JP2007300928A - サブトラクションcDNAライブラリーの作製方法および該作製されたライブラリーの使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】a)細胞のcDNAライブラリーを作製する工程と;b)該cDNAライブラリーから二本鎖DNAを単離する工程と;c)該二本鎖DNAから二本鎖cDNA挿入物を放出する工程と;d)単離された二本鎖cDNA挿入物を変性させる工程と;e)該変性された二本鎖cDNA挿入物を、前記cDNAライブラリーから差し引くべき標識された一本鎖核酸分子とハイブリダイズさせることと;f)ハイブリダイズして標識された一本鎖核酸分子を前記二本鎖cDNA挿入物から分離することにより、細胞のサブトラクションcDNAライブラリーを作製する。さらに、この作製されたライブラリーの種々の用途を提供する。
【選択図】なし
Description
C=シトシン A=アデノシン
T=チミジン G=グアノシン。
材料と方法
細胞株、増殖条件、および馴らし培地の調製
HO−1細胞株は、49才の女性からのメラニン性メラノーマであり、継代第100代と第125代の間で使用した(6、8、13)。HO−1細胞は、ガン研究ステーリン財団(Stehlin Foundation for Cancer Research)(テキサス州、ヒューストン)のベッピノ・シー・ギオバネラ博士(Dr.Beppino C.Giovanella)から供与された。10%ウシ胎児血清を補足したダルベッコ-改変イーグル培地(DMEM)(DMEM−10)(ハイクローン(Hyclone)、ローガン(Logan)、ユタ州)中で、空気95%二酸化炭素5%の湿潤インキュベーター中で37℃で培養物を増殖させた。HO−1細胞は集密状態(confluency)になる前に約4、5日毎に継代培養(1:5または1:10)して、対数増殖期を維持した。IFN−β(2000単位/ml)、IFN−γ(2000単位/ml)、IFN−β + IFN−γ(各インターフェロン1000単位/ml)、MPA(3.0μM)、RA(2.5μM)、MEZ(10ng/ml)、IFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml)、MPA+MEZ(3.0μM+10ng/ml)、およびRA+MEZ(2.5μM+10ng/ml)を用い、既に記載されているように(6、8、9)して4日間処理した後の増殖に対する作用を測定した。細胞を種々の薬剤で4日間または7日間処理して、培養物を無血清DMEMで2回洗浄し、誘導剤(inducer)の非存在下でDMEM−10中でさらに14日間インキュベートして、最終細胞分化(terminal cell differentiation)と、同時に起きる増殖能力の喪失を測定した。全細胞数はZMクルターカウンターを用いて4、7、14、および21日後に測定し、生存細胞数はトリパンブルー色素排除試験(6)により測定した。最終細胞分化は、誘導剤の非存在下で3日または4日毎に培地を交換して14日間増殖させた後に増殖はないが細胞は生存しているかどうかで示した。誘導剤を除去した後の細胞数(2倍またはそれ以上の細胞集団の倍加)の増加は、可逆的増殖抑制と見なした。馴らし培地は、高濃度のMEZ(50ng/ml)、IFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml)、MPA+MEZ(3.0μM+10ng/ml)、またはRA+MEZ(2.5μM+10ng/ml)で24時間処理し、次にFBSを含まないDMEMで3回洗浄し、誘導剤非添加の培地(DMEM−10)で72時間増殖させたHO−1細胞から調製した。処理した培養物から馴らし培地を採取し、混入している細胞を1000rpmで10分間遠心分離して除去し、馴らし培地は遺伝子修飾活性の測定まで4℃で保存した。対照馴らし培地は、試験化合物の非存在下で蒔いてから24時間後に培地交換を行い、72時間DMEM−10中で増殖させた後の細胞から実験馴らし培地として得た。
既に記載されている(14〜16)ように、適当な32Pでラベルした遺伝子プローブとプローブ結合させた全RNAのノーザンブロッティング解析により、特定のmRNAの定常状態のレベルを測定した。誘導剤で24時間処理した細胞、誘導剤で24時間処理した後誘導剤の非存在下で72時間増殖させた細胞、または誘導剤で連続的に96時間処理した細胞からのRNAを解析した。使用した誘導剤の濃度は、増殖試験で使用したものと同じである。HO−1細胞を1:2希釈の馴らし培地(等量の馴らし培地と、10%ウシ胎児血清を補足したDMEM(DMEM−10))で24時間処理、または1:4希釈の馴らし培地(1容の馴らし培地と3容のDMEM−10)で96時間処理して、遺伝子発現の変化に対する馴らし培地の影響を調べた。本研究で使用したプローブは、β−アクチン(17)、γ−アクチン(17)、c−jun(18)、c−myc(19)、フィブロネクチン(20)、gro/MGSA(21)、HLAクラスI抗原(22)、HLAクラスII抗原(HLA−DRβ)(22)、α5インテグリン(23)、β1インテグリン(24)、ISG−15(25)、ISG−54(25)、jun−B(26)、およびテネイシン(27)に特異的であった。またノーザンブロットも32PでラベルしたGAPDH遺伝子(15)とプローブ結合させて、種々の実験条件下での同様のmRNA発現を証明した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを洗浄しオートラジオグラフィーに露光させた。
組換えIFN−β(分子の17位でセリンがシステインに置換されている(28))は、トリトン・バイオサイエンス(Triton Bioscience)(アラメダ(Alameda)、カリホルニア州)より供与された。IFN−βは、4.5×107単位/mlの濃度の凍結乾燥粉末として得られた。組換えヒト免疫インターフェロン(IFN−γ)は、既に記載されている(29)ように産生し、精製して均一にした。IFN−γは、UMDNJ−ロバート・ウッド・ジョンソン医学校(UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School)(ピスカタウェイ(Piscataway)、ニュージャージー州)のシドニー・ペストカ博士(Dr.Sidney Pestka)より供与された。インターフェロンの力価は、牛腎臓細胞株(MDBK)またはヒト繊維芽細胞AG−1732細胞(30)に対する水泡性口内炎ウイルスによる細胞変性阻害測定法を用いて測定した。IFN−βとIFN−γの濃縮ストック液をDMEM−10で1×106単位/mlに希釈し、−80℃で凍結し、使用直前に融解し、DMEM−10で適当な濃度に希釈した。MEZ、RAおよびMPAはシグマ・サイエンティフック社(Sigma Scientific Co.)(セントルイス、ミズーリ州)より得た。ストック溶液はジメチルスルホキシド(DMSO)中で調製し、少量ずつ分注し、−20℃で保存した。溶媒対照で使用したDMSOの最終濃度は0.01%であった。DMSOのこの濃度は、HO−1細胞の増殖、メラニン合成、チロシナーゼ活性、または抗原発現を変化させなかった。
HO−1細胞の可逆的または不可逆的増殖抑制(最終細胞分化)の誘導
RA、MPA、MEZ、IFN−βおよびIFN−γを単独または種々の組合せで使用した場合の、増殖(可逆的および不可逆的の増殖抑制)、メラニン合成、チロシナーゼ活性、および細胞形態に対する作用を、表1に要約した。HO−1増殖を阻害する最も有効な薬剤は、IFN−β + MEZとIFN−β + IFN−γの組合せであった(図1)。残りの薬剤の抗増殖活性の相対的順序は、MPA=MPA+MEZ>IFN−γ>MEZ=RA+MEZであった。RAでは増殖阻害は起きなかった。HO−1細胞をIFN−β + MEZで96時間処理すると、増殖能力が不可逆的に失われ、すなわち最終細胞分化が起きた。これは、試験薬剤を除去した後も処理した細胞は生きてはいるが、再び増殖することができないことにより示された。対照的に、他のすべての薬剤は可逆的増殖阻害を引き起こした(非掲載データ)。これらの知見は、HO−1細胞の増殖抑制と最終細胞分化が解離していることを示している。
初期応答(early responce)遺伝子であるc−fos、c−jun、jun−B、jun−D、およびc−mycの96時間の発現に及ぼす、種々の分化調節および増殖調節薬剤の影響を測定するために最初の試験を行った(図2)。いずれの実験条件においてもc−fos発現は変化せず、jun−Dでプローブ結合させた対照細胞または処理細胞から単離したRNAとはハイブリダイゼーションしなかった(非掲載データ)。しかしIFN−βとRAを除くすべての試験薬剤で96時間処理したHO−1細胞において、c−junとjun−Bの発現増加が観察された(図2を参照)。増加の程度は、IFN−γ、MEZ、またはMPAで処理したHO−1細胞では同程度であり、IFN−β + MEZ、MPA+MEZ、またはRA+MEZで処理したHO−1細胞で最大であった(図2を参照)。c−junとjun−Bの発現と異なり、c−myc発現は、MEZ、MPA、IFN−β + MEZ、MPA+MEZ、およびRA+MEZで96時間増殖させた細胞では下方調節(down regulation)された(図2)。抑制の程度は、IFN−β + MEZ、MPA+MEZ、およびRA+MEZで処理したHO−1細胞で大きかった。これと対照的にIFN−γ単独またはIFN−γとIFN−βを組合せてHO−1細胞を処理するとc−myc発現が増加した。
IFN−β + MEZにより誘導されるHO−1細胞の最終分化は形態変化に関係しており、樹状突起様の突起の形成と特異的生化学的変化(すなわち、チロシナーゼ活性とメラニン合成の増強)が起きる(6)。同様の形態および生化学的変化は、MEZ(6、8)とMPA(11)によりHO−1細胞で誘導される。これらの形態および生化学的変化と、細胞外マトリックス分子(フィブロネクチンおよびテナスシン(tenascin))、細胞外マトリックスタンパクの受容体(α3、インテグリンおよびβ1インテグリン)、および細胞骨格タンパク(β−アクチンおよびγ−アクチン)をコードする遺伝子の発現の関係を調べるために、試験を行った。96時間処理するとすべての処理プロトコールでフィブロネクチン発現が増加したが、IFN−βとRAはHO−1細胞中のフィブロネクチンmRNAの増強誘導が最も小さかった(すなわち、ノーザンブロットに長時間暴露した後にのみシグナルが検出された)(図4および非掲載データ)。フィブロネクチン発現を増強させる最も有効な単一の薬剤はIFN−γとMPAであり、MEZはフィブロネクチン発現の誘導能力はより小さかった(図4)。IFN−β + IFN−γ、IFN−β + MEZ、MPA+MEZ、およびRA+MEZの組合せで96時間増殖させたHO−1細胞においても、フィブロネクチン発現の大きな増加が観察された。IFN−β + MEZはMPA+MEZ、RA+MEZ、または高濃度のMEZより、24時間処理後のフィブロネクチン発現を有効に増強した(図5)。IFN−β + MEZもまた、誘導剤の組合せを除去し誘導剤のない培地中で72時間増殖させた後、MPA+MEZ、RA+MEZ、および高濃度のMEZよりもフィブロネクチン発現を増強させた(図5)。
前述の試験は、インターフェロン応答性遺伝子およびgro/MGSA遺伝子がHO−1細胞の可逆的および不可逆的分化の過程で活性化されることを証明した。これらはさらに、分化過程における自己分泌性フィードバックが関与している可能性を示唆した(図2と3)。分化(高濃度のMEZ、RA+MEZ、およびMPA+MEZ)および/または最終細胞分化(IFN−β + MEZ)の可逆的動機付けを誘導する薬剤で処理したHO−1細胞は、HO−1細胞中の遺伝子発現を調節することができる因子を分泌するか否かを直接測定するために、誘導剤で24時間処理し次に誘導剤の非存在下で72時間増殖させた細胞から馴らし培地を採取した(図6と7)。HO−1細胞を等量の馴らし培地+等量のDMEM−10(1:2)で24時間増殖させるか、または1容の馴らし培地+3容のDMEM−10(1:4)で96時間増殖させた。次に全細胞質性RNAを単離し、一連の初期増殖応答、インターフェロン応答性、細胞外マトリックス遺伝子、細胞外マトリックス受容体遺伝子、および細胞骨格遺伝子の発現をノーザンブロッティングで解析した(図6と7)。フィブロネクチンとβ1−インテグリンのわずかな増加を除いて、他の実験条件(分化の可逆的動機付けが起きる)下で得られた1:2馴らし培地で24時間処理しても、試験した遺伝子(c−jun、jun−B、c−myc、gro/MGSA、HLAクラスI抗原、ISG−15、α5−インテグリン、β−アクチン、γ−アクチン、またはテナスシン)の発現を変化または誘導しなかった。IFN−β + MEZ処理したHO−1細胞から得られた1:4馴らし培地に96時間暴露すると、フィブロネクチン、HLAクラスI抗原、β1−インテグリン、およびテナスシンの発現が増大し、ISG−15発現も誘導された。IFN−β + MEZ、MPA+MEZ、RA+MEZで24時間処理した培養物から得られた1:4馴らし培地により増大したフィブロネクチンとテナスシンの場合を除いて、いずれの実験条件下でも種々の遺伝子の発現の修飾は明らかではなかった。
関連するタイプおよび異なるタイプの細胞の両方で差別的発現(dlfferential expression)を示す遺伝子の同定とクローニングのための分子生物学的方法が記載されている(1〜5)。多様な標的細胞中で差別的に発現される遺伝子の同定を可能にした特に強力な方法は、サブトラクション・ハイブリダイゼーション(subtraction hybridization)である(4、5)。この方法は、形質転換/悪性腫瘍表現型の進展時に特異的に発現される遺伝子(5、6)、増殖停止を受けている細胞中の遺伝子(7)、特定のDNA損傷薬剤に誘導される遺伝子(8)、B細胞成長の特定の段階で発現される遺伝子(9)、プログラムされた細胞死に関係のある遺伝子(10)の同定に使用され成功している。サブトラクション・ハイブリダイゼーションは、まれな転写産物(4、5、9、11、14)、または2つのタイプの細胞の間で小さな変動を示す転写産物(4、8、11)の同定に理想的である。本明細書に記載されるように、サブトラクション・ハイブリダイゼーションはまた、未分化親細胞に対して分化誘導された細胞で高レベルに発現される遺伝子の同定とクローニングにも理想的な方法である。さらに、反対の方向にサブトラクションを行うことにより(すなわち、未処理対照(Ind-)から分化誘導処理(Ind+))、このプロトコールは最終分化の間に抑制される遺伝子の同定にも使用することができる。
細胞株と分化誘導
ヒト・メラノーマ細胞株HO−1は、49才の女性からのメラニン性メラノーマであり、継代第125代と第150代(16)の間で使用した。HO−1細胞は、10%ウシ胎児血清を補足したダルベッコ-改変イーグル培地(DMEM)(DMEM−5)中で、二酸化炭素5%−空気95%の湿潤インキュベーター中で37℃で増殖させた。細胞は、未処理のままにするか(Ind-)、或いはIFN−β(2000単位/ml)とMEZ(10ng/ml)の組合せで、2、4、8、12および24時間処理した(Ind+)。発現実験のために、HO−1細胞を未処理のままにするか、またはIFN−β(2000単位/ml)、MEZ(10ng/ml)またはIFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml)で12時間および24時間処理して、細胞のRNAを単離してノーザンブロッティングで解析した(17)。
未処理(Ind-)試料およびIFN−β + MEZ処理(2、4、8、12および24時間)(Ind+)試料からの全細胞性RNAを、イソシアン酸グアニジン/CsCl遠心分離法により単離し、オリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィーによりポリ(A+)RNAを選択した(18)。グブラーとホフマン(Gubler and Hofmann)法に基づくストラタジーン(Stratagene)(登録商標)(ラホイア、カリホルニア州)からのZAP−cDNA(商標)合成キットを用いてcDNA合成を行った(19)。ユニークな制限部位(Xhol)の隣のオリゴ(dT)よりなるプライマーアダプタを最初の鎖の合成に使用した。2本鎖cDNAをEcoRIアダブターに結合し、次にXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化した。得られたEcoRIおよびXhoI粘着末端により、最終cDNAをlac−Zプロモーターに関してセンスの方向でλZAPIIベクター中に挿入した(20)。λZAPIIベクターは、ファージミド(phagemid)へのファージクローンのインビボの変換を促進するバクテリオファージ由来のf1配列が隣接するpBluescriptプラスミド配列を含有する(20)。2つのcDNAライブラリーを作成した:分化誘導剤で処理したcDNAライブラリー(Ind+)(テスターライブラリー);そして対照の非誘導cDNAライブラリー(Ind-)(ドライバーライブラリー)。ライブラリーをギガパックIIゴールドパッケージングエキストラクト(Gigapack II Gold Packaging Extract)(ストラタジーン(Stratagene)(登録商標))でパッケージングし、PLK−F’細菌細胞(ストラタジーン(Stratagene)(登録商標))で増幅させた。
