JP2013046639A - ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類およびその作製法 - Google Patents

Abstract

【課題】ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類及びその作製法を提供する。
【解決手段】鳥類の胚に形成される初期の心臓内又は血管内へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションにより感染させ、その胚を孵化させることを特徴とする方法によって得られるトランスジェニック鳥類による、ネコ由来タンパク質の生産。
【選択図】なし

Description

本発明は、外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類の作製法に関し、トランスジェニック鳥類によるネコ由来タンパク質の発現に関する。更に詳しくは、トランスジェニック鳥類による、ネコ由来エリスロポエチンの発現に関する。

近年数多くの医薬用タンパク質が利用されるようになってきた。微生物や哺乳類動物細胞に目的タンパク質の遺伝子を導入する遺伝子組換え技術が開発・応用され、これらの遺伝子組換え体を培養することでタンパク質を工業生産できるようになったためである。医薬用タンパク質が本来持っている生理活性を示す為には、タンパク質が天然に存在するのと同様に、ホールディングする必要や糖鎖付加やジスルフィド結合等の転写後修飾を受ける必要がある。

微生物培養によりタンパク質を生産する方法は、微生物の増殖速度が早いことや、培地組成が単純であることから、低コストでタンパク質を生産することが可能である。しかし、微生物では目的タンパク質の転写後修飾が正しくおこなわれないことが多い。よって、天然型と同様の生理活性を有するタンパク質を十分量得ることが難しく、工業生産の実用化への道のりは遠いのが現状である。

そこで、これまでは哺乳類動物細胞に目的タンパク質の遺伝子を導入し、その細胞を培養することによって生産する方法が主流となっている。血液凝固因子や血栓溶解剤や抗体医薬といった医薬品タンパク質が、遺伝子組換え哺乳類動物細胞を用いて生産され、販売、使用されている。しかし、哺乳類動物細胞を用いた方法は、専用の培養タンクや培地が必要であり生産コストが高いという問題がある。

これらの問題を克服する為に、動物工場が注目されてきた。遺伝子導入（トランスジェニック）動物を用いて目的タンパク質を生産する技術である。ヤギやヒツジやウシ等を用いてトランスジェニック哺乳類を作製し、その乳汁中に目的タンパク質を生産させる方法が試みられてきた。目的タンパク質にもよるが、抗体が乳汁中に１０ｍｇ／ｍｌ発現したという報告もある（例えば、非特許文献１参照）。しかし、この方法にもＢＳＥの問題や利用可能な哺乳類の個体が大きく生産、飼育、管理が大変であること、性成熟の期間がヤギやヒツジで８ヶ月、ウシでは１５ヶ月と長いこと等の問題がある。

そこで、トランスジェニック鳥類を用いて卵中に目的タンパク質を発現させる方法が検討されている。この方法は、卵の生産性の高さや、ＢＳＥの問題が存在しないこと、性成熟の期間がニワトリで５ヶ月と短いこと、個体が小さいため大量の個体の飼育が可能であること、人工授精法が確立しており大規模のトランスジェニック群を急速に育成可能であること、一般に卵の中が自然に無菌であること等の利点があげられる。

トランスジェニック鳥類を作製する方法には、レトロウイルスベクターを用いる方法、胚性幹細胞を用いる方法、始原生殖細胞を用いる方法、精子に目的遺伝子を付着させ導入する方法等が研究中であり、この中でレトロウイルスベクターを用いる方法が最も一般的である。これまでに、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いた研究が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。目的タンパク質としてβラクタマーゼを用い、プロモーター遺伝子としてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター遺伝子を用いている。放卵直後のステージＸの胚盤葉にレトロウイルスベクターを導入し、トランスジェニック鳥類の作製に成功している。発現量は、ウエスタンブロットを用いた分析方法では０．３３ｍｇ／ｍｌ（卵白を４０ｍｌとする）であり、βラクタマーゼ活性からの換算では０．００３〜０．０３３ｍｇ／ｍｌであると報告されている。また、その際のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の出現頻度は２０％である。生殖細胞への導入効率を調べた結果、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類オスのうち５％程度が精子中に導入遺伝子を有していた。他の報告として、同様の実験で、全身に遺伝子が導入されたＧ２において、多いもので卵白中に１．２μｇ／ｍｌ程度の発現であったという報告もなされている（例えば、非特許文献２参照）。またその際のＧ０からＧ１の出現頻度は３／４２２（０．７１％）であった。

