JP2007114157A - 全反射減衰を利用した測定方法及び装置 - Google Patents

Abstract

【課題】ＣＣＤセンサが飽和したときに生じる異常データが測定精度に与える影響を軽減する。
【解決手段】全反射減衰を利用する測定方法では、センサ面における試料の反応を、センサ面の裏面で反射する反射光の光強度分布をＣＣＤセンサで取得して測定する。ＣＣＤセンサは、その水平転送路の転送方向Ｈと、減衰によって生じる暗線位置Ｄの移動方向Ｍとが一致するように配置される。光量を上げるとノイズが軽減されるという効果がある反面、飽和光量を超えた場合には、電荷転送時に、溢れた電荷が転送方向の上流側に隣接する画素にこぼれて異常データが発生する。減衰部分の周辺光量は、移動方向Ｍの上流側の方が大きいため、転送方向Ｈと移動方向Ｍとを一致させることで、飽和光量が減衰部分にこぼれ落ちにくくなる。
【選択図】図１２

Description

本発明は、光の全反射減衰を利用して試料の反応状況を測定する全反射減衰を利用した測定方法及び装置に関するものである。

例えば、タンパク質やＤＮＡなどの生化学物質の相互作用を調べたり、薬品のスクリーニングを行うために、試料の反応を測定する測定装置として、全反射減衰を利用した測定装置が知られている。

全反射減衰を利用した測定装置は、透明な誘電体ブロックの一面に形成された薄膜の表面であるセンサ面上において試料の反応を生じさせ、前記薄膜と誘電体ブロックとの界面に全反射条件を満たすように光を入射させ、その反射光の減衰状況を検出することにより前記反応を測定する。こうした全反射減衰を利用した測定装置の１つに、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）現象を利用した測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置という）がある。表面プラズモンとは、金属中の自由電子が集団的に振動することによって生じ、その金属の表面に沿って進む自由電子の粗密波である。

ＳＰＲ測定装置は、前記界面に向けて光を入射させる光源と、界面で反射した反射光を受光してその光強度を検出する光検出器とからなる測定部を備えており、前記薄膜として金属膜を使用したセンサユニットを用いる。ＳＰＲ測定装置は、センサ面にＳＰＲを発生させ、そこで生じる物質の反応状況を測定部によってＳＰＲを検出することにより測定する（例えば、下記特許文献１参照）。

全反射条件を満足するように（臨界角以上の入射角で）光を前記界面に向けて入射させると、全反射が起こるが、入射光のうちわずかな光は反射せずに金属膜内を通過して、センサ面に染み出す。この染み出した光波がエバネッセント波と呼ばれる。このエバネッセント波と表面プラズモンの振動数が一致して共鳴すると（ＳＰＲが発生すると）、反射光の強度が大きく減衰する。界面には、全反射条件を満たす様々な角度の入射光が入射され、それら様々な角度の入射光が界面で反射してその反射光が光検出器の受光面に出力される。ＳＰＲが発生する入射角（共鳴角）で入射した光の反射光は、その光強度が減衰して、受光面上では暗線として捉えられる。

共鳴角は、エバネッセント波および表面プラズモンが伝播する媒質の屈折率に依存する。言い換えると、媒質の屈折率が変化すれば、共鳴角が変化する。センサ面と接する物質は、エバネッセント波および表面プラズモンを伝播させる媒質となるので、例えば、センサ面において、２種類の分子間の結合や解離などの化学反応が生じると、それが媒質の屈折率の変化として顕れて、共鳴角が変化する。ＳＰＲ測定装置は、上記暗線の位置の変化を、共鳴角に対応する反射光の減衰角として捉えることにより、分子間の相互作用を測定する。

生化学分野の実験や研究においては、タンパク質、ＤＮＡ、薬品などが、リガンドやアナライトとして使用される。例えば、薬品のスクリーニングを行う場合には、リガンドとして、タンパク質などの生体物質を使用し、このリガンドにアナライトとなる複数種類の薬品を接触させて、それらの相互作用を調べる。

特許文献１に記載のＳＰＲ測定装置では、光検出器として、ＣＣＤセンサを使用しており、その受光面の前方に遮光マスクを配置している。遮光マスクは、反射光の光強度分布のうち、前記暗線位置に相当する減衰部分を透過するスリットを持ち、前記減衰部分よりも光量が大きい他の部分が受光面へ入射することを遮る。こうした遮光マスクを用いれば、減衰部分のみが受光面に入射することになるので、限られたダイナミックレンジを有効に使用することができる。
特開平１０−１７０４３０号公報

しかしながら、上記特許文献１の方法のように、反射光をスリットを通過させて受光面に入射させると、光の回折が生じて測定精度が低下する懸念がある。また、遮光マスクを用いた場合には、暗線位置の変化に合わせて、遮光マスクを移動させる移動機構が必要になるなど構造が複雑化するという問題も生じる。