ストラタジーン(Stratagene)(登録商標)(ラホイア、カリホルニア州)記載の大量切り出し方法を用いて、Ind+ファージミド(phagemid)ライブラリーをλZAPから切り出した[21]。簡単に説明すると、1×107pfuのInd+cDNAライブラリーを10mM MgSO4中の2×108の大腸菌(Escherichia coli)のXL−1ブルー(Blue)株および2×108pfuのエクサシストヘルパー(ExAssist helper)ファージと混合し、37℃で15分間吸収した(22)。LB培地10mlを加えた後ファージ/細菌混合物を37℃で2時間振盪してインキュベートし、次に70℃で20分間インキュベートして、細菌とλZAPファージ粒子を加熱して不活性化した。4000gで15分間遠心分離した後、上清を無菌のポリスチレン管に移し、使用するまで4℃で保存した。
前述の大量切り出し方法を用いて、ラムダZAPから対照Ind-cDNAライブラリーを切り出した。ファージミド(5×107)を10mM MgSO4中の1×109の大腸菌のXL−1ブルー株と一緒にし、37℃で15分間吸収した。ファージミド/細菌を250mlのLB培地に移し、37℃で2時間振盪してインキュベートした。ヘルパーファージVCS M13(ストラタジーン(Stratagene)(登録商標)(ラホイア、カリホルニア州))を2×107pfu/mlになるように加え、1時間インキュベート後、硫酸カナマイシン(シグマ(Sigma))を70μg/mlになるように加えた。細菌を一晩増殖させた。ファージミドを採集し、標準的プロトコールを用いて1本鎖DNAを調製した(18)。
ベクターから挿入体を切り出すために、Ind+cDNAライブラリーからの2本鎖DNAをEcoRIとXhoIで消化し、フェノールとクロロホルムで抽出し、次にエタノール沈殿させた(5)。遠心分離後、ペレットを蒸留水に再懸濁した。Ind-cDNAライブラリーからの1本鎖DNAを光活性化ビオチン(フォトビオチン、シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州)を用いてビオチン化した(23)。650μlの微量遠心分離管中で、1μg/mlの1本鎖DNAを50μlと1μg/mlの光活性化ビオチン水溶液50μlを混合した。溶液を破砕した氷の中で試験管を傾けて10cmの距離で太陽灯を300ワットで15分間照射した。この溶液に光活性化ビオチンを25μl加えてDNAをさらにビオチン化して、次に前述のようにさらに15分間照射した。結合しなかったビオチンを除去するために、反応物を200μlの100mMトリス−塩酸、1mM EDTA、pH9.0で希釈し、2−ブタノールで3回抽出した。0.3Mになるように酢酸ナトリウム(pH6.5)を加え、2倍量のエタノールでビオチン化DNAを沈殿させた。
サブトラクション・ハイブリダイゼーションは基本的にはヘルフォート(Herfort)とガーバー(Garber)(24)が記載した方法を少し変更して行った。650μlのシリコン化微量遠心分離管中で、400ngのEcoRI消化およびXhoI消化したInd+cDNAライブラリーと12μgのビオチン化Ind-cDNAライブラリーを、20μlの0.5M NaCl、0.05M ヘペス(HEPES)(pH7.6)、0.2%(重量/容量)ドデシル硫酸ナトリウムおよび40%脱イオン化ホルムアミド中で混合した。混合物を5分間沸騰し、42℃で48時間インキュベートした。このハイブリダイゼーション混合物を0.5M NaCl、10mMトリス(pH8.0)、1mM EDTAで400μlに希釈し、次に15μgのストレプトアビジン(ビーアールエル(BRL)(登録商標))水溶液を加え、室温で5分間インキュベートした。試料をフェノール/クロロホルム(1:1)で2回抽出し、有機相をTE緩衝液(pH8.0)中0.5M NaCl 50μlで逆抽出を行った。さらに10μgのストレプトアビジンを加え、フェノール/クロロホルム抽出を繰り返した。短時間凍結乾燥して過剰のクロロホルムを除去し、最終溶液をTE緩衝液(pH8.0)で2mlに希釈し、製造会社が勧めるようにセントリコン(Centricon)100フィルター(アミクロン(Amicron);ダンバーズ(Danver)、マサチューセッツ州)で2回抽出した。次に濃縮したDNA溶液(約50μl)を凍結乾燥した。サブトラクションcDNAを、λZAPIIベクターのEcoRI消化しXhoI消化しCIAP処理したアーム(arm)に結合させ、ギガパックII・ゴールドパッケージング・エキストラクト(Gigapack II Gold Packaging Extract)(ストラタジーン(Stratagene)(登録商標)、ラホイア、カリホルニア州)でパッケージングした。このライブラリーをPLK−F’細菌細胞を用いて増幅した。
前述のエクサシストヘルパー(ExAssist helper)ファージを用いてライブラリーの大量切り出しを行った。大腸菌のSOLR株とcDNAファージミドを37℃で15分間混合し、アンピシリンとIPTG/X−galを含有するLB平板に蒔いた。白色のコロニーを無作為に選択し、単離し、LB培地で増殖させた。プラスミドのミニプレップ(miniprep)と制限酵素消化を行って挿入体の存在を確認した。挿入体を単離し、ノーザンブロッティング解析のプローブとして使用した(5、25)。IFN−β(2000単位/ml)、MEZ(10ng/ml)、およびIFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml)で処理したHO−1細胞から全細胞性RNAを調製し、0.8%アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜(アマーシャム(Amersham)、アーリントンハイツ(Arlington Heights)、イリノイ州)に移した。ランダム・オリゴヌクレオチド・プライミング(25)により放射標識したプローブを作成した(25)。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション後の洗浄およびオートラジオグラフィーは、既に記載されているように行った(5、18、25)。
2本鎖pBluescriptDNAを鋳型としてmdaクローンの配列を決定した。DNA配列決定は、シークエナーゼ(sequenase)(米国バイオケミカル社(United States Biochemical Corp.)、クリーブランド、オハイオ州)とT3プロモータプライマー(ギブコ(GIBCO)(登録商標)、ビーアールエル(BRL)(登録商標)、ガイサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州)を用いてサンガー(Sanger)のジデオキシ鎖法により行った。この方法は挿入体の5’からの配列を生成する。配列は、ジーンバンクFMBL(GenBank FMBL)データベースとGCG/FASTAコンピュータープログラムを用いて同定した。
サブトラクション・ハイブリダイゼーションは、選択した遺伝子またはこれにコードされた生成物の情報がない場合に優先的に発現されたmRNAに相当するcDNAクローンを単離する有用な方法である(1〜10)。この方法により、差別的に発現されたcDNAクローンが実質的に濃縮され、全cDNAを用いる差別的ハイブリダイゼーション法に好適である(4、5、11〜14)。サブトラクションライブラリー生成のために多くのプロトコールが報告されている[4で概説されている]。伝統的な方法は、1つのタイプの細胞のmRNAから作成した第1の鎖のcDNA(テスター)を、第2のタイプの細胞から調製したmRNA(ドライバー)
[または、特定の遺伝子調節薬剤で処理した第1のタイプの細胞]とハイブリダイズさせる[7〜9]。次にハイブリダイズしなかった1本鎖のcDNAを、ハイドロキシアパタイトのカラムクロマトグラフィーにより選択し、第2の鎖のcDNAの合成の鋳型として使用する(7〜9)。しかしこの方法には以下のようにいくつかの限界がある:ハイブリダイゼーション中にRNAを扱う必要が有りこれは問題が多い、そしてハイブリダイゼーションとカラムクロマトグラフィー後に回収されるcDNAの量が限られていることである。他のサブトラクション・ハイブリダイゼーション法では、cDNAと光ビオチン化RNAを使用する(23、26)。これは多量のmRNAが必要なこととハイブリダイゼーション中にRNAを扱う必要があり、まだ問題がある(22)。最近改良されたサブトラクション・ハイブリダイゼーションでは、テスターおよびドライバー核酸集団としてcDNAライブラリーを使用する(24、27、28)。クローン化された型に存在するドライバー配列を使用することにより、この新しい方法は、mRNAの量が少ないことに関連する問題およびmRNAの調製と扱いに由来する困難さを避けている。サブトラクション・ハイブリダイゼーション法の改良点には、ファージミドサブトラクション・ハイブリダイゼーションの使用(27);指向性の(directional)挿入体を有する1本鎖ファージミドの使用(28);テスターとして2本鎖cDNA挿入体そしてドライバーとして1本鎖cDNAの使用(21)がある。
ヒトにおける悪性メラノーマ(結節型メラノーマを除く)の発生は、明確に規定された段階の不連続なシリーズが関与する進行性の過程である。集中的な科学的解明が行われているにもかかわらず、発生するメラノーマの種々の段階へのメラノーマ細胞の変換を制御する遺伝的要素は同定されていない。さらに転移性メラノーマを治療する確実に有効な方法は存在しない。本計画の長期的目標は、メラノーマの増殖、分化および進展を制御する遺伝子を規定することである。この知見は、治療法の目標を解明するのに有用となるであろう。
1)メラニン細胞、母斑細胞、放射増殖相メラノーマ細胞、垂直増殖相メラノーマ細胞、および転移性メラノーマ細胞におけるmda遺伝子の発現のパターンと制御の決定;
2)mda遺伝子発現と、ヒト・メラノーマおよび他のモデル分化系の、分化の可逆的動機付け、分化誘導のない増殖抑制、DNA傷害とストレス応答および最終分化の誘導の間の関係の解析;
3)メラノーマ分化と進展に関係しているかも知れないmda遺伝子の全長cDNAの単離と、ヒト・メラノーマの分化と進展におけるその機能的役割の可能性の直接的決定;
4)適当なmda遺伝子のプロモーター領域の単離と性状解析、およびヒト・メラニン細胞、母斑およびメラノーマにおけるその制御の解析。
悪性メラノーマは癌の進行過程の典型であり、転移性表現型の選択的性質と転移性細胞の増殖優勢性を強調する(概説1〜3)。北米人の間で発生する多くの癌のうち、メラノーマは最大の速度で増加しており、現在生まれる新生児100人に1人は最終的に表面拡散型のメラノーマを発症するであろうと予測されている(3、4)。メラノーマは初期段階では確実に治療できるが、転移性疾患や悪性メラノーマの進行した段階の患者の死の防止には外科的および化学療法的介入は事実上無効である。これらの観察結果は、転移性メラノーマの患者をより効率的に治療できる改良された治療法の必要性を強調している。
背景と意義で説明したように、多くの癌を証明するものは正常なプログラムで細胞分化を受けないことである。この仮説が正しく、かつ癌細胞の遺伝機構が正常な分化の拘束を再び得るように再プログラムすることができるならば、増殖能力の喪失と最終分化を誘導するために適当な外部刺激が利用できるであろう(5〜14)。この仮説を直接検証するために計画した研究で、本出願人は組換えIFN−βと抗白血病化合物メゼレイン(MEZ)の組合せでヒト・メラノーマ細胞の最終分化の誘導に成功した(10、11、14)。これに対して、組換え白血球インターフェロン(IFN−α)+MEZの組合せは増殖抑制を増強したが、最終分化を誘導しなかった(すなわち、処理した細胞は増殖活性を保持していた)(10)。IFN−β + MEZの組合せは、使用した各薬剤単独の増殖抑制作用に対して比較的耐性または感受性のヒト・メラノーマ細胞中の最終分化誘導に有効であった(10)。IFN−β + MEZに連続的に4または7日間暴露することによる、HO−1ヒト・メラノーマ細胞株中の最終分化の誘導は:(a)急速な(24時間以内の)増殖抑制(図12)(10、11);(b)細胞形態の大きな変化(処理した細胞は樹状突起様の突起を示した)(図13)(10);および(c)メラニン(メラノーマ細胞分化のマーカー)の誘導(メラニン性メラノーマ中)または増殖増加(メラニン性メラノーマ中)に関連していた(10)。IFN−βとMEZの用量と治療スケジュールを変えて(24時間、4日間および/または7日間)、メラノーマ分化の化学的誘導を3段階に分けることができた。これらは、初期の完全に可逆的な誘導相(低用量の誘導剤を4または7日間)、後期の部分的可逆的な誘導相(高濃度の誘導剤を4日間)、および不可逆的な誘導相(特定量の誘導剤を24時間、4日間または7日間)である(10〜14)。
本出願人は、ヒト・メラノーマ細胞における増殖抑制、形態変化、メラニン合成増加、チロシナーゼ活性増強および/または最終分化誘導に関連した広範囲の遺伝子発現変化の測定を開始した(12〜14)。本出願人が選択した薬剤は、HO−1細胞において可逆的増殖抑制、メラニン合成の誘導、形態変化、チロシナーゼ活性増強、分化または同時に増殖活性の喪失を伴う最終分化の可逆的動機付けを誘導する(表2)。本出願人がここで解析した遺伝子は:初期応答遺伝子(c−fos、c−myc、c−jun、jun−B、jun−Dおよびgro/MGSA)(14);インターフェロン刺激遺伝子(ISG−15、ISG−54、HLAクラスI抗原およびHLAクラスII抗原)(13、14);細胞接着分子(P−カドヘリン、E−カドヘリン、N−カドヘリン、およびN−CAM)(14);細胞外マトリックス遺伝子(フィブロネクチン(FIB)およびテナスシン)(12、14);細胞表面プロテオグリカン/マトリックス受容体(シンデカン、β1インテグリン(主要FIB受容体サブユニット)、α5インテグリン(主要FIB受容体サブユニット))(14);細胞骨格遺伝子(トロポミオシン−1、γ−アクチンおよびβ−アクチン)(14);そしてハウスキーピング遺伝子(GAPDH)(14)である。前記遺伝子プローブを用いた場合、ユニークな遺伝子発現変化は見いだされず、最終分化したHO−1細胞にのみ起きた。これらの結果は、HO−1メラノーマ細胞において分化の拘束または最終分化は、重複する遺伝子発現の変化の特定のパターンに関係していることを示している。後述するように、分化を拘束されたおよび最終分化を誘導されたHO−1細胞で観察される遺伝子発現の興味深い変化は、I型インターフェロン応答性遺伝子とgro/MGSA遺伝子の誘導と発現増強である。これらの結果から、特異的自己分泌性フィードバックループがヒト・メラノーマ細胞の分化過程に寄与または関係しているかも知れないという仮説に至った。
前述のようにHO−1細胞をIFN−β + MEZで処理すると増殖抑制が起き、これはこれらの誘導剤に暴露後24時間以内に明らかになる(図12、10、14)。この系を使用して、cdc2、サイクリンA、サイクリンB、ヒストン1、ヒストン4、増殖性細胞核抗原(PCNA)、c−myc、p53およびRbなどの細胞サイクル制御遺伝子の発現に及ぼす、異なる誘導剤単独および組合せた場合の影響を評価した。これらの結果を要約すると以下のようになる:(a)cdc2とヒストン1の低下はすべての実験条件下で明らかであった。この作用は24時間後に観察され、96時間処理した細胞で最も劇的であった;(b)c−myc発現はMEZとIFN−β + MEZの24時間処理によりわずかに低し、96時間後に特にIFN−β + MEZで処理したHO−1細胞で有意に抑制があった;(c)PCNAとp53の両方の遺伝子発現が、IFN−β + MEZで処理した細胞でのみ低下した;そして(d)Rbレベルはいずれの処理プロトコールでも変化がなかった。cdc2とHLAクラスI抗原では、IFN−β + MEZによりこれらの遺伝子の転写速度が低下した。同様に、IFN−β + MEZによりcdc2とヒストン1のmRNAの安定性が低下した。FACS解析による細胞サイクル分布の解析は、MEZとIFN−β + MEZの両方が48時間処理でDNA合成しているHO−1細胞の数が低下することを示した。DNA合成の最も有効な阻害剤はIFNβ + MEZであった。これらの結果は、IFN−β + MEZによるHO−1細胞の最終分化誘導は、転写および転写後レベルの両方で起きる特定の細胞サイクル関連遺伝子の抑制に関連することを示している。
