JP2007516236A - 哺乳類の皮膚の美化及び/又は改善のための無毛タンパク質相互作用パートナー複合体及びその方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、無毛タンパク質相互作用パートナー(HR−IP)、作用物質及び/又は拮抗物質活性を示す化合物、これらを含む組成物及び製品、並びにその方法に関する。変更され、改善された酵母ツーハイブリッドシステム(上記で考察された)が、無毛タンパク質とのタンパク質相互作用パートナーを同定するために使用された。酵母ツーハイブリッドシステムは、一般に、酵母で発現した2つの融合タンパク質の関連を測定する。酵母で発見された相互作用は、生理学的条件下で起こるであろう潜在的な相互作用を示す。
無毛(HR)遺伝子は、多数の組織、主に皮膚に発現し、HR遺伝子の突然変異は、典型的な皮膚表現型の無毛マウスに関与している。突然変異HRマウス株は、特にT細胞及びマクロファージに関与する免疫欠如、並びに加齢に関連した免疫不全症及び胸腺の促進的萎縮を示す。(参照:無毛rhino−j(hr/rh−j)マウスの胸腺(The thymus of the hairless rhino-j(hr/rh-j)mice)。ホセ(Jose)ら、解剖学ジャーナル(J Anat)2001年4月、198(Pt4):399〜406)。
本発明の第1態様によると、マウスHRtタンパク質−ヒト相互作用パートナータンパク質複合体を含む組成物であって、ヒト相互作用パートナータンパク質が、ホモサピエンスケラチン5、オキシステロール受容体LXR−β、活性化STAT−1のホモサピエンスタンパク質阻害物質(PIAS1)、ストローマ抗原2のホモサピエンス類似物、ホモサピエンスヌクレオポリン160kD(NUP160)、ヒトレチノイン酸受容体γ−1、ホモサピエンス甲状腺ホルモン受容体α、ホモサピエンスアネキシンA1(リポコルチン−1又はP35)、ホモサピエンスHICタンパク質アイソフォームp32及びHICタンパク質アイソフォーム40、ホモサピエンスインスリン様増殖因子結合タンパク質6、ホモサピエンス内膜タンパク質ミトコンドリア(ミトフィリン(Mitofilin))、ホモサピエンス仮定的タンパク質、活性化STAT−3のホモサピエンスタンパク質阻害物質(PIAS3)、ホモサピエンスDEAD/H(Asp−Glu−Ala−Asp/His)Boxポリペプチド3、ホモサピエンスDpy−30様タンパク質、マウスビタミンD受容体(VDR)、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される分子を含む組成物が提供される。本明細書で開示されている分子は、下記で記載される、変更された酵母ツーハイブリッド技術を利用して同定されている。事実、前述の分子は、試験剤をスクリーニングするため、並びに哺乳類の皮膚に物質的美化及び改善を送り届ける化合物を同定するために有効である。
本発明の第2態様によると、HR−IP複合体に拮抗物質及び/又は作用物質活性を示す化合物が開示され、特許請求されている。当然のことながら、先行のセクションで記載されたヒト相互作用パートナータンパク質が、HR−IP複合体に結合するように適合されている拮抗物質及び/又は作用物質化合物をスクリーニングするために利用されてもよい。前記化合物とHR−IP複合体との相互作用は、哺乳類の皮膚に物質的な美化及び/又は改善利益の1つ以上を送り届けるために、消費者用及びその他のための組成物及び製品におけるそれらの使用を促進する。本発明の拮抗物質及び/又は作用物質化合物は、新規アッセイ(下記で記載される)を使用して同定されてもよく、次に本明細書で開示されている他の方法を使用して精製されてもよい。
HR−IP複合体又はHR−IP複合体をコードする核酸は、HR−IP複合体に結合する化合物をスクリーニングするために使用されてもよく、従ってそのような化合物は、HR−IP複合体の作用物質又は拮抗物質としての使用を有する。従って本発明は、HRと相互作用パートナーとの相互作用を増強するか又は阻害するかのいずれかである分子を検出するアッセイを提供する。そのような分子は、例えば、小型の分子、ペプチド、修飾ペプチド、アプタマー、核酸又は修飾核酸であってもよい。HR−IPの活性を調節する分子は、試験分子を、HR及びIPと一緒に接触させる前に、HRと接触させるか又はIPと接触させるかのいずれかによるか、或いはHR、IP及び試験分子の3方向結合させるかによって同定される。HR−IP相互作用の調節は、複合体の安定性、複合体の親和性又は結合、複合体の形成速度、複合体の量、又は複合体の別の機能により測定されてもよい。試験化合物の不在下でのパラメータと比較したこれらのパラメータのいずれかの増加又は減少は、試験化合物が複合体の作用物質又は拮抗物質であることを示している。そのような作用物質又は拮抗物質を同定する方法は、本明細書で記載されている変更された酵母ツーハイブリッドアッセイを使用して実施されてもよいか、又は例えばインビトロで実施されてもよい。
