽出した。混合した有機層をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサンからヘキサン/EtOAc 86:14へグラジエント)により精製すると、生成物(1:1エピマー混合物、461.4mg、80%)が澄明なオイルとして得られた。
開始物質(350.0mg、0.6mmol)の0℃のCH2Cl2(10.0mL)溶液に、Dess-Martinぺリオジナン(398.0mg、0.9mmol)を加えた。この混合物を室温で1時間攪拌し、次いで、1:1の飽和Na2S2O3/飽和NaHCO3のよく攪拌されている混合物に注いだ。30分後に、層を分離した。水性層を、Et2Oで3回抽出した。混合した有機抽出物を、飽和NaHCO3、ブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサンからヘキサン/EtOAc 91:9へグラジエント)により精製すると、生成物(258.4mg、74%)が澄明なオイルとして得られた。
9-ベンジルオキシ-3-ヒドロキシ-4,4,6,8-テトラメチル-5-オキソ-7-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルオキシ)-ノナン酸tert-ブチルエステル.
ボンベライナーに、(R)-RuBINAP触媒(16.8mg、10.0μmol)を充填した。HCl(555μL、MeOH中0.2N)を加え、次いで、この混合物15秒間ソニケーションを行った。次いで、開始物質(59.4mg、0.1mmol)のMeOH(555μL)溶液を加え、この混合物を、Parr装置に移した。溶液を、H2で5分間パージし、次いで、1200psiまで加圧した。17時間後に、反応を大気圧に戻し、飽和NaHCO3溶液に注いだ。水性層をEtOAcで3回抽出した。混合した有機抽出物をMgSO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサンからヘキサン/EtOAc 88:12へグラジエント)により精製すると、生成物(47.6mg、80%)が澄明なオイルとして得られた。
9-ベンジルオキシ-4,4,6,8-テトラメチル-5-オキソ-7-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルオキシ)-ノナン酸tert-ブチルエステル.
開始物質(37.6mg、6.3μmol)およびイミダゾール(9.4mg、13.8μmol)からなるDMF(0.4mL)溶液に0℃で、TESCl(11.6μL、69.3μmol)を加えた。3時間後に、混合物を飽和NaHCO3水溶液で希釈した。水性層をヘキサンで3回抽出した。混合した有機抽出物をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサンからヘキサン/EtOAc 93:7へグラジエント)により精製すると、溶離の順に、生成物(22.9mg、51%)が得られ、開始物質(12.9mg、34%)が澄明なオイルとして得られた。
9-ベンジルオキシ-3-(ジエチルメチルシラニルオキシ)-7-ヒドロキシ-4,4,6,8-テトラメチル-5-オキソ-ノナン酸tert-ブチルエステル.
開始物質(22.9mg、3.2μmol)の1:1THF/AcOH(1.4mL)溶液に、Zn(5.0mg、7.8μmol、ナノサイズ)を加えた。この混合物を15分間ソニケーションに供した。さらなるZn(5.0mg、7.8μmol、ナノサイズ)を加え、続いてさらに15分間ソニケーションに供した。懸濁液をセライトパッドで濾過し、EtOAcで複数回洗浄した。濾液を飽和NaHCO3、ブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、真空下で濃縮した。粗製生成物を、ヘキサン/EtOAc4:1で溶離させながらシリカゲルでの短いプラグに通過させると、生成物(収率99%)が無色のオイルとして得られた。
9-ベンジルオキシ-7-(tert-ブチルジメチルシラニルオキシ)-3-(ジエチルメチルシラニルオキシ)-4,4,6,8-テトラメチル-5-オキソ-ノナン酸tert-ブチルエステル.
開始物質(4.1mg、7.6μmol)および2,6-ルチジン(10.0μL、43.5mmol)からなるCH2Cl2(0.2mL)溶液に-78℃でTBSOTf(10.0μL、85.8mmol)を加えた。2時間後に、さらなる6-ルチジン(10.0μL、43.5mmol)およびTBSOTf(10.0μL、85.8mmol)を加えた。6時間後に、混合物を飽和NaHCO3水溶液で希釈した。水性層をEtOAcで3回抽出した。混合した有機抽出物をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製生成物をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサンからヘキサン/EtOAc 91:9へグラジエント)により精製すると、生成物(5.4mg、82%)が澄明なオイルとして得られた。分光データは、報告されていたデータとよく一致した。
酸およびアルコールを無水ベンゼン(5mL×2)で共沸蒸留し、反応前に高真空下で乾燥させた。アルコール(639mg、2.63mmol)のCH2Cl2(13mL)溶液に、EDCI(576mg、3.09mmol)およびDMAP(366mg、3.09mmol)を0℃で加えた。この混合物に、酸(1.11mg、1.88mmol)のCH2Cl2(2mL+すすぎ1mL)の溶液を0℃で16分かけて滴下した。0℃で1.5時間攪拌した後に、混合物を室温で3.5時間攪拌した。反応混合物を濃縮した後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/EtOAc=20:1から15:1)により精製すると、エステル(1.20g、1.61mmol、t-ブチルに対して86%)が無色のオイルとして得られた。
ジエン(26.9mg、36.1μmol)のトルエン(70mL)溶液を還流まで加熱し、Grubb's触媒(3.1mg、3.61μmol)のトルエン(2mL)溶液で処理した。混合物を25分間攪拌し、0℃に冷却し、シリカゲルパッドで濾過し、このパッドをヘキサン/EtOAc=2/1(300mL)ですすいだ。混合した濾液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/Et2O=40:1から15:2)により精製すると、望む生成物(9.9mg、13.8μmol、38%)およびシクロヘプタジエン(14.4mg、22.3μmol、62%)の両方が無色のオイルとして得られた。
Wittig反応:Wittig試薬(19.1mg、54.7μmol)のTHF(0.4mL)溶液に、KHMDS(トルエン中0.5Mの溶液109μL、54.7μmol)を0℃で加えた。混合物を0℃で0.5時間攪拌し、次いで、-78℃に冷却した。混合物に、ケトン(5.7mg、9.12μmol)のTHF(0.3mL)溶液を滴下し、生じた混合物を放置して1.5時間かけて-20℃まで加温した。反応を、飽和NH4Cl水溶液(2mL)でクエンチし、EtOAc(7mL×3)で抽出した。混合した有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濃縮した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/Et2O=10:1)により精製すると、オレフィンの分離不可能な混合物5.6mg(E/Z=9:1)が得られた。分取TLC(ヘキサン/Et2O=4:1)により混合物を精製すると、純粋な望む異性体(5.0mg、6.96μmol、76%)が無色のオイルとして得られた。
シリルエーテル(298.8mg、0.416mmol)のTHF(6.5mL)溶液に、プラスチックチューブ中でHP・ピリジン(3.2mL)を0℃で加え、混合物を室温で3時間攪拌した。0℃で、TMSOMe(30mL)を滴下することにより、反応をクエンチし、混合物を室温で3時間攪拌した。濃縮し、高真空下に乾燥させた後に、残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/EtOAc=1:1)により精製すると、アルコール(196.6mg、0.402mmol、97%)が無色の固体として得られた。
