JP2007517497A - 標的核酸配列の検出のためのolaベースの方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)核酸サンプルに前記サンプル中で検出すべき各標的配列(T)のための第1のプローブ(1)を提供し、それによって前記第1のプローブが標的配列(5)の第1の部と補完的である第1の標的特異的部分(4)を有し、かつ前記サンプル中で検出すべき各標的配列のための第2のプローブ(2)を提供し、それによって前記第2のプローブが標的配列(7)の第2の部と補完的である第2の標的特異的部分(6)を有し、それによって前記標的配列の第1および第2の部が互いに(3)隣接して配置され、それによって前記第2のプローブが、前記標的配列に実質的に非補完的であるタグ部分(8)をさらに含んで成り、それによって前記タグ部分が第1のプライマー結合配列(10)を含んで成るステップと、
b)前記第1および第2のプローブの前記第1および第2の標的特異的部分を、前記サンプル中に存在する各標的配列の前記第1および第2の部にアニールさせ、それによって前記プローブの前記第1および第2の標的特異的部分が前記標的配列上で隣接してアニールされるステップと、
c)前記標的配列に隣接してアニールされた前記第1および第2の標的特異的部分を接続し、かつ前記第1および第2の標的特異的部分を接続させ、前記サンプル中の標的配列に対応する接続プローブ(11)を生成する手段を提供するステップと、
d)ステップc)から結果として生じる混合物に、前記第1の標的特異的部分の少なくとも一部と補完的である部分(15)および第2のプライマー結合部分(14)を含んで成る合成プライマー(12)を提供するステップと、
e)前記合成プライマーを前記第1の標的特異的部分の少なくとも一部にアニールさせるステップと、
f)前記合成プライマーを伸長するステップと、
g)前記第1のプライマー結合部分と実質的に同一の配列を有する前記第1のプライマー(18)と、前記第2のプライマー結合部分と補完的である第2のプライマー(17)とを含んで成る一連のプライマーを提供するステップと、
h)結果として生じる混合物を増幅し、前記接続プローブを示すものである単位複製配列(19)を含んで成る増幅サンプルを得るステップと、
i)前記対応する単位複製配列の存在、非存在、または量を検出することによって前記サンプルにおける標的配列の存在、非存在、または量を判定するステップと
を含んで成る。
標的配列と補完的であるオリゴヌクレオチドプローブの部分は、サンプル中の各標的配列のために、第1および第2のプローブが提供され、それによってプローブが各々、標的配列の部と補完的である部分を含有し、かつ標的配列の対応する補完的部が実質的に互いに隣接して配置されるようにデザインされている。一部の実施形態においては、第1と第2のプローブの組合せは、オリゴヌクレオチドプローブの対合としてみなされる。一部の実施形態においては、1つもしくはそれ以上の合成プライマーとのプローブの対合の組合せは一連のプローブとしてみなされる。
第1のプローブは、検出すべきサンプル中の標的配列核酸の第1の部と補完的である標的特異的部分を含んで成る。一部の実施形態においては、第1のプローブは、標的配列と補完的ではないタグ部分を含有する。タグ部分はライゲート産物の中間単離または精製に役立ちうる。一部の実施形態においては、タグ部分はGCが豊富な配列またはZIP配列を含んで成る。一部の実施形態においては、タグ部分はビオチンなどの親和性リガンドを含んで成る。一部の実施形態においては、第1のプローブはエクソヌクレアーゼ耐久性であり、ライゲートされていないプローブの除去を可能にする。一部の実施形態においては、第1のプローブはプライマー結合配列を含んで成ることがない。一部の実施形態においては、第1のプローブは、検出すべきサンプル中の標的配列核酸の第1の部と補完的である標的特異的部分を含んで成る。一部の実施形態においては、第1のプローブは、核酸サンプル中の他の(標的)配列とハイブリダイズすることが可能ではない。
第2のプローブは、標的配列の部と補完的である標的特異的部分を含んで成る。第2のプローブは、標的部分と実質的に非補完的であるタグを含んで成る。好ましくは、タグ部分は標的配列とハイブリダイズすることが可能ではない。好ましくは、タグ部分も核酸サンプル中の他の(標的)配列とハイブリッド可能ではない。
合成プライマーは、第1のプローブの標的特異的部分の少なくとも一部をと補完的である第1のプローブ特異的部分を含んで成る。一部の実施形態においては、第1のプローブ特異的部分は標的配列の第1の部の少なくとも一部と実質的に同一である。合成プライマーの第1のプローブ特異的部分は、第1のプローブの標的特異的部分と補完的である少なくとも4または少なくとも8、好ましくは、少なくとも10、より好ましくは、少なくとも12個のヌクレオチド、特に、少なくとも15、より好ましくは、少なくとも18、かつ最も好ましくは、少なくとも20個のヌクレオチドを含有する。
本発明の態様の1つは、サンプル中で検出すべき各標的ヌクレオチド配列の少なくとも一対の第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それによって第1のオリゴヌクレオチドプローブは、その5’末端で標的配列の第1の部と補完的である部分を有し、第2のオリゴヌクレオチドプローブはその3’末端で標的配列の第2の部と補完的である部分を有し、それによって第1のオリゴヌクレオチドプローブは、第2のオリゴヌクレオチドプローブに配置された補完的クランプ部分とハイブリダイズすることが可能であるクランプ部分をさらに含んで成り、それによってクランプ部分は標的配列と実質的に非補完的であり、オリゴヌクレオチドプローブを標的配列にアニールすることが可能であるステップと、第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブを接続するための手段を提供し、標的配列の隣接部分とハイブリダイズされると第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブが接続されることを可能にし、サンプル中の標的配列に対応する接続プローブを生成するステップと、第1のプローブの第1の標的特異的部分の少なくとも一部および場合により第2のプローブの第2の標的特異的部分の少なくとも一部と補完的である部分および第2のプライマー結合部分を含んで成る合成プライマーを提供し、合成プライマーを第1のプライマーの第1の標的特異的部分の少なくとも一部、および場合により第2のプライマーの第2の標的特異的部分の少なくとも一部にアニールすることを可能にするステップと、合成プライマーを伸長するステップと、第1のプライマー結合部分と実質的に同一の配列を有する第1のプライマーと、第2のプライマー結合部分と補完的である第2のプライマーとを含んで成る一連のプライマーを提供するステップと、結果として生じる混合物を増幅し、接続プローブを示すものである単位複製配列を含んで成る増幅サンプルを得るステップと、対応する単位複製配列の存在、非存在、または量を検出することによってサンプル中の標的配列の存在、非存在、または量を判定するステップを含んで成るサンプルにおける標的ヌクレオチド配列を検出するための方法に関する。
