JP2007521331A - 複数キナーゼの標的化による疾患及び障害の治療方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、治療に対する耐性を実質的に避けるように2個以上のキナーゼを同時に標的化する化合物である単一薬物の使用に関する。本発明は、2個以上のキナーゼの活性に関係する各種疾患または状態を治療するために1つ以上の単一薬物を単独でまたは他の治療と組み合わせて投与することを含む前記疾患または状態を有している個体に投与するため及び個体を治療するための使用方法を提供する。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
本発明は、細胞生存、増殖、成長及び悪性転換、運動性及び侵入にとって重要なプロセスに関与するものを含めた複数のキナーゼまたはキナーゼ経路の活性を同時にモジュレートするための方法を包含する。よって、本発明は、タンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ経路に関係する状態、疾患及び障害、例えば増殖性疾患、癌及び炎症性疾患(糖尿病、肥満、及び異常血管形成及びこれに関連する疾患を含む)を治療、予防または管理するための方法も包含する。特に、本発明が意図する方法は、疾患、状態または障害を複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を特異的に標的化する単一薬物治療で治療、予防または管理することを含む。1実施形態では、単一薬物治療が複数のキナーゼまたはキナーゼ経路の活性を他のキナーゼの活性よりもモジュレートすることが好ましい。換言すると、単一薬物治療の効果は特定組のキナーゼに対して選択的である。要するに、本発明は、特定疾患環境において臨床的に有効である複数経路の適切な組合せを標的化する単一薬物の同定及び使用を意図している。
異常タンパク質リン酸化と疾患の原因または予後の関係は20年以上にわたり公知である。従って、タンパク質キナーゼは薬物標的の非常に重要な群となっている。Cohen,Nature,1:309−315(2002)を参照されたい。各種のタンパク質キナーゼ阻害剤が各種疾患、例えば癌及び慢性炎症性疾患(糖尿病及び卒中を含む)の治療において臨床的に使用されてきた。Cohen,Eur.J.Biochem.,268:5001−5010(2001)を参照されたい。
タンパク質キナーゼは、タンパク質リン酸化を触媒し、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たす酵素の大きな種々のファミリーである。タンパク質キナーゼは標的タンパク質に応じて正または負の調節効果を発揮し得る。タンパク質キナーゼは細胞機能を調節する特殊なシグナル伝達経路に関与しており、前記細胞機能には代謝、細胞周期進行、細胞接着、血管機能、アポトーシス及び血管形成が含まれるが、これらに限定されない。細胞シグナル伝達の機能障害は多くの疾患に関係しており、最も特徴的な疾患には癌及び糖尿病が含まれる。シグナル伝達のサイトカインによる調節及びシグナル分子と原癌遺伝子及び癌抑制遺伝子の関係も立証されている。また、糖尿病及び関連状態とタンパク質キナーゼの調節解除レベルの関係も立証されている。例えば、Sridharら,Pharmaceutical Reseach,17(1):1345−1353(2000)を参照されたい。ウイルス感染及びそれに関連する状態もタンパク質キナーゼの調節に関係している。Parkら,Cell,101(7):777−787(2000)。
タンパク質キナーゼは、該キナーゼが標的化するアミノ酸(セリン/スレオニン、チロシン、リシン及びヒスチジン)の正体に基づいて広いグループに分類され得る。例えば、チロシンキナーゼには、成長因子のような受容体チロシンキナーゼ(RTK)及びsrcキナーゼファミリーのような非受容体チロシンキナーゼが含まれる。チロシンとセリン/スレオニンの両方を標的化する二重特異性タンパク質キナーゼ、例えばサイクリン依存性キナーゼ(CDK)及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)もある。特定の細胞は多くのタンパク質キナーゼを含んでおり、このキナーゼの幾つかは他のタンパク質キナーゼをリン酸化する。数種のタンパク質キナーゼは多種多様のタンパク質をリン酸化し、他は1個のタンパク質のみをリン酸化する。予想されたことであるが、タンパク質キナーゼのクラスは多数ある。シグナルを受け取ると、数種のタンパク質は自己リン酸化を受けることもあり得る。
タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)は、細胞を増殖、分化、接着、運動性及び死に関与する細胞シグナルに調節する大きなファミリーのキナーゼを構成している。Robinsonら,Oncogene,19:5548−5557(2000)。チロシンキナーゼのメンバーにはYes、BMX、Syk、EphA1、FGFR3、RKY、MUSK、JAK1及びFGFRが含まれるが、これらに限定されない。チロシンキナーゼは2つのクラス、すなわち受容体型チロシンキナーゼ及び非受容体型チロシンキナーゼに区別される。興味深いことに、チロシンキナーゼファミリー全体は非常に大きく、少なくとも58個の受容体型キナーゼと少なくとも32個の非受容体型キナーゼの少なくとも90個の特徴づけられたキナーゼからなり、全部で少なくとも30個のサブファミリーを含む。Robinsonら,Oncogene,19:5548−5557(2000)。チロシンキナーゼはヒトにおける糖尿病や癌を含めた多数の疾患に関与している。Robinsonらのp.5548。チロシンキナーゼは、しばしば多くの形態のヒト悪性疾患に関与しており、各種先天性症候群にリンクしている。Robinsonら,Trends Genet.,16:265−271(2000)。
非受容体チロシンキナーゼは、細胞外及び膜貫通配列を含まない細胞内酵素のグループである。現在、32以上の非受容体チロシンキナーゼファミリーが同定されている。Robinsonら,Oncogene,19:5548−5557(2000)。例えば、Src、Btk、Csk、ZAP70、Kakファミリーである。特に、非受容体チロシンキナーゼファミリーのSrcファミリーは最大であり、Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr及びYrkタンパク質チロシンキナーゼから構成されている。キナーゼのSrcファミリーは発癌、細胞増殖及び腫瘍悪化にリンクしている。非受容体タンパク質チロシンキナーゼはOncogene,8:2025−2031(1993)に詳細に検討されている。これらのタンパク質チロシンキナーゼの多くは各種病的状態に関与する細胞シグナル伝達経路に関与していることが判明している。前記病的状態には癌、過剰増殖性疾患及び免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。
サイクリン依存性キナーゼCDKは、細胞周期を介する進行をコントロールし、細胞増殖において必須の役割を有する細胞内酵素のグループである。Cohen,Nature,1:309−315(2002)を参照されたい。CDKの例にはサイクリン依存性キナーゼ2(CKD2)、サイクリン依存性キナーゼ7(CDK7)、サイクリン依存性キナーゼ6(CDK6)及び細胞分裂コントロール2タンパク質(CDC2)が含まれるが、これらに限定されない。CDKは細胞周期の異なる相間の転移の調節、例えばG1(細胞分裂の新ラウンドのための有糸分裂とDNA複製の開始間のギャップ)の静止段階からS(能動DNA合成の期間)への進行またはG2から能動有糸分裂及び細胞分裂が生ずるM相への進行に関与している。例えば、記事はScience,274:1643−1667(1996)及びAnn.Rev.Cell Dev.Biol.,13:261−291(1997)に収録されている。CDK複合体は、調節サイクリンサブユニット(例えば、サイクリンA、B1、B2、D1、D2、D3及びE)及び触媒キナーゼサブユニット(例えば、cdc2(CDK1)、CDK2、CDK4、CDK5及びCDK6)の会合により形成される。名前が暗示しているように、CDKは、標的基質をリン酸化するためにサイクリンサブユニットへの絶対依存を示し、異なるキナーゼ/サイクリン対が細胞周期の特定部分を介する進行を調節するように機能する。CDKは各種病的状態に関与しており、前記病的状態には癌表現型を示す疾患、各種新生物疾患及び神経疾患が含まれるが、これらに限定されない。Hunter,Cell,100:113−127(2000)。
マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼは、細胞外刺激に応答してシグナルを細胞の核に伝達するのに関与している。MAPキナーゼの例にはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ3(MAPK3)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ1(EPK2)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ7(MAPK7)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ8(JNK1)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ14(p38アルファ)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ10(MAPK10)、JNKアルファタンパク質キナーゼ、ストレス活性化タンパク質キナーゼJNK2及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ14(MAPK14)が含まれるが、これらに限定されない。MAPキナーゼは、細胞外受容体または熱ショックまたはUV照射からのシグナル伝達を媒介するプロリン指向性セリン/スレオニンキナーゼのファミリーである。Sridharら,Pharmaceutical Reseach,17(11):1345−1353(2000)を参照されたい。MAPキナーゼは、成長因子のようなチロシンキナーゼを含めた二重特異性タンパク質キナーゼによるスレオニン及びチロシンのリン酸化により活性化する。細胞増殖及び分化は、複数MAPキナーゼカスケードの調節コントロール下にあることが判明している。Sridharら,Pharmaceutical Reseach,17(11):1345−1353(2000)を参照されたい。よって、MAPキナーゼ経路は多数の病的状態において重要な役割を果たしている。例えば、MAPキナーゼの活性が不足すると、異常に細胞増殖し、発癌することが判明している。Huら,Cell Growth Differ.,11:191−200(2000)及びDasら,Breast Cancer Res.Treat.,40:141(1996)を参照されたい。更に、MAPキナーゼ活性は2型糖尿病に関係するインスリン抵抗性にも関与している。Virkamakiら,J.Clin.Invest.,103:931−943(1999)を参照されたい。
p90リボソームS6キナーゼ(Rsk)はセリン/スレオニンキナーゼである。Rskファミリーメンバーは、マイトジェン活性化細胞成長及び増殖、分化及び細胞生存において機能する。キナーゼのRskファミリーのメンバーの例にはリボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド2(Rsk3)、リボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド6(Rsk4)、リボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド3(Rsk2)及びリボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド(Rsk1/p90Rsk)が含まれるが、これらに限定されない。Rskファミリーメンバーは、細胞外シグナル関連キナーゼ1/2及びホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ1により活性化される。Frodin及びGammeltoft,Mol.Cell.Endocrinol.,151:65−77(1999)。基礎条件下で、RSKキナーゼは細胞の細胞質に局在化しており、マイトジェンにより刺激すると活性化された(細胞外関連キナーゼによるリン酸化された)RSKは一時的に血漿膜に移行し、そこで完全に活性化される。完全に活性化されたRSKは、細胞成長、増殖、分化及び細胞生存に関与する基質をリン酸化する。Richardsら,Curr.Biol.,9:810−820(1999);Richardsら,Mol.Cell.Biol.,21:7470−7480(2001)。RSKシグナル伝達経路は細胞周期のモジュレーションにも関係している。Grossら,J.Biol.Chem.,276(49):46099−46103(2001)。現在のデータから、Rskを阻害する小分子は癌及び炎症性疾患を予防及び治療するための有用な治療薬であり得ると示唆される。
チェックポイントタンパク質キナーゼファミリーのメンバーは、細胞周期進行において重要な役割を果たすセリン/スレオニンキナーゼである。チェックポイントファミリーのメンバーの例にはCHK1及びCHK2が含まれるが、これらに限定されない。チェックポイントは、サイクリン依存性キナーゼの形成、活性化及びその後の不活性化に影響を及ぼすことにより細胞周期進行を同調する制御系である。チェックポイントは、不適切な時の細胞周期進行を防止し、細胞が停止している間細胞の代謝バランスを維持し、時にはチェックポイントの要件が満たされなかったときにはアポトーシス(プログラムされた細胞死)を誘導し得る。例えば、O’Connor,Cancer Surveys,29:151−182(1997);Nurse,Cell,91:865−867(1997);Hartwellら,Science,266:1821−1828(1994);Hartwellら,Science,246:629−634(1989)を参照されたい。キナーゼのチェックポイントファミリーのメンバーは細胞増殖疾患、癌表現型、並びにDNA損傷及び修復に関連する他の疾患に関与している。Kohn,Mol.Biol.Cell,10:2703−2734(1999);Ohi及びGould,Curr,Opin.Cell Biol.,11:267−273(1999);Pengら,Science,277:1501−1505(1997)。
オーロラキナーゼは、新規な癌遺伝子のクラスとして機能する多重遺伝子有糸分裂セリン−スレオニンキナーゼのファミリーである。これらのキナーゼはオーロラA及びオーロラBメンバーを含む。オーロラキナーゼは幾つかの充実性腫瘍において過多活性化及び/または過剰発現されている。前記充実性腫瘍には乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌及び結腸直腸癌が含まれるが、これらに限定されない。特に、オーロラAは、細胞周期進行及び細胞増殖において重要な役割を果たす中心体キナーゼである。オーロラAは結腸直腸癌、乳癌及び膀胱癌のような幾つかの異なるタイプの悪性腫瘍において頻繁に増殖される20q13染色体に位置している。オーロラAと高い組織予後グレード異数性に高い相関関係もあり、キナーゼを潜在的予後媒介体とする。オーロラキナーゼ活性の阻害は細胞増殖、腫瘍成長及び潜在的に腫瘍形成を減らすのを助け得る。オーロラキナーゼ機能の詳細説明はOncogene,21:6175−6183(2002)で検討されている。
Rho関連コイルドコイル含有タンパク質セリン/スレオニンキナーゼROCK−I及びROCK−IIは、サイトカイン−及び成長因子活性化小GTPアーゼのRho/Racファミリーの下流エフェクターとして作用することにより細胞骨格動態において重要な役割を果たすと考えられる。ROCKは各種基質をリン酸化する。前記基質にはミオシン軽鎖ホスファターゼ、ミオシン軽鎖、エズリン−ラディキシン−モエシンタンパク質及びLIM(Lin11、Isl1及びMec3に対して)キナーゼが含まれるが、これらに限定されない。ROCKは各種細胞型においてアクチンストレス繊維の形成及びフォーカルアドヒージョンも媒介する。ROCKは細胞収縮性を強化することにより細胞遊走において重要な役割を有する。ROCKは単球及び癌細胞の尾部収縮を必要とし、ROCK阻害剤はインビボで腫瘍細胞播種を減らすために使用されてきた。最近の実験は、各種生理学的及び病理学的状態に寄与し得る中心体位置決め及び細胞サイズ調節を含めた細胞におけるROCKの新しい機能を規定した。Nature Reviews Mol.Cell Biol.,4:446−456(2003)を参照されたい。ROCKファミリーメンバーは、癌及び心血管系疾患を含めた各種病態に対する魅力的な介入標的である。例えば、Rhoキナーゼ阻害剤は高血圧症、狭心症及び喘息に対する有用な治療薬であり得る。更に、Rhoは末梢循環疾患、アテローム性動脈硬化症、炎症及び自己免疫性疾患において役割を果たすと期待され、よって治療のための有用な標的である。
70kDaリボソームS6キナーゼ(p70S6K)は複数のマイトジェン、成長因子及びホルモンにより活性化される。p70S6Kの活性化は多数の部位でのリン酸化により生じ、活性化キナーゼの主要標的は40Sリボソームタンパク質S6であり、これは哺乳動物細胞においてタンパク質合成に関与する機構の主要成分である。翻訳の調節に関与することに加えて、p70S6K活性化は細胞周期コントロール、ニューロン細胞分化、細胞運動性の調節、並びに腫瘍転移、免疫性及び組織修復において重要な細胞応答に関与している。p70S6Kキナーゼ活性のモジュレーションは癌、炎症及び各種神経障害のような疾患において治療上関係し得る。p70S6KキナーゼはProg.Cell Cycle Res.,1:21−32(1995)及びImmunol.Cell Biol.,78(4):447−51(2000)に詳細に記載されている。
グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK−3)は、細胞基質をリン酸化し、よって発生、代謝、遺伝子転写、タンパク質翻訳、細胞骨格組織化、細胞周期調節及びアポトーシスを含めた広範囲の各種の細胞機能を調節する偏在的に発現する構成活性なセリン/スレオニンキナーゼである。GSK−3は最初、グリコーゲン代謝に関与する主要酵素と記載されていたが、現在種々の細胞機能を調節することが公知である。2形態の酵素、すなわちGSK−3α及びGSK−3βが既に同定されている。GSK−3βの活性はタンパク質キナーゼB/Akt及びWntシグナル伝達経路により負に調節される。従って、GSK−3の小分子阻害剤は、神経変性疾患、II型糖尿病、双極性障害、卒中、癌及び慢性炎症性疾患の治療を含めた幾つかの治療用途を有する。癌におけるグリコーゲンシンターゼキナーゼ3の役割は、Wuts及び他のシグナル伝達経路による調節(Adv.Cancer Res.,84:203−29(2002));糖尿病、神経変性、癌及び炎症のための新しい有望な薬物としてのグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK−3)阻害剤(Med.Res.Rev.,22(4):373−84(2002));ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ/Akt細胞生存経路におけるグリコーゲンシンターゼキナーゼ3の役割(J.Biol.Chem.,273(32):19929−32(1998))に検討されている。
タンパク質キナーゼは代謝、細胞増殖、細胞分化及び細胞生存を含めたほぼ全ての細胞プロセスを調節するので、各種病的状態の治療手段に対する魅力的な標的である。例えば、タンパク質キナーゼが重要な役割を果たす細胞周期コントロール及び血管形成は多数の病的状態に関係する細胞プロセスである。前記病的状態には癌、炎症性疾患、異常血管形成及びこれに関連する疾患、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性、糖尿病、肥満及び疼痛が含まれるが、これらに限定されない。
タンパク質キナーゼは癌治療のための魅力的な標的となっている。Fabbroら,Pharmacology & Therapeutics,93:79−98(2002)。ヒト悪性疾患の発生におけるタンパク質キナーゼの関与は、(1)ゲノム転位(例えば、慢性骨髄性白血病におけるBCR−ABL)、(2)急性骨髄性白血病及び胃腸腫瘍のような構成的に活性なキナーゼ活性に至る突然変異、(3)癌遺伝子RASを有する癌の場合のように癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制機能の喪失によるキナーゼ活性の調節解除、(4)EGFRの場合のように過剰発現によるキナーゼ活性の調節解除、及び(5)腫瘍性表現型の発生及び維持に寄与し得る成長因子の異所性発現により生じ得ると提案されてきた。Fabbroら,Pharmacology & Therapeutics,93:79−98(2002)。
特定の癌が血管形成に関係している。血管形成は、既存血管系からの新しい毛細血管の成長である。W.Risau,Nature,386:671−674(1997)。タンパク質キナーゼが腫瘍性表現型の発生及び維持に寄与し得ることが判明している。Fabbroら,Pharmacology & Therapeutics,93:79−98(2002)。例えば、VEGF A−D及びその4つの受容体は、腫瘍血管形成及びリンパ管形成のような新血管形成及び高い血管浸透性を含む表現型に関与している。A.Matter,Drug Discov.Today,6:1005−1023(2001)。
心血管疾患(CVD)は世界中の年間全死亡のほぼ1/4を占めている。血管壁の調節不全成長及び重要臓器への血流の制限によりアテローム性動脈硬化症や再狭窄のような血管障害が起こる。各種キナーゼ経路(例えば、JNK)はアテローム発生刺激により活性化され、血管細胞における局所サイトカイン及び成長因子産生により調節される。Yangら,Immunity,9:575(1998)。虚血並びに心臓、腎臓または脳における再灌流を伴う虚血により細胞死及び瘢痕形成が生じ、最終的にはうっ血性心不全、腎不全または脳機能障害を生じる恐れがある。臓器移植の場合、既に虚血性ドナー臓器の再灌流により急性リンパ球媒介組織損傷及びグラフト機能の遅れが生じる。虚血及び再灌流経路は各種キナーゼにより媒介される。例えば、JNK経路は白血球媒介組織損傷にリンクしている。Liら,Mol.Cell.Biol.,16:5947−5954(1996)。最後に、心組織での高いアポトーシスもキナーゼ活性にリンクしている。Pomboら,J.Biol.Chem.,269:26546−26551(1994)。
タンパク質キナーゼ経路の複雑さ並びに各種タンパク質キナーゼ及びキナーゼ経路間の関係及び相互作用の複雑さの解明が複数のキナーゼまたは複数のキナーゼ経路に対して有利な活性を有するタンパク質キナーゼモジュレーター、調節剤または阻害剤として作用し得る医薬品を開発する重要性を強調している。
1個のキナーゼまたは1個のキナーゼ経路を特異的に標的化する単一薬物アプローチは疾患及び障害、特に癌を治療するには複数の理由で不十分であり得ると認められている。単一薬物アプローチは、非常に複雑な疾患、状態及び障害を治療するためには限定されたアプローチである。例えば、数学的モデルは、正常細胞から悪性転換への進行のためには5〜7突然変異が必要であることを示唆している。加えて、既存遺伝子の発現を修飾する他の事象(例えば、DNAメチル化)が生じ得る。
よって、癌が複数の経路、特に細胞成長、増殖、アポトーシス、運動性または侵入のようなプロセスと関係するタンパク質キナーゼ経路の変化の結果であることは広く認められている。癌の多くにおいて共通の要件は各種タンパク質キナーゼ(例えば、受容体及び非受容体キナーゼ、セリン/スレオニンキナーゼ、P13キナーゼ及び細胞周期関連キナーゼ)の同時過剰発現及び/または過多活性化である。実際、これらのキナーゼの幾つかは単独でまたは他のキナーゼと一緒に、転移及び血管形成または炎症に至る細胞生存、増殖、成長及び悪性転換、運動性及び侵入にとって重要な多数のプロセス並びに疾患、障害及びそれに関係する状態に関わっている。
よって、状態、疾患または障害の進行に影響を及ぼす標的キナーゼは複数存在するので、1個の標的キナーゼをブロックだけでは臨床的に十分でないことがある。加えて、豊富なキナーゼ媒介経路及び別の発癌または炎症メカニズムはブロックされた標的キナーゼを補償し得るので、1つの標的キナーゼをブロックするだけでは臨床的に十分でないことがある。更に、単一薬物の使用は、該薬物に対する耐性を発現する可能性を高める恐れもある。
従って、タンパク質キナーゼ経路の細胞内シグナル伝達カスケードの複雑さのために、複数の経路に同時に影響を及ぼす薬物が有意な臨床的活動のために必要であり得ることが示唆されている。組合せ効果を与える単一薬物は魅力的であることは示唆されているが、特定疾患環境で臨床的に有効な複数の経路の適切な組合せを標的化する単一薬物の同定及び使用が必要である。実際、Gleevec(登録商標)のような複数のキナーゼ薬は幾つかのキナーゼを一度に標的化することが公知である。Gleevec(登録商標)は主に、9:22染色体転座事象により作成されるablキナーゼを含有する突然変異融合タンパク質を標的化する。Gleevec(登録商標)は胃腸支質腫瘍(GIST)に関与するチロシンキナーゼであるc−kitをも標的化する。しかしながら、最近の臨床トライアルで、患者はGleevec(登録商標)に対して耐性を示したり、治療に対して不完全にしか応答しないことが判明している。
単一薬物が疾患の主因を標的化することができ、これにより1つの特定分子を標的化するだけで下流経路を調節することができることも示唆されている。例えば、ウイルス感染はしばしば複数のキナーゼの調節に影響を及ぼし、その結果ウイルス複製を抑制する薬物はウイルスにより活性化される複数のキナーゼの全ての活性化を抑制し得ることが判明している。しかしながら、タンパク質キナーゼ経路の細胞内シグナル伝達カスケードの複雑さ及びこれらが関与する疾患のために、特定のキナーゼ及び/またはキナーゼ経路を直接標的化することにより同時に複数の経路に影響を及ぼす単一薬物が必要とされている。特に、複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を同時に標的化し得、他のキナーゼ及び/または経路に影響を及ぼすことなく特定のキナーゼ及び/またはキナーゼ経路を直接に選択的に標的化し得る単一薬物の同定が必要である。例えば、ウイルス感染におけるウイルスにより活性化される複数キナーゼの全ての活性化を抑制する単一の薬物を使用するよりむしろ、単一薬物は活性化される特定の複数キナーゼを同時に、選択的に阻害し得る。
複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化する追加の戦略では単一標的薬のカクテルを使用してきた。臨床において薬物の組合せの使用が有望であることが判明したが、単一薬物の使用は投与が容易で簡単であるといった複数の理由のためにより実用的であるので複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化することができる単一薬物の開発がなお要望されている。更に、各々が単一経路を標的化する複数の薬物を用いる特定の治療レジメンが望ましくない副作用及び毒性を含めた合併症を伴う恐れがあることは既に公知である。
従って、特定組のキナーゼまたはキナーゼ経路、特に臨床効果を得るように複数の標的の適切な組合せを標的化することができる単一薬物の使用を含む方法の開発が依然として必要とされている。
本発明は、複数のキナーゼ(本明細書中では混合キナーゼとも呼ぶ)を同時に阻害することができる小分子キナーゼ阻害剤がある特定のキナーゼ阻害剤よりもより強い抗増殖活性を有するという知見に部分的に基づいている。1個の特定キナーゼまたは特定経路の阻害が有意な臨床応答を引き出すには必ずしも十分でなく、迅速な耐性を生ずる恐れがあるので、本発明は2個以上のキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化し得る単一薬物の使用を含む方法を包含する。従って、本発明の方法は、複数のタンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ経路を同時に標的化することにより血管形成及び転移に至る細胞生存、増殖、成長及び悪性転換、運動性及び侵入にとって重要なプロセスに影響を及ぼす方法からなる。
従って、本発明は、特定のキナーゼを標的化する、すなわち特定キナーゼの活性、機能またはレベル及び/または特定キナーゼをコードする遺伝子の発現レベルを調節またはモジュレートすることができる;特定キナーゼ媒介シグナル伝達経路を調節またはモジュレートする、すなわちキナーゼまたはキナーゼ媒介経路を標的化することができる薬物の使用に関する。前記薬物は「単一薬物」または「混合キナーゼ薬物」と呼ばれる。
本出願人は、CDKキナーゼ、Rskキナーゼ、チェックポイントキナーゼ、MAPKキナーゼ、Srcキナーゼ及びキナーゼFes、Lyn、Sykが重要であり、特に増殖性疾患の悪化にとって重要であることを知見した。従って、1実施形態では、薬物はsrcキナーゼファミリーからのキナーゼ、Rskキナーゼファミリーからのキナーゼ、CDKファミリーからのキナーゼ、MAPKキナーゼファミリーからのキナーゼ及びチロシンキナーゼ(例えば、Fes、Lyn及びSykキナーゼ)の2個以上を標的化する。前記薬物は同一ファミリーの2個以上のキナーゼを標的化し得、または2個以上のキナーゼファミリーまたはクラスのキナーゼを標的化し得る。
好ましい実施形態で、本発明は、疾患、障害または状態に関与する複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化することを含む前記した疾患、障害または状態の治療方法を提供する。
本発明はまた、単一薬物を単一キナーゼまたはキナーゼ経路を特異的に標的化する1つ以上の薬物との併用をも包含する。他の実施形態では、前記単一薬物は他の治療、例えば慣用形態の化学療法、抗血管形成、ヌクレオシドアナログ、プロテオソーム阻害剤等;放射線治療;サイトカイン治療;手術;または以下の第4.3節に記載されている他の治療と一緒に使用され得る。
よって、本発明の方法は、既存及び/または実験的治療に対する補助としても有用である。
本発明の方法によれば、各種疾患または障害に決定的に関与している複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を同時に標的化、調節または阻害することができるモジュレーターの同定が実施例4〜83に開示されているアッセイまたは実施例3に記載されているインビボモデルを用いることにより達成され得る。
定義
本明細書中で使用する場合、「耐性」及び「耐性な」は、特定キナーゼモジュレーターに対して検出可能に低下した応答をずっと示す標的キナーゼを指す。例えば、耐性キナーゼは、本発明の単一薬物に最初に接触した後に曝したキナーゼが該単一薬物に最初に曝されたときのキナーゼの応答に比して検出可能により高い活性を示すものである。例として、キナーゼは単一阻害剤または阻害剤混合物に対して耐性であっても、または応答の可能な軽減を示してもよい。キナーゼの特定のモジュレーターに対する耐性は、突然変異、翻訳後修飾の変化、キナーゼをコードする遺伝子の上方制御または下方制御、キナーゼの組織からの高いまたは低いクリアランスまたは他の原因により生じ得る。耐性は、その機能が標的化されるキナーゼ経路に対して少なくとも部分的に余分である代替キナーゼ媒介経路の上方制御の結果としても生じ得る。
本明細書中で使用する場合、「耐性」及び「耐性な」は、特定キナーゼモジュレーターに対して検出可能に低下した応答をずっと示す標的キナーゼを指す。例えば、耐性キナーゼは、本発明の単一薬物に最初に接触した後に曝したキナーゼが該単一薬物に最初に曝されたときのキナーゼの応答に比して検出可能により高い活性を示すものである。例として、キナーゼは単一阻害剤または阻害剤混合物に対して耐性であっても、または応答の可能な軽減を示してもよい。キナーゼの特定のモジュレーターに対する耐性は、突然変異、翻訳後修飾の変化、キナーゼをコードする遺伝子の上方制御または下方制御、キナーゼの組織からの高いまたは低いクリアランスまたは他の原因により生じ得る。耐性は、その機能が標的化されるキナーゼ経路に対して少なくとも部分的に余分である代替キナーゼ媒介経路の上方制御の結果としても生じ得る。
本明細書中で使用する場合、用語「同時」及び「同時に」は、単一薬物を個体に投与する場合の単一薬物の特定投与及び効果の期間を意味し、治療が全ての標的化キナーゼに対して有する効果を指し、この効果が投与及び効果の間のちょうどよい同一特定ポイントで立証可能であるかないかは関係ない。特定の単一薬物、単一薬物の組合せまたは1つ以上の単一薬物と1つ以上の他の化合物の組合せは治療中2個以上のキナーゼを同時に標的化する。例えば、単一薬物を個体に投与し、1つの標的化キナーゼに対する効果が直ちに(例えば、投与から最初の数分以内に)検出可能であり、第2の標的化キナーゼに対する効果はあとで検出できる場合、単一薬物は2個のキナーゼに対して同時に影響を及ぼすと言う。「同時」及び「同時に」は、単一薬物と接触させると生ずるインビトロの同様の効果をも指す。
本明細書中で使用する場合、「副作用」は、特定の単一薬物、単一薬物の組合せまたは単一薬物と他の治療の組合せの、標的化される2個以上のキナーゼの活性をモジュレートする(例えば、阻害する)直接の効果以外の作用を指す。
本明細書中で使用する場合、単一薬物は、各キナーゼと相互作用してキナーゼ活性を修飾、阻害または調節することにより、例えばキナーゼを競合、非競合または未競合的に阻害する;キナーゼに特異的な転写複合体と相互作用することにより組織中のキナーゼレベルを変化させる;特異的キナーゼの翻訳後修飾を変化させる;等により2個以上の標的キナーゼに対して「直接」または「特異的に」作用する。例えば、化合物が2個以上のキナーゼを直接標的化するかどうかは本明細書に記載されているインビトロアッセイを用いて調べることができ、または他の当業界で公知のキナーゼアッセイを用いて調べることができる。標的キナーゼに対する作用が単に標的キナーゼを修飾するキナーゼに対する単一薬物の作用の結果である場合には標的キナーゼに対して「直接」作用しない。
本明細書中で使用する場合、「治療有効量」は、疾患の1つ以上の症状を検出可能に改善するのに十分な治療薬の量を指す。特定実施形態では、「治療有効量」は原発性、限局性または転移性癌組織を破壊、修飾、コントロールまたは除去するのに十分な治療薬の量を指す。よって、治療有効量は癌の広がりを遅らすまたは最小限とするのに十分な治療薬の量を指す。別の例では、「治療有効量」は炎症、サイトカインの産生または炎症を伴う細胞の増殖を検出可能に抑えるのに有効な量を指す。治療有効量は、個体集団において疾患、状態または障害の治療または管理において治療効果を与える;または疾患、状態または障害の1つ以上の症状の発現または再発の頻度を低下させる治療薬の量をも指すことがある。
本明細書中で使用する場合、「予防有効量」は、疾患、状態または障害の1つ以上の症状の再発または発現を防止するのに十分な予防薬の量を指す。
特定実施形態では、「予防有効量」は、癌の再発または広がりを予防するのに十分な予防薬の量を指す。よって、この用語は、個体において癌の再発または広がり或いは癌の発生を予防するのに十分な予防薬の量を指し、前記個体には癌にかかりやすいまたは発癌性薬物に既に曝されている個体が含まれるが、これらに限定されない。予防有効量は、疾患、状態または障害の予防において予防効果を与える予防薬の量を指すこともある。
本明細書中で使用する場合、「単一薬物」は、2個以上のキナーゼまたはキナーゼ経路を同時に標的化し、疾患、状態または障害の1つ以上の症状の予防、治療、管理または改善において使用され得る治療または予防薬を指す。好ましくは、単一薬物は高分子(例えば、タンパク質、ポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチド)ではなく、好ましくは1000ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。単一薬物はペプチドまたはポリヌクレオチド断片(例えば、アプタマー)であり得る。好ましくは、単一薬物は経口的に生体利用可能及び/または生物活性であり、例えば筋肉内、静脈内または吸入によりデリバリーしたとき生物活性であり且つ生体利用可能である。用語「単一薬物」は未変性形態で存在する天然タンパク質を含まない。
本明細書中で使用する場合、用語「薬物」、「治療薬」または「予防薬」は、キナーゼを標的化する、すなわちタンパク質キナーゼの機能、活性または発現をモジュレート、調節、増強、阻止、阻害、抑制または中和する任意の薬物、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、大分子または小分子(10kD未満)を指す。
本明細書中で使用する場合、成句「非応答性/難治性」は、現在利用されている治療で治療を受けが、この治療が患者の症状を改善するのに臨床的に十分でなく、よってこの患者は追加の有効治療を受けなければならない患者を指すべく使用される(例えば、治療に対して依然として非感受性である)。この成句は、治療に応答した患者がなお副作用を被る、再発する、耐性を示すこと等をも指し得る。抗癌治療に関連して、具体的実施形態では「非応答性/無反応性」は癌細胞の少なくとも若干の有意部分が殺されず、細胞分化が停止していることを意味する。癌細胞が「非応答性/難治性」であるかどうかは、「難治性」の当業界で認められている意味を用いて癌細胞に対する治療の有効性を評価するための当業界で公知の方法によりインビトロまたはインビボで調べることができる。
各種実施形態において、癌は、癌細胞の数が有意に減少していないまたは増加している「非応答性/難治性」である。
本明細書中で使用する場合、成句「低トレランス」は、患者が治療から副作用を被っている状態から患者にとって有効でない及び/または副作用のために治療を続けられない程度を指す。
本明細書中で使用する場合、用語「個体」、「被験者」及び「患者」は互換可能に使用されている。本明細書中で使用する場合、好ましい被験者は哺乳動物、例えば非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等)または霊長類(例えば、サル及びヒト)である。
本明細書中で使用する場合、用語「管理する」、「管理している」及び「管理」は、被験者が予防または治療薬の恩恵を受けるが、疾患を治癒させない有利な効果を指す。特定実施形態では、被験者は疾患を「管理」して疾患の進行または悪化を防ぐために1つ以上の予防または治療薬を投与される。
本明細書中で使用する場合、用語「予防する」、「予防している」及び「予防」は、疾患、障害または状態の1つ以上の症状の再発または発現の予防を指す。1実施形態では、この用語は、被験者において予防または治療薬を投与すると生ずる自己免疫性または炎症性疾患の1つ以上の症状の再発または発現の予防を指す。別の実施形態において、用語「予防する」、「予防している」及び「予防」は、予防または治療薬の投与により生ずる被験者における癌の再発、広がりまたは発現の予防をも指す。
本明細書中で使用する場合、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、1つ以上の予防または治療薬を投与すると生ずる疾患、障害または状態に関連する1つ以上の症状の改善を指す。特定実施形態では、この用語は、治療を要する被験者に対して1つ以上の予防または治療薬を投与すると生ずる細胞の増殖活性の低下を指す。他の実施形態において、この用語は、治療を要する被験者に対して1つ以上の予防または治療薬を投与すると生ずる細胞の炎症活性の低下を指す。他の特定実施形態において、この用語は、治療を要する被験者に対して1つ以上の予防または治療薬を投与すると生ずる細胞の異常な血管形成活性の低下を指す。
抗癌治療に関連して本明細書中で使用する場合、用語「治療する」、「治療している」及び「治療」は、1つ以上の予防または治療薬の投与により生ずる原発性、限局性または転移性癌組織の根絶、除去、修飾、蔓延の低下または蔓延速度の低下、或いはコントロールを指す。特定実施形態において、この用語は、癌患者に1つ以上の予防または治療薬を投与すると生ずる癌の蔓延を最小限にするまたは遅らすことを指す。
本発明は、2個以上のタンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ経路が関与する状態、疾患または障害の治療、予防または管理方法を包含する。本発明は、複数のキナーゼ(本明細書中では混合キナーゼとも呼ぶ)を同時に阻害することができる小分子キナーゼ阻害剤がある特定のキナーゼ阻害剤よりもより強力な抗増殖活性を有するという知見に部分的に基づいている。本発明者らは、srcキナーゼファミリーからのキナーゼ、Rskキナーゼファミリーからのキナーゼ、CDKファミリーからのキナーゼ、MAPKキナーゼファミリーからのキナーゼ及びチロシンキナーゼ(例えば、Fes、Lyn及びSykキナーゼ)の2個以上が関与するタンパク質キナーゼ経路を同時にモジュレートすることにより血管形成及び転移に至る細胞生存、増殖、成長及び悪性転換、運動性及び侵入にとって重要なプロセスに影響を及ぼす方法を知見した。具体的には、本発明者らは複数のキナーゼ及び/またはキナーゼ経路を同時に標的化することができる単一薬物を見つけた。
1つの特定キナーゼまたは特定経路の阻害が有意な臨床応答を誘起するのに必ずしも十分でなく、迅速な耐性を生ずることがあるので、本発明は2個以上のキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化することができる単一薬物の使用を含む方法を包含する。本発明の方法は、単一キナーゼまたはキナーゼ経路を標的化する単一薬物が直面する攻撃を回避することができる。
本発明の方法は、複数のタンパク質キナーゼまたはタンパク質キナーゼ経路を同時に標的化することにより血管形成及び転移に至る細胞生存、増殖、成長及び悪性転換、運動性及び侵入にとって重要なプロセスに影響を及ぼす方法を含む。この方法は、2個以上のキナーゼまたはキナーゼ経路をモジュレート、調節または阻害する単一薬物の使用を含む。
