JP2007089578A - ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類およびその作製法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】鳥類の胚に形成される初期の心臓内又は血管内へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションにより感染させ、その胚を孵化させることを特徴とする方法によって得られるトランスジェニック鳥類による、ネコ由来タンパク質の生産。
【選択図】なし
Description
本発明は、また、トランスジェニック鳥類、その子孫、その卵及び/又はその精子であり、上記のトランスジェニック鳥類の作製法のいずれかを含むことを特徴とする。
本発明は、また、トランスジェニック鳥類の血液、その体細胞及び/又はその卵より、抽出、精製、活性化することのいずれか、またはその組み合わせを含む外来性遺伝子由来のタンパク質の生産方法であり上記のトランスジェニック鳥類の作製法のいずれかを含むことを特徴とする。
好ましくは、ネコ由来タンパク質がネコ由来サイトカインタンパク質及び/又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質である。より好ましくは、ネコ由来タンパク質が配列表の配列番号1で示されるネコ由来エリスロポエチン及び/又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質である。更に好ましくは、ネコ由来タンパク質が配列表の配列番号1で示されるネコ由来エリスロポエチン及び/又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質である。
本発明は、また、ネコ由来タンパク質の修飾に用いるポリエチレングリコールの重量平均分子量が5〜40kDaであることを特徴とする。より好ましくは、ポリエチレングリコールの重量平均分子量が20kDaである。
本発明は、また、ポリエチレングリコールの付加数が1又は2以上であって、ポリエチレングリコール修飾された1分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が100kDaから900kDaであるポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質に関する。好ましくは、ポリエチレングリコールの付加数が1であって、ポリエチレングリコール修飾された1分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が100kDaから500kDaである。
本発明は、また、上記ポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質、又は、ポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質組成物を有効成分として含有するネコ用医薬組成物に関する。上記医薬組成物は、ネコエリスロポエチン活性及び薬効持続性を有し、ネコの腎性貧血を治療するための用途に好適である。
本発明は、また、ネコ由来タンパク質に、ポリエチレングリコールのスクシンイミジルエステル誘導体を付加させることからなる、ポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質組成物の製造方法に関する。
タンパク質とは2個以上のアミノ酸がペプチド結合したもので、通常ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものも含む。また、アミノ酸は修飾を受けていても良い。タンパク質の分泌のためにはタンパク質に分泌シグナル配列が備わっていることが好ましい。また分泌シグナルは自己の配列に限定されるものではない。
外来性遺伝子は上記のネコ由来タンパク質のコード配列以外の非翻訳領域を含んでもよい。
配列番号1において、26番目のアミノ酸まではシグナルペプチドと呼ばれ分泌の際、切断を受け取り除かれる。従って、ネコ由来エリスロポエチンの生物学的活性には影響の少ない領域である。本発明で得られるネコ由来タンパク質は、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列の27番目以降のアミノ酸配列中1〜10個のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有してもよい。
組織特異的なプロモーター遺伝子とは、鳥類の特定の組織・細胞で特別に活性の強いプロモーター遺伝子のことである。組織特異的なプロモーター遺伝子を用いることにより、目的タンパク質の発現が鳥類の発生や生存に悪影響を与える可能性を減少または排除できる利点がある。
本発明で用いられる複製能欠失型レトロウイルスベクターは複製に必要とされるgag、polおよびenv遺伝子を欠失している。gag、pol遺伝子を保有するパッケージング細胞に目的タンパク質を発現可能な複製能欠失型レトロウイルスプラスミドとVSV−G発現プラスミドを共導入し、培養上清をウイルス液とする。あるいは、望ましくは、上記ウイルス液を感染させたパッケージング細胞にVSV−G発現プラスミドを導入し、培養上清をウイルス液とする。ウイルス液は、必要に応じて濃縮することが好ましい。
複製能欠失型レトロウイルスベクターの調製は、このような方法に限定されるものではない。