デュアルシステムズ・バイオテック社(Dualsystems Biotech AG)(スイス、チューリッヒ(Zurich)から入手可能なデュアルハイブリッドスクリーンIIパッケージBシステム(DUALhybrid Screen II Package B System)が、ヒトケラチノサイトにおけるHRの相互作用パートナーを同定するために使用された。このスクリーニング法の完全な解説は、デュアルシステムズ・バイオテック(Dualsystems Biotech)から入手することができ、info@dualsystems.comへ電子メールにより依頼を送るか、又はインターネットhttp://www.dualsystems.comを介して入手することができる。このスクリーニング法は、一般に、餌ベクターを作成し、検証する工程、大規模ライブラリーを形質転換し、陽性クローンを選択する工程、陽性クローンを単離し、分析を限定する工程、餌依存性のためにクローンを再形質転換し、試験する工程、及び餌依存性クローンの配列決定する工程を含む。正確なベクターライブラリー(pACT2)の情報、並びに利用される完全なヌクレオチド配列は、クローンテック(Clontech)のウエブサイトhttp://www.clontech.comで入手可能である。
HR−IP複合体は、カラム・クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和、ゲル排除、逆相高圧、高速タンパク質液体など)、分画遠心分離、溶解度の差が挙げられるが、それらには限定されない、当該技術分野において既知の標準的方法によるか、又はタンパク質複合体若しくはタンパク質−核酸複合体の精製に使用される標準的技術により、複合体を発現している天然供給源又は組み換え宿主細胞から単離及び精製されてもよい。相互作用タンパク質のアミノ酸配列は、それをコードしたキメラ遺伝子の核酸配列から差し引くことができる。その結果、タンパク質又はその誘導体は、当該技術分野において既知の標準的化学又は組み換え方法によって合成できる。
本発明のさらに別の態様において、無毛タンパク質相互作用複合体に対して作用物質及び/又は拮抗物質活性を示している化合物は、哺乳類の皮膚に1つ以上の物質的な美化及び/又は改善利益を送り届ける組成物又は製品に配合されてもよい。本発明の方法で同定される拮抗物質活性物質又は作用物質活性物質の組成物中の濃度は、飽和溶液までの広い範囲にわたって変わってもよく、好ましくは0.01重量%〜99重量%である。有効的に適用される最大量は、活性物質が皮膚に浸透する速度により限定される。一般に有効量は、皮膚1平方センチメートル当たり100μg〜3000μgの範囲である。組成物は、哺乳類の皮膚の美化及び/又は改善の知覚される効果を達成するために、2週間から6か月までの間に、1日1回若しくは2回、又はさらにより頻繁に適用されてもよい。
本発明のさらに別の態様において、本明細書で開示されている拮抗物質活性又は作用物質活性化合物は、哺乳類、特にヒトの皮膚にへの投与のための組成物及び/又は製品に配合される。本発明の一つの態様において、本明細書で開示されている局所用製剤は、それらが適用される哺乳類の皮膚の外観を向上させるために適合された、安全且つ有効量の美化及び/又は改善剤、並びに他の成分を含む。
本発明の別の態様において、本発明の拮抗物質活性若しくは作用物質活性物質化合物及び/又は上記の製品の1つ以上を含む製造品は、パーソナルケア、スキンケア、及び家庭用品ケア用途が意図される。本発明の製造品は、消費者用の一組の使用説明とともに容器又はディスペンサー内に包装されてもよい、本明細書上記で記載された1つ以上の製品を包含する。本発明の製造品は、典型的には、(a)容器又はディスペンサー、(b)製品、及び(c)前記製品を適切な基質に適用して物質的な美化及び改善利益を哺乳類の皮膚に送り届けるための一組の使用説明を含む。本発明の製造品に適した容器及び/又はディスペンサーには、PETボトル及びタブ、フローラップ・ポーチ、フォーミングディスペンサー、スプレーディスペンサー、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、それらには限定されない。繰り返すが、本発明の製造品は、容器に関連付けられた一組の使用説明を更に含む。「関連付けられた」とは、製造品の消費者に一組の使用説明を伝えるため、使用説明が、容器若しくはディスペンサー自体の上に直接印刷されているか、又はパンフレット、印刷広告、電子広告及び/若しくは口頭伝達が挙げられるが、それらには限定されない異なる方式で提示されているかのいずれかであることを意味する。
