JP2007509977A - Ｐｓｍａ処方物およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明には、ＰＳＭＡタンパク質の安定な多量体形態、特に、二量体の形態、二量体ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物およびキット、さらには、これらの組成物を生産、精製、および使用する方法が含まれる。このような方法には、二量体ＰＳＭＡに対する抗体を生産させる方法を含むＰＳＭＡを発現する細胞に対する免疫応答を誘発または増強するための方法が含まれ、さらには、前立腺ガンのようなガンを処置する方法が含まれる。１つの態様においては、多量体形態のＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、これらの組成物には、単離されたＰＳＭＡタンパク質が含まれ、その少なくとも５％がＰＳＭＡタンパク質多量体の形態である。

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的には、ガン関連ポリペプチド、ならびに、これらのポリペプチドを含む処方物およびキットの分野に関する。具体的には、本発明は、ＰＳＭＡタンパク質の多量体形態、特に、二量体ＰＳＭＡの処方物、ならびに、それらを処理、精製、生産、および使用する方法に一部関係する。
（発明の背景）
前立腺ガンは、最も一般的なタイプのガンであり、米国では男性についてのガンによる死亡原因の第２位であり、１９９９年には１７９，０００件の症例があり、３７，０００人が死亡したと推定される（非特許文献１）。前立腺ガンと診断された男性の数は、老年男性の集団の拡大の結果として着実に増加しており、この疾患の認識の広まりによってその早期の診断へと繋がっている（非特許文献２）。男性が前立腺ガンを発症する生涯リスクは、白人については５人に１人、アフリカ系アメリカ人については６人に１人である。高リスクのグループは、前立腺ガンについてのポジティブな家族歴がある人、またはアフリカ系アメリカ人によって示される。
生涯にわたって、前立腺ガンと診断された男性の２／３以上がこの疾患で死亡する（非特許文献３）。さらに、前立腺ガンに屈服はしていない多くの患者には、疼痛、出血、および尿路閉塞のような症状を緩和するための持続的な処置が必要である。したがって、前立腺ガンはまた、医療費の負担、および高額な医療費の主原因でもある。
前立腺ガンが局部にとどまっており、患者の平均余命が１０年以上である場合は、前立腺全摘出術がこの疾患の根絶の可能性が一番高い。これまでは、この手法の欠点は、ほとんどのガンが、それが検出される時点までに手術の限界を超えて広がってしまっていることであった。大きい高悪性度の腫瘍を有している患者は、前立腺全摘出術によってうまく処置できる可能性は低い。
放射線治療もまた、前立腺全摘出術に代わるものとして広く使用されている。放射線治療による一般的な処置を施される患者は、高齢者や健康状態の悪い患者であり、高悪性度のより臨床的に進行した腫瘍を有している患者である。特に好ましい手法は外照射療法であり、これには、三次元共焦放射線治療（ここでは、照射領域は、処置される組織の容積に合うように設計される）；組織内照射治療（ここでは、放射活性化合物の種子が超音波誘導を使用して埋め込まれる）；および、外照射療法と組織内照射治療の組み合わせが含まれる。
局部にとどまっている進行した疾患を有している患者の処置には、前立腺全摘出術または放射線治療の前もしくは後に、ホルモン療法が利用されている。ホルモン療法は、散在性の前立腺ガンの男性を処置する主要な形式である。睾丸摘出によって血清テストステロン濃度を低下させ、一方で、エストロゲン療法も同様に効果的である。エストロゲン由来のジエチルスチルベストロールは、心血管系毒性を生じるという欠点を有している別の有用なホルモン療法である。性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニストが投与されると、テストステロン濃度は最終的には低下する。フルタミドおよび他の非ステロイド系の抗アンドロゲン薬は、その細胞内受容体に対するテストステロンの結合をブロックする。結果として、これはテストステロンの作用をブロックし、血清テストステロン濃度を増大させて、患者を強いまま維持することができる−−前立腺全摘出術および放射線治療後の有意な問題である。
細胞傷害性を有する化学療法は、前立腺ガンを処置することにおいてはほとんど効果がない。その毒性により、このような治療は高齢の患者には適さない。さらに、前立腺ガンは細胞傷害性薬に対して比較的抵抗性がある。
再発した疾患、またはより進行した疾患もまた、抗アンドロゲン治療で処置される。残念なことに、ほぼ全ての腫瘍はホルモン耐性となり、直ちに有効な治療方法がない状況へと進行する。
Ｌａｎｄｉｓ，Ｓ．Ｈ．ら，「ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．」１９９８年，第４８巻：６−２９ Ｐａｒｋｅｒら，１９９７，「ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．」１９９７年，第４７巻：５−２８０ Ｗｉｎｇｏら，「ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．」１９９６年，第４６巻：１１３−２５
したがって、患者の正常な組織に対しては圧倒的な毒性はなく、前立腺ガン細胞を選択的に排除することにおいて有効である、前立腺ガンの有効な治療方法が必要とされている。
（発明の要旨）
本発明は、一部、ＰＳＭＡタンパク質の多量体形態、特に、二量体の形態、二量体ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物およびキット、さらには、これらの組成物を生産、精製、処理、および使用する方法に関する。
１つの態様においては、多量体形態のＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、これらの組成物には、単離されたＰＳＭＡタンパク質が含まれ、その少なくとも５％がＰＳＭＡタンパク質多量体の形態である。他の実施形態においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上が、ＰＳＭＡタンパク質多量体の形態である。他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体はＰＳＭＡタンパク質二量体である。ここでは、ＰＳＭＡタンパク質二量体は、２つのＰＳＭＡタンパク質の共有結合または非共有結合によって形成される。いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質二量体は、共有結合によって安定なＰＳＭＡ二量体を形成するように操作される。いくつかの実施形態においては、共有結合はジスルフィド結合である。好ましくは、ＰＳＭＡタンパク質二量体は天然に存在するＰＳＭＡ二量体と同じ様式で会合するか、または天然に存在するＰＳＭＡ二量体を認識する抗体を作成するために使用することができる少なくとも１つの抗原性エピトープを形成するような様式で会合する。これらの抗体は、好ましくは、天然に存在するＰＳＭＡ二量体を認識し、ＰＳＭＡ単量体を認識しないか、または、天然に存在するＰＳＭＡ二量体を高い特異性で認識する。本発明のいくつかの実施形態においては、二量体の割合（％）は、ＰＳＭＡタンパク質の総数（単量体、二量体、または他の多量体）に対する二量体形態のＰＳＭＡタンパク質分子の数に関して計算することができる。他の実施形態においては、二量体の割合（％）は、ＰＳＭＡ単量体、ＰＳＭＡ二量体、およびＰＳＭＡ多量体の数に対するＰＳＭＡ二量体の数に関して計算することができる。
いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体には、全長のＰＳＭＡタンパク質（配列番号１）またはそのフラグメントが含まれる。他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体には、ＰＳＭＡの細胞外部分（配列番号１のアミノ酸４４〜７５０）またはそのフラグメントが含まれる。さらに他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体には、配列番号１のアミノ酸５８〜７５０またはそのフラグメントが含まれる。なお他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体には、配列番号１のアミノ酸６１０〜７５０またはそのフラグメントが含まれる。フラグメントは、ＰＳＭＡ、好ましくは、天然に存在するＰＳＭＡ二量体を認識する抗体を作成するために使用することができるＰＳＭＡ多量体を形成することができる。通常は、ＰＳＭＡ多量体はホモ多量体であり、これは、２つ以上のＰＳＭＡ分子が同じであることを意味する。他の実施形態においては、ＰＳＭＡ多量体は、ヘテロ多量体であり、これによれば、ＰＳＭＡタンパク質の少なくとも２つは同じではない。なお他の実施形態においては、複数のＰＳＭＡタンパク質が機能的に同等のタンパク質であることもでき、これによれば、ＰＳＭＡタンパク質は保存的に置換されている。
本発明の別の態様においては、単離された多量体ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が提供され、ここでは、組成物には、単量体ＰＳＭＡタンパク質が３５％未満含まれている。さらに他の実施形態においては、組成物には、単量体ＰＳＭＡタンパク質が２０％未満含まれている。なお他の実施形態においては、組成物には、単量体ＰＳＭＡタンパク質が１５％未満含まれている。さらに他の実施形態においては、組成物には、単量体ＰＳＭＡタンパク質が５％未満含まれている。いくつかの好ましい実施形態においては、単離された多量体ＰＳＭＡタンパク質は単離された二量体ＰＳＭＡタンパク質である。
本発明のいくつかの態様においては、ＰＳＭＡの多量体への会合、特に、二量体会合を保存または促進する因子および組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、これらの因子として、金属イオン、塩、またはｐＨ調節因子が挙げられる。多量体ＰＳＭＡへの会合を保存または促進するこれらの因子は、個々がそのように行うことができ、また組み合わせにおいてそのように行う場合もある。したがって、本発明の別の態様においては、金属イオンと組み合わせてＰＳＭＡタンパク質多量体を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、これらの組成物には、ＰＳＭＡタンパク質（その形態にはかかわらず、全ＰＳＭＡタンパク質）に対して少なくとも０．２５モル等量の金属イオンが含まれる。他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質に対して少なくとも０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．３、１．５、１．７、２、３、４、５、またはそれ以上のモル等量の金属イオンが、組成物に存在する。他の実施形態においては、金属イオンは、ＰＳＭＡタンパク質に対してモル過剰で存在する。いくつかの好ましい実施形態においては、提供される組成物にはキレート化剤は含まれない。
本発明のなお別の態様においては、ＰＳＭＡタンパク質の多量体への会合を促進または保存する溶液中にＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質の多量体への会合を促進または保存する溶液は、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液である。他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液は、４から８までの範囲のｐＨを有している。さらに他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液は、５から７までの範囲のｐＨを有している。他の実施形態には、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液が５．５から７の範囲のｐＨを有している組成物が含まれる。さらに他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液は６のｐＨを有している。
本発明のさらに別の態様においては、ＰＳＭＡタンパク質の多量体への会合を促進または保存する溶液中にＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が提供され、ここでは、溶液には塩が含まれる。いくつかの実施形態においては、塩の陽イオン性成分は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、またはそれらの組み合わせであり、塩の陰イオン性成分は塩化物、硫酸塩、酢酸塩、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態においては、塩は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫酸アンモニウムである。いくつかの実施形態においては、塩は５０ｍＭから２Ｍの範囲の濃度で存在する。他の実施形態においては、塩は１００ｍＭから３００ｍＭの範囲の濃度で存在する。さらに他の実施形態においては、塩は、１５０ｍＭの濃度で存在する。
本発明のなお別の態様においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液中にＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が提供され、ここでは、溶液には金属イオンが含まれる。いくつかの実施形態においては、金属イオンは亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせである。さらに他の実施形態においては、金属イオンは、亜鉛イオンおよびカルシウムイオンである。なお他の実施形態においては、亜鉛イオンとカルシウムイオンは、０．１ｍＭから５ｍＭの範囲の濃度で存在する。さらに他の実施形態においては、亜鉛イオンは、カルシウムイオンの濃度よりも低い濃度で存在する。いくつかの実施形態においては、亜鉛イオンは０．１ｍＭの濃度で存在し、カルシウムイオンは１ｍＭの濃度で存在する。他の実施形態においては、金属イオンはマグネシウムイオンである。これらの実施形態のいくつかにおいては、マグネシウムイオンは、０．１ｍＭから５ｍＭの範囲の濃度で存在する。他の実施形態においては、マグネシウムイオンは０．５ｍＭの濃度で存在する。別の実施形態においては、金属イオンはマグネシウムイオンおよびカルシウムイオンである。好ましい実施形態においては、組成物にはキレート化剤は含まれない。
本発明のさらなる態様においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液中に単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が提供され、ここでは、溶液には、（ａ）５から２０ｍＭのリン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせ、（ｂ）１００から３００ｍＭの塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウム、および（ｃ）０．１から２ｍＭの少なくとも１つの金属イオンが含まれる。１つの実施形態においては、溶液は、４から８までの範囲のｐＨを有する。別の実施形態においては、溶液は、５から７までの範囲のｐＨを有する。さらに別の実施形態においては、溶液は、６から６．５までの範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態においては、金属イオンは亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせである。
本発明のさらに別の態様においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液中に単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が提供され、ここでは、溶液には、（ａ）１．４７ｍＭのリン酸ニ水素カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）、（ｂ）８．１ｍＭのリン酸ニナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｄｉｂａｓｉｃ）、（ｃ）２．６８ｍＭの塩化カリウム、（ｄ）０．１４Ｍの塩化ナトリウム、（ｅ）０．９ｍＭの塩化カルシウム、および（ｆ）０．４９ｍＭの塩化マグネシウムが含まれ；そして溶液は、７．０のｐＨを有する。１つの実施形態においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質は、０．２ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度である。さらなる実施形態においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質は、２ｍｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬの間の濃度である。他の実施形態においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０，１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２２、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上の濃度である。別の実施形態においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質は０．２ｍｇ／ｍＬの濃度である。さらなる実施形態においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質は２ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態においては、提供される組成物には、さらに、アジュバントが含まれる。１つの実施形態においては、アジュバントは、サポニンベースのアジュバントである。別の実施形態においては、サポニンベースのアジュバントはＱＳ−２１である。いくつかの実施形態においては、アジュバントは、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０，１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００μｇまたはそれ以上の量で存在する。１つの実施形態においては、ＱＳ−２１は、５０μｇから１５０μｇの間の量で存在する。別の実施形態においては、ＱＳ−２１は、５０μｇの量で存在する。別の実施形態においては、ＱＳ−２１は、１００μｇの量で存在する。いくつかの実施形態においては、このような組成物が被験体に投与される場合には、アジュバントの量は被験体に対する１回の用量あたりのアジュバントの量である。
本発明の別の態様においては、ＰＳＭＡタンパク質の多量体への会合、特に、二量体会合を促進または保存する因子をもまた含む、ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が提供される。ここでは、組成物は、−８０℃で保存された場合に安定である。本発明の１つの態様においては、組成物は、−２０℃で保存された場合に安定である。さらに他の態様においては、組成物は、４℃で保存された場合に安定である。本発明のなお別の態様においては、組成物は、室温で保存された場合に安定である。
本発明の別の態様により、ＰＳＭＡタンパク質の溶液を得ること、およびｐＨを４から８の範囲に調節することによって、溶液中のＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、ｐＨは５から７の範囲に調節される。他の実施形態においては、ｐＨは、５．５から７の範囲に調節される。なお他の実施形態においては、ｐＨは６に調節される。
本発明の別の態様においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体の形成を促進または保存するために有効な量で、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する第１の因子と、溶液中のＰＳＭＡタンパク質を接触させることによってＰＳＭＡタンパク質を処理する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体の形成を促進または保存するために有効な量は、溶液中のＰＳＭＡタンパク質の少なくとも５％を、二量体の形態に促進または維持するために十分な量である。他の実施形態においては、溶液中のＰＳＭＡタンパク質の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上が二量体の形態である。二量体形態のＰＳＭＡの割合（％）は、種々の形態のＰＳＭＡタンパク質の総量に対して計算される。言い換えると、割合（％）は、ＰＳＭＡ単量体、二量体、および他の多量体の数に対するＰＳＭＡ二量体の数にしたがって計算される。いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する第１の因子は、塩、金属イオン、またはｐＨ調整剤である。塩の陽イオン性成分として、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、またはそれらの組み合わせを挙げることができ、一方、塩の陰イオン性成分としては、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施形態においては、塩は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫酸アンモニウムである。他の実施形態においては、塩は５０ｍＭから２Ｍの範囲の濃度で存在する。さらに他の実施形態においては、塩は１００ｍＭから３００ｍＭの範囲の濃度で存在する。なお他の実施形態においては、塩は、１５０ｍＭの濃度で存在する。本発明のいくつかの実施形態においては、この方法にはさらに、ＰＳＭＡタンパク質溶液を、アジュバントまたは希釈剤と混合することが含まれる。アジュバントまたは希釈剤は、１００ｍＭから３００ｍＭの塩濃度になるように希釈される量で、ＰＳＭＡタンパク質と混合することができる。いくつかの実施形態においては、塩濃度は１５０ｍＭのなるように希釈される。特定の実施形態においては、これは、被験体に溶液を投与する前に行われる。他の実施形態においては、第１の因子は金属イオンであり、金属イオンは、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態においては、金属イオンは、亜鉛イオンおよびカルシウムイオンの組み合わせである。さらに他の実施形態においては、亜鉛イオンとカルシウムイオンは、０．１ｍＭから５ｍＭの範囲の濃度で存在する。なお他の実施形態においては、亜鉛イオンは、カルシウムイオンの濃度よりも低い濃度で存在する。さらなる実施形態においては、亜鉛イオンは０．１ｍＭの濃度で存在し、カルシウムイオンは１ｍＭの濃度で存在する。他の実施形態においては、金属イオンはマグネシウムイオンである。これらの実施形態のいくつかにおいては、マグネシウムイオンは、０．１ｍＭから５ｍＭの範囲の濃度で存在する。さらに他のこれらの実施形態においては、マグネシウムイオンは０．５ｍＭの濃度で存在する。第１の因子が特定のｐＨの溶液であるこれらの実施形態においては、溶液のｐＨは、４から８までの範囲になるように調節される。いくつかの実施形態においては、溶液のｐＨは、５から７までの範囲になるように調節される。さらに他の別の実施形態においては、溶液のｐＨは、５．５から７までの範囲になるように調節される。なお他の実施形態においては、溶液のｐＨは、６になるように調節される。
いくつかの実施形態においては、この方法にはさらに、ＰＳＭＡタンパク質を、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する第２の因子と接触させることが含まれる。ここでは、第２の因子は第１の因子とは異なる。第１の因子とは異なる第２の因子としては、種々のタイプまたは種々のクラスの因子が挙げられる。したがって、第２の因子は、金属イオン、塩、またはｐＨ調整剤であり得る。第１の因子が金属イオンであるいくつかの実施形態においては、第２の因子は、塩、ｐＨ調整剤、または特定のｐＨの溶液であり得る。第１の因子が塩である他の実施形態においては、第２の因子は、金属イオン、ｐＨ調整剤、または特定のｐＨの溶液である。第１の因子がｐＨ調整剤または特定のｐＨの溶液であるさらに別の実施形態においては、第２の因子は金属イオンまたは塩である。なお他の実施形態においては、第１の因子は塩、金属イオン、ｐＨ調整剤、または特定のｐＨの溶液であり得、第２の因子は、同じクラスではあるが、同じクラスの異なるタイプの因子であり得る。例えば、第１の因子が塩化ナトリウムのような塩である場合には、第２の因子もまた、例えば、硫酸アンモニウムのような異なるタイプの塩であり得る。
本発明の別の態様においては、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する因子の存在下でのクロマトグラフィーにＰＳＭＡを含むサンプルを供することによってＰＳＭＡタンパク質を含むサンプルを精製する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡの二量体会合を促進または保存する因子は、金属イオン、塩、または４から８の範囲のｐＨの溶液、あるいはそれらの組み合わせである。好ましい実施形態においては、金属イオンは、カルシウムイオンとマグネシウムイオンの組み合わせである。１つのこのような実施形態においては、カルシウムイオンとマグネシウムイオンは、それぞれが、０．１ｍＭから５ｍＭの範囲の濃度で存在する。さらなる実施形態においては、カルシウムイオンとマグネシウムイオンは、それぞれ、１ｍＭと０．５ｍＭの濃度で存在する。ＰＳＭＡの二量体会合を促進または保存する因子が塩である他の実施形態においては、塩は、５０ｍＭから２Ｍの範囲の濃度で存在する。これらの実施形態のいくつかにおいては、塩は２Ｍの濃度で存在する。ＰＳＭＡの二量体会合を促進または保存する因子が４から８の範囲のｐＨの溶液である、なお他の実施形態においては、溶液のｐＨは５から７の範囲にある。なお他の実施形態においては、溶液のｐＨは６から７．５の範囲にある。
本発明の他の態様においては、第１のカラムにサンプルを載せること、第１のカラムを、塩と金属イオンを含む第１の洗浄溶液で洗浄すること、そして第１のカラムから溶出するＰＳＭＡタンパク質を回収することによって、ＰＳＭＡタンパク質を含むサンプルを精製する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、塩は、洗浄溶液中で３５％を超えない飽和率の硫酸アンモニウムである。
本発明の複数の実施形態においては、この方法にはさらに、ＰＳＭＡタンパク質を含む透析された溶液またはダイアフィルトレーションされた（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅｄ）溶液を生じるように、６から７．５の範囲のｐＨの第１の塩溶液で溶出させられたＰＳＭＡタンパク質を透析またはダイアフィルトレーションすることが含まれる。これらの実施形態のいくつかにおいては、第１の塩溶液は少なくとも５ｍＭの塩濃度を有する。これらの実施形態のさらに他のものにおいては、第１の塩溶液は、ｐＨ７の１０ｍＭのリン酸ナトリウム溶液である。
本発明のさらに他の実施形態においては、この方法にはさらに、溶出させられたＰＳＭＡタンパク質、ＰＳＭＡタンパク質を含む透析された溶液またはダイアフィルトレーションされた溶液を、第２のカラムに載せること、第２のカラムを第２の塩溶液で洗浄すること、そして第２の洗浄液によって溶出させられたＰＳＭＡを回収することが含まれる。いくつかの実施形態においては、第２の塩溶液は、１００ｍＭから２Ｍの塩濃度を有する。これらの実施形態の特定のものにおいては、第２の塩溶液は１０ｍＭのリン酸ナトリウム中の２Ｍの塩化ナトリウムである。さらに他の実施形態においては、第２の塩溶液は６から７．５の範囲のｐＨを有する。
本発明のなお別の実施形態においては、この方法にはさらに、金属イオンの溶液を含む第２の塩溶液によって溶出させられたＰＳＭＡを透析またはダイアフィルトレーションすること、第２の塩溶液によって溶出させられた透析またはダイアフィルトレーションされたＰＳＭＡを第３のカラムに載せること、塩と金属イオンを含む第２の洗浄溶液で第３のカラムを洗浄すること、および溶出させられたＰＳＭＡを回収することが含まれる。これらの実施形態のいくつかにおいては、ｐＨは、精製工程の全てを通じて６から７．５の範囲に維持される。
他の実施形態においては、この方法にはさらに、種々の形態のＰＳＭＡタンパク質を分離することが含まれる。ここでは、種々の形態のＰＳＭＡタンパク質は、ＰＳＭＡの単量体、二量体、または他の多量体形態である。これらの実施形態のいくつかにおいては、種々の形態のＰＳＭＡタンパク質は、サイズ排除（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーによって分離される。
本発明のなお別の態様においては、候補の因子との接触の前に、サンプル中の１つの形態のＰＳＭＡタンパク質の量を決定すること、サンプルを候補の因子と接触させること、接触の後に、サンプル中のその形態のＰＳＭＡタンパク質の量を決定すること、および接触の前と後のサンプル中のその形態のＰＳＭＡタンパク質の量を比較することによる、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する因子を同定する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質の形態は、単量体または二量体である。他の実施形態においては、ＰＳＭＡの形態は、３個以上のＰＳＭＡタンパク質が会合した別の多量体形態であり得る。
本発明の別の態様においては、本明細書中に提供される任意の組成物の有効量を被験体に投与することを含む、ＰＳＭＡを発現する被験体中の細胞に対する免疫応答を誘発または増強するように、被験体を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、発現されるＰＳＭＡは細胞表面上で発現される。他の実施形態においては、方法にはさらに、ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物の１回以上のブースター用量を投与することが含まれる。これらの実施形態のいくつかにおいては、ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物は、ＰＳＭＡタンパク質二量体の組成物である。さらに他の実施形態においては、ブースター用量の組成物にはさらにアジュバントが含まれる。なお他の実施形態においては、ブースター用量の組成物は、本明細書中に提供される組成物のいずれかであり得る。さらに他の実施形態においては、組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄から、皮内、または表皮からの投与によって投与される。本発明のこの態様においては、被験体はガンを有しているか、またはガンのリスクがある。いくつかの実施形態においては、被験体はまたガンについて処置されている。いくつかの実施形態においては、ガンは原発性腫瘍であり、また、転移性のガンでもある。好ましい実施形態においては、被験体は前立腺ガンを有している。いくつかの実施形態においては、被験体は去勢されていない患者であり、好ましくは、一次療法、例えば、前立腺切除術または放射線治療を受けた患者である。１つの実施形態においては、去勢されていない患者は、１８０ｎｇ／ｍＬ以上の血清テストステロン濃度を有している。他の実施形態においては、患者は去勢された患者であり、好ましくは、ホルモン療法が完了した患者である。１つの実施形態においては、去勢された患者は、５０ｎｇ／ｍＬ未満の血清テストステロン濃度を有する。なお他の実施形態においては、被験体は、前立腺ガンの従来のガン治療法を受けた患者である。
本発明の別の態様においては、ガン、例えば、前立腺ガンの被験体を処置する方法が提供される。このような方法には、本明細書中に提供される組成物の少なくとも１つを被験体に投与することが含まれる。１つの実施形態においては、この方法には、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液中に単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物の治療有効量を被験体に投与することが含まれる。ここでは、組成物は、前立腺ガンの処置に有効である。別の実施形態においては、方法にはさらに、アジュバント（好ましくは、単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物中に含まれる）の投与が含まれる。いくつかの実施形態においては、アジュバントは、サポニンベースのアジュバントである。他の実施形態においては、この方法にはさらに、被験体に従来のガンの治療法を施すことが含まれる。従来のガンの治療法としては、外科手術、放射線治療、凍結外科手術、温熱療法、ホルモン療法、または化学療法が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のさらに別の態様においては、ガンの被験体において転移を阻害する方法もまた提供される。このような方法の一例としては、被験体に、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液中に単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物の治療有効量を投与することが挙げられ、ここでは、組成物は、転移を阻害することにおいて有効である。１つの実施形態においては、この方法には、アジュバント（好ましくは、単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物の１つの成分である）の投与もまた含まれる。別の実施形態においては、この方法にはさらに、被験体に対して、従来の前立腺ガンの治療法を施すことが含まれる。
本発明の別の態様においては、被験体に対して、提供される組成物のいずれかの有効量を投与することによって免疫応答を誘発する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、この方法にはさらに、ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物の１回以上のブースター用量を投与することが含まれる。これらの実施形態の特定のものにおいては、ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物は、ＰＳＭＡタンパク質二量体を含む組成物である。さらに他の実施形態においては、ブースター用量の組成物は本明細書中に提供される組成物のいずれかである。なお別の実施形態においては、ブースター用量の組成物にもまたアジュバントが含まれ得る。
本発明の他の態様においては、提供される組成物のいずれかと、使用のための説明書を含むキットが提供される。いくつかの態様においては、キットには、本明細書中に提供される多量体組成物、アジュバント、および混合するための説明書が含まれる。他の態様においては、キットには、本明細書中に提供される組成物の１つ、希釈剤、および混合するための説明書が含まれる。いくつかの実施形態においては、組成物は、バイアル、または隔壁のあるアンプル、または注射器の中に提供される。他の実施形態においては、組成物は凍結乾燥させられた形態である。
本明細書中に提供される組成物にはさらに、治療薬（例えば、サイトカイン、抗ガン剤、アジュバントなど）が含まれ得る。いくつかの実施形態においては、アジュバントはミョウバン；モノホスホリルリピドＡ；サポニン：サポニン画分；サポニンベースのアジュバント（例えば、ＳａｐｏｎＩｍｍｕｎｅ（登録商標））；化学修飾されたサポニン；ＱＳ−７；ＱＳ−１７；ＱＳ−１８；ＱＳ−２１；多糖をベースとするアジュバント（例えば、ＰｏｌｙｓａｃｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標））；合成のアジュバント（例えば、ＳｙｎｔｈＩｍｍｕｎｅ（登録商標）；免疫賦活オリゴヌクレオチド；不完全フロイントアジュバント；完全フロイントアジュバント；ビタミンＥ；生分解性油から調製された水中油エマルジョン；モンタナイド（ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）（例えば、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１およびＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ７２０）；Ｑｕｉｌ Ａ；免疫賦活複合体として知られているＱｕｉｌ Ａとコレステロールのミセル混合物（ＩＳＣＯＭＳ）；ＭＰＬおよびマイコバクテリア細胞壁骨格の組み合わせ；ＥＮＨＡＮＺＹＮ（登録商標）；ＲＣ−５２９；ＲＣ−５２２；ＣＲＬ−１００５；Ｌ−１２１；α−ガラクトシルセラミド；ポリラクチド−コグリコリド（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）（ＰＬＧ）または他の同様のポリマーから構成される生分解性粒子の組成物；酸化アルミニウムまたは酸化鉄のビーズの組成物；あるいはそれらの組み合わせである。アジュバントの他の特異的な例としては、ＱＳ−２１画分、例えば、粗ＱＡ−２１、ＱＡ−２１Ｈ型、ＱＡ−２１−Ｖ１；ＱＡ−２１−Ｖ２；ＱＡ−２１−Ｖ１とＱＡ−２１−Ｖ２の組み合わせ、および化学修飾された形態、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態においては、好ましいアジュバントはＱＳ−２１である。
本明細書中で使用される場合は、「サポニンベースのアジュバント」は、サポニンもしくはその一部をベースとするか、またはサポニンもしくはその一部を含む任意のアジュバントである。したがって、サポニンベースのアジュバントとしては、サポニン、サポニン画分、および修飾されたサポニン（例えば、化学修飾されたサポニン）が挙げられる。
別の実施形態においては、本明細書中に提供される組成物にはまた、ガン治療薬も含まれ得る。ガン治療薬としては、被験体のガンを処置するために使用される任意の薬剤が挙げられる。いくつかの実施形態においては、ガン治療薬は化学療法薬であり、例えば、ドセタキセルである。ガン治療薬としてはまた、抗炎症剤および免疫調節剤も挙げられる。抗炎症剤は、１つの実施形態においては、プレドニソンである。別の実施形態においては、免疫調節剤はサイトカインである。
他の実施形態においては、提供される組成物には、少なくとも１種の緩衝剤も含まれ得る。緩衝剤としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム、リン酸、アスコルビン酸ナトリウム、酒石酸、マレイン酸、グリシン、乳酸ナトリウム、乳酸、アスコルビン酸、イミダゾール、重炭酸ナトリウム、炭酸、コハク酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態においては、提供される組成物にはさらに、遊離のアミノ酸が含まれる。これらの遊離のアミノ酸は、天然に存在するものであっても、また天然に存在しないものであってもよい。いくつかの実施形態においては、遊離のアミノ酸は非酸性の遊離のアミノ酸である。非酸性の遊離のアミノ酸の例としては、グリシン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、アルギニン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
界面活性剤を含むＰＳＭＡタンパク質多量体の組成物もまた提供される。このような界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ドデシルマルトシド（ｄｏｄｅｃｙｌｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、コール酸、ＣＨＡＰＳ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
抗凍結剤、抗酸化剤、保存剤、またはそれらの組み合わせを含む、ＰＳＭＡタンパク質多量体の組成物もまた提供される。抗凍結剤の例としては、糖、ポリオール、アミノ酸、ポリマー、無機塩、有機塩、トリメチルアミンＮ−オキサイド、サルコシン、ベタイン、γ−アミノ酪酸、オクタピン（ｏｃｔａｐｉｎｅ）、アラノピン（ａｌａｎｏｐｉｎｅ）、ストロンビン（ｓｔｒｏｍｂｉｎｅ）、ジメチルスルホキシド、およびエタノールが挙げられる。抗凍結剤が糖である場合は、糖は、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、またはマルトースであり得る。抗凍結剤がポリオールである場合の他の実施形態においては、ポリオールはイノシトール、エチレングリコール、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、マンニトール、または２−メチル−２，４−ペンタン−ジオールであり得る。抗凍結剤がアミノ酸である場合は、アミノ酸はグルタミン酸Ｎａ、プロリン、α−アラニン、β−アラニン、グリシン、リジン−ＨＣｌ、または４−ヒドロキシプロリンであり得る。抗凍結剤がポリマーである場合は、ポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、またはポリビニルピロリドンであり得る。抗凍結剤が無機塩である場合は、抗凍結剤は、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、フッ化ナトリウムであり得る。最後に、抗凍結剤が有機塩である場合は、有機塩は、酢酸ナトリウム、ナトリウムポリエチレン、カプリル酸ナトリウム、プロピオン酸塩、乳酸塩、またはコハク酸塩であり得る。いくつかの実施形態においては、これらの組成物の一部である抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アルキルガレート（ａｌｋｙｌｇａｌｌａｔｅ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、トコフェロール、トコフェロール誘導体、モノチオグリセロール、および亜硫酸ナトリウムが挙げられる。いくつかの実施形態においては、アスコルビン酸誘導体として、アスコルビン酸パルミテート、アスコルビン酸ステアレート、アスコルビン酸ナトリウム、およびアスコルビン酸カルシウムが挙げられ、一方、トコフェロール誘導体としては、ｄ−α−トコフェロール、ｄ−α−酢酸トコフェロール、ｄｌ−α−酢酸トコフェロール、ｄ−αコハク酸トコフェロール、β−トコフェロール、δ−トコフェロール、γ−トコフェロール、およびｄ−α−トコフェロールポリオキシエチレングリコール１０００スクシネートが挙げられる。いくつかの実施形態においては、組成物中に存在する保存剤の例として、塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ）、クロロブタノール、パラベン、チメロサール、ベンジルアルコール、およびフェノールが挙げられる。
いくつかの実施形態においては、組成物は生理学的に許容される組成物である。
いくつかの実施形態においては、液体の形態、または凍結乾燥させられた形態の組成物が提供される。
いくつかの他の実施形態においては、提供される組成物は滅菌のものである。
本発明の他の態様においては、本明細書中に提供される組成物のいずれかと薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物が提供される。
本発明はまた、一部、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、そのような抗体またはその抗原結合フラグメントの１つまたは組み合わせを含む組成物、抗体を生産するハイブリドーマ細胞株、ならびにガンの診断および処置のために抗体またはその抗原結合フラグメントを使用する方法にも関する。
本発明の１つの態様に従うと、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。抗体またはそのフラグメントは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＰＳＭＡ上のその標的エピトープに対する第２の抗体の特異的結合を競合的に阻害する。本発明の第２の態様においては、第２の抗体によって定義される前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）上のエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。本発明の上記の態様のそれぞれにおいて、第２の抗体は、以下からなる群より選択される：ＰＳＭＡ３．７、ＰＳＭＡ３．８、ＰＳＭＡ３．９、ＰＳＭＡ３．１１、ＰＳＭＡ５．４、ＰＳＭＡ７．１、ＰＳＭＡ７．３、ＰＳＭＡ１０．３、ＰＳＭＡ１．８．３、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２４８．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３６０．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１７７．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１６．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４０．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４９．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２０９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２１９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８８．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３３３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．５４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２３２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２９２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３０４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７８．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５２．１。これらの抗体は、（ａ）配列番号２〜７に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号８〜１３に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる軽鎖を含む。
特定の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下からなる群より選択される：ＰＳＭＡ３．７、ＰＳＭＡ３．８、ＰＳＭＡ３．９、ＰＳＭＡ３．１１、ＰＳＭＡ５．４、ＰＳＭＡ７．３、ＰＳＭＡ１０．３、ＰＳＭＡ１．８．３、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２４８．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３６０．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１７７．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１６．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４０．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４９．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２０９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２１９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８８．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３３３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．５４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２３２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２９２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３０４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７８．１、およびＡｂｇｅｎｉｘ ４．１５２．１。他の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号２〜７に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる重鎖と、（ｂ）配列番号８〜１３に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる軽鎖を含む抗体、ならびにその抗原結合フラグメントからなる群より選択される。
さらなる実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記の抗体をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％同一、好ましくは、少なくとも約９５％同一、より好ましくは、少なくとも約９７％同一、なおさらに好ましくは、少なくとも約９８％同一、そして最も好ましくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる。
上記の態様のいくつかの実施形態においては、単離された抗体の抗原結合フラグメントが提供される。抗原結合フラグメントには、（ａ）配列番号１４、１８、２２、２６、および３０に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１６、２０、２４、２８、および３２に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる軽鎖可変領域が含まれる。他の実施形態においては、抗原結合フラグメントには、（ａ）配列番号１５、１９、２３、２７、および３１に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１７、２１、２５、２９、および３３に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
本発明のさらなる実施形態においては、上記抗原結合フラグメントのＣＤＲを含む、抗体の単離された抗原結合フラグメントが提供される。好ましくは、ＣＤＲはＣＤＲ３である。
本発明の別の態様に従うと、上記の単離された抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターが提供される。これらの発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。
特定の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、生存している細胞、例えば、腫瘍細胞または前立腺細胞、好ましくは、ＬＮＣａＰ細胞に結合するその能力について選択される。他の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＳＭＡを発現する細胞の細胞溶解を媒介する。ＰＳＭＡを発現する細胞の好ましい細胞溶解は、エフェクター細胞によって媒介されるか、またはエフェクター細胞の存在下で補体媒介される。
他の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害する。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合するためには細胞の溶解を必要とはしない。
さらなる実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥからなる群より選択されるか、または、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、またはＩｇＥの免疫グロブリン定常ドメインおよび／または可変ドメインを有する。他の実施形態においては、抗体は、二重特異的抗体または多特異的抗体である。
さらに他の実施形態においては、抗体は、組み換え抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、あるいはこれらの混合物である。特に好ましい実施形態においては、抗体は、ヒト抗体、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の混合物である。さらに他の実施形態においては、抗体は、二重特異的抗体または多特異的抗体である。
好ましい抗原結合フラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメントＣＤＲ３が挙げられる。
さらなる実施形態においては、単離された抗体または抗原結合フラグメントは、以下からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株によって生産されるモノクローナル抗体である：ＰＳＭＡ ３．７（ＰＴＡ−３２５７）、ＰＳＭＡ ３．８、ＰＳＭＡ ３．９（ＰＴＡ−３２５８）、ＰＳＭＡ ３．１１（ＰＴＡ−３２６９）、ＰＳＭＡ ５．４（ＰＴＡ−３２６８）、ＰＳＭＡ ７．１（ＰＴＡ−３２９２）、ＰＳＭＡ ７．３（ＰＴＡ−３２９３）、ＰＳＭＡ １０．３（ＰＴＡ−３２４７）、ＰＳＭＡ １．８．３（ＰＴＡ−３９０６）、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３（ＰＴＡ−３９０４）、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１（ＰＴＡ−３９０５）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２４８．２（ＰＴＡ−４４２７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３６０．３（ＰＴＡ−４４２８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７．１（ＰＴＡ−４４２９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４．１（ＰＴＡ−４５５６）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１７７．３（ＰＴＡ−４５５７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１６．１（ＰＴＡ−４３５７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２２．３（ＰＴＡ−４３５８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８．３（ＰＴＡ−４３５９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４０．２（ＰＴＡ−４３６０）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４８．３（ＰＴＡ−４３６１）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４９．１（ＰＴＡ−４３６２）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２０９．３（ＰＴＡ−４３６５）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２１９．３（ＰＴＡ−４３６６）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８８．１（ＰＴＡ−４３６７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３３３．１（ＰＴＡ−４３６８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．５４．１（ＰＴＡ−４３６３）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５３．１（ＰＴＡ−４３８８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２３２．３（ＰＴＡ−４３８９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２９２．３（ＰＴＡ−４３９０）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３０４．１（ＰＴＡ−４３９１）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７８．１（ＰＴＡ−４６５２）、およびＡｂｇｅｎｉｘ ４．１５２．１（ＰＴＡ−４６５３）。
特定の他の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、立体構造エピトープに結合し、そして／また、前立腺特異的膜抗原と共に細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）される。他の実施形態においては、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、標識、好ましくは、蛍光標識、酵素標識、放射標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、および発色団標識からなる群より選択される標識に結合させられる。