−第2のオリゴヌクレオチドプローブ(P2)の第2のクランプ部分(C2)とハイブリダイズすることが可能である第1のクランプ部分(C1)を含んで成る第1のオリゴヌクレオチドプローブ(P1)、および検出すべき標的DNA配列(D)の第1の部分(S1)をハイブリダイズすることが可能である第1の標的部分(T1)と、
−第1のオリゴヌクレオチドプローブ(P1)の第1のクランプ部分(C1)とハイブリダイズすることが可能である第2のクランプ部分(C2)を含んで成る第2のオリゴヌクレオチドプローブ(P2)、および検出すべき標的DNA配列(D)の第2の部分(S2)をハイブリダイズすることが可能である第2の標的部分(T2)と、
−第1の標的特異的部分および第2のプライマー結合部分の少なくとも一部と補完的である部分を含んで成る第3のオリゴヌクレオチド合成プライマーと
を含んで成る一連のオリゴヌクレオチドプローブ(K)に関する。
クランプ部分は、好ましくは、標的部分より遠位であるプローブの端またはその近くに配置されており、すなわち、標的部分が3’末端に配置されていると、クランプ部分はより5’末端の方に配置されており、また逆の場合も同じである。クランプ部分は必ずしも最も遠位の5’末端または3’末端に配置されておらず、本明細書で別記されている他の部分によって追随されうる。クランプ部分は、好ましくは、標的部分とハイブリダイズすることが可能でないようにデザインされている。対合の第1および第2のクランプ部分は、互いとハイブリダイズすることが可能である。クランプ部分は、好ましくは、2つのクランプ部分が、標的ヌクレオチド配列におけるその補完的部に対するプローブの標的部分の結合親和性よりも互いに対してより高い結合親和性を有するようにデザインされている。これは、実際に、クランプ部分が、互いとハイブリダイズされると、標的ヌクレオチド配列における標的部分とその補完物との間のハイブリッドよりも強い二本鎖を形成し、かつ/または補完的クランプのハイブリダイゼーションが、プローブの標的との標的補完的部分のハイブリダイゼーションよりも高い温度で起こることを意味する。言い換えれば、ハイブリダイズされたクランプ部分は、そのほかの点では同等の条件下に、プローブの対合における標的補完的部分の変性温度よりも高い温度または高い厳密性条件で変性する。これは、ハイブリダイズまたはロックされたクランプが少なくともプローブが接続されて接続プローブを生じるまでハイブリダイズまたはロックされたままであるように本発明の方法中に条件の選択を可能にする。ロックされたクランプは、ロックされたクランプの変性を可能にする温度または条件下に接続プローブを変性することによって開放されうる。
本発明の一態様においては、ライゲーション前に追加の識別ステップが導入されうる。一部の実施形態においては、対合の第1または第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、2つのプローブの1つがその標的特異的部分のライゲーションの予測点を越えて伸長されるようにデザインされている。好ましくは、プローブは標的配列と補完的ではない配列で伸長される。2つのプローブの標的特異的部分が標的配列に正確にアニーリングする場合、フォーク形の開裂構造が形成され、ここで非伸長プローブの標準特異的部分の3’末端は標的配列にアニールされると同時に、標的配列と非補完的である他のプローブの伸長5’末端は一本鎖アームを形成する(図7A参照)。こうして得られるフォーク形の開裂構造は、DNAポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性のための基質であり、本明細書では開裂剤、またはクリーブアーゼと呼ばれる。好ましいクリーブアーゼが、5’ヌクレアーゼ活性を有するが、合成活性またはFENエンドヌクレアーゼを欠く修飾DNAポリメラーゼである。かかるフォーク形の開裂構造およびかかるクリーブアーゼの例が、特許文献36および特許文献37(サード・ウェーブ・テクノロジーズ社(Third Wave Technologies))に記載されている。
一部の実施形態においては、本発明の第2のオリゴヌクレオチドプローブは識別子配列をさらに含んで成る。識別子配列は、長さ、配列、または質量が可変である。一部の実施形態においては、合成プライマーは識別子をも含有する。識別子の(または第2および合成プライマーにおける結合識別子の)長さは、0〜1000、好ましくは、0〜500、より好ましくは、1〜100、かつ最も好ましくは、1〜50個のヌクレオチドである。識別子は、非特許文献9によって記載されているようにZIPコード化配列として周知の独自の配列でありうる。識別子は、第2の標的部分と第1のプライマー結合配列との間に配置されうる。識別子を使用し、プローブまたは接続プライマーとの間の長さの差を与えることができるだけではなく、これを使用し、質量ベースの検出のための質量差またはハイブリダイゼーションベースの検出のためのアドレス可能配列(ZIPおよびcZIP)を与えることができる。好ましくは、サンプル中の各標的配列のために、対応するプローブおよび/または単位複製配列には独自の識別子配列が提供される。上記のように、識別子配列は、接続プローブおよび/または単位複製配列を提供し、独自の長さ、配列、および/または質量で識別するという点で独自でありうる。
伸長合成プライマーの増幅を促進するために、プライマー結合部位が合成プライマーおよび第2のプローブに組込まれうる。プライマー結合部位は、好ましくは、それぞれの標的部分とは別の合成プライマーおよび第2のプライマー、好ましくは、標的配列と実質的に非補完的であるタグ部分に配置されている。プライマー結合部位は、プライマーに結合し、プライマー伸長また増幅を開始することが可能である。好ましくは、一連のプライマーのグループ内では、プライマー結合部位は普遍的であり、すなわち、プライマー結合部位の所定のグループのみがプローブに組込まれており、AFLP(特許文献63)から周知であるものなど、その3’末端で1つもしくはそれ以上の選択的塩基を含んで成るプライマーなど、限られた数のプライマーから多重プライマーの伸長または増幅を可能にする。一連のプライマーのグループ間では、プライマー結合部位は異なりうる。一部の実施形態においては、異なるプライマー結合部位に結合が可能なプライマーのTmは、一連のプローブのグループ間で異なりうる。