上記ウイルス液の力価は、NIH3T3細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション CRL−1658)にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義する。具体的には、6ウェル培養プレートの各ウェル(底面積約9.4cm2)に存在する5×104のNIH3T3細胞に、102から106倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を1ml加え、マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を発現している細胞の割合を、G418(ネオマイシン)に対する耐性から調べることによりウイルス液の力価を測定する。
本発明のトランスジェニック鳥類は、鳥類の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることを含む方法によって好適に得られる。
胚とは多細胞動物の個体発生初期のものであり、卵膜または卵殻に包まれているか、母体内にあって、独立して食物をとる以前のものである。孵化とは、卵膜または卵殻から出ること及び独立して食物をとるようになることである。
生殖細胞に外来性遺伝子を保有するG0トランスジェニックキメラ鳥類を野生型鳥類、G0トランスジェニックキメラ鳥類又はその子孫と交配させ、孵化したヒナを選別することによりG1トランスジェニック鳥類を得ることができる。G0トランスジェニックキメラ鳥類は、全ての細胞に外来性遺伝子が導入される確立は低く、ほとんどの場合外来性遺伝子が導入された細胞と野生型の細胞との異なる遺伝子型の細胞が共存しているキメラ状態である。一方で、G1トランスジェニック鳥類は、全ての体細胞に均一に導入遺伝子を保有している。体細胞や生殖細胞への遺伝子導入の確認は血液、体細胞、精子、卵由来のDNAやRNAをPCR法等によって調べることによって確認できる。また、目的タンパク質の発現からも判断できる。目的タンパク質の発現はELISA法や電気泳動法、目的タンパク質の活性測定等によって調べる事ができる。
ネコ由来タンパク質は、PEGを付加する前に精製しておくことが好ましい。ネコ由来タンパク質の精製は、トランスジェニック鳥類の卵とくに卵白成分を純水もしくは平衡塩類溶液で希釈した溶液から、カラム法やろ過法で行うことができる。希釈は卵白の粘性を低減し、カラム法を円滑に行う目的で行われ、粘性低減のためには高倍に希釈することが望ましい反面、容積が増えると回収が困難になることから、2倍から10倍が好ましく、5倍から6倍に希釈するのがより好ましい。
またネコ由来エリスロポエチンには少なくとも3個所のPEG結合可能部位があり、ひとつのタンパク分子に結合するPEGは1(モノ)、2(ジ)、3(トリ)分子が可能であるが、複数箇所にPEGが結合することでEPOのレセプター結合能が阻害されインビボ活性を低下させることから、モノ体が好ましい。
本明細書において、上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる見かけの分子量の測定は、低圧クロマト装置 AKTA explorer 100(アマシャム社製)及びゲルろ過カラムSuperdex 200 10/300(アマシャム社製)を用いて行う。
本発明のPEG修飾ネコ由来タンパク質組成物は、PEGの付加数が1又は2以上であって、PEG修飾された1分子の見かけの分子量が100kDaから900kDaであるPEG修飾ネコ由来タンパク質、PEGの付加数が1であって、PEG修飾された1分子の見かけの分子量が100kDaから500kDaであるPEG修飾ネコ由来タンパク質、及び/または、上述の生産方法で得られたPEG未修飾ネコ由来タンパク質の混合物からなり、少なくとも1種のPEG修飾ネコ由来タンパク質を含む。
本発明のネコ用医薬組成物は、ネコエリスロポエチン活性及び薬効持続性を有するので、ネコの腎性貧血を治療するために好適に用いることができる。
本発明のネコ用医薬組成物は、非経口的に投与することができる。非経口投与として、静脈内注射、点滴静脈内注射、皮下注射、経粘膜投与(例えば経肺、経鼻など)、経皮投与などの投与経路が挙げられる。
本発明のネコ用医薬組成物の投与量としては特に制限されず、個々の患蓄のエリスロポエチンに対する反応性の違い等から一義的には決められないが、例えばPEG修飾ネコ由来タンパク質に換算して、週2回静脈注射による投与でネコ1頭あたり0.5〜50μg程度を投与すればよい。
PEGのスクシンイミジルエステル誘導体としては特に限定されず、例えば、スクシンイミジルプロピオン酸エステル、スクシンイミジルアルファメチルブタン酸エステル等が挙げられる。
PEGのスクシンイミジルエステル誘導体の添加量は、ネコ由来タンパク質に対して、(ネコ由来タンパク質):(PEGのスクシンイミジルエステル誘導体)で1:1〜1:10のモル比が好ましい。
反応温度及び反応時間は特に限定されないが、4〜37℃で0.5〜2時間が好ましい。
ネコ由来エリスロポエチン遺伝子発現用プラスミドpMSCVneobactfEPOの構築
pMSCVneobact(配列番号2)は公知文献(Gene Ther.1994 MAR;1(2):136−8.)とインターネットの情報(http://www.ncbi.nlm.NIH.gov/他)を元に全合成し、pUC19(ジェンバンク アクセッション番号X02514)のEheI(235)〜PvuII(628)間に挿入した(東洋紡績社製)。これを、HindIII(タカラバイオ社製)で切断し、Alkaline Phosphatase BAP(タカラバイオ社製)処理後、MinElute Reaction Cleanup Kit(QIAGEN社製)により精製、回収した。これを、1%アガロースゲル電気泳動し、目的断片をMinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)により精製、回収した(実施例1ベクター断片)。
なお、図1中のマーカー遺伝子beta−lactamase、ウイルスパッケージングシグナル配列phi+、マーカー遺伝子Neomycin resistance gene、組織非特異的なプロモーター遺伝子beta−actin promoter、並びに、長い反復配列5LTR及び3LTRはすべて、pMSCVneobactに由来するものである。