本発明の別の態様において、1つ以上の物質的な美化及び/又は改善利益を哺乳類の皮膚に送り届ける、特許請求されている化合物、組成物及び製品の使用方法が開示されている。本発明の一つの態様において、哺乳類の皮膚を改善する及び/又は美しくする方法が開示されている。前記方法は、1つ以上の作用物質及び/又は拮抗物質化合物を改善及び/又は美化が望ましい哺乳類の皮膚の一部分に送達する工程、及び任意に前記化合物をそれらの送達の後に除去する工程(局所的に投与された場合)を含む。本発明の別の態様において、本発明の作用物質及び/又は拮抗物質化合物を含む組成物及び/又は製品を投与する方法が開示されている。前記方法は、前記組成物又は製品を美化及び/又は改善が望ましい哺乳類の皮膚の一部分に送達する工程、及び任意に前記組成物又は製品をその送達の後に除去する工程(局所的に投与された場合)を含む。事実、本明細書で開示されている方法の系統的な使用は、1つ以上の物質的な美化及び/又は改善利益を、本明細書で開示されている方法が使用される哺乳類、特にヒトの皮膚に送り届ける。
実施例1−無毛タンパク質の相互作用パートナー(IP)
本実施例は、酵母ツーハイブリッド技術を使用して、無毛タンパク質(HR)相互作用パートナー(HR−IP)を提供する。HRタンパク質(aa残基490〜1182、以降HRt)の半分のC末端に対応するHRcDNAが、酵母においてLex A DNA BD−HRtを発現するように、デュアルハイブリッド(DUALhybrid)餌部ベクターにクローニングされる。BD−HRtを発現している酵母菌は、活性化ドメイン(AD)ベクターにおけるヒトケラチノサイトcDNAライブラリーにより形質転換される。本発明で提供される得られた相互作用パートナーは、表1で提示されており、これは、細胞周期、細胞分化、転写、核移行、シグナル変換、細胞一体性、及びミトコンドリア機構に関わる分子を含む。従って、HRt(及びHR)は、良好に結合された多機能タンパク質であると思われる。
マウス初期成長期cDNAライブラリーは、プロクター・アンド・ギャンブル(Procter & Gamble)の社員により標準的技術を使用して作成される。大腸菌発現プラスミドpET32a(カタログ番号69015−3、ノバゲン(Novagen)のpET原核発現システムの構成成分プラスミド)及び大腸菌株BL21(DE3)適応細胞(カタログ番号69387−3)は、ノバゲン(Novagen)(ウイスコンシン州マディソン(Madison))から購入される。特注設計オリゴヌクレオチドは、プロクター・アンド・ギャンブル(Procter & Gamble)の社員により標準的技術を使用して合成されるか、又はBDバイオサイエンス・クローンテック(Biosciences Clontech)(カリフォルニア州パロアルト(PaloAlto))により作成される。DNA配列決定は、プロクター・アンド・ギャンブル(Procter & Gamble)の社員により標準的技術を使用して行われるか、又はセクライト社(Seqwright Inc)(テキサス州ヒューストン(Houston))により作成される。DNA配列分析及びデータベースのホモロジー検索は、セクウェブ(SeqWeb)バージョン1.2を(ウイスコンシンパッケージ(Wisconsin Package)バージョン10.1と併せて)使用して、実施される。種々の微生物学的培地が、BDバイオサイエンス・クローンテック(Biosciences Clontech)(カリフォルニア州パロアルト(PaloAlto))及びDIFCOベクトン・ディキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ(Becton Dickinson Microbiology Systems)(メリーランド州スパークス(Sparks))から購入される。