前述のようにIFN−β + MEZで96時間連続的に処理すると、HO−1ヒト・メラノーマ細胞で最終分化が起きる。この過程は、遺伝子発現の変化の特定のパターン(2つのインターフェロン刺激遺伝子であるISG−15とISG−54、およびメラニン細胞増殖刺激活性(gro/MGSA)を含む)に相関する(14)。これらの観察結果は、分化と最終分化の可逆的動機付けの誘導は、分化促進因子(DPF)(おそらくIFN−βまたはIFN−β様サイトカインおよびメラノーマ増殖刺激活性(gro/MGSA)を含む)の産生に関連していることを示唆した。これらのDPFは次に自己分泌性機構により、分化が可逆的に拘束されたまたは最終分化したHO−1細胞で、インターフェロン刺激遺伝子(ISG)とgro/MGSA遺伝子の転写と定常状態のmRNA発現を誘導することができた。処理時間と分化誘導の関係をさらに調べるためにそして自己分泌性仮説を検定するために、本出願人は2つの実験を行った。第1のセットの実験(In-Out)では、HO−1細胞を種々の薬剤(IFN−β + MEZ、MPA+MEZ、RA+MEZおよびMEZ(50ng/mlの高濃度で)を含む)で24時間処理し、細胞をFBSのないDMEMで2回洗浄し、培養物に10%FBS含有DMEMを添加し、72時間後全細胞性RNAを単離した。第2のセットの実験(馴らし培地)では、In-Out実験で記載のように細胞を処理したが、誘導剤の非存在下で72時間増殖させた後培地を集めた(そして混入している細胞を遠心分離により除去した)。
2つの類似のまたは異なるタイプの細胞の間の差別的に発現される遺伝子の同定を単離は、サブトラクション・ハイブリダイゼーションを用いて容易に達成される(概説57、58)。好感度で高効率的なサブトラクトされたライブラリーを作成する方法が開発されている(49)。IFN−β + MEZで処理したHO−1細胞で差別的に発現される遺伝子の同定へのこの方法の応用を、図8に要約する。テスターおよびドライバーcDNAライブラリーを、市販のλUni−ZAPファージベクターに方向を決めてクローン化した。次にライブラリーの大量切り出しにより調製した2本鎖テスターDNAと1本鎖ドライバーDNAの間でサブトラクション・ハイブリダイゼーションを行った。サブトラクトされたcDNAはλUni−ZAPファージベクターに効率的にクローン化され、これはスクリーニングと遺伝子性状解析のための扱いが容易であった。この方法の応用可能性は、IFN−β + MEZによる処理で最終分化を誘導したヒト・メラノーマ細胞(HO−1)中で発現増強を示すcDNAの同定により証明された(図10)。IFN−β + MEZ処理(Ind+)cDNAからの未処理HO−1対照(Ind-)cDNAの1回のサブトラクションにより、未処理細胞と分化誘導剤処理HO−1細胞(メラノーマ分化関連(mda)cDNAと呼ぶ)との間で差別的発現を示す一連のcDNAが産生された。前記で略述した方法を用いて、全部で23の差別的に発現されるmda cDNAを単離したが、これはサブトラクトしたHO−1 IFN−β + MEZ cDNAライブラリーの一部のみである。これら23のmda遺伝子の部分的配列解析により、ヒトTPA誘導性遺伝子、ヒトアポフェリチンH遺伝子、IFP−53(ガンマ−2タンパク)遺伝子、インターロイキン−8(単球由来走化性因子)遺伝子、ビメンチン(vimentin)遺伝子、hnRNP A2タンパク遺伝子、ヒトマクロファージ炎症性タンパク(GOS19−1)遺伝子およびIFN−β誘導性遺伝子ISG−56を含む公知の遺伝子が同定された。さらに、従来のどの遺伝子データベースにも報告されていない配列を有する6つのcDNAが同定された。使用したサブトラクションプロトコールに基づいて予測されるように、mda遺伝子のいくつかは、IFN−βおよびIFN−β + MEZ(例えば、mda−1およびmda−2);MEZおよびIFN−β + MEZ(例えば、mda−3);IFN−β、MEZおよびIFN−β + MEZ(例えば、mda−4);およびIFN−β + MEZのみ(例えば、mda−5とmda−6)により、24時間以内に誘導される(図10)。おそらく重要な群のmda遺伝子は、IFN−β + MEZで96時間処理したHO−1細胞で有意な発現増強と最終細胞分化を示すcDNAにより示される(すなわち、mda−5、mda−6、mda−7およびmda−9)(すべて新規の遺伝子である)(図15)。ヒト・メラノーマ細胞における増殖制御を理解するのに有用な、最終分化したHO−1細胞とIFN−β + IFN−γによる処理で増殖の可逆的抑制を受けるように誘導されたHO−1細胞の両方で発現される、追加のmda cDNAが単離されている(すなわち、mda−4、mda−5、mda−7、およびmda−8)(図15)。増加したmda遺伝子発現はまた、IFN−β + MEZ処理で最終分化するように誘導した追加のヒト・メラノーマで誘導されるため、IFN−β + MEZ処理後のいくつかのmda遺伝子の発現増加はHO−1細胞に限定されない(非掲載データ)。前述の試験は、ヒト・メラノーマ細胞で最終分化を直接媒介するかまたはそのマーカーである遺伝子を同定するためのサブトラクション・ハイブリダイゼーション使用の実行可能性を示している。
ウェルチ(Welch)ら(42)の最近の研究は、C8161ヒト・メラノーマ細胞株に正常の第6染色体を挿入(ミクロセル染色体置換法による)すると、ヌードマウスで転移性が抑制されるが腫瘍形成能は抑制されないことを示す。C8161細胞をIFN−β + MEZ(1000単位/ml+10ng/ml)で4日間または7日問処理すると、最終細胞分化が起きる。これに対して同様の条件下で、第6染色体を有するC8161細胞(クローン6.1、6.2および6.3)は形態変化と増殖抑制を示すが、増殖性を保持する(すなわち、薬剤の組合せは可逆的最終分化に対して分化の可逆的動機付けを誘導する)。6.1、6.2および6.3細胞の最終分化の欠如は、試験薬剤を除去し誘導剤のない培地での増殖により証明された(非掲載データ)。親株C8161細胞および6.1、6.2および6.3細胞の遺伝子発現の解析は、正常の第6染色体の存在と相関する差異を示した。IFN−β + MEZを単独でおよび組合せて4日間インキュベート後の遺伝子発現の具体的な差異は:(a)MEZおよびIFN−β + MEZで処理したC8161細胞(6.1、6.2および6.3細胞ではそうではない)でのIL−8mRNAの誘導(これはIFN−β + MEZで処理したHO−1細胞中でmda cDNAとして同定された):(b)C8161細胞でのIFN−β、MEZおよびIFN−β + MEZによるHLAクラスI抗原mRNAの誘導(6.1、6.2および6.3細胞ではIFN−βとIFN−β + MEZによってのみ);および(c)IFN−βおよびIFN−β + MEZで処理したC8161細胞対6.1、6.2および6.3細胞でのISG−15発現の誘導の低下がある。前記の概説した研究は、IFN−β + MEZは、より分化した6.1、6.2および6.3細胞より分化の少ない転移性C8161メラノーマ細胞で最終分化誘導がより有効であることを示している。このモデル系は、ヒト・メラノーマ細胞の腫瘍形成および転移性表現型の発現における特定のmda遺伝子の役割を決定するのに有用となるはずである。
A.具体的な目的#1:メラニン細胞、母斑、放射増殖相メラノーマ、垂直増殖相メラノーマおよび転移性メラノーマ細胞における、メラノーマ分化関連(mda)遺伝子の発現のパターンと制御を調べる。
本出願人は、ヒト・メラノーマ細胞は異常な分化パターンを示し、適当な化学処理により生存性を失わず増殖活性を不可逆的に喪失する(すなわち、最終細胞分化)ように誘導することができるという仮説を検証した(10、11、14)。IFN−β + MEZの組合せを用いて本出願人は、最終分化するようにヒト・メラノーマ細胞の再プログラミングをインビトロで達成できることを証明した(10、11、14)。第2の仮説(すなわち、最終分化は遺伝子発現の特定のプログラムの選択的活性化に関連している)に基づき、本出願人は最終細胞分化を起こすような条件下で発現増強を示す遺伝子を同定するための修飾サブトラクション・ハイブリダイゼーション・プロトコールを開発し使用した(49)。これらの研究からこのような特異性を示すメラノーマ分化関連(mda)遺伝子と呼ぶ、一連の遺伝子をクローニングした。この研究の目的は:(a)HO−1メラノーマ細胞で制御のレベルに関してmda遺伝子を性状解析する(すなわち、誘導の転写対転写後の機構);(b)特定のmda遺伝子の発現がメラノーマ発生の規定された段階に相関するか否かを決定する;(c)増殖の停止したおよび最終分化したヒト・メラノーマ細胞中で発現増強を示す追加のmda遺伝子を同定するためにサブトラクトしたIFN−β + MEZ cDNAライブラリーのスクリーニングを続ける;および(d)最終分化が誘導されたHO−1細胞中で高レベルに発現される遺伝子を濃縮する追加のサブトラクション工程を用いることである。
とのin situハイブリダイゼーション法を、メラニン細胞系統の組織試料中のbFGFの差別的発現の測定に使用して成功している。臨床試料におけるmda遺伝子発現を測定するための追加の方法として、メラノーマ発生の異なる段階を示す患者試料から直接単離したRNA(ハーリン博士(Dr.Herlyn)により提供される)をノーザン解析(14、49)により評価し、必要な場合はmda遺伝子の発現のためのRT−PCR(65)により検出感度を上昇させる。上皮増殖因子受容体の発現を解析するための以前の試験で、患者から得られた広範囲のヒト中枢神経系腫瘍が評価された(66)。この試験結果は、無傷の高品質のRNAが患者試料から効率的に得られ、遺伝子発現比較試験に使用できることを、明白に示した。
および転移性ヒト・メラノーマとして多くの同じ増殖因子遺伝子を発現する(20)。予備試験で考察したように、本出願人はIFN−β + MEZ処理したC8161細胞およびミクロセルトランスファー正常第6染色体を含有するC8161細胞(6.1、6.2および6.3)の遺伝子発現の変化を解析し始めた。C8161細胞と異なり、6.1、6.2および6.3細胞はヌードマウスで転移性ではなく (42)、C8161細胞で最終分化を引き起こすのと同じ濃度のIFN−β + MEZで処理しても最終分化は誘導されない。従って6.1、6.2および6.3は、メラノーマ発生においてより進行していない段階に逆戻りしたヒト・メラノーマ細胞であるかも知れない。既に考察したように、RGPまたは早期VGP初期ヒト・メラノーマは外科的に除去することにより治療できるため、同じ早期段階のメラノーマ由来のより悪化した変種を解析することは不可能であった。カーベル博士(Dr.Kerbel)と共同研究者(25)は、RGPと早期VGP初期ヒト・メラノーマをマトリゲルと組合せてヌードマウスに注射して潜在的にこの問題を解決した。次に発生した癌は、マトリゲルの必要なしでヌードマウスで腫瘍形成能であることが見いだされ、それらはまたメラノーマ進行に関連する「サイトカイン耐性表現型」を獲得した(25、70)。これら3つの細胞系は、mda遺伝子がメラノーマ進行の特定の段階に相関するか否かを決定するのに極めて有用となるであろう。この可能性を検討するために、本出願人は段階特異的細胞株を用いて前述(4.A.1.a)の実験と類似の実験を行う。もしIFN−β + MEZに対するメラニン細胞系統細胞の応答は段階特異的であるという我々の仮説が正しいなら、増殖、mda遺伝子発現および最終細胞分化に及ぼすこれらの薬剤の作用は、10Wras/早期より10Wras/後期で、C8161クローンを有する第6染色体よりC8161細胞で、そしてあまり進行していないRGPと早期VGP初期メラノーマ細胞株よりより進行したメラノーマ細胞株で大きいことが予測される。
ヒト・メラノーマ細胞、および他のタイプの細胞(例えば、筋芽細胞、神経芽細胞および白血病細胞)の最終分化誘導は、増殖能力の不可逆的喪失に関係がある(概説13、71)。従って本出願人が同定したmda遺伝子のいくつかは、増殖関連変化を誘導する種々のDNA障害剤および化学療法剤で処理した増殖抑制メラノーマ(および他のタイプの細胞)またはメラノーマ細胞で発現増強を示すことが当然推定される。確かに、予備試験は、mda−4、mda−5およびmda−8は最終分化したHO−1細胞およびIFN−β + IFN−γによる処理で可逆的増殖抑制を受けるように誘導されたHO−1細胞中で発現増加を示すことを示す(50)。さらにmda−4はまた、カフェイン酸フェネチルエステル(72)、ビンブラスチン(vinblastine)、腫瘍壊死因子−αおよびX−照射で可逆的に増殖抑制されたHO−1細胞中で発現増加を示す。HO−1細胞およびIFN−β + MEZで処理された転移性ヒト・メラノーマ細胞(すなわち、これらはメラノーマ特異的であるようである)または増殖活性を喪失するように誘導されたHO−1細胞および異なるタイプの細胞(ヒト乳癌および大腸癌を含む)(すなわち、これらは増殖特異的または分化特異的であり、メラノーマ特異的ではないようである)でのみ発現増強を示す追加のmda遺伝子が同定されている。これらの予備的観察結果に基づき、特定のmda遺伝子は、増殖可能性を喪失し最終分化するように誘導されたメラノーマ系統細胞に限定され、他のmda遺伝子は多様なタイプの細胞の増殖抑制過程に関与している中心的な遺伝子かも知れない。従って特定のmdacDNAの発現の変化が最終分化するように誘導されたヒト・メラノーマ細胞に限定されているか、またはそれらが最終分化、DNA障害および増殖停止の他のプログラムの間に修飾発現を示すか否かを決定することは重要であろう。以下の試験は、(a)ヒト・メラノーマ細胞および他のタイプの細胞でmda遺伝子発現の増強を誘導する細胞の変化の範囲、(b)他のタイプの細胞の増殖抑制と最終分化の誘導は特定のmda遺伝子の発現増強を起こすか否かを決定するために計画される。
特定のmda遺伝子の機能的な意義を解析するには、全長cDNAの単離が必要である。一旦特定のmda遺伝子の全長cDNAが同定されると、以下の用途に使用することができる:(1)インビトロ翻訳系を使用してそのコードするタンパクを産生する;(2)コードするタンパクのペプチド領域に特異的なポリクローナル抗体を作成する;(3)患者のヒト・メラノーマ細胞および組織切片におけるmda遺伝子産物の位置を測定する;(4)増殖抑制および最終分化の誘導に及ぼすmda遺伝子の過剰発現の影響を決定する;および(5)増殖抑制と最終細胞分化を誘導するIFN−β + MEZの能力に及ぼすmda遺伝子発現の阻止(アンチセンスオリゴマー又は発現ベクター作成体を使用して)の影響を決定する。全長mdaのcDNAを同定し、その全長mdaのCDNAをインビトロで翻訳し、コードするタンパクの特異的ペプチドに対する抗体を産生し、コードするタンパクの位置を測定し、そしてセンスおよびアンチセンスオリゴマーと発現ベクター作成体を作成して、HO−1およびその他のタイプの細胞における増殖と分化に及ぼすこれらの影響を解析するために使用される方法を以下に説明する。
mda遺伝子の転写調節の基になる機構を解明するために、これらの遺伝子のプロモーター領域を解析することが必要である。これは、化学誘導、自己調節、組織特異的調節および発生調節を含むmda遺伝子の調節制御を決定する目的の研究には重要なことである。一旦mda遺伝子の適切なプロモーターが単離されると、特定のシス調節性要素に結合してmda遺伝子の発現を活性化または抑制する同等なトランス調節性因子(核タンパク)を同定するための試験を行うことができる。以下に略述される実験は、以下の目的で計画される:[a]特定のmda遺伝子のプロモーター領域をクローン化して、未処理のおよびIFN−β + MEZで処理したメラノーマ細胞におけるこれらの機能を解析するため;[b]ヒト・メラノーマ細胞におけるIFN−β + MEZ誘導を担当する特定のmda遺伝子のプロモーター領域中のシス調節性要素を同定するため;および[c]mda遺伝子の発現を活性化(または抑制)するトランス調節性要素を同定して性状解析するため。
mda−1: IFN−βおよびIFN−β + MEZで処理した24時間後のHO−1細胞中で発現増強を示す新規な遺伝子。IFN−β + MEZで96時間処理したHO−1細胞では発現が減少する。(HJ3−13)。
このcDNAは新規である(種々の遺伝子データベースの解析では、mda−4の配列はヒト・インターフェロン・ガンマ誘導性タンパクと68.5%相同である)。
組換えヒト繊維芽細胞インターフェロン(IFN−β)(2,000単位/ml)、メゼレイン(MEZ)(10ng/ml)およびIFN−β + MEZ(2,000単位/ml+10ng/ml)の組合せで24時間処理したHO−1細胞ではより著しく発現が増加する。
