JP2007232559A - Ｆｒｅｔ検出方法及び装置 - Google Patents

Abstract

【課題】ドナー分子及びアクセプター分子からなるサンプルについて、短時間に多数のサンプルのＦＲＥＴ検出を行うＦＲＥＴ検出方法及び装置を提供する。
【解決手段】本発明のＦＲＥＴの検出は、まず、周波数ｆ＋Δｆで強度変調したドナー分子励起用の第１のレーザ光をドナー分子に照射するとともに、周波数ｆで強度変調したアクセプター分子励起用の第２のレーザ光をアクセプター分子に照射し、アクセプター分子が発する蛍光を受光する。受光した蛍光の蛍光信号から、ＦＲＥＴによりアクセプター分子が発する蛍光の第１の信号成分と、第２のレーザ光の照射により励起したアクセプター分子が発する蛍光の第２の信号成分とを抽出する。抽出した第１の信号成分の位相遅れと、抽出した第２の信号成分の位相遅れとを算出し、これらの位相遅れに基づいて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定する。
【選択図】図４

Description

本発明は、レーザ光の照射によって励起された第１の分子が発する蛍光が励起光として第２の分子を励起し、この励起された第２の分子が発する蛍光を受光することによって、第1の分子のエネルギーが第２の分子のエネルギーに移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を検出する方法及び装置に関する。具体的には、蛍光分子であるドナー分子と蛍光分子であるアクセプター分子との対に関して、両分子の相互作用を蛍光によって検出するＦＲＥＴ検出技術に関する。

現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパク質の機能解析が重要となっている。特に、細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
このようなタンパク質の他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用について、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して解析することが最近行われている。すなわち、数ナノメータの領域での分子間の相互作用を蛍光を用いて検出する。このようなＦＲＥＴ現象を利用した検出は、主に顕微鏡システムを用いて行われる。

下記特許文献１は、ＦＲＥＴを用いた一分子蛍光解析を開示している。この文献では、ＦＲＥＴ現象を用いて、受光した蛍光に基づいて蛍光相関分析法又は蛍光強度分布解析を行う。しかし、この方法では、短時間にＦＲＥＴの検出を行うことのできる細胞等のサンプル数は、せいぜい数十個程度に限られており、多くの細胞を解析対象として短時間に統計的に解析することは難しい。

特開２００５−２０７８２３号公報

そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、ドナー分子及びアクセプター分子を含むサンプルについて短時間に多数のサンプルを解析することのできるＦＲＥＴ検出方法及び装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、レーザ光の照射によって励起された第１の分子が発する蛍光が励起光として第２の分子を励起し、この励起された第２の分子が発する蛍光を受光することによって、第1の分子のエネルギーが第２の分子に移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を検出するＦＲＥＴ検出方法であって、第１の分子を励起するために、第１の周波数で強度変調した第１のレーザ光を第１の分子に照射するとともに、第２の分子を励起するために、第１の周波数と異なる第２の周波数で強度変調した第２のレーザ光を第２の分子に照射するステップと、第２の分子が発する蛍光を受光するステップと、受光した第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分の、第１のレーザ光の強度変調に対する第1の位相遅れと、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分の、第２のレーザ光の強度変調に対する第２の位相遅れとを取り出し、この第１の位相遅れと第２の位相遅れとに基づいて、第1の分子のエネルギーが第２の分子に移動するエネルギー移動を検出するステップと、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出方法を提供する。

ここで、前記エネルギー移動は、前記第２の位相遅れに対する前記第１の位相遅れの比によって検定されることが好ましい。
又、前記第１のレーザ光は、前記第１のレーザ光の強度変調のために第１の周波数を有する第１の変調信号を用いて強度変調され、前記第２のレーザ光は、前記第２のレーザ光の強度変調のために第２の周波数を有する第２の変調信号を用いて強度変調され、前記第１の周波数の変調信号は、前記第２の周波数の変調信号に、前記差分周波数の生成信号を合成して得られた信号であり、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号は、前記差分周波数の生成信号に同期して、前記差分周波数の整数倍の周波数をサンプリング周波数としてサンプリングされることが好ましい。その際、前記サンプリングされた蛍光信号を前記差分周波数の整数分の１の周波数を周波数分解能として周波数分析をすることにより、前記蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分と蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分とを抽出することが好ましい。

又、前記第２の分子が発する蛍光を受光する際、さらに、前記第１の分子が発する蛍光を受光し、受光した前記第１の分子の発する蛍光の蛍光信号の、第１のレーザ光の強度変調に対する第３の位相遅れを算出し、この第３の位相遅れをＦＲＥＴの検出に用いることもできる。