そこで、光強度分布のうち前記暗線位置を算出するために必要な有効部分がＣＣＤセンサのダイナミックレンジに収まるように、反射光の光量を上げて測定することが検討されている。遮光マスクを用いることなく、ダイナミックレンジを有効部分に割り当てることができる。

しかし、光量レベルを上げてＣＣＤセンサを飽和させると、電荷転送に起因して異常データが発生するという問題がある。この異常データは、電荷転送時に、飽和した画素から溢れた電荷が隣接する画素にこぼれ落ちてしまい、その画素の光量が異常に高くなることによって生じる。こうした異常データが、減衰部分に発生すると暗線位置の算出精度が著しく低下するため、問題となっていた。

本発明の目的は、ＣＣＤセンサが飽和したときに生じる異常データが測定精度に与える影響を軽減することを目的とする。

本発明の全反射減衰を利用した測定方法は、表面がリガンドを固定するセンサ面となる薄膜と、この薄膜が形成された透明な誘電体とからなるセンサを用い、前記センサ面にアナライトを送液して前記リガンドと接触させるとともに、前記薄膜の裏面と前記誘電体との界面に向けて光源から全反射条件を満たすように光を入射させ、前記界面における反射光の光強度分布をＣＣＤセンサで取得して、前記光強度分布のうち全反射減衰によって前記反射光の減衰が生じる暗線位置の変化を検出することにより、前記アナライトと前記リガンドとの結合反応を測定する全反射減衰を利用した測定方法において、前記ＣＣＤセンサとして、垂直及び水平の各転送路を持つエリアセンサを使用するとともに、前記アナライトとリガンドとが結合するときに前記ＣＣＤセンサの受光面上で前記暗線位置が移動する移動方向と、前記ＣＣＤセンサの水平転送路の転送方向とが一致するように、前記ＣＣＤセンサを配置して測定することを特徴とする。

前記水平転送路に接続され、飽和した電荷を廃却するオーバーフロードレインを持つＣＣＤセンサを使用することが好ましい。

本発明の全反射減衰を利用した測定装置は、表面がリガンドを固定するセンサ面となる薄膜と、この薄膜が形成された透明な誘電体とからなるセンサを用い、前記センサ面にアナライトを送液して前記リガンドと接触させる送液手段と、前記薄膜の裏面と前記誘電体との界面に向けて全反射条件を満たすように光を入射させる光源と、前記界面における反射光を受光してその光強度分布を取得するＣＣＤセンサと、前記光強度分布を解析する解析手段とを備え、前記光強度分布のうち全反射減衰によって前記反射光の減衰が生じる暗線位置の変化を検出して、前記アナライトと前記リガンドとの結合反応を測定する全反射減衰を利用した測定装置において、前記ＣＣＤセンサとして、垂直及び水平の各転送路を持つエリアセンサを使用するとともに、前記アナライトとリガンドとが結合するときに前記ＣＣＤセンサの受光面上で前記暗線位置が移動する移動方向と、前記ＣＣＤセンサの水平転送路の転送方向とが一致するように、前記ＣＣＤセンサを配置したことを特徴とする。

前記水平転送路に接続され、飽和した電荷を廃却するオーバーフロードレインを持つＣＣＤセンサを使用することが好ましい。

本発明は、試料の反応を検知するセンサ面の裏面に全反射条件を満たすように光を入射させ、その反射光の光強度分布をＣＣＤセンサで取得して、前記光強度分布のうち全反射減衰によって反射光の減衰が生じる暗線位置の変化を検出することにより、アナライトとリガンドとの結合反応を測定する全反射減衰を利用した測定方法において、前記ＣＣＤセンサとして、垂直及び水平の各転送路を持つエリアセンサを使用するとともに、前記アナライトとリガンドとが結合するときに前記ＣＣＤセンサの受光面上で前記暗線位置が移動する移動方向と、前記ＣＣＤセンサの水平転送路の転送方向とが一致するように、前記ＣＣＤセンサを配置して測定するようにしたから、ＣＣＤセンサが飽和したときに生じる異常データが前記有効部分に発生することが抑制されるので、測定精度に与える影響を軽減することができる。

図１に示すように、ＳＰＲ測定装置には、リガンドとアナライトとの結合反応や解離反応を検知するためのセンサユニット１２が着脱自在にセットされる。ＳＰＲ測定装置には、反応を測定する測定部と、前記流路１６への前記試料溶液の注入と排出とを行う一対のピペット２８ａ，２８ｂを備えた分注ヘッド２８とが設けられている。測定部は、センサユニット１２に対して、全反射条件を満たす様々な入射角を持つ光ビームを照射する照明部２６と、センサユニット１２で反射した反射光を受光して、その光強度分布を検出するＣＣＤセンサ２７とからなる。ＣＣＤセンサ２７は、受光面における反射光の光強度分布を測定信号として出力する。この測定信号を解析することにより、共鳴角の変化を捉えて試料の反応が測定される。

