JP2007215510A - Method for detecting horseradish - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、セイヨウワサビ（学名Ａｒｏｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の検出用プライマー及びプローブ、並びにそれらを用いたセイヨウワサビの検出方法に関する。 The present invention relates to a primer and a probe for detection of horseradish (scientific name: Aromorasia rusticana), and a method for detecting horseradish using them.
セイヨウワサビは、ワサビダイコン又はホースラディッシュとも呼ばれ、ヨーロッパのフィンランド原産と言われているアブラナ科の多年草である。根は直根で黄白色の外観を呈しており、強い辛味と香気を有し、西洋料理の薬味として欠かせない。また、日本でも粉ワサビ及びチューブやパック入りの加工ワサビ製品は、辛味成分としてこのセイヨウワサビを含んでいるものが多い。
日本において栽培されているセイヨウワサビは、青芽及び赤芽の２つの品種に分類される。この２つの品種は形態的には非常に異なっており、まず出芽はその名前の通り、青芽が緑色、赤芽が淡赤色を呈している。また、外観においては、青芽は草丈が６０〜１３０ｃｍで、葉の形状が長楕円形で束生し、長柄を有している。一方、赤芽は、草丈が１００〜１５０ｃｍで、葉は縮葉がほとんどなく、強健粗剛である。更に、根部においては、青芽の根部はタコ足状になりやすく、側根の肥大が少なく棒状に生育する。一方、赤芽の根部は生育が旺盛で、伸長領域が広く、しかも深くなり、側根の肥大も旺盛である。また、その辛味に関与するシニグリン含量は、青芽が赤芽より優っている。
最近、セイヨウワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡが分離された（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８２２７１０）。ミロシナーゼは西洋ナタネ、ホワイトマスタード、ダイコン、カラシナ、シロイヌナズナなどのアブラナ科の植物に存在し、それぞれ異なるミロシナーゼをもっており、ｃＤＮＡの解析からＭＡ、ＭＢ、ＭＣ、及びＴＧＧの４つのサブタイプに分けることができる。例えば、西洋ナタネは、ＭＡ、ＭＢ、及びＭＣの３種類のミロシナーゼの遺伝子をもっているおり、ＭＢはすべての生活環で発現しているが、ＭＡ及びＭＣは種子でわずかに発現していることが報告されている。今まで分離されたミロシナーゼ遺伝子の多くはＭＢに属するが、例えばハツカダイコンには、ＭＢタイプのミロシナーゼの中にも、ＲＭＢ１とＲＭＢ２の２種類のＭＢが存在することが報告されており、それらのアミノ酸レベルでの相同性は９３％である（非特許文献１）。このようにミロシナーゼ遺伝子は、種間で多様性があり、同じ種でも何種類かのミロシナーゼ遺伝子をもっている。セイヨウワサビは、少なくとも１種類のミロシナーゼを有しているが、ＭＡ、ＭＢ及びＭＣのように異なるタイプのミロシナーゼを有しているのか、またハツカダイコンのように同じタイプでも相同性の異なるミロシナーゼを持っているのか、更に、外観的に異なる青芽と赤芽の２品種が同じミロシナーゼを持っているかについては、明らかでなかった。
一方、市販されている加工ワサビ製品には、辛味成分としてワサビ、からし又はセイヨウワサビを含んでいるものが多い。加工食品は、農林物資の規格化及び品質表示の適正化に関する法律（ＪＡＳ法）により、原材料の表示が義務づけられているが、加工ワサビ製品中のセイヨウワサビの含有を確認するために、セイヨウワサビを特異的に且つ高感度に検出する方法の開発が望まれている。
Horseradish cultivated in Japan is classified into two varieties, green bud and red bud. The two varieties are very different in form. First, as the name suggests, the green buds are green and the red buds are light red. In terms of appearance, the green buds have a plant height of 60 to 130 cm, the leaves are long oval and bundled, and have a long handle. On the other hand, the red buds have a plant height of 100 to 150 cm, the leaves have almost no defoliation, and are strong and robust. Furthermore, in the root part, the root part of the green bud tends to have an octopus foot shape, and the side root is not enlarged and grows in a rod shape. On the other hand, the root of the red bud grows vigorously, the elongation region is wide and deep, and the lateral root is enlarged. In addition, the green bud is superior to the red bud in terms of the content of sinigrin involved in the pungent taste.
Recently, a myrosinase cDNA was isolated from horseradish (GeneBank, Accession No. AY822710). Myrosinase is present in cruciferous plants such as western rapeseed, white mustard, radish, mustard, and Arabidopsis thaliana, and each has a different myrosinase, which can be divided into four subtypes of MA, MB, MC, and TGG based on cDNA analysis. it can. For example, rapeseed has three types of myrosinase genes, MA, MB, and MC. MB is expressed in all life cycles, but MA and MC are slightly expressed in seeds. It has been reported. Most of the myrosinase genes isolated so far belong to MB. For example, in radish, two types of MBs, RMB1 and RMB2, have been reported among MB-type myrosinases. The homology at the level is 93% (Non-patent Document 1). Thus, the myrosinase gene has diversity among species, and the same species has several types of myrosinase genes. Horseradish has at least one type of myrosinase, but it has different types of myrosinase such as MA, MB and MC, and also has the same type of myrosinase such as radish. Furthermore, it was not clear whether two varieties of blue buds and red buds that differ in appearance have the same myrosinase.
On the other hand, many processed wasabi products on the market contain horseradish, mustard or horseradish as a pungent component. Processed foods are required to be labeled as raw materials by the Law Concerning the Standardization of Agricultural and Forestry Products and the Appropriate Labeling of Quality (JAS Law). In order to confirm the content of horseradish in processed wasabi products, It is desired to develop a method for specifically and highly sensitively detecting.
本発明者らは、高感度で、且つ特異的なセイヨウワサビの検出方法を開発するために、鋭意研究を重ね、形態やその性質の異なる青芽及び赤芽の２品種のセイヨウワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡを単離し塩基配列を解析した。その結果、この２品種から得られたセイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列は、ＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＴＧＧとはタイプの異なる１種類の塩基配列のみであった。すなわち、セイヨウワサビの青芽と赤芽の２品種は形態や性質は異なっているが、同一のミロシナーゼのみを発現していることを見出した。そして、このミロシナーゼをコードする塩基配列に基づいてプライマーを作成し、このプライマーを用いることにより、セイヨウワサビのミロシナーゼ遺伝子を、高感度に、且つ特異的に検出する方法を見出した。
本発明はこのような知見に基づくものである。
In order to develop a highly sensitive and specific method for detecting horseradish, the present inventors have intensively studied, and from the two varieties of horseradish and red bud of different morphologies and properties, myrosinase has been developed. cDNA was isolated and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequences encoding the horseradish myrosinase obtained from these two varieties were only one type of base sequence different from MA, MB, MC and TGG. That is, it was found that the two varieties of blue bud and red bud of horseradish expressed only the same myrosinase, although their morphology and properties were different. And the primer was created based on the base sequence which codes this myrosinase, By using this primer, the method of detecting the horseradish myrosinase gene highly sensitively and specifically was discovered.
The present invention is based on such knowledge.
従って、本発明は、（Ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）、又は配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）である第１プライマーと、（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（１ｂ）、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセットに関する。
また、本発明は、（Ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）、又は配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）である第１プライマーと、
（Ｂ）配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（３ｂ）、又は配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセットに関する。
本発明によるセイヨウワサビの検出用プライマーセットの好ましい態様においては前記第１プライマーが、配列番号８又は配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーが、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
また、本発明は、前記プライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法に関する。
Accordingly, the present invention provides (A) a DNA primer (1a) comprising an oligonucleotide part consisting of a base sequence of at least 15 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a base sequence represented by SEQ ID NO: 1. A first primer which is a DNA primer (2a) containing at least 15 nucleotides of an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence; and (B) represented by SEQ ID NO: 2 DNA primer (1b) containing an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in the base sequence to be sequenced, or an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and stringent conditions Hybridize below, at least 15 nuclei A combination of the second primer is a DNA primer (2b) containing the oligonucleotide portion of the tides, can function as a primer for polymerase polymerization reaction, to horseradish detection primer set.