本発明は、さらに、レーザ光の照射によって励起された第１の分子が発する蛍光が励起光として第２の分子を励起し、この励起された第２の分子が発する蛍光を受光することによって、第1の分子のエネルギーが第２の分子に移動するＦＲＥＴを検出するＦＲＥＴ検出装置であって、第１の分子を励起するために、第１のレーザ光を第１の分子に照射するとともに、第２の分子を励起するために、第２のレーザ光を第２の分子に照射するレーザ光源部と、第２の分子が発する蛍光を受光する受光部と、前記レーザ光源部から出射する第１のレーザ光を第１の周波数で強度変調させ、かつ前記レーザ光源部から出射する第２のレーザ光を第１の周波数と異なる第２の周波数で強度変調させるために、変調信号を生成する光源制御部と、受光した第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分の、第１のレーザ光の強度変調に対する第1の位相遅れと、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分の、第２のレーザ光の強度変調に対する第２の位相遅れとを取り出し、この第１の位相遅れと第２の位相遅れとに基づいて、第1の分子のエネルギーが第２の分子に移動するエネルギー移動を検定する処理部と、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出装置を提供する。

その際、前記処理部は、前記第２の位相差に対する前記第１の位相差の比によって前記エネルギー移動を検定することが好ましい。
又、前記光源制御部は、前記第１のレーザ光を、前記第１のレーザ光の強度変調のために第１の周波数を有する第１の変調信号を用いて強度変調させ、前記第２のレーザ光を、前記第２のレーザ光の強度変調のために第２の周波数を有する第２の変調信号を用いて強度変調させ、前記第１の周波数の変調信号は、前記第２の周波数の変調信号に、前記差分周波数の生成信号を合成して得られた信号であり、前記処理部は、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号を、前記差分周波数の生成信号に同期して、前記差分周波数の整数倍の周波数をサンプリング周波数としてサンプリングすることが好ましい。その際、前記処理部は、前記サンプリングされた蛍光信号を前記差分周波数の整数分の１の周波数を周波数分解能として周波数分析をすることにより、前記蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分と前記蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分とを抽出することが好ましい。

又、前記受光部は、前記第２の分子が発する蛍光の他に、前記第１の分子が発する蛍光を受光し、前記処理部は、前記受光部で受光した第１の分子が発する蛍光の蛍光信号の、第１のレーザ光の強度変調に対する第３の位相遅れを算出し、この第３の位相遅れをＦＲＥＴの検出に用いることもできる。

本発明は、第１の分子の励起用レーザ光と、第２の分子の励起用レーザ光とを用い、これらのレーザ光を所定の周波数で強度変調を行い、かつ、そのときの強度変調の周波数を、蛍光の識別のために周波数をずらす。さらに、これらのレーザ光によって発する蛍光の受光後、強度変調の周波数が異なることを利用してこの２つの周波数における第２の分子が発する蛍光の位相遅れを求め、これらの位相遅れを用いてＦＲＥＴを検出する。このような信号処理は短時間にできるので、短時間に効率よくサンプルの測定ができ、統計的にＦＲＥＴ検出結果を纏めることができる。
特に、上記２つの位相遅れの比は、ＦＲＥＴの発生により大きく変化する。このため、この比の値を用いることで、ＦＲＥＴ効率が低い場合でもＦＲＥＴの検出を精度良く行うことができる。又、本発明を、フローサイトメータに適用すると、一定速度で測定点を通過するサンプルからの蛍光の信号処理を行うことでＦＲＥＴの検出ができるので、短時間に効率よくサンプルの測定ができ、統計的にＦＲＥＴ検出結果を纏めることができ、注目する分子の相互作用を効率良く調べることができる。

以下、本発明のＦＲＥＴ検出方法及び装置について詳細に説明する。
図１は、本発明のＦＲＥＴ検出装置の一実施形態であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、レーザ光の照射によって励起された第１の分子（ドナー分子）が発する蛍光を励起光として第２の分子（アクセプター分子）を励起し、この励起されたアクセプター分子が発する蛍光を受光することによって、ドナー分子のエネルギーがアクセプター分子のエネルギーに移動するか否かを判定するものである。このようなエネルギー移動の検出のために、ドナー分子及びアクセプター分子に照射するレーザ光は、一定の周波数で強度変調され、このレーザ光の照射に応答して発する蛍光の位相遅れを、以下に示すように測定することにより、ＦＲＥＴの発生を検出することを特徴とする。

フローサイトメータ１０は、レーザ光の照射により蛍光するドナー分子及びアクセプター分子のサンプル１２を一定速度で流し、このときサンプル１２にレーザ光を照射し、このサンプル１２が発する蛍光の蛍光信号を検出する検出部２０と、検出部２０で得られた処理結果からサンプル１２においてＦＲＥＴが発生しているか否かの検出を行なう分析装置（コンピュータ）８０とを有する。

検出部２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４，２６と、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及びサンプル１２からの蛍光信号を処理する処理部を有する制御・処理部２８と、高速流を形成するシース液とともにサンプル１２を流してフローセルを形成する管路３０と、を有する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。

レーザ光源部２２は、ドナー分子及びアクセプター分子がレーザ光を吸収して励起状態となる所定の波長のレーザ光を出射するドナー励起光源２２ａ及びアクセプター励起光源２２ｂを有する。
図２は、レーザ光源部２２の概略構成図である。
ドナー励起光源２２ａは、ドナー分子を励起するレーザ光を出射する光源である。アクセプター励起光源２２ｂは、アクセプター分子を励起するレーザ光を出射する光源である。ドナー分子を励起するレーザ光と、アクセプター分子を励起するレーザ光とは、ドナー分子、アクセプター分子をそれぞれ好適に励起することができるように波長帯域が異なっている。例えば、ドナー分子としてＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）を用いる場合、波長４０５〜４４０ｎｍのレーザ光が用いられ、アクセプター分子としてＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）を用いる場合、波長４７０〜５３０ｎｍのレーザ光が用いられる。レーザ光源部２２は、このような可視光帯域の連続波のレーザ光を所定の周波数で強度変調して出射する部分である。