mda−4の発現の増加は、HO−1、LO−1、SH−1、WM278およびWM239ヒト・メラノーマ細胞においてIFN−β + MEZによる24時間処理後に起きる。mda−4は、メラニン性FO−1ヒト・メラノーマ細胞またはC8161ヒト・メラノーマ細胞またはC8161/6.3細胞(挿入された正常なヒト第6染色体を含有するC8161ヒト・メラノーマ細胞クローン:これらの細胞はヌードマウスにおいて腫瘍形成能であるが、親株C8161細胞とは異なりこれらは非転移性である)において発現されないか、または誘導されない。
mda−4は正常小脳、GBMまたは正常皮膚繊維芽細胞では新規に発現されない。しかしIFN−β + MEZによる24時間処理後、正常小脳およびGBMの両者では誘導され、正常皮膚繊維芽細胞では誘導されない。
mda−4は、種々の癌細胞において新規に発現されず、そしてIFN−β + MEZによる24時間処理後にこれらの細胞で誘導されない。mda−4はヒト癌細胞において発現されない。
IFN−β(2,000単位/ml)、IFN−α(2,000単位/ml)、IFN−β + MEZ(2,000単位/ml+10ng/ml)、IFN−α+MEZ(2,000単位/ml+10ng/ml)、シスプラチン(0.1μg/ml)、ガンマ線照射(3グレイで処理し、24時間後解析)による24時間処理。さらに、UV(10ジュール/mm2、そして24時間後測定)によりHO−1細胞における発現は増加する。
このcDNAは新規である(これは、ホモサピエンスの推定で転写された部分配列[受け入れ番号Z20545;UK−HGMP、エムアールシー・ヒトゲノムマッピングプロジェクトリソース(MRC Human Genome Mapping Project Resource)、センタークリニカルリサーチセンター(Centre Clinical Research Centre)、ワットフォードロード(Watford Road)、ハロー、ミドルセックス、イングランドHA1]に配列相同性を有する)。
組換えヒト繊維芽細胞インターフェロン(IFN−β)(2,000単位/ml)、および大部分はIFN−β + MEZ(2,000単位/ml+10ng/ml)の組合せで24時間処理後に発現が増加する。
この遺伝子の発現は、IFN−β + MEZにより24時間処理した、HO−1、C8161、C8161/6.3(挿入された正常ヒト第6染色体を含有するC8161ヒト・メラノーマ細胞クローン:これらの細胞はヌードマウスにおいて腫瘍形成能であるが、親株C8161細胞とは異なりこれらは非転移性である)、FO−1、LO−1、SH−1、WM278およびWM239ヒト・メラノーマ細胞において増加する。この遺伝子は、不死化ヒト・メラニン細胞FM5169(SV40により形質転換された)において構成的に発現される。FM5169では、24時間のIFN−β + MEZ処理により、ある程度の上方調節が観察される。
mda−5は正常小脳では新規に低いレベルで発現するが、GBMまたは正常皮膚繊維芽細胞ではそうではない。しかしIFN−β + MEZによる24時間処理後、正常小脳では発現が増加(>10倍)し、GBM(小さい誘導)および正常皮膚繊維芽細胞(良好な誘導)では発現が誘導される。
mda−5は、結腸直腸癌(SW613)と子宮内膜腺癌(HTB113)において新規に発現しないが、一方前立腺癌(LNCaP)では低いレベルで発現する。
IFN−β(2,000単位/ml)、IFN−α(2,000単位/ml)、IFN−β + MEZ(2,000単位/ml+10ng/ml)およびIFN−α+MEZ(2,000単位/ml+10ng/ml)による24時間処理により、HO−1細胞における発現が増加する。
mda−6は、サイクリン(cyclin)依存性キナーゼの阻害剤である分子量21,000タンパク(p21)をコードするWAF1、CIP1、SDI1と同一である。
組換えヒト繊維芽細胞インターフェロン(IFN−β)(2,000単位/ml)、MEZ(10ng/ml)およびIFN−β + MEZ(2,000単位/ml+10ng/ml)の組合せで24時間処理したHO−1細胞では最大に発現が増加した。
IFN−β + MEZにより24時間処理した、HO−1、C8161、C8161/6.3(挿入された正常ヒト第6染色体を含有するC8161ヒト・メラノーマ細胞クローン:これらの細胞はヌードマウスにおいて腫瘍形成能であるが、親株C8161細胞とは異なりこれらは非転移性である)、FO−1、LO−1、SH−1、WM278およびWM239ヒト・メラノーマ細胞において、この遺伝子の発現の種々の増加が起こる。この遺伝子は不死化ヒト・メラニン細胞FM516−SV(SV40により形質転換)において構成的に発現される。FM516−SVでは、24時間のIFN−β + MEZ処理により、ある程度の上方調節が観察される。
mda−6は、正常小脳および正常皮膚繊維芽細胞において高レベルで新規に発現される。mda−6は、GBM細胞においては有意なレベルで発現しない。
mda−6は、結腸直腸癌(SW613)および前立腺癌(LNCaP)において新規に高レベルで発現される。子宮内膜腺癌(HTB113)におけるmda−6の新規な発現は低い。IFN−β + MEZによる24時間の処理は、結腸直腸癌(SW613)および前立腺癌(LNCaP)におけるmda−6の発現に有意な変化を与えない。IFN−β + MEZによる24時間の処理により、子宮内膜腺癌(HTB113)におけるmda−6の発現は、結腸直腸癌や前立腺癌と同等のレベルに誘導される。
IFN−β(2,000単位/ml;24時間)、MEZ(10ng/ml;24時間)、IFN−β + MEZ(2,000単位/ml+10ng/ml;24時間)、アクチノマイシンD(5μg/ml;2時間処理後24時間増殖)、アドリアマイシン(0.1μg/ml;24時間)およびVP−16(5μg/ml;24時間)による処理によりHO−1細胞における発現は増加する。最高レベルの誘導は、24時間または96時間のIFN−β + MEZ処理;およびアクチノマイシンD、アドリアマイシンおよびVP−16で24時間処理したHO−1細胞において観察される。
mda−7は新規なcDNAである(この配列は、種々のDNAデータベースの既に報告されている遺伝子と相同性がない)。
組換えヒト繊維芽細胞インターフェロン(IFN−β)(2000単位/ml)、MEZ(10ng/ml)およびIFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml)ではより著しく、HO−1細胞の24時間処理後、mda−7の発現は増加する。
mda−7の発現は、IFN−β + MEZにより24時間処理した、HO−1、C8161、C8161/6.3(挿入された正常ヒト第6染色体を含有するC8161ヒト・メラノーマ細胞クローン:これらの細胞はヌードマウスにおいて腫瘍形成能であるが、親株C8161細胞とは異なりこれらは非転移性である)、FO−1、LO−1、SH−1、WM278およびWM239ヒト・メラノーマ細胞において増加する。この遺伝子は、不死化ヒト・メラニン細胞FM5169(SV40により形質転換された)において構成的に発現される。しかしFM5169では、24時問のIFN−β + MEZ処理により発現の増加は観察されない。
mda−7は正常小脳、GBMまたは正常皮膚繊維芽細胞において新規に発現されない。
mda−7は、結腸直腸癌(SW613)、子宮内膜腺癌(HTB113)または前立腺癌(LNCaP)において新規に発現されない。
IFN−β(2000単位/ml;24時間)、MEZ(10ng/ml;24時間)、IFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml;24時間および96時間)、IFN−α+MEZ(2000単位/ml+10ng/ml;24時間)、アドリアマイシン(0.1μg/ml;24時間)、ビンクリスチン(0.1μg/ml;24時間)、およびUV(10ジュール/mm2、24時間後測定)による処理によりHO−1細胞におけるmda−7の発現は増加する。またmda−7は、MPA(3μM)、IFN−β + IFN−γ(1000単位/ml+1000単位/ml)、MPA+MEZ(3μM+10ng/ml)およびRA+MEZ(2.5μM+10ng/ml)による96時間処理後にも誘導される。最高レベルの発現は、IFN−β + MEZにより24または96時間処理したHO−1細胞において観察される。
mda−8は、新規なcDNAである(この配列は、種々のDNAデータベースの既に報告されている遺伝子と相同性がない)。
IFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml)の組合せによる24時間処理後、HO−1細胞においてmda−8の発現が増加する。
IFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml)により24時間処理した、HO−1、C8161およびWM278ヒト・メラノーマ細胞においてmda−8の発現が増加する。
mda−8は、正常小脳において新規に発現されるが、GBMでは発現されない。
mda−8は、結腸直腸癌(SW613)、子宮内膜腺癌(HTB113)および前立腺癌(LNCaP)において新規に発現される。
IFN−β(2000単位/ml;24時問)、アクチノマイシンD(5μg/mlで2時間、24時間後に測定)、アドリアマイシン(0.1μg/ml;24時間)、シスプラチン(0.1μg/ml;24時間)およびUV(10ジュール/mm2、2、14および24時間後測定)による処理後にmda−8の発現は増加する。
mda−9は、新規なcDNAである(この配列は、ヒトトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNAと、138塩基対中55.1%の相同性を示す;GB−Pr;Humtgfbc)。
IFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml)の組合せによるHO−1細胞の24時間処理後にmda−9の発現は増加する。
IFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml)により24時問処理したHO−1およびC8161ヒト・メラノーマ細胞においてmda−9の発現は種々に増加する。
IFN−β(2000単位/ml;24時間)、MEZ(10ng/ml;24時間)、IFN−β + MEZ(2000単位/ml+10ng/ml;24および96時間)、酪酸フェニル(4mMPB、24時間、4日間または7日間)、ガンマ線照射(3グレイで処理し、24時間後に解析)、TNF−α(100単位/ml;24時間)、IFN−α(2000単位/ml)、IFN−α+MEZ(200単位/ml+10ng/ml)、VP−16(5μg/ml;24時間)またはUV(10ジュール/mm2、2または14時間後測定)により処理したHO−1細胞においてmda−9の発現が増加する。
mda−1:IFN−βおよびIFN−β + MEZで処理したHO−1細胞において24時間後、発現の増加を示す新規遺伝子(HP2−36)。(ジャングとフィッシャー(Jiang and Fisher),Molecular and Cellular Differentiation,1(3),印刷中,1993)。
発ガン過程は、相互に関係する一連の段階を通して進行する事が多く、多くの遺伝子的変化及び環境因子によって調節される(1-6)。この多段階過程の各構成要素を制御している特定の事象をまだ明かにされずに残されているけれどもが、多くの癌細胞において繰り返し現れるテーマは、分化の異常パターンである(7-10)。加えて、癌細胞が進化し、最終的に新規表現型を発現するにつれ、または、先在する形質転換に関連した表現型の発現が増加するにつれ、分化関連形質の発現の程度が、減少していく事がよくある。悪性のメラノーマは、腫瘍の進行の過程を具現しており、転移表現型を選択する性質および転移細胞が成長を優先的させる特質が強い(11-14)。北アメリカ人口集団で発生している多くのタイプの内、メラノーマは、最も速いスピードで増加しており、現在生まれる子供の100人に1人という多くの子供が、表面拡張型メラノーマを偶発発生していると推定されている(11)。メラノーマは、初期段階では簡単に治療できるけれども、悪性メラノーマの進行した段階では、外科的及び化学的治療の介入は、患者における疾病の転移及び死を防ぐことに事実上効果がない。これらの所見によって、転移性メラノーマ罹患者をより有効に治療するために、治療的アプローチを改良しなければならない事が強調される。
HO−1細胞における最終分化の過程には、細胞表現型及び遺伝子発現における多くの変化が伴う(18、21、23、35)。生物化学的変化及び細胞質変化としては、成長抑制、メラニン合成における変化(生化学的分化)及び抗原性の変化(免疫学的分化)があげられる(18、21、23、29、34、35)。成長及び分化を構成する様々な要素とそれに対応するヒトメラノーマ細胞において誘導される遺伝子発現の変化の間の関係は、これらの過程の異なる構成要素を誘導する特殊な化合物を確定する事に助けられて、明らかにする事ができる(図21A−H)(18、21、23、33、36)。
造血細胞の分化中に成長停止を行なうに重要と思われる因子は、自己分泌IFNーβである(37ー39)。自己分泌IFNーβが造血細胞分化に関連していることは、(a)IFNーβの中和抗体が、造血細胞分化中に起こるc−mycレベルの低下を阻害し、成長抑制を部分的に阻害するという所見(b)ミエロイド分化中にインターフェロンの調節因子I(IRFー1)が誘導される事、(c)IRF−1のアンテイセンス・オリゴマーによる成長阻止が部分的に逆転し、インターロイキン6及び白血病阻止因子による白血病細胞において分化誘導が起こる事、及び(d)造血細胞において、最終分化中に特異的タイプIインターフェロン(IFNーα/β)遺伝子発現が誘導される事、という証拠により示唆される(37ー39)。
最終分化に至るまで誘導されたヒト・メラノーマ細胞において様々に異なる発現を行なう遺伝子を確認するために、出願人は、サブトラクション・ハイブリダイゼーション法を改良して使用してきた(図8)(41)。cDNAライブラリーを、未処理のHO−1細胞から得たポリ(A+)RNAより調整し(Ind cDNAライブラリー;ドライバーcDNAライブラリー)、またIFN−β + MEZで2、4、8、12、24(時間)処理されたHO−1細胞から得られたポリ(A+)RNAより調整した(Ind-cDNAライブラリー、テスターcDNAライブラリー)。テスター及びドライバーcDNAライブラリーは、商業的に入手可能なλUni−ZAPファージベクター中に方向性をもって(directionally)クローンされた。次に、サブトラクション・ハイブリダイゼーションを、二重鎖テスターDNAとライブラリーの大量切開によって調整された単鎖ドライバーDNAの間実行した。サブトラクトされたcDNAは、スクリーンニング操作も遺伝子定性操作もし易いλUniーZAPフアージベクター中に有効にクローンされた。未処理のHO−1コントロール(Ind)cDNAsのINF−β+MEZ処理された(Ind+)cDNAsからのサブトラクトを一回行なった結果、未処理のHO−1細胞中では、分化誘導剤処理したHO−1細胞と比較して異なる発現を示す一連のcDNAsが確認された。これらのcDNAsは、メラノーマ分化関連(mda)cDNAsと呼ばれる。最初は、70cDNAのクローンを分析し、23のクローンがIndーとInd+処理されたHO−1細胞との間で遺伝子発現に差を示すことがわかった(41)。予想されたように、コントロールHO−1cDNAsをINF−β+MEZ処理されたHO−1cDNAsからサブトラクトすると、様々な誘発剤で24時間処理した後に発現の増加を示す一連のMDA遺伝子となった。IFN−βのみならず、IFN−β + MEZ(mda−1及びmda−2)、MEZ及びIFN−β + MEZ(mda−3)、IFN−β、MEZおよびIFN−β + MEZ(mde4)、ひいてはIFN−β + MEZ(mda−5及びmdaー6)で処理されたHO−1細胞中で発現の増加を示す遺伝子が含まれていた(図10)(41)。これらの6つのmda遺伝子の中で、mda−3だけは、先に確認されていた遺伝子GOSー19ー1であった(41)。他の8つのヒト・メラノーマ細胞系を分析したところ、IFN−β + MEZで24時間処理したところ、特殊なmda遺伝子が発現を増加させる事もわかった(データ表示せず)。