The present invention also relates to (A) a DNA primer (3a) comprising an oligonucleotide part consisting of a base sequence of at least 15 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 A first primer which is a DNA primer (4a) comprising an oligonucleotide part of at least 15 nucleotides and hybridizing under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to
(B) from a DNA primer (3b) comprising an oligonucleotide consisting of a base sequence of at least 15 consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 And a second primer which is a DNA primer (4b) containing at least 15 nucleotides of an oligonucleotide, which hybridizes under stringent conditions with the oligonucleotide, and functions as a primer for polymerase polymerization reaction The present invention relates to a primer set for detecting horseradish.
In a preferred embodiment of the primer set for detecting horseradish according to the present invention, the first primer is an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and the second primer is SEQ ID NO: 10 It is an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by
The present invention also provides a horseradish detection, characterized in that a DNA amplification step is performed using a mixed solution containing the primer set, the test sample and a DNA polymerase, and a DNA test step of the obtained reaction solution is performed. Regarding the method.
また、本発明は、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブに関する。
また、本発明は、配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブに関する。
更に、本発明は前記プローブと被検試料を接触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法に関する。
本明細書では、プラス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるセンスプライマーを第１プライマーと称し、マイナス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるアンチセンスプライマーを第２プライマーと称することがある。
Further, the present invention comprises an oligonucleotide part consisting of a base sequence of at least 10 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. The present invention relates to a horseradish detection probe, characterized in that a label is carried on an oligonucleotide containing at least 10 nucleotides that hybridize with an oligonucleotide under stringent conditions.
Further, the present invention comprises an oligonucleotide part consisting of a base sequence of at least 10 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. The present invention relates to a horseradish detection probe, characterized in that a label is carried on an oligonucleotide containing at least 10 nucleotides that hybridize with an oligonucleotide under stringent conditions.
Furthermore, the present invention relates to a method for detecting horseradish, wherein the probe and a test sample are brought into contact with each other and a signal from the label is detected.
In the present specification, a sense primer that is a primer for plus-strand DNA is sometimes referred to as a first primer, and an antisense primer that is a primer for minus-strand DNA is sometimes referred to as a second primer.
本発明のプライマーセットはセイヨウワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするため、ポリメレース重合反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、ＰＣＲと称する）法により、セイヨウワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを特異的に検出することが可能である。また、本発明のプローブは、セイヨウワサビのｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、他のアブラナ科又はアブラナ科以外の植物のｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡにはハイブリダイズしないため、本発明のプローブを用いた検出方法により、セイヨウワサビのゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを特異的に検出することが可能である。 Since the primer set of the present invention specifically hybridizes to horseradish cDNA or genomic DNA, the horseradish cDNA or genomic DNA is specifically synthesized by the polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) method. It is possible to detect. In addition, the probe of the present invention specifically hybridizes to horseradish mRNA and genomic DNA and does not hybridize to mRNA and genomic DNA of other cruciferous or non-brassic plants. Depending on the detection method used, it is possible to specifically detect horseradish genomic DNA and mRNA.
以下、本発明を詳細に説明する。
セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列は１種類のみであり、セイヨウワサビには、青芽及び赤芽の２品種があるが、ともに同じタイプのミロシナーゼのみを有している。本発明のＤＮＡプライマーセット及びプローブは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列を設計の基礎としているが、配列番号３で表される塩基配列のすべての領域から設計されるプライマーやプローブが、セイヨウワサビのミロシナーゼ遺伝子を特異的に検出するために有用である。このことは、後述の実施例に示したセイヨウワサビのミロシナーゼのｃＤＮＡの解析より明らかである。すなわち、本発明者はアブラナ科植物のすべてのミロシナーゼを取得可能なプライマーを用いて、青芽及び赤芽の２種のセイヨウワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡを取得し、青芽の６クローンと赤芽の７クローンについて、ミロシナーゼの一部のアミノ酸をコードする６６３ｂｐの塩基配列を決定した。その結果、青芽と赤芽から得られた１３クローンは、同一のミロシナーゼをコードする塩基配列のみを有していた。また、取得した１３クローンのｃＤＮＡの塩基配列間では若干の塩基の置換が見られたが、ｃＤＮＡのコンセンサスな塩基配列と他のアブラナ科植物のミロシナーゼをコードする塩基配列を比較したところ、最も相同性の高いシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓ）のミロシナーゼ（ＴＧＧ３）をコードする塩基配列でも８０％程度であり、ミロシナーゼをコードする塩基配列は、他のアブラナ科の植物に見られるＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＴＧＧタイプのミロシナーゼと異なるタイプのミロシナーゼであったが、セイヨウワサビの品種間ではよく保存されていた。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
There is only one kind of base sequence encoding horseradish myrosinase, and there are two kinds of horseradish, blue bud and red bud, both of which have only the same type of myrosinase. Although the DNA primer set and probe of the present invention are based on the base sequence encoding horseradish myrosinase, primers and probes designed from all regions of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 are It is useful for specifically detecting the wasabi myrosinase gene. This is apparent from the analysis of horseradish myrosinase cDNA shown in the Examples below. That is, the present inventor obtained cDNA of myrosinase from two kinds of horseradish, blue bud and red bud, using primers capable of obtaining all myrosinases of cruciferous plants. For 7 clones, the base sequence of 663 bp encoding some amino acids of myrosinase was determined. As a result, 13 clones obtained from green bud and red bud had only the base sequence encoding the same myrosinase. In addition, although some base substitution was observed between the obtained cDNA base sequences of 13 clones, the most consensus was obtained by comparing the consensus base sequence of cDNA with the base sequence encoding myrosinase of other cruciferous plants. The base sequence encoding the highly sensitive Arabidopsis myrosinase (TGG3) is about 80%, and the base sequence encoding myrosinase is the MA, MB, MC, and TGG type that is found in other cruciferous plants. Although it was a different type of myrosinase from myrosinase, it was well preserved among horseradish varieties.
更に、取得した６６３ｂｐのｃＤＮＡ配列は、セイヨウワサビのミロシナーゼとしてＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている１７９０ｂｐの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８２２７１０）ともほぼ一致した。このため、本発明者が取得した６６３ｂｐ以外のミロシナーゼをコードする塩基配列も青芽及び赤芽のセイヨウワサビの品種間では保存されているが、他のアブラナ科植物の有するミロシナーゼをコードする塩基配列とは異なっていると考えられる。そのためセイヨウワサビをコードする塩基配列のすべての領域から設計されるプライマー及びプローブがセイヨウワサビのミロシナーゼ遺伝子を特異的に検出するために有用である。 Further, the obtained 663 bp cDNA sequence substantially matched the 1790 bp nucleotide sequence (GeneBank, Accession No. AY822710) registered in GeneBank as horseradish myrosinase. For this reason, the base sequence encoding myrosinase other than 663 bp obtained by the present inventor is also conserved among the varieties of blue bud and red bud horseradish, but the base sequence encoding myrosinase possessed by other cruciferous plants Is considered different. Therefore, primers and probes designed from all regions of the base sequence encoding horseradish are useful for specifically detecting the horseradish myrosinase gene.