さらに他の実施形態においては、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの治療的部分、例えば、薬剤（好ましくは、細胞傷害性薬、複製選択性ウイルス、毒素もしくはそのフラグメント、または、酵素もしくはそのフラグメント）に結合させられる。好ましい細胞傷害性薬としては、カリカエミシン、エスペラマイシン、メトトレキセート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、エストラムスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドラスタチン１０、オーリスタチンＥおよびオーリスタチンＰＨＥが挙げられる。他の実施形態においては、治療的部分は免疫賦活剤または免疫調節剤であり、好ましくは、サイトカイン、ケモカイン、およびアジュバントからなる群より選択されるものである。
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、細胞表面ＰＳＭＡおよび／またはｒｓＰＳＭＡに特異的に結合し、約１×１０−９Ｍまたはそれ未満の結合親和性を有する。好ましくは、結合親和性は、約１×１０−１０Ｍまたはそれ未満であり、より好ましくは、結合親和性は、約１×１０−１１Ｍまたはそれ未満である。他の実施形態においては、結合親和性は、約５×１０−１０Ｍである。
さらなる実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、約１×１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０で、ＰＳＭＡを発現する細胞の特異的な細胞死滅を媒介する。好ましくは、ＩＣ５０は、約１×１０−１１Ｍ未満である。より好ましくは、ＩＣ５０は、約１×１０−１２Ｍ未満である。他の実施形態においては、ＩＣ５０は、約１．５×１０−１１Ｍ未満である。
なお他の実施形態においては、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素に結合させられる。放射性同位元素は、α線、β線、またはγ線を放射することができる。好ましくは、放射性同位元素は、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、７７Ｂｒ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、６４Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２２４Ｒａ、および２２３Ｒａからなる群より選択される。
本発明の別の態様に従うと、以下からなる群より選択される抗体を生産するハイブリドーマ細胞株が提供される：ＰＳＭＡ３．７、ＰＳＭＡ３．８、ＰＳＭＡ３．９、ＰＳＭＡ３．１１、ＰＳＭＡ５．４、ＰＳＭＡ７．１、ＰＳＭＡ７．３、ＰＳＭＡ１０．３、ＰＳＭＡ１．８．３、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２４８．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３６０．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１７７．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１６．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４０．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４９．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２０９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２１９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８８．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３３３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．５４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２３２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２９２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３０４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７８．１、およびＡｂｇｅｎｉｘ ４．１５２．１。いくつかの実施形態においては、ハイブリドーマ細胞株は、以下からなる群より選択される：ＰＳＭＡ ３．７（ＰＴＡ−３２５７）、ＰＳＭＡ ３．８、ＰＳＭＡ ３．９（ＰＴＡ−３２５８）、ＰＳＭＡ ３．１１（ＰＴＡ−３２６９）、ＰＳＭＡ ５．４（ＰＴＡ−３２６８）、ＰＳＭＡ ７．１（ＰＴＡ−３２９２）、ＰＳＭＡ ７．３（ＰＴＡ−３２９３）、ＰＳＭＡ １０．３（ＰＴＡ−３２４７）、ＰＳＭＡ １．８．３（ＰＴＡ−３９０６）、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３（ＰＴＡ−３９０４）、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１（ＰＴＡ−３９０５）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２４８．２（ＰＴＡ−４４２７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３６０．３（ＰＴＡ−４４２８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７．１（ＰＴＡ−４４２９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４．１（ＰＴＡ−４５５６）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１７７．３（ＰＴＡ−４５５７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１６．１（ＰＴＡ−４３５７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２２．３（ＰＴＡ−４３５８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８．３（ＰＴＡ−４３５９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４０．２（ＰＴＡ−４３６０）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４８．３（ＰＴＡ−４３６１）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４９．１（ＰＴＡ−４３６２）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２０９．３（ＰＴＡ−４３６５）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２１９．３（ＰＴＡ−４３６６）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８８．１（ＰＴＡ−４３６７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３３３．１（ＰＴＡ−４３６８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．５４．１（ＰＴＡ−４３６３）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５３．１（ＰＴＡ−４３８８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２３２．３（ＰＴＡ−４３８９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２９２．３（ＰＴＡ−４３９０）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３０４．１（ＰＴＡ−４３９１）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７８．１（ＰＴＡ−４６５２）、およびＡｂｇｅｎｉｘ ４．１５２．１（ＰＴＡ−４６５３）。
本発明のさらなる態様に従うと、上記の抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に受容可能な単体、賦形剤、または安定剤を含む組成物が提供される。他の組成物には、上記の抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤の２つ以上の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態においては、組成物にはまた、抗腫瘍薬、免疫賦活剤、免疫調節剤、またはそれらの組み合わせも含まれる。好ましい抗腫瘍薬としては、細胞傷害性薬、腫瘍の新脈管系に作用する薬剤、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい免疫調節剤としては、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子−α、またはそれらの組み合わせが含まれる。好ましい免疫賦活剤としては、インターロイキン−２、免疫賦活オリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
本発明の別の態様に従うと、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。いくつかの実施形態においては、これらの抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトの前立腺ガン細胞のＡＤＣＣを媒介する。他の実施形態においては、抗体はヒト抗体である。さらに他の実施形態においては、抗体は、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、４０：１、５０：１、またはそれ以上のエフェクター対標的比で、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、またはそれ以上の細胞溶解を生体外で引き起こすことができる。他の実施形態においては、これらの抗体は、対照抗体よりも多くのＡＤＣＣを媒介する。
本発明の別の態様に従うと、診断、予後診断、またはモニターするために前立腺ガンを検出するためのキットが提供される。このキットには、上記の単離された標識された抗体またはその抗原結合フラグメントと、標識を検出するための１つ以上の化合物が含まれる。好ましくは、標識は、蛍光標識、酵素標識、放射標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、および発色団標識からなる群より選択される。
別の態様においては、本発明により、凍結乾燥させられた形態でパッケージングされたか、または水性の媒体中にパッケージングされた、１つ以上の上記の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の別の態様においては、サンプル中のＰＳＭＡの存在、またはＰＳＭＡを発現する細胞の存在を検出するための方法が提供される。この方法には、サンプルを、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する上記の抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかと、抗体またはその抗原結合フラグメントとＰＳＭＡとの間で複合体を形成させるために十分な時間の間、接触させること、および、ＰＳＭＡ−抗体複合体またはＰＳＭＡ−抗原結合フラグメント複合体を検出することが含まれる。サンプル中に複合体が存在することは、ＰＳＭＡまたはＰＳＭＡを発現する細胞がサンプル中に存在することを示す。
別の態様においては、本発明によって、被験体のＰＳＭＡによって媒介される疾患を診断するための他の方法が提供される。この方法には、前立腺特異的膜抗原の細胞外ドメインに特異的に結合する上記の抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの一定の量を、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を有していると診断されると予想される被験体、またはＰＳＭＡによって媒介される疾患を有していると以前に診断された被験体に投与することが含まれる。この方法にはまた、抗体またはその抗原結合フラグメントとＰＳＭＡとの間で複合体を形成させること、および標的エピトープに対するＰＳＭＡ−抗体複合体またはＰＳＭＡ−抗原結合フラグメント抗体複合体の形成を検出することもまた含まれる。前立腺ガンを有していると診断されると予想される被験体、または前立腺ガンであると以前に診断された被験体における複合体の存在は、ＰＳＭＡによって媒介される疾患の存在を示す。
この方法の特定の実施形態においては、ＰＳＭＡによって媒介される疾患は前立腺ガンである。他の実施形態においては、ＰＳＭＡによって媒介される疾患は前立腺ガン以外のガン、例えば、以下からなる群より選択される：移行上皮ガンを含む膀胱ガン；膵菅ガンを含む膵臓ガン；非小細胞肺ガンを含む肺ガン；一般的な腎細胞ガンを含む腎臓ガン；軟組織肉腫を含む肉腫；乳腺ガンを含む乳ガン；多形性膠芽腫を含む脳のガン；神経内分泌腫瘍；結腸ガンを含む結腸ガン；精巣の胎生期ガンを含む精巣ガン；および悪性黒色腫を含む黒色腫。
上記の方法の好ましい実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントが標識される。上記の方法の他の実施形態においては、二次抗体が、一次抗体またはその抗原結合フラグメントを検出するために投与される。
本発明のさらなる態様においては、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を有している被験体の予後を評価するための方法が提供される。この方法には、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を有していると診断されると予想される被験体、またはＰＳＭＡによって媒介される疾患を有していると以前に診断された被験体に対して、請求項Ａ１またはＢ１に記載される抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与すること、抗体またはその抗原結合フラグメントとＰＳＭＡとの間で複合体を形成させること、ならびに、標的エピトープに対する複合体の形成を検出することが含まれる。ＰＳＭＡによって媒介される疾患を有していると診断されると予想される被験体、またはＰＳＭＡによって媒介される疾患を有していると以前に診断された被験体における複合体の量は、予後の指標である。
本発明の別の態様においては、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を有している被験体の処置の有効性を評価するための方法が提供される。この方法には、ＰＳＭＡによって媒介される疾患について処置されると予想される被験体に対して、上記の抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を投与すること、抗体またはその抗原結合フラグメントとＰＳＭＡとの間で複合体を形成させること、ならびに、標的エピトープに対する複合体の形成を検出することが含まれる。ＰＳＭＡによって媒介される疾患を有していると診断されると予想される被験体、またはＰＳＭＡによって媒介される疾患を有していると以前に診断された被験体における複合体の量は、処置の有効性の指標である。
本発明のこれらの２つの態様の特定の実施形態においては、ＰＳＭＡによって媒介される疾患は前立腺ガンである。他の実施形態においては、ＰＳＭＡによって媒介される疾患は、前立腺ガン以外のガンである。これらの実施形態においては、前立腺ガン以外のガンは、好ましくは、以下からなる群より選択される：移行上皮ガンを含む膀胱ガン；膵菅ガンを含む膵臓ガン；非小細胞肺ガンを含む肺ガン；一般的な腎細胞ガンを含む腎臓ガン；軟組織肉腫を含む肉腫；乳腺ガンを含む乳ガン；多形性膠芽腫を含む脳のガン；神経内分泌腫瘍；結腸ガンを含む結腸ガン；精巣の胎生期ガンを含む精巣ガン；および悪性黒色腫を含む黒色腫。さらに他の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは標識される。さらなる実施形態においては、二次抗体が、一次抗体またはその抗原結合フラグメントを検出するために投与される。
本発明のなお別の態様に従うと、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害するための方法が提供される。この方法には、ＰＳＭＡを発現する細胞を、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する上記の抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つの、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害するために有効な量と接触させることが含まれる。
本発明の別の態様に従うと、ＰＳＭＡを発現する細胞の細胞溶解を誘導するための方法が提供される。この方法には、ＰＳＭＡを発現する細胞を、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する上記の抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つの、ＰＳＭＡを発現する細胞の細胞溶解を誘導するために有効な量と接触させることが含まれる。特定の実施形態においては、細胞溶解は、エフェクター細胞の存在下で生じる。他の実施形態においては、細胞溶解は補体媒介される。
本発明のさらに別の態様に従うと、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を処置または予防するための方法が提供される。この方法には、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を有している被験体に対して、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を処置または予防するために有効な量の上記の抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つを投与することが含まれる。いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡによって媒介される疾患はガンであり、例えば、前立腺ガン、または前立腺ガン以外のガン（本明細書中で別の場所に記載される前立腺ガン以外のガンを含む）である。
本発明のさらなる態様においては、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を処置または予防するための方法が提供される。この方法には、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を有している被験体、またはＰＳＭＡによって媒介される疾患のリスクがある被験体に対して、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を処置または予防するために有効な量の上記の抗体またはその抗原結合フラグメントの少なくとも１つを投与することが含まれる。
いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡによって媒介される疾患はガンであり、例えば、前立腺ガン、または前立腺ガン以外のガン（本明細書中で別の場所に記載される前立腺ガン以外のガンを含む）である。
他の実施形態においては、この方法にはまた、抗体またはその抗原結合フラグメントの投与前、投与の間、または投与後のいずれかの時点で、ＰＳＭＡによって媒介される疾患を処置または予防するための別の治療薬を投与することも含まれる。これらの実施形態のいくつかにおいては、治療薬はワクチンであり、好ましくは、ワクチンによってＰＳＭＡに対して被験体を免疫化する。
さらに他の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの治療的部分、好ましくは、細胞傷害性薬、腫瘍の新脈菅系に作用する薬剤、およびそれらの組み合わせに結合させられる。好ましい細胞傷害性薬は、カリカエミシン、エスペラマイシン、メトトレキセート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、エストラムスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドラスタチン１０、オーリスタチンＥおよびオーリスタチンＰＨＥからなる群より選択される。
他の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは放射性同位元素に結合させられ、放射性同位元素から放射される放射線は、α線、β線、およびγ線からなる群より選択される。好ましくは、放射性同位元素は、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、７７Ｂｒ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、６４Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２２４Ｒａ、および２２３Ｒａからなる群より選択される。
本発明によって、ＰＳＭＡの少なくとも１つの酵素活性を調節するための方法が提供される。この方法の好ましい実施形態において使用される場合は、ＰＳＭＡの酵素活性を「調節する」ことは、酵素活性を増強させるかまたは阻害することを意味する。したがって、本発明の特定の態様においては、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害するための方法が提供され、本発明の他の態様においては、ＰＳＭＡの酵素活性を増強させるための方法が提供される。用語「増強させる」および「阻害する」は、この状況においては、ＰＳＭＡの酵素活性が、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下において、そのような抗体またはその抗原結合フラグメントが存在しない条件下での活性のレベルと比較して、増強させられるかまたは阻害されることを示す。ＰＳＭＡの酵素活性としては、葉酸加水分解酵素活性、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ）活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、およびγ−グルタミル加水分解酵素活性が挙げられる。
したがって、別の態様においては、本発明により、葉酸加水分解酵素活性を調節するための方法が提供される。これらの方法の特定の実施形態においては、活性は阻害され、他の実施形態においては、活性は増強させられる。この方法には、葉酸加水分解酵素を、上記の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの一定の量と、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントによって葉酸加水分解酵素の活性が調節される条件下で接触させることが含まれる。葉酸加水分解酵素ポリペプチドは単離することができ、これは、サンプル中、例えば、細胞、細胞のホモジネート、組織、または組織のホモジネートの中に含まれる場合も、また生物体に含まれる場合もある。生物体は好ましくは、動物、特に好ましくは、哺乳動物である。
本発明の別の態様においては、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ）活性を調節するための方法が提供される。これらの方法の特定の実施形態においては、活性は阻害され、他の実施形態においては、活性は増強させられる。この方法には、ＮＡＡＬＡＤａｓｅポリペプチドを、上記の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの一定の量と、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントによってＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性が調節される条件下で接触させることが含まれる。ＮＡＡＬＡＤａｓｅポリペプチドは単離することができ、これは、サンプル中、例えば、細胞、細胞のホモジネート、組織、または組織のホモジネートの中に含まれる場合も、また生物体に含まれる場合もある。生物体は好ましくは、動物、特に好ましくは、哺乳動物である。
本発明の別の態様においては、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性を調節するための方法が提供される。これらの方法の特定の実施形態においては、活性は阻害され、他の実施形態においては、活性は増強させられる。この方法には、ジペプチジルペプチダーゼＩＶポリペプチドを、上記の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの一定の量と、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントによってジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性が調節される条件下で接触させることが含まれる。ジペプチジルペプチダーゼＩＶポリペプチドは単離することができ、これは、サンプル中、例えば、細胞、細胞のホモジネート、組織、または組織のホモジネートの中に含まれる場合も、また生物体に含まれる場合もある。生物体は好ましくは、動物、特に好ましくは、哺乳動物である。
本発明の別の態様においては、γ−グルタミル加水分解酵素活性を調節するための方法が提供される。これらの方法の特定の実施形態においては、活性は阻害され、他の実施形態においては、活性は増強させられる。この方法には、γ−グルタミル加水分解酵素ポリペプチドを、上記の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの一定の量と、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントによってγ−グルタミル加水分解酵素の活性が調節される条件下で接触させることが含まれる。γ−グルタミル加水分解酵素ポリペプチドは単離することができ、これは、サンプル中、例えば、細胞、細胞のホモジネート、組織、または組織のホモジネートの中に含まれる場合も、また生物体に含まれる場合もある。生物体は好ましくは、動物、特に好ましくは、哺乳動物である。
ＰＳＭＡを発現する細胞に対して少なくとも１つの治療薬を特異的に送達する方法が、本発明の別の態様にしたがって提供される。この方法には、少なくとも１つの治療薬に結合させられた少なくとも１つの上記の抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を投与することが含まれる。いくつかの実施形態においては、治療薬は、核酸分子、抗腫瘍薬、毒素もしくはそのフラグメント、酵素もしくはそのフラグメント、複製選択性ウイルス、あるいは、免疫賦活剤または免疫調節剤である。好ましい抗腫瘍薬としては、細胞傷害性薬、腫瘍の新脈菅系に作用する薬剤、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい細胞傷害性薬としては、カリカエミシン、エスペラマイシン、メトトレキセート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、エストラムスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドラスタチン１０、オーリスタチンＥおよびオーリスタチンＰＨＥが挙げられる。好ましい免疫賦活剤または免疫調節剤としては、サイトカイン、ケモカイン、およびアジュバントが挙げられる。
本発明のさらに別の態様においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体に選択的に結合する単離された抗体が提供される。好ましい実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体は二量体であり、好ましくは、多量体を形成するＰＳＭＡタンパク質のうちの少なくとも１つは、組換え体である可溶性ＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）ポリペプチドである。好ましくは、ｒｓＰＳＭＡポリペプチドは、本質的には、配列番号１のアミノ酸４４〜７５０から構成される。
本発明のさらなる態様においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体に選択的に結合し、ＰＳＭＡタンパク質多量体の１つ以上の酵素活性を調節する単離された抗体が提供される。本発明のこの態様の好ましい実施形態において使用される場合は、ＰＳＭＡ多量体の酵素活性を「調節する」ことは、酵素活性を増強させるかまたは阻害することを意味する。したがって、本発明の特定の態様においては、ＰＳＭＡ多量体の酵素活性を阻害する抗体が提供され、本発明の他の態様においては、ＰＳＭＡ多量体の酵素活性を阻害する抗体が提供される。用語「増強させる」および「阻害する」は、この状況においては、ＰＳＭＡ多量体の酵素活性が、ＰＳＭＡ多量体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下において、そのような抗体またはその抗原結合フラグメントが存在しない条件下での活性のレベルと比較して、増強させられるかまたは阻害されることを示す。いくつかの実施形態においては、酵素活性は、葉酸加水分解酵素活性、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、およびγ−グルタミル加水分解酵素活性からなる群より選択される。他の実施形態においては、酵素活性は、ＰＳＭＡ分子の細胞外ドメイン中に存在する。さらに他の実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する。
さらなる態様においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体に選択的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。この態様においては、単離された抗体は、ＰＳＭＡタンパク質多量体を含む調製物で動物を免疫化することによって惹起させられる。抗体を惹起させることにおいて使用される好ましい調製物としては、ＰＳＭＡタンパク質多量体を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％、または９５％含む調製物が挙げられる。好ましくは、ＰＳＭＡタンパク質多量体は二量体である。
本発明のなお別の態様においては、１つ以上の上記の単離された抗体と、免疫賦活分子（例えば、アジュバントおよび／またはサイトカイン）を含む組成物が提供される。好ましくは、免疫賦活分子はＩＬ−２または免疫賦活オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態においては、上記の組成物にはまた、薬学的に受容可能なキャリアも含まれる。
本発明にはまた、そのような処置が必要である被験体に対して有効量の上記の単離された抗体または組成物を投与することを含む、免疫応答を誘導するための方法も含まれる。
別の態様においては、本発明により、ＰＳＭＡタンパク質多量体に選択的に結合してＰＳＭＡの少なくとも１つの酵素活性を調節する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。本発明のこの態様の好ましい実施形態において使用される場合は、ＰＳＭＡの酵素活性を「調節する」ことは、酵素活性を増強させるかまたは阻害することを意味する。したがって、本発明の特定の態様においては、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害する抗体が提供され、本発明の他の態様においては、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害する抗体が提供される。用語「増強させる」および「阻害する」は、この状況においては、ＰＳＭＡの酵素活性が、ＰＳＭＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下において、そのような抗体またはその抗原結合フラグメントが存在しない条件下での活性のレベルと比較して、増強させられるかまたは阻害されることを示す。特定の実施形態においては、酵素は、加水分解酵素およびペプチダーゼからなる群より選択される。好ましい加水分解酵素としては、葉酸加水分解酵素およびγ−グルタミル加水分解酵素が挙げられる。ＰＳＭＡの阻害の特に好ましい実施形態においては、加水分解酵素は葉酸加水分解酵素であり、抗体は、ｍＡｂ ５．４またはｍＡｂ ３．９である。好ましいペプチダーゼとしては、ＮＡＡＬＡＤａｓｅおよびジペプチジルジペプチダーゼＩＶが挙げられる。いくつかの実施形態においては、酵素は、ガン細胞において活性であり、正常な細胞中ではガン細胞中よりも活性が低いか、または正常な細胞中では活性はないことが好ましい。好ましい実施形態においては、その中で酵素が活性であるガン細胞は、前立腺ガン細胞である。上記の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物もまた、本発明によって提供される。
本発明の別の態様においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質多量体を含む組成物が提供される。好ましくは、ＰＳＭＡタンパク質多量体は二量体である。特定の実施形態においては、組成物には、ＰＳＭＡタンパク質多量体が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％、または９５％含まれる。他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体には、非共有的に結合したＰＳＭＡタンパク質が含まれる。ＰＳＭＡタンパク質は、好ましくは、非変性条件下で非共有的に結合させられる。
上記の組成物の特定の実施形態においては多量体を形成するＰＳＭＡタンパク質のうちの少なくとも１つが、組換え体である可溶性ＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）ポリペプチドである。他の実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体は、ＰＳＭＡを特異的に認識する立体構造特異的抗体と反応する。好ましくは、ＰＳＭＡタンパク質多量体には、天然に存在する立体配置のＰＳＭＡタンパク質が含まれ、そして／また、ＰＳＭＡ多量体は酵素活性がある。好ましい実施形態においては、酵素活性は、葉酸加水分解酵素活性、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、および／またはγ−グルタミル加水分解酵素活性である。
さらに他の実施形態においては、上記の組成物にはまた、アジュバントおよび／またはサイトカイン、あるいは、他の免疫賦活分子が含まれる。好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。さらなる実施形態においては、上記の組成物にはまた、薬学的に受容可能なキャリアも含まれる。
本発明のなお別の態様に従うと、免疫応答を誘導するための方法が提供される。この方法には、そのような処置が必要である被験体に対して、有効量の１つ以上の上記の組成物を投与することが含まれる。
さらなる態様においては、本発明には、単離された組換え体である可溶性ＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）タンパク質多量体と、単離されたｒｓＰＳＭＡタンパク質二量体が含まれる。いくつかの実施形態においては、二量体には、非共有的に結合したｒｓＰＳＭＡタンパク質が含まれ、好ましくは、ｒｓＰＳＭＡタンパク質は、非変性条件下で非共有的に結合させられる。他の実施形態においては、単離されたｒｓＰＳＭＡ二量体は、ＰＳＭＡを特異的に認識する立体構造特異的抗体と反応する。
特定の好ましい実施形態においては、単離されたｒｓＰＳＭＡ二量体は酵素活性があり、酵素活性は、葉酸加水分解酵素活性、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、およびγ−グルタミル加水分解酵素活性からなる群より選択される。
本発明のさらに別の態様においては、ＰＳＭＡ酵素の少なくとも１つの酵素活性を調節する候補の因子をスクリーニングする方法が提供される。この方法の好ましい実施形態において使用される場合は、ＰＳＭＡの酵素活性を「調節する」ことは、酵素活性を増強させるかまたは阻害することを意味する。したがって、本発明の特定の態様においては、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害する候補の因子をスクリーニングするための方法が提供され、本発明の他の態様においては、ＰＳＭＡの酵素活性を増強させる候補の因子をスクリーニングするための方法が提供される。用語「増強させる」および「阻害する」は、この状況においては、ＰＳＭＡの酵素活性が、候補の因子の存在下において、そのような因子が存在しない条件下での活性のレベルと比較して、増強させられるかまたは阻害されることを示す。この方法には、候補の因子を単離されたＰＳＭＡタンパク質多量体と混合して反応混合物を形成させること、その後、反応混合物にＰＳＭＡ酵素の基質を添加すること、そしてＰＳＭＡ酵素によって基質から形成された生成物の量を決定することが含まれる。対照と比較した形成された生成物の量の変化は、ＰＳＭＡ酵素の少なくとも１つの酵素活性を調節することができる因子の指標である。対照と比較した形成された生成物の量の減少は、ＰＳＭＡ酵素の少なくとも１つの酵素活性を阻害することができる因子の指標である。対照と比較した形成された生成物の量の増加は、ＰＳＭＡ酵素の少なくとも１つの酵素活性を増強させることができる因子の指標である。いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡ酵素は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ、葉酸加水分解酵素、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ、およびγ−グルタミル加水分解酵素からなる群より選択される。他の実施形態においては、ＰＳＭＡ多量体には組換え体である可溶性のＰＳＭＡが含まれる。なお他の実施形態においては、候補の因子は、抗体、有機低分子、またはペプチドからなる群より選択される。
本発明の別の態様においては、ＰＳＭＡの少なくとも１つの酵素活性を調節する候補の因子が提供される。候補の因子は、上記の方法にしたがって同定される。したがって、本発明の特定の態様においては、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害する候補の因子が提供され、本発明の他の態様においては、ＰＳＭＡの酵素活性を増強させる候補の因子が提供される。特定の実施形態においては、因子は、組み合わせ抗体ライブラリー、組み合わせタンパク質ライブラリー、または有機低分子のライブラリーから選択される。
本発明によってはまた、ＰＳＭＡ二量体の解離を促進する化合物を同定するための方法も提供される。この方法には、ＰＳＭＡ二量体を、化合物が存在しない条件下ではＰＳＭＡ二量体の解離を促進しない条件下で、化合物と接触させること、ＰＳＭＡ単量体および／または二量体の量を測定し、そして化合物の存在下で測定されたＰＳＭＡ単量体および／または二量体の量を、化合物が存在しない条件下で観察された量と比較することが含まれる。化合物の存在下で測定されたＰＳＭＡ単量体の量の増加は、その化合物がＰＳＭＡ二量体の解離を促進できることを示す。化合物の存在下で測定されたＰＳＭＡ二量体の量の減少は、その化合物がＰＳＭＡ二量体の解離を促進できることを示す。ＰＳＭＡ単量体とＰＳＭＡ二量体の量が測定される場合は、この方法には、ＰＳＭＡ二量体に対するＰＳＭＡ単量体の比を計算すること、そして化合物の存在下で得られた比を化合物が存在しない条件下で得られた比と比較することが含まれ得る。このような方法では、化合物の存在下で測定された比の増加は、その化合物がＰＳＭＡ二量体の解離を促進することができることを示す。
上記の組成物、分子、および因子の、医薬品の調製物中での使用もまた提供される。好ましい実施形態においては、医薬品は、ガンを含む過剰増殖性疾患、および不適切なＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、葉酸加水分解酵素活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、および／またはγ−グルタミル加水分解酵素活性に関する疾患に関係している症状の処置において有用である。
本発明の限定のそれぞれには、本発明の種々の実施形態が含まれ得る、したがって、任意の１つの要素または複数の要素の組み合わせを含む本発明の限定のそれぞれは、本発明のそれぞれの態様に含まれ得ると予想される。
本発明のこれらおよび他の態様は、本発明の詳細な説明と組み合わせてさらに詳細に記載されるであろう。
（発明の詳細な説明）
本発明により、一部、多量体形態、具体的には、二量体形態のＰＳＭＡタンパク質、二量体ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物およびキット、ならびにこれらの組成物を生産、精製、処理、および使用する方法が提供される。このような方法には、ＰＳＭＡおよび／またはＰＳＭＡを発現する細胞に対する免疫応答を誘発するまたは増強させるための方法が含まれる。このような方法には、二量体ＰＳＭＡに対する抗体を生産する方法、ならびに、ガン、例えば、前立腺ガンを処置する方法が含まれる。
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、前立腺組織中で発現される１００ｋＤａのＩＩ型膜糖タンパク質であり、これは、７Ｅ１１−Ｃ５と命名されたモノクローナル抗体との反応性によって最初に同定された（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：９２７−９３５；米国特許第５，１６２，５０４号）。ＰＳＭＡは、精製された形態で得られており（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ３：Ａｂｓｔｒａｃｔ １９３）、そしてトランスフェリン受容体と配列同一性を有しているＩＩ型膜貫通タンパク質として（Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１８０７−１８１１）、そしておよびＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を有する（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：７４９−７５３）として特徴付けられている。より重要なことは、ＰＳＭＡは前立腺ガンにおいて増大した量で発現され、そして高いレベルのＰＳＭＡはまた、これらの患者の血清中でも検出できることである（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｒｏｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２５：２１９−２２３；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２６：１６４−１６８；およびＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１４７３−１４７９）。ＰＳＭＡの発現は、疾患の進行とともに増大し、その治療法が現在は存在しない、転移性のホルモン抵抗性疾患においては最も高くなる。物議を醸し出す最近のデータは、ＰＳＭＡはまた種々の他の重要な腫瘍（膀胱、膵臓、肉腫、黒色種、肺、および腎臓の腫瘍細胞）の新脈菅系上でも多量に発現されていることを示しているが、正常な脈菅系では発現されていない。
その天然に存在する形態のＰＳＭＡはホモ二量体であることが明らかにされている。しかし、通常の単離技術に従う場合には、天然に存在する形態のＰＳＭＡは通常は維持されない。したがって、単離された多量体ＰＳＭＡ、具体的には、二量体ＰＳＭＡを含む単離されたＰＳＭＡタンパク質の組成物が提供される。これらの組成物には、単離されたＰＳＭＡタンパク質が含まれており、ここでは、単離されたＰＳＭＡタンパク質の少なくとも約５％が多量体形態である。単離されたＰＳＭＡタンパク質の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上が多量体形態である他の組成物が提供される。好ましい実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体組成物には、実質的に純粋なＰＳＭＡタンパク質多量体が含まれ、ＰＳＭＡタンパク質単量体は実質的には含まれない。特異的な割合（％）のリストには、記載される割合の間の指定されていない割合の全てが、推測によって含まれることが理解される。さらに、特定の因子によって、単離されたＰＳＭＡの多量体、特に、二量体会合が保存または促進されることが、見出されている。したがって、これらの因子を含む単離されたＰＳＭＡタンパク質の組成物、ならびに、単離されたＰＳＭＡタンパク質組成物を精製し処理する方法もまた、提供される。
本明細書中で使用される場合は、「ＰＳＭＡタンパク質」には、全長のＰＳＭＡタンパク質（配列番号１として提供される）またはその一部が含まれる。これらのタンパク質は、ＰＳＭＡタンパク質の多量体または凝集体を形成することができる。本明細書中で使用される場合は、「ＰＳＭＡタンパク質の多量体または凝集体」は、２つ以上のＰＳＭＡタンパク質の会合体をいう。好ましくは、本明細書中に記載されるＰＳＭＡタンパク質は、非共有的な相互作用によって天然に存在するＰＳＭＡの二量体と同様の二量体を形成することができるもの、または、ジスルフィド結合のような共有結合によって安定な天然に存在するものと同様の二量体を形成するように操作されたものであるかのいずれかである。「天然に存在するＰＳＭＡの二量体と同様の二量体」には、天然において見ることができるタンパク質と同じ様式、または天然に存在する二量体（すなわち、天然に存在するＰＳＭＡ二量体において見られる抗原性領域を形成することができるような様式の会合体、または交差反応性抗体を生じることができるもの）の少なくとも１つの抗原性エピトープを認識する抗体を生じることができる様式で、会合させられる２つのＰＳＭＡタンパク質が含まれる。したがって、本明細書中に提供される二量体に対して作成された抗体は、天然に存在する二量体を認識することができる。好ましくは、抗体は、天然に存在するＰＳＭＡ二量体を認識するが、ＰＳＭＡ単量体は認識しないように作成されるか、あるいは、単量体よりも天然に存在するＰＳＭＡ二量体について高い特異性を有するように作成される。いくつかの実施形態においては、本明細書中に提供されるＰＳＭＡタンパク質は、ＰＳＭＡのさらに大きな凝集体（すなわち、会合している３つ以上のＰＳＭＡタンパク質）である。これらの凝集体も同様に、ＰＳＭＡを認識する抗体を作成することができる。いくつかの実施形態においては、これらの抗体はＰＳＭＡ単量体は認識しないが、天然に存在するＰＳＭＡ二量体を認識する。他の実施形態においては、これらの抗体は、ＰＳＭＡ単量体よりも天然に存在するＰＳＭＡ二量体について高い特異性を有する。
ＰＳＭＡ多量体は、通常はホモ多量体である（すなわち、会合したＰＳＭＡタンパク質は同じである）。しかし、いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡ多量体は、ヘテロ多量体、具体的には、ヘテロ二量体である場合もある。本明細書中で使用される場合は、「ＰＳＭＡヘテロ多量体」は、少なくとも２つの異なるＰＳＭＡタンパク質から構成されるＰＳＭＡタンパク質の多量体である。例として、一方が他方よりもわずかに長いか、または一方は保存的アミノ酸置換を有しており、他方は有していない２つのＰＳＭＡフラグメントが挙げられる。ホモ多量体と同様に、本明細書中に提供されるヘテロ多量体は、天然に存在するＰＳＭＡ二量体を認識する抗体を作成することができる。好ましい実施形態においては、ＰＳＭＡヘテロ多量体に対して惹起させられた抗体は、天然に存在するＰＳＭＡ二量体を認識するが、ＰＳＭＡ単量体は認識しない。さらに他の好ましい実施形態においては、これらの抗体は、ＰＳＭＡ単量体よりも天然に存在するＰＳＭＡ二量体について高い特異性を有する。
多量体、特に、二量体を形成することができるＰＳＭＡタンパク質としては、全長のタンパク質（配列番号１）が挙げられる。いくつかの実施形態においては、多量体を形成することができるＰＳＭＡタンパク質はＰＳＭＡの細胞外部分（配列番号１のアミノ酸４４〜７５０）である。他の実施形態においては、多量体を形成することができるＰＳＭＡタンパク質は、ＰＳＭＡの異なったスプライシングを受けた形態である、ＰＳＭ’（配列番号１のアミノ酸５８〜７５０）である。なお他の実施形態においては、全長のタンパク質のフラグメント、細胞外部分、またはＰＳＭ’は多量体を形成することができる。例えば、これらのフラグメントとしては、配列番号１のアミノ酸４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５などで始まり、配列番号１のアミノ酸７５０で終わる短縮型のＰＳＭＡタンパク質が挙げられる。他のこのような短縮型のタンパク質は、配列１のアミノ酸４４で始まり、配列番号１のアミノ酸７４９、７４８、７４７、７４６、７４５、７４４、７４３、７４２、７４１、７４０などで終わる。さらに他の短縮型タンパク質としては、配列番号１のアミノ酸４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５などで始まり、配列番号１のアミノ酸７４９、７４８、７４７、７４６、７４５、７４４、７４３、７４２、７４１、７４０などで終わるものが挙げられる。いくつかの実施形態においては、短縮型のＰＳＭＡタンパク質としては、配列番号１のアミノ酸６０１〜７５０、または二量体を形成することができるその機能的部分が挙げられる。本明細書中に提供される場合は、ＰＳＭＡタンパク質は、本明細書中に提供される多量体を形成することができるＰＳＭＡタンパク質の任意のフラグメントを含むように意図される。したがって、配列番号１の任意の部分は、この定義に含まれ、その機能的変異体も含まれる。機能的変異体は本明細書において以下にさらに記載される。
いくつかの実施形態においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質は全長ではないＰＳＭ’（配列番号１のアミノ酸５８〜７５０）、またはＰＳＭＡの細胞外部分の全長（配列番号１のアミノ酸４４〜７５０）である。他の例においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質は、全長のＰＳＭＡ（配列番号１）ではない。フラグメントは、少なくとも約２５、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、または７４９アミノ酸、およびその間の全ての整数である大きさを有し得る。いくつかの実施形態においては、これらのフラグメントには、配列番号１のアミノ酸６３〜６８、１３２〜１３７、または４８２〜４８７が含まれる。いくつかの他の好ましい例においては、ＰＳＭＡタンパク質は膜に結合しない。
ＰＳＭＡの多量体への会合、特に、二量体会合を保存または促進する因子および／または溶液とのＰＳＭＡタンパク質の組成物もまた、提供される。いくつかの例においては、因子は、ＰＳＭＡタンパク質と共に溶液中に存在するが、必ずしもそうである必要はない。「ＰＳＭＡの二量体会合を保存または促進する」因子または溶液は、長時間にわたってＰＳＭＡの二量体会合（二量体化）を維持するものであるか、またはＰＳＭＡタンパク質の単量体の形態の二量体会合を促進するものであるかのいずれかである。例えば、ＰＳＭＡ二量体の量を増加させるか、ＰＳＭＡ二量体の量を維持するか、またはＰＳＭＡ二量体の解離を遅らせる任意の溶液が、上記の定義に含まれる。二量体の状態が具体的に記載されているが、これらの用語はまた、ＰＳＭＡの他の多量体の状態を含むようにも意図され、したがって、ＰＳＭＡの他の多量体の組成物、キット、生産方法、および使用方法もまた意図される。
好ましくは、「二量体ＰＳＭＡの保存または促進」は、組成物中に最初に存在するＰＳＭＡ二量体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上についてＰＳＭＡタンパク質の二量体の状態を維持することを意味する。ＰＳＭＡの二量体形態を含む好ましい組成物は、約３５％未満の単量体形態のＰＳＭＡを、好ましくは、約２０％未満、さらに好ましくは、約１５％未満の単量体形態を含む。１つの実施形態においては、組成物は、約５％未満の単量体ＰＳＭＡタンパク質を含む。二量体ＰＳＭＡの保存または促進はまた、最初の単量体ＰＳＭＡの約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上の二量体形態への転換をもいう。
二量体化の促進、または二量体状態の維持は、多数の実験温度または保存温度の任意の温度で生じ得る。いくつかの例においては、二量体ＰＳＭＡの促進または保存は、約４５℃以下の温度で生じる。他の例においては、二量体ＰＳＭＡの促進または保存は、約３７℃の温度である。促進または保存はまた、約２０℃から約３０℃の温度範囲であり得、または、室温よりも高い温度もしくは低い温度でもあり得る。他の例においては、促進または保存は、約４℃から約２０℃の範囲である。さらに他の例においては、促進または保存は約−２０℃から約４℃、または、約−８０℃から約−２０℃である。ＰＳＭＡの二量体状態の促進または保存はまた、溶液中であるかまたは凍結乾燥させられた形態、例えば、凍結乾燥形態であるＰＳＭＡタンパク質の組成物においても生じ得る。二量体状態はまた、任意の期間にわたって促進または保存され得る。いくつかの例においては、期間は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、１０、１５、２０、２４、４８、７２時間、またはそれ以上である。他の例においては、期間は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０日間、またはそれ以上である。さらに他の例においては、期間は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０週間、またはそれ以上である。なお他の例においては、期間は、少なくとも約１、２、３、６、９、１２ヶ月間、またはそれ以上、あるいは、２年またはそれ以上の期間である。本明細書中に提供される処方物は、長期間の保存の間安定である。すなわち、処方物は二量体ＰＳＭＡの状態を保存または促進する。
ｐＨが単独でＰＳＭＡの二量体状態に影響を与え得ることは驚くべき発見であった。実施例のセクションで以下に記載されるように、ＰＳＭＡ溶液がインキュベートされるｐＨは、ＰＳＭＡの多量体形態、さらにはその回収率に影響をあたえ得る。種々のｐＨでの４日間の、約４５℃の温度でのインキュベーションは、ＰＳＭＡタンパク質の二量体化または凝集に影響を与え、さらには、分析的ＴＳＫゲル濾過クロマトグラフィーによるＰＳＭＡタンパク質の回収にも影響を与える。二量体ｒｓＰＳＭＡ（ＰＢＳ＋中２ｍｇ／ｍＬ）の保存に対するｐＨの利点は、タンパク質溶液が種々の緩衝溶液（それぞれが、２ｍＭのグリシン、２ｍＭのクエン酸、２ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＭＥＳ、および２ｍＭのＴｒｉｓ塩基を含む）で１０倍に希釈された場合にも保たれた。
本発明のＰＳＭＡの二量体構造は、約４から約８の範囲のｐＨで保存される。したがって、ＰＳＭＡの二量体化の保存または促進する溶液は、約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、または８のｐＨを有している溶液である。カラムからの二量体ＰＳＭＡの回収は、約５から約７の範囲のｐＨで良好であり、これらのｐＨ値が好ましい。いくつかの例においては、約６のｐＨが好ましい。したがって、本発明によって、溶液中のＰＳＭＡの処方物が提供され、ここでは、ｐＨは約４から約８の範囲にあり、好ましくは、約５から約７の範囲にあり、より好ましくは、約５．５から約７の範囲にあり、最も好ましくは、約６から約７の範囲にある。
