JP4581101B2

JP4581101B2 - Papaya sex identification method using DNA marker

Info

Publication number: JP4581101B2
Application number: JP2000303268A
Authority: JP
Inventors: 正和徳元; 直也浦崎; 良平寺内
Original assignee: Okinawa Prefectural Government
Current assignee: Okinawa Prefectural Government
Priority date: 2000-10-03
Filing date: 2000-10-03
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2020-10-03
Also published as: JP2002112773A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイアの性識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライマー、該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマー若しくは該プローブを構成要素として含むパパイアの性識別用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を指標とするパパイアの性識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
パパイア（Carica papaya）は雄、雌、両性の３つの性表現型を持つ果樹で、果実として商品価値が高いのは両性果実である。沖縄県において栽培されているパパイアの主力品種であるサンライズは、両性自殖の品種で、その苗には雌と両性とが１対２の割合で存在している。従って、サンライズの苗の性識別においては、雌と両性とを識別することが重要となる。従来、パパイアの性識別は、花が咲くまで形態による判断ができない為、１箇所に複数本仮定植し、花型による性識別により必要な株を残す栽培法により行われてきた。しかしながら、この方法では、種苗会社における育苗コスト（肥料、水、鉢、人件費、土地占有等）や現場での栽培コスト（肥料、水、人件費、計画栽培が困難）がかさむため、育苗段階（開花前）でのパパイアの性識別法の開発が急務となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNA、該DNAを含むパパイアの性識別マーカー、該性識別マーカーの増幅用プライマー、該性識別マーカーの検出用プローブ、該プライマー若しくは該プローブを構成要素として含むパパイアの性識別用キット、及び該性識別マーカーの存在の有無を指標とするパパイアの性識別方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、RAPD法によって、パパイアの雄及び両性に特異的に存在するDNAマーカーを取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAである。
【０００５】
さらに、本発明は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むパパイアの性識別マーカーである。
さらに、本発明は、上記DNAの一部（例えば17〜30merの長さを有するもの、より具体的には、例えば配列番号４〜７のいずれかで表されるもの等）を含むパパイアの性識別マーカー増幅用プライマーである。
【０００６】
さらに、本発明は、上記性識別マーカー増幅用プライマーを構成要素として含む、パパイアの性識別用キットである。
さらに、本発明は、上記DNAの一部（例えば、20〜450merの長さを有するもの）又は全部を含むパパイアの性識別マーカー検出用プローブである。
さらに、本発明は、上記性識別マーカー検出用プローブを構成要素として含む、パパイアの性識別用キットである。
【０００７】
さらに、本発明は、被検体パパイアにおける、上記パパイアの性識別マーカーの有無を解析することを特徴とするパパイアの性識別方法である。ここで、パパイアの性識別マーカーの有無の解析は、ポリメラーゼ連鎖反応により得られる該性識別マーカー由来の増幅産物を検出することにより行われ得る。該ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型として被検体パパイア由来のDNAを、プライマーとして上記のいずれかの性識別マーカー増幅用プライマーを用いて行われ得る。また、パパイアの性識別マーカーの有無の解析は、プローブハイブリダイゼーション反応により得られるハイブリダイズ物を検出することによっても行われ得る。該プローブハイブリダイゼーション反応は、被検体パパイア由来のDNAに、該性識別マーカー検出用プローブをハイブリダイズすることにより行われ得る。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のパパイアの性識別方法は、従来の性識別方法とは異なり、性の違いに伴って生じるパパイア間のDNA配列の差異に基づいて性の識別を行う方法である。より具体的には、性識別マーカーの存在の有無を指標として、被検体パパイアの性を識別する方法である。ここで、「性識別マーカー」とは、特定の性に特異的に見出される塩基配列を有するDNAであって、性の識別に使用することがでDNAをいう。パパイアの性識別マーカーは、以下のようにして分離することができる。
【０００９】
１．性識別マーカーの探索
性識別マーカーの探索は、生物個体間の遺伝的多型を検出する方法、例えば増幅断片多型（random amplified polymorphic DNA；RAPD）法[Williamら:Nucleic Acids Res. 18:6531-6535(1990)]等によって行うことができる。すなわち、まず、パパイアから常法、例えばCTAB法[Murrayら:Nucleic Acids Res. 8:4321-4325 (1980)]等によりDNAを抽出する。この際、抽出に使用する植物組織に限定はないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これらの葉は、DNA抽出を効率良く行うことができるるように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素により凍結し、乳鉢内で粉砕することができる。
【００１０】
次に、該パパイアDNAを鋳型として、１種又は２種のランダムな配列からなるプライマー（ランダムプライマーともいう）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（plymerase chain reaction；PCR）を行う。ここで使用することができるランダムプライマーとしては、10〜12merの塩基長のものが挙げられる。本発明においては、ランダムプライマーとして、独自に設計・合成した5'-ttggcacggg-3'（配列番号３）の塩基配列からなる10 merのプライマーを用いた。PCRの反応条件は、特に限定はしないが、好ましくは92〜96℃で１〜２分間（二本鎖DNAの解離）、37〜42℃で１〜２分間（プライマーのアニーリング）、70〜74℃で１〜２分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、好ましくはこれを30〜40サイクル行う。PCRは、ヒートブロック式のプログラム温度制御装置（例えば、PCR Thermal Cycler（宝酒造社製））を用いて行うことができる。
【００１１】
PCRの後、PCR増幅産物を検出する。検出方法としては、ゲル電気泳動（例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等）及びそれに続くゲル染色（例えば、エチジウムブロミド染色等）による方法が挙げられるが、これに限定されない。例えば、アガガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロミドでゲルを染色し紫外光下で観察すると、バーコード様のバンドパターンが得られる。このバンドパターンを、雌のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合、雄のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合及び両性のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合とで比較し、それぞれの性に特異的に見出されるPCR増幅産物をパパイアの性識別マーカーとすることができる。
【００１２】
ところで、パパイア間の交配により子孫に出現する性表現型とその出現割合は表１のとおりである。沖縄県で生産されるパパイアの主力品種であるサンライズは、両性自殖の品種で、その苗（幼植物ともいう）には表１のように雌と両性が１対２の割合で存在する。よって、サンライズの苗の性識別においては、雌と両性とを識別する方法が所望される。雌のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合には見られず、両性のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合にのみ、あるいは両性及び雄のパパイア由来DNAを鋳型としてPCRを行った場合にのみ見られるPCR増幅産物は、雌のパパイアから両性又は雄のパパイアを識別するための性識別マーカーとして使用することができる。
【００１３】
【表１】