オレフィン(1.2mg、2.5μmol)およびトリスNHNH2(29.3mg、98μmol)からなるClCH2CH2Cl(0.7ml)溶液に50℃で、Et3N(13.7μL、98μmol)を加えた。反応をHPTLC(ヘキサン/EtOAC/CH2Cl2=1/1/2)によりモニターした。7時間攪拌した後に、混合物を室温に冷却し、EtOAcで希釈し、シリカゲルパッドで濾過し、このパッドをEtOAcですすいだ。濃縮した後に、残留物を分取TLC(ヘキサン/EtOAC/CH2Cl2=1/1/2)により精製すると、還元生成物(1.1mg、2.2μmol、91%)が白色の固体として得られた。この化合物のスペクトルデータは、dEpoBの報告されたデータと同じであった。
酸およびアルコールを無水ベンゼン(5mL×2)と共に共沸蒸留し、反応の前に高真空下で乾燥させた。アルコール(異性体の10:1混合物、240mg、0.756mmol)のCH2Cl2(5mL)溶液に、EDCI(192.7mg、1.01mmol)およびDMAP(122.8mg、1.01mmol)を0℃で加えた。混合物に、酸(314.6mmg、0.628mmol)のCH2Cl2(2mL+すすぎ1mL)溶液を15分かけて0℃で滴下した。0℃で2時間攪拌した後に、混合物を室温で2時間攪拌した。濃縮した後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/EtOAC=30:1から20:1)により精製すると、エステル(340.1mg、0.425mmol、酸に基づいて68%)が無色のオイルとして得られた。
ジエン(57.6mg、72.0μmol)のトルエン(142mL)溶液を還流まで加熱し、Grubbs触媒(6.1mg、7.20μmol)のトルエン(2mL)溶液で処理した。この混合物を28分間攪拌し、0℃まで冷却し、シリカゲルパッドで濾過し、このパッドをヘキサン/EtOAc=2/1(300ml)ですすいだ。混合した濾液を濃縮した後に、フラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/Et2O=40:1から15:2)により精製すると、望む生成物(12.0mg、15.5μmol、22%)およびシクロヘプタジエン(29.2mg、43.3μmol、60%)の両方が無色のオイルとして得られた。
シリルエーテル(1.78g、2.31mmol)のTHF(25mL)溶液に、プラスチックチューブ中でHF・ピリジン(12.5mL)を0℃で加え、この混合物を室温で4時間攪拌した。反応を、TMSOMe(80mL)を0℃で10分間かけて滴下することによりクエンチした。混合物を室温で2.5時間激しく攪拌した。濃縮し、2時間高真空下で乾燥させた後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2〜50g、ヘキサン/EtOAc=1:1)により精製すると、ジオール(1.20g、2.21mmol、96%)が無色の固体として得られた。
ジオール(1.22mg、2.24μmol)およびトリスNHNH2(26.7mg、89.6μmol)からなるClCH2CH2Cl(1ml)溶液に50℃で、Et3N(12.5μL、89.6μmol)を加えた。反応をHPTLC(ヘキサン/EtOAC/CH2Cl2=1/1/2)によりモニターした。6.5時間攪拌した後に、更なるトリスNHNH2(26.7mg、89.6μmol)およびEt3N(12.5μL、89.6μmol)を混合物に加えた。14時間攪拌した後に、混合物を室温に冷却し、EtOAcで希釈し、シリカゲルパッドで濾過し、このパッドをEtOAcですすいだ。濃縮した後に、残留物を分取TLC(ヘキサン/EtOAC/CH2Cl2=1/1/2)により精製すると、還元生成物(1.16mg、2.13μmol、94%)が白色の固体として得られた。
酸およびアルコールを無水ベンゼン(3mL×2)で共沸蒸留し、反応前に高真空下で乾燥させた。アルコール(68.0mg、0.173mmol)のCH2Cl2(1.3mL)溶液に、EDCI(37.8mg、0.197mmol)およびDMAP(24.1mg、0.197mmol)を0℃で加えた。この混合物に、酸(72.6mg、0.123mmol)のCH2Cl2(0.7mL)の溶液を0℃で5分かけて滴下した。0℃で1時間攪拌した後に、混合物を室温で2.5時間攪拌した。反応混合物を濃縮した後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/EtOAc=30:1)により精製すると、エステル(99.5mg、0.114mmol、t-ブチルエステルに対して92%)が無色のオイルとして得られた。
ジエン(69.7mg、79.5μmol)のトルエン(158mL)溶液を還流まで加熱し、Grubbs触媒(6.7mg、7.95μmol)のトルエン(2mL)溶液で処理した。この混合物を11分間攪拌し、0℃まで冷却し、シリカゲルパッドで濾過し、このパッドをヘキサン/EtOAc=3/1(280ml)ですすいだ。混合した濾液を濃縮した後に、フラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/Et2O=20:1から15:1)により精製すると、望む生成物(18.4mg、21.7μmol、27%)およびシクロヘプタジエン(28.3mg、45.5μmol、57%)の両方が無色のオイルとして得られた。
シリルエーテル(61.8mg、72.8μmol)のTHF(2mL)溶液に、プラスチックチューブ中でHF・ピリジン(1mL)を0℃で加え、この混合物を室温で3.2時間攪拌した。反応を、TMSOMe(15mL)を0℃で滴下することによりクエンチした。混合物を室温で2時間攪拌した。濃縮し、高真空下で乾燥させた後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/EtOAc=1:3)により精製すると、トリオール(32.4mg、64.1μmol、88%)が白色の固体として得られた。
クルードな酸(4.65g、7.27mmol)およびアルコール(2.18g、9.84mmol)を無水ベンゼンで共沸蒸留し、反応前に高真空下で20分間乾燥させた。アルコール(2.18g、9.84mmol)のCH2Cl2(65mL)溶液に、EDCI(2.09mg、10.9mmol)およびDMAP(1.33g、10.9mmol)を0℃で加えた。この混合物に、クルードな酸(4.65g、7.27mmol)のCH2Cl2(20mL+5mLのすすぎ)の溶液を0℃で20分かけて滴下した。0℃で40分間攪拌した後に、混合物を室温で4時間攪拌した。反応混合物を濃縮した後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2〜160g、ヘキサン/EtOAc=20:1)により精製すると、エステル(4.85g、6.87mmol、t-ブチルエステルに対して94%)が無色のオイルとして得られた。
ジエン(510.0mg、0.723mmol)のトルエン(500mL)溶液を還流まで加熱し、Grubbs'触媒(92.1mg、0.109mmol)のトルエン(10mL)溶液で処理した。混合物を還流下に17分間攪拌し、直ちに0℃に冷却し、0℃を維持して、その後、シリカゲルパッドで濾過した。ジエン(510.0mg、0.723mmol)の第2のバッチを、同様に処理した。混合した反応混合物をシリカゲルパッド(100g)で濾過し、このパッドをヘキサン/EtOAc=3/1(1.4L)ですすいだ。混合した濾液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2〜65g、ヘキサン/Et2O=10:1から5:1)により精製すると、マクロライド(742.4mg、1.10mmol、76%)が無色のアモルファスオイルとして得られた。