図２に示すように、センサユニット１２は、透明な誘電体であるプリズム１４と、液体を送液する流路１６が形成された流路部材１８と、この流路部材１８を、プリズム１４の上面に圧接させ、流路部材１８とプリズム１４とを一体的に保持する保持部材１９と、この保持部材１９の上面に、両面テープ２１によって取り付けられる蓋部材２２とからなる。

流路部材１８は、断面が四角形の長尺の各柱状をしており、弾性部材で形成されている。流路部材１８の下面は、プリズム１４の上面と対面して圧接される。流路１６は、略Ｕ字形をした送液管であり、プリズム１４の上面と対向して注入された液体をプリズム１４の上面に沿って流す対向部分１６ｃと、この対向部分１６ｃの両端から流路部材１８の上面１８ａに向けて流路部材１８を縦方向に貫通する貫通部分１６ｄとからなる。各貫通部分１６ｄの上端には、それぞれ、ピペット２８ａ，２８ｂの先端が挿入され試料溶液の注入口及び排出口となる出入口１６ａ，１６ｂが形成される。

流路１６の管径は、例えば、約１ｍｍ程度であり、各出入口１６ａ，１６ｂの間隔は、例えば、約１０ｍｍ程度である。対向部分１６ｃは、流路部材１８の底面に形成された溝であり、その底面に圧接されるプリズム１４の上面によってその開放部位が覆われて封止される。流路部材１８には、こうした流路１６が、例えば、３つ設けられており、各流路１６は、流路部材１８の長手方向に沿って並べて配列されている。

プリズム１４には、その上面に、表面がセンサ面１３ａとなる金属膜１３が蒸着によって形成される。この金属膜１３は、流路部材１８に形成された複数の流路１６と対向するように短冊状に形成される。さらに、この金属膜１３の上面には、各流路１６に対応する部位に、リガンドを固定するリガンド固定膜となる複数のリンカー膜２３が形成される。リンカー膜２３は、センサユニット１２の製造時に製膜される。このリンカー膜２３を含む１つのセンサ面１３ａと、１つの流路１６とによって１個のセンサセル１７が構成される。

図１に示すように、リンカー膜２３上には、リガンドが固定されアナライトとリガンドとの結合反応が生じる測定領域（ａｃｔ領域）２３ａと、リガンドが固定されず、前記測定領域の信号測定に際しての参照信号を得るための参照領域（ｒｅｆ領域）２３ｂとが形成される。ｒｅｆ領域２３ｂは、リンカー膜２３を製膜する際に形成される。形成方法としては、例えば、リンカー膜２３に対して表面処理を施して、リンカー膜２３の半分程度の領域について、リガンドと結合する結合基を失活させる。これにより、リンカー膜２３の半分がａｃｔ領域２３ａとなり、残りの半分がｒｅｆ領域２３ｂとなる。

このリンカー膜２３には、流路１６を通じて、まず、リガンドを含むリガンド溶液が送液されて、ａｃｔ領域２３ａにリガンドが固定される。リガンドを固定した後、流路１６には、アナライトを含むアナライト溶液が注入され、これがリンカー膜２３に送液されてリガンドと接触する。この際に検出される測定信号を解析することにより、リガンドとアナライトの結合反応が測定される。

プリズム１４は、例えば、断面が台形の棒状をしている。プリズム１４の素材としては、例えば、ホウケイクラウン（ＢＫ７）やバリウムクラウン（Ｂａｋ４）などに代表される光学ガラスや、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイト（ＰＣ）、非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）などに代表される光学プラスチックなどが用いられる。

プリズム１４と流路部材１８とは、保持部材１９によって一体的に保持される。プリズム１４の長手方向の両側面には、保持部材１９の係合部１９ａと係合する係合爪１４ａが設けられている。これらの係合により、流路部材１８が、保持部材１９とプリズム１４とによって挟み込まれる。また、プリズム１４の短辺方向の両端部には、突部１４ｂが設けられている。この突部１４ｂは、センサユニット１２をホルダ（図示せず）に収納する際に、その内壁と係合してその収納位置を位置決めする位置決め部材である。

保持部材１９の上部には、各流路１６の出入口１６ａ，１６ｂに対応する位置に、ピペット２８ａ，２８ｂの先端を誘い込む受け入れ口１９ｂが形成されている。保持部材１９が流路部材１８を挟み込んでプリズム１４と係合すると、各受け入れ口１９ｂと、各出入口１６ａ，１６ｂとが連結される。また、これら各受け入れ口１９ｂの両脇には、円筒形のボス１９ｃが設けられている。これらのボス１９ｃは、蓋部材２２に形成された穴２２ａと嵌合して、蓋部材２２を位置決めするためのものである。

蓋部材２２は、流路１６に通じる受け入れ口１９ｂを覆うことで、流路１６内の液体の蒸発を防止する。蓋部材２２は、弾性部材、例えば、ゴムやプラスチックで形成されており、各受け入れ口１９ｂに対応する位置に、十字形のスリット２２ｂが形成されている。ピペット２８ａ，２８ｂは、スリット２２ｂを押し広げながら挿入される。スリット２２ｂは、ピペット２８ａ，２８ｂが引き抜かれると、弾性力によって初期状態に復帰して、受け入れ口１９ｂを塞ぐ。