よって、本発明の方法は、各種疾患、障害または状態に関与する多数のキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化することを含む方法を含む。特に、本発明において意図する方法は、複数の標的の適切な組合せを標的化し、臨床効果を与える単一薬物の使用を含む。
1実施形態では、上記方法は、治療を要する患者に対して複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を同時に標的化する単一薬物を有効量投与することを含む。
好ましい実施形態では、単一薬物は以下の第3節に記載されている1つ以上のキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化する。
特に好ましい実施形態では、単一薬物はタンパク質キナーゼのsrcキナーゼファミリーの少なくとも1つのメンバーを標的化する。他の好ましい実施形態では、単一薬物はRskキナーゼファミリーの少なくとも1つのメンバーを標的化する。更に他の好ましい実施形態では、単一薬物はタンパク質キナーゼのCDKファミリーの少なくとも1つのメンバーを標的化し得る。更に他の好ましい実施形態では、単一薬物は少なくとも1つのチェックポイントキナーゼを標的化する。他の好ましい実施形態では、単一薬物はタンパク質キナーゼのMAPKキナーゼファミリーの少なくとも1つのメンバーを標的化する。本発明はまた、キナーゼを標的化することができる単一薬物の使用をも意図しており、前記キナーゼにはROCK−II、PRK2、PRAK、p70S6キナーゼまたはオーロラAキナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
上記した実施形態の各々において、本発明では単一薬物は2個以上のキナーゼまたはキナーゼ経路、好ましくは3個以上のキナーゼまたはキナーゼ経路を同時に標的化すると考えられる。
1実施形態では、単一薬物は、それぞれの特異的キナーゼの活性、発現または機能を直接モジュレート、調節または阻害することにより2個以上のキナーゼを同時に標的化する。特に、単一薬物は複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を同時に標的化し、他のキナーゼ及び/またはキナーゼ経路に影響を及ぼすことなく特定のキナーゼ及び/またはキナーゼ経路を直接且つ選択的に標的することができる。
1実施形態では、単一薬物は複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を同時にモジュレート、調節または阻害することができる。特定実施形態では、単一薬物は複数のキナーゼの活性をモジュレートし、或いは複数のキナーゼの活性を調節または阻害する。別の特定実施形態では、単一薬物は複数のキナーゼの活性をモジュレートし、或いは複数のキナーゼをコードする遺伝子の発現を調節または抑制する。更に別の特定実施形態では、単一薬物は複数のキナーゼの機能をモジュレート、調節または抑制する。代替実施形態では、単一薬物は複数のキナーゼの活性をモジュレートし、或いは複数のキナーゼの活性、発現及び/または機能を調節または阻害する。
1実施形態では、単一薬物は同一キナーゼ経路中の2個以上のキナーゼの活性をモジュレートし、或いは前記キナーゼを調節または阻害する。代替実施形態では、単一薬物は少なくとも2個の異なるキナーゼ経路中の複数のキナーゼをモジュレート、調節または阻害する。
別の実施形態では、単一薬物は同一キナーゼファミリー中の少なくとも2個のキナーゼをモジュレート、調節または阻害する。代替実施形態では、単一薬物は異なるキナーゼファミリー中の複数キナーゼをモジュレート、調節または阻害する。
更に別の実施形態では、単一薬物は対応キナーゼ、その下流標的及び/またはその上流標的をモジュレート、調節または抑制する。
特定実施形態では、単一薬物は異常に発現、異常に活性化または突然変異されるキナーゼをコードする複数の遺伝子をモジュレート、調節または抑制する。この実施形態では、キナーゼは過剰発現または過小発現され得、または過多活性化及び/または過小活性化され得及び/または全く活性化されないことがある。
特定実施形態では、単一薬物は複数のキナーゼファミリーメンバーを含むキナーゼ群を標的化する。1実施形態では、単一薬物はサイクリンヌクレオチド調節−リン脂質調節されるキナーゼ及びリボソームS6キナーゼであるキナーゼを標的化する。前記群のメンバーであるキナーゼの例は本明細書に記載されているが、この中にはタンパク質キナーゼA(PKA)、タンパク質キナーゼG(PKG)及びタンパク質キナーゼC(PKC)が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、単一薬物はCa2+/カルモジュリンキナーゼを標的化する。本発明の更に別の実施形態では、単一薬物はサイクリン依存性キナーゼを標的化する。サイクリン依存性キナーゼの例は本明細書に記載されているが、この中にはサイクリン依存性キナーゼ(CDK1)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK/ERK)及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ(GSK3)が含まれるが、これらに限定されない。本発明の更に別の実施形態では、単一薬物はタンパク質チロシンキナーゼを標的化する。チロシンキナーゼの例は本明細書に記載されているが、この中にはSRC及びEFRが含まれるが、これらに限定されない。
ヒスチジンキナーゼは本発明の方法を用いて標的化され得る。前記キナーゼにはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素4(PDK4)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素3(PDK3)、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDK)及びピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素(PDK1)が含まれるが、これらに限定されない。
他の特定実施形態では、単一薬物はセリン/スレオニンキナーゼを標的化する。別の実施形態では、単一薬物はアルギニンまたはリシン近くのセリン/スレオニン残基をリン酸化するキナーゼを標的化する。更に別の実施形態では、単一薬物はプロリンリッチドメイン中のセリン/スレオニン残基をリン酸化するキナーゼを標的化する。別の実施形態では、単一薬物は受容体型チロシンキナーゼを標的化する。更に別の実施形態では、単一薬物は非受容体型チロシンキナーゼを標的化する。特定実施形態では、単一薬物はDNA依存性タンパク質キナーゼ(DNA−PK)を標的化する。更に別の実施形態では、単一薬物は本明細書中に記載されている群、ファミリーまたはサブファミリーの1つに同定されていないキナーゼを標的化する。
本発明のより具体的な実施形態では、単一薬物はキナーゼのSRCファミリーに関連するキナーゼ、好ましくはcSRC、YES、FYN及びLCKを標的化する。
本発明の別のより具体的な実施形態では、単一薬物はSRC関連キナーゼ以外のチロシンキナーゼに関連するキナーゼを標的化する。好ましくは、前記キナーゼはFES、LYN及びSYKである。
別のより具体的な実施形態では、単一薬物はキナーゼのRskファミリーに関連するキナーゼを標的化し、好ましくはRsk1、Rsk2及びRsk3を標的化する。
別のより具体的な実施形態では、単一薬物はキナーゼのCDKファミリーに関連するキナーゼ、好ましくはCDK1/サイクリンB1、CDK2/サイクリンA、CDK3/サイクリンE、CDK5/p53、CDK6/サイクリンD3及びCDK7/サイクリンH/MAT1を標的化する。
別のより具体的な実施形態では、単一薬物はキナーゼのチェックポイントファミリーに関連するキナーゼ、好ましくはCHK1及びCHK2を標的化する。
別のより具体的な実施形態では、単一薬物はキナーゼのMAPKファミリーに関連するキナーゼ、好ましくはJNK1、MAPK1/ERK1、MAPK2/ERK2、MAPKAP−K5及びMEK1を標的化する。
別のより具体的な実施形態では、単一薬物は本明細書中の第3節に同定されている他のキナーゼを標的化する。このキナーゼにはROCK−II、PRK2、PRAK、p70S6キナーゼ及びオーロラAが含まれるが、これらに限定されない。
特定実施形態では、単一薬物は互いに相互作用するキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化する。代替実施形態では、単一薬物は互いに相互作用しないキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化する。特定の他の実施形態では、単一薬物は同一細胞プロセスに関与するキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化する。代替実施形態では、単一薬物は異なる細胞プロセスに関与するキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化する。
好ましい実施形態では、単一薬物はチロシンキナーゼまたはチロシンキナーゼ経路を標的化し、糖尿病、癌、細胞増殖性障害、炎症及び肥満のような疾患の治療において有用である。第2節も参照されたい。
好ましい実施形態では、単一薬物は少なくともヒトCDK1、CDK2、cSRC、Yes、MEK1及びRsk1を標的化する。別の好ましい実施形態では、単一薬物はCDK1、CDK2、cSRC、Yes、MEK1及びRsk1の少なくとも3個の活性を単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して少なくとも75%阻害する。別の好ましい実施形態では、単一薬物はCDK1、CDK2、cSRC、Yes、MEK1及びRsk1の各々の活性を単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して少なくとも90%阻害する。
別の実施形態では、単一薬物はインビトロで1つ以上の薬物耐性細胞系において抗増殖活性を示す。この抗増殖活性は特定増殖性細胞系の増殖率が検出可能に減少または低下することより立証される。別の実施形態では、単一薬物はインビトロで1つ以上の癌細胞系のパネルに対して抗細胞増殖活性を示す。更に別の実施形態では、単一薬物は以下の実施例に記載されているインビトロキナーゼアッセイで各種キナーゼを阻害する。
別の好ましい実施形態では、単一薬物はサイクリン依存性キナーゼまたはサイクリン依存性キナーゼ経路を標的化し、癌、過剰増殖性疾患及び免疫疾患のような疾患の治療において有用である。
別の好ましい実施形態では、単一薬物は、チロシンキナーゼまたはチロシンキナーゼ経路を標的化し、多いまたは異常な血管新生及び血管形成を伴う疾患の治療において有用である。例えば、単一薬物は、癌または腫瘍内及びその周囲での著しい血管新生または血管形成により増殖が促進される癌または腫瘍の治療において有用である。
別の実施形態では、単一薬物はcSRC、Yes、Fyn、Lck、Fes、Lyn、Syk、Rsk、CDK1、CDK2、CDK3、CDK5、CDK6、CDK7、CHK1、CHK2、JNK1、MAPK1、MAPK2、MAPKAP−K5、MEKI、ROCKII、PRK2、PRAK、p70S6及びオーロラAのキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも7個を標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例には癌または細胞増殖;不適切または疾患に関連する血管形成;心血管疾患;炎症;インスリン抵抗性、糖尿病または肥満;神経疾患;または微生物による感染が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、単一薬物は、Yes、BMX、Syk、Eph、FGFR、RYK、MUSK、JAK1及びEGFRのキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも7個を標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例にはインスリン抵抗性、糖尿病または肥満;癌、細胞増殖及び関連する先天性症候群;炎症;不適切または疾患に関連する血管形成;心血管疾患;または微生物による感染が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、単一薬物は、CDK、JNK、ERK、CDKL、ICK、CLK及びDYRKのキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個または少なくとも5個を標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例には癌、細胞増殖及び関連する先天性症候群;インスリン抵抗性、糖尿病または肥満;神経疾患;または微生物による感染が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、単一薬物は、Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr、DYRK及びYrkのキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも7個を標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例には癌または過剰増殖;免疫;不適切または疾患に関連する血管形成;神経疾患;心血管疾患;炎症;または微生物による感染が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、単一薬物は、MAPK、MAPK3、ERK2、MAPK7、JNK1、MAPK10、JNK3アルファまたはMAPK14のキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも7個を標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例にはインスリン抵抗性、糖尿病または肥満;炎症;心血管疾患;不適切または疾患に関連する血管形成;癌、細胞増殖または関連する先天性疾患;または微生物による感染が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、単一薬物は、CHK1、CHK2、RSK1、RSK2、RSK3、オーロラA、オーロラB、ROCKI、ROCKIIまたはp70S6Kのキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも7個を標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例にはインスリン抵抗性、糖尿病または肥満;炎症;不適切または疾患に関連する血管形成;心血管疾患;癌、過剰増殖または関連する先天性疾患;または微生物による感染が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、単一薬物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素4(PDK4)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素3(PDK3)、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDK)またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素1(PDK1)の少なくとも2個または少なくとも3個を標的化し、これに関係する疾患の治療、予防、管理または改善において有用である。前記疾患の例には癌、過剰増殖または関連する先天性疾患;炎症;血管形成;微生物による感染;心血管疾患;またはインスリン抵抗性、糖尿病または肥満が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、単一薬物は、エフリンタイプ受容体キナーゼ及び向神経性タイプ受容体キナーゼを標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例には神経障害が含まれるが、これに限定されない。更に別の好ましい実施形態では、単一薬物は非受容体チロシンキナーゼ及びIL−1受容体関連キナーゼを標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患には造血、免疫または血管形成が含まれるが、これらに限定されない。更に別の実施形態では、単一薬物は、チロシンキナーゼ、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ、JNK、IKK及びPKCの経路の少なくとも2個、少なくとも3個または少なくとも4個を標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例にはインスリン抵抗性、糖尿病または肥満が含まれるが、これらに限定されない。更に別の実施形態では、単一薬物は、ABL、EGFR、VEGFR、NGFR、PKC、PDGFR、CDK、MKK1、CHK1及びmTORのキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも7個を標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例には癌または細胞増殖が含まれるが、これらに限定されない。更に別の実施形態では、単一薬物はPKC、Akt、PI−3キナーゼ、GSK3及びRTKのキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個または少なくとも4個を標的化し、これに関係する疾患の治療のために有用である。前記疾患の例にはインスリン抵抗性、糖尿病または肥満が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法は化合物である単一薬物の使用を包含する。この単一薬物には2個以上のキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化する単一薬物が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、単一薬物はCC001、CC002、CC004またはCC0005として同定されている化合物であり得る。
本発明はまた、本明細書中に混合キナーゼ薬物とも呼ばれている単一薬物の単独使用(単治療)または単一キナーゼまたはキナーゼ経路を特異的に標的化する1つ以上の薬物及び/または他の治療(例えば、放射線治療)との併用を意図している。1つ以上の単一薬物と組み合わせて使用され得る他の(補助)治療のより包括的なリストについては以下の第4.3節を参照されたい。
本発明の方法によれば、各種疾患または障害に決定的に関与する複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を同時に標的化し得る、すなわちモジュレート、調節または阻害することができる単一薬物は、当業界で公知のキナーゼアッセイ、例えば後記実施例4〜84に記載されているアッセイを用いて同定され得る。
1.患者集団
本発明は、2個以上のキナーゼと関係する疾患または状態を有する個体の治療方法を提供する。本明細書中で使用する場合、「個体」、「患者」等は真核生物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。
本発明は、2個以上のキナーゼと関係する疾患または状態を有する個体の治療方法を提供する。本明細書中で使用する場合、「個体」、「患者」等は真核生物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。
1実施形態では、本発明の方法は、1個の特定キナーゼまたはキナーゼ経路を標的化し得る単一薬物に対して難治性または抵抗性である患者の疾患または障害の治療、管理または予防において有用である。本発明の方法は、他の治療を受けた、現在受けているまたは将来受けるかもしれない患者の疾患または障害の治療、管理または予防において有用であるとも考えられる。例えば、本発明の化合物は、他の治療薬を投与されたかまたは他の治療(例えば、放射線または手術)を受けた個体に対して投与され得る。
本発明の方法は、治療を受けていない患者に有用であるだけでなく、現在の標準的及び実験的治療に対して部分的または完全に難治性である患者の治療においても有用である。1実施形態で、本発明は、単一キナーゼまたはキナーゼ経路を特異的に標的化し得る薬物を投与することを含む上記治療以外の治療に対して難治性または非応答性であることが判明しているまたは難治性または非応答性であり得る疾患、状態または障害を治療または予防するための治療及び予防方法を提供する。代替実施形態では、本発明は、単一キナーゼまたはキナーゼ経路を特異的に標的化し得る単一薬物を投与することを含む治療に対して難治性または非応答性であることが判明しているまたは難治性または非応答性であり得る疾患、状態または障害を治療または予防するための治療及び予防方法を提供する。
別の実施形態では、本発明の方法は、現在他の治療、例えば抗癌治療(例:化学療法、手術、放射線治療、抗体治療等)及び抗炎症治療(例:ステロイド系または非ステロイド系抗炎症薬、抗体治療、β−アゴニスト、サイトカイン治療等)を受けている患者の疾患または障害の治療、管理または予防において有用である。
更に別の実施形態で、本発明の方法は、病的状態、特に癌、肥満または炎症関連疾患、または第2節に挙げられている疾患にかかりやすいことが分かっている患者の疾患または障害の治療、管理または予防において有用である。
2.疾患及び障害
本発明は、1個以上のタンパク質キナーゼの活性または不活性に関係する疾患、障害または感染に関連する症状を予防、治療または改善するために1つ以上の化合物を動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに投与することを含む治療を包含する。好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも2個のタンパク質キナーゼ、少なくとも3個のタンパク質キナーゼ、少なくとも4個のタンパク質キナーゼ、少なくとも5個のタンパク質キナーゼ、少なくとも10個のタンパク質キナーゼまたは少なくとも12個のタンパク質キナーゼの異常活性(例えば、異常な上方制御または下方制御)に関係する疾患、障害または炎症を伴う症状の予防、治療または改善に関する。幾つかの実施形態では、本発明の方法は1つ以上の治療と組み合わせて使用される。前記治療には化学療法、放射線治療、ホルモン治療及び/または生物学的治療/免疫治療が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、1個以上のタンパク質キナーゼの活性または不活性に関係する疾患、障害または感染に関連する症状を予防、治療または改善するために1つ以上の化合物を動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに投与することを含む治療を包含する。好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも2個のタンパク質キナーゼ、少なくとも3個のタンパク質キナーゼ、少なくとも4個のタンパク質キナーゼ、少なくとも5個のタンパク質キナーゼ、少なくとも10個のタンパク質キナーゼまたは少なくとも12個のタンパク質キナーゼの異常活性(例えば、異常な上方制御または下方制御)に関係する疾患、障害または炎症を伴う症状の予防、治療または改善に関する。幾つかの実施形態では、本発明の方法は1つ以上の治療と組み合わせて使用される。前記治療には化学療法、放射線治療、ホルモン治療及び/または生物学的治療/免疫治療が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法は、タンパク質キナーゼ活性に関係する各種疾患または障害の治療、予防、管理または改善において有用である。前記疾患または障害には遺伝子発現、細胞骨格完全性、細胞接着、細胞周期進行、分化または代謝に関連する疾患が含まれるが、これらに限定されない。前記疾患はタンパク質キナーゼ及びホスファターゼの複雑な相互作用によりコントロールされ、細胞シグナル伝達の関連機能不全は癌や糖尿病を含めた多くの疾患にリンクしている。Sridharら,Pharmaceutical Research,17(11):1345−1353(2000)。タンパク質キナーゼを標的化し、よってシグナル伝達を調節する治療法は熱心な研究の主題となっている。例えば、タンパク質キナーゼC及びチロシンキナーゼは特定タイプの癌、糖尿病及び糖尿病に伴う合併症に関与している。加えて、タンパク質キナーゼCイソ型は糖尿病の血管合併症で見られる細胞変化に関与している。Sridharら,Pharmaceutical Research,17(11):1345−1353(2000);Chalfantら,Mol.Endocrinol.,10:1273−1281(1996)。タンパク質キナーゼ経路に関係する複雑性の結果として、各種タンパク質キナーゼと広範囲の疾患または障害の間に重複が見られる。本発明の方法は、タンパク質キナーゼに関係する疾患の治療、管理、予防または改善に関する。前記疾患には癌、炎症性疾患、糖尿病、肥満、血管形成疾患及び心血管疾患が含まれるが、これらに限定されない。
特に、本発明の方法は各種疾患の予防、治療、管理及び/または改善のために有用である。非限定的例として、予防、治療または管理され得る疾患のタイプの例には炎症状態が含まれるが、これらに限定されない。この炎症性状態には糖尿病(例えば、II型糖尿病、I型糖尿病、尿崩症、真性糖尿病、成人期発症糖尿病、若年性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、栄養不良関連糖尿病、ケトーシス傾向糖尿病またはケトーシス耐性糖尿病)、腎障害(例えば、糸球体腎炎または急性/慢性腎不全)、肥満(例えば、遺伝性肥満、食事性肥満、ホルモン関連肥満または薬剤投与に関連する肥満)、難聴(例えば、外耳炎または急性中耳炎による難聴)、線維症関連疾患(例えば、肺間質性線維症、腎線維症、のう胞性線維症、肝線維症、創傷治癒または火傷治癒(ここで、火傷は1度、2度または3度の火傷及び/または熱、化学的または電気的火傷である)、関節炎(例えば、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、変形性関節炎または痛風)、アレルギー、アレルギー性鼻炎、急性呼吸窮迫症候群、喘息、気管支炎、炎症性腸疾患(例えば、過敏性腸症候群、粘液性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、胃炎、食道炎、膵炎または腹膜炎)、または自己免疫疾患(例えば、強皮症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、移植片拒絶、内毒素ショック、敗血症、乾せん、湿疹、皮膚炎または多発性硬化症)が含まれるが、これらに限定されない。
(2.1) 増殖性疾患
本発明の方法は、増殖性疾患の発生、発現、成長または進行を管理、治療、予防、抑制または軽減するために単独でまたは当業界で公知の他の治療と組み合わせて使用され得る。具体的実施形態では、本発明の方法は、単独でまたは当業界で公知の別の癌治療と組み合わせて投与するとき、罹患細胞の数で測定して増殖性疾患または状態の発生、発現、成長または進行を本発明の方法の非存在下での原発性腫瘍の成長また転移に比して少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%または少なくとも10%抑制または減少させる。
本発明の方法は、増殖性疾患の発生、発現、成長または進行を管理、治療、予防、抑制または軽減するために単独でまたは当業界で公知の他の治療と組み合わせて使用され得る。具体的実施形態では、本発明の方法は、単独でまたは当業界で公知の別の癌治療と組み合わせて投与するとき、罹患細胞の数で測定して増殖性疾患または状態の発生、発現、成長または進行を本発明の方法の非存在下での原発性腫瘍の成長また転移に比して少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%または少なくとも10%抑制または減少させる。
1実施形態では、増殖性疾患は癌である。従って、本発明は、癌、炎症、糖尿病、肥満及び他のキナーゼ関連疾患の予防、治療または管理方法を提供する。具体的実施形態では、本発明の方法は、単独でまたは当業界で公知の別の癌治療と組み合わせて投与するとき、原発性腫瘍の増殖または癌細胞の転移を本発明の方法の非存在下での原発性腫瘍の成長また転移に比して少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%または少なくとも10%抑制または減少させる。
各種実施形態において、本発明に従って治療され得る癌は頭、首、眼、口、喉、食道、胸、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、睾丸または他の生殖器官、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓及び脳または中枢神経系の癌であり得る。
本発明の方法及び組成物により治療または予防され得る癌及び関連疾患には以下の疾患が含まれるが、これらに限定されない。白血病、この例には急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病(例えば、骨髄芽球性、前骨芽球性、骨髄性単球性、単球性、赤白血病及び骨髄異形成症候群)、慢性白血病(この非限定例は慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病)、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病である)が含まれるが、これらに限定されない;真性赤血球増加症;リンパ腫、この例にはホジキン病、非ホジキン病が含まれるが、これらに限定されない;多発性骨髄腫、この例にはくすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化骨髄腫、プラズマ細胞白血病、孤立形質細胞腫及び髄外形質細胞腫が含まれるが、これらに限定されない;ワルデンストレームマクログロブリン血症;はっきりしない意味を有するモノクローナルガンマグロブリン異常;良性モノクローナルガンマグロブリン異常;重鎖疾患;骨及び結合組織肉腫、この例には硬骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊椎腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫(血管内皮腫)、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫が含まれるが、これらに限定されない;脳腫瘍、この例にはグリオーマ、アストロチトーム、脳幹部グリオーマ、脳室上皮腫、乏突起細胞腫、非グリア腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫が含まれるが、これらに限定されない;乳癌、この例には腺癌、小葉(小細胞)癌、乳管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭状乳癌、ページェット病及び炎症性乳癌が含まれるが、これらに限定されない;副腎癌、この例には褐色細胞腫及び副腎癌が含まれるが、これらに限定されない;甲状腺癌、この例には乳頭状またはろ胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌及び未分化甲状腺癌が含まれるが、これらに限定されない;膵臓癌、この例にはインスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍及びカルチノイドまたは膵島細胞腫瘍が含まれるが、これらに限定されない;下垂体癌、この例にはクッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端肥大症及び尿崩症が含まれるが、これらに限定されない;眼癌、この例には眼黒色腫(例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫及び毛様体黒色腫)及び網膜芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない;膣癌、この例には扁平上皮癌、腺癌及び黒色腫が含まれるが、これらに限定されない;外陰癌、この例には扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫及びページェット病が含まれるが、これらに限定されない;頸癌、この例には扁平上皮癌及び腺癌が含まれるが、これらに限定されない;子宮癌、この例には子宮内膜癌及び子宮肉腫が含まれるが、これらに限定されない;卵巣癌、この例には卵巣上皮癌、境界領域腫瘍、生殖細胞腫瘍及び間質性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない;食道癌、この例には扁平上皮癌、腺癌、腺様のう胞癌、粘膜上皮癌、腺表皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅癌及び燕麦細胞(小細胞)癌が含まれるが、これらに限定されない;胃癌、この例には腺癌、肉芽腫性(ポリープ状)、潰瘍化、表面拡散、びまん性拡散、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び癌肉腫が含まれるが、これらに限定されない;結腸癌;直腸癌;肝癌、この例には肝細胞癌及び肝芽腫が含まれるが、これらに限定されない;胆嚢癌、この例には腺癌が含まれるが、これに限定されない;胆管癌、この例には乳頭状、結節状及びびらん性が含まれるが、これらに限定されない;肺癌、この例には非小細胞癌、扁平上皮癌(類表皮癌)、腺癌、大細胞癌及び小細胞肺癌が含まれるが、これらに限定されない;睾丸癌、この例には生殖腫瘍、セミノーマ、未分化癌、古典的(典型的)、精母細胞、非セミノーマ、胎生期腫瘍、奇形腫、絨毛癌(卵黄のう腫瘍)が含まれるが、これらに限定されない;前立腺癌、この例には腺癌、平滑筋肉腫及び横紋筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない;陰茎癌;口腔癌、この例には扁平上皮癌が含まれるが、これに限定されない;基底癌;唾液腺癌、この例には腺癌、粘膜表皮癌及び腺様のう胞癌が含まれるが、これらに限定されない;咽頭癌、この例には扁平上皮癌及び疣贅癌が含まれるが、これらに限定されない;皮膚癌、この例には基底細胞腫、扁平上皮癌及び黒色腫、表在拡散性黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性ほくろ性黒色腫が含まれるが、これらに限定されない;腎臓癌、この例には腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌(腎盂及び/または子宮)が含まれるが、これらに限定されない;ウイルムス腫瘍;膀胱癌、この例には移行上皮細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫が含まれるが、これらに限定されない。加えて、癌には粘液肉腫、骨形成肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜肉腫、血管芽腫、上皮性悪性腫瘍、のう胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、悪性散発性黒色腫、散発性膵臓癌、ポイシ・ジェガーズ症候群、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌及び皮膚癌(扁平上皮癌を含む);リンパ系の造血性腫瘍(白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ベルケットリンパ腫を含む)、骨髄系の造血性腫瘍(急性及び慢性骨髄性白血病、前骨芽球性白血病を含む)、間葉起源の腫瘍(線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む)、他の腫瘍(黒色腫、セミノーマ、奇形癌、神経芽細胞腫及びグリオームを含む)、中枢及び末梢神経系腫瘍(星状細胞腫、神経芽細胞腫、グリオーム及びシュワノーマを含む)、間葉起源の腫瘍(線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む)及び他の腫瘍(黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、セミノーマ、甲状腺ろ胞状癌及び奇形癌を含む)が含まれる。アポトーシスの異常に起因する癌も本発明の方法及び組成物により治療されると考えられる。前記癌にはろ胞性リンパ腫、p53変異を有する癌腫、乳房、前立腺及び卵巣のホルモン依存性腫瘍並びに前癌病巣(例えば、家族性腺腫性ポリープ症及び骨髄異形成症候群)が含まれるが、これらに限定されない。具体的実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓または子宮における悪性または増殖異常変化(例えば、化生及び骨形成)または過剰増殖性疾患が本発明の方法及び組成物により治療または予防される。他の具体的実施形態では、肉腫、黒色腫または白血病が本発明の方法及び組成物により治療または予防される。(これらの疾患の総説については、Fishmanら,Medicine,第2版,フィラデルフィアに所在のJ.B.Lippincott Co.;及びMurphyら,Informed Decisions:The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment,and Recovery,米国のViking Penguin,Penguin Books U.S.A.,Inc.(1997年)発行を参照されたい)。
(2.2) 炎症性疾患、糖尿病及び肥満
上記したように、異常なキナーゼ活性は炎症性疾患及び糖尿病やその関連作用に関係している。Sridharら,Pharmaceutical Research,17(11):1345−1353(2000)。実際、多数のキナーゼが糖尿病の血管性合併症で見られる細胞変化に関与している。Chalfantら,Mol.Endocrinol.,10:1273−1281(1996)。更に、肥満がII型糖尿病で見られるインスリン抵抗性に密接に関連しているので、インスリン作用を妨害するキナーゼは肥満に関連する疾患及び糖尿病に関係している。Hirosumiら,Nature,420:333−336(2002)。肥満及び糖尿病も各種シグナルカスケードにおいてキナーゼが媒介する慢性炎症性応答に密接に関係している。上掲のp.333参照。よって、本発明の方法は炎症性疾患、糖尿病、肥満及びこれらに関連する疾患の管理、治療または予防に関する。本発明の方法により治療される肥満には遺伝性肥満、食事性肥満、薬剤の投与または治療過程に関連する肥満、糖尿病に関連する肥満が含まれる。本発明の方法を用いて管理、治療、予防または改善され得る炎症性及び糖尿病関連疾患の例にはI型糖尿病、若年性糖尿病、II型糖尿病(NIDDM)、非インスリン依存型糖尿病、成人期発症糖尿病、筋緊張性異栄養、栄養不良関連糖尿病、ケトーシス傾向糖尿病、ケト耐性糖尿病、筋緊張性ジストロフィーI、シュタイネル病、肝糖原病、x連鎖I型、肝ホスホリラーゼキナーゼ欠乏症、肝のホスホリラーゼキナーゼ欠乏症、糖原病VIIIA、x連鎖肝糖原病、ホスホリラーゼキナーゼ、肝糖原病x連鎖II型、糖原病IX、糖原病VIII、リポタンパク質リパーゼ欠乏症、lpl欠乏症、家族性高カイロミクロン血症、ベルガー・グリュツ型高脂血症、本態性家族性高脂血症、リパーゼD欠乏症、IA型高リポタンパク質血症、家族性キャミクロン血症、I型GM2ガングリオシド症、B変異体GM2ガングリオシド症、ヘキソサミニダーゼA欠乏症、ティ・サックス病、シュード−AB変異体ティ・サックス病、膵線維症、のう胞性線維症、ガラクトース−1−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ欠乏症、galt欠乏症、古典的ガラクトース血症、慢性肉芽腫症、I型常染色体シトクロム−b−陽性肉芽腫症、好中球細胞質因子1欠乏症、可溶性オキシダーゼ成分II欠乏症、soc2欠乏症、p47−phox欠乏症、I型ゴーシェ病、非脳性若年性ゴーシェ病、グルコセレブロシダーゼ欠乏症、酸性β−グルコシダーゼ欠乏症、遺伝性鉄芽球性貧血、遺伝性鉄増量性質貧血、慢性肉芽腫症、X連鎖シトクロム−b−陰性肉芽腫病、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アレルギー疾患、敗血性ショック、肺線維症、非分化脊椎関節症、非分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルスまたは細菌感染により生ずる慢性炎症が含まれるが、これらに限定されない。