細胞サイクルの調節は、サイクリン依存キナーゼ(CDKs)と呼ばれる一連の関連酵素を順序良く活性化させた結果行われる(42)。通常の細胞において、CDKsは、CDK,サイクリン、増殖細胞核抗原(PCNA)及びp21タンパクから構成される4重の複合体中で優先的に見られる(43、44)。p21は、CDK活性をコントロールし、これによってほ乳類細胞における細胞サイクルの調節及び成長に影響を与える(43ー50)。誘導可能な野生型p53の腫瘍抑制遺伝子含むヒト・グリオブラストーマ細胞及びサブトラクション・ハイブリダイゼーションを使用して、M21、000タンパクをコードするWAF1(野生型p53活性化断片1)と呼称される遺伝子が確認された(49、50)。WAF1は、CP11(Cdk相互反応性タンパク1)と呼ばれる有力なCDK阻害剤と同じ、2つのハイブリッド系を使用して確認されたp21をコードする遺伝子である(46)。p21レベルは、老衰細胞(sdiと呼ばれる遺伝子;老衰細胞派生阻害剤)で増加が観察されている(51)。p21が過剰発現すると、腫瘍細胞の成長が阻害される(46、49、51)。野生型p53を含む細胞をDNA損傷剤で処理すると、野生型p53タンパクが増加し、p21レベルが増加する(51)。この様な状況で、p21がG1成長停止に直接寄与していると思われ、結果として、特に目的とする細胞のDNA破壊を誘導した後、その細胞枯死をもたらすのかもしれない(51)。また、近年の研究によって、p21が、サイクリン/CDKの非存在下でPCNA依存DNAの複製を直接阻止できること;またDNAポリメラーゼδを活性化するPCNAの能力を、PCNAと直接相互反応して阻止できることが実証されている(52)。これらの研究では、p21は、成長調節、細胞サイクル進行、DNA複製及び損傷を受けたDNAの修復をするにあたって、重要な役割をする成分である事が示されている。
。ヒト・メラノーマにおいて、mda−6の発現は、最終分化中に増加し、無血清培地で培養されると急激に誘導され、高飽和密度まで生育した細胞中で増加する(53)。いくつかの証拠によると、mda−6の発現がメラノーマの進行と逆相関している事が指摘されている(53)。これらの証拠としては、(A)活発に成長しているメラノサイト及び母斑中により高レベルのmda−6が存在し、放射状及び早期垂直成長相原発メラノーマ及び転移性ヒト・メラノーマには、低レベルで存在すること(53);(B)ヌードマウス中で自律腫瘍形成または腫瘍形成拡大のために選択された早期垂直成長相原発ヒト・メラノーマ細胞中で、mda−6の発現が減少していること(53、54);(C)正常染色体6を導入した後に、転移ポテンシャルの低下を示しているヒト・メラノーマ細胞中で、mda−6・mRNAのレベルが増大(53、55)していること、があげられる。これら最近研究を合わせると、p21(mda6/WAF1/CIP1/CAP20/sdi−1)が、メラノーマ成長、進行及び転移のネガテイブ・レギュレータとして機能しているのではないかということが指摘される。
培養されたヒト・メラノーマ細胞を適切な誘導剤で処理する事によってその発達の最初の段階まで再プログラムする事は現在可能である。この過程は、分化治療の重要な構成要素であり、結果として、このような癌細胞中での増殖ポテンシャルが急速に失われ、最終分化をまねく事ができる。適切な誘導剤を使用することにより、可逆的または不可逆的(最終細胞分化)な方法で、分化プログラム中の特殊な構成要素を操作する事が可能である。この可能性により、ヒト・メラノーマ細胞において特殊な遺伝子の役割、及び成長調節における生化学的経路、分化および発ガン性を体系的に解析する事ができる有力なモデル体系がもたらされる。IFN−β + MEZの組み合わせると、ヒト・メラノーマ細胞において、成長ポテンシャルを不可逆的に喪失させ、最終細胞分化を誘導する。類似の濃度で、IFN−βまたはMEZ単独では、分化過程中のある構成成分を誘導するが、成長ポテンシャルの不可逆的喪失または最終分化を誘導しない。IFN−β + MEZで処理されたヒト・メラノーマ細胞における最終分化の過程は、特殊な生化学、構造的、免疫学的、遺伝子発現の変化を伴う。
多段階発癌プロセスは、正常な増殖阻害の制御への耐性及び分化の異常パターンを含む、細胞の表現系における個別的変化によりしばしば特徴付けられる(Fisher & Rowley,1991;Knudson,1993;Hoffman & Libermann,1994;Jiang et al.,1994)。分化調節剤により特定の癌を治療することは、増殖を抑制し、より成熟し、分化した表現系を誘導する結果となり得る(Sachs,1978;Jimenez & Yunis,1978;Waxman et al.,1988,1991;Fisher & Rowley,1991;Lotan,1993)。細胞生理学において、それらの強力な効果の基礎となるメカニズムは現在知られていない。ヒトメラノーマの場合においては、組換え繊維芽細胞インターフェロン(IFB−β)と抗白血病化合物のメゼレイン(mezerein)(MEZ)とを組み合わせることにより、増殖能力及び末端細胞の分化が非可逆的に喪失することになる(Fisher et al.,1985;Jiang et al.,1993)。サブトラクション・ハイブリダイゼーション(subtraction hybridization)を用いて組み合わせられたこのモデル系は、増殖制御および癌細胞分化の分子的な基礎を定義するために用いられている(Jiang & Fisher,1993;Jiang et al.,1994)。分化誘導とサブトラクション・ハイブリダイゼーションとを合わせた研究方法を採用することにより、メラノーマ分化関連(mda)遺伝子と称する一連の分化において発現するcDNAが同定されたが、これは増殖抑制及び末端細胞の分化(terminal cell differentiation)の関数としての昂進した発現を表す(Jiang & Fisher,1993;Jiang et al.,1994)。
多様作用性分化誘導剤による治療によりHL−60細胞においてmda−6(WAF1/CIP1/SDI1)発現に増強が起こる
HL−60は、適切な誘導剤への暴露の後に単球系列及び顆粒球系列の両方に分化するように誘導され得る、分化受容能を持つ骨髄白血病細胞系統である(Gallagher et al.,1979;Huberman & Callaham,1979;Breitman et al.,1980;Collins 1987)。HL−60細胞をマクロファージ様系列(Lotem & Sachs,1979;Rovera et al.,1979)へとコミットするTPAでHL−60細胞を処理することにより、ノザンブロッティング(図25A−B)とRT−PCR(図26A−C)との両方により検出されるmda−6発現が誘導される。TPA処理(3nM)後に誘導される発現は暴露の2時間以内に起こり、mda−6レベルの昂進は最終分化したHL−60細胞において持続する(図25A−Bおよび27A−C)。同様に、Vit D3(400nM)もまた、HL−60細胞を単球−マクロファージ様系列(Miyaura et al.,1981;Tanaka et al.,1982)Aとコミットするものであり、これは、処理1時間以内にmda−6を誘導する。また、発現の昂進は最終分化したHL−60細胞において持続する(図26A−Bおよび27A−C)。RA(Breitman et al.,1980)またはDMSO(Collins et al.,1978)によるHL−60細胞での顆粒球様表現型の誘導は、mda−6 mRNA産生をも誘導する。RA(1μM)の場合において、mda−6の誘導は3時間以内は明白であり、発現は、RA処理後6日間昂進されて持続する(図25A−B、26A−Cおよび27A−C)。また、DMSO(1%)は、3時間までmda−6を誘導し、増大した発現は細胞が最終分化する5日目においても持続する(データなし)。ヒト骨髄白血病HL−60細胞におけるマクロファージ/単球分化経路と顆粒球分化経路との両方の誘導によりmda−6発現の誘導が起こることを、それらの結果は明示する。加えてmda−6発現は、HL−60分化の初期拘束段階(the early commitment stage)の間に誘導され、最終分化した細胞において持続する。MDA−6(WAF1/CIP1/SDI1)タンパク質の増加に伴うmda−6発現の昂進を確認するために、HL−60細胞をTPA(3nM)、DMSO(1%)またはRA(1μM)により12、24、48および72時間処理した後に35Sメチオニンを用いて4時間ラベル化し、WAF1/CIP1抗体を用いて溶解産物を免疫沈降させた(図28)。タンパク質をロードするための対照として、免疫沈降によりアクチンタンパク質のレベルを定量した。HL−60細胞においてMDA−6タンパク質は検出されなかったけれども、TPAまたはRAによる12時間処理により、免疫学的に反応性を有するMDA−6タンパク質が得られた。1%のDMSOで処理されたHL−60において、MDA−6タンパク質は48時間までに最初に明らかとなる。MDA−6タンパク質のレベルは、3種類すべてのインデューサー(誘導物質)により時間とともに(in a temporal manner)大きくなり、最高のレベルは72時間の時点で明らかとなった。最も活性の高い増殖抑制剤であるのみならず、最も活性の高いMDA−6タンパク質のインデューサー(誘導物質)は、TPAであった。MDA−6のN末端ぺプチド領域に対して調製されたポリクローナル抗体もまた、分化インデューサー処理されたHL−60細胞およびヒトメラノーマ細胞由来のMDA−6を免疫沈降させた。対照的に、野生型と突然変異体との両方のp53と反応するモノクローナル抗体(PAb421)を用いたところ、HL−60細胞並びにTPA、DMSOまたはRAで処理されたHL−60細胞から調製された35S−メチオニンでラベル化された溶解産物を免疫沈降させた後には、反応性のタンパク質は検出されなかった(データなし)。分化インデューサー処理されたHL−60細胞におけるmda−6 mRNA発現の昂進を誘導することにより、p53タンパク質の非存在下でのMDA−6タンパク質レベルの昂進が起こることの直接の証拠を、これらの結果は与える。
TPAに誘導された増殖抑制及び分化に対する耐性を表すHL−60細胞の変異体の入手可能性は(Murao et al.,1983; Fisher et al.,1984; Anderson et al.,1985; Mitchell et al.,1986;Homma et al.,1986,1988; Tonetti et al.,1992)、これらの過程におけるmda−6の潜在的な関連性を評価するための有益な実験モデルを提供する。TPAの濃度を徐々に上昇させながら(3μMまで)HL−60細胞を連続的に増殖させることにより、TPA耐性HL−60変異体のHL−525を開発した(Homma et al.,1986; Mitchell et al.,1986)。これらの細胞を用いて、TPA、Vit D3およびRAによる短時間処理(1時間から12時間)及び長時間処理(1日から6日)の関数としてのmda−6発現の動力学を測定した。予想されたようにHL−525細胞は、TPA処理後にmda−6誘導に対して応答の抑制を明らかに示す(図26A−C)。3nMのTPAを用いて処理された親株のHL−60細胞は2時間以内にmda−6発現を示すが、一方、HL−525細胞における誘導は、12時間処理までは明白ではない(図26A−Cおよび27A−C)。HL−60親細胞のVit D3(400nm)処理により、12時間の試験時間にわたる継続的増加を行う1時間後にはmda−6発現を得る(図26A−C)。HL−525細胞において、mda−6発現は、Vit D3処理後2時間以内に観察され、400nMのVit D3への12時間暴露後の変異体細胞における発現レベルは、同様に1時間処理されたHL−60細胞において見られるよりも低い。RA(1μM)は、HL−60細胞において3時間後にmda−6発現を誘導し、mda−6発現のレベルは、12時間の試験時間にわたって増加する。対照的に、RA処理されたHL−525細胞においては、12時間目までmda−6の発現は明らかでない。mda−6の初期誘導に関して、TPA耐性HL−525細胞はHL−60細胞とは異なっていることを、それらの結果は示す。この、HL−525細胞におけるmda−6の初期誘導の欠如は、RA処理またはTPA処理の後に最も明らかであり、その一方で、Vit D3により、その他のインデューサーによるよりもより効果が劇的でないmda−6を誘導する能力が減衰される。それらの研究が分離(separate)RT−PCR反応を伴うために直接の定量は困難であるが、しかしながら、mda−6誘導の初期動力学及びmda−6誘導の最終レベルはともに、HL−60親細胞と比較すればHL−525細胞において減衰するようである。これらの観察は、同様の試料でのノザンブロッティング分析により補強される(データなし)。
mda−6発現の誘導が継続的なタンパク質合成を必要とするかどうかを確認するために、デノボでのタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド(CHX)の効果およびTPAで誘導されたmda−6発現を定量した(図29A−B)。CHXを用いてHL−60細胞を1、3、6または10時間処理することにより、mda−6の誘導が起こる。加えて、HL−60細胞をTPAおよびCHXにより同時に処理するとき、mda−6誘導の相対的なレベルには影響がない。HL−525細胞において、CHXもまたmda−6発現を誘導するが、しかし、HL−60親細胞においてよりも誘導のレベルが低い。対照的に、HL−525細胞をCHXおよびTPAの両方により処理すると、mda−6発現は、CHX単独によるよりも、より大きな程度まで増大する(併発)(図29A−B)。mda−6はHL−60細胞における即時初期応答遺伝子であり、誘導には進行中のタンパク質合成が必要ではないことをこれらの結果は示す。CHX単独での、HL−60におけるmda−6発現を誘導する能力及びHL−525細胞におけるより低い程度での誘導する能力は、不安定なサプレッサーによりmda−6発現を制御し得ることを示唆する。HL−525の場合においては、TPAに誘導された分化における阻害は、その不安定なサプレッサーのレベルにおける変更に関連を有するであろう。
自発的にか、または特異的な誘導剤による処理の結果としてかのいずれかにより生じた、異った細胞タイプにおける最終分化は、分裂増殖の潜在能力の不可逆的な消失と関係がある(Sachs,1978;Jimenez & Yunis,1978; Waxman et al.,1988;1991;Fisher & Rowley,1991;Hoffman & Liebermann,1994)。大半の分化モデルにおいて、特定の遺伝子発現の変化並びに増殖停止および分化の誘導を媒介するタンパク質は、定義されていないままである。サブトラクション・ハイブリダイゼーションおよびヒト・メラノーマ細胞において末端細胞分化を誘導することが可能である薬剤を用いて、その発現が増殖停止および末端細胞分化と直接の関連を有するものであるmda遺伝子を同定した(Jiang & Fisher,1993;Jiang et al.,1994)。そのような遺伝子の1つのmda−6は、サイクリン依存型キナーゼのユビキチン・インヒビターであるp21をコードするWAF1/CIP1/CAP20/SDI1と同一である(Jiang & Fisher,1993;Jiang et al.,1994)。増殖におけるp21の直接の効果を、哺乳類細胞に発現性構築物をトランスフェクトさせることにより明らかにした(El-Deiry et al.,1993; Harper et al.,1993;Jiang et al.,準備中)。p21発現の誘導は、最初は野生型p53タンパク質に依存すると考えられたけれども(El-Deiry et al.,1993,1994)、最近の研究によれば、この推定が再評価されねばならないことが示唆される(Michieli et al.,1994)。これらは、p53タンパク質を欠損するp53ノックアウトマウス由来の静止期の繊維芽細胞におけるp21発現(Michieli et al.,1994)および最終分化ヒトメラノーマ細胞においてp53mRNAおよびp53タンパク質の発現を減少させるがmda−6 mRNAおよびmda−6タンパク質の発現を増大させることを一時的に刺激するマイトジェンとしての能力を有する(Jiang et al.,準備中)。本研究においてはp21(mda−6/WAF1/CIP1/CAP20/SDI1)が、HL−60細胞における増殖停止および分化誘導の関数としてのp53タンパク質の非存在下において誘導される、即時初期応答遺伝子であるということの決定的な証拠を示す。HL−60細胞においてp21mRNA合成およびp21タンパク質を刺激するものである、単球及びマクロファージの分化を生じさせるTPAとVit D3並びに顆粒球の分化を引き出すRAとDMSOを含む、種々のインデューサーの作用力が、骨髄白血病細胞における増殖停止および末端分化の重要な要素としての、この初期遺伝子型変化を定義する。
細胞及び培養条件