また、図示しないが、このセンサユニット１２には、個々のユニットを識別できるように各ユニット毎の識別ＩＤなどの情報を含むバーコードが記録されている。各センサユニット１２に識別ＩＤを記録しておけば、例えば、各センサユニット１２毎の測定結果と、注入した試料溶液の種類などを対応付けてデータを管理することが可能になる。なお、バーコードを設ける代わりに、例えば、ＲＦＩＤタグなどのＩＣタグを設けてもよい。

センサユニット１２がセットされる測定ステージには、センサユニット１２を着脱自在に保持する装着部となるテーブル３１が設けられている。センサユニット１２は、図示しないハンドリング機構によって待機位置から測定ステージへ運ばれ、テーブル３１にセットされる。テーブル３１には、センサユニット１２の底部と嵌合するガイドレール３１ａが設けられている。センサユニット１２は、ガイドレール３１ａに沿ってスライド自在に設けられており、そのスライドによって、各センサセル１７が選択的に測定位置に挿入される。センサユニット１２のスライドは、前記ハンドリング機構によって行われる。

図３に示すように、照明部２６は、プリズム１４と金属膜１３との界面３３に向けて光を照射する。上述したとおり、リガンドとアナライトの反応状況は、共鳴角の変化として顕れるため、照明部２６は、全反射条件を満足する様々な入射角の光ビームを前記界面３３に入射させる。照明部２６は、光源３５と、光学系からなり、光源３４としては、例えば、ＬＥＤ（Light Emitting Diode），ＬＤ（Laser Diode），ＳＬＤ（Super Luminescent Diode）などの発光素子が使用される。

光学系は、コリメータレンズ３６，集光レンズ３７などからなる。光源３５が発光する発散光は、コリメータレンズ３６によって平行光化されて、集光レンズ３７へ入射する。集光レンズ３７は、平行光を集光して界面３３の特定の入射位置に収束させる。これにより、様々な入射角の光ビームが界面３３に照射される。この光ビームの入射位置は、反射光の光強度を検出して測定信号を得る検出位置Ｐとなる。また、ａｃｔ領域２３ａとｒｅｆ領域２３ｂには、それぞれの領域に光ビームが照射されるが、各領域への光ビームは、例えば、１つの光源からの光を分光して生成される。

ＣＣＤセンサ２７は、界面３３上の検出位置Ｐで反射した反射光を受光してその反射光の光強度に応じたレベルの光強度信号を測定信号として出力する。検出位置Ｐでは、様々な入射角で入射した光ビームが反射する。それらに対応する様々な反射角の反射光は受光面２７ａに入射する。ＣＣＤセンサ２７は、各画素毎に反射光の光強度信号を出力する。これにより、反射光の光強度分布が得られる。

様々な入射角で入射した光ビームのうち、共鳴角で入射した反射光Ｒｓｐ（図３上ハッチングで示す）の光強度は、大きく減衰するので、ＣＣＤセンサ２７の受光面２７ａ上では、反射光Ｒｓｐの受光位置（以下、暗線位置という）Ｄが暗線として検出される。この反射光Ｒｓｐと、界面３３に対する法線ＬＮとがなす角を、共鳴角に対応する反射光の減衰角θと呼ぶ。

ＣＣＤセンサ２７は、ａｃｔ領域２３ａに対応する測定信号をａｃｔ信号として出力し、ｒｅｆ領域２３ｂに対応する測定信号をｒｅｆ信号として出力する。信号処理部３８は、ａｃｔ信号とｒｅｆ信号の差や比に基づいて、測定データを生成する。ａｃｔ信号とｒｅｆ信号とに基づいて測定データを生成することで、センサユニットやセンサセルの個体差や、装置の機械的な変動や、液体の温度変化など、外乱に起因するノイズをキャンセルすることができるので、精度の高い測定が可能になる。

コントローラ３９は、分注ヘッド２８，照明部２６，検出器２７など、ＳＰＲ測定装置の各部を統括的に制御する。ヘッド駆動機構４１は、分注ヘッド２８を駆動する。コントローラ３９は、ヘッド駆動機構４１を通じて、分注ヘッド２８の移動や、吸引及び吐出動作を制御する。

データ解析部４２は、測定データを解析して、減衰角θを表すレゾナンスシグナル（ＳＰＲ信号）の経時変化を求める。光源駆動部４３は、光源３５を駆動して点灯させる。光源駆動部４３は、コントローラ３９からの制御信号に基づいて、光源３５を駆動する電流値を変化させることにより、光源３５の発光量を調節する。

