JP2007326833A5 - - Google Patents
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Description
両親媒性ポリマーを含み、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる親水性部分を有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなり、疎水性外層に表面改質剤が結合した親水性活性物質含有微粒子を製造する方法であって、
（ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒に、炭素数３から６のアルキルアルコール、炭素数３から６のアルキルアミン、炭素数３から６のアルキルカルボン酸から選ばれる化合物を添加して混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程
（ｂ）逆相エマルジョンを、表面改質剤を含む水混和性有機溶媒もしくは水系溶媒に導入する工程
（ｃ）水非混和性有機溶媒を除去する工程
を含む親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
（ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒に、炭素数３から６のアルキルアルコール、炭素数３から６のアルキルアミン、炭素数３から６のアルキルカルボン酸から選ばれる化合物を添加して混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程
（ｂ）逆相エマルジョンを、表面改質剤を含む水混和性有機溶媒もしくは水系溶媒に導入する工程
（ｃ）水非混和性有機溶媒を除去する工程
を含む親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
本発明の親水性活性物質含有微粒子の製造方法は、
（ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒に、炭素数３から６のアルキルアルコール、炭素数３から６のアルキルアミン、炭素数３から６のアルキルカルボン酸から選ばれる化合物を添加して混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程
（ｂ）逆相エマルジョンを、表面改質剤を含む水混和性有機溶媒もしくは水系溶媒に導入する工程
（ｃ）水非混和性有機溶媒を除去する工程
を含む。
（ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒に、炭素数３から６のアルキルアルコール、炭素数３から６のアルキルアミン、炭素数３から６のアルキルカルボン酸から選ばれる化合物を添加して混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程
（ｂ）逆相エマルジョンを、表面改質剤を含む水混和性有機溶媒もしくは水系溶媒に導入する工程
（ｃ）水非混和性有機溶媒を除去する工程
を含む。
工程（ａ）における、親水性活性物質を含む水系溶媒、両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒により、逆相エマルジョンを形成する工程において、逆相エマルジョンの形成を補助し、均一かつ微小な逆相エマルジョンを形成する目的のために、共剤を添加する。共剤としては、炭素数３から６のアルキルアルコール、炭素数３から６のアルキルアミン、炭素数３から６のアルキルカルボン酸から選ばれる化合物である。これら共剤のアルキル鎖の構造は、特に限定されず、直鎖構造でも分岐構造でも良く、飽和アルキルでも、不飽和アルキルでも良い。本発明において、共剤としては、tert-ブタノール、iso-プロパノール、ペンタノールが好ましい。
以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものでない。
参考例１ 逆相エマルジョンの形成
微粒子の製造：両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール-ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００もしくは３７,０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに加熱し溶解させた。該ポリマー溶液に、撹拌速度１,６００ｒｐｍで撹拌しつつ、西洋わさびペルオキシダーゼ水溶液（１ｗｔ％西洋わさびペルオキシダーゼ、９ｗｔ％スクロース、１０ｍＭ Tris-HCl pH 7.4） ５０―２００μＬを滴下した。更に１時間撹拌することで逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンの粒径は、（装置Zetasizer３０００H SA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。
参考例１ 逆相エマルジョンの形成
微粒子の製造：両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール-ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５,０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００もしくは３７,０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに加熱し溶解させた。該ポリマー溶液に、撹拌速度１,６００ｒｐｍで撹拌しつつ、西洋わさびペルオキシダーゼ水溶液（１ｗｔ％西洋わさびペルオキシダーゼ、９ｗｔ％スクロース、１０ｍＭ Tris-HCl pH 7.4） ５０―２００μＬを滴下した。更に１時間撹拌することで逆相エマルジョンを製造した。該逆相エマルジョンの粒径は、（装置Zetasizer３０００H SA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。