方法のステップ(a)を発端に、異なる標的配列、すなわち少なくとも2つの異なる標的配列の多様性が、ハイブリダイズ条件下に特異的オリゴヌクレオチドプローブ対合の多様性と接触される。オリゴヌクレオチドプローブの対合は、その後に、サンプル中の多重標的配列の好ましくは隣接した補完的部にアニールされる。オリゴヌクレオチドプローブの補完的標的配列に対する特異的アニーリングの方法および条件は技術的に公知である(例えば、非特許文献10)を参照。
標的配列の一部と補完的ではなく、または多すぎるミスマッチを含有するプローブは、サンプルがハイブリダイゼーション条件にさらされると、標的配列とハイブリダイズしないか、または削減された程度にハイブリダイズする。したがって、ライゲーションが起こる可能性は低い。したがって、一般にこれらのプローブから偽ライゲーション産物の数は、十分ではなく、その後の多重増幅中に克服されるように真正のライゲーション産物よりもはるかに小さくなる。したがって、それらは検出されず、またはわずかな程度にしか検出されない。
標的配列の補完的部と実質的に隣接してアニールされる一対の第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの5’−リン酸化末端および3’−水酸化末端はステップ(c)で接続され、技術的に既知の適切な手段によって共有結合を形成する。プローブの末端は、リガーゼ、好ましくは、DNAリガーゼによってホスホジエステル結合へ酵素的に接続される。DNAリガーゼは、補完的鎖での隣接部位で結合された2つのポリヌクレオチド鎖(の末端)間のホスホジエステル結合の形成を触媒することが可能な酵素である。DNAリガーゼは通常、ATP(EC6.5.1.1)またはNAD(EC6.5.1.2)を二本鎖DNAにおけるニックを閉鎖する共同因子として必要とする。本発明における使用に適切なDNAリガーゼは、T4DNAリガーゼ、大腸菌(E.coli)DNAリガーゼ、または好ましくは、例えば、Thernius aquaticus(Taq)リガーゼ、Thermus thermophilus DNAリガーゼ、またはピロコッカス(Pyrococcus)DNAリガーゼのような熱安定性リガーゼである。あるいは、適切に修飾されたポリヌクレオチド末端の化学的ライゲーションを使用し、標的配列の補完的部における隣接部位でアニールされた2つのオリゴヌクレオチドプローブをライゲートすることができる。修飾ポリヌクレオチド末端における例示的な反応基としては、ホスホロチオエートおよびトシルレートまたはヨウ化物、エステルおよびヒドラシド、RC(O)S、ハロアロキル、RCH2S、および[アルファ]−ハロアシル、チオホスホリルおよびブロモアセトアミド基、およびS−ピバロイルオキシメチル−4−チオチミジンが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、インデルスの識別に関する代わりの実施形態においては、第1および第2のプローブの補完的部分のそれぞれの末端が、1つもしくはそれ以上のヌクレオチドのギャップがそのままであるようにアニールされうる。このギャップは、適切な(第3)のオリゴヌクレオチドで充填され、ライゲートされうる。かかる方法は「ギャップライゲーション」として技術的に周知であり、とりわけ、特許文献58、特許文献59、特許文献60、特許文献61、特許文献62において開示されている。このギャップを充填する別の可能性は、場合により、A、T、C、またはG、またはジ−、トリ−、または他の小さなオリゴヌクレオチドからあらかじめ選択される単一ヌクレオチドと組合せてポリメラーゼおよびリガーゼを使用するプローブの1つの末端の伸長によるものである。標的配列がRNAである場合は、ギャップを充填するさらに別の可能性は、場合により、A、T、C、またはG、またはジ−、トリ−、または他の小さなオリゴヌクレオチドからあらかじめ選択される単一ヌクレオチドと組合せて逆転写酵素およびリガーゼを使用するプローブの1つの末端の伸長によるものである。
そのきわめて広い定義において、標的配列は目的とする任意のヌクレオチド配列でありうる。標的配列は、その判定/検出が、例えば、それが特定の病気もしくは遺伝子構成または疾患を示し、関連し、または表すため望ましい任意の配列でありうる。標的配列は、好ましくは、多型を含有し、表し、またはこれと関連するヌクレオチド配列である。本明細書における多型という語は、2つもしくはそれ以上の遺伝学的に判定される集団における代わりの配列または対立遺伝子の存在を指す。多型マーカーまたは部位は、配列の逸脱が起こる遺伝子座である。好ましいマーカーは、少なくとも2つの対立遺伝子を有し、各々選択集団の1%以上、かつより好ましくは、10%または20%以上の頻度で発生する。多型遺伝子座は1つの塩基対合ほど小さくありうる。多型マーカーとしては、制限断片長さ多型、長さがさまざまな縦列反復配列(VNTR)、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復、およびAluなど挿入要素が挙げられる。第1の識別対立遺伝子型が基準形として適宜指定されており、他の対立遺伝子型は代替または変形対立遺伝子として指定されている。選択集団において最も頻繁に発生する対立遺伝子型はしばしば野性型の形態と呼ばれる。2倍体生物は対立遺伝子型に対して同型または異型でありうる。2対立遺伝子多型は2つの形態を有する。3対立遺伝子多型は3つの形態を有する。単一ヌクレオチド多型は、対立遺伝子配列間の変化の部位である、単一ヌクレオチドによって占有された多型部位で発生する。この部位は通常、対立遺伝子の保存配列(例えば、集団の構成員の1/100または1/1000未満で変動する配列)によって先行され、かつ追随される。単一のヌクレオチド多型は通常、多型部位で1つのヌクレオチドの別の置換により生じる。単一のヌクレオチド多型もヌクレオチドの欠失、または基準対立遺伝子に対するヌクレオチドの挿入からも生じうる。他の多型としては、インデルスと呼ばれる、一部のヌクレオチドの(小さな)欠失または挿入が挙げられる。好ましい標的配列は、AFLP(登録商標)マーカー、すなわち、AFLP(登録商標)で検出可能である多型と関連する標的配列である。
核酸サンプルにおいては、核酸を含んで成る核酸は目的とする任意の核酸でありうる。サンプル中の核酸は通常DNAの形態ではあるが、サンプルに含まれるヌクレオチド配列情報は、例えば、RNA、ポリA+RNA、cDNA、ゲノムDNA、ミトコンドリアまたは葉緑体DNAなどオルガネラDNA、合成核酸、DNAライブラリー、クローンバンク、もしくはその任意の選択または組合せを含む核酸由来でありうる。核酸サンプル中のDNAは二本鎖、一本鎖、および一本鎖DNAに変性された二本鎖DNAでありうる。二本鎖配列の変性により2つの一本鎖断片が生じ、その一方または両方はそれぞれの鎖に対して特異的なプローブによって分析されうる。好ましい核酸サンプルは、cDNA、ゲノムDNA、制限断片、アダプターライゲート制限断片、増幅アダプターライゲート制限断片上の標的配列を含んで成る。AFLP断片すなわちAFLPテンプレート予備増幅において得られる断片。