図４のグラフに示すように、反射光の減衰角θは、センサ面１３ａ上の媒質の屈折率ｎに比例して大きくなる。屈折率ｎは、リガンドとアナライトとの結合量が多くなると上昇する。従って、リガンドとアナライトの結合反応が進むと、図５に示すように、減衰角θが大きくなり（θ０→θ１）、それに応じて、受光面２７ａ上の暗線位置Ｄも移動（Ｄ０→Ｄ１）する。ＳＰＲ測定では、測定データに基づいて、この暗線位置Ｄの変化を捉えることにより、リガンドとアナライトの結合反応が解析される。

図６は、検出器２７によって取得される反射光の光強度分布を示すグラフである。細線で示す略山形形状の曲線ＢＯは、ＳＰＲが生じないときの反射光の光強度分布であり、照明部２６が発光し界面３３で反射した光ビームの初期の形状を示すビームプロファイルを示す。太線で示す曲線ＢＡは、ＳＰＲの発生により反射光に減衰が生じたときの光強度分布を示す。この例の曲線ＢＡでは、略中央部分が大きく落ち込んでおり、この部分が暗線位置Ｄを含む減衰部分となる。暗線位置Ｄは、この減衰部分の測定データを基に、減衰部分の最小値付近に対応する光強度重心を算出することによって求められる。暗線位置Ｄを特定するために使用されるデータとしては、減衰部分のうち、その下方部分に位置する有効部分Ｅ（二点鎖線の四角で囲まれた領域）が使用される。

曲線ＢＡの有効部分Ｅを拡大した図７に示すように、検出器２７によって取得される光強度信号には、ノイズが発生する。このノイズは、検出器２７の電気的な特性に起因するノイズであり、測定した光強度値のブレとなって顕れる。こうしたノイズが大きいと、演算精度が低下して暗線位置Ｄを正確に特定することができない。そこで、暗線位置Ｄを算出する際には、こうしたノイズを打ち消すために、曲線ＢＯと曲線ＢＡとの差を求めて、図６に示すように、その差分データである曲線ＣＤ（点線で示す）を算出する。そして、この曲線ＣＤの減衰部分を解析することで、暗線位置Ｄが求められる。この曲線ＣＤは、暗線位置Ｄの解析をしやすくするために算出されるので、暗線データなどと呼ばれる。

しかし、このように暗線データを求めてもノイズを完全に除去することはできない。そこで、本実施形態では、暗線位置Ｄの算出精度を高めるために、検出器２７が受光する反射光量を上げて測定するようにしている。

図８のグラフに示す曲線ＢＡａ〜曲線ＢＡｃは、同一の減衰角θのもと、光源３５の発光量を３段階に変化させたときの反射光の光強度分布を示す。このグラフからわかるように、反射光量を上げるにつれて、減衰部分のカーブ（立ち上がりと立ち下がり）がきつくなる。このように、減衰部分のカーブをきつくすると、ノイズによる暗線位置Ｄの変動幅を小さくすることができる。

図９は、光量の低い曲線ＢＡａ及び光量の高い曲線ＢＡｃの減衰部分を拡大したグラフである。このグラフに示すように、ノイズが発生すると、各曲線ＢＡａ，ＢＡｃは、それぞれ点線で示すように横軸に沿ってブレる。この横軸方向のブレ量を暗線位置Ｄの変動幅ΔＸ、ノイズの大きさをΔＮとすると、ΔＮが同じでも、そのときの変動幅ΔＸは、曲線ＢＡａの変動幅ΔＸａよりも、曲線ＢＡｃの変動幅ΔＸｃの方が小さい。暗線位置Ｄの算出精度は、こうした変動幅ΔＸが小さい方がよいので、反射光量が大きい方がよい。

本実施形態では、図８の曲線ＢＡｃに示すように、反射光の一部が、検出器２７の蓄積電荷容量を越えて飽和するように、反射光量を上げて測定を行うようにしている。上述したとおり、暗線位置Ｄを算出するために使用する測定データは、曲線ＢＡのうち、減衰部分の一部（有効部分Ｅ）である。この有効部分Ｅが検出器２７のダイナミックレンジ（ＤＲ）に収まるレベルを上限として、その有効部分Ｅの周辺（減衰部分を谷としたときにその両脇に生じる山の部分）が検出器２７の飽和レベルＴＨを越えるように、光源３５の発光量を調節する。

これにより、減衰部分のカーブがきつくなり、光強度信号のノイズによって引き起こされる暗線位置Ｄの算出精度の低下が防止される。また、こうして有効部分Ｅの周辺を飽和させることで、ＣＣＤセンサ２７のダイナミックレンジの大半が有効部分Ｅに割り当てられるので、ダイナミックレンジを有効に使用することができる。また、従来技術のように、遮光マスクを用いていないので、構造が簡素になるとともに、スリットによる光の回折が発生する懸念もない。

このように、暗線位置Ｄの変動幅ΔＸを小さくするためには、検出器２７が飽和する程度に光量を上げて減衰部分のカーブをきつくすることが必要になるが、検出器２７を飽和させた場合には、ＣＣＤセンサ２７の電荷転送に起因する異常データが発生することが懸念される。