配列表の配列番号１で表される塩基配列は、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする１７９０ｂｐのｃＤＮＡの全長の塩基配列である。また配列番号２で表される塩基配列は、その相補鎖の塩基配列である。更に、配列番号３で表される塩基配列は、青芽と赤芽の２品種から取得したミロシナーゼをコードする６６３ｂｐのｃＤＮＡの塩基配列であり、配列番号４で表される塩基配列はその相補鎖の塩基配列である。配列番号３及び４で表される塩基配列は取得した１３クローンの塩基配列を示しているが、塩基の置換のある位置は混合塩基で示している。混合塩基の記載は、Ｙはチミン又はシトシンを示し、Ｍはアデニン又はシトシンを示し、Ｋはグアニン又はチミンを示し、Ｒはグアニン又はアデニンを示し、Ｓはグアニン又はシトシンを示し、Ｗはアデニン又はチミンを示す。これらの塩基配列から本発明のプライマー及びプローブを作成する場合、混合塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることにより、広い品種のセイヨウワサビを検出することが可能となり、検出感度や検出率が上昇すると考えられる。 The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is the full-length base sequence of a 1790 bp cDNA encoding horseradish myrosinase. The base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the base sequence of its complementary strand. Further, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is a base sequence of a 663 bp cDNA encoding myrosinase obtained from two varieties of blue bud and red bud, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is its complementary strand. Is the base sequence. The base sequences represented by SEQ ID NOs: 3 and 4 indicate the base sequences of the 13 clones obtained, but the positions where the bases are replaced are indicated by mixed bases. In the description of the mixed base, Y represents thymine or cytosine, M represents adenine or cytosine, K represents guanine or thymine, R represents guanine or adenine, S represents guanine or cytosine, and W represents adenine or Indicates thymine. When preparing the primer and probe of the present invention from these base sequences, it is possible to detect horseradish of a wide variety by using an oligonucleotide containing a mixed base, and the detection sensitivity and the detection rate are considered to increase. .
本発明のプライマーセットは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡやｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをＰＣＲ法により、特異的に検出するためのプライマーのセットであり、センスプライマー（フォワードプライマー）及びアンチセンスプライマー（リバースプライマー）からなる一対のプライマーのセットである。 The primer set of the present invention is a primer set for specifically detecting, by PCR, cDNA synthesized from genomic DNA or mRNA encoding horseradish myrosinase, and includes a sense primer (forward primer) and an antisense. It is a set of a pair of primers consisting of a primer (reverse primer).
本発明のプライマーセットの第１プライマーは、配列番号１若しくは配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）若しくは（３ａ）、又は配列番号１若しくは配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）若しくは（４ａ）である。また、第２プライマーは、配列番号２若しくは配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（１ｂ）若しくは（３ｂ）、又は配列番号２若しくは配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）若しくは（４ｂ）である。 The first primer of the primer set of the present invention is a DNA primer (1a) or (3a) comprising an oligonucleotide part consisting of a base sequence of at least 15 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, Or a DNA primer (2a) comprising an oligonucleotide part of at least 15 nucleotides that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3; (4a). The second primer is a DNA primer (1b) or (3b) containing an oligonucleotide having a base sequence of at least 15 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 2 or A DNA primer (2b) or (4b) comprising an oligonucleotide part of at least 15 nucleotides that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 .
本発明のプライマーセットの第１プライマーとして用いるプライマー（１ａ）は、配列番号１で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に第１プライマーとして用いるプライマー（３ａ）は、配列番号３で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。 The primer (1a) used as the first primer of the primer set of the present invention contains 15 or more consecutive bases contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Similarly, the primer (3a) used as the first primer contains 15 or more consecutive bases contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. This is because when only an oligonucleotide portion consisting of a base sequence of less than 15 bases is included, the specificity of the primer and the DNA that hybridizes decreases, and it is not useful as a primer. On the other hand, the upper limit of the primer length is not particularly limited as long as it functions as a PCR primer, but is preferably 50 bases or less, more preferably 35 bases or less, and most preferably 30 bases or less.
プライマー（１ａ）においては、配列番号１で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。 In the primer (1a), in addition to the base sequence of at least 15 bases derived from the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, any base sequence (for example, SEQ ID NO: 1) on the 5 'side and / or 3' side A base sequence not derived from the base sequence represented by
プライマー（３ａ）においては、配列番号３で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号３で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（３ａ）の３’末端側は、配列番号３で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、配列番号３で表される塩基配列の３’末端に隣接する配列番号１の塩基配列を含むことができる。 In the primer (3a), in addition to the base sequence of at least 15 bases derived from the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, any base sequence (for example, SEQ ID NO: 3) on the 5 ′ side and / or 3 ′ side is used. A base sequence not derived from the base sequence represented by For example, the 3 ′ terminal side of the primer (3a) consists of a base sequence of at least 15 bases derived from the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, or 3 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 'The base sequence of SEQ ID NO: 1 adjacent to the terminal can be included.
本発明のプライマーセットの第１プライマーとしては、前記のプライマー（１ａ）、及びプライマー（３ａ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（２ａ）、及び前記プライマー（４ａ）を用いることができる。これらのプライマー（２ａ）及びプライマー（４ａ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。 As the first primer of the primer set of the present invention, not only the primer (1a) and the primer (3a) but also the primer (2a) and the primer (4a) corresponding to the mutants thereof are used. Can do. These primer (2a) and primer (4a) are at least 15 nucleotides that hybridize under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by each SEQ ID NO., More preferably Contains a 20 nucleotide portion. This is because when it contains only an oligonucleotide portion of less than 15 nucleotides, it is highly likely that it will not hybridize with an oligonucleotide consisting of a complementary base sequence under stringent conditions, and will not function sufficiently as a primer. On the other hand, the upper limit of the primer length is not particularly limited as long as it functions as a PCR primer, but is preferably 50 bases or less, more preferably 35 bases or less, and most preferably 30 bases or less.
本発明のプライマーセットの第２プライマーとして用いるプライマー（１ｂ）は、配列番号２で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に第１プライマーとして用いるプライマー（３ｂ）は、配列番号４で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。これらの第２プライマーは、１５〜３５塩基を含むことができる。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。 The primer (1b) used as the second primer of the primer set of the present invention contains 15 or more consecutive bases contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Similarly, the primer (3b) used as the first primer contains 15 or more consecutive bases contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4. These second primers can contain 15 to 35 bases. This is because when only an oligonucleotide portion consisting of a base sequence of less than 15 bases is included, the specificity of the primer and the DNA that hybridizes decreases, and it is not useful as a primer. On the other hand, the upper limit of the primer length is not particularly limited as long as it functions as a PCR primer, but is preferably 50 bases or less, more preferably 35 bases or less, and most preferably 30 bases or less.
プライマー（１ｂ）においては、配列番号２で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号２で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。 In the primer (1b), in addition to the base sequence of at least 15 bases derived from the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, any base sequence (for example, SEQ ID NO: 2) on the 5 ′ side and / or 3 ′ side A base sequence not derived from the base sequence represented by
プライマー（３ｂ）においては、配列番号４で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号４で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（３ｂ）の３’末端側は、配列番号４で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、配列番号４で表される塩基配列の３’末端に隣接する配列番号３の塩基配列を含むことができる。 In the primer (3b), in addition to the base sequence of at least 15 bases derived from the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, any base sequence (for example, SEQ ID NO: 4) on the 5 ′ side and / or 3 ′ side is used. A base sequence not derived from the base sequence represented by For example, the 3 ′ terminal side of the primer (3b) consists of a base sequence of at least 15 bases derived from the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, or 3 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 'The base sequence of SEQ ID NO: 3 adjacent to the terminal can be included.
本発明のプライマーセットの第２プライマーとしては、前記のプライマー（１ｂ）、及びプライマー（３ｂ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（２ｂ）、及び前記プライマー（４ｂ）を用いることができる。これらのプライマー（２ｂ）及びプライマー（４ｂ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。 As the second primer of the primer set of the present invention, not only the primer (1b) and the primer (3b) but also the primer (2b) and the primer (4b) corresponding to the mutants thereof are used. Can do. These primer (2b) and primer (4b) are at least 15 nucleotides that hybridize under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by each SEQ ID NO., More preferably Contains a 20 nucleotide portion. This is because when it contains only an oligonucleotide portion of less than 15 nucleotides, it is highly likely that it will not hybridize with an oligonucleotide consisting of a complementary base sequence under stringent conditions, and will not function sufficiently as a primer. On the other hand, the upper limit of the primer length is not particularly limited as long as it functions as a PCR primer, but is preferably 50 bases or less, more preferably 35 bases or less, and most preferably 30 bases or less.