Wittig反応:ケトンをベンゼン(5mL×2)で共沸蒸留し、ついで、高真空下で0.5時間乾燥させた。Wittig塩(907mg、2.59mmol)のTHF(19mL)溶液に、t-BuOK(THF中1.0Mの溶液2.4mL、2.43mmol)を0℃で5分間かけて滴下した。混合物を0℃で0.5時間攪拌し、次いで、-78℃に冷却した。この混合物に、ケトン(1.10g、1.62mmol)のTHF(13mL)溶液を10分間かけて滴下し、生じた混合物を放置して、2時間かけて-20℃まで加温した。反応を飽和NH4Cl(15mL)水溶液でクエンチし、EtOAc(50mL×3)で抽出した。混合した有機層をブライン(20mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。残留物を、フラッシュクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/Et2O=20:1から10:1)により精製すると、望む16(E)-異性体(940mg、1.22mmol、75%)が望ましくない16(Z)-異性体(140.9mg、0.182mmol、11%)と共に、両方とも無色のアモルファスオイルとして得られた。
deH-dEpoB(12.2mg、24.9μmol)のCH2Cl2(1.25mL)溶液を-78℃に冷却し、DMDOの冷却溶液(-78℃、アセトン中0.06M、914μL、54.8μmol)で処理した。この混合物を放置して-50℃まで加温し、-50℃で2.7時間攪拌した。-50℃で、ジメチルスルフィド(117μL)を加えることにより、過剰なDMDOをクエンチし、この混合物をこの温度で0.5時間攪拌した。真空中で溶剤を除去した。分取薄層クロマトグラフィー(ヘキサン/EtOAc=1/2)により精製すると、β-エポキシド49(3.0mg、5.93μmol、24%)およびα-エポキシド50(7.9mg、15.6μmol、63%)が両方とも無色の固体として得られた。
エポキシド(0.7mg、1.38μmol)およびトリスNHNH2(20.6mg、69mmol)からなるClCH2CH2Cl(0.4mL)溶液に50℃で、Et3N(9.6μL、69mmol)を加えた。反応をHPTLC(ヘキサン/EtOAc=1/2)によりモニターした。6時間攪拌した後に、混合物を室温まで冷却し、EtOAcで希釈し、シリカゲルパッドで濾過し、これを、EtOAcですすいだ。濃縮した後に、残留物を分取TLC(ヘキサン/EtOAc=1/2)により精製すると、還元生成物(0.5mg、0.985μmol、71%)が白色の固体として得られた。この化合物のスペクトルデータは、EpoBの報告されているスペクトルデータと一致した。
エポキシド(14.0mg、27.7μmol)およびトリスNHNH2(165mg、0.544mmol)からなるClCH2CH2Cl(3.3mL)溶液に50℃で、Et3N(77.0μL、0.554mmol)を加えた。反応をHPTLC(ヘキサン/EtOAc=1/2)によりモニターした。6時間攪拌した後に、混合物を室温まで冷却し、EtOAcで希釈し、シリカゲルパッドで濾過し、これを、EtOAcですすいだ。濃縮した後に、残留物を分取TLC(ヘキサン/EtOAc=1/2)により精製すると、還元生成物(12.3mg、24.2μmol、87%)が無色の固体として得られた。
ケトンをベンゼン(5mL×2)で共沸蒸留し、ついで、高真空下で0.5時間乾燥させた。Wittig塩(1.19g、2.27mmol)のTHF(18mL)溶液に、t-BuOK(THF中1.0Mの溶液2.2mL、2.20mmol)を0℃で5分間かけて滴下した。混合物を0℃で20分間攪拌し、次いで、-78℃に冷却した。この混合物に、ケトン(1.06g、1.51mmol)のTHF(10mL+2mLすすぎ)溶液を10分間かけて滴下し、生じた混合物を放置して、2時間かけて-20℃まで加温した。反応を飽和NH4Cl(15mL)水溶液でクエンチし、EtOAc(50mL×3)で抽出した。混合した有機層をブライン(20mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。残留物を、フラッシュクロマトグラフィー(SiO2〜65g、ヘキサン/Et2O=30:1から20:1)により精製すると、望む16(E)-異性体(1.01g、1.11mmol、74%)が望ましくない16(Z)-異性体(154.5mg、0.182mmol、11%)と共に、両方とも無色のアモルファスオイルとして得られた。
シリルエーテル(1.04g、2.25mmol)のTHF(22mL)溶液に、プラスチックチューブ中でHF・ピリジン(11mL)を0℃で加え、この混合物を室温で4.3時間攪拌した。反応を、TMSOMe(75mL)を0℃で10分間かけて滴下することによりクエンチした。混合物を室温で4.2時間激しく攪拌した。濃縮し、高真空下で1時間乾燥させた後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2〜25g、ヘキサン/EtOAc=3:4から1:2)により精製すると、トリオール(615.7mg、1.00mmol、96%)が無色の粉体として得られた。
シリルエーテル(42.8mg、55.4μmol)のTHF(1mL)溶液に、プラスチックチューブ中でHF・ピリジン(0.5mL)を0℃で加え、この混合物を室温で4.3時間攪拌した。反応を、TMSOMe(3.2mL)を0℃で10分間かけて滴下することによりクエンチした。混合物を室温で1.5時間激しく攪拌した。濃縮し、高真空下で1時間乾燥させた後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/EtOAc=1:1)により精製すると、ジオール(23.6mg、43.4μmol、78%)が無色のオイルとして得られた。
CH2Cl2(1mL)中のアルコール(18.9mg、33.8μmol)およびEt3N(18.8μL、0.135mmol)の溶液に、TsCl(12.9mg、67.5μmol)を加え、その後、DMAP(2.1mg、16.9μmol)を0℃で加えた。室温で1.5時間攪拌した後に、シリカゲルパッドで濾過した(EtOAcですすぎ)。濃縮した後に、残留物を分取TLC(ヘキサン/EtOAc=1:1)により精製すると、トシレート(8.5mg、11.9μmol、35%)および塩化物(4.3mg、7.44μmol、22%)が両方とも無色の粉体として得られた。
トリオール(50.4mg、90.1μmol)のTHF(1mL)溶液に、(PhO)2PON3(27.2μL、126μmol)を0℃で加えた。5分間後に、DBU(16.2μL、108μmol)を加え、混合物を0℃で2時間攪拌した後に、室温で20.5時間攪拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、水(2mL)を加えてクエンチし、EtOAcで抽出し(3回)、混合した有機層をNa2SO4上で乾燥させた。濃縮した後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2、ヘキサン/EtOAc=3:2)により精製すると、アジ化物(45.6mg、78.0μmol、87%)が無色の粉体として得られた。
トシレート(8.9mg、12.5μmol)のDMF(0.4mL)溶液に、NaN3(12.2mg、0.188mmol)を加えた。室温で21時間攪拌後に、飽和NH4Cl(aq.)を加えてクエンチし、EtOAcで抽出した(3回)。濃縮した後に、残留物を分取TLC(ヘキサン/EtOAc=1:1)により精製すると、アジ化物(6.9mg、11.8μmol、94%)が無色の粉体として得られた。
アジ化物(21.0mg、35.9μmol)のTHF(0.6mL)溶液に、PMe3(THF中1.0M、43.1μL、43.1μmol)を加えた。2分間後に、水(0.1ML)を加え、混合物を室温で3時間攪拌した。更なるPMe3(THF中1.0M、7.2μL、7.2μmol)を加え、この混合物を室温で1.5時間攪拌した。この混合物に、28%のNH4OH(54.5μL)を加えた。室温で1時間攪拌した後に、混合物をそのまま、分取TLC(CH2Cl2/MeOH=100:7.5)により精製すると、アミン(15.9mg、28.5μmol、79%)が無色の粉体として得られた。
アミン (15.9mg、28.5μmol)のCH3CN(0.78mL)溶液に、HCHO(37%水溶液、31.4μL、0.143mmol)を、続いてNaBH3CN(THF中1.0M、85.5μL、85.5μmol)を加えた。この混合物を室温で20分間攪拌した。AcOH(1滴)を加え、この混合物を室温で40分間攪拌した。混合物をそのまま、分取TLC(CH2Cl2/MeOH=100:8)により精製すると、ジメチルアミン(15.6mg、26.6μmol、93%)が無色の粉体として得られた