「ＰＳＭＡの二量体会合を保存または促進する因子」は、ＰＳＭＡの二量体化を促進または維持する因子を含むように意味される。このような因子には、ｐＨ調整剤（上記で議論された）、金属イオン、および塩が含まれることが見出されている。これらの因子は、個々が、または組み合わせにおいて、ＰＳＭＡの二量体会合を保存または促進することができることが発見されている。いくつかの実施形態においては、これは、ＰＳＭＡの二量体会合を促進または保存することができる金属イオン、塩、またはｐＨ調整剤の組み合わせであって、個々の金属イオン、塩、またはｐＨ調整剤では行うことはできない。実施例において提供されるように、ＥＤＴＡのようなキレート化剤の使用によって二量体ＰＳＭＡは単量体へと変換させられる。この結果は、金属イオンの存在が二量体の安定性にポジティブな影響を与え得ることを示している。さらに、ＰＳＭＡはヒトのトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）と中程度の配列および構造相同性を共有しており、ヒトのトランスフェリン受容体には、そのヘリックスドメインにさらに金属結合部位が含まれている（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６，７７９−７８２）。したがって、金属イオンは、ＰＳＭＡタンパク質の二量体状態を促進または保存する因子と考えられる。このような金属イオンとしては、亜鉛イオン（例えば、Ｚｎ２＋）、カルシウムイオン（例えば、Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（例えば、Ｍｇ２＋）、コバルトイオン（例えば、Ｃｏ２＋）、マンガンイオン（例えば、Ｍｎ２＋）、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例においては、これらの金属イオンは塩の形態でＰＳＭＡタンパク質の組成物に添加され得る。このような塩としては、塩化亜鉛、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化コバルト、または塩化マンガンが挙げられる。さらに、二量体状態が促進または保存されるＰＳＭＡタンパク質の組成物には、ＰＳＭＡタンパク質（全ＰＳＭＡタンパク質、すなわち、ＰＳＭＡタンパク質分子の全量）に対して、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５モル等量、またはそれ以上の金属イオンが含まれることが決定されている。いくつかの例においては、金属イオンのモル等量は、ＰＳＭＡタンパク質に対してモル過剰でなければならない。ＰＳＭＡタンパク質のいくつかの特定の溶液（ＰＢＳ＋中に２ｍｇ／ｍＬ；１０倍希釈）においては、実施例において提供されるように、金属イオンが約０．１ｍＭから約５ｍＭの範囲の濃度で存在することが好ましいことがさらに見出されている。いくつかの例においては、金属イオンは、約０．１ｍＭから約１ｍＭの範囲の濃度で存在する。他の実施形態においては、金属イオンは、約０．１ｍＭから約０．５ｍＭの範囲の濃度で存在する。１つ以上のタイプの金属イオンの組み合わせが存在する溶液においては、１つ以上の金属イオンは同じ濃度で存在してもよく、また、異なる濃度であってもよい。例えば、１つのこのような溶液には、約０．５ｍＭのカルシウムイオンの濃度と、０．１ｍＭよりも大きく０．５ｍＭ未満である濃度の亜鉛イオン濃度が含まれ得る。いくつかの組成物中でのＰＳＭＡの二量体化における金属イオンの重要性の理由から、いくつかの例においては、組成物がキレート化剤を含まないことが好ましい。
塩がＰＳＭＡの二量体化を保存または促進することもまた見出されている。実施例において以下に示されるように、およそ５％の単量体を最初に含む二量体調製物は、２Ｍの塩化ナトリウムを補充したＰＢＳ＋（１ｍＭのＣａ２＋と０．５ｍＭのＭｇ２＋を含むリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．２）中での室温で７２時間のインキュベーションの間に１００％二量体に変換された。最初に＞９５％の単量体を含む調製物については、多量の塩によって同様に平衡状態へと動かされ、７２時間以内にほとんど（８１％）二量体となった。
ＰＳＭＡの二量体化を保存または促進する塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される陽イオン性成分を含むもの、ならびに、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される陰イオン性成分を含むものを挙げることができる。好ましい実施形態においては、塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫酸アンモニウムである。塩は、ＰＳＭＡの二量体化を保存または促進する任意の濃度で、ＰＳＭＡを含む組成物中に存在し得る。いくつかの例においては、塩は約５０ｍＭから２Ｍの範囲の濃度で存在する。塩は好ましくは、約１００ｍＭから３００ｍＭの範囲の濃度で存在する。さらに好ましくは、塩は約１５０ｍＭの濃度で存在する。
ＰＳＭＡの二量体化を促進または保存するために高い塩濃度が使用されるいくつかの場合においては、塩濃度は、投与前に、全身的な使用に適している生理学的に許容される範囲になるように希釈され得る。例として、塩濃度は、アジュバントまたは希釈剤で希釈され得る。希釈剤およびアジュバントは、いずれも当該分野で周知である。アジュバントは、免疫応答を増強する物質である。アジュバントの特異的な例としては、以下が挙げられる：モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１を含むサポニン（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；米国特許第６，５２４，５８４号および同第６，６４５，４９５号）；サポニンベースのアジュバント（例えば、ＳａｐｏｎＩｍｍｕｎｅ（登録商標）（ＧＰＩ−０１００）シリーズ）（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ；米国特許第５，９７７，０８１号および同第６，０８０，７２５号）および、化学修飾されたサポニン（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，米国特許第６，２６２，０２９号）；多糖をベースとするアジュバント（例えば、ＰｏｌｙｓａｃｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）（ＧＰＩ−０２００）シリーズ）（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））；合成のアジュバント（例えば、ＳｙｎｔｈＩｍｍｕｎｅ（登録商標）（ＧＰＩ−０３００）シリーズ）（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））；ポリラクチド−コグリコリド（ＰＬＧ）または他の同様のポリマーから構成される生分解性粒子（例えば、Ｋｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−９，１９９５に記載されているＣｐＧオリゴヌクレオチド）；不完全フロイントアジュバント；完全フロイントアジュバント；ビタミンＥおよび生分解性油から調製された水中油エマルジョン（例えば、スクワレンおよび／またはトコフェロール）；モンタナイド（例えば、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１およびＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ７２０）（これは、Ｓｅｐｐｉｃ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）によって提供される水中油エマルジョンである）；Ｑｕｉｌ Ａ；免疫賦活複合体として知られているＱｕｉｌ Ａとコレステロールのミセル混合物（ＩＳＣＯＭＳ）；ＭＰＬとマイコバクテリウムに由来する細胞壁骨格の組み合わせ（例えば、ＥＮＨＡＮＺＹＮ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）；ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ）；ＲＣ−５２２（Ｃｏｒｉｘａ）；ＣＲＬ−１００５；Ｌ−１２１；α−ガラクトシルセラミド（Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００３年７月２１日；１９８（２）：２６７−７９）；酸化アルミニウムまたは酸化鉄のビーズ、およびそれらの組み合わせ。アジュバントの他の特異的な例としては、ＱＳ−２１画分、例えば、粗ＱＡ−２１、ＱＡ−２１Ｈ型、ＱＡ−２１−Ｖ１；ＱＡ−２１−Ｖ２；ＱＡ−２１−Ｖ１とＱＡ−２１−Ｖ２の組み合わせ；および化学修飾された形態、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましいアジュバントとしては、ミョウバンとＱＳ−２１が挙げられる。他の希釈剤としては、注射に適している水、生理食塩水、ＰＢＳ、可溶化剤、および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル。ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、菜種油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール）、および、ソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
したがって、本発明のいくつかの態様においては、単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む好ましい組成物は、ＰＳＭＡタンパク質の多量体への会合、特に、二量体会合を促進または保存する、５から２０ｍＭのリン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせと；１００から３００ｍＭの塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムと；そして０．１から２ｍＭの少なくとも１つの金属イオンを含む溶液である。金属イオンは、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせから選択され得る。このような溶液のｐＨもまた、約４から８の範囲、好ましくは、５から７、そして最も好ましくは、６から６．５の範囲になるように調節することができる。このような溶液には、必要に応じて、ミョウバン、またはサポニンベースのアジュバント（例えば、ＱＳ−２１）のようなアジュバントが含まれ得る。
ＰＳＭＡの二量体化を保存または促進する因子は、ＰＳＭＡタンパク質の組成物中で、またはこのような組成物を処理する方法において使用することができる。さらに、このような因子を同定するための方法が本明細書中に提供される。このような方法には、以下の工程が含まれる：候補の因子と接触させる前に、サンプル中の１つの形態のＰＳＭＡの量を決定する工程；サンプルを候補の因子と接触させる工程；接触の後に、サンプル中のその形態のＰＳＭＡタンパク質の量を決定する工程；および、候補の因子との接触の前と後のサンプル中のその形態のＰＳＭＡタンパク質の量を比較する工程。ＰＳＭＡの形態は、単量体または多量体であり得、好ましくは、二量体である。ＰＳＭＡタンパク質の二量体の形成を保存および／または促進する因子は、ＰＳＭＡタンパク質二量体を含む組成物中での使用に適している。
以下に記載されるように、ＰＳＭＡを二量体化させるか、またはそのニ量体化を維持する能力に対する緩衝化物質の影響も試験した。多くのものを、ＰＳＭＡの二量体状態にネガティブな影響を与えることなく、ＰＳＭＡの溶液中で使用できることが見出された。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む６のｐＨのＰＳＭＡタンパク質の溶液についてのただ１つの例外は、クエン酸緩衝剤である。興味深いことに、クエン酸緩衝剤は、キレート化剤として作用することが知られている。したがって、本明細書中に記載されるＰＳＭＡの処方物には、緩衝剤が処方物の他の特性の保存または促進作用を上回るキレート化作用を有しているものでない限りにおいて、任意の緩衝剤が含まれ得る。好ましくは、最適な緩衝剤としては、約４から約８の範囲のｐＨに緩衝能力を有している緩衝剤が挙げられる。さらに好ましくは、緩衝剤は、約５から７の範囲のｐＨに緩衝能力を有している緩衝剤である。最も好ましくは、緩衝剤は、約５．５から７の範囲のｐＨに緩衝能力を有している緩衝剤である。一般的には、緩衝剤は、当業者に周知である。緩衝システムとしては、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、およびリン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤の特異的な例としては、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウムおよびリン酸、アスコルビン酸ナトリウム、酒石酸、マレイン酸、グリシン、乳酸ナトリウム、乳酸、アスコルビン酸、イミダゾール、重炭酸ナトリウム、炭酸、コハク酸ナトリウムおよびコハク酸、ヒスチジン、ならびに、安息香酸ナトリウムおよび安息香酸が挙げられる。緩衝剤としては、ＰＢＳおよびＨｅｐｅｓも挙げられる。
約６のｐＨで２０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ中に透析した二量体状態のｒｓＰＳＭＡ（ＰＢＳ＋中２ｍｇ／ｍＬ）に対する遊離のアミノ酸の作用もまた試験した。ヒスチジン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸を、特異的な実験条件で別々に使用した場合を除いて、概して、遊離のアミノ酸はＰＳＭＡの二量体会合および／またはカラムからの回収に対して強いネガティブな作用を有していないことが見出された。したがって、本明細書中に提供される処方物にはまた、遊離のアミノ酸が特異的な処方物の二量体会合を促進または保存する性質を上回るネガティブな作用を有していない限りにおいて、遊離のアミノ酸または遊離のアミノ酸の組み合わせが含まれ得る。このような遊離のアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、修飾されたアミノ酸、または天然には存在していない遊離のアミノ酸（すなわち、天然に存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物；例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｏ．ｃａｌｔｅｃｈ．ｅｄｕ／〜ｄａｄｇｒｐ／Ｕｎｎａｔｓｔｒｕｃｔ．ｇｉｆを参照のこと、これは、機能性のイオンチャンネルにうまく取り込ませることができている天然に存在しないアミノ酸の構造を示している）であり得る。修飾された遊離のアミノ酸、または天然に存在しない遊離のアミノ酸としてはまた、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２−アミノアジピン酸；３−アミノアジピン酸；β−アラニン、β−アミノプロピオン酸；２−アミノ酪酸；４−アミノ酪酸；ピペリジン酸；６−アミノカプロン酸；２−アミノヘプタン酸；２−アミノイソ酪産；３−アミノイソ酪酸；２−アミノピメリン酸；２，４−ジアミノ酪酸；デスモシン；２，２’−ジアミノピメリン酸；２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎ−エチルグリシン；Ｎ−エチルアスパラギン；ヒドロキシリジン；アロ−ヒドロキシリジン；３−ヒドロキシプロリン；４−ヒドロキシプロリン；イソデスモシン；アロ−イソロイシン；Ｎ−メチルグリシン；サルコシン；Ｎ−メチルイソロイシン；６−Ｎ−メチルリジン；Ｎ−メチルバリン；ノルバリン；ノルロイシン；およびオルニチン。具体的には、ＰＳＭＡの二量体会合および／またはカラムからの回収にネガティブな影響は与えない遊離のアミノ酸としては、非酸性のアミノ酸が挙げられる。これらの非酸性の遊離のアミノ酸としては、グリシン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、およびアルギニンが挙げられる。
遊離のアミノ酸に加えて、界面活性剤および／または他の賦形剤もまた、ＰＳＭＡの二量体状態に対してネガティブナ影響を有さないことが見出されている。したがって、界面活性剤、ならびに他の賦形剤が、本明細書中に提供される組成物中に含まれ得る。界面活性剤の例としては、当該分野で公知であり、本明細書中に記載される界面活性剤が挙げられる。例えば、界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシルマルトシド、コール酸、およびＣＨＡＰＳが挙げられる。
賦形剤の例としては、結合剤、コーティング剤、圧縮／カプセル化補助剤、錠剤分解物質、クリームおよびローション剤；潤滑剤、チュアブル錠用の物質、非経口剤、可塑剤、粉末潤滑剤、軟質ゼラチンカプセル、コーティング用球体、球形化剤、懸濁／ゲル化剤、甘味剤、および湿式造粒剤が挙げられる。このような賦形剤の特異的な例としては、以下が挙げられる：クエン酸アセチルトリエチル（ＡＴＥＣ）；アセチル−ｎ−ブチルクエン酸（ＡＴＢＣ）；アスパルテーム；アスパルテームおよびラクトース；アルギン酸塩；炭酸カルシウム；カルボポール；カラギーナン；酢酸フタル酸セルロースをベースとするコーティング剤；セルロースをベースとするコーティング剤；セルロースおよびラクトースの組み合わせ；薄膜コーティングシステム用の着色剤；クロスカルメロースナトリウム；クロスポビドン；デキストロース；セバシン酸ジブチル；エチルセルロースをベースとするコーティング剤；フルクトース；ゲランガム；ベヘン酸グリセリル；蜂蜜；ラクトース（無水物）；ラクトース（一水和物）；ラクトースおよびアスパルテーム；ラクトースおよびセルロース；ラクトースおよび微結晶セルロース；Ｌ−ＨＰＣ（低置換ヒドロキシプロピルセルロース）；ステアリン酸マグネシウム；マルトデキストリン；マルトースＤＣ；マンニトールＤＣ；メチルセルロースをベースとするコーティング剤；微結晶セルロース；メタクリル樹脂をベースとするコーティング剤；微結晶セルロースおよびカラギーナン；微結晶セルロースおよびグアーガム；微結晶セルロースおよびラクトース；微結晶セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム；糖蜜ＤＣ；フタル酸ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡＰ）；ポビドン；シェラック；グリコール酸ナトリウムデンプン；ソルビトール（結晶）；ソルビトール（特殊溶液）；デンプンＤＣ；スクロースＤＣ；糖球；クエン酸トリエチルおよびキサンタンガム。他の賦形剤としては、抗酸化剤および抗凍結剤が挙げられる。
抗酸化剤は、溶液からフリーラジカルを除去することによって酸化を阻害することができる物質である。抗酸化剤は当該分野で周知であり、以下の物質が挙げられる：アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体（例えば、アスコルビン酸パルミテート、アスコルビン酸ステアレート、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウムなど）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸アルキル、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メタ−重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、ジチオン酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム。ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、トコフェロールおよびその誘導体（例えば、ｄ−αトコフェロール、ｄ−α酢酸トコフェロール、ｄｌ−α酢酸トコフェロール、ｄ−αコハク酸トコフェロール、β−トコフェロール、δ−トコフェロール、γ−トコフェロール、およびｄ−αコハク酸トコフェロールポリオキシエチレングリコール１０００）、モノチオグリセロール、および亜硫酸ナトリウム。このような物質は、通常、約０．０１から約２％までの範囲で添加される。
凍結乾燥させられた産物、または低温で保存された産物については、１つ以上の抗凍結剤が添加され得る。タンパク質についての一般的な抗凍結剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、マルトースなどのような糖；イノシトール、エチレングリコール、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、マンニトール、２−メチル−２，４−ペンタン−ジオールなどのようなポリオール；グルタミン酸Ｎａ、プロリン、α−アラニン、β−アラニン、グリシン、リジン−ＨＣｌ、４−ヒドロキシプロリンなどのようなアミノ酸；ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドンなどのようなポリマー、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、およびフッ化ナトリウムなどのような無機塩；酢酸ナトリウム、ナトリウムポリエチレン、カプリル酸ナトリウム、プロピオン酸塩、乳酸塩、コハク酸塩などのような有機塩；さらには、トリメチルアミンＮ−オキサイド、サルコシン、ベタイン、γ−アミノ酪酸、オクタピン、アラノピン、ストロンビン、ジメチルスルホキシド、およびエタノールのような物質。
本発明にはまた、ＰＳＭＡタンパク質の組成物を調製または処理するための方法も含まれる。ＰＳＭＡタンパク質の水溶液がこれらの方法に含まれる。これらの方法のいくつかには、約４から約８の範囲になるようにｐＨを調節する工程が含まれる。いくつかの方法においては、ｐＨは、約５から約７の範囲になるように調節され、より好ましくは、ｐＨは、約５．５から７の範囲になるように調節される。最も好ましくは、ｐＨは、約６になるように調節される。組成物にはまた、等張化剤、緩衝物質、界面活性剤、抗酸化剤、抗凍結剤、または他の賦形剤のいずれか１つまたは組み合わせも含まれ得る。組成物にキレート化剤が含まれないことが好ましい。
本発明の別の態様に従うと、ＰＳＭＡタンパク質の組成物は、ＰＳＭＡタンパク質の組成物を、ＰＳＭＡの二量体会合を促進または保存する因子（例えば、上記に提供された、ｐＨ調整剤、金属イオン、および／または塩）と接触させることによって処理される。これらの因子を含む組成物にはまた、等張化剤、緩衝物質、界面活性剤、抗酸化剤、抗凍結剤、および他の賦形剤から選択される因子も含まれ得るが、キレート化剤が含まれないことが好ましい。このような方法にはまた、ＰＳＭＡタンパク質が溶液中に存在する場合には、ＰＳＭＡタンパク質の組成物を、他の二量体化を促進または保存する因子と接触させる工程、および／あるいはｐＨを調節する工程がさらに含まれ得る。
加えて、本発明の別の態様においては、ＰＳＭＡタンパク質を精製する方法も提供される。ＰＳＭＡを精製する方法には、ＰＳＭＡの多量体、特に、二量体会合を保存または促進する本明細書中に記載される因子および／または溶液のいずれかの使用が、当該分野で公知の分離技術のいずれかと組み合わせて含まれる。このような分離技術としては、クロマトグラフィー（例えば、ＴＳＫゲル濾過クロマトグラフィー）が挙げられ、以下の実施例においてさらに詳細に記載される。例えば、本発明のこの態様に含まれる分離技術には、カラム上にサンプルを載せる工程、カラムからサンプルを溶出させるか、またはカラムを洗浄する工程、および溶出させられた画分を回収する工程が含まれ得る。このような工程は、所望されるＰＳＭＡタンパク質組成物が生じるまで任意の回数繰り返され得る。これらの工程には、通常、ＰＳＭＡタンパク質を含むサンプルがそれによって透析される工程もまた含まれ得る。好ましくは、ＰＳＭＡタンパク質を含むサンプルは、ＰＳＭＡの多量体への会合を保存または促進する溶液中で透析される。１つの実施形態においては、これらの方法において使用される溶液には、金属イオンまたは塩が含まれる。他の実施形態においては、溶液は、ＰＳＭＡの多量体化を保存または促進するｐＨである。これらの精製方法において使用することができる濃度域さらにはｐＨ範囲を含む、金属イオンおよび塩は、上記で提供されている。いくつかの好ましい実施形態においては、溶液のｐＨは、約７から７．５であり得る。他の好ましい実施形態においては、金属は、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、またはそれらの組み合わせである。カルシウムおよびマグネシウムイオンは、例えば、それぞれ、約１ｍＭ、および約０．５ｍＭの濃度で存在する。他の好ましい実施形態においては、塩は、約２Ｍの濃度で存在する。
本明細書中に提供される組成物中の二量体ＰＳＭＡの量は、ＰＳＭＡを発現する細胞に対する免疫応答を誘発するかまたは増強させるために有効である。したがって、組成物を、二量体ＰＳＭＡに対する抗体を惹起させる目的のために動物を免疫化するために使用することができる。本明細書中に提供される組成物はまた、ガンに罹患している被験体を処置するために使用することもできる。ここでは、ガン細胞または隣接している新脈菅系はＰＳＭＡを発現する。このようなガンとしては、前立腺ガン、膀胱ガン、膵臓ガン、肺ガン、結腸ガン、腎臓ガン、黒色腫、および肉腫が挙げられ得る。好ましい実施形態においては、ガン細胞は前立腺ガン細胞である。ガン細胞はまた、原発性腫瘍の細胞であってもよく、また、転移性腫瘍の細胞であってもよい。
被験体は、去勢されていない患者であり得、いくつかの実施形態においては、一次療法、例えば、前立腺切除術または放射線治療を受けた患者であり得る本明細書中で使用される場合は、「去勢されていない患者」は、いくつかの実施形態においては、約１８０ｎｇ／ｍＬ以上の血清テストステロン濃度を有している患者をいう。被験体はまた、去勢された患者でもあり得、いくつかの実施形態においては、ホルモン療法が完了した患者であり得る。本明細書中で使用される場合は、用語「去勢された患者」は、約５０ｎｇ／ｍＬ未満の血清テストステロン濃度を有する患者をいう。本明細書中に提供される組成物はまた、従来のガン治療法を受けた患者にも投与することができる。
本発明の別の態様により、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。ここでは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＳＭＡ上のその標的エピトープに対する二次抗体の特異的結合を競合的に阻害し、二次抗体は、以下からなる群より選択される：ＰＳＭＡ３．７、ＰＳＭＡ３．８、ＰＳＭＡ３．９、ＰＳＭＡ３．１１、ＰＳＭＡ５．４、ＰＳＭＡ７．１、ＰＳＭＡ７．３、ＰＳＭＡ１０．３、ＰＳＭＡ１．８．３、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１、４．２４８．２、４．３６０．３、４．７．１、４．４．１、４．１７７．３、４．１６．１、４．２２．３、４．２８．３、４．４０．２、４．４８．３、４．４９．１、４．２０９．３、４．２１９．３、４．２８８．１、４．３３３．１、４．５４．１、４．１５３．１、４．２３２．３、４．２９２．３、４．３０４．１、４．７８．１、および４．１５２．１。
本発明の別の態様により、以下からなる群より選択される抗体によって定義されるＰＳＭＡ上のエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される：ＰＳＭＡ３．７、ＰＳＭＡ３．８、ＰＳＭＡ３．９、ＰＳＭＡ３．１１、ＰＳＭＡ５．４、ＰＳＭＡ７．１、ＰＳＭＡ７．３、ＰＳＭＡ１０．３、ＰＳＭＡ１．８．３、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１、４．２４８．２、４．３６０．３、４．７．１、４．４．１、４．１７７．３、４．１６．１、４．２２．３、４．２８．３、４．４０．２、４．４８．３、４．４９．１、４．２０９．３、４．２１９．３、４．２８８．１、４．３３３．１、４．５４．１、４．１５３．１、４．２３２．３、４．２９２．３、４．３０４．１、４．７８．１、および４．１５２．１。
特定の実施形態においては、これらの抗体は、それぞれ、ＰＳＭＡ３．７、ＰＳＭＡ３．８、ＰＳＭＡ３．９、ＰＳＭＡ３．１１、ＰＳＭＡ５．４、ＰＳＭＡ７．１、ＰＳＭＡ７．３、ＰＳＭＡ１０．３、ＰＳＭＡ１．８．３、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２４８．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３６０．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１７７．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１６．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４０．２、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４８．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４９．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２０９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２１９．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８８．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３３３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．５４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５３．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２３２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２９２．３、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３０４．１、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７８．１、およびＡｂｇｅｎｉｘ ４．１５２．１と本明細書中で呼ばれるハイブリドーマによって生産される。これらのハイブリドーマは、国際寄託当局（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）としてのＡＴＣＣに寄託され、以下の特許寄託番号が与えられた（表１）：
Figure 2007509977
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 本発明の別の態様においては、特定の配列を有している抗体が提供される。具体的には、抗体は、以下を含む複数の抗体からなる群より選択される：配列番号２〜７に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の重鎖コード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる重鎖、および配列番号８〜１３に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の軽鎖コード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる軽鎖。上記抗体の抗原結合フラグメントもまた提供される。
抗体ＰＳＭＡ１０．３、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドもまたＡＴＣＣに寄託されており、上記の表１に示されている。本明細書中で使用される場合は、寄託されたハイブリドーマまたはプラスミドの名称は、抗体の名称と同義的に使用される場合がある。これらの名称が抗体をいうように意図される場合があり、また、これらの名称が、抗体をコードするかまたは生産する、それぞれ、プラスミドまたはハイブリドーマをいう場合もあることは、当業者に明らかである。加えて、抗体の名称は、表１に示される名称の略された形態である場合もある。例えば、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６は、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６、ＰＧ１−ＸＧ１−００６、ＸＧ１−００６、００６などと呼ばれる場合もある。別の例においては、抗体の名称ＰＳＭＡ ４．２３２．３は、ＰＳＭＡ４．２３２．１、４．２３２．３、４．２３２．１、４．２３２などと呼ばれる場合もある。抗体の名称のバリエーションの全てが同じ抗体を意味し、異なるものを意味するものではないことが意図される。
重鎖配列と軽鎖配列の特定セットによってコードされる抗体もまた提供される。１つの実施形態においては、配列番号２および８に示される核酸配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６）が提供される。別の実施形態においては、抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６）は、配列番号３および９に示されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる。さらに別の実施形態においては、抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１）は、配列番号４および１０に示されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる。なお別の実施形態においては、抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９）は、配列番号５および１１に示されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる。別の実施形態においては、抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７）は、配列番号６および１２に示されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる。なお別の実施形態においては、抗体（ＰＳＭＡ１０．３）は、配列番号７および１３に示されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる。
特定の好ましい実施形態においては、抗体には、配列番号１４、１８、２２、２６、および３０に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる重鎖可変領域と、配列番号１６、２０、２４、２８、および３２に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる軽鎖可変領域が含まれる。本明細書中で使用される場合は、「コード領域」は、ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列の１つの領域をいう。コード領域には、シグナルペプチドのような、後で切断されるタンパク質の部分をコードする領域が含まれ得る。
当業者は、本発明には、本明細書中に示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む核酸およびポリペプチドが含まれることを理解するであろう。いくつかの例においては、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列には、シグナルペプチドをコードするかまたはシグナルペプチドである配列が含まれる場合もある。本発明には、これらの配列のそれぞれが、シグナルペプチドをコードするかまたはシグナルペプチドである配列の部分とともに、あるいはそのような部分を伴わずに含まれる。
重鎖可変配列と軽鎖可変配列の特定のセットを含む抗体もまた提供される。１つの実施形態においては、抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６）には、配列番号１４および１６に示される核酸配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる免疫グロブリン可変配列が含まれる。同様に、この抗体には、配列番号１５および１７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列が含まれる場合もある。別の実施形態においては、抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６）には、配列番号１８および２０に示されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる免疫グロブリン可変配列が含まれるか、または、この抗体には、配列番号１９および２１に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列が含まれる。さらに別の実施形態においては、抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１）には、配列番号２２および２４に示されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる免疫グロブリン可変配列が含まれるか、または、この抗体には、配列番号２３および２５に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列が含まれる。なお別の実施形態においては、抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９）には、配列番号２６および２８に示されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる免疫グロブリン可変配列が含まれるか、または、この抗体には、配列番号２７および２９に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列が含まれる。別の実施形態においては、抗体（ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７）には、配列番号３０および３２に示されるヌクレオチド配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる免疫グロブリン可変配列が含まれるか、または、この抗体には、配列番号３１および３３に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変配列が含まれる。
特定の実施形態においては、抗体は、上記の核酸分子に対して高度に相同である核酸分子によってコードされる。好ましくは、相同核酸分子には、本明細書中に提供されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％同一であるヌクレオチド配列が含まれる。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書中に提供されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一である。相同性は、当業者に周知である種々の、公的に利用できるソフトウェアツールを使用して計算することができる。例示的なツールとしては、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のウェブサイトから利用できるＢＬＡＳＴシステムが挙げられる。
相同性の高いヌクレオチド配列を同定する１つの方法は、核酸のハイブリダイゼーションによる。したがって、本発明にはまた、上記の核酸分子に対して、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、ＰＳＭＡ結合特性と本明細書中に記載される他の機能的特性を有している抗体も含まれる。関連する配列の同定はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および関連する核酸配列をクローニングするために適切な他の増幅技術を使用して行うこともできる。好ましくは、ＰＣＲプライマーは、ＣＤＲのような、目的の核酸配列の一部を増幅するように選択される。
用語「高いストリンジェンシーの条件」は、本明細書中で使用される場合は、当該分野でよく知られているパラメーターをいう。核酸のハイブリダイゼーションのパラメーターは、そのような方法が集められている参考文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，編、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて見ることができる。高いストリンジェンシーの条件の一例は、ハイブリダイゼーション緩衝剤（３．５×ＳＳＣ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のポリビニルピロリドン、０．０２％のウシ血清アルブミン、２．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）中で６５℃でのハイブリダイゼーションである。ＳＳＣは、０．１５Ｍの塩化ナトリウム／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）であり、ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり、そしてＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、核酸がその上に移されている膜は、例えば、２×ＳＳＣ中で、室温で洗浄され、その後、０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで、室温から６８℃までで洗浄される。
他の好ましい実施形態においては、抗体には、配列番号１５、１９、２３、２７、および３１に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７、２１、２５、２９、および３３に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。本明細書中で別の場所に記載されるように、上記の抗原結合フラグメントもまた、提供される。
本明細書中で使用される場合は、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互につなげられた、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質をいう。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と、重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中では、ＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と、軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定量領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が間に挟まっている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに分けることができる。ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端方向へと並べられた、３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれる。抗体の定常領域は、宿主組織、または免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および従来の補体システムの第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
用語抗体の「抗原結合フラグメント」は、本明細書中で使用される場合は、抗原（例えば、ＰＳＭＡ）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上の部分をいう。抗体の抗原結合機能が、全長の抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。用語抗体の「抗原結合フラグメント」に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインから構成される一価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１つのアームのＶＬおよびＶＨドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組み換え方法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３を参照のこと）を形成する１つのタンパク質鎖として作成することができるように、合成のリンカーによって連結することができる。このような単鎖抗体もまた、用語抗体の「抗原結合部分」に含まれるように意図される。これらの抗体フラグメントは、Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ９８−１１８（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８３）（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているタンパク質分解的フラグメント化手順のような、従来の手順を使用して、さらには、当業者に公知の他の技術によって、得られる。フラグメントは、完全な抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。
「単離された抗体」は、本明細書中で使用される場合は、種々の抗原特異性を有している他の抗体を実質的に含まない抗体をいう（例えば、ＰＳＭＡに特異的に結合する単離された抗体は、ＰＳＭＡ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）ように意図される。しかし、ＰＳＭＡのエピトープ、イソ型、または変異体に特異的に結合する単離された抗体は、他の関連する抗原、例えば、他の種に由来する関連する抗原（例えば、ＰＳＭＡ種ホモログ）に対して交差反応性を有する。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化合物を実質的に含まない場合もある。本明細書中で使用される場合は、「特異的結合」は、予め決定された抗原に対する抗体の結合をいう。通常は、抗体は、予め決定された抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合についてのその親和性よりも、少なくとも２倍大きい親和性で結合する。
本発明の単離された抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥのような、種々の抗体イソ型が含まれる。本明細書中で使用される場合には、「イソ型」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。抗体は全長である場合もあり、また、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、またはＩｇＥの抗体定常ドメインおよび／または可変ドメインのような抗原結合フラグメントのみが含まれる場合もあり、また、抗体はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメントから構成される場合もある。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の混合物である場合もある。抗体は、当該分野で周知の種々の技術によって生産することができる。ポリクローナル抗体を惹起させるための手順は周知である。例えば、抗ＰＳＭＡポリクローナル抗体は、予備免疫血清を得るために最初に採血したＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄシロウサギに対して、ＰＳＭＡタンパク質を皮下投与することによって惹起させられる。ＰＳＭＡは、６箇所の異なる部位に、１つの部位について１００μＬの全用量が、通常は、１つ以上のアジュバントとともに注射され得る。その後、ウサギは、最初の注射の２週間後に採血され、同じ抗原で６週間ごとに３回、定期的に追加投与される。血清サンプルが、それぞれの追加投与の１０日後に採取される。ポリクローナル抗体が血清から、好ましくは、抗体を捕捉するためにＰＳＭＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、回収される。ポリクローナル抗体を惹起させるためのこの手順および他の手順は、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．編，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。
モノクローナル抗体の生産は、これもまた当該分野で周知である技術によって行うことができる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合は、単分子組成物の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体は、１つの結合特異性と、特定のエピトープに対する親和性を示す。モノクローナル抗体の生産プロセスには、抗体を生産する能力を有している免疫体細胞、具体的には、Ｂリンパ球を得ることが含まれ、免疫体細胞は、生体内または生体外のいずれかで目的の抗原で予め免疫化されており、Ｂ細胞骨髄腫株との融合に適している。
一般的には、哺乳動物のリンパ球は、所望されるタンパク質またはポリペプチドで（例えば、本発明のＰＳＭＡで）動物（例えば、マウス）を生体内で免疫化することによって免疫化させられる。このような免疫化は、必要に応じて、十分な力価の抗体が得られるまで、数週間までの間隔で繰り返される。一旦免疫化されると、動物は、抗体を生産するリンパ球の供給源として使用され得る。最後の抗原の追加投与の後、動物は屠殺され、脾臓細胞が取り出される。マウスのリンパ球は、本明細書中に記載されるマウスの骨髄腫株との安定な融合体を高い割合で生じる。これらのうち、ＢＡＬＢ／ｃマウスが好ましい。しかし、他のマウス株、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、およびカエルもまた、抗体を生産する細胞を調製するための宿主として使用することができる。Ｇｏｄｉｎｇ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版、ｐｐ．６０−６１、Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌａ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を参照のこと。具体的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子がゲノム中に挿入されている（そして、マウス免疫グロブリンを生産することはできない）マウス株が好ましい。例として、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって生産されているＨｕＭＡｂマウス株、およびＡｂｇｅｎｉｘによって生産されているＸｅｎｏＭｏｕｓｅ株が挙げられる。このようなマウスは、免疫化に応答して、全長のヒト免疫グロブリン分子を生産する。
分裂しつつある形質芽球の段階にあるこれらの抗体を生産する細胞は、優先的に融合する。体細胞は、抗原で感作させられた動物のリンパ節、脾臓、および末梢血から、ならびに、特定の融合システムにおけるそれらの経験的な有用性に大部分依存して選択されるリンパ球から、得ることができる。次いで、抗体を分泌するリンパ球が、細胞培養物中で無限に複製することができる（マウスの）Ｂ細胞骨髄腫細胞または形質転換細胞と融合させられ、それによって、不死化させられた免疫グロブリンを分泌する細胞株が生産される。得られた融合細胞またはハイブリドーマが培養され、得られたコロニーは、所望されるモノクローナル抗体の生産についてスクリーニングされる。このような抗体を生産するコロニーがクローニングされ、生体内または生体外のいずれかで増殖させられて、大量の抗体が生産される。このような細胞を融合させる理論的根拠および実際の方法論は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）に示されている。
あるいは、抗体を生産することができるヒトの体細胞、具体的には、Ｂリンパ球は、骨髄腫細胞株との融合に適している。生検された個体の脾臓、扁桃腺、またはリンパ節に由来するＢリンパ球が使用され得るが、より簡単に入手することができる末梢血Ｂリンパ球が好ましい。リンパ球は、診断された前立腺ガン、または別のＰＳＭＡを発現するガンを有している患者から導くことができる。さらに、ヒトのＢ細胞は、エプスタインバーウイルス（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ７７−９６）によって直接不死化させられ得る。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を生産させるための他の技術、例えば、ウイルス、またはＢリンパ球の発ガン性形質転換を使用することができる。
ハイブリドーマを生産する融合手順での使用に適している骨髄腫細胞株は、好ましくは、抗体を生産しないものであり、高い融合効率を有している、所望されるハイブリドーマの増殖をサポートする特定の選択培地中で増殖することをできなくする酵素欠損を有している。融合させられた細胞株の生産のために使用することができるこのような骨髄腫細胞株の例としては、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４．１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、Ｓ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌ（全てマウスに由来する）；Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ラット由来のＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０；ならびに、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、ＵＣ７２９−６（全てヒトに由来する）が挙げられる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版、ｐｐ６５−６６，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３，Ｂｕｒｄｅｎ ａｎｄ Ｖｏｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，編、ｐｐ．７５−８３，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｗ，１９８４）。
哺乳動物の骨髄腫細胞または細胞培養物中で無限に複製することができる他の融合パートナーとの融合は、標準的な周知の技術によって、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または他の融合剤を使用することによって行われる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｏｈｌｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。
他の実施形態においては、抗体は組み換え抗体であり得る。用語「組み換え抗体」は、本明細書中で使用される場合は、組み換え手段によって調製されたか、発現させられたか、作成されたか、または単離された抗体を含むように意図され、例えば、別の種の免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、宿主細胞中にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換え体、組み合わせ抗体ライブラリーから単離された抗体、あるいは、他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製されたか、発現させられたか、作成されたか、または単離された抗体である。
なお他の実施形態においては、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。本明細書中で使用される場合は、用語「キメラ抗体」は、マウスの可変または超可変領域を、ヒトの定常領域、またはヒトの定常領域および可変フレームワーク領域と組み合わせた抗体をいう。本明細書中で使用される場合は、用語「ヒト化抗体」は、ヒトのフレームワーク領域と会合した状態でもとの抗体に由来する抗原結合ＣＤＲのみが残っている抗体をいう（Ｗａｌｄｍａｎｎ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５７を参照のこと）。マウス抗体の結合特異性を保持しているこのようなキメラ抗体またはヒト化抗体は、本発明の診断適用、予防適用、または治療適用のために生体内で投与される場合には、低い免疫原性を有していると予想される。
別の実施形態に従うと、本発明のモノクローナル抗体は、二重特異的抗体または多特異的抗体の形態になるように修飾することができる。用語「二重特異的抗体」は、（ａ）細胞表面抗原、および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合するか、またはそれらと相互作用する２つの異なる結合特異性を有している任意の因子、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチドの複合体を含むように意図される。用語「多特異的抗体」は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、および（ｃ）少なくとも１つの他の成分に結合するか、またはそれらと相互作用する２つ以上の異なる結合特異性を有している任意の因子、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチドの複合体を含むように意図される。したがって、本発明には、ＰＳＭＡのような細胞表面抗原と、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対して向けられた、二重特異的、三重特異的、四重特異的、および他の多特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。用語「二重特異的抗体」にはさらに、ダイアボディーが含まれる。ダイアボディーは、ＶＨドメインとＶＬドメインが１つのポリペプチド鎖の上で発現されるが、同じ鎖の上の２つのドメインの間で対を形成させるには短すぎるリンカーを使用しており、それによって、これらのドメインを別の鎖の相補ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を生じるように向ける、二価の二重特異的抗体である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｉｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。