本発明のプライマーセットの第１プライマー及び各第２プライマーの長さは、特に限定されないが、それぞれ１５ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであること好ましく、より好ましくは２０ｍｅｒ〜３５ｍｅｒ、最も好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。 The lengths of the first primer and each second primer of the primer set of the present invention are not particularly limited, but are preferably 15 mer to 50 mer, more preferably 20 mer to 35 mer, and most preferably 20 mer to 30 mer.
また、配列番号３及び４に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプライマーは、これらの混合塩基を含むディジェネレイテッドプライマーでもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一の配列からなるプライマーでもよい。 The base sequences described in SEQ ID NOs: 3 and 4 include mixed bases of Y, M, K, R, S, and W. This indicates that there is a substitution in the gene encoding horseradish myrosinase, but the primer of the present invention may be a degenerated primer containing these mixed bases, or only one of the bases. A primer consisting of a single sequence may be used.
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプライマーセットのＤＮＡプライマーのＴｍは、６０〜６８、好ましくは、６５〜６８であることが望ましい。なお、前記Ｔｍを計算する方法は、いくつかの方法が提案されているが、１８ヌクレオチド以上の鎖長である場合、例えば、下記の式（Ｉ）：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ） （Ｉ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）により求められる。この式で［Ｎａ＋］＝５０ｍＭで計算すると、１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］は、およそ２１．５９７０９８となりＴｍ値を計算することができる。また、鎖長が１８ヌクレオチドより短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
The “stringent conditions” are not particularly limited. For example, in a solution containing 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhardt, 0.01% denatured salmon sperm nucleic acid [Tm−25 ° C.] And the like, and the like. The Tm of the DNA primer of the primer set of the present invention is 60 to 68, preferably 65 to 68. Several methods have been proposed for calculating the Tm. When the chain length is 18 nucleotides or longer, for example, the following formula (I):
Tm = 81.5-16.6 log 10 [Na + ] +0.41 (% G + C) − (600 / N) (I)
(Where N is the chain length of the oligonucleotide probe and% G + C is the content of guanine and cytosine residues in the oligonucleotide probe primer). When calculating with [Na + ] = 50 mM in this formula, 16.6 log 10 [Na + ] is approximately 21.597098, and the Tm value can be calculated. When the chain length is shorter than 18 nucleotides, Tm is, for example, the sum of the product of A + T (adenine + thymine) residue and 2 ° C, and the product of G + C residue and 4 ° C. It can be estimated by [(A + T) × 2 + (G + C) × 4].
前記第１プライマー及び第２プライマーは公知の任意の態様で修飾（例えばビオチン化又は発光物質によるラベル化）されていてもよい。例えば、各塩基がビオチン化又は発光物質により標識されていてもよい。また、５’末端が公知の任意の態様で修飾されていてもよい。例えば、標識したプライマーを用いることにより、ＴａｑＭａｎ法などのリアルタイムＰＣＲによる遺伝子の定量を行なうことが可能となる。本発明による前記の第１プライマー及び第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイド法）によって調製することができる。 The first primer and the second primer may be modified in any known manner (for example, biotinylation or labeling with a luminescent substance). For example, each base may be labeled with biotinylation or a luminescent substance. Further, the 5 'end may be modified in any known manner. For example, by using a labeled primer, it is possible to perform gene quantification by real-time PCR such as TaqMan method. The first primer and the second primer according to the present invention can be prepared by a known DNA synthesis method (for example, phosphoramidide method) using a normal automatic DNA synthesizer (for example, Applied Biosystems).
本明細書で「ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することができる」とは、第１プライマーと第２プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを含む混合液に、セイヨウワサビのミロシナーゼの遺伝子を加え、通常の条件でＤＮＡ増幅工程を行った場合に、ＰＣＲ産物が得られることを意味する。そのため、前記第１プライマーと第２プライマーの組み合わせは、セイヨウワサビのミロシナーゼを特異的に検出可能な組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは第１プライマーが、配列番号８又は９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第２プライマーが配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。また、第１プライマー及び第２プライマーは、１種のプライマーを用いてもよいし、２種以上のプライマー、例えば、プライマー（１ａ）及びプライマー（２ａ）を組み合わせて用いてもよい。 In this specification, “can function as a primer for polymerization polymerization” means that a horseradish myrosinase gene is added to a mixed solution containing a first primer, a second primer, and a DNA polymerase under normal conditions. It means that a PCR product is obtained when a DNA amplification step is performed. Therefore, the combination of the first primer and the second primer is not particularly limited as long as it can specifically detect horseradish myrosinase, but preferably the first primer is represented by SEQ ID NO: 8 or 9. The oligonucleotide is composed of a base sequence, and the second primer is an oligonucleotide composed of a base sequence represented by SEQ ID NO: 10. In addition, as the first primer and the second primer, one kind of primer may be used, or two or more kinds of primers, for example, the primer (1a) and the primer (2a) may be used in combination.
本発明のプローブは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをハイブリダイズの原理を用いた方法で検出するためのオリゴヌクレオチドである。本発明のプローブには、ＰＣＲに用いる前記第１プライマー及び第２プライマーも含まれる。更に、ＤＮＡプローブのみではなくＲＮＡプローブも含まれる。ＲＮＡプローブの場合は、オリゴヌクレオチドのチミンの代わりにウラシルが含まれる。 The probe of the present invention is an oligonucleotide for detecting genomic DNA encoding horseradish myrosinase, mRNA or cDNA synthesized from mRNA by a method using the principle of hybridization. The probe of the present invention also includes the first primer and the second primer used for PCR. Furthermore, not only DNA probes but also RNA probes are included. In the case of RNA probes, uracil is included instead of oligonucleotide thymine.
本発明のプローブは、（Ａ）配列番号１〜４で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列において、連続する少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基、最も好ましくは２０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、プローブＡと称する）であるか、又は（Ｂ）前記配列番号１〜４で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、より好ましくは１５ヌクレオチド部分、最も好ましくは２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、プローブＢと称する）である。 The probe of the present invention comprises (A) any one of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4, and a continuous base sequence of at least 10 bases, more preferably 15 bases, most preferably 20 bases. An oligonucleotide comprising the oligonucleotide part (hereinafter referred to as probe A), or (B) an oligonucleotide consisting of any one of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 and a stringent An oligonucleotide containing at least 10 nucleotides, more preferably 15 nucleotides, most preferably 20 nucleotides (hereinafter referred to as probe B) that hybridizes under mild conditions.
本発明のプローブＡは、１０塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションができず、特異性が低くなるためプローブとして有用でない。それぞれのプローブは、少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むため、例えば、その配列番号で表される塩基配列から選択される任意の連続する１０塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることができる。更に、それぞれのプローブは、それぞれの配列番号で表される塩基配列以外に５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列に由来しない塩基配列）が付加されたオリゴヌクレオチドであってもよい。付加される塩基配列は、例えば、タグとして検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列でもよい。また、配列番号１〜４に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプローブは、これらの混合塩基を含むプローブの混合物でもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一のプローブでもよい。 When the probe A of the present invention contains only an oligonucleotide portion consisting of a base sequence of less than 10 bases, it cannot be hybridized under stringent conditions and has low specificity, so it is not useful as a probe. Since each probe includes an oligonucleotide having a base sequence of at least 10 bases, for example, the probe is made of an oligonucleotide having an arbitrary base sequence of 10 bases or more selected from the base sequence represented by the sequence number. be able to. Furthermore, each probe has an arbitrary base sequence on the 5 ′ side and / or 3 ′ side other than the base sequence represented by each SEQ ID NO (for example, a base sequence not derived from the base sequence represented by SEQ ID NO: 1). ) May be added. The base sequence to be added may be, for example, a base sequence with which a detection oligonucleotide hybridizes as a tag. The base sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 4 include mixed bases of Y, M, K, R, S, and W. This indicates that there is a substitution in the gene encoding horseradish myrosinase. However, the probe of the present invention may be a mixture of these mixed bases or a single base containing only one of the bases. One probe may be used.