【００１４】
２．性識別マーカーの塩基配列決定
上記１において得られたパパイアの性識別マーカーの塩基配列は、当該技術分野で周知の塩基配列決定法により決定することができる。すなわち、例えば、上記１におけるPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動後のゲルから性識別マーカーのバンドを抽出し、塩基配列決定用プラスミド（例えば、pT7Blue(NOVAGEN社製)）に連結する。次いで、連結物を大腸菌に形質転換後、コロニーPCR法によって、性識別マーカーの挿入されたプラスミドを含有する大腸菌をスクリーニングする。得られた大腸菌からプラスミドを調製し、ジデオキシ法等の公知の手法によって挿入DNA断片の塩基配列を決定する。本発明において性識別マーカーとして取得されたDNA断片の塩基配列を配列番号１に、その相補鎖の配列を配列番号２に示す。配列番号１及び２で表される塩基配列からなるDNAは、両性及び雄のパパイア中で互いに２本鎖を形成しに存在し、共にパパイアの性識別マーカーとして有用である。
【００１５】
なお、本発明の性識別マーカーは配列番号１及び２に示されるものに限定されるものではなく、雌のパパイアから両性又は雄のパアイアを識別することができるものであれば、配列番号１及び２において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入された「多型物」も本発明の性識別マーカーに含まれる。ここで、「多型物」とは、より詳細には、同じ性のパパイア個体間において、１若しくは数個のレベルで対応する塩基配列間に差異の生じたDNA多型物をいう。
【００１６】
配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含む本発明のDNAは、上記１の方法により調製されるが、その他にも、決定された塩基配列に基づいてプライマーを設計・合成し、このプライマーを用い、パパイアの雄および両性株から抽出したDNAを鋳型としてPCRを行うことにより調製することもできる。
【００１７】
３.本発明の性識別マーカーの解析によるパパイアの性識別
被検パパイア中の本発明の性識別マーカーの有無を解析することにより、当該被検パパイアの性を識別することができる。性識別マーカーの有無の解析は、PCR法及びプローブ法等により行うことができる。
【００１８】
(1) PCR法による性識別マーカーの解析
PCR法による性識別マーカーの解析に基づいたパパイアの性識別は、以下のようにして行うことができる。まず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配列の一部を含む性識別マーカー増幅用プライマーを設計・合成する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物中の17〜30mer、好ましくは20〜30mer、最も好ましくは20〜25merの塩基長からなる連続したヌクレオチド鎖をいう。より詳細には、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズし且つプライマーとして機能するヌクレオチド鎖である。ここで、「プライマーとして機能する」とは、PCRの相補鎖合成反応においてDNAポリメラーゼに3'末端OH基を提供し、当該酵素によるヌクレオヂド鎖合成反応を開始させるように機能することをいう。プライマーの合成は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られる公知の方法を用いることができるが、より簡便には、DNAシンセサイザー(例えばApplied Biosystem社製)を用いて行うことができる。
【００１９】
より詳細には、PCR法による性識別マーカーの解析には、性識別マーカーの一部又は全部の領域を増幅し得るような5’側プライマーと3’側プライマーとからなる性識別マーカー増幅用プライマーのペアが必要である。例えば、性識別マーカー増幅用プライマーの5’側プライマーとしては、5'-ggtaagagtttttcccaagc-3'（配列番号４）や5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列番号５）が挙げられる。
また、3’側プライマーとしては、5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番号６）、5'-gttgtgctgcgctatcttgc-3' （配列番号７）が挙げられるが、当業者であれば配列番号１又は２の塩基配列に基づいて、他の適切な配列を容易に設計・合成することができ、これらのプライマーに限定されない。なお、配列番号１における上記各プライマーの対応位置を図１に示す。図１中において、矢印の向きは配列の向きを示す。これらのプライマーは、5’側プライマーと3’側プライマーとを適当に組み合わせて、性識別マーカー領域を増幅用のプライマーペアとして使用することができるが、その適当な組み合わせは、当業者であれば適宜選択することができる。すなわち、5’側プライマーが、3’側プライマーよりも上流（5’から3’への向きにおいて）に存在するようにプライマーペアを選択することが必須の条件となる。このようなプライマーの組み合わせとしては、好ましくは、配列番号４と配列番号６、配列番号４と配列番号７、配列番号５と配列番号６、配列番号５と配列番号７の組み合わせが挙げられるが、プライマーの組み合わせは任意である。
【００２０】
配列番号４〜７のプライマーを用いてパパイア幼植物の性識別を行うことができる。より詳細には、「雌×雄」、「雌×両性」、「雄×雄」及び「両性×両性」の交配組み合わせにより得られる、雌、両性及び雄のパパイア幼植物の中から両性及び雄を識別することができる。
【００２１】
具体的手順を例示すると以下のようになる。すなわち、まず、パパイア幼植物の組織から常法に従ってDNAを抽出する。DNA抽出に用いる植物体の組織は特に限定されないが、好ましくは葉を用いる。さらに、これらの葉は、核酸抽出を効率良く行うことができるように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素を用いて粉砕することができる。DNAの抽出は公知の方法を用いて行うことができるが、好ましくはCTAB法[Murrayら, Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325 (1980)]により抽出することができる。
【００２２】
次いで、抽出したDNAを鋳型とし、上記の性識別マーカー領域増幅用のプライマーペアを加えてPCRを行い、目的のDNA断片を増幅させる。PCRの温度条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に決定することができ、特に限定はしないが、好ましくは92〜96℃で１〜２分間（二本鎖DNAの解離）、50〜55℃で１〜２分間（プライマーのアニーリング）、70〜74℃で１〜２分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、好ましくはこれを25〜30サイクル行う。上述の反応の温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置を用いることができる。このような装置の例としては、PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を挙げることができる。
【００２３】
最後に、以上のようにして得られる反応混合物から、増幅された核酸を検出する。検出の方法としては、当技術分野で通常用いられる方法を用いることができるが、好ましくは上述したアガロースゲル電気泳動およびそれに続くエチジウムブロミドによるゲル染色を行う方法を用いることができる。これにより、雄および両性の被検体パパイアにのみPCR増幅断片が検出されるが、雌には検出されない。PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイア中には本発明の性識別マーカーが存在し、当該被検体パパイアは雌ではないと評価することができる。PCR増幅断片が検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。
【００２４】
さらに、被検体パパイア幼植物の両親の性が特定されている場合には、PCR増幅断片の有無により被検パパイア幼植物の性を特定することも可能である。すなわち、「雌×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。また、「雌×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。さらに、「雄×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。同様に「両性×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、PCR増幅断片が検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。
【００２５】
(2) プローブ法による性識別マーカーの解析
プローブ法による性識別マーカーの解析に基づいたパパイアの性識別は、以下のようにして行うことができる。まず、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物の塩基配列に基づいて、当該塩基配列の一部又は全部を含む性識別マーカー検出用プローブを調製する。ここで、「当該塩基配列の一部」とは、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物中の20〜450mer、好ましくは50〜450mer、最も好ましくは100〜450merの塩基長からなる連続したヌクレオチド鎖をいう。当該ヌクレオチド鎖の塩基配列は、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズする限り、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加または挿入されている塩基配列であり得る。例えば、配列番号1に示される塩基配列に対して1以上の塩基が置換、欠失、付加または挿入されている塩基配列を有するDNAは、部位特異的変異誘発法[Zollerら：Nucleic Acids Res. 10(20):6487-6500 (1982)]によって、当業者であれば容易に調製することができる。
【００２６】
性識別マーカー検出用プローブは、クローン化された配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むプラスミドから、適当な制限酵素で所望のDNA断片を切り出したり、該プラスミド又は両性若しくは雄パパイアから調製したDNAを鋳型とするPCRによって調製することができる。配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物に特異的にハイブリダイズする限り、１若しくは数個の塩基がが置換、欠失、付加または挿入されている塩基配列を有するDNAは、部位特異的変異誘発法[Zollerら：Nucleic Acids Res. 10(20):6487-6500(1982)]によって、当業者であれば容易に調製することができる。なお、プローブDNA断片の標識は、放射性標識（例えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ）、非放射性標識（例えばビオチン、ディゴキシゲニン）等によって行うことができ、具体的には、プローブDNAの5'末端のリン酸をホスファターゼで除去後、ポリヌクレオチドキナーゼで[γ-³²Ｐ]ATPのγ-リン酸基を前記DNAの5'末端に転移する方法や、[³²Ｐ]、[³⁵Ｓ]、[³Ｈ]、ビオチン等で標識されたヌクレオチド基質を、ニックトランスレーション法等によってプローブDNAの合成とともに取り込ませる方法等が挙げられる。より簡便には、³²ＰによるプローブDNAの標識は、rediprime^TMII（アマシャムファルマシアバイオテク社製）などの市販のキットを用いて行うことができる。
【００２７】
具体的手順として、サザンハイブリダイゼーションを利用する方法を例示すると以下のようになる。すなわち、まずパパイアよりDNAを上記と同様の方法により抽出し、適当な制限酵素で消化する。使用する制限酵素は特に限定しないが、好ましくはEcoRＩを用いる。
【００２８】
次いで、制限酵素消化したDNAを上述のとおりアガロースゲル電気泳動し、常法に従いDNAを膜ににブロッティングする。膜は特に限定はしないが、好ましくはHybond N+（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等のナイロンメンブレンが好ましい。
【００２９】