pMSCVneobactfEPOとpVSV−Gを用いたレトロウイルスベクターの調製
以後特に記述の無い限り、培地は10%の牛胎児血清(Fetal Bovine Serum,FBS)と50units/mlのペニシリン、ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco‘s Modified Eagle Medium,DMEM)を用いた(ギブコ社製)。培養は37℃、CO25%でおこなった。レトロウイルスベクターに用いるプラスミドDNAはEndo Free Plasmid Maxi Kit(QIAGEN社製)を用いた。
ウイルス力価の測定
ウイルス液の力価は、NIH3T3細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション CRL−1658)にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義した。6ウェル培養プレートの各ウェル(底面積約9.4cm2)に存在する5×104のNIH3T3細胞に、102から106倍の希釈率で希釈した実施例2のウイルス溶液を1ml加え、マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を発現している細胞の割合を、G418に対する耐性から調べることによりウイルス液の力価を測定した。106倍希釈で4コロニー現れた場合、ウイルス力価は、4×106cfu/mlとなる。
ネコ由来エリスロポエチン安定パッケージング細胞の選択
ウイルス感染の前日に24ウェル培養プレートにGP293細胞を1.5×104個/ウェルとなるよう播種し培養した。ウイルス感染の当日10μg/mlのポリブレンを含有する培地1mlと交換した。これに、(実施例2)で作製したウイルス液を感染させた。以後、細胞を限界希釈法によりクローン化する。具体的には、次の日、細胞を800μg/mlのG418を含む培地に懸濁し、同じ培地に10個/mlとなるように希釈した。希釈した細胞を96ウェル培養プレートに100μlずつ播種し(ウェルに一個の細胞が入るようにする)、細胞増殖速度が早く、GP293と形態の近い細胞を選択し、ネコ由来エリスロポエチン安定パッケージング細胞クローンを得た。
ネコ由来エリスロポエチン安定パッケージング細胞とpVSV−Gを用いたレトロウイルスベクターの調製
直径100mmのコラーゲンコートされた培養ディッシュに実施例4で得られたネコ由来エリスロポエチン安定パッケージング細胞を5×106個(70%コンフルエント)となるように播種した。翌日90%コンフルエントとなるようにする。次の日、培地を取り除き、7.2mlの培地と10μlの25mMクロロキンを加えて、更に1時間培養した。56μlのLipofectamine.2000を1.4mlのOpti−MEMI培地に懸濁し、室温で5分間おいた。12μgのpVSV−Gを1.4mlのOpti−MEMI培地に懸濁する。Lipofectamine.2000溶液とプラスミドDNA溶液を混合し、室温で20分おいた。これを、培養ディッシュに加え、6時間培養した。培地を取り除き、9mlの培地と200μlの1M HEPES Buffer Solutionを加え、24時間培養した。培養上清を0.45μmのセルロースアセテートフィルターに通し、遠心管に集めた。超遠心機を用い、28000rpm(50000g)で1.5時間遠心分離した。上清を取り除き、沈殿に20μlのTNE緩衝液を加え、4℃で一晩放置後、よく懸濁して小型高速遠心機で12000rpmで1分遠心分離し、上清を0.45μmのデュラポアウルトラフリーフィルターに通しウイルス液とした。このようにして、108cfu/ml以上の力価を持つウイルス液が得られた。
WPRE配列を含むネコ由来エリスロポエチン遺伝子発現用プラスミドpMSCVneobactfEPOwpreの構築とレトロウイルスベクターの調製
pMSCVneobactfEPOを、ClaI(タカラバイオ社製)で切断し、BAP処理後、精製、回収した。精製、回収には(実施例1)記載の製品を用いた。これを、1%アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した(実施例6ベクター断片)。2つの化学合成オリゴヌクレオチド5’−ccatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtga−3’(配列番号6)及び5’−ccatcgatcaggcggggaggcg−3’(配列番号7)(下線部はClaI制限酵素部位)をプライマーとし、WPRE配列を含むpWHV8(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション45097)からPCRにより増幅した断片を精製、回収しClaIで切断した。これを、1%アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した(実施例6インサート断片)。
ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化
マイクロインジェクションと人工孵化は無菌条件下でおこなう。ニワトリ受精卵(城山種鶏場)の外側を消毒液(昭和フランキ社製)及びエタノールで除菌する。孵卵機P−008(B)型(昭和フランキ社製)を38℃、湿度50〜60%の環境になるようセットし、電源を入れた時刻を孵卵開始時刻(0時間)とし、以後15分毎に90°転卵しながら孵卵を行った。
ネコ由来エリスロポエチン発現トランスジェニックニワトリの血中、卵中の発現の確認