起源としては、HL−60細胞はR.C.Gallo博士(ナショナル・キャンサー・インステイテュート(National Cancer Institute)、メリーランド州ベセスダ)により提供された(Collins et al.,1978;Huberman & Callaham,1979)。HL−525と称されるHL−60細胞は、5日間から8日間を休止期間として、濃度上昇(3μMまで上昇)中のTPAの存在下で102回の継代培養を行った後にHL−60細胞をクローン化することに由来する(Homma et al.,1986;Mitchell et al.,1986)。HL−525細胞変異体は、少なくとも50回から60回の継代培養(200から300細胞世代(cell generations))の間は、TPAによる細胞分化を誘導することについての耐性に関して、安定な表現型を示す。本研究において記載されている実験に先立って、TPAの非存在下で20回以上継代培養した。加湿されたインキュベーター内の5%CO2含有空気雰囲気中において37℃で、20%ウシ胎児血清、ペニシリン(100単位/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)(Grand Island Biological Co.,NY)を補ったRPMI1640培地を用いて、100−mm組織培養皿の中で細胞を増殖させた。1,25−(OH)2D3(Vit D3)およびTPAを最終濃度0.01%DMSO中に溶解し、全トランスレチノイン酸(RA)を0.1%DMSO含有培養培地中に溶解した。これらの濃度のDMSOは、細胞増殖または様々な分化マーカーの発現には影響しなかった。最終濃度0.1%のDMSOを含有する培養培地により、対照培養物を処理した。HL−60細胞およびHL−525細胞に対するDMSOの効果を試験することを目的として計画された実験をするために、組織培養培地に最終濃度1%でDMSOを添加した。CHX(10mg/ml)の貯蔵溶液を培養培地で調製した。最終濃度10μg/mlでCHXを添加した。mda−6遺伝子発現におけるタンパク質合成にとっての必要性を試験するために、30mlの培地の存在する150mmペトリ皿にHL−60細胞またはHL−525細胞(5×105細胞/ml)を撒き広げた。TPAを3nMにまで加えることの15分前に、最終濃度が10μg/mlとなるようにCHXを加えた。続いてRNAを分離し、分析するために、TPA添加後の様々な時点において細胞を収集した。
血球計数室計数法(hemocytometer chamber counting)により細胞計数を行った。OKM1抗体(ニュージャージー州ラリタン(Raritan)、Ortho Pharmaceutical Corp.)との反応性についての免疫蛍光試験を、先行技術の記載に従って実施した(Murao et al.,1983)。
Chirgwin et al.(1979)により記載されたCsClクッション(cushion)による遠心分離によりRNAを精製した。先行技術の記載(Reddy et al.,1991;Su et al.,1991;Jiang et al.,1992)にしたがって、グリオキサル/DMSOにより10μgのRNAを変性させ、1.0%アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン膜に移し、32Pラベル化mda−6プローブにハイブリッド化させ(Jiang and Fisher,1993)、次いで、上記の膜を取り去った後に32Pラベル化ラットGAPDHプローブ(Fort et al.,1985)にハイブリッド化させた。ハイブリッド化の後に、フィルターを洗浄し、オートラジオグラフィーのために暴露した(Reddy et al.,1991;Su et al.,1991;Jiang et al.,1992)。先行技術の記載(Adollahi et al.1991;Lin et al.,1994)にしたがって、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によりmda−6およびGAPDH遺伝子発現をもまた確認した。全細胞質RNAを30℃で10分間、15%グリセロール,10mMトリス(pH7.5),2.5mM MgCl2,0.1mM EDTA,80mM KCl,1mM CaCl2および1単位/ml RNasin(Promega)溶液中で、0.5単位DNase(Boehringer-Mannheim Biochemicals)/μgRNAにより処理した。フェノール−クロロホルムによりRNAを抽出し、酢酸ナトリウム/エタノールにより沈殿させ、RNAペレットをジエチルピロカーボネート処理したH2O中に再懸濁させた。1μgの全RNAを、1mMデオキシリボヌクレオチド3リン酸,4mM MgCl2,10mMトリス(pH8.3),50mM KCl,0.001%ゼラチンおよび0.2μgオリゴdTプライマーを含有する20μl中において200単位のネズミ白血病ウイルス逆転写酵素(Bethesda Research Laboratories)により逆転写した。0.2mMデオキシリボヌクレオチド3リン酸,2mM MgCl2,10mMトリス(pH8.3),50mM KClおよび0.001%ゼラチンを含有する緩衝液により、試料を100μlに希釈した。50pmolのそれぞれのプライマー、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ(Perkin-Elmer Cetus)を加え、試料を鉱物油で被覆し、95℃で5分間加熱し、95℃で2分間の変性と55℃で1分間のアニーリングと72℃で4分間のポリメライゼーション(重合)からなる条件を採用して、パーキン−エルマー・サーマル・サイクラー(Perkin-Elmer Thermal Cycler)内で20サイクルのPCRを行った。クロロホルムによる抽出の後に、20μgの生成物を電気泳動し、ナイロンフィルターにブロットし、mda−6またはGAPDHに特異的なプローブとハイブリッド化させた。mda−6についてのテンプレートプライマーはCTCCAAGTACACTAAGCACT(配列番号22)およびTAGTTCTACCTCAGGCAGCT(配列番号23)(いずれも5´から3´への方向、GenBank登録番号U09579)であり、ヒトGAPDHについてのテンプレートプライマーはCATGGCCTCCAAGGAGTAAGA(配列番号24)およびCGTCTTCACCACCATGGAGAA(いずれも5´から3´への方向、GenBank登録番号J02642)(配列番号25)であった。
先行技術の記載に基づいて免疫沈降分析を行った(Duigou et al.,1991;、Su et al.1993)。対数的に増殖しているHL−60細胞について、処理しなかったか、または10cmプレート中においてTPA(3mM)、RA(1μM)もしくはDMSO(1%)により12、24、48または72時間処理したかのいずれかを行った。メチオニン欠損培地中で37℃で1時間、培養物をメチオニン飢餓とし、細胞を、ペレット化することにより濃縮し、100pCiの[35S](NEN;特殊(Express) 35S)を有するその同じ培地1ml中において37℃で4時間ラベル化した。ラベル化した後、細胞を、氷冷リン酸緩衝生理的食塩水で2回洗浄し、RIPC(20mMトリス塩基(pH7.5),500mM NaCl,0.05%ノニデット(Nonidet)P−40,100μg/mlのフェニルメチルスルホニルフルオライドおよび0.02%ナトリウムアジド)の添加により氷上で1時間溶解させた。溶解産物をエッペンドルフ・マイクロフュージ(Eppendorf microfuge)内で、遠心分離により4℃で10分間10,000×gで清澄化させた。4×106カウント分を含有する試料を、4℃で24時間振盪しながら、2μgのWAF1/CIP1(C−19)(Santa Cruz Biotechnology)ウサギポリクローナルIgG(もしくはMDA−6ペブチド誘導ウサギポリクローナルIgG)またはアクチン・モノクローナル抗体(Oncogene Sciences)とともにインキュベートした。その翌日、30μl(充填量(packed volume))のプロテインG−アガロース複合体(Oncogene Sciences)をそれぞれのチューブに加え、4℃で振盪しながらのインキュベーションをさらにもう1時間継続した。次いで、1mlの氷冷RIPC:リン酸緩衝生理的食塩水混合液(1:1,v/v)を用いて、プロテインGペレットを5回洗浄した。30μlのSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動緩衝液を該ペレットに加え、該試料を87℃で3分間加熱した。試料を10%ポリアクリルアミドゲルにロードし、40Vで一夜流した。そのゲルは、サイズ計測するためのレインボウ(Rainbow)タンパク質マーカー(Amersham)を含んでいた。30分間、10%酢酸と10%メタノールとを合わせたものを用いることによりゲルを固定し、DMSO中で30分間インキュベートし、10% 2,5−ジフェニルオキサゾール含有DMSOを用いて30分間インキュベートし、冷水で3回洗浄し(それぞれ10分間)、乾燥し、フィルムに露光した。
ヒト繊維芽細胞インターフェロン(IFN-β)の組み換え体と抗白血病化合物、メゼレイン(mezerein、MEZ)を組み合わせると、最終分化(terminal differentiation)または完全な分化が誘導されてヒト・メラノーマ細胞での増殖能は不可逆的に失われる。完全に分化して増殖の阻止が起きているヒト・メラノーマ細胞で特異的に発現している遺伝子のcDNAを、サブトラクション・ハイブリダイゼーション法により同定した(Jiang and Fisher,1993; Jiang et al.,1994)。特異的メラノーマ分化関連(mda)cDNAであるmda-6について記述するが、この発現はメラノーマの進行度と増殖とに関して反相関関係にあった。mda-6は、分子量21キロダルトンの蛋白質(p21)(サイクリン-依存性キナーゼの阻害因子)をコードするWAF1/CIP1/SDI1と同一物であった。活発に増殖している正常なメラニン細胞、SV40で不死化したヒト・メラニン細胞、および異形母斑細胞株においては、mda-6のmRNAのレベルが上昇していた。一方、活発に増殖している放射増殖相および初期垂直増殖相にある原発性メラノーマ細胞においては、転移性ヒト・メラノーマ細胞と同様にmda-6のmRNAのレベルが減少していた。原発性および転移性メラノーマ細胞をIFN-βとMEZ とで処理すると、増殖の阻害とmda-6の発現の上昇が起きる。mda-6の発現はヒト・メラノーマ細胞が高飽和密度まで増殖したとき、もしくは無血清培地で増殖させたときにも増加する。抗p53抗体および抗p21抗体を使用することにより、増殖分化の阻止時にp53とp21の蛋白質レベルの間に反相関関係があることが分かった。[INF- + MEZ]によるHO-1ヒト・メラノーマ細胞における増殖阻止および分の阻止の誘導時には一時的に野生型のp53蛋白質レベルが減少したが、それにともなってp21のレベルが増加した。マトリゲル(Matrigel)支持によるメラノーマの増殖モデルでは、ヌードマウス内における自発型もしくは促進型腫瘍形成から分離した原発性ヒト・メラノーマ細胞の初期垂直増殖相においてmda-6の発現は減少した。転移性能を喪失した転移性ヒト・メラノーマ細胞ではヒト第6染色体の導入がおきて、mda-6のmRNAレベルが上昇する。以上をまとめると、これらの研究より、mda-6(p21)はメラノーマの増殖、進行、および転移における陰性の制御因子として機能している可能性がある。
[IFN-β+MEZ]によるヒト・メラノーマ細胞の不可逆的増殖阻止と最終分化の分子的基礎を解明するために、出願人らは、非誘導のHO-1ヒト・メラノーマ、および分化誘導因子で処理したHO-1ヒト・メラノーマのcDNAライブラリーに対して、サブトラクション・ハイブリダイゼーション技術を使用した(Jiang & Fisher,1993)。この基本的手法を用いることにより、分化誘導因子([IFN-β+MEZ])で処理し、[IFN-β+MEZ]の誘導による増殖阻止および最終分化の機能としての分化発現を示している、サブトラクションHO-1ヒト・メラノーマ・ライブラリー内にmda-6のcDNAが同定された(Jiang & Fisher,1993; Jiang et al.,1994a)。分化誘導剤で処理したHO-1 cDNAライブラリーをスクリーニングし(Jiang & Fisher,1993)、更にcDNA末端の高速増殖法(RACE)を行い(Froman et al.,1988; Loh wt al.,1989;Ohara et al.,1989)、mda-6の完全長cDNAをクローニングした(Jiang et al.,1994a)。mda-6には以下のものと同じタンパク質読み取り枠が含まれている:WAF-1(El-Deiry et al.,1993)、CIP1(Harper et al.,1993)、CAP20(Gu et al.,1993)、SDI1(Noda et al.,1994)(図30)。これらの遺伝子群は、サイクリン依存性キナーゼの遍在性阻止剤、即ちp21をコードしている。
[IFN-β+MEZ]でHO-1細胞を処理すると急速に増殖が抑えられ、この抑制は24時間以内には明かとなる(Fisher et al.,1985;Jiang et al.,1993)。これとは反対に、[IFN-β+MEZ]が単独でHO-1細胞におこす増殖の変化は小さい(Fisher et al.,1985;Jiang et al.,1993)。IFN-β単独、MEZ単独、もしくは[IFN-β+MEZ]で処理したHO-1細胞におけるp53のmRNAレベルを分析すると、処理後24時間以降では顕著な変化がなかったが、特に[IFN-β+MEZ]で96時間、最終分化したHO-1細胞を処理したときにp53の発現抑制が最大となった(Jiang et al.,準備中)。MEZはまた、96時間処理したHO-1細胞でp53のmRNAレベルの減少を誘導したが、一方IFN-βで96時間処理したHO-1細胞ではp53のmRNAの変化は起きなかった(Jiang et al.,準備中)。p53遺伝子発現の抑制のキネティクス(kinetics)は、分化誘導剤で処理したHO-1細胞でのmda-6の発現に関してのものとは反対であるので、増殖阻止と最終分化がp53とp21とのタンパク質レベルに与える影響を決定する実験を行った。
出願人らのメラノーマの異常分化モデルでの予測は、正常なメラニン細胞は特定のmda-6遺伝子群を高レベルで発現しているはずであり、原発性、転移性メラノーマ細胞では進行するにつれてより少量の発現に変わるというものである。図32に示したとおり、活発に増殖している低密度の、SV40-形質転換ヒト・メラニン細胞培養中におけるほうが、高密度に増殖しているヒト・メラノーマ細胞の培養よりもmda-6のレベルは高い。mda-6のレベルは、[IFN-β+MEZ]で処理した全てのメラノーマでそれぞれ異なったレベルで上昇している(図32)。mda-6の誘導は、[IFN-β+MEZ]で処理した対数増殖期にある、FM516-SV細胞内で起きる。しかしながら、6時間[IFN-β+MEZ]中で増殖させた後ではメラノーマ細胞のみが最終分化する(非掲載データ)。mda-6の発現レベルをメラノーマの進行との関係において評価するために、活発に増殖しているメラニン細胞(5検体)、異形母斑(1検体)、SV40-形質転換による不死化メラニン細胞培養(1検体)、RGP(1検体)、初期VGP(4検体)、原発性および転移性メラノーマ(6検体)を使って、mda-6とGAPDH(内部RNA発現の標準として)とのレベルを比較RT-PCR法で決定した(図35)。活発に増殖しているメラニン細胞と異形母斑においてmda-6の発現レベルが最も高く、原発性および転移性メラノーマにおいてmda-6の発現レベルが最も低かった。比較RT-PCR法によるmda-6の相対的発現量の定量は(GAPDH発現のとの比較で)、活発に増殖している通常のメラニン細胞におけるほうが、活発に増殖している転移性メラノーマ細胞よりも平均して4倍だけ、より多い量のmda-6を発現していることを示している(P<0.01)。これらの結果より、mda-6の発現とヒト・メラノーマの進行との間には反相関関係があることを示唆している。