各光源のレーザ光の光路上には、レーザ光を同一位置に集束する光学レンズ２３ａ，２３ｂが設けられ、この集束位置を測定対象のサンプル１２が通過するようになっている。
各レーザ光源には、それぞれの光源を駆動してレーザ光を出射させるレーザドライバ３４ａ，３４ｂが接続されており、レーザドライバ３４ａ，３４ｂは、後述する信号生成部（図４参照）４０からの信号によって、レーザ光を強度変調するように制御される。

レーザ光を出射するドナー励起光源２２ａ及びアクセプター励起光源として例えば半導体レーザが用いられ、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力でレーザ光が出射される。レーザ光の強度変調の周波数（変調周波数）は、その強度変調の周期がドナー分子、アクセプター分子が発する蛍光の蛍光緩和時間に比べて長く、例えば１０〜１００ＭＨｚである。ドナー分子を励起するためのレーザ光とアクセプター分子を励起するためのレーザ光とは、強度変調の周波数が１００ｋＨｚ〜２ＭＨｚ異なり、ドナー分子を励起するレーザ光の強度変調の周波数が高くなっている。本発明においては、アクセプター分子を励起するレーザ光の強度変調の周波数がドナー分子を励起するためのレーザ光の強度変調の周波数に比べて高くてもよい。このように、レーザ光の強度変調の周波数を僅かに変えるのは、後述するように、受光した蛍光の蛍光信号の処理が短時間に行われるようにするためである。

レーザ光源部２２は、レーザ光がドナー分子及びアクセプター分子をそれぞれ励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光によって発する蛍光は、サンプル１２中のドナー分子及びアクセプター分子の発する蛍光であり、サンプル１２は管路３０を通過する際、測定点でレーザ光の照射を受けて蛍光分子特有の波長で蛍光を発する。

受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過するサンプル１２によってレーザ光が前方散乱することにより、サンプル１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において標識サンプル１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。

一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交方向であって、かつ管路３０中のサンプル１２の移動方向に対して直交方向に配置されている。受光部２６は、測定点にて照射されたサンプル１２が発する蛍光を受光するフォトマルチプライヤ（光電子倍増管）やアバランシュフォトダイオード等の光電変換器が用いられる。
図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。

図３に示す受光部２６は、サンプル１２からの蛍光の蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃ_１,２６ｃ₂と、光電子倍増管やアバランシュフォトダイオード等の光電変換器２７ａ,２７ｂと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面に集束させるように構成される。

ダイクロイックミラー２６ｂは、アクセプター分子の蛍光を透過し、ドナー分子の蛍光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められて構成されたミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ_１，２６ｃ₂でフィルタリングして光電変換器２７ａ，２７ｂは、それぞれドナー分子の蛍光及びアクセプター分子の蛍光所定の波長帯域の蛍光を取り込む。したがって、光電変換器２７ａは、ドナー分子の発する蛍光を受光し、光電変換器２７ｂは、アクセプター分子の発する蛍光を受光する。

バンドパスフィルタ２６ｃ_１，２６ｃ₂は、各光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、ドナー分子の蛍光及びアクセプター分子の蛍光の波長帯域に対応して設定されており、互いに異なる波長帯域となっている。

光電変換器２７ａ，２７ｂは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は強度変調されたレーザ光の照射によって発する位相が遅れた蛍光であり、この蛍光は、位相遅れの情報を持った光信号として受光される。このため、出力される電気信号は位相差の信号情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、制御・処理部２８に供給され、増幅器で増幅される。

制御・処理部２８は、図４に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を有して構成される。信号生成部４０は、所定の周波数の変調信号を生成する本発明の光源制御部を形成する。又、コントローラ４４及び後述の分析装置８０は、本発明における処理部を形成する。
信号生成部４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６，４７、パワースプリッタ４８及びＳＳＢ（Single Side Band）変調器５０及びアンプ５２を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４ａ，３４ｂに供給するとともに、信号処理部４２に供給する部分である。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機２７ａ,２７ｂから出力される蛍光信号の位相差検出のための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜１００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。レーザドライバ３４ｂに供給する変調信号の周波数をｆとすると、ｆは上述したようにアクセプター分子を励起するレーザ光の変調信号の周波数であり、１０〜１００ＭＨｚである。レーザドライバ３４ａに供給する変調信号の周波数は、ドナー分子を励起するレーザ光の周波数であり、ｆ＋Δｆとなる。このときのΔｆは、１００ｋＨｚ〜２ＭＨｚであり、ｆ＝１０〜１００ＭＨｚに比べてその周波数は小さい。