融点;両方のサンプルは再結晶化しなかったが、SiO2によって精製した。
図1は、12-トリフルオロメチル-9,10-デヒドロデスオキシエポチロンDの調製を示す。 図2Aは、EpoAから12-トリフルオロメチル-9,10-デヒドロデスオキシエポチロンDの幾つかの調製方法を示す。 図2A参照。 図3は、C10-C11二重結合をC9-C10位へと異性化することによる、Epo490から9,10-デヒドロ-epoDの調製を示す。 図4Aは、9,10-位で修飾した様々なエポチロン類似体を示す。 図4A参照。 図5は、9,10-位での閉環複分解反応を使用した、様々な9,10-デヒドロ-エポチロン類似体の合成を示す。 図6は、過度に大きいMX-1異種移植片をヌードマウスに移植した実験の結果を示す。MX-1腫瘍組織(50mg)をs.c.で0日目に移植した。22日目(D22)に、腫瘍の大きさが960±132mg(体重の約3.4%)に達したときに、矢印に示すように、Fludeloneを、25mg/kg、i.v.で6時間注入、Q3×5で、D22、D25、D28、D31およびD34で与えた。9日間の休憩後に、治療の第二のサイクルをD43、D46、D49およびD52に行った。腫瘍のサイズは、賦形剤処理対照(●)およびFludelone処理群(□)(n=各5)で変化した。観察をD180(実験を終了した時;D52での治療の休止後128日間)までQ3Dで続けた。図6Aは、腫瘍サイズの減少によって求めた治療効果を示す。 図6Bは、D25、D31、D37、D43およびD52で撮影したヌードマウスの写真を示す(それぞれは、対照群および処理群から選択した)。実験終了時であるD180に再発は観察されなかった。 図6Cは、体重の変化を示す。 図7は、タキソールに44倍耐性を示すヒトTリンパ芽球性白血病細胞(CCRF-CEM/タキソール)でヌードマウスを移植した実験の結果を示す。CCRF-CEM/タキソール(in vitroで44倍耐性)の腫瘍組織をマウス当り50mgで、s.c.でヌードマウスへ0日目に移植した。D8から開始したFludelone 15mg/kg(□)(n=3)および30mg/kg(△)(n=4)、またはタキソール20mg/kg(○) (n=4)を用いて、Q2D×7で、6時間i.v.注入処理し、D22での投与をとばし、その後、矢印で示すように、D24、26、28、30および32にQ2×5で処理した。対照群(●) (n=4)は、賦形剤のみを付与した。15mg/kgのFludeloneについて、D37で、1/3のマウスの腫瘍が消失し、30mg/kgでは、D22、22および32で、3/4のマウスの腫瘍が消失した。図7Aは、腫瘍サイズの減少によって求めた治療効果を示す。 図7Bは、処理中および処理後における体重の変化を示す。 図8は、26-トリフルオロ-9,10-デヒドロ-dEpoBおよびタキソール(PO、Q2D×7、×5)の経口用調合物を使用した、ヒト乳癌MX-1で移植したヌードマウスの処理を示す。図8Aは、腫瘍サイズの減少によって求めた治療効果を示す。 図8Bは、体重の変化を示す。 図9は、26-トリフルオロ-9,10-デヒドロ-dEpoBおよびタキソール((Q2D×4)×3、6時間、iv注入)を使用した、ヒト大腸癌HCT-116異種移植片を有するヌードマウスの処理を示す。HCT-116腫瘍組織を、50mg/マウスで、0日目においてヌードマウスへとs.c.移植した。Q2D×4、6時間-i.v.注入の3サイクル処理を、Fludelone 20mg/kg(□)(n=3)、30mg/kg(△)、およびタキソール20mg/kg(○) (それぞれn=4)を用いて、(D9、11、13、15)、(D19、21、23、25)および(D31、34、35、37)で実施した。Fludelone 20mg/kg、30mg/kgおよびタキソール20mg/kgについて、それぞれ、(D33、35、41、45)、(D21、23、33、41)および(D33、33、41、45)で全てのマウスにおいて完全な腫瘍消失が生じた。両方のFludelone処理群について、実験を終了したD200で、如何なる腫瘍の再発も存在しなかった。しかしながら、タキソール処理群(○)は、D71、75、81および81で再発が生じ、これは、治療停止後34日目、38日目、41日目および41日目での再発を示す。図9Aは、腫瘍サイズの減少によって表した治療効果を示す。 図9Bは、体重の変化を示す。 図10は、26-トリフルオロ-9,10-デヒドロ-dEpoB(PO、Q2D×7、×9)を使用した、巨大なヒト乳癌MX-1異種移植片を有する雌のヌードマウスの処理を示す。雌のヌードマウスを使用した。腫瘍移植後D16から開始して、その後、矢印で示すようにD32-48にQ2D×9で、Fludelone 30mg/kg(□)(n=3)を経口で与えた。全ての3匹のマウスの腫瘍が、D40、45および48で消失した。強化療法については、全てのマウスがD48で腫瘍が存在しなくなった時に、治療の第三のサイクルを、D58-66においてQ2D×5で付与した。D115(治療停止後49日)で、如何なる再発も生じなかった。対照(●)(n=2)は、賦形剤のみを付与した。並行した比較実験を、D16から開始してQ2D×3で30mg/kgで、その後、投与量を40mg/kgに増やしてQ2D×3(D22-26)で、60mg/kgに増やしてQ2D×3(D28-40)でタキソール(△)(n=3)を経口投与して実施した。図10Aは、腫瘍サイズの減少によって示した治療効果を示す。 図10Bは、体重変化を示す。 図11は、26-トリフルオロ-9,10-デヒドロ-dEpoBおよびタキソール(6時間iv注入、Q3D×11)を使用した、タキソールに対して44倍耐性を示すヒト肺癌(A549/タキソール)を有するヌードマウスの処理を示す。図11Aは、腫瘍サイズの減少によって示した治療効果を示す。 図11Bは、体重変化を示す。 図12は、9,10-デヒドロ-dEpoB(6時間iv注入、Q4D×5、×3)を使用した、タキソールに対して44倍耐性を示すヒト肺癌A549/タキソールを有するヌードマウスの処理を示す。図12Aは、腫瘍サイズの減少によって示した治療効果を示す。 図12Bは、処理前後の体重変化を示す。 図13は、経口用調合物を使用した、ヒト乳癌MX-1異種移植片を有するヌードマウスの処理における(PO、Q2D×7、×5)、26-トリフルオロ-9,10-デヒドロ-dEpoB、dEpoBおよびタキソールの比較を示す。図13Aは、腫瘍サイズの減少によって示した治療効果を示す。 図13Bは、体重変化を示す。 図14は、エポチロン誘導体の様々な治療および薬物動態学的パラメーターを要約した図である。 図15は、26-トリフルオロ-9,10-デヒドロ-dEpoBおよびdEpoB(6時間iv注入、(Q2D×6)×2、×2)を使用した、ヒト肺癌(A549)異種移植片を有するヌードマウスの処理を示す。図15Aは、腫瘍サイズの減少によって示した治療効果を示す。 図15Bは、処理前後の体重変化を示す。 図16は、10μMの薬剤での微小管形成の安定性を示す。10μMのタキソールの存在下で形成した微小管を100%ととして定義した。ウシの脳に由来するチューブリンは、Sigmaの製品を使用した。チューブリン重合アッセイは、製品の取扱説明書に従って実施した。チューブリン(200μl中で1mg)を、790μのバッファー(0.1M MES、1mM EGTA、0.5mM MgCl2、0.1mM EDTA、および2.5Mグリセロール、pH6.5)および10μlの薬剤(最終濃度10μM)とインキュベートした。重合については、インキュベーションを35℃で40分間実施し、同じサンプルの脱重合については、インキュベーションを4℃で40分間実施した。微小管安定性について、350nMの吸光度を測定した。溶媒ブランク(DMSO)を、吸光度から引いた。 図17は、in vitroでの腫瘍細胞増殖に対するエポチロンの有効性および相対的な治療指数を示す。 図18は、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって求めた細胞周期分析である。dEpoB(上パネル)およびFludelone(下パネル)を用いて処理した後のOPM-2骨髄腫細胞について、6時間から始まって、細胞周期がG2M期で停止し、24時間完全にブロックされた。2つの薬剤は、同じパターンの細胞周期停止を含んでいた。 図19は、RPMI8226骨髄腫細胞ラインのAnnexin V染色を示す。