実施例１ 逆相エマルジョンの形成
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン) （ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）６０ｍｇを酢酸エチル６００ｍｇに溶解しポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に１２０ｍｇの水を添加した。この溶液に１０μLのｔｅｒｔ−ブタノールを添加していき、波長６００ｎｍの光の透過率から濁度の変化を追った（図２）。透過率が９９．７％となったｔｅｒｔ−ブタノール８０μＬの条件でＤＬＳ測定を行い、逆相エマルジョンの粒径を測定したところ、１５．７ｎｍであった。
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン) （ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）６０ｍｇを酢酸エチル６００ｍｇに溶解しポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に１２０ｍｇの水を添加した。この溶液に１０μLのｔｅｒｔ−ブタノールを添加していき、波長６００ｎｍの光の透過率から濁度の変化を追った（図２）。透過率が９９．７％となったｔｅｒｔ−ブタノール８０μＬの条件でＤＬＳ測定を行い、逆相エマルジョンの粒径を測定したところ、１５．７ｎｍであった。
参考例２ 逆相エマルジョンおよび親水性活性物質含有微粒子の製造
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液１００μＬを滴下し、ホモジナイザーで撹拌し逆相エマルジョンを製造した（１５０００ｒｐｍ、５分）。撹拌後、２０ｍＬのジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を５００ｍｇのPluronic（BASFの登録商標）F68を含有したリン酸緩衝液（６ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、８ロット分を８０ｍＬの純水に分散させた。分画分子量１０万の濾過膜を装着した限外濾過装置で１０ｍＬまで濃縮した後、５０ｍＬの純水を添加し再び５ｍＬまで濃縮した。濃縮操作をもう一度行った後純水を添加することで４０ｍＬとした。その後、６ｍｇ／ｍＬのPluronic（BASFの登録商標）F68水溶液４０ｍＬを添加し微粒子分散液を製造した。該微粒子分散液を凍結乾燥した。凍結乾燥後、得られた粉末状サンプルに水を添加し再分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。インシュリンの封入率は、粒子試料を６ＮＨＣｌ中１０５℃で２２時間加水分解した後、アミノ酸分析を行いタンパク質量を定量することで決定した。
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液１００μＬを滴下し、ホモジナイザーで撹拌し逆相エマルジョンを製造した（１５０００ｒｐｍ、５分）。撹拌後、２０ｍＬのジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を５００ｍｇのPluronic（BASFの登録商標）F68を含有したリン酸緩衝液（６ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、８ロット分を８０ｍＬの純水に分散させた。分画分子量１０万の濾過膜を装着した限外濾過装置で１０ｍＬまで濃縮した後、５０ｍＬの純水を添加し再び５ｍＬまで濃縮した。濃縮操作をもう一度行った後純水を添加することで４０ｍＬとした。その後、６ｍｇ／ｍＬのPluronic（BASFの登録商標）F68水溶液４０ｍＬを添加し微粒子分散液を製造した。該微粒子分散液を凍結乾燥した。凍結乾燥後、得られた粉末状サンプルに水を添加し再分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。インシュリンの封入率は、粒子試料を６ＮＨＣｌ中１０５℃で２２時間加水分解した後、アミノ酸分析を行いタンパク質量を定量することで決定した。
参考例３ 逆相エマルジョンおよび親水性活性物質含有微粒子の製造
両親媒性ポリマーであるポリビニルピロリドン−ポリ（乳酸）（ポリビニルピロリドンの分子量１，７００、ポリ(乳酸)の分子量２，２００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に、１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液１００μＬを滴下し、数秒間撹拌し逆相エマルジョンを製造した。その後、１０倍量のジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を５００ｍｇのPluronic（BASFの登録商標）F68を含有したジオキサン（２０ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、２ｍＬの水を添加し微粒子を再分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。
両親媒性ポリマーであるポリビニルピロリドン−ポリ（乳酸）（ポリビニルピロリドンの分子量１，７００、ポリ(乳酸)の分子量２，２００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に、１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液１００μＬを滴下し、数秒間撹拌し逆相エマルジョンを製造した。その後、１０倍量のジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該粒子分散液を５００ｍｇのPluronic（BASFの登録商標）F68を含有したジオキサン（２０ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、２ｍＬの水を添加し微粒子を再分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。