(実施例7)により誕生した雛を飼育して成長させた。飼料として、幼雛SXセーフティー及びネオセーフティー17(豊橋飼料社製)を用いた。トランスジェニックニワトリからの採血は翼下静脈よりおこなった。採血した血液はエッペンドルフチューブに入れ、室温で30分以上放置した後、小型高速遠心機で4℃、3000rpmで5分間遠心分離し、血清と血餅を完全に分離し、上清を血清とした。卵からの抽出の際には、卵白及び卵黄を分離した。卵黄からの抽出の際は、卵黄中央にシリンジをさし、卵白が入らないように抜き取った。卵白は、超音波や物理的手法により全体を一様となるように調製した。調製したサンプルはアッセイ時まで−80℃で凍結保存した。凍結融解を避けるため、溶解は37℃で迅速に行うことが好ましい。
卵白からのネコ由来エリスロポエチンの精製
実施例8により卵白中にネコ由来エリスロポエチン活性が確認された個体の卵を回収し、卵白よりネコ由来エリスロポエチンを回収・精製した。
カラムにアプライするサンプルは全て、使用直前に孔径0.45μmのMillex−HV(ミリポア社製)にてシリンジろ過を行った。ろ過困難な場合には、孔径2μmのプラディスク25(Whatman社製)により予めろ過した後、Millexによるろ過を行った。
精製過程でのネコ由来エリスロポエチン含有量の測定は、Bicore3000(BIACORE社製)にて行った。Sensor Chip CM5 reserch grade(BIACORE社製)に抗ヒトエリスロポエチンモノクローナル抗体(R&Dシステム社製)をアミンカップリングキット(BIACORE社製)でNHS固定化して測定用チップとし、エポジンを標準物質として、装置の定量用プログラムを用いて濃度を測定した。
ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。濃縮後のサンプルを、50mM ホウ酸バッファー、pH9.0もしくは他の適当なバッファーで平衡化したSuperdex 200 10/300 GLカラム(アマシャム社製)にアプライして同バッファーで溶出した。Biacoreにてネコ由来エリスロポエチンの存在が確認された画分を回収し、分画分子量5,000のビバスピン6にて総量1〜2ml程度にまで濃縮した。このステップでのネコ由来エリスロポエチン回収率は最大93%であった。
タンパク質濃度についてはDCプロテインアッセイ(Bio−Rad社製)にてBSAを標準として測定した。発現量が最大の個体(個体番号10−1)の卵白からの精製で、卵白1個分あたり約3mgのネコ由来エリスロポエチンを得た。
精製ネコエリスロポエチンのBaf/EPOR細胞増殖アッセイ
実施例9により卵白から精製したネコ由来エリスロポエチンについて、実施例8に記載の方法により、Baf/EPOR細胞増殖アッセイを行った。その結果比活性は160,000〜290,000IU/mgであった。
mPEG修飾ネコ由来エリスロポエチンの作成
卵白より精製したネコ由来エリスロポエチン溶液(pH8.0〜9.0のリン酸あるいはホウ酸バッファーに溶解)に、PEGの分子量が約20kDaのmethoxyPEG−SPA(スクシンイミジルプロピオン酸エステル)あるいはmethocyPEG−SMB(スクシンイミジルアルファメチルブタン酸エステル)(NEKTAR社製)を加え、室温で0.5〜1時間転倒混和した。100mMグリシン溶液を1/10容加え、室温でさらに0.5時間転倒混和し、活性エステルを失活させた。反応後の溶液は、Prepacked Disposable PD−10 Columns(アマシャム社製)もしくは透析によって50mM 酢酸バッファー、pH4.5にバッファー交換し、同バッファーで平衡化した1mlのHiTrap SP HPカラム(アマシャム社製)にアプライした。未反応のPEGはカラムを素通りし、mPEG−fEPO及び未反応のネコ由来エリスロポエチンがカラムに吸着したので、これを500mM NaCl、25mM 酢酸バッファー、pH4.5で溶出し、回収した。回収した画分を、150mM NaCl、20mM リン酸バッファー、pH7.5で平衡化したSuperdex 200 10/300 GLにアプライし、PEGの付加数が2以上、1、0(未反応ネコ由来エリスロポエチン)に分けて回収した。回収後の画分は分画分子量5,000のビバスピン6により適宜濃縮した。活性化PEGの種類、反応液の組成、反応時間とmPEG−fEPO生成比について表2にまとめた。また、各mPEG−fEPOについて、理論上およびSuperdex 200 10/300 GL上での分離に基づいた分子量について表3にまとめた。PEG化およびゲルろ過精製後のサンプルのSDS−PAGEを行った。サンプルはe・パジェル12.5%を用いて、変性条件で泳動し、Bio−Safe Coomassie Stain(Bio−Rad社製)で検出した。SDS−PAGEの結果を図6に示す。
モノPEG化ネコ由来エリスロポエチンのBaf/EPOR細胞増殖アッセイ
実施例11によりPEG化、精製したモノ−mPEG−fEPOについて、実施例10に記載の方法により、Baf/EPOR細胞増殖アッセイを行った。mPEG−fEPOの量はDCプロテインアッセイ(Bio−Rad社製)にてBSAを標準として、タンパク質部の重量として測定した。その結果比活性はモノ−mPEG−SPA−fEPOで3,200〜15,000IU/mg、モノ−mPEG−SMB−fEPOで4,300〜8,300IU/mgであった。
モノPEG化ネコ由来エリスロポエチンの薬効持続性の測定