発振器４６は、周波数ｆの正弦波信号を生成し、発振器４７は周波数Δｆの正弦波信号を生成する。ＳＳＢ変調器５０は、周波数ｆの正弦波信号に周波数Δｆの正弦波信号を合成して、高周波側の合成信号（ＵＳＢ信号）である周波数ｆ＋Δｆの正弦波信号を生成する。この正弦波信号は、変調信号としてレーザドライバ３４ａに供給される。レーザドライバ３４ｂには、パワースプリッタ４８から周波数ｆの正弦波信号が変調信号として供給される。

図５は、ＳＳＢ変調器５０のブロック構成図である。
ＳＳＢ変調器５０は、９０度ハイブリッド５０ａ、ミキサ５０ｂ，５０ｃ、９０度位相器５０ｄ、１８０度ハイブリッド５０ｅを有して構成される。
９０度ハイブリッド５０ａは、発振器４６から供給される周波数ｆの正弦波信号の位相を０度及び９０度に分離するハイブリッドリングを備える高周波素子であり、０度及び９０度に分離された正弦波信号をミキサ５０ｂ，５０ｃに供給する。一方、９０度位相器５０ｄは、発振器４７から供給された周波数Δｆの正弦波信号を位相０度及び９０度に変えてミキサ５０ｂ，５０ｃに供給する。
１８０度ハイブリッド５０ｅは、受光信号の位相を０度及び１８０度に分離するハイブリッドリングを備える高周波素子であり、端子の一方では、正弦波信号の位相情報を保持したまま、高周波側に周波数ΔｆシフトさせたＵＳＢ信号が生成され、他方の端子では、受光信号の位相情報を保持したまま、低周波側に周波数ΔｆシフトさせたＬＳＢ信号が生成される。
ＳＳＢ変調器５０は、ＵＳＢ信号を出力してレーザドライバ３４ａに供給する。

信号処理部４２は、光電変換器２７ａ,２７ｂから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射によりサンプル１２が発する蛍光の位相遅れに関する情報（位相差）を抽出する部分である。信号処理部４２は、光電変換器２７ａ,２７ｂから出力される蛍光信号を増幅するアンプ５４ａ,５４ｂと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された周波数ｆの正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ５６、及び増幅された蛍光信号を上記変調信号に合成するＩＱミキサ５８ａ，５８ｂを有する。

ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂは、光電変換器２７ａ，２７ｂから供給されるドナー分子の蛍光及びアクセプター分子の発する蛍光の蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号として同期して合成するために、光電変換器２７ａ，２７ｂの別に設けられている。変調信号を参照信号として同期して合成することで、後述するように、蛍光の位相遅れを求めることができる。
具体的には、ＩＱミキサのそれぞれは、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。処理信号は、ドナー分子の発した蛍光の信号及びアクセプター分子の発した２つの蛍光の信号である。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ４４に供給される。

コントローラ４４は、信号生成部４０に周波数ｆ及びΔｆの正弦波信号を生成させるように制御するとともに、信号処理部４２にて求められた蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を求める部分である。

具体的には、コントローラ４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を制御管理するシステム制御器６０と、信号処理部４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除くローパスフィルタ６２と、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅するアンプ６４と、増幅された処理信号をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。Ａ／Ｄ変換器６６では、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号がサンプリングされて、分析装置８０に供給される。サンプリングは、上述の周波数Δｆの整数倍（好ましくは３倍以上の整数倍）の周波数をサンプリング周波数とする。ローパスフィルタ６２は、Ａ／Ｄ変換器６６によるデジタル化のときのアンチエリアジングのために、かつ周波数Δｆの信号成分を通過させるために、周波数特性が定められる。

分析装置８０は、供給された処理信号を用いて、上述したΔｆの正弦波信号に同期させて、Δｆの整数分の１の周波数を周波数分解能とする周波数分析を行い、周波数分析を行った０Ｈｚにおける振幅と位相を求めるとともに、周波数Δｆにおける処理信号の振幅と位相を求める。求められた位相は、上述したように周波数ｆにおける正弦波信号を参照信号として同期して合成された処理信号に基づくため、これらの位相は、上記正弦波信号（レーザ光の強度変調）に対する位相遅れとなっている。又、処理信号は、上述したように、レーザ光の照射によりドナー分子の発する蛍光の蛍光信号に由来するものと、アクセプター分子の発する蛍光の蛍光信号に由来するものとを含むので、この２つの蛍光信号を分離するために、周波数０Ｈｚと周波数Δｆにおける振幅と位相が別々に取り出される。

分析装置８０は、アクセプター分子の発する蛍光の処理信号の０Ｈｚにおける位相と、周波数Δｆにおける位相を求め、周波数Δｆにおける位相の、０Ｈｚにおける位相に対する比を算出し、この比の値の大小によって、上述したＦＲＥＴ発生の有無を判定する。例えば、上記比が予め設定された閾値を超えた場合、ＦＲＥＴの発生として判定する。

このように、アクセプターの発する蛍光の処理信号の０Ｈｚにおける位相と周波数Δｆにおける位相を用いるのは、０Ｈｚにおける処理信号の位相は、アクセプター分子が周波数ｆで強度変調されたレーザ光の照射によって発した蛍光の位相遅れを表し、周波数Δｆにおける処理信号の位相は、周波数ｆ＋Δｆで強度変調されたレーザ光の照射によって発したドナー分子の蛍光を励起光としてアクセプター分子が吸収し、この結果励起したアクセプター分子が発する蛍光の位相遅れ、つまり、ＦＲＥＴの発生により生じた位相遅れを表すからである。