図１０に示すとおり、ＣＣＤセンサ２７は、受光素子（フォトダイード）によって構成される画素５２を、マトリックス状に配列した受光面２７ａを持つエリアセンサである。そして、各受光素子が受光した光量に応じて蓄積した電荷は、垂直転送路５３及び水平転送路５４を通じてアンプに取り出される。垂直転送路５３は、各列毎に配列されており、各受光素子５２の電荷を、電位の井戸に取り出して蓄積し、電荷が蓄積された井戸をバケツリレーのように、水平転送路５４に向けて順次転送する。水平転送路５４は、各垂直転送路５３から転送された井戸を、１行ずつ、バケツリレーのように、アンプに向けて水平方向に転送する。こうした手順が繰り返されて、１画面分の電荷が取り出される。

こうした電荷転送の際に、ある画素５２が飽和すると、その井戸の蓄積電荷量を超えた電荷が溢れ出し、溢れた電荷が、上流側から転送されてきた隣接する井戸にこぼれ落ちてしまい、その井戸の電荷が本来の蓄積電荷量を超えて上昇してしまうという現象が生じる。

図１１に示すように、こうした現象は、読み出されたデータ上では、転送方向の上流側の画素の光量が異常に上昇するという形で顕れて、それが異常データとなる。実線で示す曲線Ｂは、点線で示す略山形状のビームプロファイルを持つ光ビームの一部が飽和したときの光強度分布を示す。ビームプロファイルのピーク部分であるエリアＡ１が飽和した光量部分であり、電荷転送時に、エリアＡ１の電荷が転送方向の上流側にこぼれると、その部分の光量が、元のビームプロファイル（点線）の光量を超えて、異常データとなるエリアＡ２が発生する。こうした異常データが、減衰部分に発生すると、暗線位置Ｄの算出精度が著しく低下してしまう。

そこで、本実施形態では、図１２に示すように、ＣＣＤセンサ２７の水平転送路５４の転送方向Ｈを、屈折率ｎの上昇によって暗線位置Ｄが移動する移動方向Ｍに一致させるように配置している。上述したとおり、リガンドとアナライトとの結合反応が生じて屈折率ｎが上昇すると、減衰角θが大きくなり（θ０→θ１）、暗線位置Ｄが移動（Ｄ0→Ｄ１）する。

図１３に示すように、減衰が生じたときの光強度分布を示す曲線ＢＡは、減衰部分の形状が非対称になる。減衰部分の周辺の光量は、前記移動方向Ｍの下流側よりも上流側の方が光量が大きいので、下流側の飽和エリアＡｄよりもその上流側の飽和エリアＡｕの方が大きくなる。

飽和光量は、水平転送路５４の転送方向Ｈの上流側にこぼれるので、移動方向Ｍと転送方向Ｈとが一致するようにＣＣＤセンサ２７を配置すれば、より飽和光量が少ない飽和エリアＡｄが減衰部分の下流側に位置することになり、減衰部分に飽和光量がこぼれ落ちる確率が減少するとともに、仮にこぼれ落ちた場合でも、その量が少量で済むので、異常データの発生が少量に抑えられる。

以下、上記構成による作用について説明する。試料の反応を測定する際には、コントローラ３９は、光源駆動部４３を通じて光源３５の光量を上げて、図８の曲線ＢＡｃのように、ＣＣＤセンサ２７へ入射する反射光の一部が飽和するように調節する。こうして光量調節を行った後、アナライト溶液を流路１６へ注入して、アナライトとリガンドとを接触させ、それらの結合反応を測定する。アナライトとリガンドとが結合すると、屈折率が上昇して、暗線位置Ｄが移動する。データ解析部４２は、ＣＣＤセンサ２７が取得した測定データに基づいて、減衰部分を解析して、暗線位置Ｄの変化を調べる。

光量を上げて測定しているので、減衰部分のカーブがきつい測定データが得られる。暗線位置Ｄの変動幅ΔＸが抑えられているので、暗線位置Ｄの算出精度が高いレベルで確保される。また、ＣＣＤセンサ２７の水平転送路５４の上流側が、屈折率ｎが上昇したときの暗線位置Ｄの移動方向Ｍの上流側に一致しているので、異常データも抑制される。

上記実施形態では、前記異常データを抑制するために、ＣＣＤセンサを配置する向きを工夫した例で示したが、図１４に示すＣＣＤセンサ７１のように、飽和した電荷を廃却するためのオーバーフロードレイン７２を備えたＣＣＤセンサを使用して、前記異常データを抑制してもよい。オーバーフロードレイン７２は、水平転送路５４に接続されており、各垂直転送路５３から電荷が蓄積された電位の井戸が転送された場合に、その井戸の蓄積電荷量を超える飽和電荷（図上二点鎖線で示す）をＣＣＤセンサ７１の基板などに流して廃却する。水平転送路５４は、前記蓄積電荷量の範囲内の電荷を信号電荷としてアンプへ送り出す。このようにオーバーフロードレイン７２を設けると、飽和電荷が廃却されるので、水平転送中の電荷のこぼれが生じにくくなる。そのため、前記減衰部分のカーブをよりきつくするためにＣＣＤセンサ７１へ入射させる反射光の光量をさらに上げても、異常データが生じにくくなるので、暗線位置Ｄの算出精度をより向上させることができる。