二重特異的抗体は、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的である抗原結合領域と、殺腫瘍活性または腫瘍阻害活性を有しているエフェクター細胞に特異的な抗原結合領域から形成され得る。二重特異的抗体の２つの抗原結合領域は、化学的に連結させられているか、または二重特異的抗体を生じるように遺伝子操作された細胞によって発現されるかのいずれかであり得る（一般的には、Ｆａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ ＆ Ｐｅｒｓｐｅｃ．８（３）：１３３−１３７を参照のこと）。殺腫瘍活性を有している適切なエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞（初代ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラー細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の二重特異的抗体の有効量が前立腺ガン患者に投与され、ＰＳＭＡを有している原発性腫瘍または転移性腫瘍の部位での局在化の後、二重特異的抗体によって、悪性細胞が死滅させられるか、そして／または悪性細胞の増殖が阻害される。
特定の実施形態においては、抗体はヒト抗体である。用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用される場合は、ヒトの生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有している抗体を含むように意図される。本発明のヒト抗体には、ヒトの生殖系の免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、生体外でのランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発によって、あるいは、生体内での体細胞変異によって導入された変異）が含まれる場合がある。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用される場合は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に繋がれている抗体（本明細書中では、「ヒト化抗体」と呼ばれる）を含むようには意図されない。ＰＳＭＡに対して向けられたヒト抗体は、マウスのシステムではなく、ヒトの免疫システムの一部を保有しているトランスジェニックマウスを使用して作成される。
完全なヒトモノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座と軽鎖遺伝子座の大きい部分についてトランスジェニックであるマウスを免疫化することによって調製することが出来る。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５９８，３６９号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５４５，８０７号、同第６，１５０，５８４号、およびそれらの中で引用されている参考文献を参照のこと（それらの内容は、引用により本明細書中に組み入れられる）。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の生産について機能欠損であるように、遺伝子修飾されている。これらの動物はさらに、ヒトの生殖系免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むように修飾され、その結果、これらの動物の免疫化によって、目的の抗原に対する完全なヒト抗体の生産が生じる。これらのマウス（例えば、ＸｏｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫化の後、モノクローナル抗体が、標準的なハイブリドーマ技術にしたがって作成される。これらのモノクローナル抗体は、ヒトの免疫グロブリンアミノ酸配列を有しており、したがって、ヒトに投与された場合に、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を誘発することはない。
マウスは、最初の免疫化の際に６〜１６週齢であることが好ましい。例えば、精製されたか、または富化させられたＰＳＭＡ抗原の調製物（例えば、組み換えＰＳＭＡ、ＰＳＭＡを発現する細胞、二量体ＰＳＭＡ）は、マウスを腹腔内（ＩＰ）で免疫化するために使用されるが、当業者に公知である他の免疫化経路もまた可能である。ＰＳＭＡ抗原は、アジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント）と組み合わせて注射され、最初の注射の後に、アジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）中の抗原での追加免疫が続くことが好ましい。免疫応答は、例えば、後眼窩採血によって得られる血漿サンプルを用いる一連の免疫化プロトコールの全体についてモニターされる。血漿は、ＥＬＩＳＡ（以下に記載される）によってスクリーニングされ、十分な力価の抗ＰＳＭＡヒト免疫グロブリンを有しているマウスが融合のために使用される。マウスは、屠殺、および脾臓が取り出される３日前に抗原を静脈内に追加投与される。
特定の実施形態においては、抗体は、本明細書中で、ＰＳＭＡ ３．７（ＰＴＡ−３２５７）、ＰＳＭＡ ３．８、ＰＳＭＡ ３．９（ＰＴＡ−３２５８）、ＰＳＭＡ ３．１１（ＰＴＡ−３２６９）、ＰＳＭＡ ５．４（ＰＴＡ−３２６８）、ＰＳＭＡ ７．１（ＰＴＡ−３２９２）、ＰＳＭＡ ７．３（ＰＴＡ−３２９３）、ＰＳＭＡ １０．３（ＰＴＡ−３２４７）、ＰＳＭＡ １．８．３（ＰＴＡ−３９０６）、ＰＳＭＡ Ａ３．１．３（ＰＴＡ−３９０４）、ＰＳＭＡ Ａ３．３．１（ＰＴＡ−３９０５）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２４８．２（ＰＴＡ−４４２７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３６０．３（ＰＴＡ−４４２８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７．１（ＰＴＡ−４４２９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４．１（ＰＴＡ−４５５６）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１７７．３（ＰＴＡ−４５５７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１６．１（ＰＴＡ−４３５７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２２．３（ＰＴＡ−４３５８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８．３（ＰＴＡ−４３５９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４０．２（ＰＴＡ−４３６０）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４８．３（ＰＴＡ−４３６１）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．４９．１（ＰＴＡ−４３６２）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２０９．３（ＰＴＡ−４３６５）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２１９．３（ＰＴＡ−４３６６）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２８８．１（ＰＴＡ−４３６７）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３３３．１（ＰＴＡ−４３６８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．５４．１（ＰＴＡ−４３６３）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．１５３．１（ＰＴＡ−４３８８）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２３２．３（ＰＴＡ−４３８９）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．２９２．３（ＰＴＡ−４３９０）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．３０４．１（ＰＴＡ−４３９１）、Ａｂｇｅｎｉｘ ４．７８．１（ＰＴＡ−４６５２）、およびＡｂｇｅｎｉｘ ４．１５２．１（ＰＴＡ−４６５３）と呼ばれるハイブリドーマによって生産される。これらのハイブリドーマは、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の要件にしたがい、それらを満たすように、国際寄託当局としてのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、上記の表１に示される特許寄託番号が与えられた。
本発明により、さらに、本明細書中に記載される、抗ＰＳＭＡ抗体をコードする核酸分子、およびこの核酸分子を含むベクターが提供される。提供されるベクターは、本明細書中に記載される抗体の特異性を有している抗ＰＳＭＡ抗体を生産するために、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。好ましい実施形態においては、生産される抗体は、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７、およびＰＳＭＡ１０．３の特異性を有する。１つの実施形態においては、ベクターには、配列番号２〜７に示される核酸配列のコード領域（単数または複数）を含む核酸分子によってコードされる、上記に列挙された抗体の重鎖をコードする単離された核酸分子が含まれ得る。別の実施形態においては、ベクターには、配列番号８〜１３に示される抗体の軽鎖をコードする核酸配列が含まれる。さらなる実施形態においては、本発明のベクターには、重鎖配列と軽鎖配列が含まれる場合がある。さらなる実施形態においては、本明細書中に記載される抗体または抗原結合フラグメントを生産するプラスミドが提供される。本発明のプラスミドとしては、以下からなる群より選択されるプラスミドが挙げられる：ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６重鎖（配列番号２）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６軽鎖（配列番号８）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６重鎖（配列番号３）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６軽鎖（配列番号９）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１重鎖（配列番号４）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１軽鎖（配列番号１０）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９重鎖（配列番号５）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９軽鎖（配列番号１１）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７重鎖（配列番号６）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７軽鎖（配列番号１２）、ＰＳＭＡ１０．３重鎖（配列番号７）、およびＰＳＭＡ１０．３κ（配列番号１３）。
単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、好ましくは、ＰＳＭＡを発現する生存している細胞に結合するその能力について選択される。ＰＳＭＡを発現する生存している細胞に対するモノクローナル抗体の結合を明らかにするためには、フローサイトメトリーが使用され得る。例えば、ＰＳＭＡを発現する細胞株（標準的な増殖条件下で増殖させた）、またはＰＳＭＡを発現する前立腺ガン細胞は、０．１％のＴｗｅｅｎ ８０と２０％のマウスの血清を含むＰＢＳ中で、種々の濃度のモノクローナル抗体と混合され、３７℃で１時間インキュベートされる。洗浄後、細胞は、フルオレセインで標識された抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ヒト抗ＰＳＭＡ抗体が使用される場合）と、一次抗体の染色と同じ条件下で反応させられる。サンプルは、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）によって、単一の細胞にゲートする光および側方散乱特性を使用して、分析することができる。蛍光顕微鏡を使用する別のアッセイが、（フローサイトメトリーアッセイに加えて、またはその代わりに）使用される場合もある。細胞は上記のように正確に染色することができ、蛍光顕微鏡によって試験することができる。この方法により、個々の細胞の視覚化ができるが、抗原の密度に応じて感度を下げることもできる。
抗体またはその抗原結合フラグメントのＰＳＭＡを発現する生存している細胞に対する結合は、細胞の増殖を阻害するか、または細胞の細胞溶解を媒介することができる。細胞溶解は、補体媒介され得るか、またはエフェクター細胞によって媒介され得る。好ましい実施形態においては、細胞溶解は、生存している生物体、好ましくは、哺乳動物において行われ、生存している細胞は腫瘍細胞である。本発明の抗体によって標的化することができる腫瘍の例としては、ＰＳＭＡを発現する任意の腫瘍、例えば、前立腺ガン、膀胱ガン、膵臓ガン、肺ガン、結腸ガン、腎臓ガン、黒色腫、および肉腫が挙げられる。好ましい実施形態においては、腫瘍細胞は前立腺ガン細胞である。
クロム放出アッセイによる生体外での抗体細胞溶解活性の試験によっては、生体内モデルを試験する前の最初のスクリーニングを提供することができる。この試験は、標準的なクロム放出アッセイを使用して行うことができる。簡単に説明すると、健常なドナーに由来する多核白血球（ＰＭＮ）または他のエフェクター細胞が、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、その後の混入している赤血球の溶解によって精製され得る。洗浄されたＰＭＮは、１０％の熱不活化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ中に懸濁させられ、ＰＳＭＡを発現する５１Ｃｒで標識された細胞と、種々のエフェクター細胞対腫瘍細胞比（エフェクター細胞：腫瘍細胞）で混合され得る。精製された抗ＰＳＭＡ ＩｇＧは、その後、種々の濃度で添加され得る。無関係なＩｇＧをネガティブ対照として使用することができる。アッセイは、３７℃で０〜１２０分間行われ得る。サンプルは、培養上清中への５１Ｃｒの放出を測定することによって、細胞溶解についてアッセイされ得る。抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体もまた、細胞溶解が複数のモノクローナル抗体を用いて増強されたかどうかを決定するために、それぞれの互いの組み合わせにおいて試験され得る。
ＰＳＭＡに結合する抗体はまた、ＰＳＭＡを発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の細胞溶解および死滅を媒介することにおけるそれらの効率を決定するための生体内モデル（例えば、マウスのもの）において試験され得る。これらの抗体は、例えば、限定とは意図されない、以下の基準に基づいて選択され得る：
１）ＰＳＭＡを発現する生存している細胞への結合；
２）ＰＳＭＡへの結合の高い親和性；
３）ＰＳＭＡ上の特有のエピトープへの結合（組み合わせて使用した場合に同じエピトープに対する結合について競合する、相補活性を有している抗体の可能性を排除するため）；
４）ＰＳＭＡを発現する細胞のオプソニン作用；
５）エフェクター細胞の存在下でのＰＳＭＡを発現する細胞の増殖の阻害、食作用、および／または死滅の媒介；
６）ＮＡＡＬＡＤａｓｅ、葉酸加水分解酵素、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ、および／またはγ−グルタミル加水分解活性の調節（阻害または増強）；
７）エフェクター細胞が存在しない条件下での、増殖の阻害、細胞周期の停止、および／または細胞傷害性；
８）ＰＳＭＡの内在化；
９）ＰＳＭＡ上の立体構造エピトープへの結合；
１０）ＰＳＭＡを発現しない細胞または組織との最小の交差反応性；
１１）単量体形態のＰＳＭＡではなく、二量体形態のＰＳＭＡへの優先的な結合。
本発明の好ましい抗体は、これらの基準の１つ以上、好ましくは、全てを満たす。特定の実施形態においては、抗体は、例えば、２つ以上の異なる抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む薬学的組成物として、使用される。例えば、様々ではあるが補体活性を有している抗ＰＳＭＡ抗体が、所望される治療効果または診断効果が得られるように、単独療法と組み合わせられ得る。この例は、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害する別の抗ＰＳＭＡ抗体と組み合わせられた、エフェクター細胞の存在下で標的細胞の非常に効率のよい死滅を媒介する抗ＰＳＭＡ抗体を含む組成物である。
本発明の好ましい態様においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＳＭＡ分子の細胞外ドメイン内の立体構造エピトープに結合する。選択されたヒトの抗ＰＳＭＡ抗体が立体構造エピトープに結合するかどうかを決定するためには、それぞれの抗体が、天然に存在するタンパク質を使用するアッセイ（例えば、非変性免疫沈降、細胞表面での結合についてのフローサイトメトリー分析）および変性させられたタンパク質を使用するアッセイ（例えば、ウェスタンブロット、変性させられたタンパク質についての免疫沈降）において試験され得る。結果の比較は、抗体が立体構造エピトープに結合するかどうかを示す。天然に存在するタンパク質に結合するが、変性させられたタンパク質には結合しない抗体は、立体構造エピトープに結合する抗体であり、好ましい抗体である。
本発明の別の好ましい態様においては、抗体またはその抗原結合フラグメントはＰＳＭＡ上の二量体特異的エピトープに結合する。一般的には、二量体特異的エピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＳＭＡ単量体ではなくＰＳＭＡ二量体に優先的に結合する。選択されたヒト抗ＰＳＭＡ抗体がＰＳＭＡ二量体に優先的（すなわち、選択的および／または特異的）に結合するかどうかを決定するために、それぞれの抗体は、天然に存在する二量体ＰＳＭＡタンパク質と、解離させられた単量体ＰＳＭＡタンパク質を使用するアッセイ（例えば、免疫沈降、その後のウェスタンブロット）において試験され得る。結果の比較は、抗体が単量体が二量体または単量体に優先的に結合するかどうかを示す。ＰＳＭＡ二量体に結合し、単量体ＰＳＭＡタンパク質には結合しない抗体が、好ましい抗体である。
好ましい抗体としては、ＰＳＭＡ上のその標的エピトープに対する二次抗体の特異的な結合を競合的に阻害する抗体が挙げられる。競合的阻害を決定するためには、当業者に公知の種々のアッセイが使用され得る。例えば、実施例４および２１に示される交差競合アッセイが、抗体が別の抗体によるＰＳＭＡに対する結合を競合的に阻害するかどうかを決定するために使用され得る。これらの実施例により、フローサイトメトリー、または固相結合分析を使用する細胞をベースとする方法が提供される。細胞の表面上では発現されないＰＳＭＡ分子について交差競合する抗体の能力を、固相または溶液相において評価する他のアッセイもまた、使用され得る。これらのアッセイは、好ましくは、本明細書中に記載されるＰＳＭＡ多量体を使用する。
特定の好ましい抗体は、ＰＳＭＡ上のその標的エピトープに対する二次抗体の特異的結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％競合的に阻害する。阻害は、種々のモル比または質量比で評価することができる；例えば、競合結合実験は、二次抗体を上回る、２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、またはそれ以上のモル過剰の一次抗体を用いて行うことができる。
他の好ましい抗体としては、二次抗体によって定義されるＰＳＭＡ上のエピトープに特異的に（すなわち、選択的に）に結合する抗体が挙げられる。エピトープを決定するためには、当該分野で公知の標準的なエピトープマッピング方法を使用することができる。例えば、二次抗体に結合するＰＳＭＡ抗原（好ましくは、合成のペプチド）のフラグメント（複数のペプチド）は、候補の抗体が同じエピトープに対して結合するかどうかを決定するために使用することができる。直線的なエピトープについては、定義された長さ（例えば、８個以上のアミノ酸）の重複しているペプチドが合成される。ペプチドは、好ましくは、１個のアミノ酸によってオフセットされ、その結果、ＰＳＭＡタンパク質配列のそれぞれ８個のアミノ酸のフラグメントをカバーするペプチドのシリーズが調製される。より少ないペプチドを、より大きなオフセット、例えば、２個または３個のアミノ酸を使用することによって調製することができる。さらに、より長いペプチド（例えば、９マー、１０マー、または１１マー）を合成することができる。ペプチドの抗体に対する結合は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ；実施例２２を参照のこと）およびＥＬＩＳＡアッセイを含む標準的な方法論を使用して決定することができる。立体構造エピトープの試験については、より長いＰＳＭＡフラグメントが使用され得る。立体構造エピトープを定義するために質量スペクトル分析を使用する他の方法が記載されており、これらを使用することができる（例えば、Ｂａｅｒｇａ−Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１：１３００−１３０８，２００２、およびその中で引用されている参考文献を参照のこと）。エピトープの決定のためのさらに他の方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓの、ｓｔａｎｄａｒｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｗｏｒｋｓ、例えば、Ｕｎｉｔ ６．８（「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」）およびＵｎｉｔ ９．８（「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」）に提供されている。エピトープは、既知のエピトープの中に点変異または欠失を導入し、その後、どの変異が抗体の結合を減少させるかを決定するために１つ以上の抗体との結合を試験することによって、確認することができる。
本発明の１つの実施形態においては、抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞上で発現されるＰＳＭＡに結合するか、またはＰＳＭＡとともに内在化される。抗体またはその抗原結合フラグメントが前立腺特異的膜抗原とともに内在化される機構は、本発明の実施には重要ではない。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＳＭＡの内在化を誘導することができる。あるいは、抗体またはその抗原結合フラグメントの内在化は、ＰＳＭＡの通常行われている内在化の結果であり得る。抗体またはその抗原結合フラグメントは、単独で、または他の組成物との組み合わせにおいて、修飾されていない形態であり得る。あるいは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントの前立腺特異的膜抗原に対する結合の際、および前立腺特異的膜抗原と一緒に生物学的因子が内在化させられる際に、細胞を死滅させるために有効な物質に結合させられ得る。
本発明のヒトＰＳＭＡ抗体は、ナノモル未満の親和性で、細胞表面ＰＳＭＡ、および／またはｒｓＰＳＭＡに特異的に結合する。本発明のヒトＰＳＭＡ抗体は、約１×１０−９Ｍ以下、好ましくは、約１×１０−１０Ｍ以下、より好ましくは、約１×１０−１１Ｍ以下の結合親和性を有する。特定の実施形態においては、結合親和性は、約５×１０−１０Ｍ未満である。
抗体は、検出マーカー、抗腫瘍薬、または免疫調節剤に連結させられ得る。抗腫瘍薬としては、細胞傷害性薬、および腫瘍の新脈菅系に作用する因子が挙げられる。検出マーカーとしては、例えば、放射活性マーカーまたは蛍光マーカーが挙げられる。細胞傷害性薬としては、細胞傷害性放射性核種、化学毒素、およびタンパク質毒素が挙げられる。
細胞傷害性放射性核種、または放射線治療用放射性同位元素は、好ましくは、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２４Ｒａ、または２２３Ｒａのようなα線を放射する同位元素である。あるいは、細胞傷害性放射性核種は、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、１５３Ｓｍ、または１６６Ｈｏのようなβ線を放射する同位元素である場合もある。さらに、細胞傷害性放射性核種は、Ａｕｇｅｒ電子線および低エネルギー電子線を放射する場合もあり、これには、１２５Ｉ、１２３Ｉ、または７７Ｂｒが含まれる。
適切な化学毒素または化学療法薬としては、カリカエミシンおよびエスペラマイシンのような、分子のエンジインファミリーのメンバーが挙げられる。化学毒素はまた、メトトレキセート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、および５−フルオロウラシルからなる群より挙げることができる。本発明の抗ＰＳＭＡ抗体に結合させることができる他の抗新生物薬としては、ドラスタチン（米国特許第６，０３４，０６５号、および同第６，２３９，１０４号）およびそれらの誘導体が挙げられる。特定の目的としては、ドラスタチン１０（ドラバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロイン−ドラフェニン）および誘導体オーリスタチンＰＨＥ（ドラバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロイン−フェニルアラニン−メチルエステル）（Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１３（４）：２４３−２７７，１９８８；Ｗｏｙｋｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４，２００１）、およびオーリスタチンＥなどが挙げられる。本発明の組成物および方法にあまり好ましくない毒素としては、有毒レクチン、植物毒、例えば、リシン、アブリン、モデシン、ボツリヌス毒素およびジフテリア毒素が挙げられる。もちろん、種々の毒素の組み合わせもまた、１つの抗体分子と組み合わせ、それによって種々の細胞傷害性に適合させることができる。他の化学療法薬は当業者に公知である。
本発明のＰＳＭＡ抗体の毒素結合形態は、ピコモル濃度でＰＳＭＡを発現する細胞の特異的な細胞の死滅を媒介する。本発明の毒素に結合させられたＰＳＭＡ抗体は、約１×１０−１０Ｍ未満、好ましくは、約１×１０−１１Ｍ未満、より好ましくは、約１×１０−１２Ｍ未満の濃度で、ＩＣ５０を示す。特定の実施形態においては、ＩＣ５０は、約１．５×１０−１１Ｍ未満の濃度で得られる。
腫瘍の脈菅系に作用する因子としては、コンブレスタチンＡ４（Ｇｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２：８２，２００１）、アンギオスタチン、およびエンドスタチン（Ｒｏｓｅｎ，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ ５：２０，２０００（引用により本明細書中に組み入れられる）において概説されている）、およびインターフェロン誘導性タンパク質１０（米国特許第５，９９４，２９２号）のような、チューブリン結合因子を挙げることができる。現在臨床試験の段階にある多数の抗血管形成剤もまた想定される。現在臨床試験段階にある薬剤としては、以下が挙げられる：２ＭＥ２、アンギオスタチン、アンギオザイム、抗ＶＥＧＦ ＲｈｕＭＡｂ、Ａｐｒａ（ＣＴ−２５８４）、アビシン（Ａｖｉｃｉｎｅ）、ベネフィン（Ｂｅｎｅｆｉｎ）、ＢＭＳ２７５２９１、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＣ４０４７、ＣＣ５０１３、ＣＣ７０８５、ＣＤＣ８０１、ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ４１２）、ＣＭ１０１、コンブレタスタチンＡ−４プロドラッグ、ＥＭＤ １２１９７４、エンドスタチン、フラボピリドール、ジェニステイン（ＧＣＰ）、緑茶抽出物（Ｇｒｅｅｎ Ｔｅａ Ｅｘｔｒａｃｔ）、ＩＭ−８６２、ＩｍｍＴｈｅｒ、インターフェロンα、インターロイキン−１２、イレッサ（ＺＤ１８３９）、マリマスタット、メタスタット（Ｃｏｌ−３）、メオバスタット、オクトレオチド、パクリタキセル、ペニシラミン、フォトフリン、フォトポイント、ＰＩ−８８、プリノマスタット（ＡＧ−３３４０）、ＰＴＫ７８７（ＺＫ２２５８４）、ＲＯ３１７４５３、ソリマスタット、スクアラミン、ＳＵ１０１、ＳＵ５４１６、ＳＵ−６６６８、スラジスタ（ＦＣＥ２６６４４）、スラミン（Ｍｅｔａｒｅｔ）、テトラチオモリブデート、サリドマイド、ＴＮＰ−４７０、およびビタキシン。さらなる抗血管形成剤は、Ｋｅｒｂｅｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９（１８ｓ）：４５ｓ−５１ｓ，２００１（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。抗ＰＳＭＡ抗体への結合に適している免疫調節剤としては、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）が挙げられる。
抗ＰＳＭＡ抗体に対する１つ以上の毒素分子のカップリングは、多くの化学的な機構、例えば、共有結合、親和性結合、層間、配位結合、および複合体形成が含まれると想定される。抗ＰＳＭＡ免疫毒素を調製するために使用される毒性化合物は、当該分野で公知の標準的なプロトコールによって、抗体またはそのＰＳＭＡ結合フラグメントに結合させられる。
共有結合は、既存の側鎖の直接の縮合によって、または外部の架橋分子の取り込みによるかのいずれかによって、行うことができる。多くの二価または多価の物質が、他のタンパク質、ペプチド、またはアミン官能基などに対してタンパク質分子をカップリングさせることにおいて有用である。例えば、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミンのようなカップリング剤は、文献に多く記載されている。これらのリストは、当該分野で公知の種々のカップリング剤の限定とは意図されず、むしろ、より一般的なカップリング剤の例である。
好ましい実施形態においては、最初に抗体を誘導し、その後、毒素成分に結合させて誘導体化生成物を生じることが望まれる場合があることが想定される。この様式において使用される適切な架橋剤としては、例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸）、およびＳＭＰＴ、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルジチオ）トルエンが挙げられる。
さらに、タンパク質毒素は、抗ＰＳＭＡ抗体またはＰＳＭＡ結合フラグメントに対して遺伝的方法によって融合させられて、ハイブリドーマ免疫毒素融合タンパク質が形成される。本発明にしたがって融合体である免疫毒素タンパク質を作成するためには、タンパク質毒素に連結させられた、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体のフラグメント、単鎖抗ＰＳＭＡ抗体、または抗ＰＳＭＡ抗体のサブユニットをコードする核酸分子が作成される。このような融合タンパク質には、動作可能であるように結合させられた、少なくとも１つの標的化因子（例えば、抗ＰＳＭＡ抗体サブユニット）と本発明の毒素が含まれる。融合タンパク質にはまた、別のペプチド配列、例えば、そのような別の配列が融合タンパク質の標的化活性または毒素活性に不適切な影響を与えない限りは、標的化因子と毒素化合物を動作可能であるように結合させるペプチドスペーサーも含まれる場合がある。２つのタンパク質は、当該分野で周知であるようなペプチドリンカーまたはスペーサー、例えば、グリシン−セリンスペーサーペプチド、またはペプチドヒンジによって結合させられ得る。したがって、例えば、抗ＰＳＭＡ抗体またはそのフラグメントのＣ末端が、抗ＰＳＭＡ抗体の結合特性を保持している免疫毒素を形成するように、タンパク質毒素分子のＮ末端に融合させられ得る。他の融合体配置は当業者に公知である。
融合体免疫毒素を発現させるために、融合タンパク質をコードする核酸は、融合タンパク質の、好ましくはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞中での安定な発現のために、標準的な方法にしたがって発現ベクター中に挿入される。融合タンパク質は、標準的な方法論、例えば、ＰＳＭＡアフィニティーカラムを使用して、細胞または培養上清から単離され、精製され得る。
放射性核種は、通常、キレート化によって抗体にカップリングさせられる。例えば、金属である放射性核種の場合には、二官能性キレート化剤が、抗体または目的の他のタンパク質に対して同位元素を連結させるために一般的に使用される。通常は、キレート化剤は、最初に抗体に結合させられ、キレート化剤−抗体結合体が、金属である放射性同位元素と接触させられる。多数の二官能性キレート化剤がこの目的のために開発されており、これには、米国特許第５，１２４，４７１号、同第５，２８６，８５０号、および同第５，４３４，２８７号（これらは、引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているアミノ酸のジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）シリーズが含まれる。別の例としては、ヒドロキサム酸をベースとする二官能性キレート化剤が、米国特許第５，７５６，８２５号（その内容は本明細書中に組み入れられる）に記載されている。別の例は、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサアザシクロ−オクタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’’，Ｎ’’’’’−六酢酸（Ｄｅａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：２９８８，１９９９）であり、これは、２２５Ａｃのような放射活性金属の有効なキレート化剤である。なお別の例は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）であり、これは、標識とその後の結合の２工程の方法において使用することができる、二官能性キレート化剤である（ＭｃＤｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：１５３７−１５４０，２００１を参照のこと）。
別の態様においては、本発明により、多量体（例えば、二量体）ＰＳＭＡタンパク質、単離された抗体、他の官能性部分に対して誘導体かさせられたかもしくは他の官能性部分に連結させられた抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント、あるいは、１つ以上の上記の多量体ＰＳＭＡタンパク質、抗体、またはその抗原結合フラグメントの組み合わせを含む組成物が提供される。組成物には、単離された多量体ＰＳＭＡタンパク質、抗体、またはその抗原結合フラグメントと混合された、生理学的または薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤が含まれる。好ましい実施形態においては、組成物には、複数（例えば、２つ以上）の本発明の単離された多量体ＰＳＭＡタンパク質、抗体、またはその抗原結合部分が含まれる。好ましくは、組成物の抗体またはその抗原結合部分のそれぞれは、ＰＳＭＡの異なる立体構造エピトープに結合する。１つの実施形態においては、補体活性を有している抗ＰＳＭＡ抗体が、２つ以上の抗ＰＳＭＡ抗体を含む薬学的組成物として、組み合わせて使用される。例えば、エフェクター細胞の存在下で標的細胞の非常に効率のよい細胞溶解を媒介する抗体は、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害する別の抗体と組み合わせられ得る。本明細書中で使用される場合は、「標的細胞」は、本発明の組成物によって標的化され得る、被験体（例えば、ヒトまたは動物）中の任意の望ましくない細胞を意味するはずである。好ましい実施形態においては、標的細胞は、ＰＳＭＡを発現または過剰発現する細胞である。ＰＳＭＡを発現する細胞には、通常、腫瘍細胞、例えば、前立腺ガン細胞、膀胱ガン、膵臓ガン細胞、肺ガン細胞、腎臓ガン細胞、結腸ガン細胞、黒色腫、および肉腫が含まれる。
本発明の薬学的組成物はまた、併用療法において、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、併用療法には、少なくとも１つの抗腫瘍薬、免疫調節剤、免疫賦活剤、または他の従来の治療法とともに、本発明の組成物が含まれ得る。例えば、薬剤は、ＰＳＭＡを発現する細胞に対して薬剤を特異的に標的化させるために、本発明のＰＳＭＡ抗体に結合させられ得るか、または連結させられ得るか、あるいは、本発明のＰＳＭＡ抗体との組み換え融合分子として形成され得る。
いくつかの実施形態においては、種々の薬剤が持続的に投与され得る。他の実施形態においては、薬剤は、別々に（互いに前または後に）投与される。本明細書中に提供される組成物は、その必要がある任意の患者に投与され得る。一例として、本明細書中に提供される組成物は、従来のガンの処置方法を受けた患者に投与され得る。例えば、二量体ＰＳＭＡの組成物は、従来のガンの治療方法の後のいくつかの時点で、そのような患者に投与され得る。従来のガンの治療方法、例えば、前立腺ガンの治療法としては、以下の１つ以上が挙げられる：外科手術、放射線治療、凍結外科手術、温熱療法、ホルモン療法、化学療法など。１つの実施形態においては、二量体ＰＳＭＡの組成物の投与の前に行われる治療方法は、少なくとも前立腺摘出術および／またはホルモン療法である。別の実施形態においては、二量体ＰＳＭＡの組成物の投与の前に行われる治療方法は、少なくとも、去勢とホルモン療法である。なお別の実施形態においては、二量体ＰＳＭＡの組成物の投与の前に行われる治療方法は、少なくとも化学療法である。前立腺ガンについての１つの実施形態においては、化学療法は、化学療法剤、ドセタキセルの単独で、または抗炎症性化合物と組み合わせての投与であることが好ましい。１つの実施形態においては、抗炎症性化合物は、プレドニソンである。したがって、いくつかの実施形態においては、従来のガンの治療方法と同時に、その後に、またはその前に投与される二量体ＰＳＭＡを含む組成物で患者を処置するための組成物および方法が提供される。１つのそのような実施形態においては、提供される方法には、本明細書中に提供される二量体ＰＳＭＡ組成物の投与と同時、その後、またはその前の、ドセタキセル（７５ｍｇ／ｍ２ｑ３週）と抗炎症剤、プレドニソン（５ｍｇを１日２回経口投与）の投与が挙げられる。
１つの実施形態においては、二量体ＰＳＭＡを使用する処置に敏感に反応する患者としては、従来のガンの処置方法を受けていない患者が挙げられる。別の実施形態においては、二量体ＰＳＭＡを使用する処置に敏感に反応する患者としては、１つ以上の従来のガンの治療方法を受けたにもかかわらず、ガンの兆候を有している患者が挙げられる。したがって、患者には、去勢されていない患者のような、生化学的に進行性の前立腺ガンを有している患者（１８０ｎｇ／ｍＬ以上の血清テストステロン濃度）が含まれ得る。いくつかの実施形態においては、これらの患者は前立腺切除術または放射線治療のような、最も確実な一次療法を受けている。患者にはまた、去勢された患者（５０ｎｇ／ｍＬ以上の血清テストステロン濃度）も含まれ得、いくつかの実施形態においては、患者は、ホルモン療法が完了した患者である。患者にはまた、Ｘ線写真による疾患の進行の兆候を有している患者が含まれ得る。１つの実施形態においては、そのような処置のレジュメが、ホルモン抵抗性前立腺ガン患者について示されている。
本発明のＰＳＭＡ抗体は、腫瘍の治療のための、ＰＳＭＡを発現する細胞に対する複製選択性ウイルスの送達のための標的化部分として使用され得る。複製可能なウイルス、例えば、ｐ５３経路を標的化するアデノウイルス変異体ｄｌ１５２０、ＯＮＹＸ−０１５は、腫瘍細胞を選択的に死滅させる（Ｂｉｅｄｅｒｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８０（３）：１６３−１７５，２００２）。
本発明の組成物には、薬学的に受容可能なキャリアが含まれ得るか、または本発明の組成物は薬学的に受容可能なキャリア中に稀釈される場合もある。本明細書中で使用される場合は、「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に許容されるキャリア」は、ヒト、または他の哺乳動物、例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはヤギへの投与に適している、１つ以上の適合性の固体または液体の増量剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。このようなキャリアとしては、生理学的に適合性である、任意の、および全ての塩、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、および抗真菌剤、等張化剤、ならびに吸収遅延剤などが挙げられる。用語「キャリア」は、適用を容易にするために、有効成分がそれとともに混合される、有機または無機の天然に存在するかまたは合成の成分を示す。キャリアは、本発明の調製物と、そして互いに、所望される薬学的効力または安定性を実質的に損なうような相互作用が存在しない様式で、混ぜ合わせることができる。好ましくは、キャリアは、経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、皮内投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見ることができる。投与経路によっては、活性のある化合物、すなわち、抗体またはＰＳＭＡ多量体は、化合物を不活化することができる酸および他の中性の条件の作用から化合物を防御するための物質の中にコーティングされる場合がある。
投与される場合は、本発明の薬学的調製物は、薬学的に受容可能な量、および薬学的に受容可能な組成物中に適用される。用語「薬学的に受容可能な」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない、毒性のない物質を意味する。薬学的組成物の成分は、本発明の分子と、そして互いに、所望される薬学的効力を実質的に損なうような相互作用が存在しない様式で、互いに混ぜ合わせることができる。このような調製物には、塩、緩衝化物質、保存剤、適合性キャリアが通常含まれ、そして、必要に応じて、他の治療用物質、例えば、補助免疫増強剤（アジュバント、ケモカイン、およびサイトカインを含む）が含まれる。医薬品として使用される場合は、塩は薬学的に許容されなければならないが、薬学的には許容されない塩がその薬学的に受容可能な塩を調製するために一般的に使用される場合もあり、これらは、本発明の範囲から排除されない。
塩は、もとの化合物の所望される生物学的活性を保持し、そして所望されない毒性作用を全く与えない場合もある（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。このような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性の無機酸、ならびに、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような、非毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。塩基添加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、ならびに、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、キオロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性の有機アミンに由来するものが挙げられる。
本発明の薬学的調製物にはまた、等張化剤も含まれ得る。この用語は、当該分野においては等浸透圧剤と互換的に使用され、血漿のような、ヒトの細胞外の液体と等浸透圧である、０．９％の塩化ナトリウム溶液の浸透圧にまで浸透圧を上昇させるために薬学的調製物に添加される化合物として知られている。好ましい等張化剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デキストロース、およびグリセロールである。
必要に応じて、本発明の薬学的組成物には、さらに、塩化ベンザルコニウムのような保存剤がさらに含まれる場合がある。適切な保存剤としては、：クロロブタノール（０．３％〜０．９％Ｗ／Ｖ）、パラベン（０．０１〜５．０％）、チメロサール（０．００４〜０．２％）、ベンジルアルコール（０．５〜５％）、フェノール（０．１〜１．０％）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に提供される処方物にはまた、滅菌である処方物も含まれる。滅菌プロセスまたは技術には、本明細書中で使用される場合は、１回以上の濾過（０．４５または０．２２マイクロンのフィルター）工程のような無菌的技術が含まれる。
抗ＰＳＭＡ抗体組成物は、所望される場合には、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられ得る。
薬学的組成物には、塩としての酢酸；塩としてのクエン酸；塩としてのホウ酸；および塩としてのリン酸を含む、適切な緩衝化物質が含まれる場合がある。
薬学的組成物は、通常、単位投与量形態で提示され得、そして、製薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。全ての方法には、有効成分を１つ以上の副成分を構成するキャリアと組み合わせる工程が含まれる。一般的には、組成物は、活性のある化合物を、液体のキャリア、微粉化させられた固体のキャリア、または両方と均質に密接に組み合わせること、その後、必要であれば、生成物を成型することによって、調製される。
非経口投与に適している組成物には、通常、ＰＳＭＡ多量体および／または抗ＰＳＭＡ抗体の滅菌の水溶性または非水溶性調製物が含まれる。調製物は、レシピエントの血液と等張であることが好ましい。この調製物は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して公知の方法にしたがって処方され得る。滅菌の注射することができる調製物はまた、毒性のない非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌の注射することができる溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液である場合もある。特に、使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンガーの溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の不揮発油は、溶媒または分散媒体として一般的に使用されている。この目的のためには、合成のモノ−グリセリドまたはジ−グリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発油が使用される場合もある。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注射することができる調製物において使用される場合もある。経口、皮下、静脈内、筋肉内などでの投与に適しているキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見ることができる。
活性のある化合物は、化合物を迅速な放出から守るキャリアとともに調製することができる。例えば、移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル送達システムを含む徐放処方物である。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸が使用され得る。このような処方物の調製のための多くの方法には特許が与えられており、一般的には当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
本発明の治療薬は、注射、または長期間にわたる段階的な注入を含む、任意の便利な経路によって投与することができる。投与は、例えば、経口、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、腫瘍内、または皮内で行われ得る。いくつかの実施形態においては、皮下または筋肉内投与が好ましい。抗体が治療的に使用される場合には、好ましい投与経路としては、静脈内、および肺へのエアゾール投与が挙げられる。抗体を含むエアゾール投与システムを調製するための技術は当業者に周知である。一般的には、このようなシステムでは、抗体の生物学的特性（例えば、パラトープ結合能力）を大きくは損なわない成分が利用されなければならない（例えば、Ｓｃｉａｒｒａ ａｎｄ Ｃｕｔｉｅ，「Ａｅｒｏｓｏｌｓ」，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０、ｐｐ．１６９４−１７１２を参照のこと；引用により本明細書中に組み入れられる）。当業者は、過度の実験に頼ることなく、抗体のエアゾールを生産するための種々のパラメーターおよび条件を容易に決定することができる。
本発明の薬学的調製物は、単独で、または混合物中で使用される場合には、治療有効量で投与される。有効量は当業者に周知であり、文献に記載されている。治療有効量は、以下に議論されるパラメーターによって決定されるが、いずれの場合も、本明細書中に記載される症状の１つを有している被験体、例えば、ヒト被験体を処置するために有効である薬剤（単数または複数）のレベルをはっきりさせる量である。有効量は、処置される症状の発症を遅延させる、症状の進行を完全に阻害するかまたは遅くする、あるいは、処置される症状の発症または進行の全てを停止させるために必要な、単回用量または多用量を意味する。被験体に投与される場合は、有効量は、もちろん、処置される特定の症状；症状の重篤度；年齢、体調、大きさ、および体重を含む個々の患者についてのパラメーター；現在施されている処置；処置の頻度；ならびに投与の態様に応じて変化する。これらの要素は当業者に周知であり、日常的に行われる実験以上のものを用いることなく得ることができる。一般的には、最大用量、すなわち、信頼できる医学的判断に従う最も多量の安全な用量が使用されることが好ましい。
「有効量」は、単独で、またはさらなる用量とともに、所望される応答を生じる、例えば、被験体の悪性腫瘍を処置する、抗ＰＳＭＡ抗体またはＰＳＭＡ多量体の量である。この用語はまた、化学療法薬と組み合わせて所望される応答を生じる、抗ＰＳＭＡ抗体および／またはＰＳＭＡ多量体の量を含むように意味される。これには、疾患の進行を一時的にのみ遅らせることが含まれる場合があるが、より好ましくは、これには、疾患の進行を永久に停止させることが含まれる。これは、日常的に行われる方法によってモニターすることができる。疾患または症状の処置に対する所望される応答はまた、疾患または症状の発症を遅らせるか、あるいは、疾患または症状の発症をさらに防ぐことでもあり得る。
このような量は、もちろん、処置される特定の症状；症状の重篤度；年齢、体調、大きさ、および体重を含む個々の患者についてのパラメーター；処置の期間；現在施されている処置の性質（行われている場合）；特定の投与経路；専門の家庭医の知識および専門知識に含まれる同様の要素に応じて変化する。これらの要素は当業者に周知であり、日常的に行われる実験以上のものを用いることなく得ることができる。一般的には、個々の成分またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、信頼できる医学的判断に従う最も多量の安全な用量が使用されることが好ましい。しかし、医学的理由、生理学的理由、または現実的な何らかの他の理由のために、患者がより低用量または寛容な用量を望む場合もあることは、当業者に理解されるであろう。
上記の方法において使用される薬学的組成物は滅菌であることが好ましく、これには、患者への投与に適している重量または容量の単位で所望される応答を生じるために有効な量の抗ＰＳＭＡ抗体またはＰＳＭＡ多量体が含まれる。応答は、例えば、抗ＰＳＭＡ抗体またはＰＳＭＡ多量体の生理学的作用、例えば、腫瘍の退縮、または疾患の兆候の軽減を決定することによって測定され得る。他のアッセイが当業者に公知であり、応答のレベルを測定するために使用され得る。
被験体に投与される抗ＰＳＭＡ抗体またはＰＳＭＡ多量体の用量は、種々のパラメーターにしたがって、具体的には、使用される投与の態様と被験体の状態にしたがって選択され得る。他の要素としては、所望される処置期間が挙げられる。被験体の応答が最初に投与された用量では不十分である場合には、さらに多い用量（または、別のより局在化させられる投与経路による実質的により多い用量）が、患者が寛容である程度で使用される場合もある。
種々の投与経路を利用することができる。選択される特定の態様は、選択された特定の薬剤、処置される疾患状態の重篤度、および治療効力に必要とされる投与量に応じて、もちろん変化する。本発明の方法は、一般的に言えば、医学的に許容される任意の投与態様を使用して行うことができ、このことは、臨床的には許容されない有害な作用を生じることなく活性のある化合物の有効なレベルを生じる任意の態様を意味する。このような投与態様としては、経口、直腸、舌下、局所、鼻孔、経皮、または非経口経路が挙げられる。用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、または注入が含まれる。
一般的には、用量は、約１０μｇ／ｋｇから約１００，０００μｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。１つの実施形態においては、用量は約５０ｍｇである。別の実施形態においては、用量は約２５０ｍｇである。さらに別の実施形態においては、用量は約５００ｍｇ、１０００ｍｇ、またはそれ以上である。組成物に基づいて、用量は１回、持続的に、例えば、持続的ポンプによって、または定期的な間隔で投与され得る。定期的な間隔は、１週間に１回、隔週で、または１ヶ月に１回であり得る。投与は、適切な体液性および／または細胞性免疫応答を誘発するために、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、またはそれ以上の期間にわたって行われ得る。多用量の特定の組成物についての所望される時間の間隔は、当業者により過度の実験が行われることなく決定することができる。抗ＰＳＭＡ抗体またはＰＳＭＡ多量体の投与のための他のプロトコールは当業者に公知であり、これにおいては、用量、投与スケジュール、投与部位、投与態様などは上記とは異なる。
投与量は、局所的または全身的に所望される薬剤レベルが得られるように適切に調節され得る。一般的には、活性のある化合物の１日の経口用量は、１日あたり約０．１ｍｇ／ｋｇから１日あたり３０ｍｇ／ｋｇである。０．０１〜１．００ｍｇ／ｋｇの範囲のＩＶ用量が有効であると予想される。被験体の応答はそのような用量では不十分である場合には、さらに多い用量（または、別のより局在化させられる投与経路による実質的により多い用量）が、患者が寛容である程度で使用される場合もある。例えば、２４時間にわたる持続的なＩＶ用量、または１日に複数回の用量もまた、化合物の適切な全身的レベルを得るために想定される。
一般的には、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体によって投与される放射性核種の用量は、約０．０１ｍＣｉ／Ｋｇから約１０ｍＣｉ／ｋｇまでの範囲であり得る。好ましくは、放射性核種の用量は、約０．１ｍＣｉ／Ｋｇから約１．０ｍＣｉ／ｋｇまでの範囲である。特定の放射性同位元素の最適な用量は、当業者に周知である簡単な日常的に行われる滴定実験によって、経験的に決定することができる。
例えば、試験目的または獣医学的な治療目的のための、抗ＰＳＭＡ抗体またはＰＳＭＡ多量体組成物のヒト以外の哺乳動物への投与は、上記に記載された条件と実質的に同じ条件下で行われる。
本発明の組成物（ＰＳＭＡに対する抗体、およびその誘導体／結合体、およびＰＳＭＡ多量体）は、生体外および生体内において、診断的および治療的有用性がある。例えば、これらの分子は、培養物中の細胞に、例えば、生体外または体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で、あるいは、被験体に、例えば、生体内で、種々の障害を処置、予防、または診断するために投与され得る。本明細書中で使用される場合は、用語「被験体」は、ヒトまたはヒト以外の動物を含むように意図される。好ましい被験体としては、ＰＳＭＡの発現、通常は、異常な発現（例えば、過剰発現）を特徴とする障害を有しているヒト患者が挙げられる。他の好ましい被験体としては、本発明の組成物を用いて処置することができる被験体が挙げられる。これには、ガンを有しているかまたはガンのリスクがある被験体、あるいは、別の方法でＰＳＭＡを発現する細胞に対する免疫応答の増強または誘発によって利点が得られる被験体が含まれる。好ましい実施形態においては、これらの細胞はその表面にＰＳＭＡを発現する。