さらに、ブロッティング後の膜に、常法に従って前記の性識別マーカー検出用プローブをハイブリズさせる。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションは65℃で、それぞれ4時間、16時間行う。この条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に設定することができるので、特に限定しない。ハイブリダイゼーションを終えたナイロンメンブレンを65℃のSSC溶液（0.1％SDS含有）で洗浄する。洗浄の条件は、当業者であれば経験に基づいて適切に設定することができるので限定しないが、2×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回、0.1×SSC溶液（0.1％SDS含有）を2回で行うことができる。なお、それぞれの洗浄時間は20分程度で行うことができる。
【００３０】
最後に、洗浄したブロットを用い、オートラジオグラフィーまたはBAS2000（富士写真フイルム株式会社製）により解析することができる。これにより、雄および両性の被検植物にのみバンド（陽性バンド）が検出されるが、雌には検出されない。
【００３１】
PCR法による性識別マーカーの解析の場合と同様に、被検体パパイア幼植物の両親の性が特定されている場合には、陽性バンドの有無により被検パパイア幼植物の性を特定することも可能である。すなわち、「雌×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。また、「雌×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。さらに、「雄×雄」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは雄であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。同様に「両性×両性」の交配組み合わせにより得られるパパイア幼植物において、陽性バンドが検出されれば、被検体パパイアは両性であると評価することができ、検出されなければ、被検体パパイアは雌であると評価することができる。
【００３２】
４.パパイアの性識別用キット
本発明のパパイアの性識別方法に基づき、当該識別方法の実施に必要な試薬類を、パッケージングし、キットとして供給することが可能である。より具体的には、例えば、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAのDNAの一部（例えば、17〜30merの長さを有するもの、より具体的には、例えば配列番号４〜７のいずれかで表されるもの）を含むパパイアの性識別マーカー増幅用プライマー、及び／又は配列番号１又は２で表される塩基配列からなるDNA又は該DNAの多型物を含むDNAの一部（例えば、20〜450merの長さを有するもの）の一部又は全部を含むパパイアの性識別マーカー検出用プローブを必須構成要素とするものが挙げられる。上記キットの構成要素は、必要に応じて変化し得る。例えば、PCR反応又はハイブリダイゼーション反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な試薬類が加えられ得る。当該キットを用い、上記３の手順に従ってパパイアの性を識別することが可能である。
【００３３】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕性識別マーカーの探索
（1）パパイアの葉からのDNA抽出
パパイアの葉5gからCTAB法を用いてDNAを抽出した。抽出に用いたパパイアは、サンライズ、ワイマナーロおよび沖縄県農業試験場育種系統等、性既知の合計33個体（雄13個体、雌16、両性4個体）を用いた。
【００３４】
（2）RAPD法による性識別マーカーの探索
上記により抽出したDNA100ngを鋳型とし、発明者らにより設計、合成されたランダムプライマーのIBRC-RP07 5'-ttggcacggg-3'（配列番号３）を用いてPCRを行った。すなわち、DNA溶液 10μl(10ng/μl)、滅菌蒸留水4μl、10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture 2μl(各2.5mM)、TaKaRa Ex Taq 1μl(0.5 U/μl)、発明者らにより設計、合成された 10-Mer プライマー1μl(20μM)を混合し、PCR反応を行った。反応は、94℃で1分間（DNA変性）、37℃で1分間（プライマーの会合）、72℃で2分間（DNA鎖の伸長）で順次反応させ、これを30サイクル行った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用いた。次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下で観察して増幅断片を検出した。結果を図２及び３に示した。
【００３５】
図２は、性が既知のパパイア17個体（雄6個体、雌7個体、両性4個体）の葉から抽出したDNAを鋳型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。雄は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種IK7、沖縄県野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県野生種2、サンライズである。両性は左より順に、ワイマナーロ、サンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナーロ×メキシコ導入種M1のF1である。
【００３６】
また図３は、性が既知のパパイア16個体（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個体）の葉から抽出したDNAを鋳型とし、IBRC-RP07プライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動で解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた雄は沖縄県農業試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場ON-36である。
図２及び３の結果から明らかなように、400bpと500bpとの間に雄および両性特異的な増幅断片（性識別マーカー）が検出された。
【００３７】
〔実施例２〕性識別マーカーの塩基配列決定
（1）性識別マーカーのクローニング
実施例１において検出された性識別マーカーをQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いてアガロースゲルより抽出し、プラスミドpT7Blue(NOVAGEN)にクローニングし、大腸菌を形質転換した。
【００３８】
（2）性識別マーカーの塩基配列決定
次に、性識別マーカーを有するクローンを培養し、QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて組換えプラスミドを抽出した。抽出した組換えプラスミドを鋳型としてBigDye Terminator Cycle Sequencing,FS キット（PEバイオシステムズジャパン社）を用いて反応を行い、ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer（PEバイオシステムズジャパン社）により塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示した。
【００３９】
〔実施例３〕 PCR法によるパパイアの性識別
得られた性識別マーカーを用い、PCR法によりパパイアの性識別を行った。まず、実施例２において決定された塩基配列に基づいて、性識別マーカー増幅用プライマーを設計および合成した。すなわち、5’側プライマーとして、5'-ggtaagagtttttcccaagc-3'（配列番号４）及び5'-tgcacgatttagattagatg-3'（配列番号５）を、3’側プライマーとして5'-ggatagcttgcccaggtcac-3'（配列番号６）及び5'-gttgtgctgcgctatcttgc-3'（配列番号７）を合成した。一方、被検パパイアの葉５ｇを乳鉢に移し、少量の液体窒素を加えて磨砕した後、CTAB法によりDNAを抽出した。抽出に用いたパパイアは、上記の33個体（雄13個体、雌16、両性4個体）、交配親（雌、両性）とそのF1集団（幼植物14個体）を用いた。抽出したDNAを鋳型として、5’側相同プライマーと3’側相補プライマーを用いたPCRにより目的DNA断片を増幅した。すなわち、DNA溶液1μl(10ng/μl)、10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture 2μl(各2.5mM)、TaKaRa Ex Taq 1μl(0.5 U/μl)、滅菌蒸留水12μl、性識別マーカー5’側相同プライマー1μl(20μM)および3’側相補プライマー1μl(20μM)を混合し、PCR反応を行った。プライマーは、配列番号５と配列番号６の組み合わせを使用した。反応は、94℃で1分間（二本鎖DNAの解離）、55℃で1分間（プライマーのアニーリング）、72℃で1分間（相補鎖の合成）で順次反応させ、これを30サイクル行った。なお、温度設定にはヒートブロック式のプログラム温度制御装置PCR Thermal Cycler（宝酒造社製）を用いた。次に、PCR反応液10μlを2％アガロースゲル電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、紫外光下で観察して増幅断片を検出した。
【００４０】
結果を図４に示した。(1)は性が既知のパパイア17個体（雄6個体、雌7個体、両性4個体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。雄は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、沖縄県野生種IK7、沖縄県野生種D、メキシコ導入種M5である。雌は左より順に、沖縄県野生種A、メキシコ導入種M1、沖縄県野生種IK2、ワイマナーロ、オレンジクイーン、沖縄県野生種2、サンライズである。両性は左より順に、ワイマナーロ、サンライズ、メキシコ導入種M1、ワイマナーロ×メキシコ導入種M1のF1である。(2)は性が既知のパパイア16個体（交配親とそのF1集団、雄7個体、雌9個体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた雄は沖縄県農業試験場育種系統ON-7、雌は沖縄県農業試験場ON-36である。(3)は交配親（雌、両性）とそのF1集団（幼植物14個体）を解析した結果である。Mは分子量マーカー100bp DNA Ladder（Bio Labs）、CはDNAの代わりに滅菌蒸留水を加えてPCRを行った対照区である。交配に用いた両性はサンライズ、雌は沖縄県農業試験場ON-34である。図４から明らかなように、雄および両性の試料にのみ目的の増幅断片が検出された（図４）。なお、F1集団（幼植物14個体）については、開花後に上記の結果と照合した。また、他の組のプライマーを用いた場合でも、同様に良好な識別結果が得られた。以上のことから、PCR法による本発明の性識別マーカーの解析に基づいて、パパイアの性識別を行うことができることが判明した。
【００４１】
〔実施例４〕プローブ法によるパパイアの性識別
また、得られた性識別マーカーを用いプローブ法により、パパイアの性識別を行った。まず、制限酵素EcoRＩにより消化した雄、雌、両性のDNA10μｇを0.8％アガロースゲル電気泳動後、常法に従いDNAをHybond N+（アマシャムファルマシアバイオテク社製）にアルカリブロッティングした。一方、実施例３において得られた増幅断片を³²Ｐにより標識した。すなわち、増幅断片20ngをrediprimeTMII（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて³²Pにより標識後、ProbeQuantTM G-50 Micro Column（アマシャムファルマシアバイオテク社製）により精製したものをプローブとした。次いで、上記により作製したブロットを65℃で4時間プレハイブリダイゼーション後、熱変性させた上記プローブを加えて、65℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。次に、ブロットを65℃の2×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20分間、2回、続いて65℃の0.1×SSC溶液（0.1％SDS含有）で20分間、2回洗浄した。最後に、洗浄したブロットをBAS2000（富士写真フイルム株式会社製）により解析した。
【００４２】
結果を図５に示した。雄は沖縄県野生種IK7、雌はワイナマーロ、両性はサンライズである。図５から明らかなように、雄および両性の被検植物にのみバンドが検出されるが、雌には検出されなかった。以上のことから、プローブ法による本発明の性識別マーカーの解析に基づいて、パパイアの性識別を行うことができることが判明した。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、DNAマーカーを用いてパパイアの性識別を行うことができる。従って、本発明の方法を利用すれば育苗段階でのパパイアの迅速かつ高感度な性識別が可能となる。
【００４４】
【配列表】