上記実施形態では、前記異常データを抑制する方法として、いずれも（１．ＣＣＤセンサを配置する向きを特定方向とする。２．オーバーフロードレイン付きのＣＣＤセンサを使用する。）、水平転送中の電荷のこぼれが生じることを前提として、それが異常データとなって顕現しないようにする方法を説明した。こうした方法の他に、ＣＣＤセンサの特性を利用して、ＣＣＤセンサの受光量を、水平転送中の電荷のこぼれが生じないレベルに調節することにより、前記異常データを抑制してもよい。

ＣＣＤセンサは、受光量が前記ダイナミックレンジの上限である飽和レベルＴＨを超えても、それが所定の受光レベル以下ならば、水平転送路を通じて電荷を転送する際の電荷のこぼれ現象が生じないという特性を備えている。ここで、前記ダイナミックレンジの上限である飽和レベル以上であり、かつ、前記電荷のこぼれ現象が生じない範囲を許容受光レンジと呼ぶ。そこで、有効部分Ｅの周辺の反射光の最大強度点が前記許容受光レンジの上限値になるように、光源３５の発光量を適切な発光量に調節すれば、転送中の電荷のこぼれを生じさせることなく、前記減衰部分のカーブを最大限きつくすることが可能になる。

この許容受光レンジの上限値は、検出器２７の種類によって異なる。例えば、１６ｂｉｔのダイナミックレンジ（２¹⁶＝６５５３６ｄｉｇｉｔ）を持つあるＣＣＤセンサでは、反射光強度が６５５３６ｄｉｇｉｔを超える飽和レベル以上であっても、１０００００ｄｉｇｉｔまでなら電荷のこぼれが発生しない。このようなＣＣＤセンサでは、１０００００ｄｉｇｉｔが許容受光レンジの上限値となる。

したがって、前記有効部分Ｅの周辺の反射光強度がこの１０００００ｄｉｇｉｔになるように、光源駆動部４３によって光源３５の発光量を調節すれば、転送中の電荷のこぼれが生じにくくなり、これにより、異常データを抑制することができる。

また、同じＣＣＤセンサであっても、センサユニット１２の界面３３内における光の入射位置（センシングポイント）や、センサユニット１２の個体差によって、界面３３における反射率が異なるため、光源３５からの入射光の光量を特定の値に調節しただけでは、反射光強度は一律には決まらない。そこで、反射光強度を許容受光レンジの上限値に合わせるためには、光源３５の発光量を次のような手順で調節することが好ましい。

図１５のフローチャートに示すように、光源３５の発光量調節は、リガンドとアナライトとの結合反応を測定する本測定の前に行われる。まず、リンカー膜２３にリガンドが固定されていないリガンドが未固定のセンサユニット１２をＳＰＲ測定装置にセットして、そのセンサユニット１２の界面３３に光源３５から光を入射させて、その反射光を検出器２７で受光して、反射光の光強度分布を得る。

次に、図１６に示すように、取得した反射光の光強度分布ＢＡ１の最大強度点Ｍが飽和レベルＴＨに達するように、光源３５の発光量を調節する。そして、この最大強度点Ｍが、飽和レベルＴＨからさらに上昇して、許容受光レンジの上限値Ｐｍａｘに達するように、光源３５の発光量を上げる。これにより、光強度分布ＢＡ１を光強度分布ＢＡ２に変化する。飽和レベルＴＨを超える領域（二点鎖線で示す）は測定不能であるので、最大強度点Ｍが飽和レベルＴＨに達したときの光源３５の発光量を、（許容受光レンジの上限値Ｐｍａｘ／飽和レベルＴＨ）倍することにより光強度分布ＢＡ２が得られる。例えば、飽和レベルＴＨが６５５３６ｄｉｇｉｔ、許容受光レンジの上限値ＰｍａｘレベルＰが１０００００ｄｉｇｉｔである場合には、１０００００ｄｉｇｉｔ／６５５３６ｄｉｇｉｔ倍する。

こうして光源３５の発光量を調節した後、リガンド固定処理を行って、測定処理を実行する。光源３５の発光量が、転送中の電荷のこぼれが発生しない適切な発光量に調節されているので、異常データが生じることがなく、精度の高い測定が可能となる。こうした発光量調節は、センサユニット１２を交換する毎に行われることが好ましい。