本発明の１つの態様は、生物学的サンプル（例えば、組織標本または細胞学的標本、生検組織など）中のガン性の細胞またはその一部を検出するため、具体的には、正常な組織および悪性ではない腫瘍から悪性の腫瘍を区別するための方法に関する。この方法には、抗体またはその抗原結合フラグメント、そのような細胞のＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合するプローブまたはリガンド、例えば、抗ＰＳＭＡ抗体）を提供することが含まれる。抗ＰＳＭＡ抗体は、細胞またはその一部（例えば、そのようなガン性の細胞から遊離させられたＰＳＭＡまたはそのフラグメント）に対する抗ＰＳＭＡ抗体の結合の際に、細胞またはその一部を検出できるようにする標識に結合させられる。生物学的サンプルは、標識された抗ＰＳＭＡ抗体と、生物学的サンプル中の任意の細胞またはその一部のＰＳＭＡの細胞外ドメインに対して抗ＰＳＭＡ抗体を結合させるために十分な条件下で、接触させられる。生物学的サンプル中の任意の細胞またはその一部の存在は、標識の検出によって検出される。１つの好ましい形態においては、抗ＰＳＭＡ抗体と生物学的サンプルとの間での接触は、生存している哺乳動物の内部で行われ、これには、生物学的サンプル中の任意の細胞またはその一部のＰＳＭＡに対して抗ＰＳＭＡ抗体を結合させる条件下で、哺乳動物に抗ＰＳＭＡ抗体を投与することが含まれる。再び、このような投与は、当業者に公知の任意の適切な方法によって行われ得る。
さらに、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体は、ヒトの組織、細胞、および体液標本を試験するための免疫蛍光技術において使用することができる。通常のプロトコールにおいては、凍結させられた、固定されていない組織生検サンプルの低温保存切片または細胞学的スメアを含むスライドが風乾させられ、ホルマリンとアセトンで固定され、室温の加湿チャンバー内でモノクローナル抗体調製物とともにインキュベートされる。その後、スライドが洗浄され、さらに、モノクローナル抗体に対する二次抗体の調製物、通常は、いくつかのタイプの抗マウス免疫グロブリン（使用されるモノクローナル抗体がマウスの脾臓リンパ球とマウスの骨髄腫細胞株の融合体に由来する場合）とともにインキュベートされる。この二次抗体は、特定の波長で蛍光を発する化合物、例えば、ローダミンまたはフルオレセインイソチオシネートでタグ化される。その後、サンプルの染色パターンと強度が蛍光顕微鏡によって決定され、必要に応じて、写真に記録される。
なお別のものとして、コンピュータ処理による蛍光画像分析またはフローサイトメトリーが、組織標本または剥離した細胞、すなわち、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体を使用する腫瘍の吸引生検による単細胞調製物を試験するために使用され得る。本発明の抗ＰＳＭＡ抗体は、生存している腫瘍細胞、すなわち、コンピュータ処理による蛍光画像分析またはフローサイトメトリーによる前立腺腫瘍の吸引生検による単細胞調製物の定量に特に有用である。本発明の抗体は、抗ＰＳＭＡ抗体がそれに結合するＰＳＭＡタンパク質が、良性の前立腺腫瘍と比較して悪性腫瘍によって多量に発現されるため、悪性の前立腺腫瘍と良性の腫瘍を区別するためのそのようなアッセイに特に有用である。ＰＳＭＡ陽性細胞の集団の割合は、それだけで、または細胞の他の特性（例えば、これらの細胞のＤＮＡ倍数性）の決定と組み合わせて、さらに、疾患の進行の初期の指標を提供することによって極めて有用な診断情報を提供することができる。
なお別の代わりの実施形態においては、本発明の抗体は、ガンの悪性の表現形に関するさらなる情報を提供するために、他の既知の抗体と組み合わせて使用することができる。
本発明の方法は、ガン性の細胞またはその一部の存在に関係している疾患について患者をスクリーニングするために使用することができる。あるいは、本発明の方法は、特に、疾患が患者の特定の生物学的な原料に局在化させられている場合には、そのような疾患の再発を同定するために使用することができる。例えば、前立腺窩での前立腺の疾患の再発は、前立腺全摘出術の後に起こり得る。本発明の方法を使用して、この再発を、哺乳動物に短い範囲の放射標識された抗体を投与すること、その後、直腸内で標識を、例えば、直腸内検出プローブを用いて検出することによって検出することができる。
あるいは、接触工程は、血清または尿または他の体液のサンプル（精液、前立腺液、射精された精液などを含むが、これらに限定されない）において、例えば、体液中のＰＳＭＡの存在を検出するために行われ得る。接触が血清または尿サンプル中で行われる場合は、生物学的な物質は、ＰＳＭＡ以外の血液中に循環している抗原を実質的には認識しないことが好ましい。完全な細胞は、細胞外環境にＰＳＭＡを排泄または分泌することはないため、血清、尿、または他の体液中のＰＳＭＡの検出は、一般的には、細胞が溶解しているかまたは流れ出していることを示す。したがって、本発明の生物学的物質および方法は、血清、尿、または他の体液中のＰＳＭＡのレベルをモニターすることによりガンの処置プロトコールの有効性を決定するために使用することができる。
本発明のガン性細胞を検出する方法の特に好ましい実施形態においては、抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、そのような細胞の前立腺特異的膜抗原に結合するか、またはそれとともに内在化される。かさねて、生物学的物質は、前立腺特異的膜抗原に対する生物学的物質の結合、および前立腺特異的膜抗原と共に生物学的物質が内在化される際に、細胞またはその一部を検出できるようにするために有効な標識に結合させられる。
ガン性の細胞を検出するために適している生物学的物質としては、抗ＰＳＭＡ抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が挙げられる。さらに、抗体フラグメント、ハーフ抗体、ハイブリッド誘導体、プローブ、および他の分子構築物を利用することができる。これらの生物学的物質（例えば、抗体、その抗原結合フラグメント、プローブ、またはリガンド）は、ガン性の細胞中の前立腺特異的膜抗原またはその一部の細胞外ドメインに結合する。結果として、生物学的物質は、固定されている細胞、またはその細胞内の抗原性ドメインが別の方法で細胞外環境にさらされている細胞だけに結合するわけではない。結果として、生物学的物質の結合は、前立腺ガン細胞が存在する（これらの細胞が固定されているかまたは固定されていないか、生存しているかまたは壊死しているかにはかかわらず）領域において濃縮される。さらに、またはあるいは、これらの生物学的物質は、ガン性の細胞においてはより大きな程度に、正常な良性の過形成性における前立腺特異的膜抗原またはその一部に結合し、そしてそれらとともに、内在化される。
ＰＳＭＡ多量体および抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、ガンの生体内治療にも有用である。ＰＳＭＡ多量体および抗体またはその抗原結合フラグメントは、悪性細胞もしくは組織を死滅させ、そして／または悪性の細胞もしくは組織の増殖を阻害する化合物とともに使用することができる。例えば、抗体は、結合体の投与および局在化後に、そのような化合物に対して直接またはリンカーを介してのいずれかによって、共有結合させることができる。抗体が単独で使用される場合は、これは、補体固定または抗体依存性細胞傷害性による腫瘍の溶解を媒介する場合がある。あるいは、ＰＳＭＡ多量体または抗体は、相乗的な治療効果を生じるように、化学療法薬と組み合わせて投与される場合もある（Ｂａｓｌｙａ ａｎｄ Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，１９９４ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ２９：１２７−１３８）。上記に記載された当業者に公知の、放射活性のある金属、金属以外の同位元素、化学療法薬、毒素などを含む種々の様々なタイプの物質を、治療的な使用のために直接結合させることができる（例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ ａｎｄ Ｕｈｒ，１９８５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１９７を参照のこと）。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、補体と共に投与することもできる。したがって、抗体またはその抗原結合フラグメントと、血清または補体を含む組成物が本発明の範囲に含まれる。これらの組成物は、補体がヒト抗体またはその抗原結合フラグメントに非常に接近して存在している点で有効である。あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと、補体または血清は、別々に投与することもできる。
ＰＳＭＡ多量体または抗体は、免疫応答を誘導するかまたは増強させるための１つ以上の免疫賦活剤、例えば、ＩＬ−２および免疫賦活オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むもの）とともに投与することができる。好ましい免疫賦活剤は、免疫系の特異的アーム、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激する。
本明細書において別の場所で提供されるように、提供される組成物は、免疫応答を誘導または増強するための１つ以上のアジュバントとともに投与することができる。アジュバントは、免疫応答を強める物質である。多種のアジュバントが当該分野で周知である。アジュバントの特異的な例としては、以下が挙げられる：モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ，ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）；ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ）を含むサポニン；免疫賦活オリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−９，１９９５に記載されているＣｐＧオリゴヌクレオチド）；不完全フロイントアジュバント；完全フロイントアジュバント；モンタナイド；ビタミンＥ；および、生分解性油、例えば、スクワレンおよび／またはトコフェロールから調製された種々の水中油エマルジョン、Ｑｕｉｌ Ａ、Ｒｉｂｉ Ｄｅｔｏｘ、ＣＲＬ−１００５、Ｌ−１２１、ならびにそれらの組み合わせ。
ＰＳＭＡ多量体抗原に対する被験体の免疫応答を刺激する他の物質もまた、被験体に投与することができる。例えば、サイトカインもまた、それらのリンパ球調節特性の結果として、ワクチン接種プロトコールにおいて有用である。そのような目的について有用である多くのサイトカインが当業者に公知であり、これには、インターロイキン−２（ＩＬ−２）；ＩＬ−４；ＩＬ−５；ＩＬ−１２（これらは、ワクチンの防御効果を増強させることが示されている（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１４３２−１４３４，１９９５を参照のこと））；ＧＭ−ＣＳＦ；ＩＬ−１５；ＩＬ−１８；それらの組み合わせなどが含まれる。したがって、サイトカインは、抗体、抗原、サイトカイン、および／またはアジュバントと組み合わせて、免疫応答を増大させるために投与することができる。
免疫応答を増大させることにおいて有用であるサイトカインとしては、ＳＬＣ、ＥＬＣ、ＭＩＰ３α、ＭＩＰ３β、ＩＬ−１０、ＭＩＧ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のＰＳＭＡ多量体または抗体またはその抗原結合フラグメントは、他の治療的な処置様式と組み合わせて使用することができる。ガン（例えば、前立腺ガン）についての現行の標準的または従来の処置としては、外科手術、放射線治療、凍結外科手術、温熱療法、ホルモン療法、および化学療法が挙げられる。１つ以上の標準的な処置を受けた被験体は、処置を経験した被験体と呼ばれる場合がある。ホルモン療法には、以下の様式の１つ以上での処置が含まれる：ロイプロリド、ゴセレリン、またはブセレリンのような、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト；フルタミドおよびビカルタミドのような抗アンドロゲン薬；ケトコナゾールまたはアミノグルテチミドのような、副腎のアンドロゲンの作成を妨げる薬剤；エストロゲン；および睾丸摘出（去勢）。化学療法では、当該分野で公知の任意の化学療法薬／抗新生物薬を使用することができる。いくつかの好ましい実施形態においては、化学療法薬は、タキサン、例えば、パクリタキセル（タキソール（登録商標））またはドセタキセル（タキソテーレ（登録商標））である。化学療法は、コルチコステロイドのような抗炎症性化合物と組み合わせて使用することもできる。コルチコステロイドとしては、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニソン、プレドニソロン、トリアムシノロン、メチルプレドニソロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンなどが挙げられる。好ましい抗炎症性化合物はプレドニソンである。ＰＳＭＡ多量体と組み合わせて使用することができる他の治療様式としては、他のワクチンおよび免疫療法薬の使用が挙げられる。
予防のために、ＰＳＭＡ多量体または抗体またはその抗原結合フラグメントを使用することを含む方法もまた、本発明に含まれる。例えば、これらの物質は、ガンの発症または進行を防ぐかまたは遅らせるために使用することができる。
本発明のガン治療方法の使用には多数の利点がある。本発明の抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは前立腺ガン細胞を優先的に標的化するため、他の組織には危害を加えない。結果として、このような生物学的物質での処置は、特に高齢者の患者にとって安全である。本発明の処置は、これは前立腺ガンが主に転移する骨髄とリンパ節に対して、抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントが高レベルになるようにするため、特に有効であると予想される。さらに、前立腺ガンの腫瘍部位は、大きさに関して小さい傾向があり、したがって、細胞傷害性物質によって容易に破壊される。本発明の処置は、血清の前立腺特異的抗原および／または患者のガンの病理学的特徴（段階、グリースンスコア、嚢外浸潤、精嚢への浸潤、小嚢への浸潤、または神経周囲の浸潤、切除縁陽性、病変リンパ節などを含む）などの臨床的パラメーターを用いて効率よくモニターすることができる。あるいは、これらのパラメーターは、そのような処置を使用しなければならない場合を示すために使用され得る。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは生存している細胞に結合するため、これらの生物学的物質を使用する治療方法は、溶解させられた細胞を標的化する治療方法よりもはるかに有効である。同じ理由から、生存している正常な細胞、良性の過形成性の細胞、またはガン性の細胞の位置を決定する診断方法および画像化方法は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを使用することによって大幅に改良される。さらに、生存している細胞と死滅した細胞とを区別する能力は、特に、特定の処置レジュメの有効性をモニターするために有効であり得る。
本発明の組成物を含むキット、および使用のための説明書もまた、本発明の範囲に含まれる。キットにはさらに、少なくとも１つの別の試薬（例えば、補体）または１つ以上の本発明の別の抗体（例えば、第１の抗体とは異なるＰＳＭＡ抗原中のエピトープに結合する補体活性を有している抗体）が含まれ得る。他のキットには、本明細書において以下に記載されるＰＳＭＡ多量体が含まれ得る。
本明細書中に提供されるキットには、記載される組成物のいずれかと、これらの組成物の使用のための説明書が含まれる。説明書には、ＰＳＭＡの多量体化を保存または促進する特定の量の因子または溶液を、特定の量のＰＳＭＡ組成物と混合するための説明が含まれ得る。説明書にはまた、特定の量の希釈剤を、特定の量のＰＳＭＡ二量体組成物と混合し、それによって、注射または注入のための最終的な処方物が調製される説明も含まれ得る。したがって、本発明の組成物と、必要に応じて、アジュバント（例えば、ミョウバン）または希釈剤と、混合のための説明書を含むキットもまた提供される。本発明の組成物がバイアル、または隔壁のあるアンプル、または注射器の中に提供されるキットもまた、提供される。組成物が凍結乾燥させられた形態である他のキットもまた提供される。したがって、説明書は、希釈剤または他の物質（例えば、治療薬）が存在するかまたは存在しないかに応じて、種々の形態をとる。説明書には、有効量の二量体ＰＳＭＡで患者を処置するための説明書が含まれ得る。薬学的調製物を含む容器（容器が、ビン、隔壁のあるバイアル、隔壁のあるアンプル、注入用バッグなどであるかにはかかわらず）には、薬学的調製物が加圧滅菌されているかまたは別の方法で滅菌されている場合には、色を変化させる従来のマーキングのような印が含まれ得る。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含むキットは、上記の免疫組織学的、免疫細胞学的、および免疫血清学的方法によってガンを生体外で診断、予後診断、および／またはモニターするために調製され得る。キットの成分は、水性媒体中、または凍結乾燥させられた形態のいずれかでパッケージされ得る。抗体またはその抗原結合フラグメントが、酵素または放射活性金属イオンのような標識部分がそれに結合させられた結合体の形態でキットにおいて使用される場合は、そのような結合体の成分は、完全に結合した形態で、中間体の形態で、またはキットの使用者によって結合させられる別の部分としてのいずれかで供給され得る。
キットには、１つ以上の容器手段、または試験管、バイアル、フラスコ、ビン、注射器などの複数の容器手段のシリーズとしてその中に閉じ込められるように仕切りを付けられたキャリアが含まれ得る。第１の上記の容器手段または容器手段のシリーズには、１つ以上の抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントまたはＰＳＭＡが含まれ得る。第２の容器手段または容器手段のシリーズには、一次抗ＰＳＭＡ抗体（またはそのフラグメント）に結合することができる標識またはリンカー−標識中間体が含まれ得る。
本発明の薬学的調製物は、通常、ビン、バイアル、アンプル、注入用バッグなどの中に維持され、これらのうちの任意のものは酸素を排除するためにスパージされ得るか、または窒素でパージされ得る。いくつかの実施形態においては、ビン、バイアル、およびアンプルは不透明であり、例えば、琥珀色である。このようなスパージおよびパージプロトコールは当業者に周知であり、薬学的調製物の安定性を維持することに関係するはずである。薬学的調製物はまた、特定の実施形態においては、注射器に含まれていることが望まれる。
他の化合物または物質に結合させられた抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、生体内での腫瘍の局在化方法および治療方法における使用のためのキットが調製され得る。キットの成分は、水性媒体中、または凍結乾燥させられた形態のいずれかでパッケージされ得る。抗体またはその抗原結合フラグメントが、放射活性金属イオンまたは治療薬部分のような標識または治療用部分がそれに結合させられている結合体の形態でキットにおいて使用される場合には、そのような結合体の成分は、完全に結合した形態で、中間体の形態で、またはキットの使用者によって結合させられる別の部分としてのいずれかで供給され得る。
本発明の１つの態様においては、ＰＳＭＡの少なくとも１つの酵素活性を調節するための方法について、活性は、生体外または生体内の、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ）活性、葉酸加水分解酵素活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、およびγ−グルタミル加水分解酵素活性、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。調節は、ＰＳＭＡの少なくとも１つの酵素活性の増強または阻害であり得る。
好ましい実施形態においては、本発明により、生体外または生体内の、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ）活性、葉酸加水分解酵素活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、およびγ−グルタミル加水分解酵素活性、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される活性である、ＰＳＭＡの少なくとも１つの酵素活性を阻害するための方法が提供される。この方法には、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ、葉酸加水分解酵素、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ、および／またはγ−グルタミル加水分解酵素を、ある量の本発明の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントと、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、葉酸加水分解酵素活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、またはγ−グルタミル加水分解酵素活性を阻害する条件下で接触させることが含まれる。
ＮＡＡＬＡＤａｓｅの組織レベルは、ホモジナイズされた組織を界面活性剤で可溶化させること、遠心分離によって不溶性の物質をペレット化させること、および残りの上清中のＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を測定することによって決定することができる。同様に、体液中のＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性はまた、遠心分離によって細胞性物質を最初にペレット化させること、および上清についてＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性についての通常の酵素アッセイを行うことによって測定することもできる。ＮＡＡＬＡＤａｓｅ酵素アッセイは、Ｆｒｉｅｄｅｎ，１９５９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４：２８９１によって記載されている。このアッセイでは、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ酵素の反応産物はグルタミン酸である。これは、Ｎ−アセチルアスパルチルグルタミン酸の、Ｎアセチルアスパラギン酸とグルタミン酸を生じる、酵素によって触媒される切断に由来する。ＮＡＤ（Ｐ）＋を必要とする工程においては、グルタミン酸は、グルタミン酸加水分解酵素によって触媒される反応において２−オキソグルタミン酸とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じる。反応の進行は、ＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの変換が原因で生じる３４０ｎｍでの吸光度の変化によって、容易に、便利に測定することができる。
ＰＳＭＡの葉酸加水分解酵素活性は、Ｈｅｓｔｏｎおよび共同研究者ら（例えば、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２（９）：１４４５−５１，１９９６；Ｕｒｏｌｏｇｙ ４９（３Ａ 補遺）：１０４−１２，１９９７）によって記載されている酵素アッセイを行うことによって測定することができる。ＰＳＭＡのような葉酸加水分解酵素は、葉酸ポリグルタミン酸塩からγ結合グルタミン酸を除去する。葉酸加水分解酵素活性は、メトトレキセートトリ−γグルタミン酸（ＭＴＸＧｌｕ３）、メトトレキセート ジ−γグルタミン酸（ＭＴＸＧｌｕ２）、およびプテロイルペンタグルタミン酸（ＰｔｅＧｌｕ５）のような物質を使用し、例えば、キャピラリー電気泳動を使用して測定することができる（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２（９）：１４４５−５１，１９９６を参照のこと）。ポリグルタミン酸化された物質とのＰＳＭＡの時間制限されたインキュベーションの後、加水分解産物の分離と検出が行われる。
本発明にはまた、ＰＳＭＡ多量体に選択的に結合する単離された抗体およびその抗原結合フラグメントが含まれる。本明細書中で使用される場合は、特に、抗ＰＳＭＡ抗体および結合フラグメントによるＰＳＭＡ多量体の結合に関して、「選択的に結合する」は、抗体がＰＳＭＡタンパク質単量体ではなくＰＳＭＡタンパク質多量体に優先的に（例えば、大きな結合力で、大きな結合親和性で）結合することを意味する。好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、ＰＳＭＡタンパク質単量体についてその抗体によって示される結合力および／または結合親和性よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７０倍、１００倍、２００倍、３００倍、５００倍、１０００倍大きいか、またはそれ以上の結合力および／または結合親和性で、ＰＳＭＡタンパク質多量体に結合する。好ましくは、抗体は、ＰＳＭＡタンパク質多量体に選択的に結合するが、ＰＳＭＡタンパク質単量体には結合しない、すなわち、ＰＳＭＡタンパク質多量体に対して実質的に排他的に結合する。最も好ましくは、抗体はＰＳＭＡタンパク質二量体に選択的に結合する。
ＰＳＭＡタンパク質多量体に選択的に結合する単離された抗体または結合フラグメントは、いくつかの実施形態においては、ＰＳＭＡタンパク質多量体の酵素活性を調節することができる。１つのそのような実施形態においては、抗体は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、葉酸加水分解酵素活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、γ−グルタミル加水分解酵素活性、またはそれらの組み合わせのような少なくとも１つの酵素活性を阻害する。別の実施形態においては、抗体は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、葉酸加水分解酵素活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、γ−グルタミル加水分解酵素活性、またはそれらの組み合わせのような少なくとも１つの酵素活性を増強させる。
本明細書中で別の場所に記載されるように、ＰＳＭＡタンパク質多量体は、少なくとも２つのＰＳＭＡタンパク質またはそのフラグメントのタンパク質複合体である。ＰＳＭＡタンパク質多量体は、全長のＰＳＭＡタンパク質（例えば、配列番号１）、組換え体である可溶性ＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ、例えば、配列番号１のアミノ酸４４〜７５０）、および多量体を形成する上記のフラグメント（すなわち、ＰＳＭＡの二量体および／またはそれよりも高次の多量体を形成するために必要なタンパク質ドメインを保持しているフラグメント）の種々の組み合わせから構成され得る。好ましい実施形態においては、多量体を形成するＰＳＭＡタンパク質のうちの少なくとも１つは組換え体である可溶性のＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）ポリペプチドである。好ましいＰＳＭＡタンパク質多量体は二量体であり、組換え体である可溶性のＰＳＭＡタンパク質から形成される二量体が特に好ましい。特に好ましい実施形態は、ｒｓＰＳＭＡホモ二量体である。
本明細書中で言及されるＰＳＭＡタンパク質多量体は、天然に存在する立体配置をとると考えられ、そのような立体配置を有することが好ましい。特定の実施形態においては、複数のＰＳＭＡタンパク質が、ＰＳＭＡタンパク質多量体を形成するように一緒に非共有的に結合させられる。例えば、ＰＳＭＡタンパク質は、以下の実施例に記載されるように、非変性条件下ではニ量体を形成するように非共有的に会合することが明らかにされている。
ＰＳＭＡタンパク質多量体は、ＰＳＭＡの活性を保持することができ、そうであることが好ましい。ＰＳＭＡ活性は、葉酸加水分解酵素活性、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、およびγ−グルタミル加水分解酵素活性のような酵素活性であり得る。多量体のＰＳＭＡ活性を試験するための方法は当該分野で周知であり（Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，：Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｌ．Ｗ．Ｋ．Ｃｈｕｎｇ，Ｗ．Ｂ．Ｉｓａａｃｓ ａｎｄ Ｊ．Ｗ．Ｓｉｍｏｎｓ（編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２０００，ｐｐ．３０７−３２６に概説されている）、そのいくつかは、本明細書中の以下の実施例に記載される。
ポリペプチド、タンパク質、またはそのフラグメントに関して本明細書中で使用される場合は、「単離された」は、その天然での環境から分離されており、その同定または使用を可能にするために十分な量で存在していることを意味する。タンパク質またはポリペプチドについて言及する場合は、「単離された」は、例えば：（ｉ）発現クローニングによって選択的に生産されたか、または（ｉｉ）クロマトグラフィーまたは電気泳動によって精製されたことを意味する。単離されたタンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋である場合もあるが、必ずしもそうである必要はない。用語「実質的に純粋」は、タンパク質またはポリペプチドは、天然または生体内システムにおいてそれらとともに見られる他の物質を、それらの意図される使用について実行可能であり適切である程度に、他の物質を本質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該分野で周知の技術によって生産することができる。単離されたタンパク質は薬学的調製物中で薬学的に受容可能なキャリアと混合することができるため、タンパク質は、調製物の中にごく少ない重量パーセントで含まれる場合がある。それにもかかわらず、タンパク質は、生存しているシステムにおいてそれと関係している物質からは分離されているという点で単離されている、すなわち、他のタンパク質から単離されている。
ＰＳＭＡタンパク質のフラグメントは、ＰＳＭＡタンパク質の異なる機能を保持しているフラグメントであることが好ましい。フラグメントにおいて保持され得る機能としては、二量体およびさらに高次の多量体を形成するための他のＰＳＭＡ分子の結合、抗体との相互作用、他のポリペプチドまたはそのフラグメントとの相互作用、および酵素活性が挙げられる。他のＰＳＭＡタンパク質フラグメント、例えば、配列番号１の他の組換え体である可溶性フラグメントを、それらの機能特性にしたがって選択することができる。例えば、当業者は、組み換えによってＰＳＭＡフラグメントを調製することができ、そして以下に記載される方法にしたがってそのようなフラグメントを試験することができる。
ＰＳＭＡポリペプチドに対する修飾は、通常は、ＰＳＭＡポリペプチドをコードする核酸に対して行われ、これには、欠失、点変位、短縮、アミノ酸の置換、およびアミノ酸または非アミノ酸部分の付加が含まれ得る。あるいは、修飾は、切断、リンカー分子の付加、検出可能な部分（例えば、ビオチン）の付加、脂肪酸の付加などにより、ポリペプチドに対して直接行うこともできる。修飾体にはまた、ＰＳＭＡアミノ酸配列全体またはその一部を含む融合タンパク質も含まれる。
一般的には、修飾されたＰＳＭＡポリペプチドには、その生理学的活性には無関係なポリペプチドの特徴を変化させるように特異的に修飾されたポリペプチドが含まれる。例えば、システイン残基が、所望されないジスルフィド結合を促進または防ぐために、それぞれ、置換または欠失させられ得る。同様に、特定のアミノ酸が、発現システム中のプロテアーゼによるタンパク質の溶解を排除することによってＰＳＭＡポリペプチドの発現を増強させるために、変化させられ得る（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在している酵母の発現システム中では、二塩基性アミノ酸残基）。
修飾体は、通常は、ＰＳＭＡポリペプチドをコードする核酸分子を変化させることによって調製される。ＰＳＭＡポリペプチドをコードする核酸の変異は、コード配列のアミノ酸リーディングフレームを保存することが好ましく、修飾されたポリペプチドの発現に対して有害であり得る、ヘアピンまたはループのような二次構造を形成するようにおそらくハイブリダイズする核酸の領域を作成しないことが好ましい。
修飾体は、アミノ酸置換を選択することによって、または、ＰＳＭＡポリペプチドをコードする核酸中の選択された部位のランダムな突然変異誘発によって作成され得る。その後、修飾されたＰＳＭＡポリペプチドが発現させられ得、どの変異によって所望される特性を有している修飾されたポリペプチドが提供されるかを決定するために、１つ以上の活性（例えば、抗体の結合、酵素活性、多量体安定性）について試験され得る。さらなる変異が、修飾されたＰＳＭＡポリペプチドに対して（または、修飾されていないＰＳＭＡポリペプチドに対して）行われ得る。これは、ポリペプチドのアミノ酸配列に対してはサイレントであるが、特定の宿主中での翻訳に好ましいコドンを提供する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での核酸の翻訳に好ましいコドンは当業者に周知である。さらに他の変異が、ＰＳＭＡをコードする配列またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して、ポリペプチドの発現を増強させるために行われ得る。修飾されたＰＳＭＡポリペプチドの活性は、修飾されたＰＳＭＡポリペプチドをコードする遺伝子を細菌または哺乳動物の発現ベクターにクローニングし、適切な宿主細胞中にベクターを導入し、修飾されたＰＳＭＡポリペプチドを発現させ、そして、本明細書中で開示されるようにＰＳＭＡポリペプチドの機能を試験することによって、試験され得る。上記の手順は当業者に周知である。
当業者はまた、保存的アミノ酸置換をＰＳＭＡポリペプチド中に作成して、機能的に同等であるＰＳＭＡポリペプチド、すなわち、ＰＳＭＡポリペプチドの機能を保持している修飾されたＰＳＭＡポリペプチドを提供することができる。これらの機能的に同等であるＰＳＭＡポリペプチドとしては、多量体、特に、二量体を形成するように会合することができるＰＳＭＡポリペプチドまたはタンパク質が挙げられる。本明細書中で使用される場合は、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が作成されるタンパク質の相対的な電荷または大きさの特徴を変化させることのないアミノ酸置換をいう。修飾されたＰＳＭＡポリペプチドは、そのような方法が集められている参考文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，編、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて見ることができるような、当業者に公知のポリペプチド配列を変化させるための方法にしたがって調製することができる。例示的な機能的に同等であるＰＳＭＡポリペプチドとしては、配列番号１の保存的アミノ酸置換体、またはそのフラグメント、例えば、組換え体である可溶性ＰＳＭＡポリペプチド（配列番号１のアミノ酸４４〜７５０）が挙げられる。アミノ酸の保存的置換としては、以下のグループ内のアミノ酸の間で行われる置換が挙げられる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
ＰＳＭＡポリペプチド中の保存的アミノ酸置換は、通常、ＰＳＭＡポリペプチドをコードする核酸の変更によって作成される。保存的置換されたＰＳＭＡポリペプチドとしては、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、またはそれ以上の置換を有しているポリペプチドが挙げられる。そのような置換は、当業者に公知の種々の方法によって作成され得る。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲによる突然変異、部位特異的突然変異によって、あるいは、ＰＳＭＡポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成によって作成され得る。アミノ酸置換がＰＳＭＡポリペプチドの小さいフラグメントに作成される場合は、置換は、ペプチドを直接合成することによって作成され得る。ＰＳＭＡポリペプチドの機能的に同等であるフラグメントの活性は、変化させたＰＳＭＡポリペプチドをコードする遺伝子を、細菌または哺乳動物の発現ベクター中にクローニングし、ベクターを適切な宿主細胞に導入し、変化させたＰＳＭＡポリペプチドを発現させ、そして本明細書中で開示されるようにＰＳＭＡポリペプチドの機能を試験することによって試験することができる。
本明細書中に記載されるＰＳＭＡタンパク質多量体には多数の用途があり、そのいくつかは本明細書において別の場所に記載される。多量体は、ＰＳＭＡの酵素活性またはＰＳＭＡの多量体形成を調節する化合物を試験することについて有用である。多量体は、ＰＳＭＡに選択的に結合する抗体（これには、立体構造エピトープについて選択的であるもの、ＰＳＭＡ多量体への結合について選択的であってＰＳＭＡ単量体についてはそうではないもの、およびＰＳＭＡの酵素活性を選択的に調節するものが含まれる）を単離するために使用することができる。多量体（具体的には、二量体ＰＳＭＡ）はまた、ワクチン組成物として、ＰＳＭＡに対する免疫応答を誘導または増大させるために使用することができる。
ＰＳＭＡの酵素活性を選択的に調節する因子としては、ＰＳＭＡの少なくとも１つの酵素活性（例えば、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、葉酸加水分解酵素活性、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ活性、γ−グルタミル加水分解酵素活性）またはそれらの組み合わせを阻害するかまたは増強させる因子が挙げられる。
したがって、ＰＳＭＡ酵素の少なくとも１つの酵素活性を調節する候補の因子についてスクリーニングする方法が、本発明にしたがって提供される。この方法には、候補の因子を単離されたＰＳＭＡタンパク質多量体と混合して反応混合物を形成させ、それによって、ＰＳＭＡ酵素を候補の因子と接触させることが含まれ得る。この方法にはまた、ＰＳＭＡ酵素の基質を反応混合物に添加すること、そしてＰＳＭＡ酵素によって基質から形成された生成物の量を決定することも含まれる。このような方法は、化合物の自動化されたハイスループットスクリーニングに適応させることができる。対照と比較した場合の、形成された生成物の量の減少は、ＰＳＭＡ酵素の少なくとも１つの酵素活性を阻害することができる因子の指標である。対照と比較した場合の、形成された生成物の量の増加は、ＰＳＭＡ酵素の少なくとも１つの酵素活性を増強させることができる因子の指標である。ＰＳＭＡ酵素は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ、葉酸加水分解酵素、ジペプチジルジペプチダーゼＩＶ、および／またはγ−グルタミル加水分解酵素であり得る。ＰＳＭＡ酵素は、好ましくは、組換え体である可溶性のＰＳＭＡを含むＰＳＭＡ多量体であり、最も好ましくは、天然において存在する立体構造で非共有的に会合したＰＳＭＡ二量体である。
反応混合物には、候補の因子が含まれる。候補の因子は、好ましくは、抗体、有機低分子化合物、またはペプチドであり、したがって、組み合わせ抗体ライブラリー、組み合わせタンパク質ライブラリー、または有機低分子ライブラリーから選択することができる。通常は、複数の反応混合物が、種々の因子濃度で同時に実験されて、種々の濃度に対する種々の応答が得られる。通常は、これらの濃度の１つ、すなわち、ゼロ濃度の因子、またはアッセイの検出限界を下回る因子の濃度がネガティブ対照とされる。
候補の因子には、多数の化学的なクラスが含まれるが、通常はこれらは、有機化合物、タンパク質、または抗体（および抗原に結合するそのフラグメント）である。いくつかの好ましい実施形態においては、候補の因子は有機低分子化合物、すなわち、５０より大きく約２５００未満である分子量を有している化合物、好ましくは、約１０００未満の分子量を有している化合物、より好ましくは、約５００未満の分子量を有している化合物である。候補の因子は、ポリペプチドおよび／または核酸との構造的な相互作用に不可欠な化学的な官能基を含み、通常は、少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含み、少なくとも２つの化学的官能基を含むことが好ましく、少なくとも３つの化学的官能基を含むことがより好ましい。候補の因子には、上記で同定された官能基の１つ以上で置換されている、環式炭素、または複素環式構造、および／あるいは芳香族または多環芳香族構造が含まれ得る。候補の因子はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体または構造的アナログ、あるいはそれらの組み合わせなどのような生体分子でもあり得る。
候補の因子は、合成の化合物または天然に存在する化合物のライブラリーを含む、広範な種々の供給源から得られる。例えば、多数の手段を、広範な種々の有機化合物および生体分子のランダムな合成および特異的な合成のために利用することができ、これには、ランダムなオリゴヌクレオチド、合成の有機組み合わせライブラリー、ランダムペプチドまたは非ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリー、タンパク質または抗体の組み合わせライブラリーなどの発現が含まれる。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態である天然に存在する化合物のライブラリーを利用することができ、これは容易に生産することができる。さらに、天然に存在するライブラリーおよび化合物、ならびに、合成によって生産されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に修飾することができる。さらに、公知の因子を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などで特異的またはランダムに化学修飾して、その因子の構造的なアナログを生じさせることができる。
種々の他の試薬もまた、混合物に含めることができる。これらとしては、塩、緩衝剤、中性のタンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの試薬が挙げられる。これらは、最適なタンパク質−タンパク質、および／またはタンパク質−因子の結合を促進するために使用することができる。このような試薬はまた、反応成分の非特異的相互作用またはバックグラウンド相互作用を減少させることもできる。プロテアーゼ阻害因子、ヌクレアーゼ阻害因子、抗菌剤などのような、アッセイの効率を改善する他の試薬もまた、使用することができる。
上記の反応物質の混合物は、候補の因子がＰＳＭＡ酵素と相互作用する条件下でインキュベートされる。成分を添加する順序、インキュベーション温度、インキュベーション時間、および他のアッセイのパラメーターは、容易に決定することができる。このような実験には、アッセイのパラメーターの最適化だけが含まれ、アッセイの基本的な成分は含まれない。インキュベーション温度は、通常は、４℃から４０℃の間である。インキュベーション時間は、好ましくは、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために最短とされ、通常は、０．１から１０時間の間である。
インキュベーション後、ＰＳＭＡ酵素活性の存在、または酵素活性がないことが、使用者が利用できる任意の便利な方法によって検出される。例えば、反応混合物には、ＰＳＭＡ酵素の基質が含まれ得る。基質、および／またはＰＳＭＡ酵素の作用によって形成される生成物が検出可能であることが好ましい。基質は、通常、検出可能な標識を含むか、または検出可能な標識に結合させられている。広範な種々の標識を使用することができ、例えば、標識は、直接的な検出（例えば、放射活性、発光、可視光線、または電子密度）を提供するもの、または間接的な検出（例えば、ＦＬＡＧエピトープのようなエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素タグなど）を提供するものである。標識は、基質に結合させることができ、また、基質の構造の中に取り込ませることもできる。
標識、および他のアッセイの成分の性質に応じて、種々の方法を、標識を検出するために使用することができる。例えば、標識は、基質に結合させられ、その後、基質から切り離される間に、検出され得る。標識は、可視光線または電子密度、放射性排出物、非放射性のエネルギー移動などによって直接検出することができ、あるいは、抗体結合体、ストレプトアビジン−ビオチン結合体などを用いて間接的に検出することもできる。種々の標識を検出するための方法は当該分野で周知である。
本発明はさらに、以下の実施例によって説明される。以下の実施例は、さらなる限定とは決して解釈されないはずである。本明細書の全範囲にわたって引用されている全ての参考文献（学術文献、交付済み特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）は、引用により本明細書中に組み入れられる。
（材料および方法）
ＤＮＡ構築物。全ての分泌されるＰＳＭＡ構築物は、Ｗ．Ｄ．Ｗ．Ｈｅｓｔｏｎ博士（Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２２７−２３０，１９９３）によって提供されたもとのヒトＰＳＭＡクローンｐ５５Ａから導いた。この構築物を、哺乳動物細胞中での高レベルの発現および分泌のために、発現ベクターＰＰＩ４（Ｔｒｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：１８４−１８７，１９９６）にサブクローニングした。組換え体である可溶性のＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）は、ＰＳＭＡの細胞外ドメイン全体（配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＡＡ６０２０９）のアミノ酸４４〜７５０）に相当する。
ｐｃＤＮＡ構築物：抗ＰＳＭＡ抗体１０．３、００６、０２６、０５１、０６９、および０７７をコードする核酸分子を、プラスミドｐｃＤＮＡ中にクローニングした。クローニングプロトコールは図１３に提供する。可変領域の増幅のために使用したプライマー（配列番号３３〜３６、センスおよびアンチセンス）もまた示す。抗ＰＳＭＡ抗体００６、０２６、０５１、０６９、０７７、および１０．３について構築したプラスミドには、抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号２〜７；それぞれ、ＰＴＡ−４４０３、ＰＴＡ−４４０５、ＰＴＡ−４４０７、ＰＴＡ−４４０９、ＰＴＡ−４４１１、ＰＴＡ−４４１３）を含めたか、あるいは、抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号８〜１３、それぞれ、ＰＴＡ−４４０４、ＰＴＡ−４４０６、ＰＴＡ−４４０８、ＰＴＡ−４４１０、ＰＴＡ−４４１２、およびＰＴＡ−４４１４）を含めた。プラスミドマップを、図１４〜２５に提供する。
ウェスタンブロット。細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および５ｍｇ／ｍＬのアプロチニンを含むＰＢＳ中で溶解させ、細胞の破片を、３０００ｇで４℃で３０分間、遠心分離によって除去した。溶解物を、５〜２０％の勾配ゲル上で分離し、その後、ニトロセルロース膜に移した。得られたブロットを、５％の乳汁、０．０２％のＳＤＳ、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中でブロックし、その後、２ｍｇ／ｍＬの濃度のＭＡＢ５４４一次抗体（Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにインキュベーションした。３回の洗浄後、ブロットを、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗マウスＨＲＰ結合二次抗体とともにインキュベートした。ブロットを、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ化学発光システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して視覚化した。
ＥＬＩＳＡ。細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および５ｍｇ／ｍＬのアプロチニンを含むＰＢＳ中で溶解させた。得られた細胞膜を９６ウェルプレート上にプレートし、滅菌したフードの中で一晩乾燥させた。その後、プレートをカゼインとＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでブロックし、その後、標準物として精製されたＭＡＢ５４４（Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または７Ｅ１１（Ｃｙｔｏｇｅｎ）を使用して、マウスの血清またはハイブリドーマ上清を添加した。ＰＢＳ中での洗浄後、アルカリホスファターゼ結合二次抗体（サブクラス特異的）をインキュベートし、その後、ＰＢＳ中で洗浄した。その後、ｐＮＰＰ基質を、４０５ｎｍの波長での比色検出のために添加した。
フローサイトメトリー。野生型３Ｔ３またはＰＳＭＡを発現する３Ｔ３細胞（１つの条件について１０６個の細胞）を、０．１％のＮａＮ３を含むＰＢＳ中で洗浄した。その後、抗体または血清（ＰＢＳ中に１：１００希釈）を添加し、３０分間氷上でインキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％のＮａＮ３中での洗浄後、細胞を、抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ）とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を再びＰＢＳ＋０．１％のＮａＮ３中で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
（実施例１：ＰＳＭＡ上の立体構造エピトープに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルの作成）
治療のための有望な候補を提示する抗ＰＳＭＡ ｍＡｂのパネルを作成した。簡単に説明すると、以下のようにｍＡｂを作成した：ＢＡＬＢ／ｃマウスを、およそ３週間の間隔で、組み換えＰＳＭＡで皮下に免疫した。全部で４回の注射の後、マウスを屠殺し、ハイブリドーマを作成するために、その脾細胞を骨髄腫細胞株と標準的な技術を使用して融合させた。個々のハイブリドーマ上清を、ＬＮＣａＰヒト前立腺腫瘍細胞に由来するか、または全長のヒトＰＳＭＡを発現するように操作された３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞）に由来するかのいずれかであるＰＳＭＡとの反応性について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ポジティブクローンを、天然に存在する細胞表面ＰＳＭＡを認識し、したがって、最も高い治療効力を有している抗体を選択するために、完全な３Ｔ３−ＰＳＭＡおよびＬＮＣａＰ細胞との特異的反応性について、フローサイトメトリーによって二次的にスクリーニングした。
ヒト抗体を生産する能力を有しているマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ，Ａｂｇｅｎｉｘ；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６，１９９７）を、ミョウバンまたはＴｉｔｅｒｍａｘ Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をアジュバントとした５×１０６個のＬＮＣａＰ細胞で１週間に１回、または１週間に２回、皮下に免疫した。動物を、１０μｇの、プロテインＧ磁気マイクロビーズ上に免疫親和性によって捕捉した組み換えＰＳＭＡタンパク質で２回追加免疫した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）。ＰＳＭＡ ｍＡｂ ３．１１を捕捉のために使用した。脾細胞をＮＳＯ骨髄腫細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを、ＰＳＭＡの細胞外部分と反応する抗体を生産するクローンを検出するために、フローサイトメトリーによって上記のようにスクリーニングした。１つのクローン１０．３（ＰＴＡ−３３４７）がこのような抗体を生産した。
これらの抗体は、細胞表面ＰＳＭＡ上の立体構造特異的エピトープと排他的に反応するｍＡｂを高い割合で生じる。図１に示すように、いくつかのｍＡｂ（ｍＡｂ ３．７、３．９、３．１１、５．４、および１０．３）は（全てではない（ｍＡｂ ３．１２）が）、生存しているＰＳＭＡを発現する細胞に特異的に結合する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株中で発現させた組換え体である可溶性のＰＳＭＡタンパク質を使用して、このｍＡｂがＰＳＭＡの細胞外領域中にあるエピトープに結合することをさらに確認した。このｍＡｂをまた、３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞溶解物に由来する天然に存在するＰＳＭＡを免疫沈降させるその能力についても試験した。フローサイトメトリー（図１）においてポジティブであるこのｍＡｂは、免疫沈降（図２）においても有効であったが、ｍＡｂ ３．１２は反応しなかった。図３は、変性させていない全長のＰＳＭＡと組換え体である可溶性のＰＳＭＡの、ＰＳＭＡ立体構造を認識するいくつかの抗体による認識を示す。これらの方法によって天然に存在するＰＳＭＡを効率よく認識するｍＡｂの優越が得られることをさらに確認した。
ｍＡｂを、ウェスタンブロット分析により、変性させられたＰＳＭＡとの反応性について試験した（図４）。示した細胞に由来する溶解物およびサンプル（対照：３Ｔ３細胞、ＰＳＭＡネガティブであるヒト前立腺細胞株ＰＣ−３およびＤＵ１４５、模造上清；ＰＳＭＡポジティブサンプル：ＰＳＭＡを発現する３Ｔ３細胞、ＰＳＭＡポジティブであるヒト前立腺細胞株ＬＮＣａＰ、ｒｓＰＳＭＡポジティブである上清）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、電気的にブロットし、そして抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ ３．１および３．１２（それぞれ、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−３６３９およびＰＴＡ−３６４０）でプローブした。同時に試験した４個のｍＡｂ（３．７、３．８、３．９、３．１１）は、全長のタンパク質または分泌されたｒｓＰＳＭＡタンパク質のいずれに対しても反応性を示さなかった。７Ｅ１１ ｍＡｂは、全長のタンパク質を免疫沈降させたが、分泌されたｒｓＰＳＭＡは沈降させなかった。
フローサイトメトリーおよび免疫沈降において反応性であったｍＡｂ（ｍＡｂ ３．７、３．９、３．１１、５．４、および１０．３）は、全て、ウェスタンブロットにおいては反応しなかった。このことは、これらのｍＡｂが直線的なエピトープを認識しないことを示している。まとめると、このデータは、これらの５個のｍＡｂはＰＳＭＡの細胞外ドメインに存在している立体構造特異的エピトープを認識することを強く示唆している。立体構造エピトープに対するｍＡＢは、通常、抗原に対して大きな親和性と特異性を有しているため、これらは、治療についての好ましい候補である。
特定の抗ＰＳＭＡ抗体の反応性を表２に記載する。
Figure 2007509977
 ｍＡｂが、主としてマウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、およびヒトＩｇＧ１イソ型であることを、ＥＬＩＳＡによって決定した。これらは、強いエフェクター機能を媒介する。多数の抗ＰＳＭＡ ｍＡｂが長年にわたって記載されており、治療可能性について評価されてきているが（例えば、Ｌｉｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：３６２９−３６３４，１９９７；Ｃｈａｎｇ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：３１９２−３１９８，１９９９；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １６０：２３９６−２４０１，１９９８を参照のこと）、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害するものはなく、ＰＳＭＡ上の立体構造決定基を認識するものもほとんどない。
（実施例２：抗ＰＳＭＡ ｍＡｂの生産）
これらのｍＡｂの治療可能性を正確かつ定量的に評価するために、ｍＡｂを、広範囲の生体外および生体内での特性決定に適切な量および質で生産させた。簡単に説明すると、ｍＡｂを分泌するハイブリドーマを、ウシＩｇＧを枯渇させた１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ローラーボトルの中で培養した。培養の生産段階の間、細胞を、培地を１週間に２回交換することによって約５×１０６個の細胞／ｍＬに維持した。回収した培地を、０．２２マイクロンのフィルターを通して濾過することによって明澄化し、精製するまで−９５℃で保存した。約２５ｍｇ／Ｌの平均の抗体発現レベルと仮定すると、およそ３Ｌのローラーボトルの上清が、精製の間に失われてもよいように、それぞれの抗体について必要であった。