同じ患者より連続して得たヒト・メラノーマ細胞株を樹立して研究するのは非常に難しいが、それは大部分のRGPや薄いCGPメラノーマを除去すると完全に治癒してしまうためである(Herlin,1990;Kerbel,1990;Clark,1991)。その結果、そのような腫瘍から、生物学的により進行した表現型を発現する遺伝的に関連した変異体を実験的に誘導することが必要となる。そのような方法の一つに、”マトリゲル(Matrigel)支持”腫瘍性増殖がある(Kobayashi et al.,1994)。例を挙げると、WM35、WM1341B、WM793として知られている、初期段階の原発性メラノーマ細胞においては、より後期の段階にあるヒト・メラノーマと比較して、ヌードマウス内における腫瘍性は全くないかほとんどない(Kobayasshi et al.,1994)。しかしながら、初期段階の細胞株を再構築済み基底膜抽出物であるマトリゲルと一緒に接種すると、ヌードマウス内で急速に腫瘍が増殖し、二次ヌードマウスに接種したときにすぐに腫瘍として根付く亜株の誘導が起きる(Kobayashi et al.,1994)。このような腫瘍性マトリゲル進行性亜株は、相対的mda-6の発現の様な種々の性質に関して、ほとんどもしくは全く腫瘍性でない親株の細胞との比較をすることができる。図36に示されたように、マトリゲル進行性亜株であるWM35、WM1341B、WM793において、RT-PCR法で決定されたmda-6のレベルは、元の親株由来の細胞株と比較して、それぞれの株で独自のレベルだけ減少している。mda-6の発現の相対的抑制度は、WM793株のシリーズにおいて最も大きく、マトリゲルの非存在下のヌードマウスにおいて新規の腫瘍性能が低いということで示されるように、これらの細胞株ではより進行した表現型を示している。これは。最小の発現抑制はマトリゲル-進行性 WM35RGP原発性メラノーマ細胞において生じる(図36)。親株、並びにマトリゲル-進行性RGPおよび、初期VGPメラノーマを[IFN-β+MEZ]で処理すると、mda-6の発現が増大し(ノーザンブロティングで決定)、増殖阻止が起きる(非掲載データ)。これらの結果は、mda-6の発現とヒト・メラノーマの進行およびメラノーマの増殖との間には相反する関係があることを更に支持する。
腫瘍性および転移性のヒト・メラノーマ細胞であるC8161に正常なヒト第6染色体を挿入すると、腫瘍性を保持したまま転移性が消出する(Table5)(Welch et al.,1994)。これらの結果は、第6染色体には、C8161細胞をメラノーマ発生の進行度がより低い段階へと逆戻りさせるサプレッサー遺伝子が含まれていることを示唆している(Welch et al.,1994)。もしもmda-6の発現とメラノーマの進行性との間に直接的な相関関係があるのならば、活発に増殖しているC8161細胞は、活発に増殖している第6染色体を含んだC8161細胞よりも低レベルのmda-6を合成することになる。予期したとおり、第6染色体を含む3つの独立したC8161細胞株では、mda-6の発現が増大している(図37)。加えて、C8161とneo6/C8161雑種クローンを[IFN-β+MEZ]で96時間処理すると、増殖の阻止が起き(Tab1e5)、mda-6のmRNAの発現量が増える(図37)。これらの結果から、ヒト・メラノーマ細胞における増殖阻止および転移性阻止と、mda-6(p21)の増大した発現との間には直接的な関係があることが分かる。
メラノーマの発生および進行を媒介するゲノムの特異的な変化についてはまだ分かっていない(Herlyn,1990; Kerbel,1990;Clark,1991)。直接的にこの問題を解決するため、またヒト・メラノーマ細胞において増殖制御と分化に関わる遺伝子のクローニングをはじめるため、出願人らはサブトラクション・ハイブリダイゼーション法を利用した(Jiang & Fisher,1993; Jiang et al.,1994a)。cDNAライブラリーは未処理ヒト・メラノーマ細胞であるHO-1から作成し、このcDNAライブラリーから[IFN-β+MEZ]で処理して増殖能と最終分可能を不可逆的に失わせたHO-1細胞より得たcDNAライブラリーを差し引いた(Fisher et al.,1985;Jiang & Fisher,1993;Jiang et al.,1993,1994a)。この方法で、ヒト・メラノーマ細胞で増殖阻止と最終分化誘導を指標とした促進発現をしているいくつかの新規のmda-6遺伝子のcDNAのクローンを同定した(Jiakng & Fisher,1993; Jiang et al.,1994a)。本研究において、出願人らはmda-6の分析を行っているが(Jiang & Fisher,1993;Jiang et al.,1994a)、そのタンパク質読み取り枠はWAF1、CIP1,SDI1遺伝子群と同じである(El-Deiry et al.,1993;Harperet al.,1993; Noda et al.,1994)。腫瘍抑制遺伝子p53の増殖抑制活性により直接制御され、更に制御そのものを自身で仲介する可能性のある下流の誘導性遺伝子群を同定するのに作られた方法でWAF1を同定した(El-Deiry et al.,1993)。WAF1をヒトの脳、肺、結腸の腫瘍細胞へ導入すると増殖阻止が起きる(El-Deiry et al.,1993)。更に、WAF1は野生型53を含む細胞でのDNAの損傷や、p53-関連G1期阻止やアポトーシスにおいて誘導される(El-Deiry et al.,1994)。改良型ツー・ハイブリッド・システムによりCIP1が同定され、サイクリン依存型キナーゼの潜在的阻害剤である21キロダルトンのタンパク質をコードしていることが分かった(Harperet al.,1993)。CIP1は正常な二倍体の繊維芽細胞の増殖阻止を誘導するが、SV40-形質転換二倍体繊維芽細胞では少ししか増殖阻止を誘導しない(Harper et al.,1993)。未熟な繊維芽細胞においてDNAの合成を阻止する遺伝子のcDNAを検出する方法としての、発現スクリーニング法により、老化期にあるヒト繊維芽細胞からSDI1を同定、クローニングした(Noda et al.,1994)。現在の研究ではmda-6(WAF1/CIP1/SDI1)の発現もまたヒト・メラノーマ細胞における増殖制御に関連していることと、その抑制された発現はメラニン細胞から転移性メラノーマへの進行時に見られる進行性の変化に貢献していることを示している。
細胞株と培養条件
HO-1メラノーマ細胞は49歳女性のメラノーマ患者より得たメラノーマ状のメラノーマより樹立し、125代から160代の間の継代期間中に使用した(Fisher et al.,1985,1986; Giovanella et al.,1976)。FM516-SVはSV40の大型T抗原遺伝子で不死化した正常なヒト・メラニン細胞である(Melber et al.,1989)。正常なヒト・メラニン細胞である、FM713、FM723、FM741、FM841、FM793および、異形母斑である、N3153を以前に記述された方法で患者より樹立した(Mancianti et al.,1988)。WM35はRGP初期ヒトメラノーマとWM278とから、WM1341B、WM793、WM902Bは初期VGP原発性ヒト・メラノーマから得た(Herlyn et al.,1990;Herelyn et al.,1989)。WM マトリゲル(Matrigel)-進行性のWM35である、WM1341B、およびWM793細胞はPl-N1およびP2-N1と呼び、それぞれの細胞をマトリゲル(Matrigel)と一緒にヌードマウスに接種して第1、第2継代したもので、これは以前記述した方法により作成した(MacDougall et al.,1993; Kobayashi et al.,1994)。C8161は高転移性メラニン欠乏性ヒト・メラノーマで腹壁転移より得た(Welch et al.,1991)。正常なヒト第6染色体をもつC8161株は、C8161/6.1(neo6/C8161.1)、C8161/6.2(neo6/C8161.2)とC8161/6.3(neo6/C8161.3)と呼び、以前記述されたようにして作成した(Welch et al.,1994)。転移性メラノーマ患者より分離したそのほかのヒト・メラノーマ細胞は、FO-1、LO-1、SH-1、WM239、WM239Aであった(Giovanella et al.,1976; Fisher et al.,1985; Herlyn et al.,1989;Herlyn,1990)。種々の細胞を増殖するための培養液と培養条件はそれぞれ上記の文献中の方法によった。
細胞増殖と最終分化アッセイは以前記述された方法で行った(Fisher et al.,1985,1986; Jiang et al.,1993)。細胞生存度維持のまま増殖能が不可逆的に失われることをモニターすることで、[IFN-β+MEZ]存在化で96時間増殖させた後の最終分化誘導を調べた(Fisher et al.,1985,1986; Jiang et al.,1993)。
サブトラクション・ハイブリダイゼーション法によるmda-6の同定とクローニングは以前記述された方法によった(Jiang & Fisher,1993)。分化誘導剤処理済みcDNAライブラリーのスクリーニング(Jiang & Fisher,1993)と、以前記述した高速cDNA末端増幅法(RACE)(Frohman et al.,1988; Loh et al.,1989;Ohara et al.,1989)により、mda-6の全長cDNAを分離した。配列分析は以前に記述された方法によった(Sanger et al.,1977;Su et al.,1993)。mda-6の全配列は、2149ヌクレオチドからなり(GenBankのU09579)、ヌクレオチド配列の95番目のヌクレオチドから始まる最長のタンパク質読み取り枠は、164アミノ酸からなるポリペプチドをコードしている。GCG/TFASTAプログラムを使って現在のタンパク質データベースと比較すると、予想したmda-6の配列はWAF1/CIP1/SDI1の配列と同等である(El-Deiry et al.,1993; Harper et al.,1993; Noda et al.,1994)。
全細胞質RNAを分離して、ノーザン・ブロッティング・ハイブリダイゼーションを以前記載の方法で行った(Reddyet al.,1991; Su et al.,1991; Jiang et al.,1992)。10μgのRNAをグリオキサール/DMSOで変性して1.0%のアガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜にトランスファーし、32Pでラベルしたp53プローブにハイブリダイズした(Baker et al.,1990)。以前に記載の方法で、ナイロン膜を短冊状に切断し、32pでラベルしたmda-6プローブにハイブリダイズし、更に短冊状に切断し32PでラベルしたGAPDHプローブ(Fort et al.,1985)にハイブリダイズした(Reddy et al.,1991; Su et al.,1991; Jiang et al.,1992)。ハイブリダイゼーション後、膜を洗浄してオートラジオグラフィーにかけた(Reddy et al.,1991; Su et al.,1991;Jiang et al.,1992)。mda-6とGDPDHの遺伝子発現は逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により決定した(Adollahi et al.,1991; Lin et al.,1994; Jiang et al.,1994b)。全細胞質RNAは1μgのRNA当り、0.5単位のDNアーゼ(Boehringer-Manheim Biochemicals)を使って15%グリセロール、10mMトリス(pH7.5)、2.5mM MgCl2、0.1mM EDTA、80mM KCl 1mM CaCl2 1単位/ml RNasin(Promega)中で、30℃、10分間処理した。RNAはフェノール/クロロホルム抽出し、酢酸ナトリウム/エタノールで沈殿させ、そのRNA沈殿をジエチルピロカルボネート処理済みの水に再懸濁した。全RNAのうち1μgを、1 mM デオキシリボヌクレオチド三リン酸、4 mM MgCl2、10mM トリス(pH 8.3)、50 mM KCl、0.001% ゲラチン、0.2μgオリゴdTプライマーを含む20μlの200単位マウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素(Bethesda Research Laboratories)を使い、逆転写させた。検体は0.2 mM デオキシリボヌクレオチド三リン酸、2 mM MgCl2、10 mM トリス(pH 8.3)、50 mM KCl、0.001% ゲラチンを含む緩衝液で100μlに調節した。それぞれのプライマーを50pmolと、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ(Perkin-Elmer Cetus)を加え、検体をミネラルオーイルで覆い、95℃で5分間加熱し、その後Perkin-Elmerのサーマル・サイクラーを使って、94℃での変性1分間、55℃でのアニール2分間、72℃での重合化反応3分間のPCRを25サイクル行った。クロロフォルム抽出の後、20μlの生成物を電気泳動にかけ、ナイロン膜にトランスファー後、mda-6かGAPDH特異的プローブでハイブリダイゼーションした。mda-6プライマーは5’から3’の方向にCTCCAAGTACACTAAGCACT(配列番号26)とTAGTTCTACCTCAGGCAGCT(配列番号27)の配列をもつ(ヌクレオチドの1527から1546に対応)(GenBankアクセス番号U09579)。GAPDHプライマーは5’から3’の方向にTCTTACTCCTTGGAGGCCATG(配列番号28)とCGTCTTCACCACCACCATGGAGAA(配列番号29)の配列をもつ(ヌクレオチドの1070から1053に対応)(Tokunaga et al.,1987)。
免疫沈降分析は以前に記載された方法により行った(Duigou et al.,1991; Su et al.,1993; Jiang et al.,1994b)。10cmのプレートを使い、対数増殖期にあるHO-1細胞を無処理のままか、IFN-β(2000単位/ml)単独、MEZ(10 ng/ml)単独、もしくは[IFN-β+MEZ](2000単位/ml+10 ng/ml)で24、48、72、もしくは96時間処理した。培養液をメチオニン欠損培養液に替えて37℃で1時間培養し、メチオニンの欠乏を起こさせ、その次に遠心で細胞を回収し、100μCiの[35S](NEN; エキスプレス35S)を含んだ1 mlの同様な培養液で37℃、1時間(p53場合)もしくは4時間(P21とアクチンの場合)ラベル化した。ラベル後、細胞を氷で冷却したリン酸緩衝塩液で二回洗浄し、RIPC(20 mM Tris-base,pH 7.5,500mM NaCl,0.05% Nonidet P-40,100μg/ml フェニルメチルスルフォニルフルオリド,0.02% アジ化ナトリウム)を氷上で加えて1時間で溶解した。溶解物はエッペンドルフマイクロチューブを使い10,000Xg、4℃で10分間遠心した。4X106カウントのHO-1検体を2μgの、p53単クローン抗体(Ab1; PAb 421)(Oncogene Sciences)、WAF1/CIP1(C-19)(Santa Cruz Biotechnology)(もしくはMDA-6由来)ラビット・ポリクロナルIgGか、アクチン単クローン抗体(Oncogene Sciences)と4℃で24時間震盪培養した。ラベル化溶解物はFO-1、LO-1、SH-1、WM239、FM516-SV、SW480、MeWo、ヒト 皮膚繊維芽細胞、Saos-2細胞を使っても作成した。4X106カウントを含む検体を2μgのp53単クローン抗体Ab1(PAb 421)かAb3(PAb240)(Oncogene Sciences)と培養した。翌日、30μl(充填容量)のGタンパク質-アガロースをそれそれの管に加え、4℃で更に1時間震盪培養した。Gタンパク質の沈殿を氷冷した1mlのRIPC:リン酸緩衝塩液(1:1、V/V)で5回洗浄した。30μlのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用緩衝液を上記洗浄済み沈殿に加え、87℃で3分間加熱した。検体を10%ポリアクリルアミドゲルにのせ、一晩40Vで泳動した。ゲルにはレインボータンパク質標識(Amersham)をサイズ推定の為に加えておいた。ゲルを10%酢酸+10メタノールで30分間固定し、DMSOで30分間培養し、DMSO中10%2,5-ジフェニルオクサゾールで30分間培養し、冷却水で三回(10分間ずつ)洗浄後乾燥してフィルムに露出した。
mda-7の性質
mda-7は新規cDNAである(すでにDNAデータベースに報告済みの遺伝子の配列とは相同性がない)。全長cDNAは1718ntで、275ntから895ntまでにタンパク質読み取り枠があり、それは206アミノ酸からなり、膜領域と糖付加の可能な部位を3つ持ったタンパク質をコードしている。