サンプルが2つもしくはそれ以上の異なる標的配列を含有することが好ましく、すなわち、2つもしくはそれ以上は、サンプル中での標的配列の量ではなく同一性を指す。特に、サンプルは少なくとも2つの異なる標的配列、特に少なくとも10、好ましくは、少なくとも25、より好ましくは、少なくとも50、さらに特に少なくとも100、好ましくは、少なくとも250、より好ましくは、少なくとも500、かつ最も好ましくは、少なくとも1000の追加の標的配列を含んで成る。実際には、分析されうるサンプル中の標的配列の数は、とりわけ、検出されうる単位複製配列の数によって制限される。例えば、サンプル中の第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブの多すぎる異なるセットは、多重増幅ステップの信頼性を損ないうる。
伸長合成プライマーは、プライマー結合部位に対応する一連のプライマーを使用して増幅される。好ましくは、これらのセットは、第1のプライマー結合部位と実質的に同一である配列を有する第1のプライマーと、第2のプライマー結合部位と補完的である第2のプライマーとを含んで成る。好ましい実施形態においては、プライマーの少なくとも1つ、または同じセットのプライマーは、サンプル中の2つもしくはそれ以上の異なる伸長合成プライマーの増幅のために、好ましくは、サンプル中のすべての伸長合成プライマーの増幅のために使用される。かかるプライマーは、これらのプライマーが対応する普遍的なプライマー結合部位を含有するすべての伸長合成プライマー、したがって普遍的なプライマー結合部位を含有するすべてのライゲートされたプローブの増幅をプライムすることが可能であると、しばしば普遍的プライマーと呼ばれる。ステップ(h)の増幅において使用される異なるプライマーは、好ましくは、アニーリングおよびプライミング効率において実質的に同等である。したがって、サンプルにおけるプライマーは、好ましくは、融解温度において20、15、10、5、または2℃未満で異なる。これはオリゴヌクレオチドプローブの補完的部分について上記で概要を示したように達成されうる。補完的部分の配列と異なり、プライマーの配列は標的配列によって左右されない。したがって、プライマー配列は、各四量体1つのA、T、C、およびGを含有するヌクレオチドの四量体からの配列をアセンブリすることによって、またはG/C含量およびプライマーの融解温度が同一またはきわめて類似していることを保証する他の方法によって都合よくデザインされる。プライマー(および第2のプライマーのタグ部分および合成プライマーにおける対応するプライマー結合部位)の長さは、好ましくは、少なくとも12、15、または17個のヌクレオチド、かつ好ましくは、25、30、40個以下のヌクレオチドである。
一部の実施形態においては、本発明の増幅ステップにおいて使用される1つもしくはそれ以上のプライマーは選択的プライマーである。選択プライマーは、本明細書では、プローブにおけるプライマー結合部位と補完的であるその普遍的な配列に加えて、いわゆる「選択的ヌクレオチド」を含んで成る領域を含有するプライマーと定義される。選択的ヌクレオチドを含有する領域は、普遍的プライマーの3’末端に配置されている。
本発明の方法のステップ(h)においては、伸長合成プライマーは増幅され、技術的に周知の適切な核酸増幅法によって標的ヌクレオチド配列を示すものである増幅された(検出可能な)伸長合成プライマー(単位複製配列)を含んで成る増幅サンプルを生成する。核酸増幅法は通常、2つのプライマー、dNTP、および(DNA)ポリメラーゼを使用する。増幅の好ましい方法がPCRである。「PCR」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特異的DNA部分のインビトロ酵素増幅のために迅速な方法である。増幅されるDNAは、サンプルを加熱することによって変性される。DNAポリメラーゼおよび過剰なデオキシヌクレオチド三リン酸塩の存在下、標的配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは新しいDNAをプライムする。ポリメラーゼは、鎖置換活性を発現せず、または少なくとも大幅に発現しないDNAポリメラーゼであることが好ましい。その例は、Amplitaq and Amplitaq Gold(供給者パーキンエルマー(Perkin Elmer)およびAccuprime(インビトロジェン(Invitrogen))である。親鎖に適する、明確な長さの新しい鎖の一連の合成結果は、変性およびアニーリングとともにプライマーにハイブリダイズしうる。変性、アニーリング、および合成の第2のサイクルは、別個の二本鎖産物、正確にプライマー末端間の長さをともに構成する2つの一本鎖産物を生成する。この別個の産物は、それぞれ一連の増幅とともに指数関数的に蓄積する。約20〜30サイクルにわたって、別個の断片の何百万倍の増幅が達成されうる。PCRプロトコールは技術的に公知であり、標準の実験教科書、例えば、非特許文献26において記載されている。本発明の方法におけるPCRの適用の適切な条件は、特許文献63、および非特許文献25において記載されており、この場合、70〜700個のヌクレオチドおよび同一のプライマー結合配列を含有する多重DNA断片が、1つのプライマーセットを使用してほぼ同等の効率で増幅される。
本明細書で使用される「単位複製配列」という語は、伸長合成プライマーの増幅ステップの産物を指す。本明細書で使用される「単位複製配列」という語は、したがって、増幅伸長合成プライマーを指す。2つの標的特異的部分がリガーゼによって接続されるライゲーションステップ後、合成プライマーは接続またはライゲートされたプローブと結合され、伸長される。伸長合成プライマーは、1つもしくはそれ以上のプライマーおよびポリメラーゼと結合されて増幅され、単位複製配列を生成する。ライゲートされたプローブ、プライマー、ポリメラーゼおよび/または他のパラメータおよび変数は、増幅が結果として接続プローブの増幅された線形表現をもたらすようになっている。
本発明の単位複製配列は、適切な検出プラットフォームで検出されうる。異なる標的配列由来の単位複製配列間の判別は、一次パラメータとしての長さ、配列、または質量に基づきうる。標識サンプルの検出は、検出データをもたらす検出器によって実行される。検出器はもちろん、分離が行われる(長さ、質量、もしくは配列、またはその組合せ)一般的なシステムに依存するが、該当する場合は、蛍光または放射性標識などプライマー上に存在する標識にも依存している。