本発明のプローブＢは、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドを含む。１０ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プローブとして機能しなくなるからである。 The probe B of the present invention comprises at least 10 nucleotides that hybridize under stringent conditions with an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence represented by each SEQ ID NO. This is because when it contains only an oligonucleotide portion of less than 10 nucleotides, it is highly likely that it will not hybridize with an oligonucleotide consisting of a complementary base sequence under stringent conditions and will not function as a probe.
本発明のプローブの長さの上限はプローブとして機能する長さであれば特に制限されないが、一般的には５００ｍｅｒ以下、より好ましくは３００ｍｅｒ以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが使用される。長いプローブの場合は、セイヨウワサビ以外のミロシナーゼとハイブリダイズする塩基配列を含むこともあるが、ハイブリダイズの条件を厳しくすることによって特異性を挙げることができるため、問題はない。 The upper limit of the length of the probe of the present invention is not particularly limited as long as it functions as a probe, but generally an oligonucleotide having a base sequence of 500 mer or less, more preferably 300 mer or less is used. In the case of a long probe, it may contain a base sequence that hybridizes with myrosinase other than horseradish, but there is no problem because the specificity can be raised by tightening the hybridization conditions.
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプローブのＴｍは、３００〜６８、好ましくは、４５〜６８、より好ましくは、６０〜６８であることが望ましい。 The “stringent conditions” are not particularly limited. For example, in a solution containing 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhardt, 0.01% denatured salmon sperm nucleic acid [Tm−25 ° C.] And the like, and the like. The Tm of the probe of the present invention is 300 to 68, preferably 45 to 68, and more preferably 60 to 68.
本発明のプローブの標識は特に限定されず、公知の方法で標識することができる。プローブの標識物質としては、従来公知の任意の物質、例えば３２Ｐなどの放射性物質、好ましくは非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチン等）を用いることができる。この標識物質から信号を発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来公知の任意の方法を用いる。 The label of the probe of the present invention is not particularly limited, and can be labeled by a known method. As the probe labeling substance, any conventionally known substance, for example, a radioactive substance such as 32 P, preferably a non-radioactive substance (enzyme, fluorescent dye, luminescent substance, biotin, etc.) can be used. As a method of generating a signal from the labeling substance and measuring the signal, any conventionally known method is used.
本発明によるセイヨウワサビの検出方法は、例えば、セイヨウワサビの植物体の品種を同定する方法、及びセイヨウワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法を意味する。セイヨウワサビ（学名Ａｒｏｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の品種としては、例えば、青芽及び赤芽を挙げることができる。 The method for detecting horseradish according to the present invention means, for example, a method for identifying the varieties of horseradish plants and a method for detecting the presence or absence of a plant-derived portion of horseradish. Examples of varieties of horseradish (scientific name: Aromoria rusticana) include blue bud and red bud.
セイヨウワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法は、例えば、セイヨウワサビの根茎をすりつぶした部分を含む加工食品、例えば、練りワサビや粉ワサビの原料にセイヨウワサビが含まれているか否かを検出することができる。 The method for detecting the presence or absence of a plant-derived portion of horseradish is, for example, processed food containing a portion obtained by grinding a root of horseradish, Can be detected.
本発明のプライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法（以下、プライマーセット検出方法と称することがある）によって、セイヨウワサビのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。 A method for detecting horseradish (hereinafter referred to as “horseradish”), characterized in that a DNA amplification step is performed using a mixed solution containing the primer set, test sample and DNA polymerase of the present invention, and a DNA test step of the obtained reaction solution is performed. It is possible to detect horseradish cDNA and genomic DNA (sometimes referred to as a primer set detection method).
本発明のプローブと被検試料を接触させ、プローブに担持した標識からの信号を検出することを特徴とするセイヨウワサビの検出方法（以下、プローブ検出方法と称することがある）により、セイヨウワサビのｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。 According to the horseradish detection method (hereinafter sometimes referred to as probe detection method), which comprises contacting the probe of the present invention with a test sample and detecting a signal from a label carried on the probe, It is possible to detect mRNA, cDNA synthesized from mRNA, and genomic DNA.
本発明の前記プライマーセット検出方法及びプローブ検出方法で用いる「被検試料」は、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードしている塩基配列からなる遺伝子を含有している可能性のあるものであれば特に限定されない。ここで遺伝子とは、特に限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ等を挙げることができる。そのため、具体的には「被検試料」はセイヨウワサビの入っている可能性のある加工食品、例えば、ねりワサビ、粉ワサビなどがある。このような加工食品を液状にしたものや、加工食品から核酸を抽出した核酸溶液も含まれる。また、セイヨウワサビの品種を確認する場合は、植物体を構成する細胞を含む分散液や、細胞から抽出した核酸を含む溶液も被検試料となる。 The “test sample” used in the primer set detection method and probe detection method of the present invention is particularly limited as long as it may contain a gene comprising a base sequence encoding horseradish myrosinase. Not. Here, the gene is not particularly limited, and examples thereof include genomic DNA, mRNA, cDNA synthesized from mRNA, and the like. Therefore, specifically, the “test sample” includes processed foods that may contain horseradish, for example, horseradish and powdered wasabi. Such processed foods in liquid form and nucleic acid solutions obtained by extracting nucleic acids from processed foods are also included. When confirming horseradish varieties, a dispersion liquid containing cells constituting a plant body and a solution containing nucleic acids extracted from the cells also serve as test samples.
公知の方法によりＤＮＡやＲＮＡを抽出し、被検試料として用いることが可能である。例えばゲノムＤＮＡを抽出する方法は、公知のＤＮＡ抽出法を適用することができ、たとえばフェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法などが挙げられる。また、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを用いることも可能である。また、ｍＲＮＡを抽出する場合も、公知の方法でＲＮＡを抽出することが可能であり、例えば、塩酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法やＡＧＰＣ変法、或いはＲＮＡが結合するカラムを用いた市販のＲＮＡ抽出用キットなどを用いることが可能である。 DNA or RNA can be extracted by a known method and used as a test sample. For example, a known DNA extraction method can be applied as a method for extracting genomic DNA, and examples thereof include a phenol extraction method, a cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method, and an alkaline SDS method. It is also possible to use a commercially available genomic DNA extraction kit. In addition, when extracting mRNA, RNA can be extracted by a known method. For example, commercially available RNA using a guanidine hydrochloride / chloroform (AGPC) method, a modified AGPC method, or a column to which RNA is bound. An extraction kit or the like can be used.
ｍＲＮＡは、プローブと直接ハイブリダイズさせて検出する場合は、ｍＲＮＡのまま使用することが可能である。一方、プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼと被検試料を混合し、ＰＣＲ法により検出する場合は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しなければならない。ｃＤＮＡ合成は、公知の方法を利用することが可能であり、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版［ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．，コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行，（２００１）］等に記載の逆転写酵素を用いる逆転写反応により実施できる。逆転写酵素としては、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ又はＡＭＶリバーストランスクリプターゼ等を用いることが可能である。ｃＤＮＡ合成に用いるプライマーは、ミロシナーゼに特異的なアンチセンスプライマー、例えば、前記第２プライマーを用いることも可能であるし、６ｍｅｒ〜９ｍｅｒのランダムプライマ−を用いてｃＤＮＡを合成することも可能である。このようにして得られたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりミロシナーゼをコードする遺伝子配列を検出することができる。 When mRNA is detected by directly hybridizing with a probe, it can be used as it is. On the other hand, when a primer set, DNA polymerase and a test sample are mixed and detected by the PCR method, cDNA must be synthesized from mRNA. A known method can be used for cDNA synthesis. For example, Molecular Cloning a Laboratory Manual 3rd edition [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (2001)], etc., can be performed by a reverse transcription reaction using a reverse transcriptase. As reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase or AMV reverse transcriptase can be used. As a primer used for cDNA synthesis, an antisense primer specific for myrosinase, for example, the second primer can be used, or cDNA can be synthesized using a random primer of 6 mer to 9 mer. . Using the cDNA thus obtained, a gene sequence encoding myrosinase can be detected by PCR.