上記したように、異常なキナーゼ活性は炎症性疾患及び糖尿病やその関連作用に関係している。Sridharら,Pharmaceutical Research,17(11):1345−1353(2000)。実際、多数のキナーゼが糖尿病の血管性合併症で見られる細胞変化に関与している。Chalfantら,Mol.Endocrinol.,10:1273−1281(1996)。更に、肥満がII型糖尿病で見られるインスリン抵抗性に密接に関連しているので、インスリン作用を妨害するキナーゼは肥満に関連する疾患及び糖尿病に関係している。Hirosumiら,Nature,420:333−336(2002)。肥満及び糖尿病も各種シグナルカスケードにおいてキナーゼが媒介する慢性炎症性応答に密接に関係している。上掲のp.333参照。よって、本発明の方法は炎症性疾患、糖尿病、肥満及びこれらに関連する疾患の管理、治療または予防に関する。本発明の方法により治療される肥満には遺伝性肥満、食事性肥満、薬剤の投与または治療過程に関連する肥満、糖尿病に関連する肥満が含まれる。本発明の方法を用いて管理、治療、予防または改善され得る炎症性及び糖尿病関連疾患の例にはI型糖尿病、若年性糖尿病、II型糖尿病(NIDDM)、非インスリン依存型糖尿病、成人期発症糖尿病、筋緊張性異栄養、栄養不良関連糖尿病、ケトーシス傾向糖尿病、ケト耐性糖尿病、筋緊張性ジストロフィーI、シュタイネル病、肝糖原病、x連鎖I型、肝ホスホリラーゼキナーゼ欠乏症、肝のホスホリラーゼキナーゼ欠乏症、糖原病VIIIA、x連鎖肝糖原病、ホスホリラーゼキナーゼ、肝糖原病x連鎖II型、糖原病IX、糖原病VIII、リポタンパク質リパーゼ欠乏症、lpl欠乏症、家族性高カイロミクロン血症、ベルガー・グリュツ型高脂血症、本態性家族性高脂血症、リパーゼD欠乏症、IA型高リポタンパク質血症、家族性キャミクロン血症、I型GM2ガングリオシド症、B変異体GM2ガングリオシド症、ヘキソサミニダーゼA欠乏症、ティ・サックス病、シュード−AB変異体ティ・サックス病、膵線維症、のう胞性線維症、ガラクトース−1−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ欠乏症、galt欠乏症、古典的ガラクトース血症、慢性肉芽腫症、I型常染色体シトクロム−b−陽性肉芽腫症、好中球細胞質因子1欠乏症、可溶性オキシダーゼ成分II欠乏症、soc2欠乏症、p47−phox欠乏症、I型ゴーシェ病、非脳性若年性ゴーシェ病、グルコセレブロシダーゼ欠乏症、酸性β−グルコシダーゼ欠乏症、遺伝性鉄芽球性貧血、遺伝性鉄増量性質貧血、慢性肉芽腫症、X連鎖シトクロム−b−陰性肉芽腫病、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アレルギー疾患、敗血性ショック、肺線維症、非分化脊椎関節症、非分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、及び慢性ウイルスまたは細菌感染により生ずる慢性炎症が含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの自己免疫疾患は炎症性状態を伴っている。よって、自己免疫疾患及び炎症性疾患とみなされるものは重複している。従って、幾つかの自己免疫疾患は炎症性疾患としても特徴づけられ得る。本発明の方法を用いて管理、治療または予防され得る自己免疫疾患の例には円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免液疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性天疱瘡、心筋症、腹腔スプルー皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集疾患、クローン病、円板状ろう瘡、本態性複合クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、クレーブス病、ギランバレー、橋本病、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgAニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔鮮、エリテマトーデス、メニエル病、混合結合組織病、多発性硬化症、I型または免疫媒介糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋炎、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾せん、乾せん性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、大動脈炎症候群、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎(例えば、疱疹状皮膚炎、脈管炎)、白斑及びウェジナー肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない。
(2.3) 他の疾患−血管形成、心血管疾患及び神経疾患
本発明は、キナーゼ活性に関係する疾患の管理、治療、予防または改善に関する。例えば、キナーゼ活性に関係する疾患または障害は本発明の方法を用いて治療、管理、予防または改善され得る。1実施形態では、本発明の方法はキナーゼ活性に関係する血管形成関連状態を治療するために使用される。別の実施形態では、本発明の方法は血管形成に関連する疾患または障害を管理、治療、予防または改善するために有用である。他の実施形態では、血管形成は、好ましくは多数のプロセス、例えば成長、組織修復、癌、乾せん、糖尿病性網膜症及び肺や関節における慢性炎症性疾患にとって重要である。
本発明は、キナーゼ活性に関係する疾患の管理、治療、予防または改善に関する。例えば、キナーゼ活性に関係する疾患または障害は本発明の方法を用いて治療、管理、予防または改善され得る。1実施形態では、本発明の方法はキナーゼ活性に関係する血管形成関連状態を治療するために使用される。別の実施形態では、本発明の方法は血管形成に関連する疾患または障害を管理、治療、予防または改善するために有用である。他の実施形態では、血管形成は、好ましくは多数のプロセス、例えば成長、組織修復、癌、乾せん、糖尿病性網膜症及び肺や関節における慢性炎症性疾患にとって重要である。
従って、別の実施形態では、本発明の方法は心血管疾患を管理、治療、予防または改善するために使用される。前記心血管疾患にはアテローム性動脈硬化症、再狭窄、左心室肥大、心筋梗塞、慢性閉塞性肺疾患または卒中が含まれるが、これらに限定されない。本発明の更に別の実施形態では、本発明の方法は虚血に関連する疾患または障害を管理、治療、予防または改善するために使用される。前記した疾患または障害には心臓、腎臓、肝臓または脳における虚血状態並びに移植、手術外傷、高血圧、血栓形成または外傷損傷に起因する虚血−再灌流障害が含まれるが、これらに限定されない。更に別の実施形態では、本発明の方法は神経変性疾患を治療するために使用される。前記神経変性疾患の例にはてんかん、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、末梢神経障害、脊髄損傷、AIDS痴呆症候群またはパーキンソン病が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法は、肝疾患を管理、治療、予防または改善するためにも使用される。前記疾患には肝炎、アルコール性肝疾患、毒素性肝疾患、脂肪症または硬化症が含まれるが、これらに限定されない。
(2.4) 細菌、ウイルス及び真菌を含めた微生物が関与する疾患
本発明の方法は、微生物による感染に関係するキナーゼを標的化するために使用され得る。この方法は微生物による宿主感染を予防するために使用され得る。前記微生物には細菌、ウイルスまたは真菌が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法は、微生物による感染を伴う症状または状態を治療、予防または改善するためにも使用され得る。前記微生物には細菌、ウイルスまたは真菌が含まれるが、これらに限定されない。生物を感染させることができ、伝染、生存またはホメオスタシスのためにキナーゼに頼っているウイルスを含めた微生物は当業界で公知である。本発明の方法を用いて治療、予防、管理または改善され得る前記感染物質には、細菌(例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性細菌、スピロヘータ、ミコバクテリア、リケッチア、クラミジア等)、寄生虫、真菌(例えば、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス等)、ウイルス(例えば、DNAウイルス、RNAウイルス等)または腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。治療、予防、管理または改善され得るウイルス感染にはヒト免疫不全ウイルス(HIV);A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルスまたは他の肝炎ウイルス;サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス−1(−2、−3、−4、−5、−6)、ヒトパピローマウイルス;呼吸シンシチアルウイルス(RSV)、パラインフルエンザウイルス(PIV)、エプスタイン・バーウイルス、メタニューモウイルス(MPV)または他のウイルス感染が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法は、微生物による感染に関係するキナーゼを標的化するために使用され得る。この方法は微生物による宿主感染を予防するために使用され得る。前記微生物には細菌、ウイルスまたは真菌が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法は、微生物による感染を伴う症状または状態を治療、予防または改善するためにも使用され得る。前記微生物には細菌、ウイルスまたは真菌が含まれるが、これらに限定されない。生物を感染させることができ、伝染、生存またはホメオスタシスのためにキナーゼに頼っているウイルスを含めた微生物は当業界で公知である。本発明の方法を用いて治療、予防、管理または改善され得る前記感染物質には、細菌(例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気性細菌、スピロヘータ、ミコバクテリア、リケッチア、クラミジア等)、寄生虫、真菌(例えば、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス等)、ウイルス(例えば、DNAウイルス、RNAウイルス等)または腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。治療、予防、管理または改善され得るウイルス感染にはヒト免疫不全ウイルス(HIV);A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルスまたは他の肝炎ウイルス;サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス−1(−2、−3、−4、−5、−6)、ヒトパピローマウイルス;呼吸シンシチアルウイルス(RSV)、パラインフルエンザウイルス(PIV)、エプスタイン・バーウイルス、メタニューモウイルス(MPV)または他のウイルス感染が含まれるが、これらに限定されない。
3.タンパク質キナーゼ及びキナーゼ経路
本発明は、タンパク質キナーゼを標的化することを包含する。前記タンパク質キナーゼには当業界で公知のキナーゼ及び発見されるかもしれない追加キナーゼが含まれるが、これらに限定されない。前記タンパク質キナーゼにはサイクリンヌクレオチド調節−リン脂質調節キナーゼ及びリボソームS6キナーゼ(本明細書中、グループ“AGC”のキナーゼとも称される)、Ca2+/カルモジュリンキナーゼ(本明細書中、グループ“CaMK”のキナーゼと称される)、サイクリン依存性キナーゼ(本明細書中、グループ“CMGC”のキナーゼと称される)及びタンパク質チロシンキナーゼ(本明細書中、グループ“PTK”のキナーゼと称される)が含まれるが、これらに限定されない。これらのグループは単にキナーゼのグループの例として挙げたにすぎず、本発明の方法において具体化されている可能なグループを限定することを意味しない。実際、本発明は、上記した4グループの範囲外のキナーゼの標的化方法にも関する。
本発明は、タンパク質キナーゼを標的化することを包含する。前記タンパク質キナーゼには当業界で公知のキナーゼ及び発見されるかもしれない追加キナーゼが含まれるが、これらに限定されない。前記タンパク質キナーゼにはサイクリンヌクレオチド調節−リン脂質調節キナーゼ及びリボソームS6キナーゼ(本明細書中、グループ“AGC”のキナーゼとも称される)、Ca2+/カルモジュリンキナーゼ(本明細書中、グループ“CaMK”のキナーゼと称される)、サイクリン依存性キナーゼ(本明細書中、グループ“CMGC”のキナーゼと称される)及びタンパク質チロシンキナーゼ(本明細書中、グループ“PTK”のキナーゼと称される)が含まれるが、これらに限定されない。これらのグループは単にキナーゼのグループの例として挙げたにすぎず、本発明の方法において具体化されている可能なグループを限定することを意味しない。実際、本発明は、上記した4グループの範囲外のキナーゼの標的化方法にも関する。
本発明の方法を用いて標的化され得るキナーゼは、その機能活性の特徴を用いても分類され得る。例えば、本発明の方法は、基質分子上のアルギニンまたはリシン残基の近くのセリン/スレオニン残基をリン酸化するタンパク質キナーゼ、例えばAGCグループまたはCaMKグループのメンバーを標的化することを包含する。別の実施形態では、本発明の方法は、基質分子上のプロリンリッチドメイン中のセリン/スレオニン残基をリン酸化するタンパク質キナーゼ、例えばCMGCグループのメンバーを標的化することを包含する。更に別の実施形態では、本発明の方法は、チロシン残基をリン酸化するタンパク質受容体キナーゼ、例えばPTKグループのメンバーを標的化することを包含する。更に別の実施形態では、本発明の方法は、チロシン残基をリン酸化するタンパク質非受容体キナーゼ、例えばPTKグループのメンバーを標的化することを包含する。本発明の方法を用いて標的化され得る他のキナーゼには二重特異性キナーゼ、例えばセリン/スレオニン残基及びチロシン残基をリン酸化し得るキナーゼが含まれる。
1実施形態では、本発明の方法により標的化されるキナーゼには受容体チロシンキナーゼ及び非受容体キロシンキナーゼの両方のチロシンキナーゼが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、チロシンキナーゼはC−SRC、YES、FYNまたはLCKである。更に別の好ましい実施形態において、チロシンキナーゼはFES、LYNまたはSYKである。例であって、本発明の方法を用いて標的化され得る可能なキナーゼを限定する意図はないが、他のチロシンキナーゼにはチロシン−タンパク質キナーゼ(SYK)、チロシン−タンパク質キナーゼ(ZAP−70)、タンパク質チロシンキナーゼ2ベータ(PYK2)、フォーカルアドヒージョンキナーゼ(FAK)、Bリンパ球キナーゼ(BLK)、造血細胞キナーゼ(HCK)、v−yes−1山口肉腫ウイルス関連発癌遺伝子ホモログ(LYN)、T細胞特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)、原発癌遺伝子チロシン−タンパク質キナーゼ(YES)、原発癌遺伝子チロシン−タンパク質キナーゼ(SRC)、原発癌遺伝子チロシン−タンパク質キナーゼ(FYN)、原発癌遺伝子チロシン−タンパク質キナーゼ(FGR)、原発癌遺伝子チロシン−タンパク質キナーゼ(FER)、原発癌遺伝子チロシン−タンパク質キナーゼ(FES)、C−SRCキナーゼ、タンパク質−チロシンキナーゼ(CYL)、チロシンタンパク質キナーゼ(CSK)、巨核球関連チロシン−タンパク質キナーゼ(CTK)、チロシン−タンパク質キナーゼ受容体(EPH)、エフリンタイプA受容体1、エフリンタイプA受容体4(EPHA4)、エフリンタイプB受容体(EPHB3)、エフリンタイプA受容体8(EPHA8)、向神経性チロシンキナーゼ受容体タイプ1(NTPK1)、タンパク質−チロシンキナーゼ(PTK2)、syk関連チロシンキナーゼ(SRK)、タンパク質チロシンキナーゼ(CTK)、tyro3タンパク質チロシンキナーゼ(TYRO3)、ブルートン型無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ(BTK)、白血球チロシンキナーゼ(LTK)、タンパク質−チロシンキナーゼ(SYK)、タンパク質−チロシンキナーゼ(STY)、tekチロシンキナーゼ(TEK)、elk関連チロシンキナーゼ(ERK)、免疫グロブリン及びegf因子相同ドメインを有するチロシンキナーゼ(TIE)、タンパク質チロシンキナーゼ(TKF)、向神経性チロシンキナーゼ受容体タイプ3(NTRK3)、混合系列タンパク質キナーゼ3(MLK3)、タンパク質キナーゼ,マイトジェン活性化4(PRKM4)、タンパク質キナーゼ,マイトジェン活性化(PRKM1)、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK7)、タンパク質チロシンキナーゼ(EEK)、ミニブレイン(ショウジョウバエ)ホモログ(MNBH)、骨髄キナーゼ,x連鎖(BMX)、eph様チロシンキナーゼ(ETK1)、マクロファージ刺激1受容体(MST1R)、btk関連タンパク質,135kd,リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)、線維芽細胞成長因子受容体2(FGFR2)、タンパク質チロシンキナーゼ3(TYK3)、タンパク質チロシンキナーゼ(TXK)、tecタンパク質チロシンキナーゼ(TEC)、タンパク質チロシンキナーゼ2(TYK2)、eph関連受容体チロシンキナーゼリガンド1(EPLG1)、t細胞チロシンキナーゼ(EMT)、ephチロシンキナーゼ1(EPHT1)、透明帯受容体チロシンキナーゼ,95kd(ZPK)、タンパク質キナーゼ,マイトジェン活性化,キナーゼ1(PRKMK1)、epeチロシンキナーゼ3(EPHT3)、成長停止特異的遺伝子6(GAS6)、キナーゼインサートドメイン受容体(KDR)、axl受容体チロシンキナーゼ(AXL)、線維芽細胞成長因子受容体1(FGFR1)、v−erb−b2鳥類赤芽球性白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ2(FEBB2)、fms様チロシンキナーゼ3(FLT3)、神経上皮チロシンキナーゼ(NEP)、向神経性チロシンキナーゼ受容体関連3(NTPKR3)、epe関連受容体チロシンキナーゼリガンド5(EPLG5)、向神経性チロシンキナーゼ,受容体,2型(NTRK2)、受容体様チロシンキナーゼ(RYK)、チロシンキナーゼ,bリンパ球特異的(BLK)、epeチロシンキナーゼ2(EPHT2)、eph関連受容体チロシンキナーゼリガンド2(EPLG2)、糖原病VIII,epe関連受容体チロシンキナーゼリガンド7(EPLG7)、ヤヌスキナーゼ1(JAK1)、fms関連チロシンキナーゼ1(FLT1)、タンパク質キナーゼ,camp依存性,調節,I型,アルファ(PRKAR1A)、wee−1チロシンキナーゼ(WEE1)、epe様チロシンキナーゼ2(ETK2)、受容体チロシンキナーゼmusk,インスリン受容体(INSR)、ヤヌスキナーゼ3(JAK3)、fms関連チロシンキナーゼ3リガンドタンパク質キナーゼc,ベータ1(PRKCB1)、チロシンキナーゼ型細胞表面受容体(HER3)、ヤヌスキナーゼ2(JAK2)、limドメインキナーゼ1(LIMK1)、二重特異性ホスファターゼ1(DUSP1)、造血細胞キナーゼ(HCK)、チロシン3−モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質,etaポリペプチド(YWHAH)、ret原発癌遺伝子(RET)、チロシン3−モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質,zetaポリペプチド(YWHAZ)、チロシン3−モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質,ベータポリペプチド(YWHAB)、肝癌貫膜キナーゼ(HTK)、mapキナーゼキナーゼ6、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ,触媒,アルファポリペプチド(PIK3CA)、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤3(CDKN3)、ジアシルグリセロールキナーゼ,デルタ,130kd,タンパク質−チロシンホスファターゼ,非受容体型,13(PTPN13)、abelsonネズミ白血病ウイルス発癌遺伝子ホモログ1(ABL1)、ジアシルグリセロールキナーゼ,アルファ(DAGK1)、フォーカルアドヒージョンキナーゼ2、上皮ジスコイジンドメイン受容体1(EDDR1)、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ,触媒,ガンマポリペプチド(PIK3CG)、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ調節サブユニット(PIK3R1)、eph相同キナーゼ1(EHK1)、v−kit hardy−zuckerman4ネコ肉腫ウイルス発癌遺伝子ホモログ(KIT)、線維芽細胞成長因子受容体3(FGFR3)、血管内皮成長因子c(VEGFC)、表皮成長因子受容体3(FGFR)、発癌遺伝子(TRK)、成長因子受容体結合タンパク質7(GRB7)、ras p21タンパク質アクチベータ(RASA2)、met原発癌遺伝子(MET)、src様アダプター(SLA)、血管内皮成長因子(VEGF)、血管内皮成長因子受容体(VEGFR)、神経成長因子受容体(NGFR)、血小板由来成長因子受容体(PDGFR)、血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFRB)、二重特異性チロシン−(Y)−リン酸化調節キナーゼ2(DYRK2)、二重特異性チロシン−(Y)−リン酸化調節キナーゼ3(DYRK3)、二重特異性チロシン−(Y)−リン酸化調節キナーゼ4(DYRK4)、二重特異性チロシン−(Y)−リン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)、二重特異性チロシン−(Y)−リン酸化調節キナーゼ1B(DYRK1B)、CDC様キナーゼ1(CLK1)、タンパク質チロシンキナーゼSTY、CDC様キナーゼ4(CLK4)、CDC様キナーゼ2(CLK2)及びCDC様キナーゼ3(CLK3)が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、本発明の方法はセリン/スレオニンキナーゼを標的化するために使用される。例てであって、本発明の方法を用いて標的化され得る可能なキナーゼを限定する意図はないが、セリン/スレオニンキナーゼまたは関連分子にはサイクリン依存性キナーゼ(CDK7)、racセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ,セリン−スレオニンタンパク質キナーゼn(PKN)、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ2(STK2)、ジッパータンパク質キナーゼ(ZPK)、タンパク質−チロシンキナーゼ(STY)、ブルートン型無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ(BTK)、mkn28キナーゼ、タンパク質キナーゼ,x連鎖(PRKX)、elk関連チロシンキナーゼ(ERK)、リボソームタンパク質s6キナーゼ,90kd,ポリペプチド3(RPS6KA3)、糖原病VIII,死関連タンパク質キナーゼI(DAPK1)、pctaireタンパク質キナーゼ1(PCTK1)、タンパク質キナーゼ、インターフェロン誘導性二本鎖rna(PRKR)、アクチビンa受容体,タイプII様キナーゼ1(ACVRLK1)、タンパク質キナーゼ,camp依存性,触媒,アルファ(PRKACA)、タンパク質キナーゼ,y連鎖(PRKY)、Gタンパク質結合受容体キナーゼ2(GPRK21)、タンパク質キナーゼc,シーター形態(PRKCQ)、limドメインキナーゼ1(LINK1)、ホスホグリセレートキナーゼ1(PGK1)、limドメインキナーゼ2(LIMK2)、c−junキナーゼ、アクチビンa受容体,タイプII様キナーゼ2(ACVRLK2)、ヤヌスキナーゼ1(JAK1)、elklモチーフキナーゼ(EMK1)、雄性細胞関連キナーゼ(MAK)、カゼインキナーゼ2,アルファ−プライムサブユニット(CSNK2A2)、カゼインキナーゼ2,ベータポリペプチド(CSNK2B)、カゼインキナーゼ2,アルファ1ポリペプチド(CSNK2A1)、ret原発癌遺伝子(RET)、造血性先祖キナーゼ1、保存ヘリックス・ループ・ヘリックス偏在性キナーゼ(CHUK)、カゼインキナーゼ1,デルタ(CSNK1D)、カゼインキナーゼ1,イプシロン(CSNK1E)、v−aktネズミ胸線腫ウイルス発癌遺伝子ホモログ1(AKT1)、腫瘍タンパク質p53(TP53)、タンパク質ホスファターゼ1,調節(インヒビター)サブユニット2(PPP1R2)、発癌遺伝子pim−1(PIM1)、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体,タイプII(TGFBR2)、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体,タイプI(TGFBR1)、v−rafネズミ肉腫ウイルス発癌遺伝子ホモログb1(BRAF)、骨形態形成受容体タイプII(BMPR2)、v−rafネズミ肉腫3611ウイルス発癌遺伝子ホモログ1(ARAF1)、v−rafネズミ肉腫3611ウイルス発癌遺伝子ホモログ2(ARAF2)、タンパク質キナーゼC(PKC)、v−kit hardy−zuckerman4ネコ肉腫ウイルス発癌遺伝子ホモログ(KIT)及びc−KIT受容体(KITR)が含まれるが、これらに限定されない。
1実施形態では、本発明の方法を用いて標的化されるキナーゼにはサイクリン依存性またはキナーゼのCDKファミリー由来のキナーゼが含まれる。本発明はキナーゼのCDKファミリーのメンバーのモジュレーションを具体化しているが、特定実施形態ではCDKはCDK1/サイクリンB1、CDK2/サイクリンA、CDK3/サイクリンE、CDK5/p35、CDK6/サイクリンD3またはCDK7/サイクリンH/MAT1である。例であって、本発明の方法を用いて標的化され得る可能なキナーゼを限定する意図はないが、本発明の方法を用いて標的化されるキナーゼのCDKファミリーの他のメンバーにはサイクリン依存性キナーゼ2(CDK2)、サイクリン依存性キナーゼ7(CDK7)、CDK活性化キナーゼ(CAK)、THIIH基本転写因子複合キナーゼサブユニット,39kDaタンパク質キナーゼ、STK1、CAK1、サイクリン依存性キナーゼ6(CDK6)、細胞分裂コントロール2タンパク質(CDC2)、p34タンパク質キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ1(CDK1)、細胞分裂タンパク質キナーゼ1、細胞分裂タンパク質キナーゼ2(CDK2)、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ、p33タンパク質キナーゼ、細胞分裂タンパク質キナーゼ(CDK3)、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ3、細胞分裂タンパク質キナーゼ5(CDK5)、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ5、タウタンパク質キナーゼII(TPKII)、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ(PSSALRE)、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼPCTAIRE−1(PCTAIRE1)、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ(PCTAIRE−2)、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼPFTAIRE−1(PFTAIRE1)、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼALS2CR7(PFTAIRE2)、細胞分裂タンパク質キナーゼ4(CDK4)、サイクリン依存性キナーゼ4、PSK−J3、細胞分裂タンパク質キナーゼ6、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ(PLSTIRE)、細胞分裂タンパク質キナーゼ10(CDK10)、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ10、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ(PISSLRE)、セリン/スレオニンキナーゼCDC2L1(PITSLRE)、ガラクトシルトランスフェラーゼ関連タンパク質キナーゼp58/GTA、細胞分裂周期2様1(CLK−1)、CDK11、p58CLK−1、細胞分裂タンパク質キナーゼ9(CDK9)、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ9、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼPITALRE、C2K、細胞分裂周期2様5(コリンエストラーゼ関連細胞分裂コントローラー)(CHED)、CDC2L、細胞分裂周期2関連タンパク質キナーゼ7(CRK7)、CDC2関連タンパク質キナーゼ7、細胞分裂タンパク質キナーゼ8(CDK8)、タンパク質キナーゼK35、サイクリン依存性キナーゼ様1(CDC2関連キナーゼ)(CDKL1)、CDC2関連キナーゼ、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ様2(CDC2関連キナーゼ)(CDKL2)、CDC2関連キナーゼ、p56タンパク質キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ様3(CDKL−3)、サイクリン依存性キナーゼ様5(CDKL−5)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3アルファ(GSK3アルファ)、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3ベータ(GSK3ベータ)及び腸管細胞(MAK様)キナーゼ(ICK)が含まれるが、これらに限定されない。これらのサイクリン依存性キナーゼの多くは各種生理学的状態に関与する細胞シグナル伝達経路に関与していることが判明している。前記した状態には癌、過剰増殖性疾患及び免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の1実施形態では、本発明の方法を用いて標的化されるキナーゼにはMAPキナーゼが含まれる。本発明はキナーゼのMAPファミリーのメンバーのモジュレーションを具体化しているが、好ましい実施形態ではMAPキナーゼはJNK1、MAPK1/ERK1、MAPK2/ERK2、MAPKAP−K5またはMEK1である。例であって、本発明の方法を用いて標的化され得る可能なキナーゼを限定する意図はないが、本発明の方法を用いて標的化されるキナーゼのMAPキナーゼファミリーの他のメンバーにはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ3(MAPK3)、p44erk1、p44mapk、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPキナーゼ3;p44)、ERK1、PRKM3、P44ERK1、P44MAPK、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ1(MAPK1)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ1(MEK1)、MAP2Kタンパク質チロシンキナーゼERK2、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ2、細胞外シグナル調節キナーゼ2、タンパク質チロシンキナーゼERK2,マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ2、細胞外シグナル調節キナーゼ2、ERK、p38、p40、p41、ERK2、ERT1、MAPK2、PRKM1、PRKM2、P42MAPK、p41mapk、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK7)、BMK1キナーゼ、細胞外シグナル調節キナーゼ5、BMK1、ERK4、ERK5、PRKM7、nemo様キナーゼ(NLK)、マウスnemo様キナーゼの有望なオルソログ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ8(MAPK8)、タンパク質キナーゼJNK1、JNK1ベータタンパク質キナーゼ、JNK1アルファタンパク質キナーゼ、c−jun N末端キナーゼ1、ストレス活性化タンパク質キナーゼJNK1、JNK、JNK1、PRKM8、SAPK1、JNK1A2,JNK21B1/2、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ10(MAPJ10)、c−Junキナーゼ3、JNK3アルファタンパク質キナーゼ、c−Jun N末端キナーゼ3、ストレス活性化タンパク質キナーゼJNK3、ストレス活性化タンパク質キナーゼベータ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ9(MAPK9)、MAPキナーゼ9、c−Junキナーゼ2、c−Jun N末端キナーゼ2、ストレス活性化タンパク質キナーゼJNK2、JNK2、JNK2A、JNK2B、PRKM9、JNK−55、JNK2BETA、p54aSAPK、JNK2ALPHA、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ14(MAPK14)、p38 MAPキナーゼ、MAPキナーゼMxi2、Csaids結合タンパク質、MAX相互作用タンパク質2,ストレス活性化タンパク質キナーゼ2A、p38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、サイトカイン抑制抗炎症薬結合タンパク質、RK、p38、EXIP、Mxi2、CSBP1、CSBP2、CSPB1、PRKM14、PRKM15、SAPK2A、p38ALPHA、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ11(MAPK11)、ストレス活性化タンパク質キナーゼ2、ストレス活性化タンパク質キナーゼ2b、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼp38−2、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼp38ベータ、P38B、SAPK2、p38−2、PRKM11、SAPK2B、p38Beta、P38BETA2、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ13(MAPK13)、ストレス活性化タンパク質キナーゼ4、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼp38デルタ、SAPK4、PRKM13、p38デルタ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ12(MAPK12)、p38ガンマ、ストレス活性化タンパク質キナーゼ3、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ3、ERK3、ERK6、SAPK3、ERKM12、SAPK−3、P38GAMMA、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ6(MAPK6)、MAPキナーゼイソ型p97、マイトジェン活性化5タンパク質キナーゼ、マイトジェン活性化6タンパク質キナーゼ、細胞外シグナル調節キナーゼ3、細胞外シグナル調節キナーゼ、p97、ERK3、PRKM6、p97MAPK、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ4(MAPK4)、Erk3関連タンパク質キナーゼ、マイトジェン活性化4タンパク質キナーゼ(MAPキナーゼ;p63)、PRKM4、p63MAPK、ERK3−RELATED及び細胞外シグナル調節キナーゼ8(ERK7)が含まれるが、これらに限定されない。
1実施形態では、本発明の方法を用いて標的化されるキナーゼにはRskキナーゼが含まれる。本発明はキナーゼのRskファミリーのメンバーのモジュレーションを具体化しているが、より好ましい実施形態ではRskキナーゼはRsk1、Rsk2またはRsk3である。例であって、本発明の方法を用いて標的化され得る可能なキナーゼを限定する意図はないが、本発明の方法を用いて標的化されるキナーゼのRSKファミリーの他のメンバーにはリボソームタンパク質S6キナーゼ様1(RskL2)、リボソームタンパク質S6キナーゼ,52kDa,ポリペプチド1(RskL2)、リボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド2(Rsk3)、リボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド6(Rsk4)、リボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド3(Rsk2)、リボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド1(Rsk1/p90Rsk)、p70リボソームS6キナーゼベータ,リボソームタンパク質S6キナーゼ,70kDa,ポリペプチド2(p70S6Kβ)、セリン/スレオニンキナーゼ14アルファ、リボソームタンパク質S6キナーゼ,70kDa,ポリペプチド1(p70S6K)、リボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド4,リボソームタンパク質キナーゼB、マイトジェン及びストレス活性化タンパク質キナーゼ2(MSK2)、マイトジェン及びストレス活性化タンパク質キナーゼ1及びリボソームタンパク質S6キナーゼ,90kDa,ポリペプチド5(MSK1)が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の1実施形態では、標的化されるキナーゼにはCHKファミリーからのキナーゼが含まれる。本発明はCHKファミリーのメンバーのモジュレーションを具体化しているが、好ましい実施形態ではCHKキナーゼはCHK1またはCHK2である。例であって、本発明の方法を用いて標的化され得る可能なキナーゼを限定する意図はないが、本発明の方法を用いて標的化されるチェックポイントファミリーの他のメンバーにはセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ(CHK1)、セリン/スレオニンキナーゼ11(LKB1)、PAS−セリン/スレオニンキナーゼ(PASK)、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼPIM−2、原発癌遺伝子セリン/スレオニンタンパク質キナーゼPIM−1及び原発癌遺伝子セリン/スレオニンタンパク質キナーゼPIM−3が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法を用いて標的化され得るキナーゼの他のファミリーにはRho関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼp160ROCK(ROCK1)、Rhoキナーゼ(ROCK2)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ5(PRAK)、リボソームタンパク質S6キナーゼ(p70S6α)、リボソームタンパク質S6キナーゼベータ2(p70S6β)、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ15(オーロラA)及びセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ12(オーロラB)が含まれるが、これらに限定されない。
4.治療/予防プロトコル及びレジメン
(4.1) 方法
本発明は、少なくとも2個の異なるキナーゼの活性に少なくとも部分的に関係している疾患、障害または状態の治療における1つ以上の単一薬物の使用を包含する。
(4.1) 方法
本発明は、少なくとも2個の異なるキナーゼの活性に少なくとも部分的に関係している疾患、障害または状態の治療における1つ以上の単一薬物の使用を包含する。
1実施形態において、本発明は、CDK1、CDK2、cSRC、Yes、MEK1、Rsk1の少なくとも2個である。複数のキナーゼを該キナーゼの活性を検出可能に変化させるのに十分な量の単一薬物と接触させることを含む複数のキナーゼの活性をモジュレートする方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、キナーゼCDK1、CDK2、cSRC、Yes、MEK1及びRskの少なくとも3個を単一薬物と接触させることを含む該キナーゼの活性を単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して少なくとも75%阻害する方法を提供する。具体的実施形態では、単一薬物はCC001またはCC004である。別の好ましい実施形態では、本発明はキナーゼCDK1、CDK2、cSRC、Yes、MEK1及びRskの少なくとも3個を単一薬物と接触させることを含む前記した各キナーゼの活性を単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して少なくとも90%阻害する方法を提供する。具体的実施形態では、単一薬物はC0001である。
別の実施形態では、単一薬物はインビトロで1つ以上の薬物耐性細胞系において抗増殖活性を示す。この抗増殖活性は特定の増殖細胞系の増殖率が検出可能に減少または低下することにより立証される。別の実施形態では、単一薬物はインビトロで1つ以上の癌細胞系のパネルに対して抗増殖活性を示す。更に別の実施形態では、単一薬物は後記実施例の欄のインビトロキナーゼアッセイで各種キナーゼを阻害する。