長さベースの検出の多くの例の1つは、電気泳動(キャピラリー電気泳動、スラブ−ゲル電気泳動、固定検出器連続ゲル電気泳動)および好ましくは、アマシャム・バイオサイエンシス社(Amersham Biosciences)から入手可能なMegaBACE装置で実行され、もしくはラブ・オン・チップまたは他のマイクロ・エルイディック(eluidic)デバイスなどナノ技術を使用するキャピラリー電気泳動に基づく検出である。検出される単位複製配列の長さの差は、1つもしくはそれ以上の識別子の使用によって提供されうる。
サンプル中の異なる標的配列間を判別するには、好ましくは、それぞれ対応する単位複製配列の長さの差が使用される。長さに基づく単位複製配列を分離することによって、サンプル中の対応する標的配列の存在が判定されうる。したがって、本発明の好ましい実施形態においては、サンプル中の異なる標的配列由来の単位複製配列間の判別は、サンプルまたは増幅サンプルにおける異なる標的配列に対応するそれぞれの単位複製配列間の長さの差に基づく。
スループットは、多重標識プライマーの使用によって増大しうる。1つのサンプル中の異なる標識の使用と関連する問題の1は、クロストークまたは残留クロストークである。本明細書で使用されるクロストークまたは残留クロストークは、異なる(蛍光)標識の発光スペクトル間の重複を指す。例えば、蛍光染料が使用される場合、各染料は異なる発光(および吸収)スペクトルを有する。1つのサンプル中の2つの染料の場合、これらのスペクトルは重複し、信号の混乱を引き起こしうるが、これらは得られるデータの品質に反する。特にサンプルにおいて検出すべき2つのヌクレオチド断片が異なる標識で標識され、断片の1つが豊富な量で存在するが、その他は微量で存在する場合、残留クロストークは、微量でのみ存在する断片の測定信号が主に、別のサンプルの同じサイズの断片に豊富に含まれる重複発光スペクトルを有する別の標識の発光由来であることをもたらしうる。他の染料の互恵的効果が起こりうるが、この例では、その効果は、それぞれの染料で標識された単位複製配列間に豊富な差のため、おそらく小さい。
多重サンプルのハイスループット方法に達するために、サンプルの数は同様に処理され、それによって、次いで、少なくとも標識および/または長さの差を検出することが可能である多チャンネルデバイスで分析されうる多様の増幅サンプルを生成する。適切なデバイスは本明細書で上記されている。
サンプルには1つもしくはそれ以上の周知の長さのヌクレオチド断片を含んで成るヌクレオチド断片サイズ標準が供給される。ヌクレオチドサイズ標準を調製し、使用する方法は技術的に公知である(例えば、非特許文献10、参照)。かかるサイズ標準は、サンプル中の単位複製配列の適切なサイジング、したがって検出される断片の適切な識別の基礎を形成する。サイズ標準には、好ましくは、すべてのサンプルおよび/またはすべての注入が供給される。サイズ標準は、好ましくは、分析すべき長さの全領域に及びさまざまな長さを含有する。本発明の特定の実施形態においては、単位複製配列のサイズが補間によって導出されうるフランキングサイズ標準を追加することが有利とみなされる。フランキングサイズ標準は、少なくとも2つの標識オリゴヌクレオチド配列を含んで成り、好ましくは、そのうちの1つは最も短い単位複製配列よりも少なくとも1個の塩基短く、好ましくは、最も長い単位複製配列よりも1個の塩基長く、補間を可能にし。サンプル中のさらに長いばらつきの導入を最小限にするサイズ標準である。好ましいフランキングサイズ標準は、最も短い単位複製配列よりも1個のヌクレオチド短く、最も長い単位複製配列よりも少なくとも1個の塩基長く、かつサンプル中に含まれる単位複製配列の標識のために使用される標識と同一である少なくとも1つの染料で標識される1個のヌクレオチドを含有する。
配列ベースの検出プラットフォームの例は、固相および液相マイクロアレイである。好ましくは、独自にアドレス可能なアレイが使用され、ここでプローブは独自の配列(ZIP配列など)を含有し、それによって、単位複製配列はアレイ上の所定のスポットにハイブリダイズされ、ここで補完的ZIP配列が配置されている(cZIP)。アレイベースの検出法は現在、一般的であり、この技術は広く普及しており、当業者は本発明の単位複製配列を検出するために適切なアレイを作成することが可能である。適切なアレイベースの検出法の例は、例えば、特許文献66、特許文献67、特許文献68、特許文献69、特許文献70、特許文献71、特許文献66、特許文献72、およびジーンチップス(Genechips)アレイ、アフィメトリックス(Affymetrix)DNAチップ、およびVLSIPSTMアレイである。本発明のアッセイに特に適切かつ好ましい検出プラットフォームは、とりわけ、特許文献73、特許文献74、特許文献75、特許文献76、特許文献77、及び特許文献78に記載されており、いわゆるパム(Pam)アレイである。
質量ベースのプラットフォームの例は、MALDI−TOFである。各々検出すべき分析物は異なる質量を有する。これは、例えば、第2のプローブまたは合成プライマーにおける制限部位を含んで成る識別子配列の組込みによって達成されうる。伸長合成プライマーが検出前(場合により増幅後)に制限されうると、一連の断片/オリゴヌクレオチドが得られ、各々、サンプル中の標的配列の存在、非存在、または量と関係する異なる質量を有する。
a)核酸サンプルに前記サンプル中で検出すべき各標的配列のための第1のプローブを提供し、それによって前記第1のプローブが標的配列の第1の部と補完的である第1の標的特異的部分を有し、かつ前記サンプル中で検出すべき各標的配列のための第2のプローブを提供し、それによって前記第2のプローブが標的配列の第2の部と補完的である第2の標的特異的部分を有し、それによって前記標的配列の第1および第2の部が互いに隣接して配置され、それによって前記第2のプローブが、前記標的配列に実質的に非補完的であるタグ部分をさらに含んで成り、それによって前記タグ部分が第1のプライマー結合配列を含んで成るステップと、
b)前記第1および第2のプローブの前記第1および第2の標的特異的部分を、前記サンプル中に存在する各標的配列の前記第1および第2の部にアニールさせ、それによって前記プローブの前記第1および第2の標的特異的部分が前記標的配列上で隣接してアニールされるステップと、
c)前記標的配列に隣接してアニールされた前記第1および第2の標的特異的部分を接続し、かつ前記第1および第2の標的特異的部分を接続させ、前記サンプル中の標的配列に対応する接続プローブを生成する手段を提供するステップと、
d)ステップc)から結果として生じる混合物に、前記第1の標的特異的部分の少なくとも一部と補完的である部分および第2のプライマー結合部分を含んで成る合成プライマーを提供するステップと、