所定のハイブリドーマに由来する培養上清をプールし、プロテインＡセファロースアフィニティーカラムに載せた。マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、およびヒトＩｇＧ１抗体は直接載せたが、マウスＩｇＧ１抗体を含む上清は、結合を促進させるために、載せる前に１ＭのＮａＣｌでｐＨを８．５に調節した。カラムの洗浄後、ｍＡｂを、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を使用して、低いｐＨの緩衝剤で画分中に溶出させた。溶出液のピーク画分をプールし、ＰＢＳ緩衝剤に対して透析し、５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−９５℃で滅菌したアリコートとして保存した。全ての精製手順を、内毒素を含まない緩衝剤と、消毒したクロマトグラフィーカラムを使用して行った。精製したｍＡｂを、還元性および非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について、ＥＬＩＳＡによってＰＳＭＡ結合親和性について、そしてｌｉｍｕｌｕｓ遊走細胞溶解物アッセイによって内毒素レベルについて試験した。これらの手順によって、日常的に行われているように、「動物グレード」の抗体が、タンパク質１ミリグラムあたり＞９５％の純度、および＜０．５単位の内毒素で得られた。
（実施例３：生体外での未標識のｍＡｂの治療可能性の評価）
精製したｍＡｂを、治療に関連する特性（親和性、特異性、酵素阻害活性、およびエフェクター機能を含む）についての複数のアッセイにおいて試験した。理想的な生成物の候補は、ナノモル未満の濃度でＰＳＭＡに結合し、ＰＳＭＡ活性を阻害して、Ｆｃ関連エフェクター機能を介して細胞の死滅を強力に媒介する。
最初に、ＰＳＭＡの細胞表面形態および分泌された形態に対するｍＡｂの親和性を、それぞれ、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡによって測定した。フローサイトメトリーアッセイにおいては、種々の量のｍＡｂを、５×１０５個の３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞とともに、ＦＡＣＳ緩衝剤（１％のＦＢＳと０．１％のＮａＮ３を含むＰＢＳ）中で、結合を飽和させるために２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによる結合したｍＡｂの検出のために、マウスＩｇＧに対するフィコエリスリン結合ヤギ抗体（ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ）とともにインキュベートした。特異的結合を、３Ｔ３親細胞を用いて観察された蛍光強度を引き算することによって計算した。
ＥＬＩＳＡについては、ＣＨＯ細胞に由来する組換え体である可溶性のＰＳＭＡタンパク質（ｒｓＰＳＭＡ、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を、５０ｍＭの炭酸緩衝剤（ｐＨ９．４）中に１μｇ／ｍＬになるように希釈し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩマイクロタイタープレート上で４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝剤で２時間ブロックした。ｍＡｂを、ＥＬＩＳＡ緩衝剤（２％のＢＳＡ、１％のＦＢＳ、および０．５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ緩衝剤）中の一定の濃度範囲で、室温で２時間かけて添加した。プレートを洗浄し、マウスＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体を、室温で１時間かけて添加した。再び、プレートを洗浄し、３，３’、５、５’−テトラメチルベンジジン二塩酸塩（ＴＭＢ）基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用する４５０ｎｍでの比色の読取のために添加した。
（実施例４：ｍＡｂ交差競合結合アッセイ）
所定のグループのｍＡｂがＰＳＭＡ上の異なるエピトープまたは重複しているエピトープを認識するかどうかを同定するために、交差競合結合アッセイを行った（Ｌｉｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：３６２９−３６３４，１９９７）。このフローサイトメトリーアッセイにおいては、ビオチニル化した試験ｍＡｂを３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞とともに、種々の濃度の未標識の競合相手であるｍＡｂ（上記）の存在下で、またはそれが存在しない条件下でインキュベートした。洗浄後、フィコエリスリン結合ストレプトアビジンを添加して、結合したビオチニル化ｍＡｂの量を決定した。阻害の割合（％）は、無関係な特異性のイソ型適合ｍＡｂの存在下で観察した阻害（０％）、および過剰の未標識の試験ｍＡｂを使用して観察した阻害（１００％）と比較して定義した。
（実施例５：ＰＳＭＡ酵素活性に対するｍＡｂの効果）
ＰＳＭＡが、葉酸加水分解酵素（プテロイル−グルタミルカルボキシペプチダーゼ）およびＮ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ）酵素活性の両方を有していることは示されており、これらは、腫瘍細胞の増殖および悪性度に影響をあたえ得る（Ｈｅｓｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．Ｗ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ（Ｒ．Ｋ．Ｎａｚ，編）．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：２１９−２４３，１９９７）。上記に記載されているｍＡｂの第１のセット（ｍＡｂ ３．９、ｍＡｂ ５．４、およびｍＡｂ ７．３）と、ｍＡｂ Ｊ５９１（ＡＴＣＣ ＃ＨＢ−１２１２６）を、ＰＳＭＡ酵素活性を測定するための以前に記載されたアッセイ（Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１４４５−１４５１，１９９６）を使用して、葉酸加水分解酵素を調節する活性について試験した。
簡単に説明すると、葉酸加水分解酵素活性は以下のように測定した。５０μＭのメトトレキセート ジ−γグルタミン酸と１０μｇ／ｍＬのｒｓＰＳＭＡ（抗ＰＳＭＡまたは無関係なｍＡｂと予め混合しておいた）を、１００μＬの容量のｐＨ４．５の酢酸緩衝剤中で３７℃で２時間インキュベートした。反応を、５分間沸騰させることによって停止させ、その後、メトトレキセートの遊離のモノ−およびジ−γグルタミン酸塩の形態を、キャピラリー電気泳動によってＳｐｅｃｔｒａ Ｐｈｏｒｅｓｉｓ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分離した。種々のメトトレキセート誘導体を、それらの保持時間と３００ｎｍでの吸光度に基づいて定量した。
データは、ｍＡｂ ５．４が精製されたＰＳＭＡタンパク質の酵素活性と、Ｃ４−２細胞の溶解物中の酵素活性を強力にブロックすることを示している。Ｃ４−２は、ＬＮａＣＰ細胞株（ヒトの前立腺ガン株）のアンドロゲン依存性誘導体であり、これは、内因性のＰＳＭＡを発現する。Ｃ４−２細胞株に関するさらなる詳細は、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ４５：１４９−１５７，２０００に見ることができる。図８および９に、ｒｓＰＳＭＡの２つの生産ロット（ｒｓＰＳＭＡ ＃７およびｒｓＰＳＭＡ ＃８）についての結果を提供する。Ｃ４−２細胞溶解物についての結果は図１０に示す。これらの図は、ｒｓＰＳＭＡの２つの生産ロット中、およびＣ４−２細胞溶解物中に存在する葉酸加水分解酵素による、メトトレキセート ジ−γグルタミン酸（ＭＴＸＧｌｕ２）からのグルタミン酸の切断の速度により、葉酸加水分解酵素の酵素活性に対する４つの抗体（ｍＡｂ ３．９、ｍＡｂ ５．４、およびｍＡｂ ７．３、およびｍＡｂ Ｊ５９１）の効果を示す。ｍＡｂ ５．４の阻害効果に加えて、ｍＡｂ ３．９もまた、葉酸加水分解酵素活性を阻害することを見出した。
ｍＡｂの別のセット（ｍＡｂ ４．４０．２、ｍＡｂ ００６、ｍＡｂ ０２６、およびｍＡｂ ５．４）もまた、葉酸加水分解酵素を調節する活性について試験した。データから、ｍＡｂ ５．４がＰＳＭＡの葉酸加水分解酵素活性を強く阻害することを確認した（図１１）。ＰＳＭＡの酵素活性を５０％阻害するｍＡｂ ５．４の濃度（ＩＣ５０、ＥＣ５０または「有効濃度」とも呼ばれる）が、４．９０２×１０−４ｍｇ／ｍＬであることを決定した。データはさらに、ｍＡｂ ００６およびｍＡｂ ０２６もまたＰＳＭＡ葉酸加水分解酵素活性をブロックするが、ｍＡｂ ４．４０．２は阻害しないことを示している（図１１）。ｍＡｂ ００６およびｍＡｂ ０２６についてのＩＣ５０値は、それぞれ、９．３３８×１０−３ｍｇ／ｍＬおよび１．３８５×１０−３ｍｇ／ｍＬであった。
ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性のアッセイのために、ｒｓＰＳＭＡタンパク質を種々の量の抗ＰＳＭＡまたは対照ｍＡｂとともに、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＣｏＣｌ２中で３７℃で１０分間インキュベートし、その後、５０μＬの０．６μＭのＮ−アセチルアスパルチル−［３Ｈ］グルタミン酸を添加した。１５分後、反応を、１ｍＬの１００ｍＭのＮａＰＯ４を添加することによって停止させた。切断されたグルタミン酸をイオン交換クロマトグラフィーによって基質から切り離し、シンチレーションカウンティングによって検出した。それぞれの測定を３連で行った。
（実施例６：免疫組織化学による正常なヒト組織および悪性腫瘍であるヒト組織との反応性）
抗ＰＳＭＡ ｍＡｂを、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ法（Ｓｉｌｖｅｒ Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３：８１−８５，１９９７）を使用して、正常なヒト組織と悪性腫瘍であるヒト組織の両方との反応性について免疫組織化学によって試験した。凍結させたか、またはパラフィンに包埋した組織を使用することができる。パラフィンに包埋した組織の切片からパラフィンを除去し、内因性のペルオキシダーゼ活性を、１％のＨ２Ｏ２と共に１５分間インキュベーションすることによってブロックした。切片を１：１０に希釈したウマの血清を含む２％のＰＢＳ−ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で３０分間ブロックし、その後、２％のＰＢＳ−ＢＳＡ中の２μｇ／ｍＬの抗ＰＳＭＡ ｍＡｂとともに一晩インキュベートした。洗浄後、切片をビオチニル化二次抗体とともにインキュベートし、洗浄し、ＰＢＳ中に１：２５に希釈したアビジン：ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともに、３０分間インキュベートした。洗浄後、切片を、０．０５％のジアミノベンジジン四塩酸、０．０１％のＨ２Ｏ２、および０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中に浸すことによって視覚化した。ネガティブ対照の切片は、無関係な特異性を有しているイソ型が適合しているｍＡｂとともにインキュベートした。ポジティブ対照としては、十分に特徴付けられている抗ＰＳＭＡ ｍＡｂである７Ｅ１１（Ｃｙｔｏｇｅｎ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を使用した。
（実施例７：抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ））
ＡＤＣＣアッセイにおいては、ｍＡｂを段階希釈し、５１Ｃｒで標識した３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞またはヒトＰＳＭＡを発現するように操作されたヒトの前立腺ＰＣ３細胞（ＰＣ−３−ＰＳＭＡ細胞）と混合した。ＮＫエフェクター細胞を、リンパ節または脾臓から、抗ＮＫマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して精製した。血清、ＮＫエフェクター細胞、および５１Ｃｒを載せた標的細胞を、１０：１、２０：１、および４０：１のエフェクター：標的細胞比で一緒にインキュベートし、それぞれの条件について３連で行った。細胞を３７℃で４〜５時間インキュベートし、その後、上清を、ガンマカウンティングによる５１Ｃｒの放出の測定のために回収した。特異的溶解の割合（％）を、イソ型が適合している非特異的ｍＡｂの存在下で観察された溶解（０％の溶解）と、１０％のドデシル硫酸ナトリウムを使用して得られた溶解（１００％の溶解）と比較して決定した。
（実施例８：補体媒介される溶解（ＣＭＬ））
ＣＭＬについては、５１Ｃｒを載せた３Ｔ３−ＰＳＭＡまたはＰＣ−３−ＰＳＭＡ細胞を標的細胞とした。ｍＡｂの段階希釈物を、ウサギの補体および標的細胞とともに、３７℃で４〜５時間一緒にインキュベートし、それぞれの条件について３連で行った。その後、上清を回収し、ガンマカウンターで数えた。特異的溶解を、ＡＤＣＣアッセイのデータを用いた以前に行ったのと同様に計算した。
（実施例９：抗増殖効果）
これらの抗体の抗増殖効果を試験するために、抗ＰＳＭＡ ｍＡｂを段階希釈し、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３−ＰＳＭＡ、およびもとのＰＣ−３細胞とともに対数増殖期においてインキュベートした。４時間、２４時間、および７２時間の間隔で細胞を取り出し、トリパンブルー染色およびＷＳＴ−１アッセイによって密度と生存性について分析した（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
（実施例１０：キレート化および放射標識手順の最適化）
上記の実施例に記載した手順を使用して同定した最も有望なｍＡｂを、動物での評価の前に、標識後の生化学的および生物学的安定性および活性について最適化した。生体外での実験における成功を、未標識または同様に標識されたイソ型対照ｍＡｂよりも＞１０倍低い濃度でＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞を特異的に死滅させる、放射標識されたｍＡｂの同定として定義した。
好ましいα線およびβ線を放射する同位元素は全て放射性金属であるため、個々のｍＡｂを、最初に適切な金属キレート化剤と結合させた。好ましい生体内安定性のデータと、ヒトでの臨床試験においてのその証明された用途に基づくと、二官能性キレート化剤Ｃ官能化トランスシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（ｐ−ＳＣＮ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ）が、９０Ｙまたは２１３Ｂｉのいずれかを抗体に結合させるために好ましい（Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１６９−１１７０，１９９１）。このキレートの形態は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ−Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭｃＤｅｖｉｔｔ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：１７２２−１７２７，１９９９）での継続中の試験において、ヒトにおいて７０回以上の用量で以前に試験されている。２２５Ａｃについては、本発明者らの最初の研究では、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサアザシクロオクタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’’，Ｎ’’’’’−六酢酸）と呼ばれる新規の二官能性キレート化剤を試験した（Ｄｅａｌ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：２９８８−２９９２，１９９９）。目的は、生体内での利用に適切な安定性を維持したまま、標識量および活性を最大にするために、抗体結合体とキレート剤の比を最適化することである。さらなるキレート化剤もまた使用することができ、これらは、Ｎ．Ｉ．Ｈ．および他の供給元から入手することができる。
最初に、抗体を、ｐＨ＝５で大モル過剰のＥＤＴＡとともにインキュベーションすることによって、金属を含まないようにした。ＥＤＴＡおよび抗体調製物から取り除かれた全ての金属を、持続的な緩衝剤交換／透析によって除去し、その結果、結合体緩衝剤でｐＨ＝５緩衝剤を置き換えた（Ｎｉｋｕｌａ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２：３８７−３９０，１９９５）。最適なキレート化剤対抗体比を生じるが、免疫反応性をなおも維持する条件を、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ８．５）中の抗体に対して４０倍モル過剰のキレート化剤を使用する最初の条件について、キレート化剤：抗体比、反応時間、温度、および／または緩衝剤システムを体系的に変化させることによって同定した。１つの抗体に結合したキレートの数を、確立されている分光光度測定法を使用して決定した（Ｐｉｐｐｉｎ，Ｃ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３：３４２−３４５，１９９２）。
９０Ｙおよび２２５Ａｃ構築物については、標識効率は直接測定する。例えば、２１３Ｂｉについては、最初の抗体構築物を、１１１Ｉｎを使用してキレート化効率について試験する。これは、２１３Ｂｉと同様のキレート化化学反応であるが、より長い半減期（ｔ１／２＝３日）、容易に利用できること、および跡をたどることができるγ線放射という利点を有している。一旦１１１Ｉｎを使用して最適化できたら、標識効率を２１３Ｂｉについて決定する。
放射標識されたｍＡｂを、移動相として１％のＨＳＡを使用して、ＢｉｏＲａｄ １０ＤＧ脱塩カラム上で精製し、簡易薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）および／または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、放射性核種の取り込みの割合（％）を決定するために評価した（Ｚａｍｏｒａ，Ｐ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：３０６−３１１，１９９４）。ＩＴＬＣおよびＨＰＬＣによって、低分子量の放射性化学的不純物（すなわち、金属キレート、コロイド、および遊離の金属）の純度の確立および割合（％）の同定の手段が提供される。それぞれの移動相についての二つのＩＴＬＣ細片を展開させ、乾燥させ、そして０．５のＲｆで切断し、ガンマカウンターでマークし、数えた。ＨＰＬＣシステムをオンラインＵＶ吸光度検出器および放射活性検出器の両方に取り付けた。ＨＰＬＣ溶出プロフィールは、タンパク質と低分子量の種の放射活性に、溶出時間の関数として直接相関していた。ＴＳＫ ＳＷ３０００ＸＬカラム（ＴｏｓｏＨａｓｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を使用し、タンパク質の分子量標準物の範囲を使用して較正した。
（実施例１１：放射標識されたｍＡｂの親和性および免疫反応性）
一旦、放射標識された構築物が得られ、精製され、生化学的および放射線化学的純度について評価されると、生物学的活性を決定した。放射性構築物の結合活性は、全ＬＮＣａＰおよび３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞、ならびに／または、以前に記載された膜画分を使用して得た結合データのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって行った（Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３：４４０−４４５（１９９１））。
合成の構築物の免疫反応性を、キレート：抗体分子の比を生物学的活性と相関させるために評価した。簡単に説明すると、２ｎｇの標識されたｍＡｂを、３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞上で発現させた約２５倍過剰のＰＳＭＡとともにインキュベートした。０℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離によって回収し、結合していないｍＡｂを含む上清を、新しい３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞に添加し、０℃でさらに３０分間インキュベートした。細胞のいずれのセットをも遠心分離し、冷却したＰＢＳで２回洗浄した。細胞のペレット、上清、および洗浄画分について、放射活性をカウントした。免疫反応性は、細胞ペレット、上清、および洗浄画分中の全放射活性によって割り算した、細胞ペレット中の放射活性の量と定義した。
（実施例１２：ｍＡｂの内在化）
放射標識されたｍＡｂの活性は、それらの内在化速度によってはっきりと調節することができる。他のグループ（Ｓｍｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：５２３７−５２４３，２０００）による以前の結果に基づいて、１つ以上のｍＡｂ構築物との結合の後の、ＰＳＭＡの有意な内在化を予想した。細胞表面抗体−抗原複合体の内在化を、１１１Ｉｎ放射標識抗体（ｍＡｂ ０２６）構築物（Ｃａｒｏｎ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：６７６１−６７６７，１９９２）を使用して測定した。簡単に説明すると、５×１０５個のＣ４−２細胞を、１１１Ｉｎ放射標識抗体とともに、５％のＣＯ２中で３７℃でインキュベートした。種々の時点で、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞表面に結合した放射標識構築物を、１ｍＬの５０ｍＭのグリシン／１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝２．８）を用いて剥がした。細胞に結合した放射活性および耐酸性（内在化された）放射活性の全てを、γカウンティングによって決定した。内在化の割合（％）と全結合を計算した。１１１Ｉｎで標識したｍＡｂ ０２６が、迅速に効率よく内在化されたことを見出した。図１２は、インキュベーション時間の関数として、内在化の割合（％）と１１１Ｉｎで標識されたｍＡｂ ０２６の全結合を示す。ＰＳＭＡを発現しない細胞（例えば、３Ｔ３親細胞）を、非特異的結合を決定するための対照として使用することができる。
（実施例１３：生体外での細胞傷害性の研究）
α−標識ｍＡｂの生体外での細胞傷害性の評価を、一旦、放射免疫結合体の免疫反応性を確立した後で行った。およそ５０，０００個の標的細胞（ＬＮＣａＰまたは３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞のいずれか）を、９６ウェルプレート中で処理し、２４〜９６時間後に分析した。２２５Ａｃで標識した構築物（または２１３Ｂｉで標識した構築物）による細胞死の量を、生存している細胞による３Ｈチミジンの取り込みを決定することによって行った（Ｎｉｋｕｌａ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：１６６−１７６，１９９９）。特異性を、対照細胞（ＰＳＭＡ陰性ヒト前立腺細胞株ＰＣ−３およびＤＵ−１４５、ならびに対照の３Ｔ３細胞）、過剰の未標識の抗体でのブロック、および対照の放射性結合体の使用によって決定した。
次いで、抗体結合体の濃度、比活性、および接触時間の細胞傷害性効果を評価した。細胞傷害性を、１ＭのＨＣｌ（１００％の細胞死）および培地（バックグラウンドの細胞死）を用いて見られた細胞傷害性と比較して表した。ＬＤ５０値を、細胞上に結合した２２５Ａｃ原子の数の関数として細胞の生存性をプロットすることによって計算した（ＭｃＤｅｖｉｔｔ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２５：１３４１−１３５１（１９９８））。
ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞の多細胞スフェロイドを確立させ、これを、生体外での最小の疾患を全滅させる放射免疫療法（ＲＩＴ）の能力を調べるために使用した。これらの三次元スフェロイドは、単層培養物よりも正確に組織構造を模倣し、したがって、充実性腫瘍のより近いモデルを提供する（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｋ．Ｃ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：４８６−４９３，１９９９）。ＬＮＣａＰ−ＦＧＣは、もとのＬＮＣａＰ細胞株の早く増殖するクローンであり、細胞を、液体重層技術を使用して２００〜６００μｍの大きさにまで増殖させた（Ｂａｌｌａｎｇｒｕｄ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：３１７１ｓ−３１７６ｓ、１９９９）。より大きいスフェロイドにおいては、細胞の内部の大部分は壊死し、外部の縁は増殖しつつある腫瘍細胞から構成される。抗体調製物を、共焦点顕微鏡によって測定し、先の結果は、抗ＰＳＭＡ抗体が４０〜５０μｍの深さにまで浸潤するはずであることを示唆した（Ｂａｌｌａｎｇｒｕｄ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，７ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ＮＪ，１９９８）。ＬＮＣａＰ標的細胞上の２２５Ａｃ−３．９の生体外での細胞傷害性を図２６に示す。生存しているＰＳＭＡ＋ＬＮＣａＰ細胞の割合を、放射性結合体の活性の関数としてプロットした。１００倍過剰の未標識の抗体の添加を、特異性についての対照として使用した。
（実施例１４：ヒトの前立腺ガンのマウス異種移植モデルにおける未標識のｍＡｂおよび放射標識ｍＡｂの生体内での効率の評価）
上記のアッセイにおいて成功した抗体は、有意な特異性および機能特性を示し、このことは、これらが治療的な使用に有用であることを示唆している。これらの放射標識ｍＡｂ構築物と「裸の」ｍＡｂ構築物の最高の有望性を、前立腺ガンについての最も利用されているマウスモデルにおいて評価した。この研究では、ＬＮＣａＰヒト前立腺腫瘍細胞株を免疫システムが損なわれているヌードマウスに注入し、充実性腫瘍を形成させた、確立されている異種移植モデルを使用し（Ｅｌｌｉｓ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２：１０３９−１０４８（１９９６）、次いでこれを、放射標識した抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ構築物と未標識の抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ構築物の両方で処置した。研究の追跡にはまた、マウスの異種移植モデルＣＷＲ２２を利用した。これは、ヒトの前立腺ガンの鍵となる生物学的特徴の多くを再現する。
（Ｌｎｃａｐ腫瘍細胞異種移植モデル）
高い親和性と高い特異性を示す構築物を、生体内分布および薬物動態分析のために、ＬＮＣａＰ腫瘍細胞異種移植生体内モデルに取り込ませた。１１１Ｉｎ標識抗ＰＳＭＡ抗体を、その好ましいキレート化化学反応、放射活性半減期、および追跡することができるγ線放射の理由から、これらの研究に使用した。治療上利点がある核種である、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、１７７Ｌｕ、および９０Ｙの半減期について適切である時点を評価した。標識された放射性構築物（１〜５μｇ）を、ヌードマウス（正常なマウス、および腫瘍を有しているマウス）にｉ．ｖ．で注射し、マウスを、注射後５分、１５分、３０分、６０分、２時間、４時間、１８時間、および２４時間で屠殺した。血液と腫瘍な臓器を動物から取り出し、重さを測定し、組織１グラムあたりの注射した放射活性の割合（％）を決定した（Ｎｉｋｕｌａ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：１６６−１７６，１９９９）。特異性を、過剰の未標識の構築物を事前に注射することによって得た。微視的な腫瘍の容量と動物の生存率を、実験の最初から最後までを通じて記録した。
用量範囲の研究もまた、正常なマウスと腫瘍を保有しているマウスに対するｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．で投与した際の、構築物の毒性を決定するために行った。これらの動物は、血液の化学的および物理的試験により、研究の間を通じて、毒性の副作用について日常行っているように試験した。動物を、さらに評価するために血液および体組織を回収するために、研究の間、および研究の終わりの時点で屠殺した。以前のデータは、およそ２５０μＣｉ／マウスの最大耐量を明らかにしており、したがって、全用量はこのレベルよりも低く維持した。
一旦、ｉ．ｖ．での生体内分布および毒性が明らかになると、腫瘍の放射線治療を評価した。５匹のマウスのグループに、＜１μｇの放射標識した抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ構築物を、腫瘍のチャレンジの前と後の両方に注射して、抗腫瘍活性を評価した。抗原陰性（ＲＡＪＩまたはＲＡＭＯＳ）異種移植腫瘍もまた、対照として使用した。他の対照としては、（１）未標識の抗ＰＳＭＡ ｍＡｂのみで処置したもの、ならびに、（２）特異的標的化をブロックするために、過剰の未標識の抗ＰＳＭＡ ｍＡｂで事前に処置し、その後、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、１７７Ｌｕ、および／または９０Ｙで標識した抗ＰＳＭＡで処置したものを含めた。
腫瘍を保有しているマウスのグループには、未標識の抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ（等モル濃度で）と、いくつかの用量レベルの放射標識した抗ＰＳＭＡまたは同様に標識したイソ型対照抗体を注射した。腫瘍の増殖に対する効果を経時的に評価した。治療グループの間での統計学的な差を、分散（ＡＮＯＶＡ）法の分析を使用して決定し、動物の生存性を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを使用して図解する。２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、１７７Ｌｕ、および／または９０Ｙで標識した抗ＰＳＭＡ構築物の効力は、生体外で得られたデータと相関していた。これらの実験の成功は、放射標識されたイソ型対照ｍＡｂと比較して、半減期を有意に（ｐ＜０．０５）増大させる、および／または腫瘍の容積を減少させる能力として定義した。
さらに、腫瘍モデルを、放射標識された抗体の注射の前に未標識の抗体を予め投与することによって腫瘍に対する放射標識された抗体の送達が改善されるかどうかを試験するために使用した。腫瘍を保有しているマウスに、＜１μｇの放射標識された抗ＰＳＭＡ抗体を、５〜１００μｇの未標識の抗体を１回事前に注射して、またはそのような事前の注射をせずに注射した。数日後、動物を、腫瘍、正常組織、および血液中の放射活性の分布を評価するために屠殺した。未標識の抗体の事前の投与によって、腫瘍への放射標識された抗体の送達および標的化が改善されれば、このアプローチが、毒性の研究および治療的な研究において適用され、最適化される。
全体的な生存性に加えて、腫瘍の移植後の注射のタイミング（１日目対３日目対７日目）の役割、投与量の役割（３〜４の用量レベルを使用した用量応答曲線）、スケジュールの役割（１回対複数回に分けた１日の注射量）、および処置の特異性（標的化をブロックするための未標識の抗ＰＳＭＡでの事前の処置）を試験した。
これらの生体内での研究は、放射標識された抗体の最大耐量、抗体の活性、最適な投与量スケジュール（１回または複数回の注射）、および腫瘍の大きさに対する作用が得られるように設計した。これらの研究の成功裏の終結によって、前立腺ガンのＰＳＭＡ標的化α粒子放射免疫療法（ＲＩＴ）の実行可能性の決定、および臨床開発に入るための最適な２１３Ｂｉおよび／または２２５Ａｃ標識構築物の同定が可能になった。
（ＣＷＲ２２マウス異種移植モデル）
未標識の形態、毒素で標識された形態、および／または放射標識された形態の最も有望な抗ＰＳＭＡ ｍＡｂを、ＣＷＲ２２ヒト前立腺ガン異種移植マウスモデルにおいて試験した（Ｗａｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：６０４９−６０５２（１９９４）；Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：３０４２−３０４６（１９９６）；Ｐｒｅｔｌｏｗ，Ｔ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８５：３９４−３９８（１９９３））。このモデルは、アンドロゲンに対する依存性、測定した血清中のＰＳＡのレベルと腫瘍の大きさとの間の相関関係、およびＰＳＭＡの高レベルの発現を含む、ヒトの症状の多くの特徴を有している。アンドロゲンの使用中止後、ＰＳＡのレベルはほぼ検出不可能なレベルにまで低下し、腫瘍の容積も小さくなった。その後、腫瘍は、アンドロゲン依存性の新生物として再生し、ＰＳＡの上昇が最初に現れ、その後、測定可能な腫瘍の増殖が現れた。アンドロゲンの使用中止後、腫瘍は種々の期間で再生した。
４から６週齢の胸腺欠損ヌードＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒから入手し、加圧型の空気を通したケージの中で維持した。多くの局面においては免疫不全であるが、これらのマウスはＡＤＣＣおよびＣＭＬに関して野生型のレベルを媒介する。ＣＷＲ２２腫瘍株を、確立された腫瘍に由来するすりつぶした腫瘍組織を胸腺欠損ヌードマウスのわき腹の皮下組織に、再構成された基底膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）とともに注射することによって、動物において増殖させた。血清のアンドロゲンレベルを維持するために、マウスに１２．５ｍｇの徐放テストステロンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を、腫瘍を投与する前に、皮下投与した。接種後３〜４週間で、およそ１．５×１．０×１．０ｃｍの腫瘍が測定された。アンドロゲンをペントバルビタール麻酔下での去勢手術、および徐放テストステロンペレットの除去によってなくした。腫瘍の大きさを、高さ、幅、および深さの測径器での測定によって決定した。ＰＳＡ値は、Ｔａｎｄｅｍ−Ｒ ＰＳＡ免疫放射分析アッセイ（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して尾からの採血の後に、マウスの血清について行った。
抗腫瘍活性を評価するために、５匹のマウスのグループに、抗ＰＳＭＡ ｍＡｂまたは同様のイソ型対照ｍＡｂを５〜１００μｇの投与量で注射した。単回投与対複数回に分けた１日量のスケジュールの効果もまた試験した。微視的な腫瘍の容量と動物の生存率を、実験を通じて記録した。治療グループの間での統計学的な差を、分散（ＡＮＯＶＡ）法の分析を使用して決定し、動物の生存性を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを使用して図解する。成功は、ｐ＜０．０５の差と定義する。同様に、「裸の」ｍＡｂの効力を、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１３Ｂｉ、および／または２２５Ａｃで標識された抗ＰＳＭＡ構築物を用いて見られた効力と比較した。
これらの生体内での研究は、ｍＡｂの最大耐量、抗体の活性、最適な投与量および投与スケジュール（１回または複数回の注射）、ならびに、腫瘍の大きさに対する処置の効果が得られるように設計した。これらの研究の成功裏の終結によって、前立腺ガンのＰＳＭＡ標的化免疫療法の実行可能性の決定、および臨床開発に入るための最適な構築物の同定が可能になった。
（実施例１５：天然に存在するＰＳＭＡタンパク質の立体構造の研究）
（ＬＮＣａＰおよび３Ｔ３細胞の細胞表面からのＰＳＭＡの抽出）
ＬＮＣａＰまたは３Ｔ３細胞を、Ｔ１５０細胞培養フラスコ中でコンフルエントにまで増殖させ、細胞解離溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）を使用して剥離させ、そして１５ｍＬの円錐菅に移した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２ｍＬのＭ−Ｐｅｒ（登録商標）哺乳動物タンパク質抽出試薬（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に再懸濁させた。４℃で１０分間のインキュベーションの後、細胞の破片と不溶性の凝集物を、４℃で３０分間の、１５，０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。上清を、極低温用バイアルに移し、さらに使用するまで−８０℃で保存した。
（組換え体である可溶性のＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）の生産）
ＰＳＭＡの細胞外ドメイン（全長のタンパク質（配列番号１）のアミノ酸４４〜７５０）を、ｒｓＰＳＭＡ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＤＸＢ１１チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から分泌されたタンパク質として得た。細胞を、Ｃｅｌｌｉｇｅｎ Ｐｌｕｓ ２．２Ｌ Ｐａｃｋｅｄ Ｂｅｄ バイオリアクター（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）においてタンパク質を含まない培地中で増殖させた。バイオリアクターを還流モードで操作し、上清を４℃に保った回収バッグに吸引することによって回収した。プロテアーゼ阻害因子であるアプロチニンを回収した上清に添加し、これを、２５倍に濃縮し、その後、−９０℃で保存した。いくつかの場合には、精製のために、濃縮物を融解させ、次の段階のコンカナバリンＡレクチン親和性クロマトグラフィーおよびブチル−セファロース疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、または以下に示される段階にしたがって精製した。
精製したｒｓＰＳＭＡタンパク質は二量体であり、公開されている手順（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：１４４５，１９９６）にしたがって試験すると、葉酸加水分解酵素活性を有しており、立体構造特異的モノクローナル抗体のパネルのそれぞれと反応した。このことは、ｒｓＰＳＭＡが天然の立体構造をとっていることを示している。
（組換え体である可溶性のＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）の精製）
細胞培養上清を、接線流限外濾過によって２５倍に濃縮し、硫酸アンモニウムで３５％の飽和度に調節した。これらの条件下では、ｒｓＰＳＭＡは上清の中に残った。沈殿したタンパク質を遠心分離（２０，０００×ｇで３０分間、ＳＳ−３４、Ｓｏｒｖａｌｌ）によって除去し、明澄化した上清をブチル−セファロース樹脂（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に載せ、その後、１ｍＭのＣａ２＋と０．５ｍＭのＭｇ２＋（ＰＢＳ＋）を含む中性のリン酸緩衝化生理食塩水中の３５％の硫酸アンモニウムで洗浄した。ｒｓＰＳＭＡは、カラムのフロースルーと洗浄画分の中に溶出した。ｒｓＰＳＭＡタンパク質を含む画分をプールし、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に対して透析し、セラミックヒドロキシアパタイト（Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）カラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に載せた。ｒｓＰＳＭＡを、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の２Ｍの塩化ナトリウムを使用して樹脂から溶出させた。タンパク質を含む画分をプールし、１ｍＭのＣａ２＋と０．５ｍＭのＭｇ２＋を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）に対して透析し、Ｑ６５０−セファロースカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）に載せた。ｒｓＰＳＭＡを、１ｍＭのＣａ２＋と０．５ｍＭのＭｇ２＋を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中の１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて樹脂から溶出させた。この工程の後に存在している単量体形態および二量体形態のｒｓＰＳＭＡを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００樹脂上での分配サイズ排除クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と、ランニングバッファーとしてのＰＢＳ＋（１ｍＭのＣａ２＋および０．５ｍＭのＭｇ２＋を含む）を使用して分離した。精製したｒｓＰＳＭＡをＰＢＳ＋中で−８０℃で保存した。他の場所で明確に記載されない限りは、ＰＳＭＡ単量体は、強制的に変性させられた物質ではなく、ＳＥＣ上で回収された自発的に解離したタンパク質である。
（種々のＰＳＭＡタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロッティング）
それぞれの個々のＰＡＧＥ分析のために、１５μＬのそれぞれの細胞溶解物と５μＬの精製したｒｓＰＳＭＡを使用した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、標準的な手順を使用して行った。サンプルをＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝剤（還元剤であるジチオスレイトール［ＤＴＴ］を含むもの、または含まないもの）の存在下で５分間沸騰させることによって調製した。その後、サンプルを４〜１５％のトリス−グリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に載せた。２００Ｖで１時間の電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース（ＢｉｏＲａｄ）上に移し、ウェスタンブロッティングによって分析した。
種々のＰＳＭＡタンパク質のオリゴマーの性質を、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（ＢＮ−ＰＡＧＥ）を使用して分析した。それぞれのサンプルを等容量の２×ＢＮ−ＰＡＧＥサンプル緩衝剤（０．１ＭのＭＯＰＳ／０．１ＭのＴｒｉｓ／４０％のグリセロール／０．１％のクマシーＧ−２５０）で希釈し、その後、ゲル上に載せた。ＢＮ−ＰＡＧＥを、４〜１２％のＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、ランイングバッファーとしての５０ｍＭのＭＯＰＳ／５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．７）を使用して行った。クマシーブルーを、ニトロセルロース上へのタンパク質の移動の間のタンパク質の結合の妨害を避けるために、カソード緩衝剤から省いた。１２５Ｖで２．５時間の電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）上に移し、ウェスタンブロッティングによって分析した。
ウェスタンブロッティングは以下のように行った：移動後、ニトロセルロース膜を、ＰＢＳ／０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／０．０２％のＳＤＳ中の５％の乳汁でブロックした。これは、その後の洗浄および抗体のインキュベーション工程にも使用した。ＰＳＭＡタンパク質を、一次抗体としての抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ ３．１または３．９（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）と、二次抗体としてのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧと、室温で１時間のインキュベーションを使用して検出した。膜を、化学発光（ＮＥＮ Ｐｌｕｓ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して発色させた。
分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＰＢＳ＋中で平衡化させたＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）カラムを使用して行った。カラムを、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）、免疫グロブリンＧ（１５０ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、およびサイログロンビン（６７０ｋＤａ）を標準物として使用して較正した。
（結果）
全長のＰＳＭＡと、組換え体である可溶性のＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）の両方ともが、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび非還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約１００ｋＤａの分子量として移動した（図５）。したがって、全長のＰＳＭＡと同様に、ｒｓＰＳＭＡは変性剤の存在下では単量体であり、オリゴマーの形成を媒介するためのジスルフィド結合または他の共有結合は存在しない。全長のＰＳＭＡについての結果は、以前の観察と一致した（Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５３８，８６６号；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，１５８，５０８号；Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５４：１８０７，１９９４；Ｔｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６２：５５２，１９９５；Ｔｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０：２３３，１９９７；Ｇｒａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：４７８７，１９９８）。これらの報告のそれぞれにおいては、全長のＰＳＭＡは１００〜１２０ｋＤａの主要なバンドとして移動し、報告の一部（米国特許第６，１５８，５０８号；Ｔｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｔｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）においては、主要ではない（通常は全ＰＳＭＡタンパク質の＜５％）１８０〜２００ｋＤａのバンドとして観察された。Ｔｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）には、１８０〜２００ｋＤａの種が、漸増濃度のＳＤＳ界面活性剤を用いて崩壊させることができる非共有的に結合したＰＳＭＡ二量体であることが記載されている。
ｒｓＰＳＭＡは、その９４％（７５０個のうちの７０７個）が全長のＰＳＭＡ中に存在するアミノ酸であり、２つのタンパク質は、予想されたとおり、この分析においては明らかに分離することができなかった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっては、変性したタンパク質のみが分析された。その天然に存在する状態で天然に存在するタンパク質を試験するためには、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（ＢＮ−ＰＡＧＥ）のような他の技術を使用しなければならなかった。ＢＮ−ＰＡＧＥを、タンパク質およびそれらの非共有的複合体の天然の分子量を決定するために使用した（Ｓｃｈaｇｇｅｒ ＆ ｖ．Ｊａｇｏｗ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９：２２３−２３１，１９９１；Ｓｃｈaｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：２２０−２３０，１９９４）。色素であるクマシーブルーＧ−２５０は、ほとんどのタンパク質の表面上の疎水性ドメインに結合し、可溶性を増大させ、天然に存在するタンパク質に対する電荷の移動を生じさせ、その結果、タンパク質の等電点とは無関係にｐＨ７．５の陽極への移動を生じさせる。ＢＮ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質の移動速度はいくらか変化するが、タンパク質分子の大きさは、ゲル中に存在するアクリルアミド勾配の徐々に小さくなる孔の大きさが原因で生じる、それらのそれぞれの移動の終点によって決定することができる。
ＢＮ−ＰＡＧＥによって分析すると、全長のＰＳＭＡ（ＬＮＣａＰまたは３Ｔ３細胞から、非イオン性界面活性剤を用いて抽出した）、ならびに、精製されたｒｓＰＳＭＡは、約１９０ｋＤａの分子量で移動する（図６Ａ）。全長のＰＲＭＳについてのこの驚くべき観察は、細胞表面ＰＳＭＡの優勢な形態が非共有的に会合した二量体であることを示している。この予想外の結果は、これまでの報告（米国特許第６，１５８，５０８号；Ｔｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｔｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）とは対照的であり得るが、ＰＳＭＡ二量体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において主要ではない種を示す。おそらく、非共有的なＰＳＭＡ二量体は、変性性の界面活性剤であるＳＤＳの存在下での沸騰によって、ほとんどが解離させられる。
さらに、精製されたｒｓＰＳＭＡタンパク質についての結果は、二量体が、ｒｓＰＳＭＡ中には存在しない、膜貫通セグメントまたは細胞内セグメント中のアミノ酸に加えて、またはそれを除く、細胞外アミノ酸同士の間での相互作用によって安定化させられていることを示している。
ｒｓＰＳＭＡについて、第２のサイズ分析方法としての分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。中性のＰＢＳ＋緩衝剤中で分析すると、精製されたｒｓＰＳＭＡが、２６０ｋＤａの見かけの分子量の１つの主要なピークとして溶出し（図６Ｂ）、これは予想されたよりもわずかに大きかった。しかし、糖タンパク質（例えば、ｒｓＰＳＭＡ）は、通常、球形ではない形状であり、標準的なＳＥＣ較正用タンパク質よりも大きな見かけの分子量で移動する（Ｓｃｈｕｌｋｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６，７７６０−７７７６）。したがって、２６０ｋＤａの見かけの分子量は、ｒｓＰＳＭＡについての提案されているホモ二量体構造と一致する。対照的に、精製された単量体ｒｓＰＳＭＡは、１３０ｋＤａの見かけの分子量で溶出させられた。この研究は、ＰＳＭＡの細胞外ドメインが二量体化に十分であることを示しており、ｒｓＰＳＭＡ（アミノ酸４４〜７５０）とＰＳＭ’（アミノ酸５８〜７５０）との間の類似性により、後者のタンパク質もおそらく同様に二量体化することを示唆している。
（実施例１６：酵素活性に必要なホモ二量体化Ｉｓ）
（酵素アッセイ）
プテロイルγ−グルタミルカルボキシペプチダーゼ（葉酸加水分解酵素）活性を、以下の点を除いて、記載されているように、ポリγ−グルタミル化メトトレキセートの切断をモニターすることによって決定した（Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２，１４４５−１４５１）。ジ−γ−グルタミン酸化メトトレキセート（ＭＴＸｇｌｕ２）を基質として使用し、キャピラリー電気泳動ではなくＨＰＬＣを使用した。インキュベーション（１００μＬの容量のｐＨ４．５の酢酸緩衝剤中の５０μＭのメトトレキセート−ジ−γ−グルタミン酸および１０μｇ／ｍＬのｒｓＰＳＭＡ、３７℃で２時間）の終了時点で、１００μＬの０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を反応を停止させるために添加した。サンプルを１．２５ｍＬ／分の流速で、５０×４．６ｍｍの３μｍのＰＲＩＳＭ逆相カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を通じて、ＰＲＩＳＭ １０×４−ｍｍのガードカラムを用いて載せ、８５％の０．５Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）中の１５％のメタノールを用いて溶出させ、３１３ｎｍの波長で観察した相対的なピーク面積に基づいて定量した。
ＮＡＡＬＡＤａｓｅアッセイについては、ｒｓＰＳＭＡをＮ−アセチル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸とともに３７℃で２２時間、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＺｎＣｌ２（ｐＨ７．１）の存在下でインキュベートした。放出させられたＬ−グルタミン酸を、市販されているキット（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，ＭＩ）を使用して定量した。２−（ホスホノメチル）五ペンタン二酸と、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−７−アミド−４−メチルクマリンは、Ｓｉｇｍａから購入した。ブタの腎臓のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）は、製造業者の説明書（Ｓｉｇｍａ）にしたがって使用した。
（結果）
ＰＳＭＡが、葉酸加水分解酵素活性、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性、およびＤＰＰ ＩＶ活性を有していることは報告されている（Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１４４５−１４５１；Ｃａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：７４９−７５３；Ｐａｎｇａｌｏｓ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，８４７０−８４８３）。最初の２つの活性には、遊離のグルタミン酸残基に結合させられたカルボキシル末端ペプチドの加水分解が含まれるが、一方、ＤＰＰ ＩＶは、アミノ末端Ａａａ−Ｐｒｏジペプチド配列の下流を切断する。ｒｓＰＳＭＡの精製された単量体および二量体形態について、葉酸加水分解酵素活性を評価した。二量体は、高いレベルの葉酸加水分解酵素活性を示したが、単量体は本質的には不活性であった（図７Ａ）。実際、単量体の残存活性は、調製物中に存在している二量体ｒｓＰＳＭＡの残存量（およそ４％）によるものであり得た。高レベルの葉酸加水分解酵素活性はまた、ＬＮＣａＰ細胞溶解物についても観察され、これは、以前の観察と一致した（Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１４４５−１４５１）。同様に、単量体形態のｒｓＰＳＭＡではなく、二量体形態のｒｓＰＳＭＡは高レベルのＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性を有しており（図７Ｂ）、これは、阻害因子である５ｎＭの２−（ホスホノメチル）五ペンタニ酸を使用することによって撤回された。単量体および二量体のいずれも、ブタのＤＰＰ ＩＶが基質であるＧｌｙ−Ｐｒｏ−７−アミド−４−メチルクマリンを効率的に加水分解する条件下ではＤＰＰ ＩＶ活性を示さなかった。このことは、Ｂａｒｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．，（Ｂａｒｉｎｋａ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８０，４７７−４８７）によって報告された結果と一致しており、彼らも同様に、ＰＳＭＡについて以前に報告された（Ｐａｎｇａｌｏｓ，Ｍ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，８４７０−８４８３）ＤＰＰ ＩＶ活性を確認することはできなかった。
（実施例１６：ＰＳＭＡ多量体の解離）
ＰＳＭＡは、推定される亜鉛メタロプロテアーゼであり、亜鉛の結合に関係しているアミノ酸の部位特異的変異誘発によって、酵素活性の完全な欠失を生じる（Ｓｐｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５５：１７９，１９９９）。これらのアミノ酸には、Ｈｉｓ−３７７、Ａｓｐ−３８７、Ｇｌｕ−４２５、Ａｓｐ−４５３、およびＨｉｓ−５５３が含まれている。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、Ｚｎ２＋と他の二価の陽イオンについての強力なキレート化剤であり、したがって、ＰＳＭＡからＺｎ２＋または他の配位した二価の陽イオンを除去する能力を有している。本発明者らは、ＥＤＴＡでの処理によって、ＰＳＭＡホモ二量体の単量体サブユニットへの解離が生じることを決定した。同様の結果は、例えば、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）（ＥＧＴＡ）のような類似しているキレート化特性を有している他の物質についても予想することができる。