他に、ヒトインターフェロンやヒト由来エリスロポエチンを発現するトランスジェニック鳥類の報告がある（例えば、特許文献２及び３参照）。インターフェロンはウイルス感染に際して、ほとんどすべての動物細胞が生産、分泌する分子量約２万の糖タンパク質であり、ウイルス抑制因子とも言う。エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、主に腎臓で産生され、造血組織の前駆細胞に作用して赤血球への分化・増殖を促進する糖鎖に富んだポリペプチドである。現在、ＥＰＯは、遺伝子組換え技術により、動物細胞を宿主として生産される組換えヒトＥＰＯとして市販されており、腎障害に基づくＥＰＯ産生低下による腎性貧血を始め、各種の貧血症に対する治療薬として主として使用されている。ＡＬＶ複製能欠失型レトロウイルスベクターと、ＣＭＶプロモーター遺伝子又はオボムコイド、オボトランスフェリン融合プロモーター遺伝子を用いて、ヒトインターフェロンは血清中に最大２００ｎｇ／ｍｌ、ヒト由来エリスロポエチンは血清中、卵白中共に最大７０ｎｇ／ｍｌ発現している。

別の報告では、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターとＶＳＶ−Ｇエンベロープを用い、高いウイルス力価や感染性、発現性を得た報告がなされている（例えば、特許文献４参照）。更に、その報告ではレトロウイルスベクターを導入する時期を調節することによっても、高発現を実現しており、目的タンパク質として抗プリオン１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を用い、卵白、卵黄中に０．５〜１ｍｇ／ｍｌの発現を実現している。

ネコはペットとして昔から人間に愛着のある動物であるが、最近では「伴侶、仲間、相棒としての動物」として人間社会の一員としての地位が確立しつつある。一方、医学、薬学、獣医学、心理学などで従来から実験動物として使用されており、最近では医薬品の安全性試験、効果検定にも使用されるようになってきている。このようにネコの社会的重要性が高まっている状況の中では、ネコの疾病や伝染病に対する関心が高く、その有効な治療法が望まれている。近年ネコの疾病治療においても医薬用タンパク質が注目されており、主としてヒト用の医薬用タンパク質が転用されている。しかし、ヒト用の医薬用タンパク質はネコが本来持つ生体内タンパク質とアミノ酸配列が異なるため、生体内での効果が異なる可能性がある。また、アミノ酸配列の差異により、アレルギーを起こす可能性もあり、悪くすればアナフィラキシー様症状を引き起こす。よって、高頻度の投与には耐えないため、ネコが本来もつ医薬用タンパク質の開発が求められている。

現在までにネコ由来医薬用タンパク質として、サイトカインが多く研究されている。サイトカインとは細胞から放出され、免疫、炎症反応の制御作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖・分化の調節作用など細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子である。これまでに、ネコ由来サイトカインとして報告されているものにはエリスロポエチン（例えば、非特許文献３及び４参照）、インターロイキン１２（例えば、特許文献５参照）などが挙げられる。これらの生産に関してはこれまでのところ哺乳類動物細胞を用いてなされており、トランスジェニック鳥類を用いた生産は行われていないのが現状である。

特表２００１−５２０００９号公報 米国特許出願公開第２００４／００１９９２２号明細書 米国特許出願公開第２００４／００１９９２３号明細書 特開２００２−１７６８８０号公報 国際公開第９７／０４６５８３号パンフレット

Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ｓｅｐ；１７（９）：３６７−７４． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２ Ａｐｒ；２０（４）：３９６−９． Ｂｌｏｏｄ．１９９３ Ｓｅｐ １；８２（５）：１５０７−１６． Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１９８６ Ｊａｎ；１１（１）：１−１９．

これまでにネコ由来タンパク質をトランスジェニック鳥類を用いて発現させた例は報告されていない。高等生物のタンパク質は翻訳後、生理活性を有するよう特定の構造をとるようホールディングしたり、糖付加やジスルフィド結合などの種々の修飾を受ける。タンパク質の修飾は同一個体内でも組織によって異なる。その為、動物細胞内で外来遺伝子を高発現させるのは非常に難しい。例えば、医薬用タンパク質を哺乳類動物細胞の培養で生産する際には、その医薬用タンパク質の生産に適当な細胞株を種々の動物種や組織から選択する。これまでにトランスジェニック鳥類を用いて、ヒト由来タンパク質の生産がなされてきたが、ヒトとネコでは分類学上、目が異なりこれは大きな違いである。同一の活性を有するタンパク質でもヒトとネコではアミノ酸配列が異なる。エリスロポエチンにおいて、ヒトとネコのアミノ酸の相同性は８３％程度である。また、ヒトとネコでは糖鎖配列が異なるため、ヒト由来タンパク質で可能であったからといってネコ由来タンパク質で可能であるとは言い難い。従って、本発明では、トランスジェニック鳥類によるネコ由来タンパク質の生産方法を示すことを課題とする。

本発明者らは、ネコ由来タンパク質としてネコ由来サイトカインに注目し、ネコ由来サイトカインの一つであるネコ由来エリスロポエチンをターゲットとした。本発明は、特にトランスジェニック鳥類によるネコ由来エリスロポエチンの生産方法を示すことを課題とする。また、米国特許出願公開２００４／００１９９２２および２００４／００１９９２３号明細書が開示するヒト由来エリスロポエチン産生トランスジェニック鳥類は、エリスロポエチン産生量が少ないという点で問題がある。したがって、本発明は高濃度のエリスロポエチンを産生するトランスジェニック鳥類、およびその作製方法を提供することを課題とする。

本発明は、配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチンのアミノ酸配列、又は配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチンのアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類の卵よりネコ由来エリスロポエチンを抽出する工程、精製する工程、およびポリエチレングリコールで化学修飾する工程を含む、ネコ由来エリスロポエチンの生産方法に関する。

ポリエチレングリコールの重量平均分子量が５〜４０ｋＤａであることが好ましい。

ポリエチレングリコールの重量平均分子量が２０ｋＤａであることが好ましい。

ポリエチレングリコールの付加数が１又は２以上であって、ポリエチレングリコール修飾された１分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が１００ｋＤａから９００ｋＤａであることが好ましい。

ポリエチレングリコールの付加数が１であって、ポリエチレングリコール修飾された１分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が１００ｋＤａから５００ｋＤａであることが好ましい。

本発明によれば、ネコ由来タンパク質を産生するトランスジェニック鳥類及びその作製方法が提供される。その結果として、ネコ由来サイトカインを産生するトランスジェニック鳥類及びその作製方法が提供される。更には、ネコ由来エリスロポエチンを産生するトランスジェニック鳥類及びその作製方法が提供される。また従来よりも高濃度のエリスロポエチンを産生するトランスジェニック鳥類およびその作製をも可能とした。