大腸菌及び酵母の培養用の予め作られた種々の培地プレートは、ギブソン・ラボラトリーズ(Gibson Laboratories)(ケンタッキー州レキシントン(Lexington))から購入される。マッチメーカー・ツーハイブリッドシステム3(Matchmaker two-hybrid System 3)(カタログ番号K1612−1)、pACT2ベクターにおける形質転換済ヒト脳マッチメーカーcDNAライブラリー(pre-transformed human brain Matchmaker cDNA library in pACT2 vector)(カタログ番号HY4004AH、ロット番号9070550)、アドバンテージ2PCRキット(Advantage 2 PCR kit)(カタログ番号K1910−1)、及びマッチメーカーAD LD−挿入スクリーニング増幅セット(Matchmaker AD LD-insert screening amplimer sets)(カタログ番号9103−1)は、BDバイオサイエンス・クローンテック(Biosciences Clontech)(カリフォルニア州パロアルト(PaloAlto))から購入される。雄マウス(C3H系統)は、ハーラン・ラボ(Harlan Labs)(インディアナ州インディアナポリス(Indianapolis)から購入される。NAIRローション脱毛剤(4マイナス処方)は、地元のウオールグリーン(Walgreen)の店から購入される。ドルゲル・ゲル(Dolgel Gel)(イブプロフェン5%)は、ライフ・エクステンション・インターナショナル・センター社(Life Extension International Center Inc.)(フロリダ州 コーラルゲーブルズ(Coral Gables))から購入される。制限酵素、T4DNAリガーゼ、分子量マーカー、アガロース、及び他の常用の分子生物学試薬は、ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)(メリーランド州ゲイサーズバーグ(Gaithersburg))から購入される。
オリゴヌクレオチドは、発表されたマウスHRの配列(「マウスの無毛遺伝子の構造及び発現(Structure and Expression of the Hairless Gene of Mice)」、ベゴナ(Begona)、M.ら、米国科学アカデミー紀要(J.Proc.Natl.Acad.Sci,USA)91:7717〜7721、1994年)(ジーンバンク(GenBank)受け入れ番号Z32675)に基づいて、マウスHRcDNAの所望の部分のPCR増幅のために設計される。オリゴヌクレオチドは、また、後に続くPCR産物の操作のため、Eco RI、Xba I、Not I及びBam HI制限酵素のための制限酵素認識部位を含有するように設計される。特に、Eco RI及びNot Iのための制限酵素部位(下記で示されているオリゴヌクレオチドで下線が引かれイタリック体になっているものに留意すること)は、後に続くクローニング及び操作に特に有用である。順方向及び逆方向オリゴヌクレオチドプライマー対5’−CCGGAA TTC GTC ACC CAG TGC CAA AGC TGT(配列番号:100)及び5’−CGG GAT CCT CTA GAG CGG CCG CTT ATT ATT TAG CTT CCT GTA ACG CCCC(配列番号:101)が、マウス初期成長期cDNAライブラリーからのHRのヌクレオチド1845〜3923に対応するHRcDNAをPCR増幅するために使用される。PCR増幅はアドバンテージ2PCRキット(Advantage 2 PCR kit)により供給される、標準PCRプロトコールを使用して実施される。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動により分析され、予想された大きさ(約2Kb)を有することが判明している。PCR産物は、Eco RI及びNot I制限酵素で切除されている。制限産物は、ゲル精製され、挿入断片が上流配列とインフレーム融合を起こすように、pET32aのEco RI及びNot I部位に挿入される。得られるプラスミドは、指定のpET32a−HRtである。このプラスミドは、ヌクレオチド配列確認、並びに大腸菌におけるタンパク質発現の両方のために使用される。ヌクレオチド配列は、発表された配列(配列番号:102)の3つの位置における変化(ヌクレオチド位置2166、CからTへの変化は、AGCからAGTへのコドンの変化を引き起こす、ヌクレオチド位置2611、CからTへの変化は、GACからGATへのコドンの変化を引き起こす、ヌクレオチド位置2916、TからCへの変化は、CCTからCCCへのコドンの変化を引き起こす)を明らかにしている。配列番号:103のアミノ酸番号1は、HRタンパク質のC末端部のアミノ酸残基490に対応する。この切断型HR(HRt)cDNAは、HRタンパク質のC末端部のアミノ酸残基490〜1182に対応する。