プライマーセットを用いる本発明のプライマーセット検出方法は、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検出工程とからなる。プライマーセット検出方法においては、最初にＤＮＡ増幅工程を行うことが好ましい。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣＲ法を用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１プライマー及び第２プライマーとともに、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ポリメラーゼを用いて増幅サイクルを繰り返す。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に９５℃までの温度で活性を維持することができるＤＮＡポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程では、前記のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及び液体被検試料を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実施することができる範囲で容易に決定することができる。この混合液は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム）を含有することができる。 The primer set detection method of the present invention using a primer set comprises (1) a DNA amplification step and (2) a DNA detection step. In the primer set detection method, it is preferable to first perform a DNA amplification step. In the DNA amplification step (1) of the present invention, a PCR method can be used. In the DNA amplification step (1) of the present invention, the amplification cycle is repeated using a DNA polymerase, particularly a heat-resistant polymerase, together with the first primer and the second primer. As the thermostable DNA polymerase, it is possible to use a DNA polymerase that can maintain activity particularly at a temperature up to 95 ° C., for example, a commercially available Taq polymerase. In the DNA amplification step of the present invention, a mixed solution containing the primer set, DNA polymerase, and liquid test sample is used. The usage amounts of the first primer, the second primer, and the DNA polymerase vary depending on the type of the liquid test sample, but can be easily determined as long as the DNA amplification step by the PCR method can be performed. This mixture can optionally contain a buffer (eg, Tris-HCl buffer), a stabilizer (eg, gelatin), or salts (eg, sodium chloride, magnesium chloride).
プライマーセット検出方法では、前記の混合液を用いてＰＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、例えば（ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃、約１０秒〜２分間）、（ii）１本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃、約３０秒〜３分間）、及び（iii）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約６５℃〜８０℃、約３０秒〜５分間）とからなる。 In the primer set detection method, an amplification cycle of the PCR method is performed using the above mixed solution. The amplification cycle includes, for example, (i) a DNA denaturation step (about 90 ° C. to 95 ° C., about 10 seconds to 2 minutes), (ii) an annealing step (about 37 ° C.) of the single-stranded DNA and the first primer and the second primer. And (iii) a DNA synthesis step (about 65 ° C. to 80 ° C., about 30 seconds to 5 minutes) by DNA polymerase.
ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を利用する方法、電気泳動後にフィルターに移してサザンブロットハイブリッド法を行う方法、増幅したＤＮＡをそのままフィルターにブロットしてドットブロットハイブリッド法を行う方法、又は、ジデオキシ法による塩基配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、又はアクリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用し、分子量により目的のＰＣＲ産物を検出することができる。 As the DNA testing process, after gel electrophoresis, a method using ethidium bromide staining, a method of transferring to a filter after electrophoresis and performing a Southern blot hybrid method, and a dot blot hybrid method of blotting amplified DNA directly on a filter and performing a dot blot hybrid method The method or the base sequence determination method by dideoxy method, etc. can be used. In the case of performing gel electrophoresis, for example, submarine type electrophoresis using agarose gel as a carrier or slab type electrophoresis using acrylamide can be used to detect a target PCR product based on molecular weight.
ＰＣＲを行った後に、サザンブロットハイブリッド法、ドットブロットハイブリッド法等でＰＣＲ産物を検出する場合には、プライマーに用いた以外のセイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列からなる非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ、又は、化学発光物質、蛍光物質で標識したプローブ）を用いることができる。 When PCR products are detected by Southern blot hybrid method, dot blot hybrid method, etc. after PCR, a non-radioactive probe comprising a base sequence encoding horseradish myrosinase other than that used as a primer (for example, an enzyme) A labeled probe, a biotinylated probe, a digoxigenated probe, or a probe labeled with a chemiluminescent substance or a fluorescent substance) can be used.
本発明のプローブ検出法は、プローブと被検試料を接触させプローブからの信号を検出することにより、セイヨウワサビの検出を行う。公知の方法で抽出したＤＮＡやＲＮＡを被検試料として、ノザンブロットハイブリダイゼーションやサザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより、ミロシナーゼをコードするｍＲＮＡやＤＮＡの存在を解析することができる。また本発明のプローブは、慣用のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いることも可能である。 The probe detection method of the present invention detects horseradish by bringing a probe into contact with a test sample and detecting a signal from the probe. The presence of mRNA or DNA encoding myrosinase can be analyzed by performing Northern blot hybridization or Southern blot hybridization using DNA or RNA extracted by a known method as a test sample. The probe of the present invention can also be used for conventional in situ hybridization.
本発明のプローブと、セイヨウワサビの植物体、及びその類縁種の染色体とのハイブリダイゼーション条件は、前記「ストリンジェントな条件」が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件が挙げられる。 Examples of the hybridization conditions of the probe of the present invention with the horseradish plant and the chromosomes of its related species include the above-mentioned “stringent conditions”. For example, 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × An example is a condition in which the solution is kept overnight at a temperature of [Tm−25 ° C.] in a solution containing Denhardt and 0.01% denatured salmon sperm nucleic acid.
また、前記ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の２５℃低い温度、好ましくは、２２℃低い温度、より好ましくは、２０℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、６０℃以上、好ましくは、６２℃以上、より好ましくは、６５℃以上等の条件下でのハイブリダイゼーションを行い、より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、１×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃低い温度、より好ましくは、３０℃低い温度、さらに好ましくは、２５℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、３０℃以上、３７℃以上、４２℃以上、４５℃以上等の条件下での洗浄等を行うことができる。 Further, in the hybridization under the stringent conditions, from the viewpoint of further improving accuracy, lower ionic strength, for example, conditions such as 0.1 × SSC, 0.2 × SSC, and / or higher temperatures, for example, are used. The temperature is 25 ° C. lower than the Tm value of the nucleic acid to be used, preferably 22 ° C. lower temperature, more preferably 20 ° C. lower temperature, specifically 60 ° C. or more, preferably depending on the Tm value of the nucleic acid used. Hybridization is performed at a temperature of 62 ° C. or higher, more preferably 65 ° C. or higher, and more stringent washing conditions, specifically, a low ionic strength buffer such as 1 × SSC, 2 × SSC, etc. Higher temperature, for example, 40 ° C. lower than the Tm value of the nucleic acid used, more preferably 30 ° C. lower temperature, more preferably 25 ° C. lower temperature Specifically, varies depending Tm value of the nucleic acid used, 30 ° C. or higher, 37 ° C. or higher, 42 ° C. or higher, it can be cleaned like under conditions such as 45 ° C. or higher.
本発明のプライマーセット及びプローブを含むセイヨウワサビを検出するための試薬及びキットを調製することも可能である。前記試薬やキットは、本発明のプライマーセット検出方法やプローブ検出方法により、セイヨウワサビを検出することが可能である。 It is also possible to prepare reagents and kits for detecting horseradish containing the primer set and probe of the present invention. The reagents and kits can detect horseradish by the primer set detection method and probe detection method of the present invention.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
《遺伝子取得例１：セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするｃＤＮＡの単離》
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成
合成ＤＮＡ機モデル３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いホスホアミダイト法により、
配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマー、
ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＴＲ ＹＭＲ ＡＡＹ ＴＣＲ ＴＡＲ ＴＴＲ ＴＣＮ ＣＣ−３’、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマー、
ＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＡＹ ＴＡＹ ＴＡＹ ＧＴＮ ＡＣＮ ＣＡＲ ＴＡＹ ＧＣ−３’、及び配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー、
ＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＡＹ ＡＴＨ ＧＴＮ ＧＣＮ ＣＡＹ ＡＡＹ ＣＡ−３’
を合成した。これらのプライマーは、アブラナ科のミロシナーゼに共通の塩基配列を有するプライマーであり、新規のミロシナーゼを取得することが可能である。混合塩基の記載は、Ｙはチミン又はシトシンを示し、Ｍはアデニン又はシトシンを示し、Ｒはグアニン又はアデニンを示し、Ｈはアデニン、シトシン又はチミン、Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン又はチミンを示す。
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(1) Synthesis of oligonucleotide primers Using a synthetic DNA machine model 394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems), the phosphoramidite method,
An oligonucleotide sense primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 5,
MYR1 primer: 5′-TTR YMR AAY TCR TAR TTR TCN CC-3 ′, an oligonucleotide sense primer comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 6,
MYR2 primer: 5′-AAY TAY TAY GTN ACN CAR TAY GC-3 ′, and an oligonucleotide antisense primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7,
MYR3 primer: 5′-TAY ATH GTN GCN CAY AAY CA-3 ′
Was synthesized. These primers are primers having a base sequence common to Brassicaceae myrosinase, and it is possible to obtain a novel myrosinase. In the description of the mixed base, Y represents thymine or cytosine, M represents adenine or cytosine, R represents guanine or adenine, H represents adenine, cytosine or thymine, and N represents adenine, guanine, cytosine or thymine. .