実施例１で構築した、ネコ由来エリスロポエチン発現用ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯの構造を示す。ｐｈｉ＋はウイルスパッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ｆＥＰＯはネコ由来エリスロポエチン遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。 実施例６で構築した、ネコ由来エリスロポエチン発現用ベクターｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯｗｐｒｅの構造を示す。ｐｈｉ＋はウイルスパッケージングシグナル配列を示す。モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル配列にｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）をＴＡＧに変更したｇａｇの一部が付随している。ｆＥＰＯはネコ由来エリスロポエチン遺伝子を示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはＭＳＣＶのＬＴＲ配列を示す。ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節因子である。 実施例８で測定した、トランスジェニックニワトリの血清中及び卵白中の活性を示す。活性はエポジンを標準エリスロポエチンとし、ＥＰＯ依存性細胞株であるＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイによりおこなった。雌雄不明は雌雄判定以前に殺処分したものである。（＊）はｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯベクターを用いたトランスジェニックニワトリであり、他は、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯｗｐｒｅを用いたトランスジェニックニワトリである。発現量が最大のもの（個体番号１０−１）で活性は血清中５３００ＩＵ／ｍｌ、卵白中９２０００ＩＵ／ｍｌであった。 実施例８で行った、トランスジェニックニワトリ（個体番号６−３）の血清及び卵白の抗ネコ由来エリスロポエチン抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。個体番号６−３の発現量は血清中６２０ＩＵ／ｍｌ、卵白中６４００ＩＵ／ｍｌであった。マーカーは分子量マーカー（ドクターウエスタン、オリエンタル酵母社製）である。エリスロポエチンの分子量は３２〜３４ｋＤａ程度である。エポジンを標準サンプルとした。野生型は非トランスジェニックニワトリ由来のサンプルである。エポジンは１．２Ｕ／レーン。卵白、血清はそれぞれ０．２μｌ／レーン、０．４μｌ／レーンを電気泳動した。野生型に見られるバンドはエリスロポエチンに非特異的なバンドである。血清由来のエリスロポエチンは、わずかであるが野生型と比較するとエポジンと同じ位置にバンドを確認できる。卵白由来のエリスロポエチンは分子量が通常のものより低い泳動距離を示している。これは糖鎖の修飾パターンが異なる為であると考えられる。 実施例９で行った、トランスジェニックニワトリ（固体番号１０−１）の卵白中のネコ由来エリスロポエチンの精製の各ステップにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。２μｇ／レーン（エポジン・１０μｌ／レーンを除く）を電気泳動した。左から、卵白（ＥＷ）、ブルーセファロースクロマトグラフィー溶出画分（ＢＳ）、ヘパリンセクロマトグラフィー溶出画分（ＨＥ）、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー素通り画分（ＤＥＡＥ）、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー溶出画分（ＧＰＣ）、エポジン（ＥＰＯＧＥＮ）を表す。分子量マーカーはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いた。図４のウエスタンブロットの結果と一致して、卵白より精製したネコ由来エリスロポエチンはエポジンよりも分子量が低い位置にバンドを確認できる。 実施例１１で行った、ネコ由来エリスロポエチンのＰＥＧ化反応後混合物および精製後のＰＥＧ−ｆＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。１０μｌ／レーンを電気泳動した。レーン１はＰＥＧ化反応混合物、レーン２は陽イオン交換結合画分、レーン３はｄｉ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ｆＥＰＯ、レーン４はｍｏｎｏ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ｆＥＰＯ、レーン５は未修飾ｆＥＰＯの結果を表す。レーン１では３０〜４０ｋＤａ付近にＣＢＢ染色されないバンドが存在するがこれは未反応ＰＥＧであると考えられる。陽イオン交換クロマトグラフィーによりこのバンドは除去されている（レーン２）。 実施例１３で行った、非ＰＥＧ化ネコ由来エリスロポエチン、モノ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ｆＥＰＯ及びＥＰＯＧＥＮの投与による、ラットの網状赤血球数の変化を示す。

本発明の特徴とするところは、ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類及びその作製方法である。本発明は、また、ネコ由来サイトカインタンパク質及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類及びその作製方法である点を特徴とする。本発明は、また、配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチン及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質のコード配列の少なくとも一部を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類及びその作製方法である点を特徴とする。本発明は、また、配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチン及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類及びその作製方法である点を特徴とする。