【００４５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
【図面の簡単な説明】
【図１】パパイア性識別マーカーの全塩基配列における、配列番号４〜７の配列の存在位置を示す概略図である。
【図２】性が既知のパパイア17個体の葉から抽出したDNAを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図３】性が既知のパパイア16個体の葉から抽出したDNAを鋳型として用いたときのPCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図４】PCR法による性識別マーカーの解析に基づくパパイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。
【図５】プローブ法による性識別マーカーの解析に基づくパパイアの性識別の結果を示す電気泳動写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to DNA specifically present in male and both sexes of papaya, papaya sex identification marker containing the DNA, primer for amplification of the sex identification marker, probe for detection of the sex identification marker, the primer or the probe The present invention relates to a sex identification method for papaya, and a papaya sex identification method using the presence or absence of the sex identification marker as an index.
[0002]
[Prior art]
Papaya (Carica papaya) is a fruit tree with three sexual phenotypes, male, female, and amphoteric. Sunrise, the main cultivar of papaya cultivated in Okinawa Prefecture, is an amphibious breed, and females and amphibians are present at a ratio of 1 to 2 in their seedlings. Therefore, it is important to identify females and both sexes in the sex identification of Sunrise seedlings. Conventionally, sex identification of papayas has been performed by a cultivation method in which a plurality of hypotheses are planted in one place and necessary strains are left by sex identification by flower type since it cannot be determined by the form until the flower blooms. However, this method increases the seedling costs (fertilizer, water, pots, labor costs, land occupancy, etc.) and seedling costs (fertilizer, water, labor costs, planned cultivation difficult) at the seedling company. There was an urgent need to develop a papaya sex identification method (before flowering).
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to DNA specifically present in male and both sexes of papaya, papaya sex identification marker containing the DNA, primer for amplification of the sex identification marker, probe for detection of the sex identification marker, the primer or the probe An object of the present invention is to provide a sex identification method for papaya, which uses the presence or absence of the sex identification marker as an index.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors have succeeded in obtaining a DNA marker specifically present in males and both sexes of papaya by the RAPD method, thereby completing the present invention. It came to.
That is, the present invention is a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or a DNA containing a polymorphic form of the DNA.
[0005]
Furthermore, the present invention is a papaya sex identification marker comprising DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a polymorphic form of the DNA.
Furthermore, the present invention relates to the properties of papaya containing a part of the above DNA (for example, one having a length of 17 to 30 mer, more specifically, one represented by any of SEQ ID NOs: 4 to 7, etc.). It is a primer for amplification of an identification marker.
[0006]
Furthermore, the present invention is a papaya sex identification kit containing the sex identification marker amplification primer as a constituent element.
Furthermore, the present invention is a probe for detecting a papaya sex identification marker comprising a part (for example, one having a length of 20 to 450 mer) or all of the above DNA.
Furthermore, the present invention is a papaya sex identification kit including the above-described sex identification marker detection probe as a constituent element.
[0007]
Furthermore, the present invention is a papaya sex identification method characterized by analyzing the presence or absence of the papaya sex identification marker in a subject papaya. Here, analysis of the presence or absence of the sex identification marker of papaya can be performed by detecting an amplification product derived from the sex identification marker obtained by polymerase chain reaction. The polymerase chain reaction can be performed using DNA derived from the subject papaya as a template and any of the above-described primers for amplification of the sex identification marker as primers. The analysis of the presence or absence of a papaya sex identification marker can also be performed by detecting a hybridized product obtained by a probe hybridization reaction. The probe hybridization reaction can be performed by hybridizing the probe for sex identification marker detection to DNA derived from the subject papaya.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The papaya sex identification method of the present invention differs from the conventional sex identification method in that it discriminates sex based on DNA sequence differences between papayas caused by gender differences. More specifically, this is a method for identifying the sex of a subject papaya using the presence or absence of a sex identification marker as an index. Here, the “sex identification marker” is a DNA having a base sequence that is specifically found for a specific sex and can be used for sex identification. Papaya sex identification markers can be separated as follows.
[0009]
1. Search for sex identification markers
The search for a sex discrimination marker is performed by a method for detecting a genetic polymorphism between individual organisms, for example, a random amplified polymorphic DNA (RAPD) method [William et al .: Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535 (1990). ] Etc. That is, first, DNA is extracted from papaya by a conventional method such as the CTAB method [Murray et al .: Nucleic Acids Res. 8: 4321-4325 (1980)]. At this time, the plant tissue used for the extraction is not limited, but preferably leaves are used. Furthermore, these leaves are preferably pulverized so that DNA extraction can be performed efficiently. For example, the leaves can be frozen with liquid nitrogen and pulverized in a mortar.
[0010]
Next, a polymerase chain reaction (PCR) is performed using the papaya DNA as a template and using a primer composed of one or two random sequences (also referred to as a random primer). Random primers that can be used here include those having a base length of 10 to 12 mer. In the present invention, a 10-mer primer consisting of a base sequence of 5′-ttggcacggg-3 ′ (SEQ ID NO: 3) uniquely designed and synthesized was used as a random primer. The PCR reaction conditions are not particularly limited, but preferably at 92 to 96 ° C. for 1 to 2 minutes (dissociation of double-stranded DNA), 37 to 42 ° C. for 1 to 2 minutes (primer annealing), 70 to 74 The reaction is sequentially carried out at 1 ° C. for 1-2 minutes (complementary strand synthesis), preferably 30 to 40 cycles. PCR can be performed using a heat block type program temperature controller (for example, PCR Thermal Cycler (Takara Shuzo)).
[0011]
After PCR, the PCR amplification product is detected. Examples of the detection method include, but are not limited to, gel electrophoresis (for example, agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, etc.) and subsequent gel staining (for example, ethidium bromide staining, etc.). For example, after agarose gel electrophoresis, when the gel is stained with ethidium bromide and observed under ultraviolet light, a barcode-like band pattern is obtained. This band pattern was compared when PCR was performed using female papaya-derived DNA as a template, when PCR was performed using male papaya-derived DNA as a template, and when PCR was performed using amphoteric papaya-derived DNA as a template. PCR amplification products specifically found for each sex can be used as papaya sex identification markers.
[0012]
By the way, Table 1 shows the sex phenotypes that appear in offspring by mating between papayas and their appearance ratios. Sunrise, the main varieties of papaya produced in Okinawa Prefecture, is an amphoteric self-breeding variety, and its seedlings (also called seedlings) have a ratio of 1 to 2 females and both sexes as shown in Table 1. Therefore, in sex identification of Sunrise seedlings, a method of discriminating between females and both sexes is desired. Not seen when PCR was performed using female papaya-derived DNA as a template, but only when PCR was performed using amphoteric papaya-derived DNA as a template, or PCR was performed using amphoteric and male papaya-derived DNA as a template PCR amplification products that are found only in cases can be used as sex-identifying markers to distinguish bisexual or male papaya from female papaya.
[0013]
[Table 1]