別の好ましい実施形態では、単一薬物はサイクリン依存性キナーゼまたはサイクリン依存性キナーゼ経路を標的化し、癌、過剰増殖性疾患及び免疫性疾患のような疾患の治療において有用である。
別の好ましい実施形態では、単一薬物はチロシンキナーゼまたはチロシンキナーゼ経路を標的化し、高いまたは異常な血管形成及び血管新生を伴う疾患の治療において有用である。例えば、単一薬物は、癌または腫瘍内及びその周辺の血管形成及び血管新生が高いために増殖が促進される癌または腫瘍の治療において有用である。
別の実施形態において、本発明は、cSRC、Yes、Fyn、Lck、Fes、Lyn、Syk、Rsk、CDK1、CDK2、CDK3、CDK5、CDK6、CDK7、CHK1、CHK2、JNK1、MAPK1、MAPK2、MAPKAP−K5、MEK1、ROCKII、PRK2、PRAK、p70S6またはオーロラAの2個以上を含む複数のキナーゼを該キナーゼの活性を検出可能にモジュレートするのに十分な濃度の単一薬物と接触させることを含む該キナーゼの活性を単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して複数のキナーゼの活性をモジュレートする方法を提供する。具体的実施形態では、前記接触はインビボで癌または細胞増殖;不適切または疾患に関連する血管形成;心血管疾患;炎症;インスリン抵抗性、糖尿病または肥満;神経疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体において前記状態を治療するのに十分な濃度で実施する。別の実施形態において、本発明は、癌または細胞増殖;不適切または疾患に関連する血管形成;心血管疾患;炎症;インスリン抵抗性、糖尿病または肥満;神経疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体に対してcSRC、Yes、Fyn、Lck、Fes、Lyn、Syk、Rsk、CDK1、CDK2、CDK3、CDK5、CDK6、CDK7、CHK1、CHK2、JNK1、MAPK1、MAPK2、MAPKAP−K5、MEK1、ROCKII、PRK2、PRAK、p70S6またはオーロラAの2個以上の活性をモジュレートするのに十分な量の単一薬物を投与することを含む前記個体の治療方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、Yes、BMX、Syk、Eph、FGFR、RYK、MUSK、JAK1またはEGFRの2個以上を含む複数のキナーゼを該キナーゼの活性を検出可能にモジュレートするのに十分な濃度の単一薬物と接触させることを含む単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して複数のキナーゼの活性をモジュレートする方法を提供する。具体的実施形態では、前記接触はインビボでインスリン抵抗性、糖尿病または肥満;癌、細胞増殖またはそれに関連する先天性症候群;炎症;不適切または疾患に関連する血管形成;心血管疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体において前記状態を治療するのに十分な濃度で実施する。別の実施形態において、本発明は、インスリン抵抗性、糖尿病または肥満;癌、細胞増殖またはそれに関連する先天性症候群;炎症;不適切または疾患に関連する血管形成;心血管疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体に対してYes、BMX、Syk、Eph、FGFR、RYK、MUSK、JAK1及びEGFRの2個以上の活性をモジュレートするのに十分な量の単一薬物を投与することを含む前記個体の治療方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、CDK、JNK、ERK、CDKL、ICK、CLK及びDYRKの2個以上を含む複数のキナーゼを該キナーゼの活性を検出可能にモジュレートするのに十分な濃度の単一薬物と接触させることを含む単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して複数のキナーゼの活性をモジュレートする方法を提供する。具体的実施形態では、前記接触はインビボで癌、細胞増殖またはそれに関連する先天性症候群;インスリン抵抗性、糖尿病または肥満;神経疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体において前記状態を治療するのに十分な濃度で実施する。別の実施形態において、本発明は、癌、細胞増殖またはそれに関連する先天性症候群;インスリン抵抗性、糖尿病または肥満;神経疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体に対してCDK、JNK、ERK、CDKL、ICK、CLK及びDYRKの2個以上の活性をモジュレートするのに十分な量の単一薬物を投与することを含む前記個体の治療方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr、DYRK及びYrkの2個以上を含む複数のキナーゼを該キナーゼの活性を検出可能にモジュレートするのに十分な濃度の単一薬物と接触させることを含む単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して複数のキナーゼの活性をモジュレートする方法を提供する。具体的実施形態では、前記接触はインビボで癌または過剰増殖;免疫;不適切または疾患に関連する血管形成;神経疾患;心血管疾患;炎症;または微生物による感染である状態を患っている個体において前記状態を治療するのに十分な濃度で実施する。別の実施形態において、本発明は、癌または過剰増殖;免疫;不適切または疾患に関連する血管形成;神経疾患;心血管疾患;炎症;または微生物による感染である状態を患っている個体に対してSrc、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr、DYRK及びYrkの2個以上の活性をモジュレートするのに十分な量の単一薬物を投与することを含む前記個体の治療方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、MAPK、MAPK3、ERK2、MAPK7、JNK1、MAPK10、JNK3アルファまたはMAPK14の2個以上を含む複数のキナーゼを該キナーゼの活性を検出可能にモジュレートするのに十分な濃度の単一薬物と接触させることを含む単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して複数のキナーゼの活性をモジュレートする方法を提供する。具体的実施形態では、前記接触はインビボでインスリン抵抗性、糖尿病または肥満;炎症;心血管疾患;不適切または疾患に関連する血管形成;癌、細胞増殖または関連する先天性疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体において前記状態を治療するのに十分な濃度で実施する。別の実施形態において、本発明は、インスリン抵抗性、糖尿病または肥満;炎症;心血管疾患;不適切または疾患に関連する血管形成;癌、細胞増殖または関連する先天性疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体に対してMAPK、MAPK3、ERK2、MAPK7、JNK1、MAPK10、JNK3アルファまたはMAPK14の2個以上の活性をモジュレートするのに十分な量の単一薬物を投与することを含む前記個体の治療方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、CHK1、CHK2、RSK1、RSK2、RSK3、オーロラA、オーロラB、ROCKI、ROCKIIまたはp70S6Kの2個以上を含む複数のキナーゼを該キナーゼの活性を検出可能にモジュレートするのに十分な濃度の単一薬物と接触させることを含む単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して複数のキナーゼの活性をモジュレートする方法を提供する。具体的実施形態では、前記接触はインビボでインスリン抵抗性、糖尿病または肥満;炎症;不適切または疾患に関連する血管形成;心血管疾患;癌、過剰増殖性疾患または関連する先天性疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体において前記状態を治療するのに十分な濃度で実施する。別の実施形態において、本発明は、インスリン抵抗性、糖尿病または肥満;炎症;不適切または疾患に関連する血管形成;心血管疾患;癌、過剰増殖性疾患または関連する先天性疾患;または微生物による感染である状態を患っている個体に対してCHK1、CHK2、RSK1、RSK2、RSK3、オーロラA、オーロラB、ROCKI、ROCKIIまたはp70S6Kの2個以上の活性をモジュレートするのに十分な量の単一薬物を投与することを含む前記個体の治療方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素4(PDK4)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素3(PDK3)、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDK)またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素1(PDK1)の2個以上を含む複数のキナーゼを該キナーゼの活性を検出可能にモジュレートするのに十分な濃度の単一薬物と接触させることを含む単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの活性と比較して複数のキナーゼの活性をモジュレートする方法を提供する。具体的実施形態では、前記接触はインビボで癌、過剰増殖性疾患または関連する先天性疾患;炎症;血管形成;微生物による感染;心血管疾患;またはインスリン抵抗性、糖尿病または肥満である状態を患っている個体において前記状態を治療するのに十分な濃度で実施する。別の実施形態において、本発明は、癌、過剰増殖性疾患または関連する先天性疾患;炎症;血管形成;微生物による感染;心血管疾患;またはインスリン抵抗性、糖尿病または肥満である状態を患っている個体に対してピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素4(PDK4)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素3(PDK3)、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDK)またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素1(PDK1)の2個以上の活性をモジュレートするのに十分な量の単一薬物を投与することを含む前記個体の治療方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、癌または増殖性疾患である状態を患っている個体に対してCDK1、CDK2、cSrc、Yes、Rsk1またはMEK1の2個以上の活性をモジュレートするのに十分な量の単一薬物を投与することを含む前記個体の治療方法を提供する。
別の実施形態では、単一薬物は、エフリンタイプ受容体キナーゼ及び向神経性タイプ受容体キナーゼを標的化し、例えば神経障害(これに限定されない)の治療において有用である。別の好ましい実施形態では、単一薬物は、非受容体チロシンキナーゼ及びIL−1受容体関連キナーゼを標的化し、例えば造血、免疫または血管形成(これらに限定されない)に関連する疾患の治療において有用である。更に別の実施形態では、単一薬物は、チロシンキナーゼ、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ、JNK、IKK及びPKCの経路の少なくとも2個、少なくとも3個または少なくとも4個を標的化し、例えばンスリン抵抗性、糖尿病または肥満(これらに限定されない)に関連する疾患を治療するために有用である。更に別の実施形態では、単一薬物は、ABL、EGFR、VEGFR、NGFR、PKC、PDGFR、CDK、MKK1、CHK1及びmTORのキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個、、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも7個を標的化し、例えば癌または細胞増殖(これらに限定されない)に関連する疾患を治療するために有用である。更に別の実施形態では、単一薬物は、PKC、Akt、PI−3キナーゼ、GSK3及びRTKのキナーゼまたはキナーゼ経路の少なくとも2個、少なくとも3個または少なくとも4個を標的化し、例えば非限定的にインスリン抵抗性、糖尿病または肥満に関連する疾患を治療するために有用である。
別の実施形態において、本発明は、複数のキナーゼを単一薬物と接触させることを含む前記した複数キナーゼの活性の阻害方法を提供し、前記した複数のキナーゼの少なくとも2個の活性は検出可能に阻害される、すなわち単一薬物により単一薬物を存在させない同等条件下での該複数キナーゼの少なくとも2個の活性と比較して少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または少なくとも95%阻害される。より具体的な実施形態では、複数のキナーゼはCDK1、CHK2、PRK2及びROCK−IIを含み、単一薬物は、単一薬物を約3μMの濃度で存在させるインビトロキナーゼアッセイにおいてCDK1、CHK2、PRK2及びROCK−IIを単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの少なくとも2個の活性と比較して少なくとも90%阻害する。別の具体的実施形態では、単一薬物は、単一薬物を約3μMの濃度で存在させるインビトロキナーゼアッセイにおいて表2にリストしたキナーゼの少なくとも7個を単一薬物を存在させない同等条件下での表2にリストしたキナーゼの少なくとも7個の活性と比較して90%以上阻害する。別の具体的実施形態では、単一薬物は、単一薬物を約3μMの濃度で存在させるインビトロキナーゼアッセイにおいて表2にリストしたキナーゼの少なくとも12個を単一薬物を存在させない同等条件下での表2にリストしたキナーゼの少なくとも12個の活性と比較して75%以上阻害する。別の具体的実施形態では、単一薬物は、単一薬物を約3μMの濃度で存在させるインビトロキナーゼアッセイにおいて表2にリストしたキナーゼの少なくとも21個を単一薬物を存在させない同等条件下での表2にリストしたキナーゼの少なくとも21個の活性と比較して50%以上阻害する。
別の実施形態において、本発明は、状態を患っている個体に対してインビボで複数のキナーゼの活性を検出可能に阻害する単一薬物を治療有効量投与することを含む前記個体の治療方法を提供する。具体的実施形態では、複数のキナーゼはcSRC、Yes、Fyn、Lck、Fes、Lyn、Syk、Rsk、CDK1、CDK2、CDK3、CDK5、CDK6、CDK7、CHK1、CHK2、JNK1、MAPK1、MAPK2、MAPLAP−K5、MEK1、ROCKII、PRK2、PRAK、p70S6またはオーロラA;Yes、BMX、Syk、Eph、FGFR、RYK、MUSK、JAK1またはEGFR;CDK、JNK、ERK、CDKL、ICK、CLKまたはDYRK;Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr、DYRK及びYrk;MAPK、MAPK3、ERK2、MAPK7、JNK1、MAPK10、JNK3アルファまたはMAPK14;CHK1、CHK2、RSK1、RSK2、RSK3、オーロラA、オーロラB、ROCK1、ROCKIIまたはp70S6K;ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素4(PDK4)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素3(PDK3)、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDK)またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼイソ酵素1(PDK1);或いはCDK1、CDK2、cSrc、Yes、Rsk1またはMEK1を含む。別の具体的実施形態では、単一薬物は前記した複数のキナーゼの少なくとも1個の活性を阻害する、すなわち単一薬物を存在させない同等条件下での該キナーゼの少なくとも2個の活性と比して少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または少なくとも95%阻害する。別の具体的実施形態では、前記状態はインスリン抵抗性、糖尿病または肥満;炎症;不適切または疾患関連血管形成;心血管疾患;癌、過剰増殖性疾患または関連する先天性疾患;または微生物による感染の1つ以上である。より具体的な実施形態では、複数のキナーゼはCDK1、CHK2、PRK2及びROCK−IIであり、単一薬物は、単一薬物を約3μMの濃度で存在させるインビトロキナーゼアッセイにおいてCDK1、CHK2、PRK2及びROCK−IIを単一薬物を存在させない同等条件下での該CDK1、CHK2、PRK2及びROCK−IIの活性と比して少なくとも90%阻害する。別の具体的実施形態では、単一薬物は、単一薬物を約3μMの濃度で存在させるインビトロキナーゼアッセイにおいて表2にリストしたキナーゼの少なくとも7個の活性を単一薬物を存在させない同等条件下での表2にリストしたキナーゼの少なくとも7個の活性と比較して90%以上阻害する。別の具体的実施形態では、単一薬物は、単一薬物を約3μMの濃度で存在させるインビトロキナーゼアッセイにおいて表2にリストしたキナーゼの少なくとも12個の活性を単一薬物を存在させない同等条件下での表2にリストしたキナーゼの少なくとも12個の活性と比較して75%以上阻害する。別の具体的実施形態では、単一薬物は、単一薬物を約3μMの濃度で存在させるインビトロキナーゼアッセイにおいて表2にリストしたキナーゼの少なくとも21個の活性を単一薬物を存在させない同等条件下での表2にリストしたキナーゼの少なくとも21個の活性と比較して50%以上阻害する。
1実施形態において、本発明は、有効量の化合物CC001を投与することを含む1つ以上の病的状態を有する個体の治療方法を提供し、前記有効量は1個以上のキナーゼの活性を検出可能にモジュレートし、前記した1個以上のキナーゼは1つ以上の病的状態に関係している。具体的実施形態では、キナーゼはCDK1/サイクリンB、CDK2/サイクリンA、cSRC、Yes、MEKまたはRsk1である。別の実施形態では、本発明は、有効量の化合物CC004を投与することを含む1つ以上の病的状態を有する個体の治療方法を提供し、前記有効量は1個以上のキナーゼの活性を検出可能にモジュレートし、前記した1個以上のキナーゼは1つ以上の病的状態に関係している。具体的実施形態では、キナーゼはCDK1/サイクリンB、CDK2/サイクリンA、cSrc、Yes、MEKまたはRsk1である。別の具体的実施形態では、前記治療は個体に対してCC001及びCC004の両方を投与することを含む。
(4.2) 化合物
現在、CC001、CC002、CC004及びCC005(実施例1参照)と称される4つの化合物が単一薬物として作用するとして同定されている。これら4つの化合物は、Srcファミリーキナーゼ及びCDKキナーゼを含めた数種のキナーゼの活性をモジュレート、特に阻害することが判明している。
現在、CC001、CC002、CC004及びCC005(実施例1参照)と称される4つの化合物が単一薬物として作用するとして同定されている。これら4つの化合物は、Srcファミリーキナーゼ及びCDKキナーゼを含めた数種のキナーゼの活性をモジュレート、特に阻害することが判明している。
下記するように、上記した単一薬物はいずれも治療しようとする特定の病的状態に関係する1つ以上の治療と組み合わせて個体に対して投与され得る。よって、本発明は、有効量の化合物CC004またはCC001を前記単一薬物以外の化合物である第2化合物と組み合わせて投与することを含む1つ以上の病的状態を有する個体の治療方法をも提供し、前記有効量は1個以上のキナーゼの活性を検出可能にモジュレートし、前記した1個以上のキナーゼは1つ以上の病的状態に関係している。
勿論、上記した2つの化合物の各々は単一薬物のみを含む治療レジメンまたは他の補助薬物を含むレジメンのいずれにおいても他の単一薬物と組み合わされ得る。
特定の病的状態の治療において有用な第2の補助薬物の例を以下にリストする。
本発明は、複数のキナーゼを標的化するための及び複数のキナーゼを標的化することにより治療可能な疾患、障害及び状態を治療するための好ましい単一薬物の使用を提供する。1実施形態では、複数のキナーゼを標的化するための好ましい単一薬物は、式(Ia)を有するインダゾール化合物、並びにその異性体、プロドラッグ、製薬上許容される塩、溶媒和物及び水和物である。
上記式中、
R1は−H、−ハロ、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−OR3、−N(R4)2、−CN、−NO2、−C(O)R5、−OC(O)R5、−NHC(O)R5、−SO2R6、−アリール、−ヘテロ環、−ヘテロアリール、−シクロアルキル、−(C1−6アルキレン)−R2または−O−(C1−6アルキレン)−R2であり;
R2は−H、−ハロ、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−OR3、−N(R4)2、−CN、−NO2、−C(O)R5、−OC(O)R5、−NHC(O)R5、−SO2R6、−アリール、−ヘテロ環、−ヘテロアリールまたは−シクロアルキルであり;
R3は独立して−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−C1−6ハロアルキル、−シクロアルキル、−アリールまたは−ヘテロ環であり;
R4はそれぞれ独立して−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−シクロアルキル、−アリール、−ヘテロ環または−(C1−6アルキレン)−OR3であり;
R5は−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−シクロアルキル、−アリール、−ヘテロ環、−OR3または−N(R4)2であり;
R6は−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−N(R4)2、−シクロアルキル、−アリールまたは−ヘテロ環であり
Zはそれぞれ−C(R7)−または−N−(ただし、Zの最高3個が−N−であり得る)であり;
R7は−H、−ハロ、−C1−6アルキル、−C1−6ハロアルキル、−O−(C1−6ハロアルキル)、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−OR3、−N(R4)2、−CN、−NO2、−C(O)R5、−OC(O)R5、−NHC(O)R5、−SO2R6、−アリール、−ヘテロ環、−シクロアルキル、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)n−シクロアルキル、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)n−アリール、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)n−ヘテロ環、−(C1−6アルキレン)−シクロアルキル、−(C1−6アルキレン)−アリール、−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環、−O−(C1−6アルキレン)−C(O)R5、−O−(C1−6アルキレン)−N(R4)2、−O(C1−6アルキレン)−シクロアルキル、−O−(C1−6アルキレン)−アリールまたは−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環(ここで、R7は炭素原子を介して二環式環系に結合しており、nは0または1である)であり;
R9は−H、−C1−6アルキルまたはシクロアルキルである。
R1は−H、−ハロ、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−OR3、−N(R4)2、−CN、−NO2、−C(O)R5、−OC(O)R5、−NHC(O)R5、−SO2R6、−アリール、−ヘテロ環、−ヘテロアリール、−シクロアルキル、−(C1−6アルキレン)−R2または−O−(C1−6アルキレン)−R2であり;
R2は−H、−ハロ、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−OR3、−N(R4)2、−CN、−NO2、−C(O)R5、−OC(O)R5、−NHC(O)R5、−SO2R6、−アリール、−ヘテロ環、−ヘテロアリールまたは−シクロアルキルであり;
R3は独立して−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−C1−6ハロアルキル、−シクロアルキル、−アリールまたは−ヘテロ環であり;
R4はそれぞれ独立して−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−シクロアルキル、−アリール、−ヘテロ環または−(C1−6アルキレン)−OR3であり;
R5は−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−シクロアルキル、−アリール、−ヘテロ環、−OR3または−N(R4)2であり;
R6は−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−N(R4)2、−シクロアルキル、−アリールまたは−ヘテロ環であり
Zはそれぞれ−C(R7)−または−N−(ただし、Zの最高3個が−N−であり得る)であり;
R7は−H、−ハロ、−C1−6アルキル、−C1−6ハロアルキル、−O−(C1−6ハロアルキル)、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−OR3、−N(R4)2、−CN、−NO2、−C(O)R5、−OC(O)R5、−NHC(O)R5、−SO2R6、−アリール、−ヘテロ環、−シクロアルキル、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)n−シクロアルキル、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)n−アリール、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)n−ヘテロ環、−(C1−6アルキレン)−シクロアルキル、−(C1−6アルキレン)−アリール、−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環、−O−(C1−6アルキレン)−C(O)R5、−O−(C1−6アルキレン)−N(R4)2、−O(C1−6アルキレン)−シクロアルキル、−O−(C1−6アルキレン)−アリールまたは−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環(ここで、R7は炭素原子を介して二環式環系に結合しており、nは0または1である)であり;
R9は−H、−C1−6アルキルまたはシクロアルキルである。
1実施形態では、−Zはそれぞれ−C(R7)−である。
別の実施形態では、R1は−Hである。
更に別の実施形態では、R1は−C1−6アルキルである。
別の実施形態では、R1は−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環である。
更に別の実施形態では、R1は−CH2−ヘテロ環である。
更なる実施形態では、R1は−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環である。
別の実施形態では、R1は−O−CH2−ヘテロ環である。
別の実施形態では、R1は−(C1−6アルキレン)−N(R4)2(ここで、R4はそれぞれ独立して−HまたはC1−6アルキルである)である。
別の実施形態では、R1は−(C1−6アルキレン)−NH(C1−6アルキル)である。
別の実施形態では、R1は−(C1−6アルキレン)−N(R4)2(ここで、両R4基は−(C1−6アルキレン)−(O−C1−6アルキル)である)である。
実施形態では、R1は−CH2−N(R4)2(ここで、R4はそれぞれ独立して−HまたはC1−6アルキルである)である。
1実施形態では、R7は−Hである。
1実施形態では、R7は−ハロである。
1実施形態では、R7は−O−(C1−6アルキル)である。
別の実施形態では、R7は−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環である。
更に別の実施形態では、R7は−C(O)−(C1−6アルキル)である。
別の実施形態では、R7は−O−(C1−6ハロアルキル)である。
1実施形態では、R8は−Hである。
別の実施形態では、R9は−Hである。
更に別の実施形態では、R8は−Hであり、R9は−Hである。
好ましい実施形態では、R1は−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環であり、R7は−O−(C1−6アルキル)である。
更に好ましい実施形態では、R1は−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環であり、R7は−O−(C1−6アルキル)であり、R8は−Hであり、R9は−Hである。
別の好ましい実施形態では、R1は−(C1−6アルキレン)−N(R4)2であり、R7は−O−(C1−6アルキル)であり、R8は−Hであり、R9は−Hである。
本発明はまた、治療有効量の式(Ia)を有するインダゾール化合物及び製薬上許容されるビヒクルを含む組成物の複数のキナーゼの標的化及び複数のキナーゼを標的化することにより治療可能な疾患、障害または状態の治療における使用も提供する。
特に好ましい実施形態では、単一薬物は本明細書中で“CC001”と命名されている上記化合物20である。実施例1及び85を参照されたい。
上記式中、
R1は−H、−C1−6アルキル、−(C1−6アルキレン)−R2または−O−(C1−6アルキレン)−R2であり;
R2は−C1−6アルキル、−C1−6アルコキシ、−OH、−N(R3)2、−アリール、−ヘテロアリール、−ヘテロ環または−シクロアルキルであり;
R3はそれぞれ独立して−H、−C1−6アルキルまたは−C1−6アルキレン−(C1−6アルコキシ)であり;
R4は−N(R5)2、−O−C1−6アルキル、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)m−ヘテロ環、−C(O)−ヘテロ環、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)m−ヘテロアリール、−C(O)−ヘテロアリール、−(C1−6アルキレン)−シクロアルキル、−O−(C1−6アルキレン)−N(R5)2、−O−(C1−6アルキレン)m−ヘテロ環、−O−(C1−6アルキレン)m−ヘテロアリール、−O−(C1−6アルキレン)m−シクロアルキルまたは−O−(C1−6アルキレン)m−C(O)R5であり;
Zは−CH−または−N−であり;
R5はそれぞれ独立して−Hまたは−C1−6アルキルであり;
mは0または1である。
R1は−H、−C1−6アルキル、−(C1−6アルキレン)−R2または−O−(C1−6アルキレン)−R2であり;
R2は−C1−6アルキル、−C1−6アルコキシ、−OH、−N(R3)2、−アリール、−ヘテロアリール、−ヘテロ環または−シクロアルキルであり;
R3はそれぞれ独立して−H、−C1−6アルキルまたは−C1−6アルキレン−(C1−6アルコキシ)であり;
R4は−N(R5)2、−O−C1−6アルキル、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)m−ヘテロ環、−C(O)−ヘテロ環、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)m−ヘテロアリール、−C(O)−ヘテロアリール、−(C1−6アルキレン)−シクロアルキル、−O−(C1−6アルキレン)−N(R5)2、−O−(C1−6アルキレン)m−ヘテロ環、−O−(C1−6アルキレン)m−ヘテロアリール、−O−(C1−6アルキレン)m−シクロアルキルまたは−O−(C1−6アルキレン)m−C(O)R5であり;
Zは−CH−または−N−であり;
R5はそれぞれ独立して−Hまたは−C1−6アルキルであり;
mは0または1である。
1実施形態では、−Zは−CH−である。
別の実施形態では、R1は−Hである。
更に別の実施形態では、R1は−C1−6アルキルである。
別の実施形態では、R1は−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環である。
更に別の実施形態では、R1は−CH2−ヘテロ環である。
更なる実施形態では、R4は−N(R5)2である。
更なる実施形態では、R4は−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環である。
更なる実施形態では、R4は−O−C1−6アルキル、好ましくは−OCH3である。
別の実施形態では、R4は−O−CH2−ヘテロ環である。
別の実施形態では、R4は−O−(CH2)2−ヘテロ環である。
別の実施形態では、R4は−O−(CH2)3−ヘテロ環である。
別の実施形態では、R4は−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環である。
好ましい実施形態では、R1は−Hであり、R4は−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環である。
別の好ましい実施形態では、R1は−CH2−ヘテロ環であり、R4は−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環である。
更に別の好ましい実施形態では、R1は−C1−6アルキルであり、R4は−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環である。
更に別の好ましい実施形態では、Zは−CH−であり、R1は−(C1−6アルキレン)−R2であり、R2は−N(R3)2であり、R4は−O−CH3である。
更に別の好ましい実施形態では、Zは−CH−であり、R1は−C1−6アルキルであり、R4は−O−(C2アルキレン)−N(R5)2である。
本発明はまた、治療有効量の式(Ib)を有するインダゾール化合物及び製薬上許容されるビヒクルを含む組成物の複数のキナーゼの標的化及び複数のキナーゼを標的化することにより治療可能な疾患、障害または状態の治療における使用も提供する。
特に好ましい実施形態では、単一薬物は本明細書中で“CC002”と命名されている上記化合物52である。別の特に好ましい実施形態では、単一薬物は本明細書中で“CC0004”と命名されている上記化合物92である。特に好ましい実施形態では、単一薬物は本明細書中で“CC005”と命名されている上記化合物117である。実施例1及び86〜88を参照されたい。
別の実施形態で、本発明は、複数のキナーゼを標的化(例えば、阻害)するため、複数のタンパク質キナーゼを標的化(例えば、阻害)することにより治療可能な疾患、状態または障害を治療するための単一薬物の使用を提供する。ただし、前記単一薬物は、5−(5−シクロペンチル−1H−[1,2,4]トリアゾル−3−イル)−3−(4−フルオロフェニル−1H−インダゾール:
でもない。
別の実施形態では、本発明の方法は、インタゾール含有化合物ではない小(<1000ダルトン)有機分子である単一薬物を用いる複数のキナーゼの標的化を包含する。別の実施形態では、本発明の方法は、複数のタンパク質キナーゼの活性をモジュレートする核酸(例えば、アプタマー)である単一薬物を用いる複数のキナーゼの標的化を包含する。別の実施形態では、本発明の方法は、複数のキナーゼの活性をモジュレートするペプチドである単一薬物を用いる複数のキナーゼの標的化を包含する。これらの単一薬物及びその他の本明細書中に記載されている薬物は相互に組み合わせて使用され得る。例えば、インダゾール含有化合物である単一薬物は、インダゾール含有化合物、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである単一薬物、或いはその組合せと一緒に使用され得る。ペプチドである単一薬物は、インダゾール含有化合物、非インダゾール含有化合物またはポリヌクレオチド等である単一薬物と一緒に使用され得る。具体的実施形態では、本発明の方法は、CDKキナーゼ、Yesキナーゼ、cSrcキナーゼ、MEKキナーゼ及びRskキナーゼである複数のタンパク質キナーゼのペプチド、ポリヌクレオチドまたは非インダゾール小分子を用いる標的化を包含する。より具体的な実施形態では、前記した複数のキナーゼはヒトCDK1、CDK2、Yes、MEK1、cSRC及びRsk1からなる。
(4.3) 補助治療
本発明によれば、1つ以上の単一薬物の投与による治療は1つ以上の治療の投与と組み合わされ得る。前記した治療には化学療法、放射線治療、ホルモン治療及び/または生物学的治療/免疫治療が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、1つ以上の単一薬物の投与による治療は1つ以上の治療の投与と組み合わされ得る。前記した治療には化学療法、放射線治療、ホルモン治療及び/または生物学的治療/免疫治療が含まれるが、これらに限定されない。
(4.3.1)癌補助治療
特定実施形態においては、本発明の方法は、1つ以上の単一薬物と共に1つ以上の血管形成抑制剤の投与を包含する。前記血管形成抑制剤の例にはアンギオスタチン(プラスミノーゲン断片)、抗血管形成アンチトロンビンIII、アンギオザイム、ABT−627、Bay 12−9566、ベネフィン、ベバシズマブ、BMS−275291、軟骨由来阻害剤(CDI)、CAI、CD59補体断片、CEP−7055、Col 3、コンブレタスタチンA−4、エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片)、フィブロネクチン断片、Gro−β、ハロフギノン、ヘパリナーゼ、ヘパリンヘキササッカリド断片、HMV833、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、IM−862、インターフェロンα/β/γ、インターフェロン誘導性タンパク質(IP−10)、インターロイキン12、クリングル5(プラスミノーゲン断片)、マリマスタット、メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMP)、2−メトキシエストラジオール、MMI 270(CGS 27023A)、MoAb IMC−1C11、ネオバスタット、NM−3、パンゼム、PI−88、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、血小板因子4(PF−4)、プリノマスタット、プロラクチン16kD断片、プロリフェリン関連タンパク質(PRP)、PTK 787/ZK 222594、レチノイド、ソリマスタット、スクアラミン、SS 3304、SU 5416、SU 6668、SU 11248、テトラヒドロコルチゾール−S、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン1(TSP−1)、TNP−470、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)、バスクロスタチン、バソスタチン(カルレティキュリン断片)、ZD6126、ZD6474、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(FTI)及びビスホスホネートが含まれるが、これらに限定されない。