本発明は、また、トランスジェニック鳥類の作製に複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いることを特徴とする。本発明は、また、複製能欠失型レトロウイルスベクターがモロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルス由来の配列を含むことを特徴とする。本発明は、また、複製能欠失型レトロウイルスベクターがマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来の配列を含むことを特徴とし、その点で、胚細胞や幹細胞への感染性の高いウイルスを用いることを特徴とする。本発明は、また、複製能欠失型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇエンベロープを含むことを特徴とし、その点で、広範囲の哺乳類および非哺乳類の細胞に対し、形質導入が難しい細胞であっても感染可能であることを特徴とする。

本発明は、また、組織非特異的なプロモーター遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いてトランスジェニック鳥類を作製することを特徴とする。本発明は、また、組織非特異的なプロモーター遺伝子がニワトリβアクチンプロモーター遺伝子の一部又は全部を含むことを特徴とする。

本発明は、また、組織特異的なプロモーター遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いてトランスジェニック鳥類を作製することを特徴とする。本発明は、また、組織特異的の組織として卵管特異的なプロモーター遺伝子の一部又は全部を含む組織特異的なプロモーター遺伝子を含むことを特徴とする。本発明は、また、卵管特異的なプロモーター遺伝子としてオボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、Ｇ２グロブリン、Ｇ３グロブリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、シスタチン又はアビジンのプロモーター遺伝子の少なくとも一部若しくは全部又はその組み合わせを含むことを特徴とする。

本発明は、また、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントを含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いてトランスジェニック鳥類を作製することを特徴とする。本発明は、また、調節エレメントがｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ配列の一部又は全部を含むことを特徴とする。

本発明は、また、鳥類の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることを含む方法によってトランスジェニック鳥類を作製することを特徴とする。本発明は、また、鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始後２４時間以後の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることを含む方法によってトランスジェニックを作製することを特徴とする。より好ましくは外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる胚が孵卵開始後３２時間以後７２時間以前に形成されたものであることを特徴とする。更に好ましくは外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる胚が孵卵開始後４８時間以後６４時間以前に形成されたものであることを特徴とする。本発明は、また、外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターの感染方法が胚に形成される心臓内又は血管内へのマイクロインジェクションであることを含む方法であることを特徴とする。

本発明は、また、鳥類が家禽である上記のトランスジェニック鳥類であることを特徴とする。より好ましくは鳥類がニワトリである上記のトランスジェニック鳥類であることを特徴とする。
本発明は、また、トランスジェニック鳥類、その子孫、その卵及び／又はその精子であり、上記のトランスジェニック鳥類の作製法のいずれかを含むことを特徴とする。
本発明は、また、トランスジェニック鳥類の血液、その体細胞及び／又はその卵より、抽出、精製、活性化することのいずれか、またはその組み合わせを含む外来性遺伝子由来のタンパク質の生産方法であり上記のトランスジェニック鳥類の作製法のいずれかを含むことを特徴とする。

本発明は、また、上記の方法により生産されたネコ由来タンパク質をポリエチレングリコールで化学修飾して得られるポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質に関する。
好ましくは、ネコ由来タンパク質がネコ由来サイトカインタンパク質及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質である。より好ましくは、ネコ由来タンパク質が配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチン及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質である。更に好ましくは、ネコ由来タンパク質が配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチン及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質である。
本発明は、また、ネコ由来タンパク質の修飾に用いるポリエチレングリコールの重量平均分子量が５〜４０ｋＤａであることを特徴とする。より好ましくは、ポリエチレングリコールの重量平均分子量が２０ｋＤａである。
本発明は、また、ポリエチレングリコールの付加数が１又は２以上であって、ポリエチレングリコール修飾された１分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が１００ｋＤａから９００ｋＤａであるポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質に関する。好ましくは、ポリエチレングリコールの付加数が１であって、ポリエチレングリコール修飾された１分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が１００ｋＤａから５００ｋＤａである。