[0014]
2. Determination of the base sequence of the sex identification marker
The base sequence of the papaya sex identification marker obtained in 1 above can be determined by a base sequence determination method well known in the art. That is, for example, the band of the sex identification marker is extracted from the gel after the agarose gel electrophoresis of the PCR amplification product in the above 1, and is ligated to a nucleotide sequencing plasmid (for example, pT7Blue (manufactured by NOVAGEN)). Next, after transforming the ligation product into E. coli, E. coli containing the plasmid with the sex identification marker inserted therein is screened by colony PCR. A plasmid is prepared from the obtained Escherichia coli, and the base sequence of the inserted DNA fragment is determined by a known technique such as dideoxy method. The base sequence of a DNA fragment obtained as a sex identification marker in the present invention is shown in SEQ ID NO: 1, and the sequence of its complementary strand is shown in SEQ ID NO: 2. DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 are present in both sexes and male papaya in a double strand form, and both are useful as papaya sex identification markers.
[0015]
The sex identification markers of the present invention are not limited to those shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and any one can identify both sexes and male paia from female papayas. “Polymorphism” in which one or several bases are substituted, deleted, added or inserted in 2 is also included in the sex identification marker of the present invention. Here, the “polymorphism” refers to a DNA polymorphism in which a difference occurs between corresponding base sequences at one or several levels among papaya individuals of the same sex.
[0016]
The DNA of the present invention containing DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a polymorphic form of the DNA is prepared by the above method 1, but in addition, based on the determined nucleotide sequence It is also possible to prepare and synthesize a primer and perform PCR using this primer and DNA extracted from male and amphoteric strains of papaya as a template.
[0017]
3. Sex identification of papaya by analysis of sex identification marker of the present invention
By analyzing the presence or absence of the sex identification marker of the present invention in the test papaya, the sex of the test papaya can be identified. Analysis of the presence or absence of the sex identification marker can be performed by PCR method, probe method or the like.
[0018]
(1) Analysis of sex identification markers by PCR
Sex identification of papaya based on analysis of sex identification markers by PCR method can be performed as follows. First, based on the base sequence of DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a polymorphic form of the DNA, a sex identification marker amplification primer containing a part of the base sequence is designed and synthesized. Here, “part of the base sequence” refers to DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or 17 to 30 mer, preferably 20 to 30 mer in the polymorphic form of the DNA, most preferably It refers to a continuous nucleotide chain consisting of 20-25mer base length. More specifically, it is a nucleotide chain that specifically hybridizes to a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a polymorphic form of the DNA and functions as a primer. Here, “functions as a primer” means that it functions to provide a 3′-terminal OH group to DNA polymerase in a complementary strand synthesis reaction of PCR and to initiate a nucleotide chain synthesis reaction by the enzyme. The primer can be synthesized by a known method known as a method for synthesizing oligonucleotides, but more simply can be performed using a DNA synthesizer (for example, manufactured by Applied Biosystem).
[0019]
More specifically, sex identification marker amplification primers comprising a 5'-side primer and a 3'-side primer that can amplify a part or all of the sex-identification marker are used for analysis of sex-identification markers by PCR. A pair of is required. For example, 5'-ggtaagagtttttcccaagc-3 '(SEQ ID NO: 4) and 5'-tgcacgatttagattagatg-3' (SEQ ID NO: 5) may be mentioned as the 5'-side primer for sex identification marker amplification primer.
Examples of the 3 ′ primer include 5′-ggatagcttgcccaggtcac-3 ′ (SEQ ID NO: 6) and 5′-gttgtgctgcgctatcttgc-3 ′ (SEQ ID NO: 7). Other appropriate sequences can be easily designed and synthesized based on the base sequence, and the present invention is not limited to these primers. In addition, the corresponding position of each said primer in sequence number 1 is shown in FIG. In FIG. 1, the direction of the arrow indicates the direction of the array. These primers can be used by appropriately combining a 5′-side primer and a 3′-side primer, and the sex identification marker region can be used as a primer pair for amplification. It can be selected appropriately. That is, it is an indispensable condition to select a primer pair so that the 5 ′ primer exists upstream (in the direction from 5 ′ to 3 ′) than the 3 ′ primer. Preferred combinations of such primers include SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7. The primer combination is arbitrary.
[0020]
Sex identification of papaya seedlings can be performed using the primers of SEQ ID NOs: 4-7. More specifically, the male, male and male papaya seedlings obtained by mating combinations of “female × male”, “female × bisexual”, “male × male”, and “male × male” are males and males. Can be identified.
[0021]
A specific procedure is exemplified as follows. That is, first, DNA is extracted from the tissue of a papaya seedling according to a conventional method. The plant tissue used for DNA extraction is not particularly limited, but leaves are preferably used. Further, these leaves are preferably pulverized so that nucleic acid extraction can be performed efficiently. For example, the leaves can be pulverized using liquid nitrogen. Extraction of DNA can be performed using a known method, but it can be preferably extracted by the CTAB method [Murray et al., Nucleic Acids Res. 8, 4321-4325 (1980)].
[0022]
Next, using the extracted DNA as a template, a primer pair for amplification of the sex identification marker region is added and PCR is performed to amplify the target DNA fragment. Those skilled in the art can appropriately determine the PCR temperature conditions based on experience and are not particularly limited, but preferably 92 to 96 ° C. for 1 to 2 minutes (dissociation of double-stranded DNA), 50 The reaction is carried out sequentially at ~ 55 ° C for 1 to 2 minutes (primer annealing) and 70 to 74 ° C for 1 to 2 minutes (complementary strand synthesis), preferably 25 to 30 cycles. A heat block type program temperature control device can be used for the temperature setting of the reaction described above. An example of such an apparatus is PCR Thermal Cycler (Takara Shuzo).
[0023]
Finally, the amplified nucleic acid is detected from the reaction mixture obtained as described above. As a detection method, a method usually used in this technical field can be used, and preferably, the above-described agarose gel electrophoresis and subsequent gel staining with ethidium bromide can be used. Thus, PCR amplified fragments are detected only in male and amphoteric subject papaya, but not in females. If a PCR amplified fragment is detected, the sex identification marker of the present invention is present in the subject papaya, and it can be evaluated that the subject papaya is not a female. If no PCR amplified fragment is detected, the subject papaya can be assessed as female.
[0024]
Further, when the sex of the parent of the test papaya seedling is specified, the sex of the test papaya seedling can be specified by the presence or absence of the PCR amplified fragment. That is, in a papaya seedling obtained by a mating combination of “female × male”, if a PCR amplified fragment is detected, the subject papaya can be evaluated as a male, and if not detected, the subject papaya is It can be evaluated as a female. In addition, in a papaya seedling obtained by a mating combination of “female × bisexual”, if a PCR-amplified fragment is detected, the subject papaya can be evaluated as amphoteric, and if not detected, the subject papaya is It can be evaluated as a female. Furthermore, in a papaya seedling obtained by a “male × male” mating combination, if a PCR amplified fragment is detected, the subject papaya can be evaluated as a male, and if not detected, the subject papaya is It can be evaluated as a female. Similarly, in a papaya seedling obtained by a combination of “amphoteric x amphoteric”, if a PCR amplified fragment is detected, the subject papaya can be evaluated as amphoteric, and if not detected, the subject papaya is It can be evaluated as a female.