特定実施形態においては、本発明の方法は、1つ以上の単一薬物と共に1つ以上の血管形成抑制剤の投与を包含する。前記血管形成抑制剤の例にはアンギオスタチン(プラスミノーゲン断片)、抗血管形成アンチトロンビンIII、アンギオザイム、ABT−627、Bay 12−9566、ベネフィン、ベバシズマブ、BMS−275291、軟骨由来阻害剤(CDI)、CAI、CD59補体断片、CEP−7055、Col 3、コンブレタスタチンA−4、エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片)、フィブロネクチン断片、Gro−β、ハロフギノン、ヘパリナーゼ、ヘパリンヘキササッカリド断片、HMV833、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、IM−862、インターフェロンα/β/γ、インターフェロン誘導性タンパク質(IP−10)、インターロイキン12、クリングル5(プラスミノーゲン断片)、マリマスタット、メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMP)、2−メトキシエストラジオール、MMI 270(CGS 27023A)、MoAb IMC−1C11、ネオバスタット、NM−3、パンゼム、PI−88、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、血小板因子4(PF−4)、プリノマスタット、プロラクチン16kD断片、プロリフェリン関連タンパク質(PRP)、PTK 787/ZK 222594、レチノイド、ソリマスタット、スクアラミン、SS 3304、SU 5416、SU 6668、SU 11248、テトラヒドロコルチゾール−S、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン1(TSP−1)、TNP−470、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)、バスクロスタチン、バソスタチン(カルレティキュリン断片)、ZD6126、ZD6474、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(FTI)及びビスホスホネートが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物、剤形及びキットを含めた本発明の各種実施形態において使用され得る抗癌剤の追加例にはアシビシン、アクラルビシン、塩酸アクダゾール、アクロニン、アドゼルシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ジメシル酸ビスナフィド、ビゼルシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼルシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルブシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、塩酸イダルビシン、イフォスファミド、イルモフォシン、インターロイキンII(組換えインターロイキンIIまたはrIL2を含む)、インターフェロン−2a、インターフェロンα−2b、インターフェロンα−n1、インターフェロンα−n3、インターフェロンβ−Ia、インターフェロンγ−Ib、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、マイトクロミン、マイトギリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトスペル、マイトタン、塩酸マイトキサントロン、マイコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィメルナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォサートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフル、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシンが含まれるが、これらに限定されない。他の抗癌剤には20−エピ−1,25−ジヒドロキシビタミンD3、5−エチニルウラシル、アビラテロン、アクラビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼルシン、アルデスロイキン、ALL−TKアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管新生阻害剤、アンタゴニストD、アンタゴニストG、アンタレリックス、抗背方化形態形成タンパク質−1、抗アンドロゲン、前立腺癌、抗エストロゲン、抗ネオプラストン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、グリシン酸アフィジコリン、アポトーシス遺伝子モジュレーター、アポトーシス調節因子、アプリニン酸、アラ−CDP−DL−PTBA、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン1、アキシナスタチン2、アキシナスタチン3、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンIII誘導体、バラノール、バチマスタット、BCR/ABLアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、βラクタム誘導体、β−アレチン、ベタクラマイシンB、ベツリニン酸、bFGF阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンA、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンC、カンプトテシン誘導体、カナリポックスIL−2、カペシタビン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、CaRest M3、CARN 700、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS)、カスタノスペルミン、セクロピンB、セトロレリクス、クロルリン、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェンアナログ、クロトリマゾール、コリスマイシンA、コリスマイシンB、コンブレタスタチンA4、コンブレタスタチンアナログ、コナゲニン、クラムベシジン816、クリスナトール、クリプトフィシン8、クリプトフィシンA誘導体、クラシンA、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクホスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンB、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシフォスファミド、デキスラゾキサン、デキスベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンB、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−5−アザシチジン、ジヒドロタキソール,9−、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカマイシンSA、エブセレン、エコムスチン、エデルフォシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチンアナログ、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン、ホルフェニメクス、ホルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモッド、免疫刺激ペプチド、インスリン様成長因子1受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール,4−、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンB、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドF、ラメラリン−Nトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミソール、リアロゾール、線形ポリアミン類似体、親油性ジサッカリドペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド7、ロバプラチン、ロムブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解ペプチド、メイタンシン、マンノスタチンA、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、MIF阻害剤、ミフェプリストロン、ミルテフォシン、ミリモスチム、不適性二本鎖RNA、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシンアナログ、ミトナフィド、マイトトキシンフィブロブラスト増殖因子−サポリン、マイトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリルリピドA+ミオバクテリウム細胞壁sk、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多発性腫瘍抑制因子1に基づく治療、マスタード抗癌剤、ミカペルオキシドB、マイコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、N−アセチルジナリン、N−置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン+ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素モジュレーター、一酸化窒素抗酸化剤、ニトルリン、O6−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導因子、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントザンポリサルフェートナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニル酢酸、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニル、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンA、プラセチンB、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、白金複合体、白金化合物、白金−トリアミン複合体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビス−アクリドン、プロスタグランジンJ2、プロテアソーム阻害剤、プロテインAに基づく免疫モジュレーター、タンパク質キナーゼC阻害剤、タンパク質キナーゼC阻害剤、ミクロアルガル、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、rafアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、rasファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤、ras阻害剤、ras−GAP阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムRe 186エチドロナート、リゾキシン、リボザイム、RIIレチナミド、ログレチミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメクス、ルビギノンB1、ルボキシル、サフィンゴール、サイントピン
、SarCNU、サルコフィトールA、サルグラモスチム、Sdi 1ミメティックス、セムスチン、セネッセンス誘導性阻害剤1、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達モジュレーター、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォス酸、スピカマイシンD、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンギスタチン1、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、過活動バソアクティブ腸内ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、サリブラスチン、チオコラリン、トロンボポイエチン、トロンボポイエチンミメティック、チマルファシン、チモポイエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、チンエチルエチオプルプリン、チラパザミン、チタノセン二塩化物、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チロホスチン、UBC阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンB、ベクター系、赤血球遺伝子治療、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ及びジノスタチン刺激因子が含まれるが、これらに限定されない。好ましい追加抗癌剤は5−フルオロウラシル及びロイコボリンである。これら2つの薬剤は、サリドマイド及びトポイソメラーゼ阻害剤を用いる方法において使用する場合に特に有用である。
、SarCNU、サルコフィトールA、サルグラモスチム、Sdi 1ミメティックス、セムスチン、セネッセンス誘導性阻害剤1、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達モジュレーター、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォス酸、スピカマイシンD、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンギスタチン1、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、過活動バソアクティブ腸内ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、サリブラスチン、チオコラリン、トロンボポイエチン、トロンボポイエチンミメティック、チマルファシン、チモポイエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、チンエチルエチオプルプリン、チラパザミン、チタノセン二塩化物、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チロホスチン、UBC阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンB、ベクター系、赤血球遺伝子治療、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ及びジノスタチン刺激因子が含まれるが、これらに限定されない。好ましい追加抗癌剤は5−フルオロウラシル及びロイコボリンである。これら2つの薬剤は、サリドマイド及びトポイソメラーゼ阻害剤を用いる方法において使用する場合に特に有用である。
本発明はまた、癌細胞を壊すためにX線、ガンマ線及び他の放射線源を用いることを含む放射線治療と組み合わせた1つ以上の単一薬物の投与を包含する。好ましい実施形態では、放射線治療は、放射線を遠隔源から当てる外部ビーム放射線治療または遠隔放射線治療として投与される。他の好ましい実施形態では、放射線治療は、放射線源を癌細胞または腫瘍塊の近くの体内に配置する内部治療または近接照射治療として投与される。
癌治療並びにその用量、投与ルート及び推奨使用量は当業界で公知であり、Physician’s Desk Reference(56版,2002年)のような文献に記載されている。
(4.3.2)炎症補助治療
炎症及び炎症関連状態を治療するために、1つ以上の単一薬物を1つ以上の抗炎症活性を有する化合物と組み合わせて投与され得る。従って、各種実施形態において単一薬物を用いる治療は例えばステロイド系抗炎症剤、非ストロイド系抗炎症剤(NSAID)、ベナドリル(登録商標)、IL−9アンタゴニスト、抗ヒスタミン薬、交感神経作用薬、グルココルチコイド、コルチコステロイド、β−アドレナリン作用薬(エピネフリン及びイソプロテレノール)、テオフィリン、抗コリン作用薬(例えば、アトロピン及び臭化イプラトロピウム)、ロイコトリエン阻害剤、免疫療法(例えば、アレルゲンの反復長期間注射、短期間脱感作、毒物免疫治療、有効量の1つ以上の抗IgE抗体及び/または1つ以上の肥満細胞モジュレーター(例:肥満細胞プロテアーゼ阻害剤、幹細胞因子(c−kitリガンド)阻害剤及びc−kit受容体阻害剤)を用いる治療と組み合わされ得る。
炎症及び炎症関連状態を治療するために、1つ以上の単一薬物を1つ以上の抗炎症活性を有する化合物と組み合わせて投与され得る。従って、各種実施形態において単一薬物を用いる治療は例えばステロイド系抗炎症剤、非ストロイド系抗炎症剤(NSAID)、ベナドリル(登録商標)、IL−9アンタゴニスト、抗ヒスタミン薬、交感神経作用薬、グルココルチコイド、コルチコステロイド、β−アドレナリン作用薬(エピネフリン及びイソプロテレノール)、テオフィリン、抗コリン作用薬(例えば、アトロピン及び臭化イプラトロピウム)、ロイコトリエン阻害剤、免疫療法(例えば、アレルゲンの反復長期間注射、短期間脱感作、毒物免疫治療、有効量の1つ以上の抗IgE抗体及び/または1つ以上の肥満細胞モジュレーター(例:肥満細胞プロテアーゼ阻害剤、幹細胞因子(c−kitリガンド)阻害剤及びc−kit受容体阻害剤)を用いる治療と組み合わされ得る。
(4.4) 用量及び投与
本発明は、2個以上のキナーゼまたはこれらをコードする遺伝子を同時に標的化するように作用する1つ以上の化合物(単一薬物とも呼ぶ)の投与に関する。
本発明は、2個以上のキナーゼまたはこれらをコードする遺伝子を同時に標的化するように作用する1つ以上の化合物(単一薬物とも呼ぶ)の投与に関する。
好ましい実施形態では、単一薬物は医薬組成物である。前記組成物は、予防または治療有効量の1つ以上の単一薬物及び製薬上許容される担体を含む。具体的実施形態では、用語「製薬上許容される」は、動物、特にヒトに使用するために連邦または州政府の取り締まり機関が承認しているか或いは米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方にリストされていることを意味する。用語「担体」は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントアジュバント(完全及び不完全))、賦形剤またはビヒクルを指す。この医薬用担体は滅菌液体、例えば水及び油(落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等のような石油、動物、植物または合成起源のもの)である。医薬組成物を静脈内投与する場合には水が好ましい担体である。食塩液、水性デキストロース及びグリセロール溶液も液体担体として、特に注射液用液体担体として使用され得る。適当な医薬用賦形剤にはデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。所望により、組成物は少量の湿潤/乳化剤またはpH緩衝剤をも含み得る。組成物は溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の形態をとり得る。経口組成物には一般的な担体、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が配合され得る。適当な医薬用担体の例は、E.W.Martinの“Remington’s Pharmaceutical Sciences”に記載されている。上記組成物は、患者に対して適切に投与するために予防または治療有効量の(好ましくは、精製形態の)予防または治療薬を適量の担体と一緒に含む。製剤は投与モードに適合していなければならない。好ましい実施形態では、医薬組成物は滅菌であり、被験者、好ましくは動物被験者、より好ましくは哺乳動物被験者、最も好ましくはヒト被験者に投与するのに適した形態を有する。
具体的実施形態では、本発明の医薬組成物を治療を要する領域に局所的に投与することが望ましいことがある。これは、例であって限定はしないが、局所注入、注射またはインプラントを用いることにより達成され得る。前記インプラントは、シラスチック膜のような膜を含めた多孔性、非孔性またはゼラチン質材料または繊維製である。好ましくは、1つ以上の予防または治療薬を投与する場合予防または治療薬を吸収しない材料を使用するように留意しなければならない。
別の実施形態では、単一薬物は小胞、特にリポソームでデリバリーされ得る(Langer,Science,249:1527−1553(1990);Treatら,Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez−Berestein及びFidles編,ニューヨークに所在のLiss(1989年)発行,p.353−365;上掲のLopez−Berestein,p.317−327参照;概説は上記参照)。
更に別の実施形態では、単一薬物は制御放出性または徐放性システムでデリバリーされ得る。1実施形態では、制御放出または徐放するためにポンプが使用され得る(上掲のLanger;Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.,14:20(1987);Buchwaldら,Surgery,88:507(1980);Saudekら,N,Engl.J.Med.,321:574(1989)参照)。別の実施形態では、本発明の抗体またはその断片を制御放出または徐放するためにポリマー材料が使用され得る(例えば、Medical Applications of Controlled Release,Langer及びWise編,フロリダ州ボカラトンに所在のCRC Press(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen及びBall編,ニューヨークに所在のWiley(1984年)発行;Ranger及びPeppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.,23:61(1983)参照;Levyら,Science,228:190(1985);Duringら,Ann.Neurol.,25:351(1989);Howardら,J.Neurosurg.,71:105(1989);米国特許第5,679,377号、米国特許第5,916,597号、米国特許第5,912,015号、米国特許第5,989,463号、米国特許第5,128,326号、国際特許出願公開第99/15154号及び国際特許出願公開第99/20253号も参照)。徐放性製剤中に使用されるポリマーの例にはポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン−コ−酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコシド(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N−ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)及びポリオルトエステルが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、徐放性製剤中に使用されるポリマーは不活性であり、浸出性不純物を含まず、貯蔵時に安定であり、無菌であり、生分解性である。更に別の実施形態では、制御放出または徐放システムは治療標的の近くに、すなわち肺に配置され得、よって全身量の一部のみが必要とされる(例えば、上掲のGoodson,Medical Applications of Controlled Release,2:115−138(1984)参照)。
制御放出システムは、Langerによる論文(Science,249:1527−1533(1990))で検討されている。1つ以上の本発明の抗体またはその断片を含む徐放性製剤を作成するために当業者に公知の技術が使用され得る。例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れる米国特許第4,526,938号;国際特許出願公開第91/05548号;国際特許出願公開第96/20698号;Ningら,“Intramoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained−Release Gel”,Radiotherapy & Oncology,39:179−189(1996);Songら,“Antibody Mediated Lung Targeting of Long−Circulating Emulsions”,PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology,50:372−397(1995);Cleekら,“Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application”,Proc.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.,24:853−854(1997);及びLamら,“Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery”,Proc.Int’l.Symp.Control Res.Bioact.Mater.,24:759−760(1997)を参照されたい。
本発明の単一薬物が1つ以上の予防または治療薬をコードする1つ以上の核酸分子である具体的実施形態では、核酸はインビボで、適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内にあるように例えばレトロウイルスベクター(米国特許第4,980,286号)の使用;直接注射;微粒子衝撃(例えば、遺伝子銃;Biolistic,Dupont)の使用;脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクト物質での被覆;核が進入することが公知のホメオボックス様ペプチドに連結させた投与(例えば、Joliotら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1864−1868(1991)参照)等により投与することによりコード化予防または治療薬の発現を促進するように投与され得る。或いは、核酸は細胞内に導入され、相同組換えによる発現のために宿主細胞DNAに組み込まれ得る。
本発明の医薬組成物は所期投与ルートと適合するように製剤化される。投与ルートの例には非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、鼻腔内、経皮(局所)、経粘膜及び直腸投与が含まれるが、これらに限定されない。具体的実施形態では、組成物は、ヒトに静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内または局所投与するのに適した医薬組成物としてルーチンの手順に従って製剤化される。好ましい実施形態では、医薬組成物はヒトに皮下投与するためにルーチンの手順に従って製造化される。典型的には、静脈内投与用組成物は滅菌等張性水性バッファー中の溶液である。所要により、組成物は可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるために局所麻酔薬(例えば、リグノカイン)をも配合し得る。
単一薬物を局所的に投与しようとする場合、例えば軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアゾール、溶液、乳濁液または当業者に公知の他の形態で製剤化され得る。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,第4版,ペンシルバニア州フィラデルフィアに所在のLea & Febiger(1985年)発行を参照されたい。スプレー以外の局所剤形の場合、局所適用に適合性であり、(好ましくは水よりも高い)動的粘性を有する担体または1つ以上の賦形剤を含む粘性〜半固体もしくは固体形態が通常使用される。適当な製剤には溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、ロウ膏剤等が含まれるが、これらに限定されない。前記製剤は、所望により滅菌しても各種特性(例えば、浸透圧)に影響を及ぼすために助剤、例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤、バッファーまたは塩と混合してもよい。他の適当な局所剤形には、活性成分を好ましくは固体または液体不活性担体と組み合わせて圧縮揮発物(例えば、フレオンのような気体噴射剤)との混合物またはスクイズボトル中に包装しているスプレー可能なエアゾル製剤が含まれる。所望により、医薬組成物及び剤形に保湿剤または湿潤剤を配合してもよい。追加成分の例は当業界で公知である。
本発明の組成物を鼻腔内に投与しようとする場合、組成物はエアゾル形態、スプレー、ミストまたは液滴剤の形態で製剤化され得る。特に、本発明に従って使用するための予防または治療薬は、有利には適当な噴射剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガス)を用いて加圧パックまたはネブライザーからエアゾールスプレーの形態でデリバリーされ得る。加圧エアゾールの場合、1回用量は計量した量をデリバリーするために弁を備えることにより決定され得る。カプセル及びカートリッジ、例えば吸入器または注入器中に使用するためのゼラチン製カプセル及びカートリッジは化合物と適当な粉末基剤(例えば、ラクトースまたはデンプン)の粉末ミックスを収容して製剤化され得る。
本発明の組成物を経口投与しようとする場合、組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ゲルキャップ、溶液剤、懸濁液剤等の形態で製剤化され得る。錠剤またはカプセル剤は製薬上許容される賦形剤、例えば結合剤(例えば、予ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム)または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)を用いて慣用手段により調製され得る。錠剤に当業界で公知の方法によりコーティングを施してもよい。経口投与用液体製剤は例えば溶液剤、シロップ剤または懸濁液剤の形態をとり得、または使用前に水または他の適当なビヒクルを用いて構成される乾燥粉末として提供され得る。液体製剤は製薬上許容され得る添加剤、例えば懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂);乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア);非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画化植物油)及び保存剤(例えば、p−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、またはソルビン酸)を用いて慣用の手段により調製され得る。製剤は適当ならば、緩衝塩、着香料、着色料及び甘味料をも含み得る。経口投与用製剤は、予防または治療薬を徐放、制御放出または持続放出するために適当に製剤化され得る。
本発明の組成物は注射、例えばボーラス注射または連続注入により非経口投与するために製剤化され得る。注射用製剤は保存剤を添加した1回量剤形、例えばアンプルまたは複数回投与容器中に入れて提供され得る。組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態を取り得、懸濁剤、安定化剤及び/または分散剤のような製剤化剤を含み得る。或いは、活性成分は使用前に適当なビヒクル(例えば、滅菌の発熱物質非含有水)で構成するための粉末形態であり得る。
本発明の組成物はまた、例えばカカオ脂または他のグリセリドのような一般的な座薬基剤を含有する座剤または停留浣腸剤のような直腸組成物でも製剤化され得る。
上記した製剤に加えて、本発明の組成物はデポ製剤としても製剤化され得る。長時間作用する製剤は(例えば、皮下または筋肉内に)移植することにより、また筋肉内注射により投与され得る。よって、例えば前記組成物は適当なポリマーまたは疎水性材料(例えば、許容される油中の乳濁液として)またはイオン交換樹脂を用いて、或いは難溶性誘導体(例えば、難溶性塩)として製剤化され得る。
本発明の組成物は中性または塩形態として製剤化され得る。医薬的に許容される塩には、アニオン、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されるアニオンを用いて形成される塩;及びカチオン、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、鉄水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されるカチオンを用いて形成される塩が含まれる。
一般的に、本発明の組成物の成分は1回量剤形の形で、例えば活性成分の量を表示している密閉容器(例えば、アンプルまたはサッシェ)中にの凍結乾燥粉末または無水濃縮物として別々にまたは混合して供給されている。組成物を注入により投与しようとする場合、組成物は滅菌医薬グレードの水または食塩液を収容している注入ボトル中に分配され得る。組成物を注射により投与する場合、投与前に成分が混合されるように注射用滅菌水または食塩液のアンプルが用意され得る。
特に、本発明によれば、1つ以上の本発明の予防または治療薬或いは医薬組成物は単一薬物の量を表示している密閉容器(例えば、アンプルまたはサッシェ)に収容されている。1実施形態では、1つ以上の本発明の予防または治療薬或いは医薬組成物は、密閉容器中の乾燥滅菌された凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給され、被験者に投与するためには例えば水または食塩液で適当な濃度に復元され得る。1つ以上の本発明の予防または治療薬或いは医薬組成物は、乾燥滅菌された凍結乾燥粉末として密閉容器中に好ましくは少なくとも5mg、より好ましくは少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、少なくとも75mgまたは少なくとも100mgの1回量で供給される。本発明の予防または治療薬、或いは医薬組成物は元封容器中に2〜8℃で保存されなければならず、本発明の予防または治療薬或いは医薬組成物は復元後1週間以内、好ましくは5日以内、72時間以内、48時間以内、24時間以内、12時間以内、6時間以内、5時間以内、3時間以内または1時間以内に投与されなければならない。代替実施形態では、1つ以上の本発明の予防または治療薬或いは医薬組成物は単一薬物の量及び濃度を表示している密閉容器中に液体の形態で供給される。投与される液体形態の組成物は、密閉容器中に好ましくは少なくとも0.25mg/ml、より好ましくは少なくとも0.5mg/ml、少なくとも1mg/ml、少なくとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/ml、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも75mg/mlまたは少なくとも100mg/mlで供給される。液体形態は元封容器中に2〜8℃で保存されなければならない。
所望により、単一薬物は、活性成分を含有している1つ以上の1回量剤形を収容し得るパックまたはディスペンサーデバイスの形態で提供され得る。前記パックは、例えばブリスターパックのように金属またはプラスチックホイルから構成され得る。前記したパックまたはディスベンサーデバイスには投与説明書が添付されていてもよい。
化合物CC001、CC002及びCC004は試験したキナーゼに対して最も活性であり、それぞれ表2にリストした16、29及び16キナーゼのそれぞれのキナーゼ活性を非化合物対照に比して95%以上阻害した。CC004はCDK1、CDK2、MEK1及びRsk1に対して良好な阻害活性を示し、SrcファミリーキナーゼのcSrc及びYesに対してはやや低い阻害活性を示した。CC006(5−(5−シクロペンチル−1H−[1,2,4]トリアゾル−3−イル)−3−(4−フルオロ−フェニル)−1H−インダゾール)及びCC007(3−(5−(1H−1,2,4−トリアゾル−3−イル)(1H−インダゾル−3−イル))フェニル−N−シクロペンチルカルボキサミド)を対照として含めた。
複数のキナーゼまたはキナーゼ経路を標的化できる単一薬物のインビトロ効果
CC001は、広範囲のキナーゼに対して強いインビトロ阻害活性を有する低分子量混合キナーゼ阻害剤(MK1)である。CC001はHCT−116結腸癌細胞においてキナーゼ及びその下流標的の活性化を濃度依存的に抑制した。CC001は、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌、膵臓癌、頭部癌及び頸部癌、乳癌及び卵巣癌を含めた広範囲の癌細胞系に対しても強い抗増殖活性を示した。いずれの場合も、IC50値はナノモル範囲である。タキソールのような標準化学療法剤及び新規なシグナル伝達抑制剤を用いたインビトロ組合せ研究で、CC001は相加的及び/または相乗的な抗増殖活性を示した。
CC001は、広範囲のキナーゼに対して強いインビトロ阻害活性を有する低分子量混合キナーゼ阻害剤(MK1)である。CC001はHCT−116結腸癌細胞においてキナーゼ及びその下流標的の活性化を濃度依存的に抑制した。CC001は、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌、膵臓癌、頭部癌及び頸部癌、乳癌及び卵巣癌を含めた広範囲の癌細胞系に対しても強い抗増殖活性を示した。いずれの場合も、IC50値はナノモル範囲である。タキソールのような標準化学療法剤及び新規なシグナル伝達抑制剤を用いたインビトロ組合せ研究で、CC001は相加的及び/または相乗的な抗増殖活性を示した。
CC001はインビボ癌モデルで癌抑制効果を示している。10〜20mg/kgの濃度のCC001を1日2回投与して結腸及び肺に腫瘍を有するSCIDマウスを治療した。CC001は単一薬物として腫瘍増殖を用量依存的に抑制した(T/C比:40〜60%)。
CC001を最大許容量のタキソテール(タキソールに関連する抗癌化合物)と組み合わせた類似研究をNCI−H460 NSCLC異種移植片モデルを用いて実施した。この実験では、16〜28%のT/C比が観察された。体重減少で明らかとなる明白な追加毒性は観察されなかった。相加的インビボ効果はカンプトサー(結腸直腸癌に対して一般的に使用されている抗癌剤)でも観察され、T/C比は15%に達した。
1つの実験で、雌CB.17SCIDマウスの右後肢に2×106個のHCT−116細胞を皮下接種した。8日後、通常75〜125mm3のサイズの腫瘍を有するマウスを選択し、群にランダムに割り当てた。治療は8日目に始め、研究期間中続けた。全ての化合物はビヒクルNPS中5ml/kgの容量でi.p.投与した。CC001は20mg/kgでb.i.d.投与した。カンプトサーはi.p. q4dとして投与した。腫瘍容量はカリパスを用いて1週間に2回測定した。値は平均値±SEMである。統計分析はANOVAを用いて実施した。図1及び表3に示すように、CC001での治療により、腫瘍の大きさは実験中大きく縮小した(ビヒクル対照と比較してP<0.001)。
関連実験において、CC002及びCC003と称される2つの化合物を試験した。CC003はナフタレン含有インダソールである。雌CB.17SCIDマウスの右後肢に2×106個のHCT−116細胞を皮下接種した。8日後、通常75〜125mm3のサイズの腫瘍を有するマウスを選択し、群にランダムに割り当てた。治療は8日目に始め、研究期間中続けた。全ての化合物はビヒクルNPS中5ml/kgの容量でi.p.投与した。CC002及びCC003は20mg/kgで最初の4日間(8〜11日目)はb.i.d.投与し、その後はqdとした。カンプトサーは25mg/kgでq4d投与した。腫瘍容量はカリパスを用いて1週間に2回測定した。値は平均値±SEMである。統計分析はANOVAを用いて実施した。図2及び表4に示すように、CC002またはCC003の治療により、腫瘍容量は実験中縮小した(ビヒクル対照と比較してP<0.001)。
化合物C001は、第2化合物と一緒に投与されたとき高い効果を示す。雌CB.17 SCIDマウスの右後肢に2×106個のHCT−116細胞を皮下接種する。8日後、通常75〜125mm3のサイズの腫瘍を有するマウスを選択し、群にランダムに割り当てた。治療は8日目に始め、研究期間中続けた。全ての化合物はビヒクルNPS中で5ml/kgの容量でi.p.投与した。CC001は20mg/kgでb.i.d.投与した。カンプトサーはi.p. q4dとして投与した。腫瘍容量はカリパスを用いて1週間に2回測定した。値は平均値±SEMである。統計分析はANOVAを用いて実施した。図3及び表5に示すように、2.5mg/kgのカンプトサーと一緒にCC001を20mg/kg投与すると、腫瘍発育に対して10mg/kgのカンプトサーのみの投与に等しい効果を示した(ビヒクル対照と比較してP<0.001)。
候補単一薬物を評価するためのインビボアッセイ
単一薬物は各種インビボモデルを用いて確認または最終的に同定され得る。通常、候補単一薬物はまずインビトロスクリーンで同定され、研究対象の特定病的状態についてインビトロモデルで確認される。
単一薬物は各種インビボモデルを用いて確認または最終的に同定され得る。通常、候補単一薬物はまずインビトロスクリーンで同定され、研究対象の特定病的状態についてインビトロモデルで確認される。
まず、適当なインビトロモデルが選択される。例えば、特異的転移パターンを有する癌を含めた多くのタイプの癌に対してマウス腫瘍モデルが利用され得、利用可能なマウス腫瘍モデルに関する情報の情報センターとして働くマウス腫瘍生物学データベースプロジェクト(MTBOP)のような公知ソースから選択され得る。MTBOPはインターネット上でtumor.informatics.jax.org/FMPro?−db=TumorInstance&−format=mtdp.html&−viewで利用可能である。マウス炎症及び糖尿病モデルは、例えばThe Jackson Laboratory(メーン州バーハーバーに所在)からJax Mice & Servicesの名前で入手可能である。それぞれjax.org/jaxmice及びjaxmice.jax.org/jaxmicedb/html/sbmodel_7.shtmlを参照されたい。マウスまたは他の哺乳動物における他の疾患モデルも使用され得る。例えば、関節炎や糖尿病のマウス、ハムスターまたはラットモデルが公知である。