参考例４ 逆相エマルジョンおよび親水性活性物質含有微粒子の製造
粒子製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液１００μＬを滴下し、ホモジナイザーで撹拌し逆相エマルジョンを製造した（１５０００ｒｐｍ、５分）。撹拌後、２０ｍＬのジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該濃縮液を種々の濃度のCremophor EL(ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油)を含有したジオキサン（８ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、１０ｍＬの純水を添加し、超音波処理により分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。
＜結果＞純水への分散後の粒子粒径はCremophor EL濃度とともに減少し、ジオキサン中のCremophor EL濃度１０００ｍｇ／ｍＬでは６１ｎｍとなった（図３）。
粒子製造：
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量１０，０００）１０ｍｇを酢酸エチル２ｍＬに溶解し、ポリマー溶液を調製した。該ポリマー溶液に１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン溶液１００μＬを滴下し、ホモジナイザーで撹拌し逆相エマルジョンを製造した（１５０００ｒｐｍ、５分）。撹拌後、２０ｍＬのジオキサンに添加した。溶媒を蒸発させ約２ｍＬまで濃縮した後、該濃縮液を種々の濃度のCremophor EL(ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油)を含有したジオキサン（８ｍＬ）に添加した。試料を凍結乾燥した後、１０ｍＬの純水を添加し、超音波処理により分散させた。該微粒子の粒径は、（装置Zetasizer３０００HSA(MALVERN INSTRUMENTS)）を使用し、動的光散乱法で測定した。得られたデータはCONTIN法およびヒストグラム法によって解析し、粒径を算出した。
＜結果＞純水への分散後の粒子粒径はCremophor EL濃度とともに減少し、ジオキサン中のCremophor EL濃度１０００ｍｇ／ｍＬでは６１ｎｍとなった（図３）。
実施例２ 逆相エマルジョンおよび親水性活性物質含有微粒子の製造
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）５０ｍｇを溶解させた炭酸ジメチル１ｇにn-ペンタノール４００ｍｇを加え、１０ｍｇ／ｍｌインスリン水溶液１００μＬを滴下し、ボルテックスで攪拌することで逆エマルションを調製した。この溶液を５％Pluronic F-68含有水溶液１０ｍｌに滴下し、ホモジナイザー（１５０００rpm、５min）またはボルテックス（数秒）で予備乳化し、W/O/W型エマルション溶液を調製した。得られたエマルション溶液から溶媒除去し、微粒子分散液とし、さらに凍結乾燥を行った。溶媒除去した分散液及び凍結乾燥して得られた粉末を純水に分散させた分散液に関してDLS測定を行った。また、凍結乾燥微粒子を純水に分散させ、HPLCにより遊離インシュリン量の測定も行った。
両親媒性ポリマーであるポリエチレングリコール−ポリ(イプシロン-カプロラクトン)（ポリエチレングリコールの分子量５，０００、ポリ(イプシロン-カプロラクトン)の分子量３７，０００）５０ｍｇを溶解させた炭酸ジメチル１ｇにn-ペンタノール４００ｍｇを加え、１０ｍｇ／ｍｌインスリン水溶液１００μＬを滴下し、ボルテックスで攪拌することで逆エマルションを調製した。この溶液を５％Pluronic F-68含有水溶液１０ｍｌに滴下し、ホモジナイザー（１５０００rpm、５min）またはボルテックス（数秒）で予備乳化し、W/O/W型エマルション溶液を調製した。得られたエマルション溶液から溶媒除去し、微粒子分散液とし、さらに凍結乾燥を行った。溶媒除去した分散液及び凍結乾燥して得られた粉末を純水に分散させた分散液に関してDLS測定を行った。また、凍結乾燥微粒子を純水に分散させ、HPLCにより遊離インシュリン量の測定も行った。
Claims (4)
- 両親媒性ポリマーを含み、内部に両親媒性ポリマーの親水性セグメントからなる親水性部分を有し、両親媒性ポリマーの疎水性セグメントからなる疎水性外層とからなり、疎水性外層に表面改質剤が結合した親水性活性物質含有微粒子を製造する方法であって、
（ａ）親水性活性物質を含む水系溶媒と両親媒性ポリマーを溶解した水非混和性有機溶媒に、炭素数３から６のアルキルアルコール、炭素数３から６のアルキルアミン、炭素数３から６のアルキルカルボン酸から選ばれる化合物を添加して混合することにより、逆相エマルジョンを形成する工程
（ｂ）逆相エマルジョンを、表面改質剤を含む水混和性有機溶媒もしくは水系溶媒に導入する工程
（ｃ）水非混和性有機溶媒を除去する工程
を含む親水性活性物質含有微粒子の製造方法。 - 逆相エマルジョンの平均粒径が１０〜５００ナノメートルである、請求項１に記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
- 両親媒性ポリマーの疎水性セグメントが生分解性ポリマーを含み、親水性セグメントがポリエチレングリコールを含む、請求項１または２に記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
- 親水性活性物質含有微粒子の平均粒径が５０〜１０００ナノメートルである、請求項１〜３のいずれかに記載の親水性活性物質含有微粒子の製造方法。
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