精製されたｒｓＰＳＭＡタンパク質を、１０ｍＭのＥＤＴＡとともに、またはＥＤＴＡを伴わずに、４℃で１６時間インキュベートし、その後、ＢＮ−ＰＡＧＥによって分析した。これらの条件下では、ＥＤＴＡで処理したタンパク質は単量体であるが、一方、ｒｓＰＳＭＡはＥＤＴＡが存在しない条件下では二量体のままであった。ＰＳＭＡ二量体の単量体への解離は本質的には完了しているが、任意の残存している二量体タンパク質は、所望される場合には、ゲル濾過、限外濾過、または当業者に周知である他の大きさに基づく分類方法によって除去することができる。
（実施例１７：ＰＳＭＡの解離についての促進因子を同定するための方法）
化合物を、以下を含む方法を使用して、ＰＳＭＡ二量体の解離を促進する能力についてスクリーニングした：
（ａ）ＰＳＭＡ二量体を化合物と、その化合物が存在しない場合にはＰＳＭＡ二量体の解離を促進することはない条件下で接触させること；
（ｂ）ＰＳＭＡ単量体の量を測定すること；および
（ｃ）その化合物の存在下で測定されたＰＳＭＡ単量体の量を、その化合物が存在しない条件下で観察された量と比較すること。
化合物の存在下で測定されたＰＳＭＡ単量体の量の増加は、その化合物がＰＳＭＡ二量体の解離を促進することができることを示す。
さらなる実施形態においては、化合物を、以下を含む方法を使用して、ＰＳＭＡ二量体の解離を促進する能力についてスクリーニングした：
（ａ）ＰＳＭＡ二量体を化合物と、その化合物が存在しない場合にはＰＳＭＡ二量体の解離を促進することはない条件下で接触させること；
（ｂ）ＰＳＭＡ二量体の量を測定すること；および
（ｃ）その化合物の存在下で測定されたＰＳＭＡニ量体の量を、その化合物が存在しない条件下で観察された量と比較すること。
化合物の存在下で測定されたＰＳＭＡニ量体の量の減少は、その化合物がＰＳＭＡ二量体の解離を促進することができることを示す。
さらなる実施形態においては、化合物を、以下を含む方法を使用してＰＳＭＡ二量体の解離を促進する能力についてスクリーニングした：
（ａ）ＰＳＭＡ二量体を化合物と、その化合物が存在しない場合にはＰＳＭＡ二量体の解離を促進することはない条件下で接触させること；
（ｂ）ＰＳＭＡ単量体とＰＳＭＡ二量体の量を測定すること；
（ｃ）ＰＳＭＡ二量体に対するＰＳＭＡ単量体の割合を計算すること；および
（ｄ）（ｃ）で得られた割合を、その化合物が存在しない条件下で得られた割合と比較すること。
化合物の存在下で測定された割合の増加は、その化合物がＰＳＭＡ二量体の解離を促進することができることを示す。
（実施例１８：細胞表面でのＰＳＭＡの結合についての研究）
（フローサイトメトリー）
３Ｔ３親細胞またはＰＳＭＡを発現する３Ｔ３細胞（１つの条件について２×１０５個の細胞）をＰＢＳ中で洗浄し、非特異的結合部位をブロックするためにヤギの血清（１０％ｖ／ｖ）を含むＰＢＳと共に２０分間氷上でインキュベートした。抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体（上清中の未精製の形態、または精製したｍＡｂ）を段階希釈して、１００μＬのＰＢＳ中の細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。対照の抗ヒトＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、バックグラウンドの結合を確立するために使用した。ＰＢＳ中での２回の洗浄後、細胞を抗ヒトＩｇＧ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、２５０μＬのＰＢＳ中に再度懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してフローサイトメトリーによって分析した。生存している細胞を前方散乱と側方散乱パラメーターによってゲートし、結合を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルのヒストグラムプロットを使用して定量した。
抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ ＸＧ−００６（ＰＴＡ−４４０３およびＰＴＡ−４４０４、重鎖および軽鎖プラスミド）、ＸＧ−０５１（ＰＴＡ−４４０７およびＰＴＡ−４４０８）、４．４０．１（ＰＴＡ−４３６０；４．４０、４．４０．１、および４．４０．２は、ハイブリドーマのサブクローニングの異なる段階を示す同じ抗体である）、４．４９．１、４．２９２．１（ＰＴＡ−４３９０）および４．３０４．１が、細胞表面ＰＳＭＡに強い力で結合することを見出した（図２７）。
（最大結合）
フローサイトメトリーのデータ（平均蛍光強度ｖ．抗体濃度）を、Ｅｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を使用して置き換え、プロットした。少なくとも３回の決定の代表的な実験による結果を、図２８Ａ〜２８Ｃに示す。結合を、ＥｘｃｅｌのＦｏｒｅｃａｓｔ関数を使用して５０％の有効濃度（ＥＣ５０）の計算によって比較した。ＥＣ５０値は、最大の結合の半分に必要な抗体の濃度を示す。
抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ １０．３（ＰＳＭＡ １０．３）とＸＧ−００６が、３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞に結合するが、３Ｔ３細胞には結合しないことが明らかになった（図２８Ａ）。抗体（２６ｎＭ）を細胞に添加し、これを、フローサイトメトリーによって分析した。段階希釈した抗ＰＳＭＡ ｍＡｂを含むＸＧ−００６、４．３０４．１、ＸＧ−０２６（ＰＴＡ−４４０５およびＰＴＡ−４４０６）および４．４９．１の培養上清を用いた細胞表面ＰＳＭＡへの結合もまた明らかになった（図２８Ｂ）。精製した抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ ＸＧ−００６および１０．３の段階希釈物を使用した細胞表面ＰＳＭＡへの結合を、図２８Ｃに示す。
（実施例１９：毒素で標識した抗体の細胞傷害性）
ＰＳＭＡ−３Ｔ３、ＬＮＣａＰ、および／またはＣ４−２細胞（ならびに、ＰＳＭＡを発現しない対照細胞株３Ｔ３およびＰＣ３）を、９６ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に２，５００個の細胞／１００μＬ／ウェルでプレートし、これを、５％のＣＯ２の存在下で３７℃にて一晩インキュベートした。ＰＳＭＡ−３Ｔ３（および３Ｔ３）と、ＬＮＣａＰ（およびＣ４−２とＰＣ３）について使用した培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％のＦＢＳ、および１％のペニシリン−ストレプトマイシンを含む、それぞれ、ＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ １６４０であった。培地中の５０ｎｇ（５０μＬ中）のＭａｂ−ＺａｐまたはＨｕｍ−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、それぞれのウェルに添加した。Ｍａｂ−ＺａｐおよびＨｕｍ−Ｚａｐは、植物ザボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の種子に由来するもっとも強力な植物のリボゾーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）であるサポリンに共有結合させられたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体またはヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体である。サポリンは、アポトーシスによる細胞死を誘導する（Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ，Ｇ．，Ｐｅｒｆｅｔｔｉ，Ｖ．，Ｔｏｎｏｎ，Ｌ．，Ｎｏｖｅｌｌａ，Ａ．，Ｌｕｃｏｔｔｉ，Ｃ．，Ｄａｎｏｖａ，Ｍ．，Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｅｒｌｉｎｉ，Ｇ．，Ｃａｚｚｏｌａ，Ｍ．Ｓａｐｏｒｉｎ，ａ ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ，ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｖｉａ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９３，７８９−９４．（１９９６））。Ｍａｂ−Ｚａｐは適切な一次抗体が存在しない条件下では、細胞に結合せず、内在化しない。
マウス３．９、５．４、ｍＪ５９１（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１２１２６）およびヒト００６、４．４０、４．３０４抗ＰＳＭＡ抗体（および対照のＩｇＧ抗体）を、三連で、種々の濃度でプレートに添加し、２００μＬの全容量とした。プレートを、内在化の前のＰＳＭＡ抗体に対するＭａｐ−ＺａｐまたはＨｕｍ−Ｚａｐの結合が最大になるように、少なくとも３０分間氷上で冷却した状態で維持した。プレートを２日間インキュベートし、その後、培地を交換し、さらに２日間インキュベートした。４日間のインキュベーションの後、培地を吸引し、１０％のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（２０μＬ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を含む新しい培地をそれぞれのウェルに添加し、２時間インキュベートした。ＣｙｔｏＦｌｏｕｒプレートリーダーを使用して、５３０ｎｍの励起波長と５９０ｎｍの発光波長で、９６ウェルプレート中の蛍光を測定した。毒素の内在化は、抗ＰＳＭＡ抗体によって媒介された。細胞の死滅を、Ｃ４−２細胞については図２９に、ＰＳＭＡ ３Ｔ３細胞については図３０に示す。
ヒト４．３０４抗ＰＳＭＡ抗体をサポリンと直接結合させ（Ｗｒｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７４０：１７５−１８４，１９９６）、その細胞傷害性を、上記と同様のプロトコールを使用して明らかにした（図３１を参照のこと）。
（実施例２０：免疫反応性）
ＰＳＭＡ−３Ｔ３、ＬＮＣａＰ、およびＣ４−２を、ＰＳＭＡを発現する細胞株として使用し、３Ｔ３を、ＰＳＭＡを発現しない対照細胞株として使用した。細胞を、１０％のヤギ血清を用いて氷上でブロックして、このアッセイにおける非特異的結合を減少させた。
少量（１〜５ｎｇ）の標識したｍＡｂを、１０００万個の細胞の細胞ペレットに添加し、穏やかに攪拌しながら０℃（氷上）でインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離によって回収し、結合していないｍＡｂを含む上清を、新しい細胞ペレットに移し、さらに１時間０℃でインキュベートした。両方の細胞のセットを遠心分離し、冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレット、上清、および洗浄画分について、放射活性をカウントした。免疫反応性は、細胞ペレット、上清、および洗浄画分中の全放射活性で割り算した、細胞ペレット中の放射活性の量と定義した。これらのデータを以下の表３に示す。
Figure 2007509977
 抗体４．４０、４．３０４、およびｍＪ５９１を、二官能性キレート化ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡに結合させ、抗体３．９はＣ−ＤＯＴＡに結合させた。
２２５Ａｃ放射標識抗体（０２６および４．４０）の免疫反応性もまた、１１１Ｉｎで標識した抗体について上記に記載した方法と同様の方法を用いて評価した。２２５Ａｃを、二官能性ＤＯＴＡで、５０℃で３０分間キレート化させた。その後、キレート化した２２５Ａｃを、３５℃で３０分間、抗体０２６および４．４０に結合させた。結合していない２２５ＡｃをＰＤ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって除去した。次いで、放射標識抗体の免疫反応性を決定した。データを以下の表４に示す。これらの抗体の免疫反応性の評価に加えて、標識手順の収量もまた評価し、これらの結果もまた以下の表４に示した。
Figure 2007509977
 （実施例２１：結合エピトープを同定するための競合結合アッセイ）
所定のグループのｍＡｂがＰＳＭＡ上の別のエピトープまたは重複しているエピトープを認識するかどうかを同定するために、競合結合アッセイを、１１１Ｉｎ放射標識抗体を用いて行った。ＰＳＭＡ−３Ｔ３の２×１０５個の細胞（１００μＬ）を９６ウェルマイクロプレートにプレートし、抗体４．４０、４．３０４、およびｍＪ５９１（１００μＬ）を種々の濃度（段階希釈）で添加した。細胞を、０℃で３０分間インキュベートした。２０μＬのＩｎ−１１１放射標識ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ抗体構築物をそれぞれのウェルに添加した。競合結合のための氷上で２時間のインキュベーションの後、細胞を冷ＰＢＳを使用して５回洗浄し、結合した１１１Ｉｎ抗体を含む細胞を、マイクロプレートから試験管に回収し、ガンマカウンターにおいてカウントした。
図３２の詳細な結果は、ｍＪ５９１が１１１Ｉｎ ４．４０のＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞への結合をブロックしたが、１１１Ｉｎ ４．３０４はブロックしなかったことを示している。さらに、４．４０および４．３０４は、互いにブロックしなかった。未修飾の抗体４．３０４およびｍＪ５９１もまた使用して、１１１Ｉｎ放射標識ｍＪ５９１と競合させた。ヒト４．３０４は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３への結合について１１１ｍＪ５９１とは競合しなかった（図３３）。
（実施例２２：Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００を使用した結合親和性）
抗体の反応速度論および親和性を決定するために、粗上清中の抗体、精製された形態の抗体、および二官能性キレートで修飾された形態の抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して分析した。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００は全自動表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくバイオセンサーシステムであり、生体分子の相互作用のため化合物のタグまたは標識を必要としないアッセイ形式により、リアルタイムの反応速度論データを提供するように設計されている。これは、粗上清をスクリーニングするためには理想的である。
ストレプトアビジンでコーティングしたセンサーチップ（ＳＡチップ、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、ビオチニル化抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を捕捉した。センサーチップの表面全体を、馴化溶液（１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＯＨ）の５回の注射によって馴化し、０．００５％のポリソルベート２０を含むＰＢＳ緩衝剤で平衡化した。２０００から３０００共鳴単位（ＲＵ）のビオチニル化抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）をＳＡチップ上に固定し、その後、リジェネレーションバッファー（グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２）を注入した。上清中の抗体を、ＰＢＳ緩衝剤中に２μｇ／ｍＬになるように希釈し、１つの抗ヒトＩｇＧフロー細胞上に捕捉し、一方、イソ型適合対照ヒト抗体（Ｓｉｇｍａ）も同様に、第２のフロー細胞上に捕捉した。ＰＢＳ緩衝剤中の種々の濃度のｒｓＰＳＭＡを、「会合相」の中に３分間、３０μＬ／分で細胞上に流し、その後、「解離相」を１０分間流した。ＳＰＲをモニターし、時間の関数として表示する。１つの濃度のそれぞれの抗体について、チップを再生させ、平衡化させた。１００ｎＭから６．２５ｎＭまでのｒｓＰＳＭＡの種々の濃度の会合相および解離相の中での抗体ＰＲＧＸ１−ＸＧ−００６の分析の例を図３４に示す。結合についての熱力学的および力学的反応速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して計算した。例えば、ｒｓＰＳＭＡに対する上清中のＸＧ−００６抗体の親和性を、４．９２×１０−１０Ｍ、１．３×１０５Ｍ−１ｓ−１のＫａおよび６．４×１０−５ｓ−１のＫｄと決定した。粗上清中の形態、精製された形態、および二官能性キレートで修飾した形態のいくつかのヒトＰＳＭＡ抗体についての選択的なデータを、比較のために表５に列挙する。
１１１Ｉｎ放射標識抗体の結合活性を、ＰＳＭＡを発現する細胞（ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２、ＰＳＭＡ−３Ｔ３、および対照としてのもとの３Ｔ３）を使用して得られた結合データのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定した。実験手順とデータ分析の方法は以前に記載されている（Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３：４４０−４４５（１９９１））。
（表５：１１１Ｉｎ放射標識Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析を使用して決定したＫＤを含む、粗上清中の形態、精製された形態、二官能性キレートで修飾された形態の抗体の力学的反応速度定数）
Figure 2007509977
 ヒト抗体４．４０．１、４．４９．１、０５１、および００６の全体と、マウス抗体３．９の比較を、Ｂｉａｃｏｒｅによって行った。比較用のそれぞれの抗体について、応答を１００ＲＵに較正した。これらの抗体についての時間対応答の差のグラフを図３５に示す。これらの抗体についての結合親和性を、それぞれ、６．１、６．７、５．８、４．８、および１３．７×１０−１０Ｍと決定した。
（実施例２３：生体外および生体内での研究のための細胞株の特徴づけ）
１１１Ｉｎで標識した抗ＰＳＭＡ抗体３．９を使用したＳｃａｔｃｈａｒｄ分析による結果を、図３６に示す。トランスフェクトされたマウス３Ｔ３細胞は、細胞１個あたりＰＳＭＡの＞１００万個のコピーを発現し、ＬＮＣＡＰ細胞（アンドロゲン依存性ヒト前立腺ガン細胞株）は、６４万個のコピーを発現し、一方、Ｃ４−２細胞（アンドロゲン依存性）は、細胞１個あたり２５万個のコピーを発現する。細胞表面ＰＳＭＡについての３．９の親和性は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３については６．４ｎＭ、ＬＮＣＡＰについては４．０ｎＭ、そしてＣ４−２については３．３ｎＭであった（４．６ｎＭがこれらのデータの平均であった）。
ヒト抗ＰＳＭＡ抗体についての粗上清の分析のまとめを以下の表６に示す。
Figure 2007509977
 （実施例２４：放射標識抗体の細胞傷害性）
２２５Ａｃ標識抗ＰＳＭＡ抗体（４．４０および０２６）の生体外での細胞傷害性を、実施例１９で使用した方法と同様の方法論を使用して決定した。前立腺ガン細胞（２×１０４個の細胞／ｍＬの濃度の１００μＬのＣ４−２、ＬＮＣａＰ、およびＰＣ３細胞）を、９６ウェルマイクロプレートの別々のウェルにプレートした。０２６抗体を用いる試験については、Ｃ４−２およびＰＣ３細胞を、９６ウェルマイクロプレートの別々のウェルにプレートした。一晩のインキュベーションの後、細胞を種々の濃度の２２５Ａｃ標識ヒト抗ＰＳＭＡ抗体で４日間処理した。細胞傷害性を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を使用して定量した。
図３７は、２２５Ａｃ標識４．４０抗体を使用した、細胞の生存性ｖｓ．２２５Ａｃ活性濃度のプロットを示す。ＰＳＭＡを発現する細胞（Ｃ４−２およびＬＮＣａＰ）についてのＥＣ５０は＜２ｎＣｉ／ｍＬであった。しかし、ＥＣ５０は、ＰＳＭＡを細胞表面上では発現しないＰＣ３細胞については４２０ｎＣｉ／ｍＬであった。したがって、２２５Ａｃ標識ヒト抗ＰＳＭＡ ４．４０抗体は、ＰＳＭＡを発現する前立腺ガン細胞（Ｃ４−２およびＬＮＣａＰ）を死滅させることにおいて、対照細胞（ＰＣ３）と比較して＞２００倍の選択性を示した。
図３８は、２２５Ａｃ標識０２６抗体を使用した、細胞の生存性ｖｓ．２２５Ａｃ活性濃度のプロットを示す。２２５Ａｃ標識ヒト抗ＰＳＭＡ ０２６抗体は、対照細胞（ＰＣ３）と比較して、ＰＳＭＡを発現する前立腺ガン細胞（Ｃ４−２）を死滅させることにおいて、＞５０倍の選択性を示した。
（実施例２５：対照抗体に対する２２５Ａｃ標識抗体の細胞傷害性）
２２５Ａｃ標識抗ＰＳＭＡ抗体についての生体外での細胞傷害性を、上記の実施例１９および実施例２４で使用した方法と同様の方法論を使用して決定した。ヒトの前立腺ガン細胞（２×１０４個の細胞／ｍＬの濃度の１００μＬのＣ４−２およびＬＮＣａＰ）を、９６ウェルマイクロプレートの別々のウェルにプレートした。一晩のインキュベーションの後、細胞を種々の濃度の２２５Ａｃ標識ヒト抗ＰＳＭＡ ０２６抗体で４日間処理した。細胞傷害性を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を使用して定量した。ヒトＩｇＧ（ＨｕＩｇＧ）を対照として使用した。抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ ０２６「２時間洗浄」の細胞傷害性もまた決定した。２時間洗浄は、細胞を２２５Ａｃ標識抗体とともに２時間インキュベートしたことを意味する。２時間後、培地を除去し、４日間のインキュベーションのための新しい培地を添加した。
図３９は、標識ｍＡｂ ０２６、ｍＡｂ ０２６の２時間洗浄、およびＨｕＩｇＧを使用した、Ｃ４−２細胞とＬＮＣａＰ細胞の両方についての、細胞の生存性ｖｓ．２２５Ａｃ活性濃度のプロットを示す。２２５Ａｃ標識ｍＡｂ ０２６は、＜１ｎＣｉ／ｍＬのＩＣ５０を示した。したがって、２２５Ａｃ標識ヒト抗ＰＳＭＡ ０２６抗体は、対照抗体に対して、前立腺ガン細胞を死滅させることにおいて、＞５０倍の選択性を示した。
（実施例２６：３Ｈチミジンの取り込みによって評価した、２２５Ａｃ標識抗体ｖｓ．対照抗体の細胞傷害性）
９６マイクロプレート中のヒトの前立腺ガン細胞（Ｃ４−２）を、種々の濃度の２２５Ａｃ標識ｍＡｂで４日間処理した。細胞の生存性を３Ｈチミジンの取り込みを用いて評価した（Ｎｉｋｕｌａ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：１６６−１７６，１９９９）。
図４０は、放射標識ｍＡｂ ０２６と対照ｍＡｂ（ＨｕＭ１９５）を使用した、Ｃ４−２細胞についての細胞の生存性ｖｓ．２２５Ａｃ活性濃度のプロットを示す。ＩＣ５０は、対照ｍＡｂ（ＨｕＭ１９５）を用いた場合の１３ｎＣｉ／ｍＬに対して、２２５Ａｃ標識０２６を使用した場合には０．１２ｎＣｉ／ｍＬであった。したがって、放射標識０２６抗体は、対照抗体と比較して、ＰＳＭＡを発現するＣ４−２細胞を死滅させることにおいて＞１００倍の選択性を示した。
（実施例２７：１７７Ｌｕ標識抗体での生体内での放射免疫治療）
国立ガン研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）による無胸腺ヌードマウスに、２×１０６個のＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞を皮下に移植した。移植の７日後に測定できるほどの腫瘍が現れた後、マウスを、１７７Ｌｕで標識した１回の２５０μＣｉ用量のヒト抗ＰＳＭＡ抗体４．４０または４．３０４（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅａｃｔｏｒ）のいずれかを注射することによって処置したか、あるいは対照としての緩衝剤のみを注射した。個々の動物の腫瘍の大きさを電子測径器を使用して測定した。図４１は、それぞれのグループについての平均の腫瘍の大きさの経時的なプロットを示す。腫瘍の増殖は、対照グループと比較して１７７Ｌｕ抗体で処置したグループにおいて実質的に減少していた。
（実施例２８：１７７Ｌｕで標識した抗体を用いた生体内分布の研究）
国立ガン研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）による無胸腺ヌードマウス（およそ６週齢の雄）に、それぞれ、０．２ｍＬ中の４×１０６個のＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞と２．８×１０６個の３Ｔ３細胞を、それぞれの動物の右脇腹と左脇腹に皮下に注射した。ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡで修飾した抗ＰＳＮＡ抗体００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ（対照）を、１７７Ｌｕで標識した。図４２は、放射標識抗体の放射線ＨＰＬＣプロフィールと、さらに、定量対照として行った細胞にもとづく免疫反応性を示す。腫瘍の移植後６日目に１７７Ｌｕで標識した抗体（０．１５ｍＬ中の１０μＣｉおよび１μｇ）を、後眼窩に注射した。動物をランダマイズし、その後、抗体を注射した。マウス（１つの抗体について３０匹、１つの時点について５匹）を、種々の時点（０．１７日目、１、２、４、７、および１２日目）に屠殺した。腫瘍と個々の臓器（ＰＳＭＡ＋腫瘍、ＰＳＭＡ−腫瘍、血液、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨、筋肉、残り）を採取し、重さを測定した。注射溶液から調製した標準物とともに、個々の臓器における活性を、多チャンネルガンマカウンターを使用してカウントした。
この研究の結果は、１７７Ｌｕ標識抗体が、動物モデルにおいては、生体内でＰＳＭＡを発現する腫瘍に特異的に結合することを示している。１グラムの組織あたりの注射した用量の割合（％ＩＤ／ｇ）を計算し、ＰＳＭＡ＋腫瘍およびＰＳＭＡ−腫瘍中の種々の抗体について経時的にプロットした（図４３Ａ）。ＰＳＭＡ特異的腫瘍の標的化（ＰＳＭＡ＋腫瘍による取り込み／ＰＳＭＡ−腫瘍による取り込みの比）を、図４３Ｂに提供する。
図４４は、種々の放射標識抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）を用いて、腫瘍中の活性の割合を経時的に示す（腫瘍が保持している活性ｖｓ．全抗体が保持している活性の割合（％））。データは再び、放射標識抗体がＰＳＭＡを発現する腫瘍を標的化する特異性を示している。図４４Ａは、ＰＳＭＡ＋腫瘍中での活性を経時的に示しており、一方、図４４Ｂは、種々の抗体についてＰＳＭＡ−腫瘍中での活性の割合（％）を経時的に示している。図４５は、経時的にプロットした正常な臓器（血液、肝臓、腎臓、脾臓、肺、骨、心臓、および筋肉）による取り込み（％ＩＤ／ｇ）についてのデータを示す。
（実施例２９：１７７Ｌｕ放射標識抗体の生体内での治療効力）
国立ガン研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）による無胸腺ヌードマウス（およそ６週齢の雄）に、それぞれ、０．２ｍＬ中の４×１０６個のＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞と２．８×１０６個の３Ｔ３細胞を、それぞれの動物の右脇腹と左脇腹に皮下に注射した。１７７Ｌｕ標識ｍＡｂ ０２６（０μＣｉ、ｎ＝５；３００μＣｉおよび１０μｇ、ｎ＝９；ならびに、４００μＣｉおよび１３．５μｇ、ｎ＝５）を、腫瘍の移植後６日目に、マウスに注射した。動物の体重を測定し、腫瘍を経時的に測定した。腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を、以下の式を使用して計算した：長さ×（幅）２／２。腫瘍の大きさが１０００ｍｍ３に達した時点で、マウスを屠殺した。動物の生存性もまた評価し、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを作成した。
この研究の結果は、処置によって腫瘍の大きさが小さくなり、マウスの生存性が増大したことを示している。図４６Ａは、３つの用量レベルのすべてについて、放射標識抗体（１７７Ｌｕ標識ｍＡｂ ０２６）で処置したマウスにおける腫瘍の大きさを示している。３００μＣｉおよび４００μＣｉで処置したマウスは、対照グループ（０μＣｉ）のマウスよりも一貫して小さい腫瘍を有していた。図４６Ｂは、３００μＣｉおよび４００μＣｉで処置したマウスが対照マウスと比較して高い生存性を有していたことを示している。平均の生存性は、処置後の時間を使用して、３００μＣｉで処置したマウスにおいては２．４倍、そして４００μＣｉで処置したマウスにおいては３．５倍に増大した。４００μＣｉでの処置には毒性がないことが明らかになった。さらに、実験（腫瘍の移植後４８日間）の最後に、それぞれの処置グループからの１匹の動物は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３腫瘍を有していないままであったが、大きな３Ｔ３腫瘍を有していた。
（実施例３０：ｒｓＰＳＭＡ二量体および単量体に対する抗体の結合）
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００機器を使用して、ｒｓＰＳＭＡ二量体および単量体の抗ＰＳＭＡ ｍＡｂに対する結合をリアルタイムでモニターした。抗体を、アミンのカップリングについての製造業者の説明書（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）９にしたがって、ＣＭ５センサーチップに対しておよそ１０，０００共鳴単位で固定した。無関係な特異性のイソ型適合抗体の基準面を、バックグラウンド対照として使用した。結合実験を、０．００５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０を含むＰＢＳ緩衝剤中で２５℃で行った。精製されたｒｓＰＳＭＡ二量体（５０ｎＭ）または単量体（１００ｎＭ）を、５μＬ／分の流速で、対照および試験フロー細胞上を通過させた。センサー表面を２０ｎＭのＨＣｌの２回のパルスを用いて再生させた。
図４７および４８は、それぞれ、抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ ００６および０２６が、ｒｓＰＳＭＡ単量体ではなくｒｓＰＳＭＡ二量体に優先的に結合することを示している。しかし、抗ＰＳＭＡ抗体４．４０およびｍＪ５９１は、ｒｓＰＳＭＡ二量体および単量体のいずれに対しても、有意なレベルでの結合を示した（それぞれ、図４９および５０）。この研究は、抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ ００６および０２６がＰＳＭＡ二量体特異的抗体であり、ＰＳＭＡ上の二量体特異的エピトープに結合することを示している。結果もまた、ＰＳＭＡの天然の立体構造がホモ二量体であり、単量体は部分的に変性させられた立体構造を有しているか、あるいは、二量体表面および／または二量体においては利用することができない二量体界面に存在するエピトープを発現することを示している。
（実施例３１：ｒｓＰＳＭＡ二量体調製物での免疫化）
（免疫化）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ミョウバン（１用量につき２５０μｇ、Ｓｉｇｍａ）上または１用量につき５０μｇのアルヒドロゲルをアジュバントとした、５μｇの臨床用ｒｓＰＳＭＡ ｌｏｔ＃４０１９−Ｃ００１（７５％二量体／２５％単量体）または５μｇのｒｓＰＳＭＡ ｂａｔｃｈ＃ＴＤ０４５−００３ ｒｕｎ１／ｐｅａｋ２（１００％単量体）のいずれかを、０日目、７日目、１４日目、および４２日目に皮下注射することによって免疫化した。血清を４回目の免疫化の１０日後に採取し、酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）とフローサイトメトリーによって分析した。
（ＥＬＡ）
ｒｓＰＳＭＡ ｌｏｔ＃４０１９−Ｃ００１またはｒｓＰＳＭＡ ｂａｔｃｈ＃ＴＤ０４５−００３ ｒｕｎ１／ｐｅａｋ２を、９６ウェルマイクロタイタープレートに対して逆らわずに吸着させた。プレート上に残っている結合部位をＰＢＳ／カゼイン／ＴＷｅｅｎ ２０緩衝剤でブロックした。段階希釈したマウスの血清と対照を添加し、結合した抗体を、アルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用して検出した。ＥＩＡを、結合した抗ＰＳＭＡ抗体の量に直接比例する色の変化を生じる基質ｐＮＰＰを用いて発色させた。吸光度を、４０５ｎｍで読み取り、６２０ｎｍで補正した。抗体力価は、０．１のブランクで補正した吸光度を生じるマウスの血清の最高希釈率と定義した。既知の抗ＰＳＭＡ力価を有している免疫マウスの血清または抗ＰＳＭＡ反応性を有さない正常なマウスの血清を、対照として使用した。
（フローサイトメトリー）
ＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞を、０．１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中での１／５０希釈で２００μＬの免疫血清とともに氷上で３０分間インキュベートした。既知の抗ＰＳＭＡ力価を有している免疫マウスの血清、または抗ＰＳＭＡ反応性を有さない正常なマウスの血清を対照として使用した。細胞を、０．１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧとともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、０．１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でフローサイトメトリー分析を行った。
（結果）
ｒｓＰＳＭＡ ｌｏｔ＃４０１９−Ｃ００１で免疫化した５匹のマウスのうちの５匹が、ＥＩＡによって抗ＰＳＭＡ抗体応答を示した。抗体力価は、ｒｓＰＳＭＡ ｌｏｔ＃４０１９−Ｃ００１（７５％二量体／２５％単量体）でコーティングしたアッセイプレート、およびｒｓＰＳＭＡ ｂａｔｃｈ＃ＴＤ０４５−００３ ｒｕｎ１／ｐｅａｋ２（１００％単量体）でコーティングしたアッセイプレートについて、同様であった。グループについての平均の応答は１／６４００であった。
ｒｓＰＳＭＡ ｂａｔｃｈ＃ＴＤ０４５−００３ ｒｕｎ１／ｐｅａｋ２で免疫化した５匹のマウスのうちの４匹が、ＥＩＡによって抗ＰＳＭＡ抗体応答を示した。１匹のマウスはネガティブであった。抗体力価は、ｒｓＰＳＭＡ ｌｏｔ＃４０１９−Ｃ００１（７５％二量体／２５％単量体）でコーティングしたアッセイプレート、およびｒｓＰＳＭＡ ｂａｔｃｈ＃ＴＤ０４５−００３ ｒｕｎ１／ｐｅａｋ２（１００％単量体）でコーティングしたアッセイプレートについて、同様であった。グループについての平均の応答は１／６４００であった。
ＥＩＡ分析の結果を表７に提供する。
フローサイトメトリー分析の結果を図５１に提供する。
（表７：ｒｓＰＳＭＡ ５μｇ／用量および５０μｇ／用量のアルヒドロゲルを用いて４回ワクチン接種したマウスにおける抗ＰＳＭＡ抗体応答の特異性）
Figure 2007509977
 ＥＬＩＳＡによって試験した場合には、単量体で免疫化した動物および二量体で免疫化した動物の両方に由来する血清が、同様のレベルの抗ＰＳＭＡ抗体を示し、このことは、それぞれのタンパク質がミョウバンとともに処方された場合には免疫原性であったことを示している。二量体で免疫化された動物については、平均の終点力価は、ｒｓＰＳＭＡ単量体またな二量体のいずれがコーティング抗原として使用されたかにはかかわらず、１／６，４００（１／３，２００から１／１２，８００の範囲）であった。同様に、単量体で免疫化したマウスは、いずれのアッセイ形式においても１／６，４００の平均終点力価を有していたが、範囲は、単量体（範囲＜１／４００から１／１２，８００）または二量体（範囲＜１／４００から１／６，４００）のいずれをコーティングに使用したかによって変化した。
しかし、細胞をベースとするフローサイトメトリーでは血清間で差が観察された（図５１）。ｒｓＰＳＭＡ（ｌｏｔ ＃４０１９−Ｃ００１）の二量体調製物で免疫化したマウスの血清中の抗ＰＳＭＡ抗体は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞に対する強い結合を示した。１００％単量体のｒｓＰＳＭＡ（ｂａｔｃｈ ＃ＴＤ０４５−００３ ラン（ｒｕｎ）１／ピーク（ｐｅａｋ）２）で免疫化したマウスの血清中の抗ＰＳＭＡ抗体は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞に対する結合を示さなかった。
二量体で免疫化した動物はそれぞれ、ＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞に対して高い力価の抗体を誘発した（中央値平均蛍光強度（ＭＦＩ）＝７４、範囲４１〜８４）が、このような抗体は、単量体で免疫化した動物においては非常に弱いかまたは存在しなかった（中央値ＭＦＩ＝６、範囲５〜１２）。単量体で免疫化した動物について観察された結合のレベルは、天然に存在する動物について観察されたレベルに匹敵した。全ての血清について、３Ｔ３親細胞に対する結合と同様のバックグラウンドレベルが観察された（全ての場合において、中央値ＭＦＩ＝６）。
同一の反応性のパターンを、ヒトの前立腺ガン細胞株を用いて観察した。一貫して、ＰＳＭＡを発現するＣ４−２細胞との高いレベルの反応性が、二量体で免疫化した動物に由来する血清について観察された（中央値ＭＦＩ＝２８．０、範囲２３．１〜２８．８）が、単量体で免疫化された動物（中央値ＭＦＩ＝１２．８、範囲１１．２〜１４．５）または対照動物（中央値ＭＦＩ＝１２．３、範囲８．６〜１６．０）については観察されなかった。ＰＳＭＡ−ネガティブＰＣ−３細胞に対する結合のバックグラウンドレベルを、全ての血清について観察した（全ての場合について、中央値ＭＦＩ＝７）。
したがって、単量体形態のＰＳＭＡタンパク質またはそのフラグメントを使用して、天然に存在するＰＳＭＡを認識する抗体の生産を誘発することができるが、これらの結果は、二量体形態のＰＳＭＡタンパク質を使用して天然に存在するＰＳＭＡに対する免疫応答を誘発することの相対的な効率を示している。さらに、ＥＬＩＳＡではないフローサイトメトリーによって、単量体形態のＰＳＭＡと二量体形態のＰＳＭＡによって誘発された体液性免疫応答の差を明らかにすることができた。ＥＬＩＳＡによってはこのような差をカバーすることができないことは、ｒｓＰＳＭＡがプラスチック上に吸着させられる際に部分的に変性した立体構造をとることを示唆している。
（実施例３２：ｍＡｂ ００６およびｍＡｂ ０２６はヒト前立腺ガン細胞の効率のよいＡＤＣＣを媒介する）
５１Ｃｒで標識したＣ４−２細胞（１×１０４個の細胞／ウェル、標的細胞）を、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂとともに３連で、４℃で１時間インキュベートした。新しいヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）を洗浄した標的細胞に対して、４０：１、２０：１、および１０：１のエフェクター対標的（Ｅ／Ｔ）比で添加し、３７℃で一晩インキュベートした。回収した上清中の５１Ｃｒを、γ−シンチレーションカウンターを使用して測定し、細胞溶解の割合（％）を計算した。ｍＡｂ ００６およびｍＡｂ ０２６は、イソ型適合ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂ対照と比較して、統計学的に有意なＣ４−２細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示した（図５２）。ＰＳＭＡ陰性ヒト前立腺腫瘍細胞（ＰＣ−３）を使用した場合には、この作用は観察されなかった。
（実施例３３：単量体−二量体の平衡）
精製された二量体形態および単量体形態のｒｓＰＳＭＡを、ＰＢＳ＋緩衝剤中での分配サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分離させ、別々の画分に回収した。二量体と単量体が可逆的な平衡状態として存在しているかどうかを評価するために、緩衝剤条件を摂動させ、単量体−二量体比をＳＥＣによって分析した。図５３Ａに示したように、およそ５％の単量体を最初に含む二量体調製物は、２Ｍの塩化ナトリウムを補充したＰＢＳ＋中での室温で７２時間のインキュベーションの際に１００％二量体に転換された（図５３Ａ）。逆に、２ｍＭの金属キレート化剤ＥＤＴＡを添加することにより、二量体はおよそ２日の半減期を有している単量体に変換された（図５３Ａ）。このことは、二量体の安定性が、ＰＳＭＡの活性化部位中の金属イオン（例えば、Ｚｎ２＋）の存在に依存していることを示している。
最初に＞９５％の単量体を含む調製物についても、同様に、高い塩濃度によって平衡は、７２時間以内にほぼ（８１％）二量体へと移動した（図５３Ｂ）。ＥＤＴＡは、単量体のオリゴマー状態に対してはほとんど影響を与えることはなかった。したがって、タンパク質の最初のオリゴマー状態とは無関係に、高い塩濃度によって二量体化が促進されたが、金属キレート化剤は二量体を単量体へと解離させた。
ＰＳＭＡはヒトのトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）と中程度の配列相同性および構造的相同性を共有している。ヒトのトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、遺残触媒ドメインを含むが、酵素活性は欠損している。ＴｆＲは、ジスルフィド結合されたホモ二量体を形成するＩＩ型膜タンパク質として発現され、分子内ジスルフィドは二量体化には必要はない（Ａｌｖａｒｅｚ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８，２２３１−２２４０．０）。ＴｆＲエクトドメインの高分解能結晶構造により、このタンパク質がプロテアーゼ様ドメイン、先端ドメイン、およびヘリックスドメインとして知られている３個の異なるドメインに組織されており、最後のドメインは主に二量体化を担っていることが明らかになった（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６，７７９−７８２）。ＰＳＭＡおよびＴｆＲは、これらのドメイン内で、それぞれ、３０％、３０％、および２４％の配列同一性を共有している。ＰＳＭＡのヘリックス二量体化ドメインは、配列番号１のアミノ酸６０１〜７５０である。
（実施例３４：ｒｓＰＳＭＡ処方物の研究）
（ｒｓＰＳＭＡのｐＨ安定性）
二量体ｒｓＰＳＭＡ（ＰＢＳ＋中２ｍｇ／ｍＬ）を、広範囲の塩基緩衝溶液（２ｍＭのグリシン、２ｍＭのクエン酸、２ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＴｒｉｓ Ｂａｓｅ）中に１０倍に希釈した。これを、０．５ｐＨ単位ずつ、ｐＨ４からｐＨ８．５までをカバーするように調節した。４５℃で４日間のインキュベーションの後、個々のサンプルを分析用ＴＳＫゲル濾過クロマトグラフィー（ｐＨ７．５で実行）に供し、タンパク質の回収率と、ｒｓＰＳＭＡの二量体構造の保存について分析した。結果を表８にまとめる。
Figure 2007509977
 （塩基緩衝剤の評価）
二量体ｒｓＰＳＭＡ（ＰＢＳ＋中２ｍｇ／ｍＬ）を、以下の緩衝溶液中に１０倍に希釈した：
ＰＢＳ＋
２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．０
２０ｍＭのリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５
２０ｍＭのヒスチジン＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０
２０ｍＭのリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０
２０ｍＭの酢酸ナトリウム＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０
２０ｍＭのクエン酸ナトリウム＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０
個々のサンプルを４５℃で３日間または４日間インキュベートし、その後、分析用ＴＳＫゲル濾過クロマトグラフィーによってｒｓＰＳＭＡのタンパク質回収率と二量体構造の保存について分析した。結果を表９にまとめる。
Figure 2007509977
 （賦形剤）
二量体ｒｓＰＳＭＡ（ＰＢＳ＋中２ｍｇ／ｍＬ）を２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌに対して一晩透析した。個々のアミノ酸の作用を評価するために、タンパク質を、賦形剤としての５０ｍＭのグリシン、ヒスチジン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、リジン、アルギニン、スレオニン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸のいずれかを含む、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭのＮａＣｌ中に８倍に希釈した。４５℃で５日間のインキュベーションの後、分析用ＴＳＫゲル濾過クロマトグラフィーによって、タンパク質の回収率とタンパク質の二量体構造の保存について分析した。結果を表１０にまとめる。
Figure 2007509977
 （界面活性剤）
二量体ｒｓＰＳＭＡ（ＰＢＳ＋中２ｍｇ／ｍＬ）を、０．５％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシルマルトシド、コール酸、またはＣＨＡＰＳのいずれかを含むＰＢＳ＋中に１０倍に希釈し、４℃で４日間インキュベートした。それぞれのサンプルを、その後、分析用ＴＳＫゲル濾過クロマトグラフィーによって、タンパク質の回収率とタンパク質の二量体構造の保存について分析した。結果を表１１にまとめる。
Figure 2007509977
 （他の賦形剤）
二量体ｒｓＰＳＭＡ（ＰＢＳ＋中２ｍｇ／ｍＬ）を、１．４Ｍ（３５％の飽和度）硫酸アンモニウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、または１０％のグリセロールのいずれかを含むＰＢＳ＋中に１０倍に希釈し、４℃で４日間インキュベートした。それぞれのサンプルを、その後、分析用ＴＳＫゲル濾過クロマトグラフィーによって、タンパク質の回収率とタンパク質の二量体構造の保存について分析した。結果を表１２にまとめる。
Figure 2007509977
 （単量体の二量体への転換）
単量体ｒｓＰＳＭＡが二量体へと戻る可能性を評価するために、単量体ｒｓＰＳＭＡ（ＰＢＳ＋中２ｍｇ／ｍＬ）を、１．４Ｍ（３５％の飽和度）の硫酸アンモニウム、２Ｍの
ＮＡＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＥＤＴＡ、または１０％のグリセロールのいずれかを含むＰＢＳ＋中に１０倍に希釈し、４℃で４日間インキュベートした。それぞれのサンプルを、その後、分析用ＴＳＫゲル濾過クロマトグラフィーによって、タンパク質の回収率とタンパク質の二量体構造の形成について分析した。結果を表１３にまとめる。
Figure 2007509977
 本発明は、説明の目的のために詳細に記載されているが、このような詳細はその目的のためだけのものであり、複数のバリエーションが、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって行われ得ることが理解される。
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図１は、フローサイトメトリーによって決定したｍＡｂのＰＳＭＡ反応性を示す。抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ（３．７、３．９、３．１１、３．１２、５．４、および１０．３）を、３Ｔ３親細胞（黒線で示した）またはＰＳＭＡを細胞表面で発現するように操作した３Ｔ３細胞（３Ｔ３−ＰＳＭＡ；灰色の線）のいずれかとともにインキュベートした。 図２は、ｍＡｂによるＰＳＭＡの免疫沈降のデジタル画像を示す。３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞または３Ｔ３親細胞に由来する溶解物を各ｍＡｂとともにインキュベートし、その後、プロテインＡ／Ｇアガロースビーズを使用して沈殿させた。洗浄後、タンパク質をポリアクリルアミドゲル上で分解し、ニトロセルロース膜にブロットし、ＭＡＢ５４４抗−ＰＳＭＡ ｍＡｂを使用して視覚化した。 図３は、ＰＳＭＡ立体構造を認識するいくつかのＰＳＭＡ抗体による、変性させていないＰＳＭＡの認識を示す。 図４は、ウェスタンブロットのデジタル画像であり、これは、２つのＰＳＭＡ抗体による変性させられたＰＳＭＡの認識を示し、ＰＳＭＡ立体構造を認識する抗体が変性しているＰＳＭＡは認識しないことを示している。 図５は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって３Ｔ３細胞（３Ｔ３ ＰＳＭＡ）またはＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ ＰＳＭＡ）から精製した、組み換え体である可溶性ＰＳＭＡ（ｒｓＰＳＭＡ）、および全長のＰＳＭＡの分析を示すポリアクリルアミドゲルのデジタル画像である。 図６は、ＰＳＭＡの二量体構造の決定結果を提供する。図６Ａは、精製された組み換え体である可溶性ＰＳＭＡ（精製されたｒｓＰＳＭＡ）、および３Ｔ３細胞（３Ｔ３ ＰＳＭＡ）またはＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ ＰＳＭＡ）から抽出した全長のＰＳＭＡの、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ分析を示すポリアクリルアミドゲルのデジタル画像である。 図６Ｂは、中性のＰＢＳ緩衝剤中の精製されたｒｓＰＳＭＡの分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す。矢印は、タンパク質標準物の保持時間を示す。ｒｓＰＳＭＡについての２６０ｋＤａの保持時間は、ホモ二量体の保持時間と一致する。 図７は、単量体ｒｓＰＳＭＡ（ＰＳＭＡＥＣＴＯとも呼ばれる）ではなく、二量体に酵素活性があることを示す。二量体ＰＳＭＡおよび単量体ＰＳＭＡを、葉酸加水分解酵素活性について（図７Ａ）、そしてＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性について（図７Ｂ）試験した。ＰＳＭＡ単量体について観察したバックグラウンドの活性は、調製物中に存在する二量体の残りの量（およそ４％）と一致する。 図７は、単量体ｒｓＰＳＭＡ（ＰＳＭＡＥＣＴＯとも呼ばれる）ではなく、二量体に酵素活性があることを示す。二量体ＰＳＭＡおよび単量体ＰＳＭＡを、葉酸加水分解酵素活性について（図７Ａ）、そしてＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性について（図７Ｂ）試験した。ＰＳＭＡ単量体について観察したバックグラウンドの活性は、調製物中に存在する二量体の残りの量（およそ４％）と一致する。 図８は、４種の抗体（ｍＡｂ ３．９、ｍＡｂ ５．４、ｍＡｂ ７．３、およびｍＡｂ Ｊ５９１）の葉酸加水分解酵素の酵素活性に対する効果を、０．０００２μｇのｒｓＰＳＭＡ ＃７中に存在する葉酸加水分解酵素によるメトトレキセート ジ−γグルタミン酸からのグルタミン酸の切断速度を測定することにより、示す。 図９は、４種の抗体（ｍＡｂ ３．９、ｍＡｂ ５．４、ｍＡｂ ７．３、およびｍＡｂ Ｊ５９１）の葉酸加水分解酵素の酵素活性に対する効果を、０．０００２μｇのｒｓＰＳＭＡ ＃８中に存在する葉酸加水分解酵素によるメトトレキセート ジ−γグルタミン酸からのグルタミン酸の切断速度を測定することにより、示す。 図１０は、４種の抗体（ｍＡｂ ３．９、ｍＡｂ ５．４、ｍＡｂ ７．３、およびｍＡｂ Ｊ５９１）の葉酸加水分解酵素の酵素活性に対する効果を、Ｃ４−２細胞の溶解物中に存在する葉酸加水分解酵素によるメトトレキセート ジ−γグルタミン酸からのグルタミン酸の切断速度を測定することにより、示す。 図１１は、４種の抗体（ヒトｍＡｂ ００６、０２６、４．４０．２、さらには、マウスｍＡｂ ５．４）のＰＳＭＡ葉酸加水分解酵素活性に対する影響を示す。 図１１は、４種の抗体（ヒトｍＡｂ ００６、０２６、４．４０．２、さらには、マウスｍＡｂ ５．４）のＰＳＭＡ葉酸加水分解酵素活性に対する影響を示す。 図１１は、４種の抗体（ヒトｍＡｂ ００６、０２６、４．４０．２、さらには、マウスｍＡｂ ５．４）のＰＳＭＡ葉酸加水分解酵素活性に対する影響を示す。 図１１は、４種の抗体（ヒトｍＡｂ ００６、０２６、４．４０．２、さらには、マウスｍＡｂ ５．４）のＰＳＭＡ葉酸加水分解酵素活性に対する影響を示す。 図１２は、Ｃ４−２細胞とともにインキュベートした、１１１Ｉｎで標識されたｍＡｂ ０２６の迅速であり効率的な内在化を示す。 図１２は、Ｃ４−２細胞とともにインキュベートした、１１１Ｉｎで標識されたｍＡｂ ０２６の迅速であり効率的な内在化を示す。 図１３は、ｐｃＤＮＡへのＩｇＧ１抗体のクローニングのためのクローニングプロトコールを示す。 図１４は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６の重鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図１５は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６の重鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図１６は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１の重鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図１７は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９の重鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図１８は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７の重鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図１９は、抗体ＰＳＭＡ １０．３の重鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図２０は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−００６の軽鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図２１は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６の軽鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図２２は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０５１の軽鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図２３は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０６９の軽鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図２４は、抗体ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０７７の軽鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図２５は、抗体ＰＳＭＡ １０．３の軽鎖をコードする核酸分子のプラスミドマップを提供する。 図２６は、ＬＮＣａＰ標的細胞に対する２２５Ａｃ−３．９の細胞傷害性を示す。 図２７は、３Ｔ３親細胞（黒い柱状グラフ）またはヒトＰＳＭＡを細胞表面で発現するように操作した３Ｔ３細胞（赤い柱状グラフ）のいずれかとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体ＸＧ−００６、ＸＧ−０５１、４．４０．１、４．４９．１、４．２９２．１、および４．３０４．１の反応性を示す。 図２７は、３Ｔ３親細胞（黒い柱状グラフ）またはヒトＰＳＭＡを細胞表面で発現するように操作した３Ｔ３細胞（赤い柱状グラフ）のいずれかとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体ＸＧ−００６、ＸＧ−０５１、４．４０．１、４．４９．１、４．２９２．１、および４．３０４．１の反応性を示す。 図２７は、３Ｔ３親細胞（黒い柱状グラフ）またはヒトＰＳＭＡを細胞表面で発現するように操作した３Ｔ３細胞（赤い柱状グラフ）のいずれかとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体ＸＧ−００６、ＸＧ−０５１、４．４０．１、４．４９．１、４．２９２．１、および４．３０４．１の反応性を示す。 図２７は、３Ｔ３親細胞（黒い柱状グラフ）またはヒトＰＳＭＡを細胞表面で発現するように操作した３Ｔ３細胞（赤い柱状グラフ）のいずれかとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体ＸＧ−００６、ＸＧ−０５１、４．４０．１、４．４９．１、４．２９２．１、および４．３０４．１の反応性を示す。 図２７は、３Ｔ３親細胞（黒い柱状グラフ）またはヒトＰＳＭＡを細胞表面で発現するように操作した３Ｔ３細胞（赤い柱状グラフ）のいずれかとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体ＸＧ−００６、ＸＧ−０５１、４．４０．１、４．４９．１、４．２９２．１、および４．３０４．１の反応性を示す。 図２７は、３Ｔ３親細胞（黒い柱状グラフ）またはヒトＰＳＭＡを細胞表面で発現するように操作した３Ｔ３細胞（赤い柱状グラフ）のいずれかとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体ＸＧ−００６、ＸＧ−０５１、４．