第2の例として、推定単一薬物の抗炎症性活性はカラゲナン誘発関節炎ラットモデルを用いて評価され得る。カラゲナン誘発関節炎は慢性関節炎または炎症の研究において家兎、イヌ及びブタで使用されてきた。治療効果を調べるために定量組織形態計測評価が使用される。カラゲナン誘発関節炎モデルを用いる方法はP.Hansra,“Carrageenan−Induced Arthritis in the Rat”,Inflammation,24(2):141−155(2000)に記載されている。当業界で公知であり、公開されているザイモサン誘発炎症動物モデルも一般的に使用されている。推定単一薬物の抗炎症活性は、ラットにおけるカラゲナン誘発肢浮腫の抑制をC.A.Winterら,“Carrageenan−Induced Edema in Hind Paw of the Rats as an Assay for Anti−Inflammatory Drugs”,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,111:544−547(1962)に記載されている方法の改変を用いて測定することによっても評価され得る。このアッセイは、多くのNSAIDの抗炎症活性に関する一次インビボスクリーンとして使用されており、ヒトに対する効果が予測されると見なされている。試験される推定単一薬物の抗炎症活性は、ビヒクルを投与した対照群と比較した試験群の後肢重量の増加の抑制%として表示される。
推定単一薬物の効果を評価するために喘息の動物モデルも使用され得る。例えば、
Cohnら,J.Exp.Med.,186:1737−1747(1997)を参照されたい。
Cohnら,J.Exp.Med.,186:1737−1747(1997)を参照されたい。
推定単一薬物の効果を評価するために自己免疫疾患の動物モデルも使用され得る。1型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマトーデス及び糸球体腎炎のような自己免疫疾患の動物モデルも開発されている(Flandersら,Autoimmunity,29:235−246(1999);Kroghら,Biochimie,81:511−515(1999);Foster,Semin.Nephrol.,19:12−24(1999))。
また、インビボモデルも作成され得る。例えば、マウスに特定腫瘍モデルを投与することにより腫瘍モデルが作成され得る。例として、結腸癌モデルは次のように構築され得る。MCA26は、BALB/cマウスにおいて化学的に誘発させた結腸癌の腫瘍細胞系である(Corbettら,1975)。転移性結腸癌は、8〜10週齢の雌BALB/cマウス(Taconic)の肝の左葉に約7×104個のMCA26細胞を移植することにより誘発される。7日目に、5×5mm2のサイズの腫瘍を有するマウスが推定単一薬物の投与のために選択される。或いは、細胞を腹腔内または尾静脈を介して投与してもよい。
モデルを選択したら、特定キナーゼを可能性ある標的化して同定する。例えば、腫瘍モデルの場合、標的に対する適当なキナーゼは細胞周期コントロール、接着シグナル伝達または血管形成に関与することが公知のものであり得る。特定病的状態における役割が未知であるかまたは余り特徴づけられていないキナーゼも試験され得る。しかしながら、この場合、キナーゼ活性の阻害またはモジュレーションは適当な所望応答(例えば、増殖の低下)と相関していなければならない。
次いで、特定化合物(すなわち、推定単一薬物)を研究対象の病的状態に影響を及ぼす能力について調べる。試験しようとする単一薬物を被験動物に投与し、病的状態の生理学的応答を対照(通常、単一薬物に対する担体のみを投与した動物)と比較する。効果の基準は研究対象の病的状態に依存する。例えば、腫瘍モデルに関する典型的な効果基準は、明らかな体重減少の抑制、腫瘍サイズの拡大の減少または抑制、転移の抑制、組織片中の異常細胞数の減少等である。基準は主観的(例えば、外観または健康状態の見かけの改善)または客観的(対照群と実験群の差を通常統計的に求める)である。キナーゼ活性及び活性の変化は、血液または組織サンプルを一般的手段により採取し、キナーゼ活性を実施例4〜83に例示されているアッセイの1つ以上を用いて試験することにより調べることができる。
単一薬物は、上記したインビボアッセイにおいて2個以上のキナーゼに影響を与え、研究中の病的状態に対して少なくとも1つの有利な効果を有する薬物として同定される。
実施例4〜83:候補物の活性を測定するためのアッセイ:以下のアッセイを用いてキナーゼ活性を評価することができる。アッセイは実験条件においてキナーゼ阻害またはモジュレーション活性について試験しようとする化合物を添加することにより修飾する。これらのアッセイの例は排他的であるとは意味しない。各種キナーゼの活性は他の方法でも評価され得る。
JNK2アッセイ
20% DMSO/80% 希釈緩衝液中の試験化合物(10μl)に同一希釈緩衝液中50ngのHis6−JNK2(30μl)を添加する。前記希釈緩衝液は、水中20mM HEPES(pH7.6)、0.1mM EDTA、2.5mM 塩化マグネシウム、0.004% トリトンx100、2μg/ml ロイペプチン、20mM グリセロホスフェート、0.1mM 吉草酸ナトリウム及び2mM DTTから構成されている。混合物を室温で30分間プレインキュベートする。水中20mM HEPES(pH7.6)、50mM 塩化ナトリウム、0.1mM EDTA、24mM 塩化マグネシウム、1mM DTT、25mM PNPP、0.05% トリトンx100、11μM ATP及び0.5μCi γ−32P ATPからなるアッセイ緩衝液中10μgのGST−c−Jun(1−79)(60μl)を添加し、反応を室温で1時間進行させる。12.5% トリクロロ酢酸(150μl)を添加することによりc−Junリン酸化を停止する。30分後、沈殿をフィルタープレート上で収集し、シンチレーション流体(50μl)で希釈し、カウンターにより定量化する。IC50値は、c−Junリン酸化が対照値の50%に低下する試験化合物の濃度として算出する。本発明の好ましい化合物は本アッセイで0.01〜10μMのIC50値を有する。
20% DMSO/80% 希釈緩衝液中の試験化合物(10μl)に同一希釈緩衝液中50ngのHis6−JNK2(30μl)を添加する。前記希釈緩衝液は、水中20mM HEPES(pH7.6)、0.1mM EDTA、2.5mM 塩化マグネシウム、0.004% トリトンx100、2μg/ml ロイペプチン、20mM グリセロホスフェート、0.1mM 吉草酸ナトリウム及び2mM DTTから構成されている。混合物を室温で30分間プレインキュベートする。水中20mM HEPES(pH7.6)、50mM 塩化ナトリウム、0.1mM EDTA、24mM 塩化マグネシウム、1mM DTT、25mM PNPP、0.05% トリトンx100、11μM ATP及び0.5μCi γ−32P ATPからなるアッセイ緩衝液中10μgのGST−c−Jun(1−79)(60μl)を添加し、反応を室温で1時間進行させる。12.5% トリクロロ酢酸(150μl)を添加することによりc−Junリン酸化を停止する。30分後、沈殿をフィルタープレート上で収集し、シンチレーション流体(50μl)で希釈し、カウンターにより定量化する。IC50値は、c−Junリン酸化が対照値の50%に低下する試験化合物の濃度として算出する。本発明の好ましい化合物は本アッセイで0.01〜10μMのIC50値を有する。
JNK3アッセイ
20% DMSO/80% 希釈緩衝液中の試験化合物(10μl)に同一希釈緩衝液中50ngのHis6−JNK3(30μl)を添加する。前記希釈緩衝液は、水中20mM HEPES(pH7.6)、0.1mM EDTA、2.5mM 塩化マグネシウム、0.004% トリトンx100、2μg/ml ロイペプチン、20mM グリセロホスフェート、0.1mM 吉草酸ナトリウム及び2mM DTTから構成されている。混合物を室温で30分間プレインキュベートする。水中20mM HEPES(pH7.6)、50mM 塩化ナトリウム、0.1mM EDTA、24mM 塩化マグネシウム、1mM DTT、25mM PNPP、0.05% トリトンx100、11μM ATP及び0.5μCi γ−32P ATPからなるアッセイ緩衝液中10μgのGST−c−Jun(1−79)(60μl)を添加し、反応を室温で1時間進行させる。12.5% トリクロロ酢酸(150μl)を添加することによりc−Junリン酸化を停止する。30分後、沈殿をフィルタープレート上で収集し、シンチレーション流体(50μl)で希釈し、カウンターにより定量化する。IC50値は、c−Junリン酸化が対照値の50%に低下する試験化合物の濃度として算出する。本発明の好ましい化合物は本アッセイで0.01〜10μMのIC50値を有する。
20% DMSO/80% 希釈緩衝液中の試験化合物(10μl)に同一希釈緩衝液中50ngのHis6−JNK3(30μl)を添加する。前記希釈緩衝液は、水中20mM HEPES(pH7.6)、0.1mM EDTA、2.5mM 塩化マグネシウム、0.004% トリトンx100、2μg/ml ロイペプチン、20mM グリセロホスフェート、0.1mM 吉草酸ナトリウム及び2mM DTTから構成されている。混合物を室温で30分間プレインキュベートする。水中20mM HEPES(pH7.6)、50mM 塩化ナトリウム、0.1mM EDTA、24mM 塩化マグネシウム、1mM DTT、25mM PNPP、0.05% トリトンx100、11μM ATP及び0.5μCi γ−32P ATPからなるアッセイ緩衝液中10μgのGST−c−Jun(1−79)(60μl)を添加し、反応を室温で1時間進行させる。12.5% トリクロロ酢酸(150μl)を添加することによりc−Junリン酸化を停止する。30分後、沈殿をフィルタープレート上で収集し、シンチレーション流体(50μl)で希釈し、カウンターにより定量化する。IC50値は、c−Junリン酸化が対照値の50%に低下する試験化合物の濃度として算出する。本発明の好ましい化合物は本アッセイで0.01〜10μMのIC50値を有する。
Junkat T細胞IL−2産生アッセイ
Junkat T細胞(クローンE6−1)はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入し、2mM L−グルタミン(Mediatech)、10% ウシ胎児血清(Hyclone)及びペニシリン/ストレプトマイシンを含有するRPMI 1640からなる増殖培地において維持する。全ての細胞を95% 空気と5% CO2中37℃で培養する。細胞を培地200μlを用いて0.2×106細胞/ウェルの密度で平板培養する。化合物ストック(20mM)を増殖培地で希釈し、各ウェルに容量25μlで10×濃縮溶液として添加し、混合し、細胞と30分間プレインキュベートする。すべてのサンプルにおいて化合物ビヒクル(ジメチルスルホキシド)を0.5%の最終濃度で維持する。30分後、細胞をPHA(ホルボールミリステートアセテート;最終濃度50μg/ml)及びPHA(フィトヘマグルチニン;最終濃度2μg/ml)で活性化する。PMA及びPHAを増殖培地で10×濃縮溶液として添加し、25μl/ウェルの容量で添加する。細胞プレートを10時間培養する。遠心して細胞をペレット化し、培地を除き、−20℃で保存する。培地アリコートをIL−2の存在について製造業者(Endogen)の指示に従ってサンドイッチELSAにより分析する。IC50値は、IL−2産生が対照値の50%に低下する試験化合物の濃度として算出する。本発明の好ましい化合物は本アッセイで0.01〜10μMのIC50値を有する。
Junkat T細胞(クローンE6−1)はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入し、2mM L−グルタミン(Mediatech)、10% ウシ胎児血清(Hyclone)及びペニシリン/ストレプトマイシンを含有するRPMI 1640からなる増殖培地において維持する。全ての細胞を95% 空気と5% CO2中37℃で培養する。細胞を培地200μlを用いて0.2×106細胞/ウェルの密度で平板培養する。化合物ストック(20mM)を増殖培地で希釈し、各ウェルに容量25μlで10×濃縮溶液として添加し、混合し、細胞と30分間プレインキュベートする。すべてのサンプルにおいて化合物ビヒクル(ジメチルスルホキシド)を0.5%の最終濃度で維持する。30分後、細胞をPHA(ホルボールミリステートアセテート;最終濃度50μg/ml)及びPHA(フィトヘマグルチニン;最終濃度2μg/ml)で活性化する。PMA及びPHAを増殖培地で10×濃縮溶液として添加し、25μl/ウェルの容量で添加する。細胞プレートを10時間培養する。遠心して細胞をペレット化し、培地を除き、−20℃で保存する。培地アリコートをIL−2の存在について製造業者(Endogen)の指示に従ってサンドイッチELSAにより分析する。IC50値は、IL−2産生が対照値の50%に低下する試験化合物の濃度として算出する。本発明の好ましい化合物は本アッセイで0.01〜10μMのIC50値を有する。
ラットのインビボLPS誘導TNF−α産生アッセイ
Charles River Laboratoriesから購入した7週齢の雄CDラットを使用前1週間順化させる。外側尾静脈に軽くイソフルラン麻酔しながら22ゲージ以上のカテーテルを用いて経皮的にカニューレを挿入する。0.05mg/kgのLPS(大腸菌0.55:BS)の注射15〜180分前に、ラットに試験化合物を尾静脈カテーテルを介する静脈内注入または経口灌注により投与する。カテーテルを2.5ml/kgの注射用生理食塩液で洗浄する。LPS攻撃してから90分後に血液を心穿刺により採取する。血漿をリチウムヘパリン分離管を用いて作成し、分析するまで−80℃で冷凍する。TNF−αレベルをラット特異的TNF−α ELISAキット(Biosource)を用いて測定する。ED50値は、TNF−α産生が対照値の50%に低下する試験化合物の用量として算出する。本発明の好ましい化合物は本アッセイで1〜30mg/kgのEC50値を有する。
Charles River Laboratoriesから購入した7週齢の雄CDラットを使用前1週間順化させる。外側尾静脈に軽くイソフルラン麻酔しながら22ゲージ以上のカテーテルを用いて経皮的にカニューレを挿入する。0.05mg/kgのLPS(大腸菌0.55:BS)の注射15〜180分前に、ラットに試験化合物を尾静脈カテーテルを介する静脈内注入または経口灌注により投与する。カテーテルを2.5ml/kgの注射用生理食塩液で洗浄する。LPS攻撃してから90分後に血液を心穿刺により採取する。血漿をリチウムヘパリン分離管を用いて作成し、分析するまで−80℃で冷凍する。TNF−αレベルをラット特異的TNF−α ELISAキット(Biosource)を用いて測定する。ED50値は、TNF−α産生が対照値の50%に低下する試験化合物の用量として算出する。本発明の好ましい化合物は本アッセイで1〜30mg/kgのEC50値を有する。
CDCキナーゼ活性アッセイ
サイクリン依存性キナーゼ活性は、[32P]ATPまたは[33P]ATPからの放射性ホスフェートのタンパク質基質への酵素触媒の時間依存的取り込みを定量することにより調べることができる。別段の記載がない限り、アッセイは96ウェルプレートにおいて50μlの総容量で、1回の反応あたり10mM HERPES(N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N’−[2−エタンスルホン酸])(pH7.4)、10mM MgCl2、25μM アデノシントリホスフェート(ATP)、1mg/ml 卵アルブミン、5μg/ml ロイペプチン、1mM ジチオトレイトール、10mM β−グリセロホスフェート、0.1mM 吉草酸ナトリウム、1mM フッ化ナトリウム、2.5mM エチレングリコールビス(β−アミノエチルエーテル)−N,N,N’,N’−テトラ酢酸(EGTA)、2%(v/v)ジメチルスルホキシド及び0.03−0.4μCi [32/33P]ATP(EDTA)の存在下で実施する。適当な酵素を用いて反応を開始し、30℃でインキュベートし、20分後250mMまでエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を添加することにより反応を停止する。次いで、リン酸化基質を96ウェル濾過マニフォールドを用いてニトロセルロースまたはホスホセルロース膜上で捕捉し、取り込まれなかった放射能を0.85% リン酸で繰り返し洗浄することにより除去する。乾燥させた膜をホスホロイメージャーに曝すことにより放射能を定量する。
サイクリン依存性キナーゼ活性は、[32P]ATPまたは[33P]ATPからの放射性ホスフェートのタンパク質基質への酵素触媒の時間依存的取り込みを定量することにより調べることができる。別段の記載がない限り、アッセイは96ウェルプレートにおいて50μlの総容量で、1回の反応あたり10mM HERPES(N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N’−[2−エタンスルホン酸])(pH7.4)、10mM MgCl2、25μM アデノシントリホスフェート(ATP)、1mg/ml 卵アルブミン、5μg/ml ロイペプチン、1mM ジチオトレイトール、10mM β−グリセロホスフェート、0.1mM 吉草酸ナトリウム、1mM フッ化ナトリウム、2.5mM エチレングリコールビス(β−アミノエチルエーテル)−N,N,N’,N’−テトラ酢酸(EGTA)、2%(v/v)ジメチルスルホキシド及び0.03−0.4μCi [32/33P]ATP(EDTA)の存在下で実施する。適当な酵素を用いて反応を開始し、30℃でインキュベートし、20分後250mMまでエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を添加することにより反応を停止する。次いで、リン酸化基質を96ウェル濾過マニフォールドを用いてニトロセルロースまたはホスホセルロース膜上で捕捉し、取り込まれなかった放射能を0.85% リン酸で繰り返し洗浄することにより除去する。乾燥させた膜をホスホロイメージャーに曝すことにより放射能を定量する。
見かけKi値は、濃度の異なる阻害剤化合物の存在下で酵素活性をアッセイし、酵素の非存在下で測定したバックグラウンド放射能を差し引くことにより求めた。阻害データをKaleidagraph(Synergy Software)を用いて競合阻害に関する式に当てはめるかまたはソフトウェアKineTic(BioKin,Ltd)を用いて競合密着結合阻害に関する式に当てはめる。
CDK4/サイクリンD網膜芽細胞腫キナーゼ活性の阻害
ヒトCDK4とサイクリンD3の複合体またはヒトCDK4と遺伝的に短小化した(1−264)サイクリンD3の複合体を、対応のバキュロウイルス発現ベクター(Meijer及びKim,“Chemical Inhibitors of Cyclin−Dependent Kinases”,Methods in Enzymol.,283:113−128(1997)参照)を共感染させた昆虫細胞から一般的な生化学クロマトグラフィー技術を用いて精製する。酵素複合体(5または50nM)を、基質として0.3〜0.5μgの精製組換え網膜芽細胞腫タンパク質断片(Rb)を用いてアッセイする。工学操作したRb断片(天然網膜芽細胞腫タンパク質の残基386〜928;62.3kDa)は天然106kDaタンパク質中に存在しているリン酸化部位の大部分及び精製を容易とするために6個のヒスチジン残基のタグを含んでいる。リン酸化Rb基質をニトロセルロース膜上で微量濾過により捕捉し、上記したようにホスホロイメージャーを用いて定量する。密着結合結合剤の測定のために、酵素複合体の濃度を5nMに低下させ、アッセイ期間を産物形成の時間依存性が直線的である60分まで延ばす。
ヒトCDK4とサイクリンD3の複合体またはヒトCDK4と遺伝的に短小化した(1−264)サイクリンD3の複合体を、対応のバキュロウイルス発現ベクター(Meijer及びKim,“Chemical Inhibitors of Cyclin−Dependent Kinases”,Methods in Enzymol.,283:113−128(1997)参照)を共感染させた昆虫細胞から一般的な生化学クロマトグラフィー技術を用いて精製する。酵素複合体(5または50nM)を、基質として0.3〜0.5μgの精製組換え網膜芽細胞腫タンパク質断片(Rb)を用いてアッセイする。工学操作したRb断片(天然網膜芽細胞腫タンパク質の残基386〜928;62.3kDa)は天然106kDaタンパク質中に存在しているリン酸化部位の大部分及び精製を容易とするために6個のヒスチジン残基のタグを含んでいる。リン酸化Rb基質をニトロセルロース膜上で微量濾過により捕捉し、上記したようにホスホロイメージャーを用いて定量する。密着結合結合剤の測定のために、酵素複合体の濃度を5nMに低下させ、アッセイ期間を産物形成の時間依存性が直線的である60分まで延ばす。
CDK2/サイクリンA網膜芽細胞腫キナーゼ活性の阻害
CDK2を、Rosenblattら,“Purification and Crystallization of Human Cyclin−dependent Kinase 2”,J.Mol.Biol.,230:1317−1319(1993)に記載されている方法を用いて精製する。サイクリンAは、完全長組換えサイクリンAを発現する大腸菌細胞から精製し、短小化サイクリンA構築物は限定タンパク質分解により作成し、Jeffreyら,“Mechanism of CDK activation revealted by the structure of a cyclin A−CDK2 complex”,Nature,376:313−320(1995年7月27日)に記載されているように精製する。CDK2とタンパク質分解サイクリンAの複合体を作成し、ゲル濾過により精製する。本アッセイの基質はCDK4アッセイで用いた同一のRb基質断片であり、CDK2/サイクリンA及びCDK4/サイクリンD3アッセイの方法は、CDK2を150nMまたは5nMで存在させる以外は本質的に同一である。Ki値は上記したように測定する。
CDK2を、Rosenblattら,“Purification and Crystallization of Human Cyclin−dependent Kinase 2”,J.Mol.Biol.,230:1317−1319(1993)に記載されている方法を用いて精製する。サイクリンAは、完全長組換えサイクリンAを発現する大腸菌細胞から精製し、短小化サイクリンA構築物は限定タンパク質分解により作成し、Jeffreyら,“Mechanism of CDK activation revealted by the structure of a cyclin A−CDK2 complex”,Nature,376:313−320(1995年7月27日)に記載されているように精製する。CDK2とタンパク質分解サイクリンAの複合体を作成し、ゲル濾過により精製する。本アッセイの基質はCDK4アッセイで用いた同一のRb基質断片であり、CDK2/サイクリンA及びCDK4/サイクリンD3アッセイの方法は、CDK2を150nMまたは5nMで存在させる以外は本質的に同一である。Ki値は上記したように測定する。
VEGF活性アッセイ
細胞増殖のVEGF等の成長因子による刺激は各受容体のチロシンキナーゼの自己リン酸化の誘導に依存している。従って、これらの成長因子により誘導される細胞増殖を阻止するタンパク質キナーゼ阻害剤の能力は受容体自己リン酸化を阻止する能力に直接相関している。化合物のタンパク質キナーゼ阻害活性を調べるために以下の構築物を使用する。
細胞増殖のVEGF等の成長因子による刺激は各受容体のチロシンキナーゼの自己リン酸化の誘導に依存している。従って、これらの成長因子により誘導される細胞増殖を阻止するタンパク質キナーゼ阻害剤の能力は受容体自己リン酸化を阻止する能力に直接相関している。化合物のタンパク質キナーゼ阻害活性を調べるために以下の構築物を使用する。
アッセイのためのVEGF−R2構築物:この構築物はチロシンキナーゼ活性を阻害する試験化合物の能力を調べる。キナーゼインサートドメインの68残基の50中心残基を欠いているヒト血管内皮成長因子受容体2(VEGF−R2)の細胞質ゾルドメインの構築物(VEGF−R2Δ50)をバキュロウイルス/昆虫細胞系において発現させる。完全長VEGF−R2の1356残基のうち、VEGF−R2Δ50構築物は残基806〜939及び990〜1171を含み、野生型VEGF−R2に比してキナーゼインサートドメイン内に1つの点突然変異(E990V)をも含む。精製構築物の自己リン酸化は、酵素を4μM濃度で5% グリセロール及び5mM DTTを含有する100mM Hepes(pH7.5)中で3mM ATP及び50mM MgCl2の存在下で4℃で2時間インキュベートすることにより実施する。自己リン酸化後、この構築物は野生型の自己リン酸化キナーゼドメイン構築物と本質的に同等の触媒活性を有することが判明した。Parastら,Biochemistry,37:16788−16801(1998)を参照されたい。
アッセイのためのCHK1構築物:C末端にHisタグを有する完全長ヒトCHK1(FL−CHK1)をバキュロウイルス/昆虫細胞系を用いて発現させる。476アミノ酸ヒトCHK1のC末端に6個のヒスチジン残基(6×His−タグ)を含んでいる。タンパク質を慣用されているクロマトグラフィー技術により精製する。
VEGF−R2アッセイ−結合分光光度(FLVK−P)アッセイ:リン酸転移を伴うATPからのADP産生を、ホスホエノールピルベート(PEP)を用いるNADHの酸化及びピルベートキナーゼ(PK)及び乳酸デヒドロキナーゼ(LDH)を有する系に結合させる。NADHの酸化は、Beckman DU 650分光光度計を用いて340nmでの吸光度(ε340=6.22cm−1mM−1)の低下を調べることによりモニターすることができる。リン酸化VEGF−R2Δ50(下表にはFLVK−Pとして示す)に関するアッセイ条件は、200mM Hepes(pH7.5)中1mM PEP、250μM NADH、50単位/ml LDH、20単位/ml PK、5mM DTT、5.1mM ポリ(E4Y1)、1mM ATP及び25mM MgCl2である。非リン酸化VEGF−R2Δ50(下表にはFLVKとして示す)に関するアッセイ条件は、200mM Hepes(pH7.5)中1mM PEP、250μM NADH、50単位/ml LDH、20単位/ml PK、5mM DTT、20mM ポリ(E4Y1)、3mM ATP、60mM MgCl2及び2m MnCl2である。アッセイを5〜40nMの酵素で開始する。Ki値は、異なる濃度の試験化合物の存在下で酵素活性を測定することにより求める。データを酵素カイネティック及びKaleidagraphソフトウェァを用いて分析する。
CHK1アッセイ
合成基質ペプチドSyntide2(PLARTLSVAGLPGKK;配列番号1)へのリン酸転移を伴うATPからのADPの産生を、ピルビン酸キナーゼ(PK)及び乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の作用を介するホスホエノールピルベート(PEP)を用いるNADHの酸化と結合させる。NADHの酸化は、HP8452分光光度計を用いて340nmでの吸光度(ε340=6.22cm−1mM−1)の低下を調べることによりモニターすることができる。典型的な反応溶液は、50mM トリス(pH7.5)及び400mMのNaCl中に4mM PEP、0.15mM NADH、28単位/ml LDH、16単位/ml PK、3mM DTT、0.125mM Syntide−2、0.15mM ATP、25mM MgCl2を含む。アッセイを10nMのFL−CHK1で開始する。Ki値は、異なる濃度の試験化合物の存在下で最初の酵素活性を測定することにより求める。データを酵素カイネティック及びKaleidagraphソフトウェァを用いて分析する。
合成基質ペプチドSyntide2(PLARTLSVAGLPGKK;配列番号1)へのリン酸転移を伴うATPからのADPの産生を、ピルビン酸キナーゼ(PK)及び乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の作用を介するホスホエノールピルベート(PEP)を用いるNADHの酸化と結合させる。NADHの酸化は、HP8452分光光度計を用いて340nmでの吸光度(ε340=6.22cm−1mM−1)の低下を調べることによりモニターすることができる。典型的な反応溶液は、50mM トリス(pH7.5)及び400mMのNaCl中に4mM PEP、0.15mM NADH、28単位/ml LDH、16単位/ml PK、3mM DTT、0.125mM Syntide−2、0.15mM ATP、25mM MgCl2を含む。アッセイを10nMのFL−CHK1で開始する。Ki値は、異なる濃度の試験化合物の存在下で最初の酵素活性を測定することにより求める。データを酵素カイネティック及びKaleidagraphソフトウェァを用いて分析する。
リン酸化FGF受容体及びLCKチロシンキナーゼ活性の阻害
3個のアミノ酸置換(L457V、C488A及びC84S)を含むFGFR1チロシンキナーゼの細胞質ゾルドメイン(アミノ酸456〜766)のクローニング、発現及び精製は、M.Mohammadi,J.Schlessinger及びS.R.Hubbard,Cell,86:577−587(1996)に記載されているように実施され得る。このドメインは、バキュロウイルスベクターを用いてSf9昆虫細胞において発現させ、タンパク質は慣用の技術を用いて精製する。LCKチロシンキナーゼは、アミノ酸223からアミノ酸509のタンパク質の末端までのN末端欠失として昆虫細胞において発現させる。タンパク質のN末端は2つのアミノ酸置換P223M及びc224Dも有していた。キナーゼは慣用のクロマトグラフィー法を用いて精製する。
3個のアミノ酸置換(L457V、C488A及びC84S)を含むFGFR1チロシンキナーゼの細胞質ゾルドメイン(アミノ酸456〜766)のクローニング、発現及び精製は、M.Mohammadi,J.Schlessinger及びS.R.Hubbard,Cell,86:577−587(1996)に記載されているように実施され得る。このドメインは、バキュロウイルスベクターを用いてSf9昆虫細胞において発現させ、タンパク質は慣用の技術を用いて精製する。LCKチロシンキナーゼは、アミノ酸223からアミノ酸509のタンパク質の末端までのN末端欠失として昆虫細胞において発現させる。タンパク質のN末端は2つのアミノ酸置換P223M及びc224Dも有していた。キナーゼは慣用のクロマトグラフィー法を用いて精製する。
チロシンキナーゼ活性は、リン酸化ポリ(Glu,Tyr;4:1)基質及びADPの産生をピルベートを形成し、ATPを再生成させるホスホエノールピルベートからADPへのホスフェートのピルベートキナーゼ触媒転移に結合させる結合連続分光光度アッセイを用いて測定することができる。ピルベート産生は、ラクテートを形成し、同時にNADHをNAD+に変換させるピルベートの乳酸デヒドロゲナーゼ触媒還元に結合させる。NADHのロスは、340nmで吸光度を測定することによりモニターする(例えば、Technikova−Dobrovaら,“Spectrophotometric determination of functional characteristics of protein kinases with coupled enzymatic assay”,FEBS Letters,292:69−72(1991)参照)。酵素活性は、200mM HEPES(pH7.5)、2mM ホスホエノールピルベート、0.3mM NADH、20mM MgCl2、100μM ATP、5mM DTT、P−FCFまたはP−LCKアッセイの場合5.1または25mM ポリ(Glu,Tyr)4:1、及び15単位/mlずつのピルベートキナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼの存在下で測定する。リン酸化FGF受容体キナーゼは100nMの濃度で存在させ、リン酸化LCKキナーゼは50nMの濃度で存在させる。アッセイは37℃で初期速度条件下で実施し、速度は酵素の非存在下で測定したバックグランウンド速度に対して補正する。阻害%は、2%(v/v)DMSOの存在下でアッセイした対照酵素に対して算出する。
一般的なキナーゼ阻害アッセイ
キナーゼ毎に適当なペプチド基質へのリン酸への転移を調べることにより各種キナーゼの阻害をモニターした。
キナーゼ毎に適当なペプチド基質へのリン酸への転移を調べることにより各種キナーゼの阻害をモニターした。
Jnk1、Jnk2、Jnk3、IKK1、IKK2EE、p38α、p38β、MKK3、MKK4、MKK4、MKK6、MKK7、cdk2/E、cdk2/A、PKCα、ERK及びPKAについての活性は、放射線標識したホスフェートのATP(γSSP)からタンパク質基質への転移及び産物のトリクロロ酢酸を用いる沈降によりモニターした。ATPは当該キナーゼに関するKmの3倍であった。Akt1、Akt2及びSGKについての活性は、放射線標識したホスフェートのATPから特異的基質ペプチドへの転移及びP81充填濾紙上へのペプチドの捕捉によりモニターした。ATPは当該キナーゼに関するKmであった。IRTK、Abl及びSRCの活性は、ホスフェートのATPからビオチニル化ペプチド基質への転移及びLANCE技術(Perkin Elmer)を用いるリン酸化ペプチドの検出によりモニターした。ATPは当該キナーゼに関するKmの3倍であった。
2個以上の異なるキナーゼを標的化する薬物は本明細書中に記載されている本発明の方法において有用である。前記化合物は同定され得、特定キナーゼに対するその効果は以下の実施例4〜83に簡単に記載されているアッセイを用いて同定され得る。これらのキナーゼの各々は、Daviesら,Biochem.J.,351:96−105(2000)に記載されているように実施した。別段の記載がない限り、アッセイはすべて10μMのATPで実施した。
キナーゼ希釈
キナーゼはすべてアッセイに添加する前に10×作業濃度に予め希釈する。各キナーゼの希釈緩衝液の組成を以下に詳記する。
キナーゼはすべてアッセイに添加する前に10×作業濃度に予め希釈する。各キナーゼの希釈緩衝液の組成を以下に詳記する。
基質
ヒストンH1及びAFT2を除く全ての基質を脱イオン水中の作業ストックに溶解し、希釈する。ヒストンH1は、アッセイに添加する前に20mM MOPS(pH7.4)中10×作業ストックに希釈する。AFT2は通常50mM トリス(pH7.5)、150mM NaCl、0.1mM EGTA、0.03% Brij−35、50% グリセル、1mM ベンズアミジン、0.2mM PMSF及び0.1% β−メルカプトエタノール中20×作業ストックで保存する。
ヒストンH1及びAFT2を除く全ての基質を脱イオン水中の作業ストックに溶解し、希釈する。ヒストンH1は、アッセイに添加する前に20mM MOPS(pH7.4)中10×作業ストックに希釈する。AFT2は通常50mM トリス(pH7.5)、150mM NaCl、0.1mM EGTA、0.03% Brij−35、50% グリセル、1mM ベンズアミジン、0.2mM PMSF及び0.1% β−メルカプトエタノール中20×作業ストックで保存する。
SGk(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、SGK(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(配列番号2)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、SGK(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(配列番号2)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
GSK3β(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、GSK3β(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、20μM YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(p)EDEEE(ホスホGS2ペプチド;配列番号3)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、50mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、GSK3β(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、20μM YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(p)EDEEE(ホスホGS2ペプチド;配列番号3)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、50mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
AMPK(r)アッセイ
25μlの最終反応容量で、AMPK(r)(5〜10mU)を50mM Hepes(pH7.4)、1mM DTT、0.02% Brij−35、200μM AMP、200μM AMARAASAAALARRR(配列番号4)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、AMPK(r)(5〜10mU)を50mM Hepes(pH7.4)、1mM DTT、0.02% Brij−35、200μM AMP、200μM AMARAASAAALARRR(配列番号4)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CHK1(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CHK1(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、200μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR(配列番号5)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CHK1(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、200μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR(配列番号5)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CHK2(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CHK2(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.6)、0.15M NaCl、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.1% トリトンX−100、165μM RRRDDDSDDDD(配列番号6)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CHK2(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.6)、0.15M NaCl、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.1% トリトンX−100、165μM RRRDDDSDDDD(配列番号6)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Lck(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Lck(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(Cdc2ペプチド;配列番号7)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Lck(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(Cdc2ペプチド;配列番号7)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CDK2/サイクリンA(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CDK2/サイクリンA(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンHCl、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CDK2/サイクリンA(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンHCl、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
MAPK2(m)アッセイ
25μlの最終反応容量で、MAPK2(m)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、MAPK2(m)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
SAPK2a(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、SAPK2a(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、SAPK2a(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
SAPK2b(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、SAPK2b(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、SAPK2b(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