（２）ＲＮＡの抽出
セイヨウワサビの２つの品種である青芽及び赤芽からＲＮＡを抽出した。−８０℃に保存されていた茎サンプル１ｇを液体窒素中で粉砕し、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡは、ジエチルピロカーボネイト（ＤＥＰＣ）処理した蒸留水５０μＬに溶解した。
(2) Extraction of RNA RNA was extracted from blue bud and red bud, which are two varieties of horseradish. Stem samples stored at −80 ° C. were pulverized in liquid nitrogen, and total RNA was extracted using QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's protocol. The obtained RNA was dissolved in 50 μL of distilled water treated with diethyl pyrocarbonate (DEPC).
（３）ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲによる増幅
抽出したＲＮＡから、前記ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせ又はＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔを用いてメーカーのプロトコールに従ってｃＤＮＡ合成及びＰＣＲを行なった。逆転写反応は、オリゴｄＴプライマーを用い、３０℃で１０分保持し、その後６０℃で３０分保持することによって行なった。そして９９℃で５分処理することによって、逆転写酵素を不活化した。逆転写反応終了後の反応液にＰＣＲ試薬を加え、９４℃で２分保持した後に、ＤＮＡ変性９４℃で３０秒、アニーリング４５℃、５０℃、５５℃又は６０℃で３０秒、伸張反応７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行なった。
(3) cDNA synthesis and amplification by PCR From the extracted RNA, cDNA synthesis and PCR were performed using TaKaRa RNA PCR Kit with the combination of MYR1 primer and MYR2 primer or MYR1 primer and MYR3 primer according to the manufacturer's protocol. . The reverse transcription reaction was performed by using an oligo dT primer and holding at 30 ° C. for 10 minutes and then holding at 60 ° C. for 30 minutes. The reverse transcriptase was inactivated by treatment at 99 ° C. for 5 minutes. After adding the PCR reagent to the reaction solution after the completion of the reverse transcription reaction and holding at 94 ° C. for 2 minutes, DNA denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 45 ° C., 50 ° C., 55 ° C. or 60 ° C. for 30 seconds, extension reaction 72 The PCR reaction was performed by repeating the 1 minute cycle 30 ° C. 30 times.
（４）ＲＴ−ＰＣＲ産物の解析
得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。赤芽のＲＮＡから、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、アニーリング温度が４５℃、５０℃、５５℃の場合に、約４２０ｂｐバンドが確認でき、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするｃＤＮＡのＰＣＲ産物と考えられた。またＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせは、すべてのアニーリング温度において、予想される約７６０ｂｐのＰＣＲ産物が確認できた。一方、青芽のＲＮＡから、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせでは、ＰＣＲ産物が確認できなかったが、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、アニーリング温度が４５℃の場合のみにおいて、予想される約７６０ｂｐのＰＣＲ産物が確認できた。そのため、青芽及び赤芽のセイヨウワサビからＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで得られた約７６０ｂｐのＰＣＲ産物を以下のクローニング及び塩基配列の決定に用いた。
(4) Analysis of RT-PCR product The obtained PCR product was electrophoresed on a 1.5% agarose gel. From the red bud RNA, when the annealing temperature is 45 ° C, 50 ° C, and 55 ° C with the combination of MYR1 primer and MYR2 primer, an approximately 420 bp band can be confirmed, which is considered to be a PCR product of cDNA encoding horseradish myrosinase. It was. In addition, the combination of MYR1 primer and MYR3 primer confirmed the expected PCR product of about 760 bp at all annealing temperatures. On the other hand, from the blue bud RNA, the PCR product could not be confirmed with the combination of MYR1 primer and MYR2 primer, but with the combination of MYR1 primer and MYR3 primer, the expected temperature is about 760 bp only when the annealing temperature is 45 ° C. The PCR product was confirmed. Therefore, an approximately 760 bp PCR product obtained from the combination of MYR1 primer and MYR3 primer from horseradish of red and red buds was used for the following cloning and determination of the base sequence.
（５）クローニングベクターによるクローニングと塩基配列の決定
ＰＣＲ産物から余ったプライマーを除去し、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、メーカーのプロトコールに従い、プラスミドに導入した。形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドをプラスミド精製キットＡｕｒｕｍ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用い、メーカーのプロトコールに従い精製した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラスミドＤＮＡを選択した。
精製したプラスミドＤＮＡはＤＮＡをＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｙ５．５Ｄｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いメーカーのプロトコールに従って反応させた。この反応産物をＬｏｎｇ−Ｒｅａｄ ＴｏｗｅｒＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで解析し、塩基配列を決定した。
(5) Cloning with a cloning vector and determination of the base sequence The excess primer was removed from the PCR product and introduced into a plasmid using QIAGEN PCR Cloning Kit according to the manufacturer's protocol. The transformed Escherichia coli was cultured, and the plasmid was purified using a plasmid purification kit Aurum Plasmid Mini Kit (Bio-Rad) according to the manufacturer's protocol. This plasmid DNA was cleaved with a restriction enzyme, and a plasmid DNA containing a fragment of the desired length was selected.
The purified plasmid DNA was reacted using Thermo Sequence Cy5.5 Dye Terminator Sequencing Kit (Amersham Bioscience) according to the manufacturer's protocol. This reaction product was analyzed with Long-Read Tower ™ Sequencer, and the base sequence was determined.
（６）配列の比較
青芽から得られた６クローンの塩基配列及び赤芽から得られた７クローンの６６３ｂｐの塩基配列を比較したところ、クローン間で若干の塩基の置換は見られたが、品種にかかわらず高い相同性を示した。すべてのクローンの塩基配列を配列番号３に示している。クローンによって塩基の置換がある塩基は混合塩基で示しているが、１３クローンのうち６クローンは１００％一致した。得られたコンセンサスな塩基配列を他のアブラナ科の植物であるワサビ、ダイコン、アラビドプシスのミロシナーゼをコードする塩基配列と比較したところ、最も相同性が高いシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓ）のミロシナーゼ（ＴＧＧ３）をコードする塩基配列でも８０％程度であった。そのため、決定した６６３ｂｐの塩基配列はセイヨウワサビのミロシナーゼに特異的な配列である。また、得られた塩基配列をＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているセイヨウワサビのミロシナーゼをコードする全長のｍＲＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８２２７１０と比較したところ、非常に高い相同性を示した。このため、本発明者が取得した６６３ｂｐ以外のミロシナーゼをコードする塩基配列も青芽及び赤芽のセイヨウワサビの品種間では保存されているが、他のアブラナ科植物の有するミロシナーゼをコードする塩基配列とは異なっていると考えられた。
(6) Sequence comparison When comparing the base sequence of 6 clones obtained from green buds and the base sequence of 663 bp of 7 clones obtained from red buds, some base substitution was observed between the clones. It showed high homology regardless of the variety. The nucleotide sequences of all clones are shown in SEQ ID NO: 3. Bases with base substitution by clones are shown as mixed bases, but 6 out of 13 clones were 100% identical. When the obtained consensus base sequence is compared with the base sequences encoding other cruciferous plants such as horseradish, radish, and Arabidopsis myrosinase, the most homologous Arabidopsis myrosinase (TGG3) is encoded. The base sequence was about 80%. Therefore, the determined base sequence of 663 bp is a specific sequence for horseradish myrosinase. Further, when the obtained base sequence was compared with the full-length mRNA (GeneBank, Accession No. AY82210) encoding horseradish myrosinase registered in GeneBank, it showed very high homology. The base sequence encoding myrosinase other than 663 bp obtained by the author is also conserved among the varieties of blue bud and red bud horseradish, but is different from the base sequence encoding myrosinase possessed by other cruciferous plants. It was considered.