本発明は、また、上記ポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質を含むポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質組成物に関する。
本発明は、また、上記ポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質、又は、ポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質組成物を有効成分として含有するネコ用医薬組成物に関する。上記医薬組成物は、ネコエリスロポエチン活性及び薬効持続性を有し、ネコの腎性貧血を治療するための用途に好適である。
本発明は、また、ネコ由来タンパク質に、ポリエチレングリコールのスクシンイミジルエステル誘導体を付加させることからなる、ポリエチレングリコール修飾ネコ由来タンパク質組成物の製造方法に関する。

以下に本発明を詳細に説明する。
タンパク質とは２個以上のアミノ酸がペプチド結合したもので、通常ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものも含む。また、アミノ酸は修飾を受けていても良い。タンパク質の分泌のためにはタンパク質に分泌シグナル配列が備わっていることが好ましい。また分泌シグナルは自己の配列に限定されるものではない。

外来性遺伝子としては特に限定されず、鳥類以外の遺伝子はもちろん、鳥類のものを含んでも良い。トランスジェニック作製に用いる個体が本来有する配列であっても、その個体が本来有する全遺伝子にあらたに遺伝子を導入するので外来性遺伝子と呼ぶ。

本発明において、外来性遺伝子はネコ由来タンパク質のコード配列を含んでおり、コード配列の境界は５’末端の開始コドン、及び開始コドンに対応する３’末端の終始コドンにより決定される。５’末端の開始コドン近傍はコザックのコンセンサス配列を含むことが好ましい。コード配列の上流にはリボソーム結合部位が存在していることが好ましい。
外来性遺伝子は上記のネコ由来タンパク質のコード配列以外の非翻訳領域を含んでもよい。

ネコ由来タンパク質としては特に限定されないが、ネコ由来サイトカインタンパク質及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質が好ましい。
サイトカインとは、細胞から放出され、免疫、炎症反応の制御作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖・分化の調節作用など細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子であり、具体的には、各種インターロイキン、インターフェロンα、β、γ、腫瘍壊死因子、リンホトキシン、造血因子のコロニー刺激因子やエリスロポエチン、増殖因子の上皮増殖因子や繊維芽細胞増殖因子などがあげられる。本発明においては、配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチン及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質の少なくとも一部を含むものがより好ましく、配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチン及び／又はそれらと実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質の全部が更に好ましい。

本明細書において、「実質的に同一の生物学的活性を示すタンパク質」とは、例えばサイトカインの場合、ネコ由来サイトカインタンパク質のアミノ酸配列中の、１〜１０個のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、生理作用の変わらないものを示し、生理作用が同じであれば活性の大小に関係なく実質的に同一とする。
配列番号１において、２６番目のアミノ酸まではシグナルペプチドと呼ばれ分泌の際、切断を受け取り除かれる。従って、ネコ由来エリスロポエチンの生物学的活性には影響の少ない領域である。本発明で得られるネコ由来タンパク質は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の２７番目以降のアミノ酸配列中１〜１０個のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有してもよい。

本発明のトランスジェニック鳥類の作製には、レトロウイルスベクターを用いることが好ましい。レトロウイルスベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、パッケージング細胞の異なる形態を含む。パッケージング細胞とはウイルス粒子の複製に必要なタンパク質の少なくとも一つをコードする遺伝子を導入した細胞である。

本発明で使用するレトロウイルスベクターは、安全性を考慮して、複製能を欠失していることが好ましい。複製能の欠失方法としては、ウイルス粒子の複製に必要な内部コアに含まれるタンパク質（ｇｒｏｕｐ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ，ｇａｇ）、逆転写酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｐｏｌ）及びエンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ，ｅｎｖ）のうちいずれか又はその組み合わせが発現しないように、コード配列または発現に必要な配列の少なくとも一部または全部を欠失するか、それらが発現不能なように置換、挿入変異を含むことが好ましい。レトロウイルスベクターは、ウイルス毎に挿入可能な遺伝子の長さが限定を受ける為、欠失変異が好ましく、安全性や挿入断片の長さを増やす観点から、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの複数を欠失させることが好ましい。レトロウイルスベクターはウイルス粒子にパッケージされる目印として機能するウイルスパッケージングシグナル（ｐｈｉ）を含んでいることが好ましい。ｇａｇ領域の一部はウイルスパッケージングシグナルとして機能することもあるため、ウイルス力価向上の観点から、ウイルスベクターは発現不能としたｇａｇ領域の少なくとも一部を含んでいることが好ましい（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９８７ Ｍａｙ；６１（５）：１６３９−４６．）。