周波数Δｆにおける処理信号の位相、すなわちＦＲＥＴの発生により生じた位相遅れは、後述するように、レーザ光が照射されて発するドナー分子の蛍光の蛍光放射速度及びＦＲＥＴの発生速度と、ＦＲＥＴを介して励起したアクセプター分子が発する蛍光の蛍光放射速度と、レーザ光が照射されたアクセプター分子が発する蛍光の蛍光放射速度によって表される。また、０Ｈｚにおける処理信号の位相、すなわちレーザ光の照射によって発した蛍光の位相遅れは、後述するように、レーザ光の照射されてアクセプター分子が発する蛍光の蛍光放射速度によって表される。このため、後述するように、位相遅れの比を求めることで、ＦＲＥＴの発生の有無を判定することができる。特に、ＦＲＥＴの速度はドナー分子の蛍光放射速度及びアクセプター分子の蛍光放射速度に比べてその値が極めて小さい場合が多く、さらにドナー分子及びアクセプター分子の放射速度が比較的等しい場合、上記比の値は２になる。したがって、分析装置８０は、測定結果である位相遅れの比を算出することにより、ＦＲＥＴの発生を上記比の値によって比較的容易に検出することができる。

また、ＦＲＥＴが発生したとき、ドナー分子が発する蛍光の処理信号のΔｆＨｚにおける位相は、ＦＲＥＴの発生に応じて変わる。この位相の変化を用いてＦＲＥＴの発生を検出することもできる。すなわち、ドナー分子の発する蛍光の蛍光信号から、ドナー分子の励起用のレーザ光の強度変調に対する位相遅れを取り出し、この位相遅れをＦＲＥＴの検出に用いることもできる。
勿論、分析装置８０では、処理信号の０Ｈｚ及び周波数Δｆにおける振幅を用いて、ドナー分子及びアクセプター分子が発する蛍光強度を定量的に求めることもでき、周波数Δｆにおける蛍光強度によって、ＦＲＥＴの発生を検出することもできる。
以上が、本発明を実施するフローサイトメータ１０の説明である。

次に、このフローサイトメータ１０で行われるＦＲＥＴの検出方法を説明する。図６は、ＦＲＥＴの発生の検出の流れを示すフローチャートである。

まず、コントローラ４４からの指示により、周波数ｆの正弦波信号を発振器４６に発生させ、さらに周波数Δｆの正弦波信号を発振器４７に発生させる。周波数ｆの正弦波信号は、パワースプリッタ４８で分けられ、一方は、ＳＳＢ変調器５０に、他方はアンプ５２に供給される。周波数Δｆの正弦波信号はＳＳＢ変調器５０に供給される。
ＳＳＢ変調器５０では、供給された周波数ｆの正弦波信号は周波数Δｆの正弦波信号と合成されて、高周波側の合成信号である周波数ｆ＋Δｆの正弦波信号が生成され、レーザドライバ３４ａに強度変調信号として供給される。

一方、パワースプリッタ４８で分けられた周波数ｆの正弦波信号は、レーザドライバ３４ｂに強度変調信号として供給される。
この状態で、サンプル１２が管路３０を流れ、シースフローが形成される。シースフローは、例えば１００μｍの流路径に１〜１０ｍ／秒の流速を有する。また、サンプル１２にはレーザ光の照射により蛍光を発するドナー分子とアクセプター分子が含まれる。
レーザ光は、ドナー励起光源２２ａから周波数ｆ＋Δｆで強度変調されたレーザ光と、アクセプター励起光源２２ｂから周波数ｆで強度変調されたレーザ光とが同時にサンプル１２に向けて照射される（ステップＳ１０）。
測定点でこれらのレーザ光による照射が成され、受光部２４でサンプル１２の通過を検出すると、検出信号がコントローラ４４にトリガ信号として出力される。

信号処理部４２及びコントローラ４４では、この検出信号をトリガ信号として、ドナー分子が発する蛍光の受光が光電変換器２７ａにて、アクセプター分子が発する蛍光の受光が光電変換器２７ｂにてそれぞれ開始されて、受光された蛍光の蛍光信号の信号処理が行われる（ステップＳ２０）。
具体的には、アンプ５２から供給された周波数ｆの正弦波信号を参照信号として、ＩＱミキサ５４ａ，５４ｂで合成され、ｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号が生成される。この処理信号は、コントローラ４４に供給される。

コントローラ４４では、フィルタリング処理が行われ、ｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分が取り除かれ、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分からなる処理信号が取り出される。この信号は、アンプ６４を介してＡ／Ｄ変換器６６に供給される。
ここで、コントローラ４４のシステム制御器６０には、発振器４７にて生成される周波数Δｆの正弦波信号の整数倍の周波数（ｎ・Δｆ）を持つ信号が供給され、この信号に同期してＡ／Ｄ変換器６６にてドナー分子の発する蛍光の処理信号及びアクセプター分子の発する蛍光の処理信号のサンプリングが行われる（ステップＳ３０）。
こうしてデジタル化された処理信号は、分析装置８０に供給される。