ラットはCrlj:CD系の正常雄(日本チャールス・リバー社製)を用い、7週齢時に実験に用いた。モノ−PEG化ネコ由来エリスロポエチンには、(実施例11)によりPEG化、精製したモノ−mPEG−SPA−fEPO(比活性8,300IU/mg)、非PEG化ネコ由来エリスロポエチンには、実施例9の個体番号10−1より精製した非PEG化ネコ由来エリスロポエチン(比活性160,000IU/mg)、CHO産生ヒトエリスロポエチンにはエポジン(比活性180,000IU/mg:インタビューフォーム記載値)をそれぞれ用いた。これらを0.05%ヒト血清アルブミン、0.05% Tween20を含む生理食塩水に希釈して2ml/kgで単回投与した。ラットは1群5匹で12群に分け、それぞれ2群ずつ、モノ−mPEG−SPA−fEPOを25、5、1μg/ml(投与量はそれぞれ50、10、2μg/kg)、非PEG化ネコ由来エリスロポエチンまたはエポジンをそれぞれ25μg/ml(投与量は50μg/kg)となるよう希釈したものを投与した。対照群には溶媒のみを投与した。被験物質は事前に調整し、−20℃で保存した。投与直前に室温にて解凍し、体温程度になったものを27Gの注射針を用いて尾静脈内に投与した。採血は、動物の負担を軽減するため、同量の同一被験物質を投与した2群(それぞれAまたはB群とする)に対し、以下のように交互に行った。A群:被験物質投与後0、4、10、21日、B群:被験物質投与後2、7、15日。無麻酔下で総頚静脈より23G注射針により0.5ml採血した。各試料について、網状赤血球数を自動網赤血球測定装置R−3000(Sysmex社製)にて測定した。
各測定時点における網状赤血球数について、対照群とモノ−mPEG−SPA−fEPO投与群、非PEG化ネコ由来エリスロポエチン投与群及びエポジン投与群の平均値の差の優位性をSASシステム(SAS Institute社製)を用いて、Dunnett型多重比較法により検定した。有意水準は両側5%とした。
Claims (38)
- ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類。
- ネコ由来サイトカインタンパク質及び/又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類。
- 配列表の配列番号1で示されるネコ由来エリスロポエチン及び/又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質のコード配列の少なくとも一部を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類。
- 配列表の配列番号1で示されるネコ由来エリスロポエチン及び/又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類。
- 複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いて作製した、請求項1〜4のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類。
- 複製能欠失型レトロウイルスベクターがモロニーマウス白血病ウイルス及び/又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含む請求項5に記載のトランスジェニック鳥類。
- 複製能欠失型レトロウイルスベクターがマウス幹細胞ウイルス由来の配列を含む請求項5に記載のトランスジェニック鳥類。
- 複製能欠失型レトロウイルスベクターがVSV−Gエンベロープを含む請求項5〜7のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類。
- 組織非特異的なプロモーター遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いて作製した請求項1〜4のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類。
- 組織非特異的なプロモーター遺伝子がニワトリβアクチンプロモーター遺伝子の一部又は全部を含む請求項9に記載のトランスジェニック鳥類。
- 組織特異的なプロモーター遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いて作製した請求項1〜4のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類。
- 組織特異的なプロモーター遺伝子が卵管特異的なプロモーター遺伝子の一部又は全部を含む請求項11に記載のトランスジェニック鳥類。
- 卵管特異的なプロモーター遺伝子が、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、G2グロブリン、G3グロブリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、シスタチン又はアビジンのプロモーター遺伝子の少なくとも一部若しくは全部又はその組み合わせを含む請求項12に記載のトランスジェニック鳥類。
- 転写エンハンサー及び/又は調節エレメントを含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いて作製した請求項1〜4のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類。
- 調節エレメントがwoodchuck post−transcriptional regulatory element配列の一部又は全部を含む請求項14に記載のトランスジェニック鳥類。
- 鳥類の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることを含む方法によって得られる請求項1〜4のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類。
- 鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始後24時間以後の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることを含む方法によって得られる請求項16に記載のトランスジェニック鳥類。
- 胚が孵卵開始後32時間以後72時間以前に形成されたものである請求項17に記載のトランスジェニック鳥類。