HO-1細胞を組み換えヒト繊維芽細胞インタフェロン(IFN-β)(2000単位/ml)、MEZ(10 ng/ml)で24時間処理したときの発現増加と[IFN-β+NIEZ](2000単位/ml+10 ng/ml)で処理したときの最大の発現増加 IFN-β(2000単位/ml)、MEZ(10 ng/ml)、MPA(3μM)、IFN-β +IFN-γ(1000 単位/ml+1000 単位/ml)、[IFN-β+MEZ](2000単位/ml+10 ng/ml)、MPA+MEZ(3μM+10 ng/ml)、RA+ MEZ(2.5μM+10ng/ml)でHO-1細胞を96時間処理すると、mda-7の発現が増加した。最大の誘導は[IFN-β+MEZ]による処理時でその次はMPA+MEZ、IFN-β+IFN-γによる処理の順となった。mda-7の誘導に関する相対的レベルは、種々の増殖分化修飾剤で処理したHO-1細胞の増殖阻止と相関関係があった。最大の発現誘導は、[IFN-β+MEZ]で不可逆に増殖能を失わせて最終分化を起こした細胞で起きた。
mda-7の発現は、[IFN-β+MEZ]で24時間処理したHO-1、C8161、8161/6.3(正常ヒト第6染色体が挿入された、C8161ヒト・メラノーマ細胞株:この細胞はヌードマウスにおいて腫瘍性を持つが、親株のC8161細胞とは異なり、非転移性である)、FO-1、LO-1、SH-1、WM278、WM239ヒト・メラノーマ細胞において増加する。この遺伝子は不死化したヒト・メラノーマFM5169(SV40で形質転換)細胞内で構成発現している。しかし、[IFN-β+MEZ]で24時間処理した後はFM5169内では発現の増加は見られない。
mda-7はLANヒト神経芽腫細胞でにおいては発現していないことはRT-PCR法で決定される。mda-7の発現はRAで5日間処理しても誘導されないが、フェニル酢酸か、フェニル酢酸とRAとの組み合わせで5日間培養すると誘導される。mda-7はヒト神経芽腫細胞で増殖阻止と分化誘導の機能として誘導される。mda-7の発現はヒト神経芽腫における増殖阻止と最終分化に貢献する可能性がある。
mda-7の発現は、RT-PCR法でHL-60やU-937においては検出できない。HL-60やU-937におけるmda-7の発現は、増殖阻止および分化誘導剤であるTPAによる処理で誘導できる。mda-7の発現は、TPAで2日間、およびRAで4日間処理して最終分化したHL -60において持続する。
mda-7の発現は、RT-PCR法で増殖能をもつ細胞(即ち、非老化細胞である)において検出できない。IMR90を十分に培養して老化期に近付けると、mda-7の発現は検出できる。
mda-7は正常な小脳、GBMや、正常皮膚繊維芽細胞内において新規の発現を行っていない。[IFN-β+MEZ]で正常な小脳、GBMや、正常皮膚繊維芽細胞を24時間処理すると、mda-7の発現は起きる。
mda-7は結腸直腸癌(SW613)、子宮内膜腺癌(HTB113)や、前立腺癌(LNCaP)において新規合成がなされる。結腸直腸癌(SW613)、子宮内膜腺癌(HTB113)と、前立腺癌(LNCaP)を[IFN-β+MEZ]で24時間処理しても、mda-7は誘導されない。
IFN-β(2000単位/ml; 24時間)、MEZ(10 ng/ml;24時間)、[IFN-β+MEZ](2000単位/ml+10 ng/ml;24時間)、IFN-α+MEZ(2000単位/ml+10 ng/ml;24および96時間)、アドリアマイシン(0.1ng/ml;24時間)、ビンクリスチン(0.1ng/ml;24時間)、とUV(10ジュール/mm2、アッセイは24時間後)で処理するとHO-1細胞内でのmda-7の発現は増加する。MPA(2μM)、IFN-β+IFN-γ(1000単位/ml+1000単位/ml)、MPA+MEZ(3μM+10ng/ml)、RA+MEZ(2.5μM+10 ng/ml)で96時間処理してもmda-7の発現が増加する。
mda-7は増殖分化で制御され、老化と関連した新規の遺伝子で、以下に述べる性質を兼ねている:
1)最終分化時([IFN-β+MEZ]による96時間の処理)や、種々の増殖修飾剤や分化誘導剤で96時間処理したときには誘導される。
2)[IFN-β+MEZ]で24時間処理すると、調べたヒト・メラノーマにおいては発現が誘導されるが、SV40で不死化したヒト・メラニン細胞では誘導されない。
3)増殖期のヒト神経芽腫細胞では発現されないが、増殖阻止や最終分化誘導を行うと誘導される。
4)ヒト前骨髄球白血病(HL-60)やヒト組織球リンパ腫(U-937)では発現されないが、増殖停止や最終分化を誘導すると誘導される。
5)活発に増殖しているヒトの細胞では発現されていないが、細胞老化時には誘導される。
6)正常な小脳、GBM、正常な皮膚繊維芽細胞では新規発現されないが、[IFN-β+MEZ]で24時間処理すると容易に誘導がかかる。
7)結腸、子宮内膜、前立腺癌では発現も発現誘導もおきない。
8)アドリアマイシン、ビンクリスチン、UV照射で処理したHO-1細胞では、発現の増加を誘導する。
1)特別な組織の分化系統における標識になりえる(即ち表皮ケラチン細胞からメラノーマへの分化)(診断的応用)。
2)([IFN-β+MEZ]で誘導される)繊維芽細胞と([IFN-β+MEZ]で誘導されない)癌の見分け(診断的応用)に使える。
3)増殖能を失って老化した細胞を同定するのに使える。
4)癌の分化療法時におきる癌細胞分化誘導をモニターするのに使える。
5)ヒト・メラノーマ、神経芽腫、白血病、リンパ腫を使った、分化誘導性、化学療法性薬剤を同定するためのスクリーニングで、増殖阻止や分化過程の種々の段階(最終分化を含む)を誘導する新規の薬剤を同定するのに使える。
6)メラニン細胞やおそらく母斑と、初期および後期段階のメラノーマ細胞とを区別するのに使える(診断的応用)。
Claims (54)
- 配列番号7に示されるmda-7アミノ酸配列をコードする単離されたmda-7核酸を含む薬学的組成物。
- 前記核酸がプロモーターをさらに含む請求項1に記載の薬学的組成物であって、前記プロモーターは、核酸の発現を制御する薬学的組成物。
- 前記プロモーターが誘導プロモーターである、請求項2に記載の薬学的組成物。
- 前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項2に記載の薬学的組成物。
- 前記プロモーターがバクテリオファージ・プロモータである、請求項2に記載の薬学的組成物。
- 前記バクテリオファージ・プロモータがT3、T7、またはSP6である、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 前記プロモーターがRNA転写酵素のプロモーターである、請求項2に記載の薬学的組成物。
- 前記核酸がリポソームと組み合わせられている、請求項1〜7の何れか1項に記載の薬学的組成物。
- 配列番号7に示されるmda-7アミノ酸配列をコードする単離されたmda-7核酸を含むベクターであって、プラスミドベクターATCC Accession No.75905であるベクター。
- 配列番号7に示されるmda-7アミノ酸配列をコードする単離されたmda-7核酸を含むベクターであって、プラスミドベクトルATCC Accession No.75906であるベクター。
- 配列番号7に示されるmda-7アミノ酸配列をコードする単離されたmda-7核酸を含むベクターで安定に形質転換されたホスト細胞。
- 配列番号7に示されるmda-7アミノ酸配列をコードする単離されたmda-7核酸を含むベクターを含むホスト細胞であって、前記ホスト細胞が、神経芽腫細胞、白血病細胞、リンパ性細胞、線維芽細胞、メラノーマ細胞、グリア芽細胞腫細胞、結腸カルチノーマ細胞、乳癌細胞、卵嚢癌細胞、または前立腺カルシノーマ細胞であるホスト細胞。
- 細胞のmda-7遺伝子の発現を検出する方法であって:
a)細胞の核酸を単離することと;
b)ハイブリッドの形成が可能な条件下で、配列番号7に示されるmda-7アミノ酸配列をコードする単離されたmda-7核酸分子と単離された核酸をハイブリダイズさせることと;および、
c)形成されたハイブリッドを検出することと、
を含み、形成されたハイブリッドの検出は、細胞におけるmda-7遺伝子の発現を示す方法。 - 細胞がメラノーマ細胞またはカルシノーマ細胞であるどうかを決定するための方法であって、請求項13に記載の方法を使用してmda-7遺伝子の発現を検出することを含み、mda-7遺伝子の発現は、細胞がメラノーマ細胞であることを示す方法。
- ヒト・メラノーマ細胞の増殖抑制を誘導することができる化合物を同定するための方法であって:
a)ヒト・メラノーマ細胞をヒト・メラノーマ細胞の増殖抑制を誘導するために有効な化合物の量と共にインキュベートすることと;および、
b)請求項13に記載の方法を使用してmda-7遺伝子の発現を検出することとを含み、mda-7遺伝子の発現は、化合物がヒト・メラノーマ細胞の増殖抑制を誘導することができることを示す方法。 - 細胞の悪性表現型を逆転させるための薬学的組成物の調製のためのmda-7遺伝子の使用であって、前記mda-7遺伝子は、前記mda-7遺伝子の発現が調節要素の制御下にあるように調節要素に連結されており、かつ前記組成物は、mda-7遺伝子の発現のために悪性細胞に導入されて、これにより細胞の悪性表現型を逆転させるようにデザインされている使用。
- 細胞の悪性表現型を逆転させるための薬学的組成物の調製のためのmda-7遺伝子の使用であって、前記mda-7遺伝子は、前記mda-7遺伝子の発現が調節要素の制御下にあるように調節要素に連結されており、かつ前記組成物は、mda-7遺伝子の発現が悪性細胞の形質転換する表現型を逆転させるように、前記悪性細胞に導入されて、前記mda-7遺伝子を発現するために適切な条件に配置される用にデザインされている使用。
- 細胞の悪性細胞の表現型を逆転させるための薬学的組成物の調製のためのmda-7遺伝子の使用であって、前記mda-7遺伝子は、前記mda-7遺伝子の発現が調節要素の制御下にあるように調節要素に連結されており、かつ前記組成物は、mda-7遺伝子の発現のために悪性細胞に導入されて、これにより悪性細胞の表現型を逆転させるようにデザインされている使用。
- 被検者の悪性細胞の表現型を逆転させるための薬学的組成物の調製のためのmda-7遺伝子の使用であって、前記mda-7遺伝子は、前記mda-7遺伝子の発現が調節要素の制御下にあるように調節要素に連結されており、かつ前記組成物は、mda-7遺伝子の発現が誘導される被験者の悪性細胞に導入るようにデザインされており、前記細胞の形質転換特性を逆転させるであろう使用。
- 腫瘍原性細胞および転移性細胞の増殖抑制を誘導するための薬学的組成物の調製のためのmda-7遺伝子の使用であって、前記mda-7遺伝子は、前記mda-7遺伝子の発現が調節要素の制御下にあるように調節要素に連結されており、かつ前記組成物は、mda-7遺伝子の発現が誘導される腫瘍原性細胞および転移性細胞に導入されるようにデザインされている使用。
- 腫瘍原性細胞および転移性細胞の末端分化を誘導するための薬学的組成物の調製のためのmda-7遺伝子の使用であって、前記mda-7遺伝子は、前記mda-7遺伝子の発現が調節要素の制御下にあるように調節要素に連結されており、かつ前記組成物は、mda-7遺伝子の発現が誘導される腫瘍原性細胞および転移性細胞に導入されるようにデザインされている使用。
- 前記細胞がメラノーマ細胞である、請求項16〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 細胞が白血病細胞である、請求項16〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記細胞がリンパ腫細胞である、請求項16〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記細胞が神経芽腫細胞である、請求項16〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記細胞が多形性神経膠芽腫細胞である、請求項16〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記調節要素がプロモーターである、請求項16〜21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項27に記載の使用。
- 前記プロモーターが誘導プロモーターである、請求項27に記載の使用。
- 前記組成物が、非ウィルス・ベクター、ウィルス・ベクター、抗体を被覆したリポソーム、機械的または電気的手段によって細胞に導入されるように設計されている、請求項16〜21のいずれか1項に記載の使用。
- メラノーマの段階を決定する方法であって、メラノーマ試料細胞におけるmda-7遺伝子の発現レベルを測定することと、および前記発現レベルを、正常細胞および異なる段階のメラノーマ細胞の所定の標準と比較することとを含み、これによりメラノーマの段階を決定する方法。
- 前記発現がmda-7タンパク質に対する抗体によって測定される、請求項31に記載の使用。
- 前記発現がインシチューハイブリダイゼイションによって測定される、請求項32に記載の使用。
- 癌に対する治療の効果を示すための方法であって、癌試料細胞におけるmda-7遺伝子の発現レベルを測定することを含み、前記発現レベルの増大は治療の効果を示す方法。
- 前記癌がメラノーマである、請求項34記載の使用。
- 前記癌が白血病である、請求項34記載の使用。
- 前記癌がリンパ腫である、請求項34記載の使用。
- 前記癌が神経芽細胞腫である、請求項34記載の使用。
- 前記癌が多形性神経膠芽腫腫瘍である、請求項34記載の使用。
- 細胞が老化しているか否かを決定する方法であって、試料細胞におけるmda-7遺伝子の発現を検出することを含み、前記mda-7の発現は、細胞が老化していることを示す方法。
- 老化を阻害する化合物を同定する方法であって、複数の試料細胞を化合物の適切な量と共にインキュベートすること、および前記複数の試料細胞におけるmda-7遺伝子の発現を検出することとを含み、前記複数の試料細胞におけるmda-7遺伝子の発現の阻害は、化合物が老化を阻害することを示す方法。
- 図38Bに記載されたアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質。
- 図38Bに記載された配列を有する核酸によってコードされる、単離されたタンパク質。
- 図38Bに記載された配列を有する核酸に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする核酸によってコードされる、単離されたタンパク質。
- 図38Bに記載された配列を有する核酸に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし、かつmda-7タンパク質をコードする核酸によってコードされる、単離されたタンパク質であって、前記mda-7タンパク質は、有効濃度において、HO-1細胞の増殖を抑制し、かつ図38Bに記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質に対して特異的な抗体に結合するタンパク質。
- ATCC Accession Number 75905を有するプラスミドmda-7.3'のEcoRIとXbaI部位の間に位置するmda-7遺伝子の3'断片によってコードされる、単離されたタンパク質。
- ATCC Accession Number 75906を有するプラスミドmda-7.5'のSalI部位の間に位置するmda-7遺伝子の5'断片によってコードされる、単離されたタンパク質。
- 細胞において増殖抑制を誘導するための薬学的組成物の調製のための、請求項42に記載の単離されたタンパク質の使用。
- 細胞において増殖停止を誘導するための薬学的組成物の調製のための、請求項42に記載の単離されたタンパク質の使用。
- 細胞において末端分化を誘導するための薬学的組成物の調製のための、請求項42に記載の単離されたタンパク質の使用。
- 細胞増殖の割合を減少させるための薬学的組成物の調製のための、請求項42に記載の単離されたタンパク質の使用。
- 細胞において老化を誘導するための薬学的組成物の調製のための、請求項42に記載の単離されたタンパク質の使用。
- 前記細胞が腫瘍原性細胞または転移性細胞である、請求項48〜52のいずれか1項に記載の使用。
- 前記腫瘍原性細胞または転移性細胞が、メラノーマ細胞、神経芽腫細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、結腸直腸の癌細胞、子宮体癌細胞、および前立腺癌細胞からなる群より選択される、請求項53に記載の使用。
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