４０．１、４．４９．１、４．２９２．１、および４．３０４．１の反応性を示す。 図２８は、抗ＰＳＭＡ Ａｂの結合を示す。図２８Ａは、抗ＰＳＭＡ ｍＡｂが３Ｔ３−ＰＳＭＡ細胞に結合し、３Ｔ３細胞には結合しないことを示す。少なくとも１０回の決定による１つの代表的な実験を示す。 図２８Ｂは、抗ＰＳＭＡ ｍＡｂを含む培養上清の段階希釈物を使用して細胞表面ＰＳＭＡに対する結合が生じたこをを示す。５回の実験による１つの代表的な実験を示す。 図２８Ｃは、精製された抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ、ＸＧ−００６、および１０．３の段階希釈物を使用して、細胞表面ＰＳＭＡに対する結合を示す。１つの代表的な実験を示す。 図２９は、Ｃ４−２前立腺ガン細胞に対するマウス抗ＰＳＭＡ抗体の免疫毒素複合体細胞傷害性を示す。対照抗体としてのＳＪ２５Ｃ−１は、マウスの抗ＣＤ１９ ＩｇＧである。５．４、３．９、およびｍＪ５９１抗体についてのＬＤ ５０ｓ（Ｍ）は、それぞれ、２．２７×１０−１１、２．２９×１０−１１、および８．８２×１０−１１、であった。 図２９は、Ｃ４−２前立腺ガン細胞に対するマウス抗ＰＳＭＡ抗体の免疫毒素複合体細胞傷害性を示す。対照抗体としてのＳＪ２５Ｃ−１は、マウスの抗ＣＤ１９ ＩｇＧである。５．４、３．９、およびｍＪ５９１抗体についてのＬＤ ５０ｓ（Ｍ）は、それぞれ、２．２７×１０−１１、２．２９×１０−１１、および８．８２×１０−１１、であった。 図２９は、Ｃ４−２前立腺ガン細胞に対するマウス抗ＰＳＭＡ抗体の免疫毒素複合体細胞傷害性を示す。対照抗体としてのＳＪ２５Ｃ−１は、マウスの抗ＣＤ１９ ＩｇＧである。５．４、３．９、およびｍＪ５９１抗体についてのＬＤ ５０ｓ（Ｍ）は、それぞれ、２．２７×１０−１１、２．２９×１０−１１、および８．８２×１０−１１、であった。 図３０は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞に対するマウス抗ＰＳＭＡ抗体の免疫毒素複合体細胞傷害性を示す。対照抗体としてのＳＪ２５Ｃ−１は、マウスの抗ＣＤ１９ ＩｇＧである。５．４、３．９、およびｍＪ５９１抗体についてのＬＤ ５０ｓ（Ｍ）は、それぞれ、１．６４×１０−１１、１．９６×１０−１１、および８．９０×１０−１１、であった。 図３０は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞に対するマウス抗ＰＳＭＡ抗体の免疫毒素複合体細胞傷害性を示す。対照抗体としてのＳＪ２５Ｃ−１は、マウスの抗ＣＤ１９ ＩｇＧである。５．４、３．９、およびｍＪ５９１抗体についてのＬＤ ５０ｓ（Ｍ）は、それぞれ、１．６４×１０−１１、１．９６×１０−１１、および８．９０×１０−１１、であった。 図３０は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞に対するマウス抗ＰＳＭＡ抗体の免疫毒素複合体細胞傷害性を示す。対照抗体としてのＳＪ２５Ｃ−１は、マウスの抗ＣＤ１９ ＩｇＧである。５．４、３．９、およびｍＪ５９１抗体についてのＬＤ ５０ｓ（Ｍ）は、それぞれ、１．６４×１０−１１、１．９６×１０−１１、および８．９０×１０−１１、であった。 図３１は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３に対するサポリンと直接結合させたヒト４．３０４抗ＰＳＭＡ抗体の細胞傷害性を提供する。ＬＤ５０は、サポリンと直接結合させた４．３０４抗ＰＳＭＡ抗体について１．４８×１０−１１Ｍであった。 図３２は、Ｉｎ−１１１で放射標識した４．４０および４．３０４抗ＰＳＭＡ抗体と競合させるために使用した、未修飾の４．３０４、４．４０、ｍＪ５９１抗ＰＳＭＡ抗体の競合アッセイの結果を示す。 図３３は、Ｉｎ−１１１で放射標識したｍＪ５９１抗ＰＳＭＡ抗体と競合させるために使用した、未修飾の４．３０４、ｍＪ５９１抗ＰＳＭＡ抗体の競合アッセイの結果を示す。 図３４は、１００ｎＭから６．２５ｎＭまでの種々の濃度のｒｓＰＳＭＡでの会合状態、および解離状態の抗体ＰＲＧＸ１−ＸＧ−００６の分析を示す。 図３５は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析を使用して行った、全長のヒト抗ＰＳＭＡ抗体４．４０．１、４．４９．１、０５１、および００６と、マウス抗ＰＳＭＡ抗体３．９の比較の結果を示す。 図３６は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３、ＬＮＣａＰ、およびＣ４−２細胞株の、Ｉｎ−１１１標識された抗ＰＳＭＡ抗体３．９を使用したスキャッチャード分析による結果を提供する。 図３７は、前立腺ガン細胞に対するＡｃ−２２５で標識したヒト抗ＰＳＭＡ抗体４．４０の生体外での細胞傷害性を示す。 図３８は、２２５Ａｃで標識したｍＡｂ ０２６で処理した、ＰＳＭＡを発現する細胞（Ｃ４−２）対ＰＳＭＡを発現しない細胞（ＰＣ−３）の特異的な死滅を示す。 図３９は、ヒトの前立腺ガン細胞株（Ｃ４−２およびＬＮＣａＰ）に対する２２５Ａｃで標識したｍＡｂ ０２６の生体外での細胞傷害性を示す。 図３９は、ヒトの前立腺ガン細胞株（Ｃ４−２およびＬＮＣａＰ）に対する２２５Ａｃで標識したｍＡｂ ０２６の生体外での細胞傷害性を示す。 図４０は、３Ｈチミジンの取り込みによって評価した、ヒトの前立腺ガン細胞株Ｃ４−２に対する２２５Ａｃで標識したｍＡｂ ０２６の生体外での細胞傷害性を示す。 図４１は、Ｌｕ−１７７で標識したヒト抗ＰＳＭＡ抗体での生体内での放射線免疫療法の結果を示す。 図４２は、１７７Ｌｕで標識された抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ（対照））の放射線−ＨＰＬＣプロフィールと細胞をベースとする免疫反応性を提供する。 図４２は、１７７Ｌｕで標識された抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ（対照））の放射線−ＨＰＬＣプロフィールと細胞をベースとする免疫反応性を提供する。 図４３は、生体内でのＰＳＭＡ陽性腫瘍に対する１７７Ｌｕ標識抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＩｇＧ（対照））の特異的結合を示す。 図４３は、生体内でのＰＳＭＡ陽性腫瘍に対する１７７Ｌｕ標識抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＩｇＧ（対照））の特異的結合を示す。 図４４は、腫瘍中での活性の割合（％）によって評価した、ＰＳＭＡ＋腫瘍対ＰＳＭＡ−腫瘍における放射標識された抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）の優先的な保持を示す。 図４４は、腫瘍中での活性の割合（％）によって評価した、ＰＳＭＡ＋腫瘍対ＰＳＭＡ−腫瘍における放射標識された抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）の優先的な保持を示す。 図４５は、抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）についての正常な臓器（血液、肝臓、脾臓、肺、骨、心臓、および筋肉）による取り込み（組織１グラムあたりの注射用量、％ＩＤ／ｇ）についてのデータを提供する。 図４５は、抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）についての正常な臓器（血液、肝臓、脾臓、肺、骨、心臓、および筋肉）による取り込み（組織１グラムあたりの注射用量、％ＩＤ／ｇ）についてのデータを提供する。 図４５は、抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）についての正常な臓器（血液、肝臓、脾臓、肺、骨、心臓、および筋肉）による取り込み（組織１グラムあたりの注射用量、％ＩＤ／ｇ）についてのデータを提供する。 図４５は、抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）についての正常な臓器（血液、肝臓、脾臓、肺、骨、心臓、および筋肉）による取り込み（組織１グラムあたりの注射用量、％ＩＤ／ｇ）についてのデータを提供する。 図４５は、抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）についての正常な臓器（血液、肝臓、脾臓、肺、骨、心臓、および筋肉）による取り込み（組織１グラムあたりの注射用量、％ＩＤ／ｇ）についてのデータを提供する。 図４５は、抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）についての正常な臓器（血液、肝臓、脾臓、肺、骨、心臓、および筋肉）による取り込み（組織１グラムあたりの注射用量、％ＩＤ／ｇ）についてのデータを提供する。 図４５は、抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）についての正常な臓器（血液、肝臓、脾臓、肺、骨、心臓、および筋肉）による取り込み（組織１グラムあたりの注射用量、％ＩＤ／ｇ）についてのデータを提供する。 図４５は、抗体（００６、０２６、ｍＪ５９１、およびＨｕＩｇＧ）についての正常な臓器（血液、肝臓、脾臓、肺、骨、心臓、および筋肉）による取り込み（組織１グラムあたりの注射用量、％ＩＤ／ｇ）についてのデータを提供する。 図４６は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３および３Ｔ３腫瘍を有しているマウスにおける１７７Ｌｕで標識されたｍＡｂ ０２６の治療効力を示す。 図４６は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３および３Ｔ３腫瘍を有しているマウスにおける１７７Ｌｕで標識されたｍＡｂ ０２６の治療効力を示す。 図４７は、ｒｓＰＳＭＡ二量体に対するｍＡｂ ００６の優先的な結合を示す。 図４８は、ｒｓＰＳＭＡ二量体に対するｍＡｂ ０２６の優先的な結合を示す。 図４９は、ｒｓＰＳＭＡ二量体および単量体に対するｍＡｂ ４．４０の結合を示す。 図５０は、ｒｓＰＳＭＡ二量体および単量体に対するｍＡｂ ｍＪ５９１の結合を示す。 図５１は、ＰＳＭＡ−３Ｔ３細胞に対する抗ＰＳＭＡ抗血清の結合についてのフローサイトメトリーのデータを示す一連のグラフである。ｒｓＰＳＭＡ二量体調製物（ＡＢＩＭ１５１、ＡＢＩＭ１５２、ＡＢＩＭ１５３、ＡＢＩＭ１５４、およびＡＢＩＭ１５５）で免疫化したマウスに由来する抗血清は、ＰＳＭＡを発現する細胞に対して強い結合を示した。ｒｓＰＳＭＡ単量体調製物（ＡＢＩＭ１５６、ＡＢＩＭ１５７、ＡＢＩＭ１５８、ＡＢＩＭ１５９、およびＡＢＩＭ１６０）で免疫化したマウスに由来する抗血清は、ＰＳＭＡを発現する細胞に対してほとんど結合しないこと、または結合しないことが示された。 図５２は、ｍＡｂ ００６およびｍＡｂ ０２６によって媒介されるヒトの前立腺ガン細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す結果を提供する。 図５３は、ＰＳＭＡ単量体−二量体平衡分析の結果を示す。精製された二量体（図５３Ａ）ｒｓＰＳＭＡおよび単量体（図５３Ｂ）ｒｓＰＳＭＡを、種々の緩衝剤条件に供し、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって大きさについて分析した。単量体（Ｍ）と二量体（Ｄ）の割合（％）を示す。単量体と二量体は、最初は、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ＋緩衝剤中に含まれていた。緩衝剤の条件を示したように調節し、タンパク質を、示した時間の間室温でインキュベートし、その後、ＳＥＣ分析した。 図５３は、ＰＳＭＡ単量体−二量体平衡分析の結果を示す。精製された二量体（図５３Ａ）ｒｓＰＳＭＡおよび単量体（図５３Ｂ）ｒｓＰＳＭＡを、種々の緩衝剤条件に供し、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって大きさについて分析した。単量体（Ｍ）と二量体（Ｄ）の割合（％）を示す。単量体と二量体は、最初は、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ＋緩衝剤中に含まれていた。緩衝剤の条件を示したように調節し、タンパク質を、示した時間の間室温でインキュベートし、その後、ＳＥＣ分析した。

Claims (224)

  1. 単離されたＰＳＭＡ タンパク質を含む組成物であって、該単離されたＰＳＭＡタンパク質の少なくとも５％が単離されたＰＳＭＡタンパク質多量体である、組成物。
  2. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質多量体が、単離されたＰＳＭＡタンパク質二量体である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質二量体が、全長のＰＳＭＡ（配列番号１）のフラグメントを含む、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質二量体が、ＰＳＭＡの細胞外部分（配列番号１のアミノ酸４４〜７５０）のフラグメントを含む、請求項２に記載の組成物。
  5. 前記フラグメントが、配列番号１のアミノ酸５８〜７５０を含む、請求項３に記載の組成物。
  6. 前記フラグメントが、配列番号１のアミノ酸４４〜７５０を含む、請求項３に記載の組成物。
  7. 前記フラグメントが、配列番号１のアミノ酸６０１〜７５０を含む、請求項３に記載の組成物。
  8. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質の少なくとも２５％が、単離されたＰＳＭＡタンパク質二量体の形態である、請求項２に記載の組成物。
  9. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質の少なくとも５０％が、単離されたＰＳＭＡタンパク質二量体の形態である、請求項２に記載の組成物。
  10. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質の少なくとも７５％が、単離されたＰＳＭＡタンパク質二量体の形態である、請求項２に記載の組成物。
  11. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質の少なくとも９０％が、単離されたＰＳＭＡタンパク質二量体の形態である、請求項２に記載の組成物。
  12. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質の少なくとも９５％が、単離されたＰＳＭＡタンパク質二量体の形態である、請求項２に記載の組成物。
  13. 前記組成物が、ＰＳＭＡタンパク質に対して少なくとも０．２５モル等量の金属イオンをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記組成物が、ＰＳＭＡタンパク質に対して少なくとも０．５モル等量の金属イオンをさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記組成物が、ＰＳＭＡタンパク質に対して少なくとも１モル等量の金属イオンを含む、請求項１３に記載の組成物。
  16. 前記組成物が、ＰＳＭＡタンパク質に対してモル過剰の金属イオンを含む、請求項１３に記載の組成物。
  17. 前記組成物が、液体形態または凍結乾燥形態である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記アジュバントが、ミョウバン；モノホスホリルリピドＡ；サポニン；ＱＳ−７；ＱＳ−１７；ＱＳ−１８；ＱＳ−２１；サポニン画分；サポニンベースのアジュバント；ＳａｐｏｎＩｍｍｕｎｅＴＭ；ＰｏｌｙｓａｃｃＩｍｍｕｎｅＴＭ；ＳｙｎｔｈＩｍｍｕｎｅＴＭ；免疫賦活オリゴヌクレオチド；不完全フロイントアジュバント；完全フロイントアジュバント；モンタナイド；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ７２０；ビタミンＥ；生分解性油から調製された水中油エマルジョン；Ｑｕｉｌ Ａ；免疫賦活複合体として公知のＱｕｉｌ Ａとコレステロールとのミセル混合物（ＩＳＣＯＭＳ）；ＭＰＬおよびマイコバクテリア細胞壁骨格の組み合わせ；ＥＮＨＡＮＺＹＮＴＭ；ＲＣ−５２９；ＲＣ−５５２；ＣＲＬ−１００５、Ｌ−１２１、α−ガラクトシルセラミド；ポリラクチド−コグリコリド（ＰＬＧ）から構成される生分解性粒子の組成物；酸化アルミニウムまたは酸化鉄のビーズの組成物、またははこれらの組み合わせである、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記アジュバントが、ミョウバンまたはサポニンベースのアジュバントである、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記サポニンベースのアジュバントが、ＱＳ−２１である、請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記組成物が、ガン治療剤をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記ガン治療剤が、ドセタキセルである、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記組成物が、プレドニソンをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記組成物が、サイトカインをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記組成物が、滅菌されている、請求項１〜１８および２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記組成物が、キレート化剤を含まない、請求項１〜１８および２５のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記組成物が、少なくとも１種の緩衝剤をさらに含む、請求項１〜１８および２５のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 前記少なくとも１種の緩衝剤が、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム、リン酸、アスコルビン酸ナトリウム、酒石酸、マレイン酸、グリシン、乳酸ナトリウム、乳酸、アスコルビン酸、イミダゾール、重炭酸ナトリウム、炭酸、コハク酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、またはそれらの組み合わせである、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記組成物が、遊離のアミノ酸をさらに含み、該遊離のアミノ酸が天然に存在するものか、または天然に存在しないものである、請求項１〜１８および２５のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 前記天然に存在する遊離のアミノ酸または天然に存在しない遊離のアミノ酸が、非酸性の遊離のアミノ酸である、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記非酸性の遊離のアミノ酸が、グリシン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、アルギニン、またはそれらの組み合わせである、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記組成物が、界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１８および２５のいずれか１項に記載の組成物。
  34. 前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシルマルトシド、コール酸、ＣＨＡＰＳ、またはそれらの組み合わせである、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記組成物が、抗凍結剤、抗酸化剤、保存剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜１８および２５のいずれか１項に記載の組成物。
  36. 前記抗凍結剤が、糖、ポリオール、アミノ酸、ポリマー、無機塩、有機塩、トリメチルアミンＮ−オキサイド、サルコシン、ベタイン、γ−アミノ酪酸、オクタピン、アラノピン、ストロンビン、ジメチルスルホキシド、またはエタノールである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記糖が、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、またはマルトースである、請求項３６に記載の組成物。
  38. 前記ポリオールが、イノシトール、エチレングリコール、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、マンニトール、または２−メチル−２，４−ペンタン−ジオールである、請求項３６に記載の組成物。
  39. 前記アミノ酸が、グルタミン酸Ｎａ、プロリン、α−アラニン、β−アラニン、グリシン、リジン−ＨＣｌ、または４−ヒドロキシプロリンである、請求項３６に記載の組成物。
  40. 前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、またはポリビニルピロリドンである、請求項３６に記載の組成物。
  41. 前記無機塩が、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、またはフッ化ナトリウムである、請求項３６に記載の組成物。
  42. 前記有機塩が、酢酸ナトリウム、ナトリウムポリエチレン、カプリル酸ナトリウム、プロピオン酸塩、乳酸塩、またはコハク酸塩である、請求項３６に記載の組成物。
  43. 前記抗酸化剤が、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アルキルガレート、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、トコフェロール、トコフェロール誘導体、モノチオグリセロール、または亜硫酸ナトリウムである、請求項３５に記載の組成物。
  44. 前記アスコルビン酸誘導体が、アスコルビン酸パルミテート、アスコルビン酸ステアレート、アスコルビン酸ナトリウム、またはアスコルビン酸カルシウムである、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記トコフェロール誘導体が、ｄ−αトコフェロール、ｄ−α酢酸トコフェロール、ｄｌ−α酢酸トコフェロール、ｄ−αコハク酸トコフェロール、βトコフェロール、δトコフェロール、γトコフェロール、またはｄ−α−トコフェロールポリオキシエチレングリコール１０００スクシネートである、請求項４３に記載の組成物。
  46. 前記保存剤が、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、チメロサール、ベンジルアルコール、またはフェノールである、請求項３５に記載の組成物。
  47. 単離された多量体ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物であって、該組成物は、３５％未満の単量体ＰＳＭＡタンパク質を含む、組成物。
  48. 前記単離された多量体ＰＳＭＡタンパク質が、単離された二量体ＰＳＭＡタンパク質である、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記組成物が、２０％未満の単量体ＰＳＭＡタンパク質を含む、請求項４７または４８に記載の組成物。
  50. 前記組成物が、１５％未満の単量体ＰＳＭＡタンパク質を含む、請求項４９に記載の組成物。
  51. 前記組成物が、５％未満の単量体ＰＳＭＡタンパク質を含む、請求項５０に記載の組成物。
  52. 溶液においてＰＳＭＡタンパク質を含む組成物であって、該溶液は、ＰＳＭＡタンパク質の多量体会合を促進または保存する、組成物。
  53. ＰＳＭＡタンパク質の多量体会合を促進または保存する前記溶液が、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液である、請求項５２に記載の組成物。
  54. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する前記溶液が、４〜８までの範囲のｐＨを有する、請求項５２または５３に記載の組成物。
  55. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する前記溶液が、５〜７までの範囲のｐＨを有する、請求項５４に記載の組成物。
  56. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する前記溶液が、５．５〜７までの範囲のｐＨを有する、請求項５５に記載の組成物。
  57. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する前記溶液が、６のｐＨを有する、請求項５６に記載の組成物。
  58. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する前記溶液が、塩を含む、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の組成物。
  59. 前記塩の陽イオン性成分が、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、またはそれらの組み合わせであり、そして該塩の陰イオン性成分が塩化物、硫酸塩、酢酸塩、またはそれらの組み合わせである、請求項５８に記載の組成物。
  60. 前記塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫酸アンモニウムである、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記塩が、５０ｍＭ〜２Ｍの範囲の濃度で存在する、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記塩が、１００ｍＭ〜３００ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項６１に記載の組成物。
  63. 前記塩が、１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項６２に記載の組成物。
  64. 前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項６１に記載の組成物。
  65. 前記組成物が、生理学的に受容可能である、請求項６１に記載の組成物。
  66. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する前記溶液が、金属イオンを含む、請求項５２〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
  67. 前記金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせである、請求項６６に記載の組成物。
  68. 前記金属イオンが、亜鉛イオンおよびカルシウムイオンである、請求項６７に記載の組成物。
  69. 前記亜鉛イオンおよびカルシウムイオンが、０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項６８に記載の組成物。
  70. 前記亜鉛イオンが、前記カルシウムイオンの濃度よりも低い濃度で存在する、請求項６８に記載の組成物。
  71. 前記亜鉛イオンが０．１ｍＭの濃度で存在し、そして前記カルシウムイオンが１ｍＭの濃度で存在する、請求項７０に記載の組成物。
  72. 前記金属イオンが、マグネシウムイオンである、請求項６７に記載の組成物。
  73. 前記マグネシウムイオンが、０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項７２に記載の組成物。
  74. 前記マグネシウムイオンが、０．５ｍＭの濃度で存在する、請求項７３に記載の組成物。
  75. 前記金属イオンが、マグネシウムイオンおよびカルシウムイオンである、請求項６７に記載の組成物。
  76. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する前記溶液が、キレート化剤を含まない、請求項５２〜７５のいずれか１項に記載の組成物。
  77. 前記組成物が、少なくとも１種の緩衝剤をさらに含む、請求項５２〜７５のいずれか１項に記載の組成物。
  78. 前記少なくとも１種の緩衝剤が、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム、リン酸、アスコルビン酸ナトリウム、酒石酸、マレイン酸、グリシン、乳酸ナトリウム、乳酸、アスコルビン酸、イミダゾール、重炭酸ナトリウム、炭酸、コハク酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、またはそれらの組み合わせである、請求項７７に記載の組成物。
  79. 前記組成物が、遊離のアミノ酸をさらに含み、該遊離のアミノ酸が、天然に存在するもの、または天然に存在しないものである、請求項５２〜７４に記載の組成物。
  80. 前記天然に存在する遊離のアミノ酸、または天然に存在しない遊離のアミノ酸が、非酸性の遊離のアミノ酸である、請求項７９に記載の組成物。
  81. 前記非酸性の遊離のアミノ酸が、グリシン、プロリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、アルギニン、またはそれらの組み合わせである、請求項８０に記載の組成物。
  82. 前記組成物が、界面活性剤をさらに含む、請求項５２〜７４に記載の組成物。
  83. 前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシルマルトシド、コール酸、ＣＨＡＰＳ、またはそれらの組み合わせである、請求項８２に記載の組成物。
  84. 前記組成物が、抗凍結剤、抗酸化剤、保存剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項５２〜７４に記載の組成物。
  85. 前記抗凍結剤が、糖、ポリオール、アミノ酸、ポリマー、無機塩、有機塩、トリメチルアミンＮ−オキサイド、サルコシン、ベタイン、γ−アミノ酪酸、オクタピン、アラノピン、ストロンビン、ジメチルスルホキシド、またはエタノールである、請求項８４に記載の組成物。
  86. 前記糖が、スクロース、ラクトース、グルコース、トレハロース、またはマルトースである、請求項８５に記載の組成物。
  87. 前記ポリオールが、イノシトール、エチレングリコール、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、マンニトール、または２−メチル−２，４−ペンタン−ジオールである、請求項８５に記載の組成物。
  88. 前記アミノ酸が、グルタミン酸Ｎａ、プロリン、α−アラニン、β−アラニン、グリシン、リジン−ＨＣｌ、または４−ヒドロキシプロリンである、請求項８５に記載の組成物。
  89. 前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、またはポリビニルピロリドンである、請求項８５に記載の組成物。
  90. 前記無機塩が、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、またはフッ化ナトリウムである、請求項８５に記載の組成物。
  91. 前記有機塩が、酢酸ナトリウム、ナトリウムポリエチレン、カプリル酸ナトリウム、プロピオン酸塩、乳酸塩、またはコハク酸塩である、請求項８５に記載の組成物。
  92. 前記抗酸化剤が、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アルキルガレート、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、トコフェロール、トコフェロール誘導体、モノチオグリセロール、または亜硫酸ナトリウムである、請求項８４に記載の組成物。
  93. 前記アスコルビン酸誘導体が、アスコルビン酸パルミテート、アスコルビン酸ステアレート、アスコルビン酸ナトリウム、またはアスコルビン酸カルシウムである、請求項９２に記載の組成物。
  94. 前記トコフェロール誘導体が、ｄ−α−トコフェロール、ｄ−α−酢酸トコフェロール、ｄｌ−α−酢酸トコフェロール、ｄ−α−コハク酸トコフェロール、β−トコフェロール、δ−トコフェロール、γ−トコフェロール、またはｄ−α−トコフェロールポリオキシエチレングリコール１０００スクシネートである、請求項９２に記載の組成物。
  95. 前記保存剤が、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、チメロサール、ベンジルアルコール、またはフェノールである、請求項８４に記載の組成物。
  96. 前記組成物は、−８０℃で保存された場合に安定である、請求項５２〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
  97. 前記組成物は、−２０℃で保存された場合に安定である、請求項５２〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
  98. 前記組成物は、４℃で保存された場合に安定である、請求項５２〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
  99. 前記組成物は、室温で保存された場合に安定である、請求項５２〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
  100. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液において単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物であって、ここで該溶液は、
    （ａ）５〜２０ｍＭのリン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせ
    （ｂ）１００〜３００ｍＭの塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウム、および
    （ｃ）０．１〜２ｍＭの少なくとも１種の金属イオン
    を含む、組成物。
  101. 前記溶液が、４〜８の範囲のｐＨを有する、請求項１００に記載の組成物。
  102. 前記溶液が、５〜７の範囲のｐＨを有する、請求項１０１に記載の組成物。
  103. 前記溶液が、６〜６．５の範囲のｐＨを有する、請求項１０２に記載の組成物。
  104. 前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項１０１に記載の組成物。
  105. 前記アジュバントが、ミョウバンまたはサポニンベースのアジュバントである、請求項１０４に記載の組成物。
  106. 前記サポニンベースのアジュバントが、ＱＳ−２１である、請求項１０５に記載の組成物。
  107. 前記組成物が、ガン治療剤をさらに含む、請求項１００〜１０６のいずれか１項に記載の組成物。
  108. 前記ガン治療剤が、ドセタキセルである、請求項１０７に記載の組成物。
  109. 前記組成物が、プレドニソンをさらに含む、請求項１０８に記載の組成物。
  110. 前記金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせである、請求項１００に記載の組成物。
  111. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液において単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物であって、ここで該溶液は、
    （ａ）１．４７ｍＭのリン酸ニ水素カリウム、
    （ｂ）８．１ｍＭのリン酸ニナトリウム、
    （ｃ）２．６８ｍＭの塩化カリウム、
    （ｄ）０．１４Ｍの塩化ナトリウム、
    （ｅ）０．９ｍＭの塩化カルシウム、および
    （ｆ）０．４９ｍＭの塩化マグネシウム
    を含み、そして該溶液は、７．０のｐＨを有する、組成物。
  112. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質が、０．２ｍｇ／ｍＬと１０ｍｇ／ｍＬとの間の濃度である、請求項１１１に記載の組成物。
  113. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質が、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１１２に記載の組成物。
  114. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質が、２ｍｇ／ｍＬと５ｍｇ／ｍＬとの間の濃度である、請求項１１１に記載の組成物。
  115. 前記単離されたＰＳＭＡタンパク質が、２ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１１４に記載の組成物。
  116. 前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項１１１に記載の組成物。
  117. 前記アジュバントが、サポニンベースのアジュバントである、請求項１１６に記載の組成物。
  118. 前記サポニンベースのアジュバントが、ＱＳ−２１である、請求項１１７に記載の組成物。
  119. 前記ＱＳ−２１が、５０μｇと１５０μｇとの間の量である、請求項１１８に記載の組成物。
  120. 前記ＱＳ−２１が、５０μｇの量である、請求項１１９に記載の組成物。
  121. 前記ＱＳ−２１が、１００μｇの量である、請求項１１９に記載の組成物。
  122. 溶液においてＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する方法であって、該方法は：
    ＰＳＭＡタンパク質の溶液を得る工程、および
    ｐＨを４〜８の範囲になるように調整する工程
    を包含する、方法。
  123. 前記ｐＨが、５〜７の範囲になるように調整される、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記ｐＨが、５．５〜７の範囲になるように調整される、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記ｐＨが、６になるように調整される、請求項１２４に記載の方法。
  126. ＰＳＭＡタンパク質を処理する方法であって、該方法は：
    溶液中の該ＰＳＭＡタンパク質を、ＰＳＭＡタンパク質の二量体の形成を促進または保存するために有効な量のＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する第１の因子と接触させる工程、
    を包含する、方法。
  127. 前記ＰＳＭＡタンパク質の二量体の形成を促進または保存するために有効な量が、ＰＳＭＡタンパク質の少なくとも５％、２５％、５０％、７５％、または、９５％をＰＳＭＡ二量体の形態に促進または維持するために十分である、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する第１の因子が、塩、金属イオン、またはｐＨ調整剤である、請求項１２６に記載の方法。
  129. 前記塩の陽イオン性成分が、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、またはそれらの組み合わせであり、そして該塩の陰イオン性成分が塩化物、硫酸塩、酢酸塩、またはそれらの組み合わせである、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫酸アンモニウムである、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記塩が、５０ｍＭ〜２Ｍの範囲の濃度で存在する、請求項１２９に記載の方法。
  132. 前記塩が、１００ｍＭ〜３００ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項１３１に記載の方法。
  133. ＰＳＭＡタンパク質溶液をアジュバントまたは希釈剤と混合する工程をさらに包含する、請求項１３１に記載の方法。
  134. 前記アジュバントまたは希釈剤が、１００ｍＭ〜３００ｍＭまでの塩濃度に希釈するための量のＰＳＭＡタンパク質と混合される、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記塩濃度が、１５０ｍＭに希釈される、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせである、請求項１２８に記載の方法。
  137. 前記金属イオンが、亜鉛イオンおよびカルシウムイオンの組み合わせである、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記亜鉛イオンおよびカルシウムイオンが、０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記亜鉛イオンが、前記カルシウムイオンの濃度よりも低い濃度で存在する、請求項１３７に記載の方法。
  140. 前記亜鉛イオンが０．１ｍＭの濃度で存在し、そして前記カルシウムイオンが１ｍＭの濃度で存在する、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記金属イオンが、マグネシウムイオンである、請求項１３６に記載の方法。
  142. 前記マグネシウムイオンが、０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記マグネシウムイオンが、０．５ｍＭの濃度で存在する、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記溶液のｐＨが、４〜８の範囲になるように調整される、請求項１２８〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
  145. 前記溶液のｐＨが、５〜７の範囲になるように調整される、請求項１４４に記載の方法。
  146. 前記溶液のｐＨが、５．５〜７の範囲になるように調整される、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記溶液のｐＨが６になるように調整される、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前記方法が、
    前記ＰＳＭＡタンパク質を、ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する第２の因子と接触させる工程
    をさらに包含し、該第２の因子は、前記第１の因子とは異なる、請求項１２８に記載の方法。
  149. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する前記第２の因子が、金属イオン、塩、またはｐＨ調整剤である、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせである、請求項１４９に記載の方法。
  151. 前記塩の陽イオン性成分が、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、またはそれらの組み合わせであり、そして該塩の陰イオン性成分が、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、またはそれらの組み合わせである、請求項１４９に記載の方法。
  152. 前記塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫酸アンモニウムである、請求項１５１に記載の組成物。
  153. 前記溶液のｐＨが、４〜８の範囲になるように調整される、請求項１４８〜１５２のいずれか１項に記載の方法。
  154. 前記溶液のｐＨが、５〜７の範囲になるように調整される、請求項１５３に記載の方法。
  155. 前記溶液のｐＨが、５．５〜７の範囲になるように調整される、請求項１５４に記載の方法。
  156. 前記溶液のｐＨが、６になるように調整される、請求項１５５に記載の方法。
  157. ＰＳＭＡタンパク質を含むサンプルを精製する方法であって、該方法は、
    ＰＳＭＡの二量体会合を保存または促進する因子の存在下で、ＰＳＭＡを含むサンプルをクロマトグラフィーに供する工程
    を包含する、方法。
  158. 前記ＰＳＭＡの二量体会合を促進または保存する因子が、金属イオン、塩、または４〜８の範囲のｐＨを有する溶液、あるいはそれらの組み合わせである、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせである、請求項１５８に記載の方法。
  160. 前記金属イオンが、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンの組み合わせである、請求項１５９に記載の方法。
  161. 前記カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンが、各々、０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項１６０に記載の方法。
  162. 前記カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンが、それぞれ、１ｍＭおよび０．５ｍＭの濃度で存在する、請求項１６１に記載の方法。
  163. 前記塩の陽イオン性成分が、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、またはそれらの組み合わせであり、そして該塩の陰イオン性成分が塩化物、硫酸塩、酢酸塩、またはそれらの組み合わせである、請求項１５８に記載の方法。
  164. 前記塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、または硫酸アンモニウムである、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記塩が、５０ｍＭ〜２Ｍの範囲の濃度で存在する、請求項１６３に記載の方法。
  166. 前記塩が、２Ｍの範囲の濃度で存在する、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記溶液のｐＨが、５〜７の範囲にある、請求項１５８に記載の方法。
  168. 前記溶液のｐＨが、６〜７．５の範囲に維持される、請求項１６７に記載の方法。
  169. ＰＳＭＡタンパク質を含むサンプルを精製する方法であって、該方法は、
    第１のカラムに該サンプルを適用する工程、
    該第１のカラムを、塩および金属イオンを含む第１の洗浄溶液で洗浄する工程、ならびに
    該第１のカラムから溶出した該ＰＳＭＡタンパク質を回収する工程、
    を包含する、方法。
  170. 前記金属イオンが、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、またはそれらの組み合わせである、請求項１６９に記載の方法。
  171. 前記金属イオンが、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンである、請求項１７０に記載の方法。
  172. 前記カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンが、０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項１７１に記載の方法。
  173. 前記カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンが、それぞれ、１ｍＭおよび０．５ｍＭの濃度で存在する、請求項１７２に記載の方法。
  174. 前記塩の陽イオン性成分が、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、またはそれらの組み合わせであり、そして該塩の陰イオン性成分が、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、またはそれらの組み合わせである、請求項１７２に記載の方法。
  175. 前記塩が、前記洗浄溶液において３５％を越えない飽和度の硫酸アンモニウムである、請求項１７４に記載の方法。
  176. 前記溶出させたＰＳＭＡタンパク質を、６〜７．５の範囲のｐＨの第１の塩溶液で透析またはダイアフィルトレーションして、ＰＳＭＡタンパク質を含む透析溶液またはダイアフィルトレーション溶液を得る工程をさらに包含する、請求項１６９に記載の方法。
  177. 前記第１の塩溶液が、少なくとも５ｍＭの塩濃度を有する、請求項１７６に記載の方法。
  178. 前記第１の塩溶液が、ｐＨ７の１０ｍＭのリン酸ナトリウム溶液である、請求項１７７に記載の方法。
  179. 請求項１６９または１７６に記載の方法であって、該方法は、
    前記溶出させたＰＳＭＡタンパク質、ＰＳＭＡタンパク質を含む透析溶液またはダイアフィルトレーション溶液を、第２のカラムにローディングする工程、
    該第２のカラムを第２の塩溶液で洗浄する工程、および
    該第２の塩溶液によって溶出されたＰＳＭＡを回収する工程
    をさらに包含する、方法。
  180. 前記第２の塩溶液が、１００ｍＭ〜２Ｍの塩濃度を有する、請求項１７９に記載の方法。
  181. 前記第２の塩溶液が、１０ｍＭのリン酸ナトリウム中の２Ｍの塩化ナトリウムである、請求項１８０に記載の方法。
  182. 前記第２の塩溶液が、６〜７．５の範囲のｐＨを有する、請求項１７９または１８０に記載の方法。
  183. 請求項１７９に記載の方法であって、該方法は、
    金属イオン溶液を含む第２の塩溶液によって溶出させたＰＳＭＡを、透析またはダイアフィルトレーションする工程、
    該第２の塩溶液によって溶出された透析されたＰＳＭＡまたはダイアフィルトレーションされたＰＳＭＡを、第３のカラムに適用する工程、
    塩および金属イオンを含む第２の洗浄溶液で該第３のカラムを洗浄し、溶出されたＰＳＭＡを回収する工程、
    をさらに包含する、方法。
  184. 前記ｐＨが、精製工程の全てを通じて、６〜７．５の範囲に維持される、請求項１８３に記載の方法。
  185. 異なる形態のＰＳＭＡタンパク質を分離する工程をさらに包含し、ここで該異なる形態のＰＳＭＡタンパク質は、ＰＳＭＡの単量体、二量体、または他の多量体の形態である、請求項１８３に記載の方法。
  186. 前記異なる形態のＰＳＭＡタンパク質が、サイズ排除クロマトグラフィーによって分離される、請求項１８５に記載の方法。
  187. ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する因子を同定する方法であって、該方法は、
    候補の因子に曝される前に、サンプル中のＰＳＭＡタンパク質の１つの形態の量を決定する工程、
    該サンプルを該候補の因子に曝す工程、
    該曝す工程の後に、該サンプル中のＰＳＭＡタンパク質の該形態の量を決定する工程、および
    該曝す工程の前のサンプルおよび該曝す工程の後のサンプルにおいて、ＰＳＭＡタンパク質の該形態の量を比較する工程
    を包含する、方法。
  188. 前記ＰＳＭＡタンパク質の形態が、単量体または二量体である、請求項１８７に記載の方法。
  189. 被験体においてＰＳＭＡを発現する細胞への免疫応答を誘発または増強するために該被験体を処置する方法であって、該方法は、
    請求項１〜２６、４７〜７６、１００、および１１１のいずれか１項に記載の組成物の有効量を該被験体に投与する工程
    を含む、方法。
  190. 前記発現されたＰＳＭＡが、前記細胞の表面上で発現される、請求項１８９に記載の方法。
  191. 前記方法が、ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物の１回以上のブースター用量を投与する工程をさらに包含する、請求項１８９に記載の方法。
  192. 前記ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が、ＰＳＭＡタンパク質二量体の組成物である、請求項１９１に記載の方法。
  193. 前記ブースター用量の組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項１９１に記載の方法。
  194. 前記ブースター用量の組成物が、請求項１〜２６、４７〜７６、１００、および１１１のいずれか１項に記載の組成物である、請求項１９１に記載の方法。
  195. 前記組成物が、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、皮内投与、または表皮投与によって投与される、請求項１８９に記載の方法。
  196. 前記組成物が、皮下投与または筋肉内投与によって投与される、請求項１９５に記載の方法。
  197. 前記被験体がガンを有しているか、またはガンについて処置されている、請求項１８９に記載の方法。
  198. 前記ガンが原発性腫瘍、または転移性のガンである、請求項１９７に記載の方法。
  199. 前記被験体が、前立腺ガンを有する、請求項１９７に記載の方法。
  200. 免疫応答を誘発する方法であって、該方法は、
    請求項１〜２６、４７〜７６、１００、および１１１のいずれか１項に記載の組成物の有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
  201. 前記方法が、ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物の１以上のブースター用量を投与する工程をさらに包含する、請求項１９５に記載の方法。
  202. 前記ＰＳＭＡタンパク質を含む組成物が、ＰＳＭＡタンパク質二量体の組成物である、請求項２０１に記載の方法。
  203. 前記ブースター用量の組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項２０１に記載の方法。
  204. 前記ブースター用量の組成物が、請求項１〜２６、４７〜７６、１００、および１１１のいずれか１項に記載の組成物である、請求項２０１に記載の方法。
  205. 前記組成物が、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、皮内投与、または表皮投与によって投与される、請求項２００に記載の方法。
  206. 前記組成物が、皮下投与または筋肉内投与によって投与される、請求項２０５に記載の方法。
  207. 請求項１〜２６、４７〜７６、１００、および１１１のいずれか１項に記載の組成物ならびに使用についての説明書を備える、キット。
  208. 請求項２６、４７〜６２、６６〜７６、１００、および１１１のいずれか１項に記載の組成物、アジュバント、ならびに混合についての説明書を備える、キット。
  209. 前記アジュバントが、ミョウバンまたはサポニンベースのアジュバントである、請求項２０８に記載のキット。
  210. 前記サポニンベースのアジュバントが、ＱＳ−２１である、請求項２０９に記載のキット。
  211. 請求項２６、４７〜６２、６６〜７６、１００、および１１１のいずれか１項に記載の組成物、希釈剤、ならびに混合についての説明書を備える、キット。
  212. 前記組成物が、バイアル、または隔壁のあるアンプル、または注射器において提供される、請求項２０７、２０８、および２０９のいずれか１項に記載のキット。
  213. 前記組成物が、凍結乾燥形態である、請求項２０７、２０８、および２０９のいずれか１項に記載のキット。
  214. 請求項１〜２６、４７〜７６、１００、および１１１のいずれか１項に記載の組成物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
  215. 被験体において前立腺ガンを処置する方法であって、該方法は、
    ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液において単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物の治療有効量を、該被験体に投与する工程を包含する方法であって、該組成物は、前立腺ガンの処置において有効である、方法。
  216. 投与される前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項２１５に記載の方法。
  217. 前記アジュバントが、サポニンベースのアジュバントである、請求項２１６に記載の方法。
  218. 前記方法が、前記被験体に従来の前立腺ガンの治療法を被験体に施す工程をさらに包含する、請求項２１５〜２１７のいずれか１項に記載の方法。
  219. 前記従来の前立腺ガンの治療法が、外科手術、放射線治療、凍結外科手術、温熱療法、ホルモン療法、または化学療法である、請求項２１８に記載の方法。
  220. 前立腺ガンを有する被験体において転移を阻害する方法であって、該方法は、
    ＰＳＭＡタンパク質の二量体会合を促進または保存する溶液において、単離されたＰＳＭＡタンパク質を含む組成物の治療有効量を該被験体に投与する工程、
    を包含し、該組成物は、転移の阻害において有効である、方法。
  221. 投与される前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項２２０に記載の方法。
  222. 前記アジュバントが、サポニンベースのアジュバントである、請求項２２１に記載の方法。
  223. 前記方法が、従来の前立腺ガンの治療法を前記被験体に施す工程をさらに包含する、請求項２２０〜２２１のいずれか１項に記載の方法。
  224. 前記従来の前立腺ガンの治療法が、外科手術、放射線治療、凍結外科手術、温熱療法、ホルモン療法、または化学療法である、請求項２２３に記載の方法。
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