初期アポトーシス細胞においては、膜に存在するリン脂質ホスファチジルセリン(PS)は、プラズマ細胞膜の内側の膜から外側の膜へと移行し、それにより、PSは細胞外部環境に曝される。Annexin Vは、PSに対して高い親和性を有し、曝露したPSを有する細胞に結合する35-36kDのCa+2依存性リン脂質-結合タンパク質である。7-アミノ-アクチノマイシン(7-AAD)などの生体染色色素で死滅細胞を染色することと組み合わせて、このアッセイにより、初期のアポトーシス細胞の同定が可能である。このデータにより、大部分の細胞が、dEpoBまたはFludeloneを用いた24時間処理後に、アポトーシスがもたらされたか、死滅したことが示された。 図20Aは、24時間Fludelone(125nM)で処理した骨髄腫および細胞ラインの顕微鏡写真を示す。G2/Mで停止した細胞に特徴的な環状用構造が見られる。 図20A参照。 図21は、FludeloneおよびdEpoB(125nM)で処理したRPMI8226骨髄腫細胞の細胞数を示す。異なる時間で(1、2、4、8、24時間)薬剤を洗い流し、細胞を48時間までインキュベートし続けた。Fludeloneへのたった1時間の曝露により、腫瘍細胞の数が徐々に減少し、大部分の細胞が、24時間でアポトーシスが生じるのに対して、dEpoB細胞は増殖し続けた。 図22は、RPMI8226骨髄腫細胞のα-チューブリン染色を示す。Fludeloneは、微小管を安定化し、処理の初期段階で(RPMI8226骨髄腫細胞を用いた12時間で)、微小管重合体重量を非常に増加させると思われる。24時間の薬剤処理後、細胞がアポトーシスを受ける間に、微小管が減少し崩壊した。 図23は、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって求めた細胞周期分析である。実線は、G1およびG2の値を示し、灰色の領域はS期の細胞を記し、点線は特にタキソール(左上のイメージ)を用いて明らかなダブレット(doublet)の数を与える全体の曲線を示す。上の列は、Fludelone(10nM)、dEpoB(100nM)、およびタキソール(100nM)を用いた卵巣癌細胞ラインIGROVの24時間インキュベート後のG2M期での停止を求めたものである。下の列は、Fludeloneの濃度を増すにつれてHT-29の細胞周期の停止が増すことを示す。Fludeloneを用いた100nMでのインキュベーションによって、IGROVおよびHT-29を含む幾つかの細胞ラインにおいて、24時間の細胞周期分析後に広範なアポトーシスがもたらされた。 図24は、100nMのFludelone、タキソールまたはdEpoBを用いた24時間のインキュベーション後のOvcar3卵巣癌細胞ラインのAnnexin V染色を示す。左下の象限で現されたパーセンテージは、Annexin V+/P1-ネガティブ細胞のパーセンテージであり、このパーセンテージは初期のアポトーシス段階にある細胞に類似する。 図25は、HEMA3で24時間染色処理した後のHT-29大腸癌細胞のサイトスピンである(200×拡大図)。(a)溶媒(DMSO)で処理した対照細胞。(b)-(d)Fludeloneの1、10および100nMと増加させた濃度を示す。(e)100nM dEpoB添加後のHT-29細胞。(f)100nMのタキソール添加後のHT-29細胞。全ての3つの薬剤が、24時間後に、アポトーシスをもたらす核の環状様構造に明らかな同じ表現型を示した。 図26は、播種性転移ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、FludeloneおよびdEpoBの作用を評価するためのシステムの実験を示す。 図27は、細胞増殖およびIC50(50%の細胞阻害濃度)アッセイを示す。細胞増殖は、3’-[1-(フェニルアミノ-カルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物(XTT)を用いて測定し、生きた細胞においてミトコンドリアデハイドロゲナーゼによるテトラゾリウム化合物からホルマザンへの転換を測定した。ホルマザンの量は、アッセイ混合物に存在する生きた細胞の数に比例する。それぞれのデータは、独立して4回測定した平均である。骨髄腫細胞ライン(RPMI8226、CAG)について、FludeloneのIC50は約7.6〜36.67nMであり、dEpoBのIC50は36.67〜61.34nMであった。リンパ腫細胞ライン(SKIDLBCLおよびRL)について、FludeloneのIC50は約60〜80nMであった。 図28は、正常の間質細胞での細胞増殖およびIC50アッセイを示す。同じ手法を図104で記載したように使用した。E6/E7遺伝子によって不死化させたヒト骨髄間質細胞ラインHS-27AおよびHS-5は、幹細胞の自己再生および増殖をサポートする正常な骨髄間質細胞の機能を有する。これらの間質ラインについて、腫瘍ラインでの分裂時間を用いて、FludeloneおよびdEpoBのIC50は、約90-100nMであった。 図29は、細胞周期停止に対するFludeloneおよびdEpoBのタイター濃度を示す。CAG骨髄腫細胞ラインを使用した。31.25nMの濃度で、両方の薬剤が、完全にG2M期で細胞周期をブロックした(31.25nMより低いデータは示さず)。 図30は、細胞周期停止に対するFludeloneおよびdEpoBのタイター濃度を示す。RPMI8226骨髄腫細胞ラインを使用した。31.25nMの濃度で、両方の薬剤が、完全にG2M期で細胞周期をブロックした(31.25nMより低いデータは示さず)。 図31は、CAG骨髄腫細胞ラインのAnnexin V染色を示す。初期のアポトーシス細胞においては、膜に存在するリン脂質ホスファチジルセリン(PS)は、プラズマ細胞膜の内側の膜から外側の膜へと移行し、それにより、PSは細胞外部環境に曝される。Annexin Vは、PSに対して高い親和性を有し、曝露したPSを有する細胞に結合する35-36kDのCa2+依存性リン脂質-結合タンパク質である。7-アミノ-アクチノマイシン(7-AAD)などの生体染色色素で死滅細胞を染色することと組み合わせて、このアッセイにより、初期のアポトーシス細胞の同定が可能である。このデータにより、大部分の細胞が、FludeloneまたはdEpoBを用いた24時間処理後に、アポトーシスがもたらされたか、死滅したことが示された。X軸はAnnexin染色であり、Y軸が7-ADD染色である。 図32は、DNA断片化アッセイである。アポトーシスの主要な生化学的特徴は、クロマチンからのヌクレオソーム切除である。ヌクレオソーム切除は、クロマチンにおけるヌクレオソーム間の曝露されたDNAリンカー領域のエンドヌクレアーゼ媒介分解によって引き起こされる。ヒストンコア周囲の180-200塩基対のDNAは構造的に分解から保護されているので、このエンドヌクレアーゼ媒介ヌクレオソーム切除は、アガロースゲルにおいて、DNAラダーとして観察することができる。データによって、典型的なDNAラダーは、RPMI8226およびCAG骨髄腫細胞のFludeloneまたはdEpoBの24時間処理後に検出されたことが示された。データによって、細胞のアポトーシスがカスパーゼ経路を介してエポチロンによって誘導されたことが示された。 図33は、播種性CAG異種移植片骨髄腫マウスのエポチロン(20mg/kg)処理後の体重変化および結果を示す。データによって、対照マウスは約30日で死亡し、処理の20日後に顕著な体重減少が観察されたことを示された。dEpoBで処理したマウスと対照では寿命に顕著な差異はなかった;しかしながら、Fludeloneで処理したマウスは、対照およびdEpoB群のいずれかよりも、生存日数の顕著な伸びが見られた。各群において使用したマウスの数は4匹であり、マウスはCAG細胞の注入前に、300Radの放射線照射を行った。 図34は、4週間での播種性CAG異種移植片骨髄腫マウスの処理を示す。Luc-eGFP-TK融合遺伝子で遺伝子組み換えした10×106のCAG骨髄腫細胞を、マウスの尾静脈へと静脈内注入し、7日目にバイオルミネスセンスイメージングによってかなりの骨髄腫細胞移植が検出された時に、処理を開始した。図は、対照、またはdEpoB、またはFludeloneのいずれかでそれぞれ処理したマウスのバイオルミネスセンスイメージを示す。 