SAPK3(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、SAPK3(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、SAPK3(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
SAPK4(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、SAPK4(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、SAPK4(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
MSK1(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、MSK1(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(配列番号2)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、MSK1(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(配列番号2)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PKBα(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PKBα(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(配列番号2)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PKBα(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(配列番号2)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
ROCK−II(r)アッセイ
25μlの最終反応容量で、ROCK−II(r)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、30μM KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK(配列番号8)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、ROCK−II(r)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、30μM KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK(配列番号8)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
P70S6K(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、P70S6K(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、100μM KKRNRTLTV(配列番号9)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、P70S6K(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、100μM KKRNRTLTV(配列番号9)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PKA(b)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PKA(b)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM LRRASLG(ケムプチド;配列番号10)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、5分間に50mM リン酸で3回洗浄し、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PKA(b)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM LRRASLG(ケムプチド;配列番号10)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、5分間に50mM リン酸で3回洗浄し、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
MAPKAP−K2(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、MAPKAP−K2(h)(5〜10mU)を50mM β−グリセロリン酸Na(pH7.5)、0.1mM EGTA、30μM KKLNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、MAPKAP−K2(h)(5〜10mU)を50mM β−グリセロリン酸Na(pH7.5)、0.1mM EGTA、30μM KKLNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
JNK1α1(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、JNK1α1(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、3μM ATF2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、JNK1α1(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、3μM ATF2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
JNK2α2(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、JNK2α2(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、3μM ATF2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、JNK2α2(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、3μM ATF2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
JNK3(r)アッセイ
25μlの最終反応容量で、JNK3(r)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、250μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、JNK3(r)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、250μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PRAK(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PRAK(h)(5〜10mU)を50mM β−グリセロリン酸Na(pH7.5)、0.1mM EGTA、30μM KKLRRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、50mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PRAK(h)(5〜10mU)を50mM β−グリセロリン酸Na(pH7.5)、0.1mM EGTA、30μM KKLRRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、50mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CHK2(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CHK2(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、200μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR(配列番号5)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CHK2(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、200μM KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR(配列番号5)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
MAPK1(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、MAPK1(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、200μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、MAPK1(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、200μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
c−RAF(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、c−RAF(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.66mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、c−RAF(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.66mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CDK1/サイクリンB(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CDK1/サイクリンB(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CDK1/サイクリンB(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
cSRC(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、cSRC(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(Cdc2ペプチド;配列番号7)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、cSRC(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、250μM KVEKIGEGTYGVVYK(Cdc2ペプチド;配列番号7)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CaMKII(r)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CaMKII(r)(5〜10mU)を40mM Hepes(pH7.4)、5mM CaCl2、30μg/ml カルモジュリン、30μM KKLNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CaMKII(r)(5〜10mU)を40mM Hepes(pH7.4)、5mM CaCl2、30μg/ml カルモジュリン、30μM KKLNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PRK2(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PRK2(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、30μM AKRRRLSSLRA(配列番号12)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PRK2(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、30μM AKRRRLSSLRA(配列番号12)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PDK1(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PDK1(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、100μM KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC(配列番号13)(PDKtide)、0.1% β−メルカプトエタノール、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PDK1(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、100μM KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC(配列番号13)(PDKtide)、0.1% β−メルカプトエタノール、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Fyn(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Fyn(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、250μM KVEKIGEGTYCVVVK(Cdc2ペプチド;配列番号7)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Fyn(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、250μM KVEKIGEGTYCVVVK(Cdc2ペプチド;配列番号7)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PKCα(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PKCα(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.4)、0.03% トリトンX−100、0.1mM CaCl2、0.1mg/ml ホスファチジルセリン、10μg/ml ジアシルグリセロール、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PKCα(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.4)、0.03% トリトンX−100、0.1mM CaCl2、0.1mg/ml ホスファチジルセリン、10μg/ml ジアシルグリセロール、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PKCβII(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PKCβII(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.4)、0.03% トリトンX−100、0.1mM CaCl2、0.1mg/ml ホスファチジルセリン、10μg/ml ジアシルグリセロール、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PKCβII(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.4)、0.03% トリトンX−100、0.1mM CaCl2、0.1mg/ml ホスファチジルセリン、10μg/ml ジアシルグリセロール、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PKCγ(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PKCγ(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.4)、0.03% トリトンX−100、0.1mM CaCl2、0.1mg/ml ホスファチジルセリン、10μg/ml ジアシルグリセロール、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PKCγ(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.4)、0.03% トリトンX−100、0.1mM CaCl2、0.1mg/ml ホスファチジルセリン、10μg/ml ジアシルグリセロール、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CK1(y)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CK1(y)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、250μM KRRRALS(p)VASLPGL(配列番号14)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CK1(y)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、250μM KRRRALS(p)VASLPGL(配列番号14)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
ZAP−70(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、ZAP−70(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、ZAP−70(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
MEK1(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、MEK1(h)(1〜5mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.2mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、0.01% Brij−35、1μM 不活性MAPK2(m)、10mM 酢酸Mg及び冷ATP(比必要とされる濃度)とインキュベートする。MgATPを添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物(5μl)を用いて、この本のp.7に記載されているMAPK2(m)アッセイを開始させる。
25μlの最終反応容量で、MEK1(h)(1〜5mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.2mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、0.01% Brij−35、1μM 不活性MAPK2(m)、10mM 酢酸Mg及び冷ATP(比必要とされる濃度)とインキュベートする。MgATPを添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物(5μl)を用いて、この本のp.7に記載されているMAPK2(m)アッセイを開始させる。
MKK4(m)アッセイ
25μlの最終反応容量で、MKK4(m)(1〜5mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mM 吉草酸Na、2μM 不活性JNK1α1(h)、10mM 酢酸Mg及び冷ATP(必要とされる濃度)とインキュベートする。MgATPを添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物(5μl)を用いて、AFT2を250μM ペプチドで交換した以外はこの本のp.10に正確に記載されているJNK1α1(h)アッセイを開始させる。
25μlの最終反応容量で、MKK4(m)(1〜5mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mM 吉草酸Na、2μM 不活性JNK1α1(h)、10mM 酢酸Mg及び冷ATP(必要とされる濃度)とインキュベートする。MgATPを添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物(5μl)を用いて、AFT2を250μM ペプチドで交換した以外はこの本のp.10に正確に記載されているJNK1α1(h)アッセイを開始させる。
MKK7β(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、MKK7β(h)(1〜5mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mM 吉草酸Na、2μM 不活性JNK1α1(h)、10mM 酢酸Mg及び冷ATP(必要とされる濃度)とインキュベートする。MgATPを添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物(5μl)を用いて、AFT2を250μM ペプチドで交換した以外はこの本のp.10に正確に記載されているJNK1α1(h)アッセイを開始させる。
25μlの最終反応容量で、MKK7β(h)(1〜5mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mM 吉草酸Na、2μM 不活性JNK1α1(h)、10mM 酢酸Mg及び冷ATP(必要とされる濃度)とインキュベートする。MgATPを添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物(5μl)を用いて、AFT2を250μM ペプチドで交換した以外はこの本のp.10に正確に記載されているJNK1α1(h)アッセイを開始させる。
MKK6(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、MKK6(h)(1〜5mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mM 吉草酸Na、1mg/ml BSA、1μM 不活性SAPK2a(h)、10mM 酢酸Mg及び冷ATP(必要とされる濃度)とインキュベートする。MgATPを添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物(5μl)を用いて、この本のp.8に記載されているSAPK2a(h)アッセイを開始させる。
25μlの最終反応容量で、MKK6(h)(1〜5mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mM 吉草酸Na、1mg/ml BSA、1μM 不活性SAPK2a(h)、10mM 酢酸Mg及び冷ATP(必要とされる濃度)とインキュベートする。MgATPを添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、このインキュベーション混合物(5μl)を用いて、この本のp.8に記載されているSAPK2a(h)アッセイを開始させる。
IKKα(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、IKKα(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、200μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、IKKα(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、200μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
IKKβ(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、IKKβ(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、100μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、IKKβ(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、100μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PKCθ(h)アッセイ
5μlの最終反応容量で、PKCθ(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
5μlの最終反応容量で、PKCθ(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CaMKIV(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CaMKIV(h)(5〜10mU)を40mM Hepes(pH7.4)、5mM CaCl2、30μg/ml カルモジュリン、30μM KKLNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CaMKIV(h)(5〜10mU)を40mM Hepes(pH7.4)、5mM CaCl2、30μg/ml カルモジュリン、30μM KKLNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Blk(m)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Blk(m)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Blk(m)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Syk(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Syk(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Syk(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CSK(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CSK(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CSK(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Lyn(m)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Lyn(m)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Lyn(m)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CDK3/サイクリンE(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CDK3/サイクリンE(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CDK3/サイクリンE(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CDK5/p35(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CDK5/p35(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CDK5/p35(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CDK2/サイクリンE(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CDK2/サイクリンE(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CDK2/サイクリンE(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CDK6/サイクリンD3(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CDK6/サイクリンD3(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CDK6/サイクリンD3(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ヒストンH1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
CDK7/サイクリンH/MAT1(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、CDK7/サイクリンH/MAT1(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、500μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、CDK7/サイクリンH/MAT1(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、500μM ペプチド、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Rsk3(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Rsk3(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Rsk3(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
IR(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、IR(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、250μM KKSRGDYMTMQIG(配列番号15)、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、IR(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、250μM KKSRGDYMTMQIG(配列番号15)、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
IGF−1R(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、IGF−1R(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、250μM KKKSPGEYVNIEFG(配列番号16)、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、IGF−1R(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、250μM KKKSPGEYVNIEFG(配列番号16)、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PKBβ(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PKBβ(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(配列番号2)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PKBβ(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM GRPRTSSFAEGKK(配列番号2)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
FGFR3(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、FGFR3(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、FGFR3(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1mM 吉草酸Na、0.1% β−メルカプトエタノール、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PDGFRα(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PDGFRα(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PDGFRα(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PDGFRβ(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PDGFRβ(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PDGFRβ(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM MnCl2、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
MAPK2(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、MAPK2(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、MAPK2(h)(5〜10mU)を25mM トリス(pH7.5)、0.02mM EGTA、0.33mg/ml ミエリン塩基性タンパク質、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
ROCK−II(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、ROCK−II(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、30μM KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK(配列番号8)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、ROCK−II(h)(5〜10mU)を50mM トリス(pH7.5)、0.1mM EGTA、30μM KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK(配列番号8)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PKA(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PKA(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM LRRASLG(ケムプチド;配列番号10)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、50mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PKA(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM LRRASLG(ケムプチド;配列番号10)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、50mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Rsk1(r)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Rsk1(r)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Rsk1(r)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Rsk2(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Rsk2(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Rsk2(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM KKKNRTLSVA(配列番号11)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PAK2(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PAK2(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK(配列番号8)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PAK2(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、30μM KEAKEKRQEQIAKRRRLSSLRASTSKSGGSQK(配列番号8)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Fes(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Fes(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Fes(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
Yes(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、Yes(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、Yes(h)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、0.1mg/ml ポリ(Glu,Tyr)4:1、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をフィルターマットA上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
ABL(m)アッセイ
25μlの最終反応容量で、ABL(m)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(配列番号17)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、ABL(m)(5〜10mU)を8mM MOPS(pH7.0)、0.2mM EDTA、50μM EAIYAAPFAKKK(配列番号17)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
PKCε(h)アッセイ
25μlの最終反応容量で、PKCε(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.4)、0.03% トリトンX−100、0.1mg/ml ホスファチジルセリン、10μg/ml ジアシルグリセロール、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV(配列番号18)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
25μlの最終反応容量で、PKCε(h)(5〜10mU)を20mM Hepes(pH7.4)、0.03% トリトンX−100、0.1mg/ml ホスファチジルセリン、10μg/ml ジアシルグリセロール、50μM ERMRPRKRQGSVRRRV(配列番号18)、10mM 酢酸Mg及び[γ−33P−ATP](比活性約500cpm/pmol、必要とされる濃度)とインキュベートする。Mg2+[γ−33P−ATP]を添加することにより反応を開始させる。室温で40分間インキュベートした後、3%リン酸溶液(5μl)を添加することにより反応を停止させる。次いで、反応物(10μl)をP30フィルターマット上にスポットし、75mM リン酸で5分間に3回、メタノールで1回洗浄した後、乾燥し、シンチレーション計数する。