e)前記合成プライマーを前記第1の標的特異的部分の少なくとも一部にアニールさせるステップと、
f)前記合成プライマーを伸長するステップと、
g)前記第1のプライマー結合部分と実質的に同一の配列を有する前記第1のプライマーと、前記第2のプライマー結合部分と補完的である第2のプライマーとを含んで成る一連のプライマーを提供するステップと、
h)結果として生じる混合物を増幅し、前記接続プローブを示すものである単位複製配列を含んで成る増幅サンプルを得るステップと、
i)前記対応する単位複製配列の存在、非存在、または量を検出することによって前記サンプルにおける標的配列の存在、非存在、または量を判定するステップと
を含んでおり、
ここで合成プライマーおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも1つが、制限酵素の制限部位をさらに含み、その制限部位は、それぞれのプライマー結合部位と、第1のプローブまたは標的配列の第2の部とそれぞれ補完的であるオリゴヌクレオチドプローブの部分との間に位置し、ここで識別子が制限部位とプライマー結合部位との間に位置し、ここでこの方法は、制限酵素で単位複製配列を消化し、ステップi)の前に検出可能な断片を得るステップを含んでいる。
技術の変形において、多重個体の出発(DNA)物質は、この物質を含有する少ない検出サンプルが検出デバイスに装填される。これは出発物質の特定のプール、例えば特定の形質に対して異なる表現型を有する個体由来の出発物質のプールに特異的である、目的が単位複製配列(SNP対立遺伝子を示すものなど)を識別する連鎖不均衡(LDマッピング)の場合に有利でありうる。
本発明の一態様は、さまざまな用途における方法の使用に関する。本発明に記載の方法の用途は、遺伝子型決定、転写物プロファイリング、遺伝子マッピング、遺伝子発見、マーカー補助選択、種子品質管理、ハイブリッド選択、QTLマッピング、バルクセグレガント分析、DNA指紋法、およびマイクロサテライト分析などの方法において見出されるが、これらに限定されない。別の態様は、標的核酸配列の量的存在度の同時のハイスループット検出に関する。この方法は一般的にバルクセグレガント分析(BSA)として周知である。
本発明による方法の1つの特定の好ましい用途は、単一ヌクレオチド多型(SNP)の検出にある。本発明による対合の第1のオリゴヌクレオチドプローブ(および好ましくは第1のプローブ)は、好ましくは、多型部位、すなわち単一の多型ヌクレオチドに隣接して配置されている標的配列の一部と補完的である一部を含んで成る。本発明による対合の第2のオリゴヌクレオチドプローブ(および好ましくは第2のプローブ)は、その末端塩基が多型部位、すなわち単一の多型ヌクレオチドに隣接して配置されているように標的配列の一部と補完的である。末端塩基が標的配列における多型部位で存在するヌクレオチドと補完的である場合は、これは標的配列にアニールし、結果として2つのプローブのライゲーションが生じる。エンドヌクレアーゼ、すなわち、対立遺伝子特異的ヌクレオチドがマッチしない場合、ライゲーションは起こらず、または低レベルのライゲーションのみが起こり、多型は未検出のままである。
標的配列は、ゲノム由来の既知のヌクレオチド配列を含有する。かかる配列は、必ずしも多型を含有することはないが、例えば、遺伝子、プロモーター、遺伝子移入部、または導入遺伝子に対して特異的であり、または生産形質、耐病性、収率、ハイブリッド強勢に関する情報を含有し、ヒト、動物、および植物における腫瘍または他の疾患および/または遺伝子機能を示す。このために、第1のプローブおよび第2のプローブの補完的部は、所望の情報に付随して、ゲノムにおける標的配列に対応し、好ましくは、独自にデザインされている。標的配列における補完的部は、互いに隣接して配置されている。所望の標的配列がサンプルに存在する場合、2つのプローブは隣接してアニールし、合成プライマーのライゲーションアニーリングおよび伸長および増幅後に検出されうる。
AFLPは、その用途および技術が、非特許文献25および特許文献62に記載されており、これらは参照により本明細書で援用される。AFLPの別の説明、その利点、その実施形態、その技術、使用される酵素、アダプター、プライマー、および別の化合物、器具、および定義について、明示的な引例が、AFLPに関する上記の刊行物の関連文章になされている。AFLPおよびその関連技術は、例えば、特定の遺伝子または遺伝子形質の存在を示し、または一般に既知の起源または制限パターンのDNA、cDNA、またはRNAサンプルの比較のために使用されうる識別のための強力なDNA指紋法である。AFLPマーカーは一般に分析すべきヌクレオチド配列における多型部位の存在と関係がある。かかる多型は、制限部位、選択的ヌクレオチドに、例えば、インデルスもしくは置換基の形で存在し、または制限断片の残りの部分、例えばインデルスもしくは置換基の形で存在しうる。AFLPマーカーがそのようなものとして識別されると、AFLPマーカーと関係がある多型は識別されうるとともに、本発明のライゲーションアッセイにおいて使用されるプローブが開発されうる。
DNAを4個の同型トマト系の葉材料から本質的に周知の、例えば実質的に特許文献63=欧州特許第0534858号明細書に記載されている方法を使用して単離し、1XTE(1mM EDTA含有10mM Tris−HCl pH8.0)溶液中に保存した。濃度を標準の手順を使用して分光光度計(MERK)のUV測定によって判定し、1XTEを使用して100ng/μlに調節した。
選択SNPを識別し、テーブル1に示す。
オリゴヌクレオチドプローブ(5’−3’配向)を選択し、実施例2に記載されているSNP遺伝子座の各々のSNP対立遺伝子を判別した。プローブのすべてを5’末端でリン酸化する。配列はテーブル2Aおよびテーブル2Bに示されている。第1のプローブの1グループはチオエートリンケージを含有し、プローブにエクソヌクレアーゼ耐性を与える(太字で表示、3個の最大3’ヌクレオチド、テーブル2A)。第1のプローブの別のグループは3’末端でビオチニル化される(テーブル2B)。
合成プライマー(5’−3’配向)を選択し、実施例3に記載されている第1のプローブにハイブリダイズした。PCR結合領域は下線で示され、第1のプローブ特異的配列は二重下線で示されている。配列はテーブル3に示されている。
PCR増幅に使用されるプライマーの1つの配列は、実施例4に記載されている合成プライマーに組込まれたPCRプライマー結合領域と補完的であった。第2のPCRプライマーの配列は、実施例3における第2のプローブのPCRプライマー結合領域にマッチした。通常、順方向プライマーは標識されている。オリゴヌクレオチドの濃度は50ng/μlに調節された。5’−3’配向におけるプライマーの配列は下記表2のテーブル5に示されている。