《実施例１：セイヨウワサビのミロシナーゼのゲノムＤＮＡの検出》
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成
合成ＤＮＡ機モデル３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いホスホアミダイト法により、
Ｓｅｉｗａｓａ１；５’−ＧＴＡ ＴＧＴ ＣＴＡ ＣＧＣ ＣＡＴ ＴＣＣ−３’（配列番号８）、
Ｓｅｉｗａｓａ２；５’−ＧＡＡ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＡＴ Ｇ−３’（配列番号９）、及び
Ｓｅｉｗａｓａ３；５’−ＴＣＡ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＣ−３’、
（配列番号１０）を合成した。
Example 1: Detection of genomic DNA of horseradish myrosinase
(1) Synthesis of oligonucleotide primers Using a synthetic DNA machine model 394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems), the phosphoramidite method,
Seiwasa1; 5′-GTA TGT CTA CGC CAT TCC-3 ′ (SEQ ID NO: 8),
Seiwasa2; 5′-GAA CAG ACT CAC CGT CAT G-3 ′ (SEQ ID NO: 9), and Seiwasa3; 5′-TCA AAA GGA GTG TCA CCA CC-3 ′,
(SEQ ID NO: 10) was synthesized.
（２）ゲノムＤＮＡの抽出
セイヨウワサビの２品種の青芽及び赤芽、他のアブラナ科の植物であるワサビ、及びカイワレダイコン並びにアブラナ科以外の植物であるホウレンソウ及びトウミョウからゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、それぞれの植物体を、葉、茎、及び根茎に分離し、液体窒素で凍結し、−７０℃に保存した。保存したサンプルを液体窒素中で粉砕し、Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、キットのプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、滅菌蒸留水５０μＬに溶解した。
(2) Extraction of genomic DNA Genomic DNA was extracted from two varieties of blue bud and red bud of horseradish, horseradish, which is another cruciferous plant, and spinach and cypress, which are plants other than cruciferous and cruciferous. Specifically, each plant was separated into leaves, stems, and rhizomes, frozen with liquid nitrogen, and stored at -70 ° C. The stored sample was pulverized in liquid nitrogen, and genomic DNA was extracted using Nucleon Physiopure Kit (Amersham Biosciences) according to the protocol of the kit. The obtained DNA was dissolved in 50 μL of sterile distilled water.
（３）ＰＣＲによる増幅
ゲノムＤＮＡ溶解液１０μＬ（１μｇ）に１０×ＰＣＲ緩衝液５μＬ、第１プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、及び第２プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ（ニッポンジーン社）０．５μＬを加え滅菌蒸留水で５０μＬにした。第１プライマーとしてＳｅｉｗａｓａ１、第２プライマーとしてＳｅｉｗａｓａ３の組み合わせ（Ｓｅｉｗａｓａ１−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセット）で反応液を作成した。この反応液を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＴＰ６００（ＴＡＫＡＲＡ）にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応のプロファイルはＤＮＡ変性９４℃で２分保持し、ＤＮＡ変性９４℃で３０秒、アニーリング６１℃で３０秒、伸張反応７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返した。３０サイクル終了後７２℃で１．５分間保持し、４℃に冷却した。
(3) Amplification by PCR 10 μL (1 μg) of genomic DNA lysate, 5 μL of 10 × PCR buffer, 0.2 μL of the first primer (100 pmol / μL), 0.2 μL of the second primer (100 pmol / μL), Gene Taq ( Nippon Gene Co., Ltd.) 0.5 μL was added to make 50 μL with sterilized distilled water. A reaction solution was prepared using a combination of Seiwasa1 as the first primer and Seiwasa3 as the second primer (Seiwasa1-Seiwasa3 primer set). This reaction solution was set in TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient TP600 (TAKARA), and PCR reaction was performed. The reaction profile was maintained at 94 ° C for DNA denaturation for 2 minutes, and 30 cycles of DNA denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 61 ° C for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C for 1 minute were repeated 30 times. After 30 cycles, the temperature was held at 72 ° C for 1.5 minutes and cooled to 4 ° C.
（４）ＰＣＲ産物の解析
ＰＣＲ反応終了した溶液を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。図２に示すように、Ｓｅｉｗａｓａ１−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセットを用いた場合、セイヨウワサビの２種類の品種から抽出したＤＮＡからＰＣＲ産物を確認することができた。一方、ワサビ、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウから抽出したＤＮＡを用いた場合は、ＰＣＲ産物を確認することはできなかった。更に、青芽又は赤芽のゲノムＤＮＡからＳｅｉｗａｓａ１−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセットで増幅されたＰＣＲ産物を２０倍希釈し、Ｓｅｉｗａｓａ２−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセットによってＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を増幅することができた。
(4) Analysis of PCR product The solution after the PCR reaction was electrophoresed on a 1.5% agarose gel. As shown in FIG. 2, when the Seiwasa1-Seiwasa3 primer set was used, PCR products could be confirmed from DNA extracted from two varieties of horseradish. On the other hand, when DNA extracted from horseradish, silkworm radish, spinach, and cypress was used, the PCR product could not be confirmed. Furthermore, PCR product amplified with Seiwasa1-Seiwasa3 primer set from genomic DNA of blue bud or red bud was diluted 20 times, and PCR was performed with Seiwasa2-Seiwasa3 primer set, and a specific PCR product could be amplified. .
本発明のプライマーセット及びプローブを用いたセイヨウワサビの検出方法は、加工ワサビ食品にセイヨウワサビの含有の有無を高感度に検出することが可能である。またセイヨウワサビの品種の同定に使用できる。 The method for detecting horseradish using the primer set and probe of the present invention can detect the presence or absence of horseradish in a processed wasabi food with high sensitivity. It can also be used to identify horseradish varieties.
Claims (7)
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（１ｂ）、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセット。 (A) a DNA primer (1a) comprising an oligonucleotide part consisting of at least 15 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 A first primer which is a DNA primer (2a) comprising an oligonucleotide part of at least 15 nucleotides, which hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of
(B) from a DNA primer (1b) comprising an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 And a second primer which is a DNA primer (2b) containing at least 15 nucleotides of an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with the oligonucleotide, and functions as a primer for polymerase polymerization reaction A primer set for horseradish detection.
（Ｂ）配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（３ｂ）、又は配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセット。 (A) a DNA primer (3a) comprising an oligonucleotide part consisting of at least 15 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 A first primer which is a DNA primer (4a) comprising an oligonucleotide part of at least 15 nucleotides, which hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of
(B) from a DNA primer (3b) comprising an oligonucleotide consisting of a base sequence of at least 15 consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 And a second primer which is a DNA primer (4b) containing at least 15 nucleotides of an oligonucleotide, which hybridizes under stringent conditions with the oligonucleotide, and functions as a primer for polymerase polymerization reaction A primer set for horseradish detection.
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Non-Patent Citations (6)
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|---|
| JPN6010013512, 日本香辛料研究会講演要旨集, 2002, Ｖｏｌ．１７ｔｈ, ｐ．２５ * |
| JPN6010013514, 日本食品科学工学会大会講演集, 1999, Ｖｏｌ．４６ｔｈ, ｐ．１２７，３Ｂａ１２ * |
| JPN6010013516, 日本農芸化学会大会講演要旨集, 2002, Ｖｏｌ．２００２, ｐ．９１，３−２Ｇａ０２ * |
| JPN6010013519, 神奈川県農業総合研究所試験研究成績書（野菜） 平成１３年度, 2002, ｐ．７−８ * |
| JPN6010013520, Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ, 2000, Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．１０, ｐ．１１０２−１１０９ * |
| JPN6010013523, Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｒｅｓ, 2005, Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．４, ｐ．４１２−４１５ * |
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