[0025]
(2) Analysis of sex identification markers by probe method
Papaya sex identification based on the analysis of sex identification markers by the probe method can be performed as follows. First, based on the base sequence of DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a polymorphic form of the DNA, a probe for detecting a sex identification marker containing part or all of the base sequence is prepared. Here, “part of the base sequence” means 20 to 450 mer, preferably 50 to 450 mer, most preferably DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a polymorphic form of the DNA. A continuous nucleotide chain consisting of a base length of 100 to 450 mer. As long as the base sequence of the nucleotide chain specifically hybridizes to DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or a polymorphic form of the DNA, one or several bases are substituted, deleted, The nucleotide sequence may be added or inserted. For example, a DNA having a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be obtained by site-directed mutagenesis [Zoller et al .: Nucleic Acids Res. 10 (20): 6487-6500 (1982)] can be easily prepared by those skilled in the art.
[0026]
The sex identification marker detection probe can be used to excise a desired DNA fragment with a suitable restriction enzyme from a cloned DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or a plasmid containing a polymorph of the DNA. It can be prepared by PCR using the plasmid or DNA prepared from amphoteric or male papaya as a template. As long as it specifically hybridizes to DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a polymorphic form of the DNA, one or several bases are substituted, deleted, added or inserted. DNA having a sequence can be easily prepared by those skilled in the art by site-directed mutagenesis [Zoller et al .: Nucleic Acids Res. 10 (20): 6487-6500 (1982)]. The probe DNA fragment is labeled with a radioactive label (for example, ³² P, ³⁵ S, ^Three H), non-radioactive labeling (for example, biotin, digoxigenin) and the like. Specifically, after removing the phosphate at the 5 ′ end of the probe DNA with phosphatase, [γ− ³² A method of transferring the γ-phosphate group of P] ATP to the 5 ′ end of the DNA, ³² P], [ ³⁵ S], [ ^Three H], a method of incorporating a nucleotide substrate labeled with biotin or the like together with probe DNA synthesis by a nick translation method or the like. More simply, ³² The labeling of probe DNA with P is rediprime. ^TM It can be carried out using a commercially available kit such as II (Amersham Pharmacia Biotech).
[0027]
As a specific procedure, a method utilizing Southern hybridization is exemplified as follows. That is, DNA is first extracted from papaya by the same method as described above and digested with an appropriate restriction enzyme. The restriction enzyme to be used is not particularly limited, but EcoRI is preferably used.
[0028]
Subsequently, the restriction enzyme-digested DNA is subjected to agarose gel electrophoresis as described above, and the DNA is blotted onto a membrane according to a conventional method. The membrane is not particularly limited, but a nylon membrane such as Hybond N + (Amersham Pharmacia Biotech) is preferable.
[0029]
Further, the above-described probe for detecting a sex identification marker is hybridized to the blotted membrane according to a conventional method. Prehybridization and hybridization are performed at 65 ° C. for 4 hours and 16 hours, respectively. This condition is not particularly limited because those skilled in the art can appropriately set based on experience. After the hybridization, the nylon membrane is washed with a 65 ° C. SSC solution (containing 0.1% SDS). The conditions for washing can be appropriately set based on experience by those skilled in the art, but are not limited. However, 2 × SSC solution (containing 0.1% SDS) twice, 0.1 × SSC solution (containing 0.1% SDS) Can be done twice. Each cleaning time can be about 20 minutes.
[0030]
Finally, the washed blot can be used for analysis by autoradiography or BAS2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.). As a result, a band (positive band) is detected only in male and amphoteric test plants, but not in females.
[0031]
As in the case of analysis of sex identification markers by PCR, when the sex of the parent of the test papaya seedling is specified, the sex of the test papaya seedling can be specified by the presence or absence of a positive band. It is. That is, in a papaya seedling obtained by a “female × male” mating combination, if a positive band is detected, the subject papaya can be evaluated as male, and if not detected, the subject papaya is female. Can be evaluated. In addition, in a papaya seedling obtained by a “female × bisexual” mating combination, if a positive band is detected, the subject papaya can be evaluated as amphoteric, and if not detected, the subject papaya is a female. Can be evaluated. Further, in a papaya seedling obtained by a “male × male” mating combination, if a positive band is detected, the subject papaya can be evaluated as male, and if not detected, the subject papaya is a female. Can be evaluated. Similarly, if a positive band is detected in a papaya seedling obtained by a combination of “amphoteric x amphoteric”, the subject papaya can be evaluated as amphoteric, and if not detected, the subject papaya is female. Can be evaluated.
[0032]
4. Papaya sex identification kit
Based on the papaya sex identification method of the present invention, reagents necessary for carrying out the identification method can be packaged and supplied as a kit. More specifically, for example, a part of the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or a DNA containing the polymorphic form of the DNA (for example, one having a length of 17 to 30 mer, More specifically, for example, a papaya sex identification marker amplification primer including one represented by any one of SEQ ID NOs: 4 to 7) and / or a DNA comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or Examples include those comprising, as an essential component, a papaya sex identification marker detection probe containing a part or all of a part of the DNA (for example, one having a length of 20 to 450 mer) containing the polymorph of the DNA. . The components of the kit can vary as needed. For example, a buffer providing conditions suitable for the PCR reaction or hybridization reaction, and reagents necessary for detection of the synthesis reaction product can be added. Using this kit, it is possible to identify the sex of papaya according to the above procedure 3.
[0033]
【Example】
Examples of the present invention will be specifically described below, but the scope of the present invention is not limited thereto.
[Example 1] Search for sex identification marker
(1) DNA extraction from papaya leaves
DNA was extracted from 5 g of papaya leaves using the CTAB method. Papaya used for the extraction was a total of 33 individuals of known sex (13 males, 16 females, 4 bisexuals) such as Sunrise, Waimanalo, and the Okinawa Prefectural Agricultural Experiment Station breeding lines.
[0034]
(2) Search for sex identification markers by RAPD method
PCR was performed using 100 ng of the DNA extracted as described above as a template and the random primer IBRC-RP07 5′-ttggcacggg-3 ′ (SEQ ID NO: 3) designed and synthesized by the inventors. Specifically, DNA solution 10 μl (10 ng / μl), sterile distilled water 4 μl, 10 × PCR buffer 2 μl, dNTP mixture 2 μl (2.5 mM each), TaKaRa Ex Taq 1 μl (0.5 U / μl), designed and synthesized by the inventors. Furthermore, 1 μl (20 μM) of 10-Mer primer was mixed and PCR reaction was performed. The reaction was carried out sequentially at 94 ° C. for 1 minute (DNA denaturation), 37 ° C. for 1 minute (primer association), and 72 ° C. for 2 minutes (DNA chain extension), and this was performed for 30 cycles. For temperature setting, a heat block type program temperature controller PCR Thermal Cycler (Takara Shuzo) was used. Next, 10 μl of the PCR reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and then the gel was stained with ethidium bromide and observed under ultraviolet light to detect the amplified fragment. The results are shown in FIGS.
[0035]