pET32a−HRtからのHRt挿入断片がEcoRI−Xho Iフラグメント(HRt挿入断片に直ぐ隣接する独自のXho I部位が存在する)として切除され、Y2H−BDベクターpGBKT7(カタログ番号K1612−B、マッチメーカーツーハイブリッドシステム3(Matchmaker two-hybrid System 3)(カタログ番号K1612−1)、BDバイオサイエンス・クローンテック(Biosciences Clontech,)、カリフォルニア州パロアルト(Palo Alto)の構成成分)のEco RI−Sal I部位に挿入して、pGBKT7−HRtを得て、そこでは、HRtは、GAL4 DNA BD(このプラスミドも指定されたGAL4 BD−HRtである)にインフレーム融合している。このプラスミドは、HRt−IP相互作用の作用物質及び拮抗物質について、S.セレヴィシエAH109菌株スクリーニングにおいてAD−IPと組み合わされた(実施例2及び3を参照すること)。しかし、まずIPのためにスクリーニングするため、GAL BDーHRtからのHRtが切除され、デュアルハイブリッド(DUALhybrid)餌ベクター(このプラスミドも指定されたLexA BD−HRtである)に挿入される。
pACT2ベクターにおけるクローンテック(Clontech)ヒトケラチノサイトGAL4cDNAライブラリー(複雑度2.5×106)が、HRt相互作用タンパク質をスクリーニングするために使用された。酵母ツーハイブリッド相互作用(菌株L41)のためのHIS3及びLACZレポーターを有するLeu-、Trp-酵母菌株は、最初に、Trp+表現型のためにLexA BD−HRtプラスミドにより形質転換された。得られたL41/LexA BD−HR形質転換体は、LexA BD−HRtタンパク質の発現を確実するため、またレポーター遺伝子HIS3及びLACZの自己活性化の欠如を確実にするためにスクリーニングされた。この菌株は、ケラチノサイトAD−cDNAライブラリーで形質転換され、陽性相互作用をもつクローンを選択するためにTrp-Leu-His-プレートで平板培養された。選択プレート上に現れたコロニーは、続いてX−GALプレート上でLACZ発現について試験された。合計90個のコロニーが同定された。AD−プラスミドが、90個のクローンから救出され、HRt餌依存性について再試験された。54個の隔離集団が陽性と確認された。陽性クローンは、BD−HRtと相互作用するAD−IP(相互作用パートナー)を含有すると予想される。IPを特徴決定するため、IPの配列が決定され、ヒトゲノムデータベースDNA配列分析と照合され、データベースのホモロジー検索は、セクウェブ(SeqWeb)バージョン1.2を(ウイスコンシンパッケージ(Wisconsin Package)バージョン10.1と併せて)使用して実施される。
AH109が化合物のスクリーニングのために使用された。AH109(マッチメーカーツーハイブリッドシステム3(Matchmaker two-hybrid System 3)(カタログ番号K1612−1)、BDバイオサイエンス・クローンテック(Biosciences Clontech)、カリフォルニア州パロアルト(Palo Alto)の構成成分)は、Y2H相互作用のために望ましい酵母レポーター菌株である。それはADE2、HIS3、lacZ及びMEL1レポーター遺伝子を含有し、これらはそれぞれ異なるGAL4応答性プロモーターを使用する。種々のY2H組み換えプラスミドは、Y2Hシステムの供給元(BDバイオサイエンス・クローンテック(Biosciences Clontech)、カリフォルニア州パロアルト(Palo Alto))により提供される酢酸リチウム媒介酵母形質転換プロトコルを使用して、酵母菌株AH109に導入される。組み合わされたAD及びBDプラスミドのための形質転換体は、Leu及びTrp二重脱落培地(DDO)で増殖する能力に基づき選択される。
種々の試験化合物の存在下でのLeu、Trp、HisのTDO中で増殖するAH109(BD−HRt><AD−IP)菌株のα−ガラクトシダーゼ活性の増加又は減少は、BD−HRt><AD−IP相互作用の作用物質又は拮抗物質のスクリーニングに使用される。化合物の多様なライブラリーがスクリーニングされる。