A. モルホリン−4−イル−酢酸ヒドラジド
モルホリン酢酸メチル(2.43g,15.3ミリモル)、エタノール(20ml)及びヒドラジン(0.53ml,16.8ミリモル)の溶液を90℃で18時間撹拌した。混合物を濃縮し、乾燥して、標記化合物(2.30g,95%)を得た。ES−MS(m/z)=160[M+1]+。
モルホリン酢酸メチル(2.43g,15.3ミリモル)、エタノール(20ml)及びヒドラジン(0.53ml,16.8ミリモル)の溶液を90℃で18時間撹拌した。混合物を濃縮し、乾燥して、標記化合物(2.30g,95%)を得た。ES−MS(m/z)=160[M+1]+。
B. 3−(6−メトキシナフタレン−2−イル)−5−(5−モルホリン−4−イルメチル−1H−[1,2,4]トリアゾル−3−イル)−1H−インダゾール
標記化合物を以下のように製造した。フラスコに3−(6−メトキシナフタレン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボキシミド酸エチルエステル(1.0g,2.62ミリモル)及びモルホリン−4−イル−酢酸ヒドラジド(1.67g,10.5ミリモル)を充填した。10分後、国際特許出願公開第02/10137号の実施例422Aに記載されているように製造したヒドラジド(1.05g,7.31ミリモル)を添加し、混合物を90℃で18時間加熱した。混合物を濃縮し、分取HPLCにより精製して、標記化合物(481mg,42%)を得た。1H NMR(CD3OD) δ 8.82(s,1H),8.42(s,1H),8.08(d,2H),7.93(t,2H),7.65(br s,1H),7.30(s,1H),7.21(d,1H),4.15(s,3H),3.72(m,6H),2.59(br s,4H);ES−MS(m/z)=441[M+1]+。
標記化合物を以下のように製造した。フラスコに3−(6−メトキシナフタレン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボキシミド酸エチルエステル(1.0g,2.62ミリモル)及びモルホリン−4−イル−酢酸ヒドラジド(1.67g,10.5ミリモル)を充填した。10分後、国際特許出願公開第02/10137号の実施例422Aに記載されているように製造したヒドラジド(1.05g,7.31ミリモル)を添加し、混合物を90℃で18時間加熱した。混合物を濃縮し、分取HPLCにより精製して、標記化合物(481mg,42%)を得た。1H NMR(CD3OD) δ 8.82(s,1H),8.42(s,1H),8.08(d,2H),7.93(t,2H),7.65(br s,1H),7.30(s,1H),7.21(d,1H),4.15(s,3H),3.72(m,6H),2.59(br s,4H);ES−MS(m/z)=441[M+1]+。
A. 4−フルオロ−3−[ヒドロキシ−(6−メトキシ−ナフタレン−2−イル)−メチル]ベンゾニトリル
LDA(24.5ml,49ミリモル)をTHF(40ml)中に含む冷(−78℃)溶液にTHF(30ml)中4−フルオロベンゾニトリル(5.45g,45ミリモル)及びTHF(40ml)中6−メトキシ−2−ナフトアルデヒド(9.13g,49ミリモル)を添加した。反応物を−78℃で1時間撹拌した後、2時間かけて室温まで加温した。反応を氷でクエンチし、THFを真空中で除去した。次いで、水溶液を酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去した。粗な物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2,4:1 ヘキサン:酢酸エチル)により精製して、標記化合物(5.5g,収率40%)を得た。ES−MS(m/z)=308[M+1]+。
LDA(24.5ml,49ミリモル)をTHF(40ml)中に含む冷(−78℃)溶液にTHF(30ml)中4−フルオロベンゾニトリル(5.45g,45ミリモル)及びTHF(40ml)中6−メトキシ−2−ナフトアルデヒド(9.13g,49ミリモル)を添加した。反応物を−78℃で1時間撹拌した後、2時間かけて室温まで加温した。反応を氷でクエンチし、THFを真空中で除去した。次いで、水溶液を酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去した。粗な物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2,4:1 ヘキサン:酢酸エチル)により精製して、標記化合物(5.5g,収率40%)を得た。ES−MS(m/z)=308[M+1]+。
B. 4−フルオロ−3−(6−メトキシナフタレン−2−カルボニル)−ベンゾニトリル
丸底フラスコにおいてピリジニウムクロロクロメート(6.4g,29.7ミリモル)をジクロロメタンのスラリー(40ml)に吸収させた。ジクロロメタン(40ml)中の4−フルオロ−3−[ヒドロキシ−(6−メトキシ−ナフタレン−2−イル)−メチル]ベンゾニトリル(6.08g,19.8ミリモル)を添加した。反応物は黒くなった。混合物を室温で5時間撹拌した後、セライトパッドを介して濾過し、溶媒を真空中で除去した。粗な物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2,4:1 ヘキサン:酢酸エチル−1:1 ヘキサン:酢酸エチル)により精製して、標記化合物(4.54g,収率75%)を得た。ES−MS(m/z)=306[M+1]+。
丸底フラスコにおいてピリジニウムクロロクロメート(6.4g,29.7ミリモル)をジクロロメタンのスラリー(40ml)に吸収させた。ジクロロメタン(40ml)中の4−フルオロ−3−[ヒドロキシ−(6−メトキシ−ナフタレン−2−イル)−メチル]ベンゾニトリル(6.08g,19.8ミリモル)を添加した。反応物は黒くなった。混合物を室温で5時間撹拌した後、セライトパッドを介して濾過し、溶媒を真空中で除去した。粗な物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2,4:1 ヘキサン:酢酸エチル−1:1 ヘキサン:酢酸エチル)により精製して、標記化合物(4.54g,収率75%)を得た。ES−MS(m/z)=306[M+1]+。
C. 4−フルオロ−3−(6−ヒドロキシナフタレン−2−カルボニル)−ベンゾニトリル
4−フルオロ−3−(6−メトキシナフタレン−2−カルボニル)−ベンゾニトリル(3.976g,13ミリモル)をジクロロメタン(350ml)中に溶解し、窒素下で氷浴において冷却した。三臭化ホウ素(12.28ml,130ミリモル)をゆっくり添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。反応を氷でクエンチし、炭酸水素ナトリウムで中和し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去した。粗な物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2,7:3 ヘキサン:酢酸エチル)により精製して、標記化合物(2.5g,収率66%)を得た。ES−MS(m/z)=292[M+1]+。
4−フルオロ−3−(6−メトキシナフタレン−2−カルボニル)−ベンゾニトリル(3.976g,13ミリモル)をジクロロメタン(350ml)中に溶解し、窒素下で氷浴において冷却した。三臭化ホウ素(12.28ml,130ミリモル)をゆっくり添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。反応を氷でクエンチし、炭酸水素ナトリウムで中和し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去した。粗な物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2,7:3 ヘキサン:酢酸エチル)により精製して、標記化合物(2.5g,収率66%)を得た。ES−MS(m/z)=292[M+1]+。
D. 4−フルオロ−3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−カルボニル]−ベンゾニトリル
4−フルオロ−3−(6−ヒドロキシナフタレン−2−カルボニル)−ベンゾニトリル
(2.7g,9.3ミリモル)をジオキサン(22ml)中に溶解した。臭化テトラエチルアンモニウム(195mg,0.93ミリモル)及び水酸化ナトリウム(水16ml中1.12g)を順次添加した。1−(2−クロロエチル)ピロリジン塩酸塩(1.74g,10.23ミリモル)を添加し、反応混合物を55℃で4時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、水を添加した。反応混合物をpH7に中和し、酢酸エチルで十分抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去して、標記化合物(3.16g,収率87%)を得た。ES−MS(m/z)=389[M+1]+。
4−フルオロ−3−(6−ヒドロキシナフタレン−2−カルボニル)−ベンゾニトリル
(2.7g,9.3ミリモル)をジオキサン(22ml)中に溶解した。臭化テトラエチルアンモニウム(195mg,0.93ミリモル)及び水酸化ナトリウム(水16ml中1.12g)を順次添加した。1−(2−クロロエチル)ピロリジン塩酸塩(1.74g,10.23ミリモル)を添加し、反応混合物を55℃で4時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、水を添加した。反応混合物をpH7に中和し、酢酸エチルで十分抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で除去して、標記化合物(3.16g,収率87%)を得た。ES−MS(m/z)=389[M+1]+。
E. 3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール−5−カルボニトリル
4−フルオロ−3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−カルボニル]−ベンゾニトリル(3.16g,8.14ミリモル)をトルエン(40ml)中に含む溶液にヒドラジン1水和物(0.87ml,17.9ミリモル)を添加し、反応混合物を65℃で一晩加熱した。溶媒を真空中で除去し、粗な物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2,1% トリエチルアミン/酢酸エチル)により精製して、標記化合物(2.0g,収率65%)を得た。ES−MS(m/z)=383[M+1]+。
4−フルオロ−3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−カルボニル]−ベンゾニトリル(3.16g,8.14ミリモル)をトルエン(40ml)中に含む溶液にヒドラジン1水和物(0.87ml,17.9ミリモル)を添加し、反応混合物を65℃で一晩加熱した。溶媒を真空中で除去し、粗な物質をカラムクロマトグラフィー(SiO2,1% トリエチルアミン/酢酸エチル)により精製して、標記化合物(2.0g,収率65%)を得た。ES−MS(m/z)=383[M+1]+。
F. 3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール−5−カルボキシミド酸エチルエステル塩酸塩
標記化合物を以下のように製造した。3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(2g,5.23ミリモル)をエタノール(400ml)中に含む溶液を0℃に冷却した。反応混合物にHClガスを30分間通した。反応容器を封鎖し、混合物を室温で20時間撹拌した、反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、沈殿を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。白色固体を真空中40℃で一晩乾燥して、標記化合物を黄色固体(2g,収率89%)として得た。ES−MS(m/z)=429[M+1]+。
標記化合物を以下のように製造した。3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(2g,5.23ミリモル)をエタノール(400ml)中に含む溶液を0℃に冷却した。反応混合物にHClガスを30分間通した。反応容器を封鎖し、混合物を室温で20時間撹拌した、反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、沈殿を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。白色固体を真空中40℃で一晩乾燥して、標記化合物を黄色固体(2g,収率89%)として得た。ES−MS(m/z)=429[M+1]+。
G. 5−(5−イソブチル−1H−[1,2,4]トリアゾル−3−イル)−3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール
標記化合物を以下のように製造した。3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール−5−カルボキシミド酸エチルエステル(2g,4.67ミリモル)の溶液に3−メチル酪酸ヒドラジド(1.63g,14.04ミリモル)及びメタノール(20ml)中トリエチルアミン(13.04ml,93.44ミリモル)を添加した。反応物を密封圧力容器において100℃で4時間撹拌した。濃縮し、HPLC(20〜65% 水/アセトニトリル)により精製して、標記化合物(378.5mg,収率17%)を得た。1H NMR(メタノール−d4,300MHz) δ 8.82(s,1H),8.47(s,1H),8.10(dd,2H),7.97(dd.2H),7.69(d,1H),7.39(s,1H),7.29(d,1H),4.47(t,2H),3.72(m,4H),3.28(m,2H),2.75(d,2H),2.07(m,5H),1.01(d,6H);ES−MS(m/z)=481[M+1]+。
標記化合物を以下のように製造した。3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール−5−カルボキシミド酸エチルエステル(2g,4.67ミリモル)の溶液に3−メチル酪酸ヒドラジド(1.63g,14.04ミリモル)及びメタノール(20ml)中トリエチルアミン(13.04ml,93.44ミリモル)を添加した。反応物を密封圧力容器において100℃で4時間撹拌した。濃縮し、HPLC(20〜65% 水/アセトニトリル)により精製して、標記化合物(378.5mg,収率17%)を得た。1H NMR(メタノール−d4,300MHz) δ 8.82(s,1H),8.47(s,1H),8.10(dd,2H),7.97(dd.2H),7.69(d,1H),7.39(s,1H),7.29(d,1H),4.47(t,2H),3.72(m,4H),3.28(m,2H),2.75(d,2H),2.07(m,5H),1.01(d,6H);ES−MS(m/z)=481[M+1]+。
A. 2−(6−ブロモ−ナフタレン−2−イルオキシメチル)−ピリジン
6−ブロモナフトール(6.13g,27.5ミリモル)、ピリジン−2−イル−メタノール(2.64ml,27.5ミリモル,1.0eq)及びトリフェニルホスフィン(10.8g,41.30ミリモル,1.5eq)をTHF中に含む溶液を氷浴で冷却し、ここにアゾジカルボン酸ジイソプロピル(8.12ml,41.3ミリモル,1.5eq)を添加した。反応をTLC(30% 酢酸エチル/ヘキサン)によりモニターし、24時間後完了した。溶媒を真空中で除去し、Biotageカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物(9.00g,収率100%)を褐色固体として得た。ES−MS(m/z)=313[M+1]。
6−ブロモナフトール(6.13g,27.5ミリモル)、ピリジン−2−イル−メタノール(2.64ml,27.5ミリモル,1.0eq)及びトリフェニルホスフィン(10.8g,41.30ミリモル,1.5eq)をTHF中に含む溶液を氷浴で冷却し、ここにアゾジカルボン酸ジイソプロピル(8.12ml,41.3ミリモル,1.5eq)を添加した。反応をTLC(30% 酢酸エチル/ヘキサン)によりモニターし、24時間後完了した。溶媒を真空中で除去し、Biotageカラムクロマトグラフィーにかけて、標記化合物(9.00g,収率100%)を褐色固体として得た。ES−MS(m/z)=313[M+1]。
B. 3−[6−(ピリジン−2−イルメトキシ)ナフタレン−2−イル]−1−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボニトリル
2−(6−ブロモ−ナフタレン−2−イルオキシメチル)−ピリジン(4.97g,15.8ミリモル)をDMF(50ml)中に含む溶液にビス(ピンナカラト)ジボロン(4.02g,15.8ミリモル,1.0eq)、酢酸カリウム(4.66g.47.6ミリモル,3.0eq)及び塩化パラジウムII(ビス−ジフェニルホスフィノフェロセン)ジクロロメタン(1.29g,10%ミリモル)を添加した。反応物を80℃で一晩加熱し、LCMSでボロネートエステル複合体の形成を確認した。反応物に3−ブロモ−1−ペルヒドロ−2H−ピラン−2−イル−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(4.85g,15.8ミリモル,1.0eq)及びリン酸カリウム(10.09g,47.6ミリモル.3.0eq)を添加し、80℃で一晩撹拌した。反応をLCMSによりモニターし、24時間後完了した。溶媒を真空中で除去し、残渣を水で洗浄し、酢酸エチルで抽出し、Biotageカラムクロマトグラフィー(60% 酢酸エチル/ヘキサン)にかけて、標記化合物(2.10g,収率30%)を褐色固体として得た。ES−MS(m/z)=460[M+1]。
2−(6−ブロモ−ナフタレン−2−イルオキシメチル)−ピリジン(4.97g,15.8ミリモル)をDMF(50ml)中に含む溶液にビス(ピンナカラト)ジボロン(4.02g,15.8ミリモル,1.0eq)、酢酸カリウム(4.66g.47.6ミリモル,3.0eq)及び塩化パラジウムII(ビス−ジフェニルホスフィノフェロセン)ジクロロメタン(1.29g,10%ミリモル)を添加した。反応物を80℃で一晩加熱し、LCMSでボロネートエステル複合体の形成を確認した。反応物に3−ブロモ−1−ペルヒドロ−2H−ピラン−2−イル−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(4.85g,15.8ミリモル,1.0eq)及びリン酸カリウム(10.09g,47.6ミリモル.3.0eq)を添加し、80℃で一晩撹拌した。反応をLCMSによりモニターし、24時間後完了した。溶媒を真空中で除去し、残渣を水で洗浄し、酢酸エチルで抽出し、Biotageカラムクロマトグラフィー(60% 酢酸エチル/ヘキサン)にかけて、標記化合物(2.10g,収率30%)を褐色固体として得た。ES−MS(m/z)=460[M+1]。
C. 3−[6−(ピリジン−2−イルメトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール−5−カルボキシミド酸エチルエステル
3−[6−(ピリジン−2−イルメトキシ)ナフタレン−2−イル]−1−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(2.00g,4.30ミリモル)をエタノール(500ml)中に含む溶液をドライアイス/アセトン浴で冷却し、ここにHCl(g)を20分間通した。反応をLCMSによりモニターし、72時間後完了した。溶媒を真空中で除去し、ジエチルエーテルと摩砕した。固体を濾過して、標記化合物(1.05g,収率58%)をオフホワイト色固体として得た。ES−MS(m/z)=422[M+1]。
3−[6−(ピリジン−2−イルメトキシ)ナフタレン−2−イル]−1−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(2.00g,4.30ミリモル)をエタノール(500ml)中に含む溶液をドライアイス/アセトン浴で冷却し、ここにHCl(g)を20分間通した。反応をLCMSによりモニターし、72時間後完了した。溶媒を真空中で除去し、ジエチルエーテルと摩砕した。固体を濾過して、標記化合物(1.05g,収率58%)をオフホワイト色固体として得た。ES−MS(m/z)=422[M+1]。
D. 5−[5−(2,2−ジメチルプロピル)−1H−[1,2,4]トリアゾル−3−イル]−3−[6−(ピリジン−2−イルメトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール
3−[6−(ピリジン−2−イルメトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール−5−カルボキシミド酸エチルエステル(0.50g,1.18ミリモル)を含む溶液にジメチル酪酸ヒドラジド(0.62g,4.72ミリモル,4.0eq)及びトリエチルアミン(3.28ml,23.6ミリモル,20.0eq)を添加した。反応物を密封管において90℃に一晩加熱した。反応をLCMSによりモニターし、24時間後完了した。溶媒を真空中で除去し、分取HPLC(20〜80% アセトニトリル/水+0.1% TFA)にかけて、標記化合物(60mg,収率9%)を白色固体として得た。1H NMR(CD3OD) δ 8.98(s,1H),8.70(d,1H),8.60(s,1H),8.35(dd,2H),8.10(d,1H),8.00(dd,2H),7.80(m,2H),7.55−7.40(m,3H),5.45(s,2H),2.95(s,2H),1.05(s,9H);ES−MS(m/z)=566[M+1]。
3−[6−(ピリジン−2−イルメトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール−5−カルボキシミド酸エチルエステル(0.50g,1.18ミリモル)を含む溶液にジメチル酪酸ヒドラジド(0.62g,4.72ミリモル,4.0eq)及びトリエチルアミン(3.28ml,23.6ミリモル,20.0eq)を添加した。反応物を密封管において90℃に一晩加熱した。反応をLCMSによりモニターし、24時間後完了した。溶媒を真空中で除去し、分取HPLC(20〜80% アセトニトリル/水+0.1% TFA)にかけて、標記化合物(60mg,収率9%)を白色固体として得た。1H NMR(CD3OD) δ 8.98(s,1H),8.70(d,1H),8.60(s,1H),8.35(dd,2H),8.10(d,1H),8.00(dd,2H),7.80(m,2H),7.55−7.40(m,3H),5.45(s,2H),2.95(s,2H),1.05(s,9H);ES−MS(m/z)=566[M+1]。
2−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ]−6−{5−[3−(2,2−ジメチルプロピル)(1H−1,2,4−トリアゾル−5−イル)](1H−インダゾル−3−イル)}ナフタレン(CC005)の合成
A. 2−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ]−6−ブロモナフタレン
標記化合物を以下のように製造した。6−ブロモ−2−ナフトール(6.95g,31.2ミリモル)、((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メタン−1−オール(6.20g,48.13ミリモル)及びトリフェニルホスフィン(12.26g,46.8ミリモル)をTHF中に含む溶液にアゾジカルボン酸ジイソブチル(9.23ml,46.8ミリモル)を添加した。溶液を周囲温度で20分間撹拌し、反応が完了するまでTLCによりモニターした。溶媒を減圧下で蒸発させると、油状物が生じた。この油状物にジエチルエーテル:ヘキサン(1:1)の混合物を添加し、5分間音波処理すると、トリフェニルホスフィンオキシドが析出した。白色固体をセライトを介して濾過し、生じた濾液を減圧下で油状物まで凝縮した。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(3〜10% メタノール/ジクロロメタン)により精製して、標記化合物(11.0g,収率>100%)を得た。ES−MS(m/z)=334[M+1]+,336[M+2]+。
標記化合物を以下のように製造した。6−ブロモ−2−ナフトール(6.95g,31.2ミリモル)、((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メタン−1−オール(6.20g,48.13ミリモル)及びトリフェニルホスフィン(12.26g,46.8ミリモル)をTHF中に含む溶液にアゾジカルボン酸ジイソブチル(9.23ml,46.8ミリモル)を添加した。溶液を周囲温度で20分間撹拌し、反応が完了するまでTLCによりモニターした。溶媒を減圧下で蒸発させると、油状物が生じた。この油状物にジエチルエーテル:ヘキサン(1:1)の混合物を添加し、5分間音波処理すると、トリフェニルホスフィンオキシドが析出した。白色固体をセライトを介して濾過し、生じた濾液を減圧下で油状物まで凝縮した。この油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(3〜10% メタノール/ジクロロメタン)により精製して、標記化合物(11.0g,収率>100%)を得た。ES−MS(m/z)=334[M+1]+,336[M+2]+。
B. 3−{6−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ](2−ナフチル)}−1−ペルヒドロ−2H−ピラン−2−イル−1H−インダゾール−5−カルボニトリル
標記化合物を以下のように製造した。ジメチルホルムアミド(70ml)中の2−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ]−6−ブロモナフタレン(4.46g,13.39ミリモル)、ジクロロメタンとの[1,1’−ビス(ジフェニルホスフィノフェロセン)]複合体(1:1)(1.13g,1.385ミリモル)、酢酸カリウム(4.07g,41.55ミリモル)及びビス(ピミナコラト)ジボラン(3.51g,13.85ミリモル)の混合物を95℃に3時間加熱した。反応をTLC及びES−MSによりモニターして、ボロネートエステルの形成が確認された。次いで、3−ブロモ−1−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(4.23g,13.85ミリモル)及び炭酸カリウム(10.85g,41.55ミリモル)を添加し、95℃で更に16時間加熱した。次いで、生じた混合物を減圧下で凝縮すると、黒色油状物が生じた。次いで、この油状物を酢酸エチルで希釈し、セライトを介して濾過し、溶媒を減圧下で除去した。生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(10〜15% メタノール/ジクロロメタン)により精製して、標記化合物(1.05g,収率16%)を得た。ES−MS(m/z)=481[M+1]+。
標記化合物を以下のように製造した。ジメチルホルムアミド(70ml)中の2−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ]−6−ブロモナフタレン(4.46g,13.39ミリモル)、ジクロロメタンとの[1,1’−ビス(ジフェニルホスフィノフェロセン)]複合体(1:1)(1.13g,1.385ミリモル)、酢酸カリウム(4.07g,41.55ミリモル)及びビス(ピミナコラト)ジボラン(3.51g,13.85ミリモル)の混合物を95℃に3時間加熱した。反応をTLC及びES−MSによりモニターして、ボロネートエステルの形成が確認された。次いで、3−ブロモ−1−(テトラヒドロ−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(4.23g,13.85ミリモル)及び炭酸カリウム(10.85g,41.55ミリモル)を添加し、95℃で更に16時間加熱した。次いで、生じた混合物を減圧下で凝縮すると、黒色油状物が生じた。次いで、この油状物を酢酸エチルで希釈し、セライトを介して濾過し、溶媒を減圧下で除去した。生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー(10〜15% メタノール/ジクロロメタン)により精製して、標記化合物(1.05g,収率16%)を得た。ES−MS(m/z)=481[M+1]+。
C. (3−{6−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ](2−ナフチル)}(1H−インダゾル−5−イル))エトキシメタンイミン
標記化合物を以下のように製造した。3−{6−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ](2−ナフチル)}−1−ペルヒドロ−2H−ピラン−2−イル−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(4.6g,8.85ミリモル)をエタノール(800ml)中に溶解し、0℃に冷却した。次いで、塩化水素ガスを溶液中に20分間通した。次いで、酸性化混合物を室温で16時間撹拌した。生じた溶液を減圧下で凝縮すると、固体が生じた。この固体をジエチルエーテルで洗浄し、ブフナー漏斗を介して濾過し、真空下で乾燥して、標記化合物(1.10g,収率98%)を得た。ES−MS(m/z)=443[M+1]+。
標記化合物を以下のように製造した。3−{6−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ](2−ナフチル)}−1−ペルヒドロ−2H−ピラン−2−イル−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(4.6g,8.85ミリモル)をエタノール(800ml)中に溶解し、0℃に冷却した。次いで、塩化水素ガスを溶液中に20分間通した。次いで、酸性化混合物を室温で16時間撹拌した。生じた溶液を減圧下で凝縮すると、固体が生じた。この固体をジエチルエーテルで洗浄し、ブフナー漏斗を介して濾過し、真空下で乾燥して、標記化合物(1.10g,収率98%)を得た。ES−MS(m/z)=443[M+1]+。
D. [((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ]−6−{5−[3−(2,2−ジメチルプロピル)(1H−1,2,4−トリアゾル−5−イル)](1H−インダゾル−3−イル)}ナフタレン
標記化合物を以下のように製造した。(3−{6−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ](2−ナフチル)}(1H−インダゾル−5−イル))エトキシメタンイミン(0.550g,1.24ミリモル)及びN−アミノ−3,3−ジメチルブタナミド(0.323g,2.488ミリモル)を含む溶液にシクロペンチルメチルヒドラジド(1.4g,9.89ミリモル)及びトリエチルアミン(4.98g,49.4ミリモル)を添加した。混合物を密封管において95℃に16時間加熱した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、油状物を分取HPLC(20〜80% アセトニトリル/水,60ml/分)により精製して、標記化合物(0.061g,収率9.6%)を得た。この化合物はHPLC分析により純度100%であった。。1H NMR(CHCl3) δ 8.83(s,1H),8.39(s,1H),8.20(d,1H),8.09(d,1H),7.83(m,2H),7.58(d,1H),7.19(m,2H),4.16(m,1H),4.0(m,1H),3.26(t,1H),3.05(m,1H),2.97(m,1H),2.78(s,2H),2.50(m,1H),2.33(m,1H),2.21(m,1H),2.05(m,1H),1.85(m,4H),1.10(t,3H),1.04(q,2H);ES−MS(m/z)=509[M+1]+。
標記化合物を以下のように製造した。(3−{6−[((2S)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ](2−ナフチル)}(1H−インダゾル−5−イル))エトキシメタンイミン(0.550g,1.24ミリモル)及びN−アミノ−3,3−ジメチルブタナミド(0.323g,2.488ミリモル)を含む溶液にシクロペンチルメチルヒドラジド(1.4g,9.89ミリモル)及びトリエチルアミン(4.98g,49.4ミリモル)を添加した。混合物を密封管において95℃に16時間加熱した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、油状物を分取HPLC(20〜80% アセトニトリル/水,60ml/分)により精製して、標記化合物(0.061g,収率9.6%)を得た。この化合物はHPLC分析により純度100%であった。。1H NMR(CHCl3) δ 8.83(s,1H),8.39(s,1H),8.20(d,1H),8.09(d,1H),7.83(m,2H),7.58(d,1H),7.19(m,2H),4.16(m,1H),4.0(m,1H),3.26(t,1H),3.05(m,1H),2.97(m,1H),2.78(s,2H),2.50(m,1H),2.33(m,1H),2.21(m,1H),2.05(m,1H),1.85(m,4H),1.10(t,3H),1.04(q,2H);ES−MS(m/z)=509[M+1]+。
当業者は、本明細書に記載されている本発明の具体的実施形態の多くの均等物を認識したり、ルーチンの実験だけで確認することができる。これらの均等物は請求の範囲に包含されると解される。
本明細書中に挙げた刊行物及び特許文献はすべて、個々の刊行物及び特許文献が具体的に個別に参照により本明細書に組み入れると記載されていると同程度に参照により本明細書に組み入れる。
Claims (15)
- 少なくとも2個のキナーゼの活性をモジュレートする単一薬物を個体に投与することを含み、前記キナーゼの各々がCDKキナーゼ、Rskキナーゼ、MAPKキナーゼ、チェックポイントキナーゼ、Srcキナーゼ、Fes、Lyn、Sykからなる群から独立して選択される前記個体の治療方法。
- 少なくとも2個のキナーゼがcSRC、Yes、Fyn、Lck、Fes、Lyn、Syk、Rsk1、CDK1、CDK2、CDK3、CDK5、CDK6、CDK7、CHK1、CHK2、JNK1、MAPK1、MAPK2、MAPKAP−K5、MEK1、ROCKII、PRK2、PRAK、p70S6またはオーロラAの少なくとも2個である請求項1に記載の方法、
- 少なくとも2個のキナーゼがヒトCDK1、CDK2、cSRC、Yes、MEK1及びRsk1である請求項2に記載の方法。
- 個体が癌、増殖性疾患、炎症性疾患または肥満を患っている請求項1または2に記載の方法。
- 単一薬物が構造:
R1は−H、−ハロ、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−OR3、−N(R4)2、−CN、−NO2、−CO(R)5、−OCO(R)5、−NHC(O)R5、−SO2R6、−アリール、−ヘテロ環、−ヘテロアリール、−シクロアルキル、−(C1−6アルキレン)−R2または−O−(C1−6アルキレン)−R2であり;
R2は−H、−ハロ、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−OR3、−N(R4)2、−CN、−NO2、−C(O)R5、−OC(O)R5、−NHC(O)R5、−SO2R6、−アリール、−ヘテロ環、−ヘテロアリールまたは−シクロアルキルであり;
R3は独立して−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−C1−6ハロアルキル、−シクロアルキル、−アリールまたは−ヘテロ環であり;
R4はそれぞれ独立して−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−シクロアルキル、−アリール、−ヘテロ環または−(C1−6アルキレン)−OR3であり;
R5は−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−シクロアルキル、−アリール、−ヘテロ環、−OR3または−N(R4)2であり;
R6は−H、−C1−6アルキル、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−N(R4)2、−シクロアルキル、−アリールまたは−ヘテロ環であり
Zはそれぞれ−C(R7)−または−N−(ただし、Zの最高3個が−N−であり得る)であり;
R7は−H、−ハロ、−C1−6アルキル、−C1−6ハロアルキル、−O−(C1−6ハロアルキル)、−C1−6アルケニル、−C1−6アルキニル、−OR3、−N(R4)2、−CN、−NO2、−C(O)R5、−OC(O)R5、−NHC(O)R5、−SO2R6、−アリール、−ヘテロ環、−シクロアルキル、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)n−シクロアルキル、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)n−アリール、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)n−ヘテロ環、−(C1−6アルキレン)シクロアルキル、−(C1−6アルキレン)−アリール、−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環、−O−(C1−6アルキレン)−C(O)R5、−O−(C1−6アルキレン)−N(R4)2、−O(C1−6アルキレン)−シクロアルキル、−O−(C1−6アルキレン)−アリールまたは−O−(C1−6アルキレン)−ヘテロ環(ここで、R7は炭素原子を介して二環式環系に結合しており、nは0または1である)であり;
R9は−H、−C1−6アルキルまたはシクロアルキルである]
を有する化合物、並びにその異性体、プロドラッグ、製薬上許容される塩、溶媒和物及び水和物である請求項1に記載の方法。 - 単一薬物は構造:
R1は−H、−C1−6アルキル、−(C1−6アルキレン)−R2または−O−(C1−6アルキレン)−R2であり;
R2は−C1−6アルキル、−C1−6アルコキシ、−OH、−N(R3)2、−アリール、−ヘテロアリール、−ヘテロ環または−シクロアルキルであり;
R3はそれぞれ独立して−H、−C1−6アルキルまたは−C1−6アルキレン−(C1−6アルコキシ)であり;
R4は−N(R5)2、−O−C1−6アルキル、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)m−ヘテロ環、−C(O)−ヘテロ環、−C(O)NH−(C1−6アルキレン)m−ヘテロアリール、−C(O)−ヘテロアリール、−(C1−6アルキレン)−シクロアルキル、−O−(C1−6アルキレン)−N(R5)2、−O−(C1−6アルキレン)m−ヘテロ環、−O−(C1−6アルキレン)m−ヘテロアリール、−O−(C1−6アルキレン)m−シクロアルキルまたは−O−(C1−6アルキレン)m−C(O)R5であり;
Zは−CH−または−N−であり;
R5はそれぞれ独立して−Hまたは−C1−6アルキルであり;
mは0または1である]
を有する化合物、並びにその異性体、プロドラッグ、製薬上許容される塩、溶媒和物及び水和物である請求項1に記載の方法。 - 単一薬物が3−(6−メトキシナフタレン−2−イル)−5−(5−モルホリン−4−イルメチル)−1H−[1,2,4]トリアゾル−3−イル)−1H−インダゾール、5−(5−イソブチル−1H−[1,2,4]トリアゾル−3−イル)−3−[6−(2−ピロリジン−1−イル−エトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール、5−[5−(2,2−ジメチル−プロピル)−1H−[1,2,4]トリアゾル−3−イル]−3−[6−(ピリジン−2−イルメトキシ)−ナフタレン−2−イル]−1H−インダゾール、または2−[((2s)−1−エチルピロリジン−2−イル)メトキシ]−6−{5−[3−(2,2−ジメチルプロピル)(1H−1,2,4−トリアゾル−5−イル)](1H−インダゾル−3−イル)}ナフタレンである請求項1に記載の方法。
- 単一薬物が非インダゾール小分子、ペプチドまたはポリヌクレオチドである請求項1に記載の方法。
- 単一薬物が5−(5−シクロペンチル−1H−[1,2,4]トリアゾル−3−イル)−3−(4−フルオロ−フェニル)−1H−インダゾールまたは3−(5−(1H−1,2,4−トリアゾル−3−イル)(1H−インダゾル−3−イル))フェニル−N−シクロペンチルカルボキサミド以外のインダゾール含有化合物である請求項1に記載の方法。
- 単一薬物が3μMの濃度で存在しているとき、単一薬物は表2に示す少なくとも7個のキナーゼのそれぞれの活性を単一薬物の非存在下での前記した少なくとも7個のキナーゼの活性と比べて少なくとも90%阻害する請求項1に記載の方法。
- 単一薬物が3μMの濃度で存在しているとき、単一薬物はヒトCDK1、CHK2、PRK2及びROCK−IIの各活性を単一薬物の非存在下の同等条件下での前記CDK1、CHK2、PRK2及びRPCK−IIの活性と比べて90%以上阻害する請求項1に記載の方法。
- 単一薬物を医薬組成物中に存在させる請求項1に記載の方法。
- 個体を複数の単一薬物で治療する請求項1に記載の方法。
- 個体に更に単一薬物以外の癌治療薬または治療を投与する請求項4に記載の方法。
- 個体を肺癌または結腸癌のために治療する請求項4に記載の方法。
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