Figure 2 shows the results of PCR using IBRC-RP07 primer with DNA extracted from the leaves of 17 papayas of known sex (6 males, 7 females, 4 bisexuals) and 2% of the amplified product. It is the result analyzed by agarose gel electrophoresis. M is a molecular weight marker 100 bp DNA Ladder (Bio Labs), and C is a control group in which sterilized distilled water was added instead of DNA and PCR was performed. The males are, from left to right, Okinawa Prefecture wild species A, Mexican introduced species M1, Okinawa Prefecture wild species IK2, Okinawa Prefecture wild species IK7, Okinawa Prefecture wild species D, and Mexico introduced species M5. The females are, from left to right, Okinawa Wild Species A, Mexican Introduced Species M1, Okinawa Prefectural Wild Species IK2, Waimanalo, Orange Queen, Okinawa Prefectural Wild Species 2, and Sunrise. The two sexes are, from left to right, F1 of Waimanalo, Sunrise, M1 introduced in Mexico, Waimanaro x M1 introduced in Mexico.
[0036]
Figure 3 also shows the amplification of PCR using IBRC-RP07 primers using DNA extracted from the leaves of 16 papayas of known sex (mating parents and their F1 population, 7 males and 9 females). It is the result of having analyzed the product by 2% agarose gel electrophoresis. M is a molecular weight marker 100 bp DNA Ladder (Bio Labs), and C is a control group in which sterilized distilled water was added instead of DNA and PCR was performed. The male used for mating is the Okinawa Agricultural Experiment Station Breeding Line ON-7, and the female is the Okinawa Agricultural Experiment Station ON-36.
As is apparent from the results of FIGS. 2 and 3, a male and gender-specific amplified fragment (sex discrimination marker) was detected between 400 bp and 500 bp.
[0037]
[Example 2] Determination of base sequence of sex identification marker
(1) Cloning of sex identification markers
The sex identification marker detected in Example 1 was extracted from an agarose gel using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), cloned into plasmid pT7Blue (NOVAGEN), and transformed into E. coli.
[0038]
(2) Determination of the base sequence of the sex identification marker
Next, clones having sex identification markers were cultured, and recombinant plasmids were extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit. Reaction was performed using BigDye Terminator Cycle Sequencing, FS kit (PE Biosystems Japan) using the extracted recombinant plasmid as a template, and the base sequence was determined by ABI PRISM ™ 377 DNA Sequencer (PE Biosystems Japan). The determined base sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
[0039]
[Example 3] Sex identification of papaya by PCR
Using the obtained sex identification marker, sex identification of papaya was performed by PCR. First, based on the base sequence determined in Example 2, a sex identification marker amplification primer was designed and synthesized. That is, 5'-ggtaagagtttttcccaagc-3 '(SEQ ID NO: 4) and 5'-tgcacgatttagattagatg-3' (SEQ ID NO: 5) are used as 5'-side primers, and 5'-ggatagcttgcccaggtcac-3 '(SEQ ID NO: 5) is used as the 3'-side primer. 6) and 5′-gttgtgctgcgctatcttgc-3 ′ (SEQ ID NO: 7) were synthesized. On the other hand, 5 g of the leaves of the test papaya were transferred to a mortar, added with a small amount of liquid nitrogen and ground, and then DNA was extracted by the CTAB method. The papaya used for the extraction was the above 33 individuals (13 males, 16 females, 4 bisexuals), mating parents (female, both sexes) and their F1 population (14 seedlings). Using the extracted DNA as a template, the target DNA fragment was amplified by PCR using a 5 ′ homologous primer and a 3 ′ complementary primer. DNA solution 1 μl (10 ng / μl), 10 × PCR buffer 2 μl, dNTP mixture 2 μl (2.5 mM each), TaKaRa Ex Taq 1 μl (0.5 U / μl), sterile distilled water 12 μl, sex identification marker 5 ′ homologous primer 1 μl (20 μM) and 1 μl (20 μM) of the 3 ′ side complementary primer were mixed to carry out a PCR reaction. As a primer, a combination of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 was used. The reaction was performed sequentially at 94 ° C for 1 minute (dissociation of double-stranded DNA), 55 ° C for 1 minute (primer annealing), and 72 ° C for 1 minute (complementary strand synthesis) for 30 cycles. . For temperature setting, a heat block type program temperature controller PCR Thermal Cycler (Takara Shuzo) was used. Next, 10 μl of the PCR reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and then the gel was stained with ethidium bromide and observed under ultraviolet light to detect the amplified fragment.
[0040]
The results are shown in FIG. (1) is the result of analyzing 17 papaya individuals (6 males, 7 females, 4 bisexuals) with known gender. M is a molecular weight marker 100 bp DNA Ladder (Bio Labs), and C is a control group in which sterilized distilled water was added instead of DNA and PCR was performed. The males are, from left to right, Okinawa Prefecture wild species A, Mexican introduced species M1, Okinawa Prefecture wild species IK2, Okinawa Prefecture wild species IK7, Okinawa Prefecture wild species D, and Mexico introduced species M5. The females are, from left to right, Okinawa Wild Species A, Mexican Introduced Species M1, Okinawa Prefectural Wild Species IK2, Waimanalo, Orange Queen, Okinawa Prefectural Wild Species 2, and Sunrise. The two sexes are, from left to right, F1 of Waimanalo, Sunrise, M1 introduced in Mexico, Waimanaro x M1 introduced in Mexico. (2) is the result of analysis of 16 papaya individuals of known sex (mating parents and their F1 population, 7 males, 9 females). M is a molecular weight marker 100 bp DNA Ladder (Bio Labs), and C is a control group in which sterilized distilled water was added instead of DNA and PCR was performed. The male used for mating is the Okinawa Agricultural Experiment Station Breeding Line ON-7, and the female is the Okinawa Agricultural Experiment Station ON-36. (3) shows the results of analysis of mating parents (female, both sexes) and their F1 population (14 seedlings). M is a molecular weight marker 100 bp DNA Ladder (Bio Labs), and C is a control group in which sterilized distilled water was added instead of DNA and PCR was performed. The both sexes used for the mating are Sunrise, and the female is the Okinawa Agricultural Experiment Station ON-34. As is apparent from FIG. 4, the target amplified fragment was detected only in male and bisexual samples (FIG. 4). The F1 population (14 seedlings) was compared with the above results after flowering. Even when other sets of primers were used, good discrimination results were obtained as well. From the above, it was found that sex identification of papaya can be performed based on the analysis of the sex identification marker of the present invention by PCR.
[0041]
[Example 4] Sex identification of papaya by probe method
Moreover, the sex identification of papaya was performed by the probe method using the obtained sex discrimination marker. First, 10 μg of male, female and amphoteric DNA digested with the restriction enzyme EcoRI was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and then the DNA was alkaline blotted onto Hybond N + (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) according to a conventional method. On the other hand, the amplified fragment obtained in Example 3 was ³² Labeled with P. That is, 20 ng of amplified fragment was used with rediprimeTMII (Amersham Pharmacia Biotech) ³² The probe was labeled with P and purified with a ProbeQuant ™ G-50 Micro Column (Amersham Pharmacia Biotech). Next, the blot prepared as described above was prehybridized at 65 ° C. for 4 hours, and then the heat-denatured probe was added thereto, followed by hybridization at 65 ° C. for 16 hours. The blot was then washed twice with 65 ° C. 2 × SSC solution (containing 0.1% SDS) for 20 minutes twice, followed by 65 ° C. 0.1 × SSC solution (containing 0.1% SDS) for 20 minutes twice. Finally, the washed blot was analyzed by BAS2000 (Fuji Photo Film Co., Ltd.).
[0042]
The results are shown in FIG. Males are IK7 wild species in Okinawa, females are Wine Maro, and both sexes are Sunrise. As is clear from FIG. 5, bands were detected only in male and bisexual test plants, but not in females. From the above, it was found that sex identification of papaya can be performed based on the analysis of the sex identification marker of the present invention by the probe method.
[0043]
【The invention's effect】
According to the present invention, sex identification of papaya can be performed using a DNA marker. Therefore, by using the method of the present invention, it is possible to quickly and highly sensitively identify papaya at the seedling raising stage.
[0044]
[Sequence Listing]