レトロウイルスとしては特に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルスやモロニーマウス肉腫ウイルスやトリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のウイルス等が挙げられる。モロニーマウス白血病ウイルス及び／又はモロニーマウス肉腫ウイルスが好ましいが、鳥類の胚へ感染させるため、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）やマウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等、胚細胞や幹細胞への感染性の高いウイルスを用いることが好ましい。より好ましくは、ＭＳＣＶである。本発明の複製能欠失型レトロウイルスベクターは、これらのウイルスに由来する配列を含むものが好ましい。鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパク質を人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質とすることが好ましいが、このウイルスタイプに限定されるものではない。

本発明の複製能欠失型レトロウイルスベクターは、外来性遺伝子が鳥類細胞内で発現するために適当なプロモーター遺伝子の少なくとも一部または全部を含んでいることが好ましい。プロモーター遺伝子とは遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する、ＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。

本発明で用いる複製能欠失型レトロウイルスベクターは、組織非特異的なプロモーター遺伝子、又は、組織特異的なプロモーター遺伝子を含むものが好ましい。
組織特異的なプロモーター遺伝子とは、鳥類の特定の組織・細胞で特別に活性の強いプロモーター遺伝子のことである。組織特異的なプロモーター遺伝子を用いることにより、目的タンパク質の発現が鳥類の発生や生存に悪影響を与える可能性を減少または排除できる利点がある。

組織特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、卵管特異的なプロモーター遺伝子をあげることができる。卵管組織は性成熟後に活発に活動することから性成熟後に強く誘導されることが多い。

卵管特異的なプロモーター遺伝子として鳥類由来のオボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、オボムチン、リゾチーム、Ｇ２グロブリン、Ｇ３グロブリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、オボフラボプロテイン、オボマクログロブリン、シスタチン、アビジンのプロモーター遺伝子等をあげることができる。これらの卵管特異的なプロモーター遺伝子を用いた場合、目的タンパク質を卵白中に高発現させることができ、特に好ましい。

組織非特異的なプロモーター遺伝子とは、組織特異的なプロモーター遺伝子でないプロモーター遺伝子のことである。組織非特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、鳥類のほぼ全ての体細胞で活性のあるものをいう。その場合、目的タンパク質は血中にも発現するため雛の段階で発現の可否を検出できるという利点がある。

組織非特異的なプロモーター遺伝子としては特に限定されないが、βアクチンプロモーター遺伝子、ＥＦ１αプロモーター遺伝子、チミジンキナーゼプロモーター遺伝子やシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター遺伝子、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター遺伝子等のウイルス由来プロモーター遺伝子が挙げられる。他に、テトラサイクリン誘導型プロモーター遺伝子のような、組織非特異的な誘導型プロモーター遺伝子を用いても良い。組織非特異的なプロモーター遺伝子としては、ニワトリβアクチンプロモーター遺伝子の一部又は全部を含むことが好ましい。

本発明で用いる複製能欠失型レトロウイルスベクターは、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントを含んでいてもよい。転写エンハンサーはプロモーター遺伝子からの転写を促進する配列であるが、単独では転写を起こせないＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。本来機能しているものとは異なるプロモーター遺伝子に連結した場合にも機能することが多いのでプロモーター遺伝子との組み合わせについては限定しない。転写エンハンサーとしては、特に限定されないが、ＳＶ４０、ＣＭＶ、チミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサー等が挙げられる。調節エレメントは、転写調節や、転写後のＲＮＡの安定化に寄与する単独では転写を起こせないＤＮＡまたはＲＮＡ上の領域のことである。調節エレメントとしては特に限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ：ＷＰＲＥ、米国特許６１３６５９７号明細書）等が挙げられる。