分析装置８０では、サンプリングされたアクセプター分子の蛍光の処理信号に対して周波数分析が行われる（ステップＳ４０）。周波数分析は、周波数Δｆの整数分の１の周波数を周波数分解能として、行われる。周波数分析後の、０Ｈｚにおける処理信号の成分は、アクセプター分子にレーザ光が照射されて発した蛍光の蛍光信号成分である。周波数Δｆにおける処理信号の成分は、ＦＲＥＴにより発したアクセプター分子の蛍光の蛍光信号成分である。このように、蛍光信号成分は、レーザ光の強度変調の周波数の違いを利用して取り出される。
得られた周波数分析の結果から、０Ｈｚにおけるアクセプター分子の蛍光の処理信号の位相に対する、ΔｆＨｚにおけるアクセプター分子の蛍光の処理信号の位相遅れの比を求める。この比が予め設定された閾値と比較され、この閾値を超える場合、ＦＲＥＴが発生したと判定することで、ＦＲＥＴの検出が行われる（ステップＳ５０）。
その際、アクセプター分子の蛍光の処理信号の他に、ドナー分子の蛍光の処理信号の位相遅れの比を求め、この比を用いて、ＦＲＥＴの検出を綜合的に行うこともできる。
最後に、フローサイトメータ１０にて測定点を通過して測定されるサンプル数が所定の数に達したか、例えばサンプル数が１０００に達したか否かを判定し、サンプル数が所定の数に達するまで測定を続ける。

このように、強度変調したレーザ光をサンプル中のドナー分子に照射してアクセプター分子から発する蛍光を受光し、信号処理し、レーザ光の強度変調に対する位相遅れを求めることで、ＦＲＥＴの発生の有無の判定を短時間に行うことができ、測定点を通過するサンプルのＦＲＥＴの検出を効率よく行うことができる。

図７は、ドナー分子のエネルギー吸収と蛍光及びアクセプター分子の吸収と蛍光のスペクトルの例を示す図である。図８は、ＦＲＥＴの発生を判り易く説明した説明図である。
図７では、ドナー分子がＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプター分子がＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）であるときのエネルギーの吸収、蛍光放射の特性を示している。図７中、曲線Ａ₁はＣＦＰのエネルギー吸収スペクトルを、曲線Ａ₂はＣＦＰの蛍光放射スペクトルを、曲線Ｂ₁はＹＦＰのエネルギー吸収スペクトルを、曲線Ｂ₂はＹＦＰの蛍光放射スペクトルをそれぞれ示す。図７中、斜線の部分は、ＣＦＰが放射した蛍光をＹＦＰがエネルギー吸収して、ＦＲＥＴが生じる波長帯域を示す。

一般に、ＦＲＥＴは、ドナー分子がレーザ光により励起され、その一部分が蛍光を放射し、一部のエネルギーはクーロン相互作用によりアクセプター分子へ流れる。このエネルギー移動は、２ｎｍ以下の極めて至近距離によって生じるものであり、このエネルギー移動が、分子の相互作用（結合）を表す。したがって、エネルギー移動が起きることで、アクセプター分子が励起されてアクセプター分子から蛍光が放射される。このとき、図７に示すように、ドナー分子の蛍光放射波長帯域と、アクセプター分子のエネルギー吸収の波長帯域とが一部分で重なっていることが、ＦＲＥＴの発生において必要である。

本発明では、図８に示すように、周波数ｆ＋Δｆで強度変調したレーザ光が照射されたドナー分子は蛍光を放射し、その蛍光がアクセプター分子を励起して、周波数ｆ＋Δｆで蛍光強度の変化する蛍光をアクセプター分子は放射する。同時に、周波数ｆで強度変調されたレーザ光が照射されたアクセプター分子は周波数ｆで蛍光強度が変化する蛍光を放射する。これによって、周波数ｆ+Δｆの蛍光と周波数ｆの蛍光を同時に受光するが、この２つの蛍光の蛍光信号は、上記周波数の違いによって分離することができる。

このようなＦＲＥＴの現象を、１次の緩和過程により以下のように簡単に説明することができる。具体的に、ＦＲＥＴ現象は、以下の方程式で規定される。

ここで、Ｗ_dはドナー分子の励起状態密度、Ｗ_aはアクセプター分子の励起状態密度、ｋ_dはドナー分子の蛍光放射速度、k_aはアクセプターの蛍光放射速度、k_daはＦＲＥＴ速度をそれぞれ表す。また、ｐe^jωｔはレーザ光により単位時間に励起される状態密度であり、ωは２πｆ（ｆは強度変調の周波数）を表す（角周波数）。

ここで、Ｗ_d及びＷ_aは角周波数ωを用いて下記式（３）、（４）で表される。

上記式（３）、（４）におけるＷ_d、Ｗ_aの位相は、下記式（５），（６）となる。
一方、レーザ光がアクセブター分子を直接励起して蛍光を発するとき、蛍光は下記式（７）にしたがって表される。