図35は、CAG異種移植片マウスにおける、平均腫瘍陽子放出の定量化を示す(N=4)。図は、Fludeloneで処理したマウスが、賦形剤またはdEpoB単独のいずれかで処理したマウスよりも顕著に減少した腫瘍陽子放出を有することを示す。腫瘍陽子放出は、全腫瘍組織量と明確に相関する。 図36は、播種性CAG異種移植片骨髄腫マウスのエポチロン(20mg/kg)処理後の体重変化および結果を示す。図は、最初の30日で、図33と類似の特徴を示す;しかしながら、Fludelone処理マウスの唯一の生存群は、追加5回のVelcade(6.25ug/マウス、I.V)投与を行った。 図37は、18日目での播種性CAG異種移植片骨髄腫マウスの処理を示す。図は、群間における、群での全腫瘍組織量を反映するイメージの顕著な差異を示す。 図38は、18日目での、CAG異種移植片マウスにおける、平均腫瘍陽子放出の定量化を示す。図は、群間における、群での全腫瘍組織量を反映するイメージの顕著な差異を示す。 図39は、40日目での播種性CAG異種移植片骨髄腫マウスの処理を示す。図は、3つの群における全腫瘍組織量を反映するイメージの差異を示す。 図40は、40日目での、CAG異種移植片マウスにおける、平均腫瘍陽子放出の定量化を示す。図は、3つの群における全腫瘍組織量を反映するイメージの差異を示す。 図41は、Velcadeと組み合わせたFludeloneによって治療したCAG異種移植片骨髄腫マウスを示す。マウスは、0日目から28日目までFludeloneで処理し(20mg/kg、Q2d)、35日目から45日目までVelcadeで処理した(6.25ug/マウス、I.V、3/w)。10日目に処理を開始、Fludeloneでの12回投与およびVelcadeでの5回投与後の59日目にイメージを得た。40日目のイメージと比較して、3匹のうち2匹のマウスが、大腿および脊椎の両方において、全腫瘍組織量が顕著に減少した。 図42は、CAG骨髄腫細胞で異種移植した7匹のNOD/SCIDマウスのKaplan-Meier曲線である。対照マウスは、CAG細胞移植後40日以内に死亡し、dEpoBで処理したマウスは50日以内に死亡した。70日で死んだ1匹のマウスを除き、Fludeloneで処理した全てのマウスは80日を越えて生存した。 図43は、細胞のアポトーシス経路を示す。 図44は、CAG骨髄腫細胞における、エポチロンに誘導された時間依存的なカスパーゼ3のプロセシングを示し、薬剤処理時間とともにカスパーゼ3の17kd切断体が増すことが示された。 図45は、切断されたカスパーゼ3を認識する抗体を使用した、CAG骨髄腫細胞の免疫組織染色であり、アポトーシス細胞における細胞質内局在および核周辺局在が示された(低解像度および高解像度を示す)。 図46は、切断されたカスパーゼ3を認識する抗体を使用した、CAG骨髄腫細胞の免疫組織染色であり、アポトーシス細胞における細胞質内局在および核周辺局在が示された(低解像度および高解像度を示す)。 図47は、カスパーゼ8活性がエポチロン処理後に増加したことを示し、この増加は、カスパーゼ8特異的阻害剤によって阻害することができることを示す。 図48は、カスパーゼ8活性がエポチロン処理後に増加したことを示し、この増加は、カスパーゼ8特異的阻害剤によって阻害することができることを示す。 図49は、カスパーゼ9活性がエポチロン処理後に増加したことを示す。 図50は、KL非存在下または存在下における、dEpoBまたはFludeloneを用いて24時間インキュベーションしたCB CD34+細胞のAnnexin V染色を示す。その後、薬剤を洗い流して、Annexin V染色を行った。色塗りされた領域は賦形剤対照を表し、無色の領域は薬剤処理群を表す。エポチロンの短期間の曝露では、non-cyclingヒトCD34+細胞のアポトーシスは明らかには増加しなかった。 図51は、コロニー形成における、non-cyclingヒトCD34+細胞へのエポチロンの影響を示す。対照と薬剤処理における2週間のコロニー形成によって評価したところ、前駆細胞の如何なる顕著な差異も存在しなかった。 図52は、コロニー形成における、non-cyclingヒトCD34+細胞へのエポチロンの影響を示す。対照と薬剤処理における2週間のコロニー形成によって評価したところ、前駆細胞の如何なる顕著な差異も存在しなかった。 図53は、FludeloneおよびPaclitaxelによる、薬剤耐性ヒトT細胞リンパ芽球性白血病CCRF-CEM/Paclitaxel異種移植片に対する治療効果を示す(体重減少)。著しい体重減少以外は、全ての治療について如何なる細胞毒性死も見られなかった。

Claims (56)

  1. 次式:
    [上式中、
    R1は、水素または低級アルキルであり;
    R2は、置換または非置換のアリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル基であり;
    R5およびR6はそれぞれ独立に、水素または保護基であり;
    Xは、O、S、C(R7)2またはNR7であり、ここで、R7はそれぞれ独立に、水素または低級アルキルであり;
    A-Bは、CRA=CRB-、C(RA)2-C(RB)2-、または
    を表し;
    C-Dは、-CRC=CRD-、-C(RC)2-C(RD)2-、または
    を表す;
    (ここで、
    RAは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORA';-SRA';-N(RA')2;-C(O)ORA';-C(O)RA';-CONHRA';-O(C=O)RA';-O(C=O)ORA';-NRA'(C=O)RA';N3;N2RA';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORA';-SRA';-N(RA')2;-C(O)ORA';-C(O)RA';-CONHRA';-O(C=O)RA';-O(C=O)ORA';-NRA'(C=O)RA';N3;N2RA';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;
    RBは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;
    RCは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORC';-SRC';-N(RC')2;-C(O)ORC';-C(O)RC';-CONHRC';-O(C=O)RC';-O(C=O)ORC';-NRC'(C=O)RC';N3;N2RC';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORC';-SRC';-N(RC')2;-C(O)ORC';-C(O)RC';-CONHRC';-O(C=O)RC';-O(C=O)ORC';-NRC'(C=O)RC';N3;N2RC';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;
    RDは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORD';-SRD';-N(RD')2;-C(O)ORD';-C(O)RD';-CONHRD';-O(C=O)RD';-O(C=O)ORD';-NRD'(C=O)RD';N3;N2RD';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORD';-SRD';-N(RD')2;-C(O)ORD';-C(O)RD';-CONHRD';-O(C=O)RD';-O(C=O)ORD';-NRD'(C=O)RD';N3;N2RD';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;または
    RA、RB、RCまたはRDのいずれか2つが、共同して環式基を形成し、酸素、イオウ、炭素もしくは窒素原子を介して結合することができ、または、いずれか2つの隣接するRA、RB、RCまたはRD基が、共同して、3から6員の置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはヘテロアリール環を形成することができ;