- 胚が孵卵開始後48時間以後64時間以前に形成されたものである請求項18に記載のトランスジェニック鳥類。
- 胚に形成される心臓内又は血管内へのマイクロインジェクションにより複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させることを含む方法によって得られる請求項16〜19のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類。
- 鳥類が家禽である請求項1〜4のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類。
- 鳥類がニワトリである請求項21に記載のトランスジェニック鳥類。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類、その子孫、その卵及びその精子。
- 外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを鳥類の胚へ感染させ、その胚を孵化させることをからなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類の作製方法。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載のトランスジェニック鳥類の血液、その体細胞及び/又はその卵より、抽出、精製、活性化することのいずれか、またはその組み合わせを含むネコ由来タンパク質の生産方法。
- 請求項25に記載の方法により生産されたネコ由来タンパク質をポリエチレングリコールで化学修飾して得られるポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質。
- ネコ由来タンパク質がネコ由来サイトカインタンパク質及び/又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質である請求項26に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質。
- ネコ由来タンパク質が配列表の配列番号1で示されるネコ由来エリスロポエチン及び/又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質である請求項26に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質。
- ネコ由来タンパク質が配列表の配列番号1で示されるネコ由来エリスロポエチン及び/又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質である請求項26に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質。
- ネコ由来タンパク質の修飾に用いるポリエチレングリコールの重量平均分子量が5〜40kDaである請求項26から29いずれか1項に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質。
- ポリエチレングリコールの重量平均分子量が20kDaである請求項30に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質。
- ポリエチレングリコールの付加数が1又は2以上であって、ポリエチレングリコール修飾された1分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が100kDaから900kDaである請求項26から31いずれか1項に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質。
- ポリエチレングリコールの付加数が1であって、ポリエチレングリコール修飾された1分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が100kDaから500kDaである請求項32に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質。
- 請求項32に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質、請求項33に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質及び/または請求項25に記載の方法により生産された未修飾ネコ由来タンパク質の混合物からなり、請求項32に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質又は請求項33に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質の少なくとも1種を含むポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質組成物。
- 請求項26から33いずれか1項に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質を有効成分として含有するネコ用医薬組成物。
- 請求項34に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質組成物を有効成分として含有するネコ用医薬組成物。
- ネコエリスロポエチン活性及び薬効持続性を有し、ネコの腎性貧血を治療するための、請求項35又は36に記載の医薬組成物。
- ネコ由来タンパク質に、ポリエチレングリコールのスクシンイミジルエステル誘導体を付加させることからなる、請求項34に記載のポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質組成物の製造方法。
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