上述した異常データを抑制する３つの方法は、それぞれ１つずつ適用してもよいし、２つ以上の方法を組み合わせてもよい。

また、上記実施形態では、ＣＣＤセンサの光強度分布のうち、有効部分の周辺の光強度が飽和するように、光源の発光量を調節しているが、必ずしも飽和させなくてもよい。すなわち、異常データは、光強度を飽和させた場合に発生する確率が高いが、飽和させなくても生じる場合がある。このような場合でも、ＣＣＤセンサの水平転送路の向きを上述したとおり工夫したり、オーバーフロードレイン付きのＣＣＤセンサを使用することで、異常データを抑制するという効果を得ることができる。

また、センサユニットとして、金属膜、流路、プリズムを一体化した例で説明したが、これらのうち、プリズムや流路部材をセンサユニットの構成要素から除いて、装置側に設けてもよい。

また、上記実施形態では、センサ面上にＳＰＲを発生させて、そのときの反射光の減衰を検出するＳＰＲセンサを例に説明したが、本発明は、ＳＰＲセンサに限らず、他の全反射減衰を利用した測定にも適用することができる。全反射減衰を利用するセンサとしては、ＳＰＲセンサの他に、例えば、漏洩モードセンサが知られている。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、ＳＰＲの共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応が測定される。

ＳＰＲ測定方法の概略説明図である。 センサユニットの構成図である。 ＳＰＲ測定装置の概略図である。 屈折率と減衰角の関係を示すグラフである。 減衰角変化と暗線位置の移動の関係を示す説明図である。 光強度分布を示すグラフである。 光強度信号のノイズの説明図である。 反射光の光量レベルと減衰部分のカーブの関係を示すグラフである。 ノイズと変動幅の関係を示すグラフである。 ＣＣＤセンサの電荷転送方法の説明図である。 電荷転送に起因して生じる異常データの説明図である。 ＣＣＤセンサの配置方向の説明図である。 減衰部分の非対称性を説明するグラフである。 オーバーフロードレイン付きＣＣＤセンサの説明図である。 光量調節を行って測定する手順を示すフローチャートである。 光量調節方法を説明するグラフである。

符号の説明

１２ センサユニット
１３ 金属膜
１３ａ センサ面
１４ プリズム
２６ 照明部
２７ ＣＣＤセンサ
２８ 分注ヘッド
３９ コントローラ
４２ データ解析部
４３ 光源駆動部

Claims (4)

1. 表面がリガンドを固定するセンサ面となる薄膜と、この薄膜が形成された透明な誘電体とからなるセンサを用い、前記センサ面にアナライトを送液して前記リガンドと接触させるとともに、前記薄膜の裏面と前記誘電体との界面に向けて光源から全反射条件を満たすように光を入射させ、前記界面における反射光の光強度分布をＣＣＤセンサで取得して、前記光強度分布のうち全反射減衰によって前記反射光の減衰が生じる暗線位置の変化を検出することにより、前記アナライトと前記リガンドとの結合反応を測定する全反射減衰を利用した測定方法において、
   前記ＣＣＤセンサとして、マトリックスに配列された複数の受光素子と、これら各受光素子から電荷を取り出すための垂直及び水平の各転送路とを持つエリアセンサを使用するとともに、前記アナライトとリガンドとが結合するときに前記ＣＣＤセンサの受光面上で前記暗線位置が移動する移動方向と、前記ＣＣＤセンサの水平転送路の転送方向とが一致するように、前記ＣＣＤセンサを配置して測定することを特徴とする全反射減衰を利用した測定方法。
2. 前記水平転送路に接続され、飽和した電荷を廃却するオーバーフロードレインを持つＣＣＤセンサを使用することを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用した測定方法。
3. 表面がリガンドを固定するセンサ面となる薄膜と、この薄膜が形成された透明な誘電体とからなるセンサを用い、前記センサ面にアナライトを送液して前記リガンドと接触させる送液手段と、前記薄膜の裏面と前記誘電体との界面に向けて全反射条件を満たすように光を入射させる光源と、前記界面における反射光を受光してその光強度分布を取得するＣＣＤセンサと、前記光強度分布を解析する解析手段とを備え、前記光強度分布のうち全反射減衰によって前記反射光の減衰が生じる暗線位置の変化を検出して、前記アナライトと前記リガンドとの結合反応を測定する全反射減衰を利用した測定装置において、
   前記ＣＣＤセンサとして、マトリックスに配列された複数の受光素子と、これら各受光素子から電荷を取り出すための垂直及び水平の各転送路とを持つエリアセンサを使用するとともに、前記アナライトとリガンドとが結合するときに前記ＣＣＤセンサの受光面上で前記暗線位置が移動する移動方向と、前記ＣＣＤセンサの水平転送路の転送方向とが一致するように、前記ＣＣＤセンサを配置したことを特徴とする全反射減衰を利用した測定装置。
4. 前記水平転送路に接続され、飽和した電荷を廃却するオーバーフロードレインを持つＣＣＤセンサを使用することを特徴とする請求項３記載の全反射減衰を利用した測定装置。

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