[0045]
[Sequence Listing Free Text]
Sequence number 3: Synthetic DNA
Sequence number 4: Synthetic DNA
Sequence number 5: Synthetic DNA
Sequence number 6: Synthetic DNA
Sequence number 7: Synthetic DNA
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the positions of the sequences of SEQ ID NOs: 4 to 7 in the entire base sequence of a papaya identification marker.
FIG. 2 is an electrophoresis photograph showing the results of PCR when DNA extracted from leaves of 17 papaya individuals of known sex is used as a template.
FIG. 3 is an electrophoresis photograph showing the results of PCR when DNA extracted from leaves of 16 papaya individuals of known sex is used as a template.
FIG. 4 is an electrophoretogram showing the results of sex identification of papaya based on the analysis of sex identification markers by PCR.
FIG. 5 is an electrophoretogram showing the results of sex identification of papaya based on the analysis of sex identification markers by the probe method.

Claims

DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or DNA comprising a polymorphism in which one or several bases of the DNA are substituted, deleted, added or inserted .

A papaya sex identification marker comprising a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or a polymorphism in which one or several bases of the DNA are substituted, deleted, added or inserted .

A primer for amplification of a papaya sex identification marker, comprising a part of the DNA according to claim 1 and having a length of 17 to 30 mer .

The primer for amplification of a papaya sex identification marker according to claim 3, wherein a part of the DNA is represented by any one of SEQ ID NOs: 4 to 7.

A papaya sex identification kit comprising the sex identification marker amplification primer according to claim 3 as a constituent element.

A probe for detecting a papaya sex-identifying marker, comprising a part of the DNA according to claim 1 having a length of 20 to 450 mer or all of it.

A papaya sex identification kit comprising the sex identification marker detection probe according to claim 6 as a component.

A papaya sex identification method, comprising analyzing the presence or absence of the papaya sex identification marker according to claim 2 in a subject papaya.

The papaya sex identification method according to claim 8 , wherein the analysis of the presence or absence of a papaya sex identification marker is performed by detecting an amplification product derived from the sex identification marker obtained by polymerase chain reaction.

Polymerase chain reaction, from the subject papaya as a template DNA, and according to claim 9, characterized in that it is performed using either sex identification marker amplification primers according to claim 3 or 4, wherein the primer papaya Sex identification method.

The papaya sex identification method according to claim 8 , wherein the analysis of the presence or absence of a papaya sex identification marker is performed by detecting a hybridized product obtained by a probe hybridization reaction.

12. The method for sex identification of papaya according to claim 11 , wherein the probe hybridization reaction is performed by hybridizing the probe for sex identification marker according to claim 6 to DNA derived from the subject papaya.