レーザ光の照射により励起したアクセプター分子が蛍光を発するとき、Ｗ_aは、上記式（７）から下記式（８）で表され、下記式（９）に示す位相を生じる。

このとき、上記式（６）及び式（９）から位相の比を求めると、下記式（１０）のようになる。

上記式（１０）で求められる比は、アクセプター分子に直接レーザ光を照射したときの位相遅れに対する、ドナー分子にレーザ光を照射しＦＲＥＴを介してアクセプター分子が発する蛍光の位相遅れの比を表す。したがって、この比の値と予め設定された閾値とを比較して、比の値が閾値よりが大きい場合ＦＲＥＴが発生していると判定する。
特に、多くのドナー分子及びアクセプター分子において、ｋ_d，ｋ_a＞＞k_daであるので、上記式（１０）は、下記式（１１）のように表すことができ、ｋ_d,ｋ_aにて比を表すことができる。さらに、ω²＜＜ｋ_d・ｋ_aのとき、上記比は、下記式（１２）のように表される。
特に、上記放射速度ｋ_d,ｋ_aが比較的等しい場合、上記式（１２）で定まる比の値は２になる。したがって、分析装置８０では、アクセプター分子の放射する蛍光の測定結果である位相遅れの比を算出することにより、ＦＲＥＴの発生の有無を精度良く判定することができる。

フローサイトメータ１０では、単独のドナー分子をレーザ光で照射したときの蛍光の位相遅れと、レーザ光を照射してアクセプター分子との間でＦＲＥＴが発生したときのドナー分子の蛍光の位相遅れとの比を求めることもできるが、アクセプター分子における位相遅れの比の値が上述したように２になるとき、ドナー分子における位相遅れの比の値は１近傍の値となり、アクセプター分子における位相遅れの比に比べてＦＲＥＴの検出が難しくなる。このため、本発明では、アクセプター分子の蛍光の位相遅れの比を求める。勿論、アクセプター分子の蛍光の位相遅れの比に加えて、ドナー分子の蛍光の位相遅れの比を用いてＦＲＥＴを綜合的に検出することもできる。

従来、ドナー分子の励起用レーザ光をドナー分子に照射し、ＦＲＥＴを介して発するアクセプター分子の蛍光強度を測定する方法が行われている。しかし、この方法の場合、アクセプター分子がドナー分子の励起用レーザ光によって励起されて蛍光を発することもあり、ＦＲＥＴにより励起されたアクセプター分子の発する蛍光の他、ドナー分子の励起用レーザ光によって励起されて発するアクセプター分子の蛍光を余分に受光する。このため、発生効率の低いＦＲＥＴの場合ＦＲＥＴの誤検出を行うといった問題が生じる。しかし、本発明は、ドナー分子の励起用レーザ光と、アクセプター分子の励起用レーザ光とを用い、これらのレーザ光を所定の周波数で強度変調を行い、かつ、そのときの強度変調の周波数を、蛍光の識別のために周波数Δｆずらす。さらに、これらのレーザ光によって発する蛍光の受光後、ＦＲＥＴを介して発するアクセプター分子の蛍光の位相遅れと、アクセプター分子がレーザ光で励起されて発する蛍光の位相遅れとを求め、これらの位相遅れを用いてＦＲＥＴを検定する。このとき位相遅れの比の値は、上述したようにＦＲＥＴの有無により比較的大きく変化する。このため、ＦＲＥＴ効率が低い場合でも検出を精度良く行うことができる。又、上記フローサイトメータにおいて、信号処理を行うことでＦＲＥＴの検出ができるので、短時間に効率よくサンプルの測定ができ、統計的にＦＲＥＴ検出結果を纏めることができ、注目する分子の相互作用を調べることができる。

以上、本発明のＦＲＥＴ検出方法及び装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。

本発明のＦＲＥＴ検出装置の一実施形態であるフローサイトメータの概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータにおけるレーザ光源部の概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータにおける受光部の概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータにおける制御・処理部の概略構成図である。 図４に示す制御・処理部におけるＳＳＢ変調器のブロック構成図である。 本発明のＦＲＥＴ検出方法の一例の流れを示すフローチャートである。 ドナー分子のエネルギー吸収と蛍光及びアクセプター分子の吸収と蛍光のスペクトルの例を示す図である。 ＦＲＥＴの発生を説明する説明図である。

符号の説明

１０ フローサイトメータ
１２ サンプル
２０ 検出部
２２ レーザ光源部
２２ａ ドナー励起光源
２２ｂ アクセプター励起光源
２３ａ，２３ｂ レンズ系
２４，２６ 受光部
２６ａ レンズ系
２６ｂ ダイクロイックミラー
２６ｃ₁，２６ｃ₂ バンドパスフィルタ
２７ａ，２７ｂ 光電変換器
２８ 制御・処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
３４ａ，３４ｂ レーザドライバ
４０ 信号生成部
４２ 信号処理部
４４ コントローラ
４６，４７ 発振器
４８，５６ パワースプリッタ
５０ ＳＳＢ変調器
５０ａ ９０度ハイブリッド
５０ｂ，５０ｃ ミキサ
５０ｄ ９０°移相器
５２，５４ａ，５４ｂ，６４ 増幅器
５８ａ，５８ｂ ＩＱミキサ
６０ システム制御器
６２ ローパスフィルタ
６６ Ａ／Ｄ変換器
８０ 分析装置