同型トマト系(実施例1)の4つのサンプル(サンプル1−4)を20個のプローブ(遺伝子座当たりプローブ2個)の混合物を使用して多重オリゴヌクレオチドライゲーション反応にかけた。使用条件は、容積10μl中の各プローブの1×Taq DNAリガーゼバッファー(NEB)、0.2U/μl Taq DNAリガーゼ、および0.05fmol/μlであった。ライゲーションをサーモサイクラー(パーキンエルマー(Perkin Elmer)において以下のサイクル条件で実行した。すなわち、2分を94℃+10*(15秒を94℃+60分を60℃)+4℃連続。ライゲーション後、10μlライゲーション産物を30μl 1×Taq DNAリガーゼバッファーで希釈した。
1×Taq DNAリガーゼバッファー
20mM Tris−HCl
25mM 酢酸カリウム
10mM 酢酸マグネシウム
10mM DTT
1mM NAD
0.1%Triton X−100
(pH 7.6@25℃)
20mM Tris−HCl(pH8.4)
50mM KCI
1.5mM MgCl2
0.2mM dGTP、dATP、dTTP、およびdCTP
熱安定性AccuPrime(商標)プロテイン
10%グリセロール.
MegaBace1000キャピラリーシークエンシング機器を使用する検出の場合、PCR反応混合物の脱塩および精製を96ウェルフォーマットで以下の手順を使用して行った。
サンプル調製:
ET−900Roxサイズ標準(アマシャム・バイオサイエンシス(Amersham Biociences)の800倍希釈を水中で行った。希釈ET−900Rox 8μlを精製サンプル2μlに添加した。実行前に、サイジング標準を含有するサンプルを1分間94℃下にインキュベーションによって加熱変性させ、その後に氷上に置いた。
MegaBACEキャピラリーを1XLPA(アマシャム・バイオサイエンシス(Amersham Biociences)、Piscataway、ニュージャージー州(NJ)、米国)でメーカーの指示に従って充填した。サンプルの界面動電注入のパラメータは以下のとおりであった。すなわち、3kVで45秒。実行パラメータは10kVで10分間であった。実行後、クロストーク補正、ピークの平滑化、およびクロストーク補正をGenetif Profilerソフトウェア、バージョン1.0製造20001017(モレキュラー・ダイナミックス(Molecular Dynamics)、サニーベール(Sunnyvale)、カリフォルニア州(CA)、米国)を使用して行い、電気泳動図を作成した。
本発明のプローブを試験し、最近開発され、従来のリニアまたは南京錠プローブよりも優れていることがわかっている別の種類のプローブと比較した。この種類のプローブは、その内容が本明細書で参照により援用される、PCT/NL0300444として2004年7月17日出願の別の特許出願の主題である。「キーロック」で示されたプローブも本出願のテーブル5で示されている。本発明のプローブは、3つのセット、すべて10個の合成プローブを含有するセット1(テーブル4、遺伝子座31−40)、5個のプローブを含有するセット2(テーブル4、遺伝子座31、33、35、37、39)、および5個の他の合成プローブを含有するセット3(テーブル4、遺伝子座32、34、36、38、40)に分割した。同型トマト系(実施例1)のサンプル2個を20個のプローブ(遺伝子座当たりプローブ2個)の混合物を使用して多重オリゴヌクレオチドライゲーション反応にかけた。使用条件は、容積10μl中の各プローブの100ngDNA、1×Taq DNAリガーゼバッファー(NEB)、0.2U/μl Taq DNAリガーゼ、および0.05fmol/μlであった。ライゲーションをサーモサイクラー(パーキンエルマー(Perkin Elmer)において以下のサイクル条件で実行した。すなわち、2分を94℃+10*(15秒を94℃+60分を60℃)+4℃連続。ライゲーション後、10μlライゲーション産物を30μl 1×Taq DNAリガーゼバッファーで希釈した。
クリーブアーゼ−ライゲーション法の実行可能性を証明するために、テーブル2A(配列ID#)からのプローブを配列「CACAC」を有する別の領域によりその5’末端で伸長した。伸長プローブをテーブル3の第2のプローブと結合し、上記のハイブリダイゼーションおよびライゲーションプロトコールにかけ、ここで酵素(リガーゼとクリーブアーゼの両方(サード・ウェーブ社(Third Wave Inc.)から入手され、1〜10マイクロリットルの量で「そのままで」使用)を添加した。結果として生じる混合物をサーモサイクラー(パーキンエルマー(Perkin Elmer)において以下のサイクル条件でインキュベートした。すなわち、4分を94℃+240分を60℃+4℃連続。その後、混合物を実施例6に記載した条件下に増幅した。予想産物が確認され、すなわち、伸長されなかったテーブル3の第2のプローブで得られた結果に対応する長さのライゲートされたプローブであり、クリーブアーゼステップとライゲーションステップが成功したことを示し、方法が機能していることを示した。実験は酵素の非存在下(その組合せ)で行った。これらの実験は両方の酵素が、このプローブ型がライゲート型プローブに達するために必要であることを証明した。
Claims (26)
- 核酸サンプルにおける標的ヌクレオチド配列の存在、非存在、または量を判定するための方法であって、前記方法が、
a)核酸サンプルに前記サンプル中で検出すべき各標的配列(T)のための第1のプローブ(1)を提供し、それによって前記第1のプローブが標的配列(5)の第1の部と補完的である第1の標的特異的部分(4)を有し、かつ前記サンプル中で検出すべき各標的配列のための第2のプローブ(2)を提供し、それによって前記第2のプローブが標的配列(7)の第2の部と補完的である第2の標的特異的部分(6)を有し、それによって前記標的配列の第1および第2の部が互いに(3)隣接して配置され、それによって前記第2のプローブが、前記標的配列に実質的に非補完的であるタグ部分(8)をさらに含んで成り、それによって前記タグ部分が第1のプライマー結合配列(10)を含んで成るステップと、
b)前記第1および第2のプローブの前記第1および第2の標的特異的部分を、前記サンプル中に存在する各標的配列の前記第1および第2の部にアニールさせ、それによって前記プローブの前記第1および第2の標的特異的部分が前記標的配列上で隣接してアニールされるステップと、
c)前記標的配列に隣接してアニールされた前記第1および第2の標的特異的部分を接続し、かつ前記第1および第2の標的特異的部分を接続させ、前記サンプル中の標的配列に対応する接続プローブ(11)を生成する手段を提供するステップと、
d)ステップc)から結果として生じる混合物に、前記第1の標的特異的部分の少なくとも一部と補完的である部分(15)および第2のプライマー結合部分(14)を含んで成る合成プライマー(12)を提供するステップと、