    RA'、RB'、RC'およびRD'はそれぞれ独立に、水素;保護基;直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、環式または非環式脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、またはヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、へテロアリールアルキニル基である)]
    の化合物およびその薬学的に許容できる誘導体。
  2. 次式:
    [上式中、
    Xは、O、S、C(R7)2またはNR7(ここで、R7はそれぞれ独立に、水素または低級アルキルである)であり;
    Yは、OまたはSであり;
    R5およびR6はそれぞれ独立に、水素または保護基であり;
    R8は、独立に、水素、ハロゲン、-OR9、-SR9、-N(R9)2、-CZ3、-CHZ2、-CH2Z(ここで、Zは、F、Br、Cl、I、ORB'、NHRB'、N(RB')2またはSRB'である);-(CV2)nOR9、-(CV2)nN(R9)2、-(CV2)nSR9、-(C=O)R9、-O(C=O)R9、-(C=O)OR9、-O(C=O)OR9;-NH(C=O)R9、-NH(C=O)OR9、-(C=O)NHR9、あるいは、1個または複数のハロゲン、-OR9、-SR9、-N(R9)2、-(CV2)nOR9、-(CV2)nN(R9)2、-(CV2)nSR9、-(C=O)R9、-O(C=O)R9、-(C=O)OR9、-O(C=O)OR9;-NH(C=O)R9、-NH(C=O)OR9、-(C=O)NHR9または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルもしくはへテロアリールアルキル基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル基であり;
    (ここで、
    R9はそれぞれ独立に、水素;保護基;環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリール基であるか;エポチロン、デスオキシエポチロンまたはそれらの類似体;ポリマー;炭水化物;光親和性標識;あるいは放射標識であり;
    Vはそれぞれ独立に、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、チオ、アミノ、アルキルアミノあるいは保護されているヒドロキシ、チオまたはアミノであり;tはそれぞれ独立に、0、1または2であり;nはそれぞれ独立に、0〜10である)
    A-Bは、CRA=CRB-、C(RA)2-C(RB)2-、または
    を表し;
    C-Dは、-CRC=CRD-、-C(RC)2-C(RD)2-、または
    を表す;
    (ここで、
    RAは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORA';-SRA';-N(RA')2;-C(O)ORA';-C(O)RA';-CONHRA';-O(C=O)RA';-O(C=O)ORA';-NRA'(C=O)RA';N3;N2RA';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORA';-SRA';-N(RA')2;-C(O)ORA';-C(O)RA';-CONHRA';-O(C=O)RA';-O(C=O)ORA';-NRA'(C=O)RA';N3;N2RA';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;
    RBは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;
    RCは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORC';-SRC';-N(RC')2;-C(O)ORC';-C(O)RC';-CONHRC';-O(C=O)RC';-O(C=O)ORC';-NRC'(C=O)RC';N3;N2RC';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORC';-SRC';-N(RC')2;-C(O)ORC';-C(O)RC';-CONHRC';-O(C=O)RC';-O(C=O)ORC';-NRC'(C=O)RC';N3;N2RC';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;
    RDは、それぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORD';-SRD';-N(RD')2;-C(O)ORD';-C(O)RD';-CONHRD';-O(C=O)RD';-O(C=O)ORD';-NRD'(C=O)RD';N3;N2RD';環式アセタール;あるいは1個または複数の水素;ハロゲン;-ORD';-SRD';-N(RD')2;-C(O)ORD';-C(O)RD';-CONHRD';-O(C=O)RD';-O(C=O)ORD';-NRD'(C=O)RD';N3;N2RD';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであり;または
    RA、RB、RCまたはRDのいずれか2つが、共同して環式基を形成し、酸素、イオウ、炭素もしくは窒素原子を介して結合することができ、または、いずれか2つの隣接するRA、RB、RCまたはRD基が、共同して、3から6員の置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはヘテロアリール環を形成することができ;
    RA'、RB'、RC'またはRD'はそれぞれ独立に、水素;保護基;直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、環式または非環式脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、またはヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、へテロアリールアルキニル基である)]
    の化合物およびその薬学的に許容できる誘導体。
  3. A-Bは、-CH=C(RB)-である、請求項2に記載の化合物。
  4. A-Bは、
    である、請求項2に記載の化合物。
  5. RBは、メチルである、請求項2に記載の化合物。
  6. RBは、-CF3である、請求項2に記載の化合物。
  7. R8は、メチルである、請求項2から4のいずれか一項に記載の化合物。
  8. R8は、-CH2OHである、請求項2から4のいずれか一項に記載の化合物。
  9. R8は、-CH2NH2である、請求項2から4のいずれか一項に記載の化合物。
  10. C-Dは、
    [上式中、
    ZはO、S、NRZまたはC(RZ)2(ここで、RZは水素、ハロゲン、低級アシルまたは低級アルキルである)である]
    である、請求項2から4のいずれか一項に記載の化合物。
  11. Zは、NHである、請求項10に記載の化合物。
  12. Zは、CH2である、請求項10に記載の化合物。
  13. Zは、Oである、請求項10に記載の化合物。
  14. Zは、Sである、請求項10に記載の化合物。
  15. C-Dは、
    [上式中、
    ZはO、S、NRZまたはC(RZ)2(ここで、RZは水素、ハロゲン、低級アシルまたは低級アルキルである)である]
    である、請求項2から4のいずれか一項に記載の化合物。
  16. Zは、NHである、請求項15に記載の化合物。
  17. Zは、CH2である、請求項15に記載の化合物。
  18. Yは、Sである、請求項2に記載の化合物。
  19. Yは、Oである、請求項2に記載の化合物。
  20. C-Dは、-C(RC)2-C(RD)2-である、請求項2から4のいずれか一項に記載の化合物。
  21. RCおよびRDのいずれかは、水素、低級アルキル、ヒドロキシ、ハロゲンまたは低級アルコキシからなる群から選択される、請求項20に記載の化合物。
  22. RCおよびRDのいずれかは、水素およびメチルからなる群から選択される、請求項20に記載の化合物。