相対的活性=〔OD410exp−OD410ref×0.67〕/OD650ref
発明者たちは、甲状腺ホルモン受容体(TR)のような特定のIPによって、BD−HRt><AD−TR構成よりもAD−HRt><BD−TR構成において相互作用がより強力であることを観察した。この観察に基づき、発明者たちは、幾つかのIPが、BD−HRt><AD−cDNAライブラリースクリーニングで検出されずにいる可能性があり、HRtのための追加のIPが、またAD−HRt><BD−cDNAライブラリースクリーニングを使用して検出できると想像する。
Claims (8)
- マウスHRtタンパク質−ヒト相互作用パートナータンパク質複合体を含むことを特徴とする組成物であって、ヒト相互作用パートナータンパク質が、ホモサピエンスケラチン5、ホモサピエンスに遍在する受容体、活性化STAT−1のホモサピエンスタンパク質阻害物質、ストローマ抗原2のホモサピエンス類似物、ホモサピエンスヌクレオポリン160Kda、ホモサピエンスレチノイン酸受容体γ−1、ホモサピエンス甲状腺ホルモン受容体α、ホモサピエンスアネキシンA1、ホモサピエンスHICタンパク質アイソフォームp32及びアイソフォーム40、ホモサピエンスインスリン様増殖因子結合ドメインタンパク質6、ホモサピエンス内膜タンパク質ミトコンドリア、ホモサピエンス小胞体チオレドキシンスーパーファミリーメンバー、活性化STAT−3のホモサピエンスタンパク質阻害物質、ホモサピエンスDEAD Boxポリペプチド3、ホモサピエンスDpy−30様タンパク質、ハツカネズミビタミンD受容体、及びこれらの組み合わせから選択される分子を含むことを特徴とする組成物。
- マウスHRtタンパク質−ヒト相互作用パートナータンパク質複合体を含むことを特徴とする組成物であって、前記ヒト相互作用パートナーが、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16及びこれらの組み合わせから選択される核酸でコードされている、組成物。
- 請求項1の組成物に対する作用物質又は拮抗物質活性について試験化合物をアッセイする方法であって、
a)試験化合物の不在下でマウスHRtタンパク質とヒト相互作用パートナータンパク質との間の相互作用のレベルを測定すること、
b)試験化合物の存在下でマウスHRtタンパク質とヒト相互作用パートナータンパク質との間の相互作用のレベルを測定すること、を含むことを特徴とし、
工程b)で測定されたレベルが工程a)のレベルより大きい場合は、試験化合物は作用物質活性を有し、工程b)で測定されたレベルが工程a)のレベルより小さい場合は、試験化合物は拮抗物質活性を有する、方法。 - 請求項2の組成物に対する作用物質又は拮抗物質活性について試験化合物をアッセイする方法であって、
a)試験化合物の不在下でマウスHRtタンパク質とヒト相互作用パートナータンパク質との間の相互作用のレベルを測定すること、
b)試験化合物の存在下でマウスHRtタンパク質とヒト相互作用パートナータンパク質との間の相互作用のレベルを測定すること、を含むことを特徴とし、
工程b)で測定されたレベルが工程a)のレベルより大きい場合は、試験化合物は作用物質活性を有し、工程b)で測定されたレベルが工程a)のレベルより小さい場合は、試験化合物は拮抗物質活性を有する、方法。 - 哺乳類の皮膚の美化及び/又は改善を、その必要性のある対象で行う方法であって、請求項1の組成物に対して拮抗物質活性を有する化合物を、治療を必要とする哺乳類の皮膚の一部分に適用する工程を含むことを特徴とする方法。
- 哺乳類の皮膚の美化及び/又は改善をその必要性のある対象で行う方法であって、請求項1の組成物に対して作用物質活性を有する化合物を、治療を必要とする哺乳類の皮膚の一部分に適用する工程を含むことを特徴とする方法。
- 哺乳類の皮膚の美化及び/又は改善をその必要性のある対象で行う方法であって、請求項2の組成物に対して拮抗物質活性を有する化合物を、治療を必要とする哺乳類の皮膚の一部分に適用する工程を含むことを特徴とする方法。
- 哺乳類の皮膚の美化及び/又は改善をその必要性のある対象で行う方法であって、請求項2の組成物に対して作用物質活性を有する化合物を、治療を必要とする哺乳類の皮膚の一部分に適用する工程を含むことを特徴とする方法。
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