Claims (10)

1. レーザ光の照射によって励起された第１の分子が発する蛍光が励起光として第２の分子を励起し、この励起された第２の分子が発する蛍光を受光することによって、第1の分子のエネルギーが第２の分子に移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を検出するＦＲＥＴ検出方法であって、
   第１の分子を励起するために、第１の周波数で強度変調した第１のレーザ光を第１の分子に照射するとともに、第２の分子を励起するために、第１の周波数と異なる第２の周波数で強度変調した第２のレーザ光を第２の分子に照射するステップと、
   第２の分子が発する蛍光を受光するステップと、
   受光した第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分の、第１のレーザ光の強度変調に対する第1の位相遅れと、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分の、第２のレーザ光の強度変調に対する第２の位相遅れとを取り出し、この第１の位相遅れと第２の位相遅れとに基づいて、第1の分子のエネルギーが第２の分子に移動するエネルギー移動を検出するステップと、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出方法。
2. 前記エネルギー移動は、前記第２の位相遅れに対する前記第１の位相遅れの比によって検定される請求項１に記載のＦＲＥＴ検出方法。
3. 前記第１のレーザ光は、前記第１のレーザ光の強度変調のために第１の周波数を有する第１の変調信号を用いて強度変調され、前記第２のレーザ光は、前記第２のレーザ光の強度変調のために第２の周波数を有する第２の変調信号を用いて強度変調され、前記第１の周波数の変調信号は、前記第２の周波数の変調信号に、前記差分周波数の生成信号を合成して得られた信号であり、
   受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号は、前記差分周波数の生成信号に同期して、前記差分周波数の整数倍の周波数をサンプリング周波数としてサンプリングされる請求項１又は２に記載のＦＲＥＴ検出方法。
4. 前記サンプリングされた蛍光信号を前記差分周波数の整数分の１の周波数を周波数分解能として周波数分析をすることにより、前記蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分と蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分とを抽出する請求項３に記載のＦＲＥＴ検出方法。
5. 前記第２の分子が発する蛍光を受光する際、さらに、前記第１の分子が発する蛍光を受光し、
   受光した前記第１の分子の発する蛍光の蛍光信号の、第１のレーザ光の強度変調に対する第３の位相遅れを算出し、この第３の位相遅れをＦＲＥＴの検出に用いる請求項１〜４のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ検出方法。
6. レーザ光の照射によって励起された第１の分子が発する蛍光が励起光として第２の分子を励起し、この励起された第２の分子が発する蛍光を受光することによって、第1の分子のエネルギーが第２の分子に移動するＦＲＥＴを検出するＦＲＥＴ検出装置であって、
   第１の分子を励起するために、第１のレーザ光を第１の分子に照射するとともに、第２の分子を励起するために、第２のレーザ光を第２の分子に照射するレーザ光源部と、
   第２の分子が発する蛍光を受光する受光部と、
   前記レーザ光源部から出射する第１のレーザ光を第１の周波数で強度変調させ、かつ前記レーザ光源部から出射する第２のレーザ光を第１の周波数と異なる第２の周波数で強度変調させるために、変調信号を生成する光源制御部と、
   受光した第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分の、第１のレーザ光の強度変調に対する第1の位相遅れと、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分の、第２のレーザ光の強度変調に対する第２の位相遅れとを取り出し、この第１の位相遅れと第２の位相遅れとに基づいて、第1の分子のエネルギーが第２の分子に移動するエネルギー移動を検定する処理部と、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出装置。
7. 前記処理部は、前記第２の位相差に対する前記第１の位相差の比によって前記エネルギー移動を検定する請求項６に記載のＦＲＥＴ検出装置。
8. 前記光源制御部は、前記第１のレーザ光を、前記第１のレーザ光の強度変調のために第１の周波数を有する第１の変調信号を用いて強度変調させ、前記第２のレーザ光を、前記第２のレーザ光の強度変調のために第２の周波数を有する第２の変調信号を用いて強度変調させ、前記第１の周波数の変調信号は、前記第２の周波数の変調信号に、前記差分周波数の生成信号を合成して得られた信号であり、
   前記処理部は、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号を、前記差分周波数の生成信号に同期して、前記差分周波数の整数倍の周波数をサンプリング周波数としてサンプリングする請求項６又は７に記載のＦＲＥＴ検出装置。
9. 前記処理部は、前記サンプリングされた蛍光信号を前記差分周波数の整数分の１の周波数を周波数分解能として周波数分析をすることにより、前記蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分と前記蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分とを抽出する請求項８に記載のＦＲＥＴ検出装置。
10. 前記受光部は、前記第２の分子が発する蛍光の他に、前記第１の分子が発する蛍光を受光し、
    前記処理部は、前記受光部で受光した第１の分子が発する蛍光の蛍光信号の、第１のレーザ光の強度変調に対する第３の位相遅れを算出し、この第３の位相遅れをＦＲＥＴの検出に用いる請求項６〜９のいずれか１項に記載のＦＲＥＴ検出装置。

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