  23. 各RCはメチルであり、各RDは水素である、請求項20に記載の化合物。
  24. 各RCは水素であり、各RDはメチルである、請求項20に記載の化合物。
  25. 1つのRCは水素であり、他のRCはメチルである、請求項20に記載の化合物。
  26. 1つのRDは水素であり、他のRDはメチルである、請求項20に記載の化合物。
  27. 次式:
    からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
  28. 次式:
    からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
  29. 次式:
    からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
  30. 次式:
    からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
  31. 次式:
    からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
  32. 次式:
    からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
  33. 請求項1に記載の化合物および薬学的に許容できる賦形剤を含有する癌を治療するための医薬組成物。
  34. クレモフォールをさらに含有する、請求項33に記載の医薬組成物。
  35. クレモフォールおよびエタノールをさらに含有する、請求項33に記載の医薬組成物。
  36. 前記化合物が、1:1のクレモフォール/EtOHに懸濁している、請求項33に記載の医薬組成物。
  37. 追加の細胞毒剤をさらに含有する、請求項33に記載の医薬組成物。
  38. 治療有効量の請求項1に記載の化合物またはその薬学的に許容できる塩;および、薬学的に許容できる担体または希釈剤を含有する、癌を治療するための医薬組成物であって、
    前記化合物の治療有効量が、患者の体重1kg当り約0.001から約40mgの化合物を送達するのに十分な量である医薬組成物。
  39. 請求項1に記載の化合物;および、薬学的に許容できる賦形剤を含有する、癌を治療するための医薬組成物であって、
    患者への経口投与に適する医薬組成物。
  40. 請求項2に記載の化合物;および、薬学的に許容できる賦形剤を含有する、癌を治療するための医薬組成物であって、
    患者への経口投与に適する医薬組成物。
  41. R8は、-CH2OHである、請求項40に記載の医薬組成物。
  42. RBは、-CHF2、-CH2Fまたは-CF3である、請求項40に記載の医薬組成物。
  43. C-Dは、-CH=CH-(ここで、二重結合はトランス構造である)である、請求項40に記載の医薬組成物。
  44. 前記化合物は、次式:
    である、請求項40に記載の医薬組成物。
  45. 前記化合物は、固体形態である、請求項40に記載の医薬組成物。
  46. 前記化合物は、液体形態である、請求項40に記載の医薬組成物。
  47. 治療有効量の請求項1に記載の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
  48. 前記化合物の治療有効量が、体重1kg当り約0.001mgから約40mgの化合物を送達するのに十分な量である、請求項47に記載の方法。
  49. 前記化合物の治療有効量が、体重1kg当り約0.1mgから約25mgの化合物を送達するのに十分な量である、請求項47に記載の方法。
  50. 治療有効量の次式:
    の化合物を、それを必要とする患者に経口投与することを含む、癌を治療する方法。
  51. 次式:
    [上式中、
    R1は、水素または低級アルキルであり;
    R2は、置換または非置換のアリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル基であり;
    R5およびR6はそれぞれ独立に、水素または保護基であり;
    Xは、O、S、C(R7)2またはNR7(ここで、R7はそれぞれ独立に、水素または低級アルキルである)であり;
    RBはそれぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-CY3、-CHY2、-CH2Y(ここで、Yは、F、Br、Cl、I、ORB'、NHRB'、N(RB')2またはSRB'である);-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;あるいは、1個または複数の水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであるか;あるいは、エポチロン、デスオキシエポチロンまたはこれらの類似体であるか;あるいは、ポリマー;炭水化物;光親和性標識;または放射標識であり、ここで、RB'はそれぞれ独立に、水素;保護基;直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、環式または非環式脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニルまたはへテロアリールアルキニル基である]
    の化合物を調製する方法であって:
    次式:
    の化合物を金属および還元剤の存在下で異性化させる、前記[化18]で表した化合物を調製する方法。
  52. 前記金属は、遷移金属である、請求項51に記載の方法。
  53. 前記金属は、パラジウムである、請求項51に記載の方法。
  54. 前記還元剤は、LiAlH4、NaBH4およびNaBH3CNからなる群から選択される、請求項51に記載の方法。
  55. 次式:
    [上式中、
    R1は、水素または低級アルキルであり;
    R2は、置換または非置換のアリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはへテロアリールアルキル基であり;
    R5およびR6はそれぞれ独立に、水素または保護基であり;
    Xは、O、S、C(R7)2またはNR7(ここで、R7はそれぞれ独立に、水素または低級アルキルである)であり;
    RBはそれぞれ独立に、水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-CY3、-CHY2、-CH2Y(ここで、Yは、F、Br、Cl、I、ORB'、NHRB'、N(RB')2またはSRB'である);-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;あるいは、1個または複数の水素;ハロゲン;-ORB';-SRB';-N(RB')2;-C(O)ORB';-C(O)RB';-CONHRB';-O(C=O)RB';-O(C=O)ORB';-NRB'(C=O)RB';N3;N2RB';環式アセタール;または環式もしくは非環式の、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の脂肪族、複素脂肪族、アリールもしくはへテロアリール基で置換されていてもよい環式または非環式の、直鎖または分枝鎖の脂肪族、複素脂肪族、アリールまたはへテロアリールであるか;あるいは、エポチロン、デスオキシエポチロンまたはこれらの類似体であるか;あるいは、ポリマー;炭水化物;光親和性標識;または放射標識であり、ここで、RB'はそれぞれ独立に、水素;保護基;直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、環式または非環式脂肪族、複素脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニルまたはへテロアリールアルキニル基である]
    の化合物を調製する方法であって:
    次式:
    の化合物をカルベンおよびカルベノイド試薬で反応させる、前記[化20]で表した化合物を調製する方法。
  56. 前記カルベンは、CH2N2である、請求項55に記載の方法。
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