e)前記合成プライマーを前記第1の標的特異的部分の少なくとも一部にアニールさせるステップと、
f)前記合成プライマーを伸長するステップと、
g)前記第1のプライマー結合部分と実質的に同一の配列を有する前記第1のプライマー(18)と、前記第2のプライマー結合部分と補完的である第2のプライマー(17)とを含んで成る一連のプライマーを提供するステップと、
h)結果として生じる混合物を増幅し、前記接続プローブを示すものである単位複製配列(19)を含んで成る増幅サンプルを得るステップと、
i)前記対応する単位複製配列の存在、非存在、または量を検出することによって前記サンプルにおける標的配列の存在、非存在、または量を判定するステップと
を含んでいることを特徴とするヌクレオチド配列の検出方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記第1、第2、または前記第1および第2のプライマーの前記合成プライマーとのモル比が10〜1000であることを特徴とする方法。
- 請求項1または2に記載の方法において、前記第1および第2のプライマーが、ステップf)における合成プライマーの伸長前にステップc)から生じる混合物に提供されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法において、前記化合物が、前記第2の標的特異的部分と補完的である部分をさらに含んで成ることを特徴とする方法。
- 請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法において、前記プライマー結合部位が普遍的なプライマー結合部位であることを特徴とする方法。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法において、前記第1および第2のプライマーの少なくとも1つが選択的プライマーであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法において、前記サンプル中の標的配列に対応する単位複数配列が、前記サンプル中の異なる標的配列に対応する単位複数配列と長さ、質量、または標識が異なることを特徴とする方法。
- 請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法において、前記タグ部分が識別子配列を含んでいることを特徴とする方法。
- 請求項8に記載の方法において、前記サンプル中の各標的配列の対応する単位複製配列には独自の識別子配列が備わっていることを特徴とする方法。
- 請求項1〜9のいずれか1つに記載の方法において、サンプル中の標的配列の存在、非存在、または量が、分子量、長さ、標識、または配列に基づく接続プローブを示す単位複製配列を検出することによって検出されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法において、前記識別子が分子量、長さ、または配列の差を提供することを特徴とする方法。
- 請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法において、前記標的配列が、DNA、RNA、mRNA、ポリA+RNA、cDNA、ゲノムDNA、ミトコンドロアまたは葉緑体DNAなどオルガネラDNA、DNAライブラリー、クローンバンク、またはそのいずれかの選択物または組合せより成る群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜12に記載の方法において、前記第1のプローブがさらに第1のクランプ部分を含んで成り、かつ第2のプローブがさらに第2のクランプ部分を含んで成り、ここで前記第1および第2のクランプ部分が互いにハイブリダイズが可能なことを特徴とする方法。
- 請求項1〜13に記載の方法において、前記第1または第2のプローブが、別の領域が前記標的核酸配列の前記第1と第2との接合部位の位置で前記第1または第2のプローブの端に位置している前記標的核酸配列にアニーリングが可能ではない領域をさらに含んで成る、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記別の領域が開裂構造の生成が可能であり、それによって開裂構造の開裂剤への露出により、開裂構造および開裂剤が開裂が起こりうる条件下にインキュベートされると開裂構造の開裂が生じることを特徴とする方法。
- 請求項1〜15のいずれか1つの方法を標的ヌクレオチド配列の多様性のハイスループット検出のために使用することを特徴とする使用方法。
- 請求項16に記載の使用方法において、多型、好ましくは、単一ヌクレオチド多型の検出のために用いることを特徴とする使用方法。
- 請求項16または17に記載の使用方法において、転写物プロファイリング用、標的核酸配列の量的存在量の検出用、遺伝子マッピング、遺伝子発見、マーカー補助選択、種子品質制御、ハイブリッド選択、QTLマッピング、バルクセグレガント分析、DNA指紋法用、および形質、耐病性、収量、ハイブリッド強勢、かつ/または遺伝子機能に関する情報を開示するために使用することを特徴とする使用方法。
- 請求項1〜15のいずれか1つの方法に使用されることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブ。
- 請求項1〜15のいずれか1つの方法に使用されることを特徴とする2つもしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブのセット。
- 請求項1〜15のいずれか1の方法に使用されることを特徴とする合成プライマー。
- 請求項20に記載の2つもしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブのセットの使用であって、前記セットが単一ヌクレオチド多型の各対立遺伝子のプローブを含んでいりことを特徴とする使用方法。
- 請求項1〜15のいずれか1つに記載の方法における使用に適したオリゴヌクレオチドプローブを含んでいることを特徴とするキット。
- 請求項1〜15のいずれか1つに記載の方法において使用するためのプライマーを含んでいることを特徴とするキット。
- 請求項1〜15のいずれか1つに記載の方法において使用するための合成プライマーを含んでいることを特徴とするキット。
- 請求項23、24、および25のいずれかに記載のキットにおいて、請求項1〜15のいずれか1つに記載の方法で使用するためのプライマーおよび/またはオーステナイトオリゴヌクレオチドプローブおよび/または合成プローブを含んでいることを特徴とするキット。
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