レトロウイルスベクターは、５’末端、３’末端に長い反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ）の少なくとも一部を含む。ＬＴＲは転写プロモーター遺伝子やｐｏｌｙＡ付加シグナルを持つことから、プロモーター遺伝子やターミネーター遺伝子として利用し得る。レトロウイルスベクターにおいて、目的タンパク質のコード配列、プロモーター遺伝子、転写エンハンサー及び／又は調節エレメントは、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に含まれる。ＬＴＲ以外のプロモーターを用いる際は、プロモーターの下流に目的タンパク質のコード配列を接続した構造を有することが好ましい。レトロウイルスベクターが転写され、ウイルス粒子が作製されるためには、５’ＬＴＲから３’ＬＴＲの間にターミネーターやｐｏｌｙＡシグナルを含まないことが好ましい。

本発明に用いるレトロウイルスベクターには、マーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は、正しく遺伝子導入された細胞の同定及び単離の目印となるタンパク質をコードする遺伝子である。マーカー遺伝子としては特に限定されないが、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）やシアン・フルオレッセント・プロテイン（ＣＦＰ）、ルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質の遺伝子；ネオマイシン耐性（Ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ^ｒ）ピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏ^ｒ）等の薬剤耐性遺伝子；他にチミジンキナーゼ、ジヒドロフォレート・レダクターゼ、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の遺伝子が挙げられる。マーカー遺伝子は、プロモーター遺伝子や発現に必要な要素を伴っていることが好ましい。

次に、本発明で好適に用いられる複製能欠失型レトロウイルスベクターの調製法について、好ましい一態様を説明する。
本発明で用いられる複製能欠失型レトロウイルスベクターは複製に必要とされるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を欠失している。ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を保有するパッケージング細胞に目的タンパク質を発現可能な複製能欠失型レトロウイルスプラスミドとＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを共導入し、培養上清をウイルス液とする。あるいは、望ましくは、上記ウイルス液を感染させたパッケージング細胞にＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドを導入し、培養上清をウイルス液とする。ウイルス液は、必要に応じて濃縮することが好ましい。
複製能欠失型レトロウイルスベクターの調製は、このような方法に限定されるものではない。

上記ウイルス液において、複製能欠失型レトロウイルスベクターの力価（タイター）は、１×１０^８〜１×１０^１４ｃｆｕ／ｍｌが好ましく、１×１０^９〜１×１０^１４ｃｆｕ／ｍｌがより好ましい。
上記ウイルス液の力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＲＬ−１６５８）にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義する。具体的には、６ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約９．４ｃｍ^２）に存在する５×１０^４のＮＩＨ３Ｔ３細胞に、１０^２から１０^６倍の希釈率で希釈したウイルス溶液を１ｍｌ加え、マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を発現している細胞の割合を、Ｇ４１８（ネオマイシン）に対する耐性から調べることによりウイルス液の力価を測定する。

複製能欠失型レトロウイルスベクターの鳥類胚への感染について説明する。
本発明のトランスジェニック鳥類は、鳥類の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることを含む方法によって好適に得られる。
胚とは多細胞動物の個体発生初期のものであり、卵膜または卵殻に包まれているか、母体内にあって、独立して食物をとる以前のものである。孵化とは、卵膜または卵殻から出ること及び独立して食物をとるようになることである。

複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる胚は、孵卵開始から２４時間以上経過していることが望ましい。より望ましくは孵卵開始から３２時間以後７２時間以前の胚である。更に望ましくは、４８時間以後６４時間以前の胚である。感染させる、つまりウイルス液を導入する場所としては、胚に形成される心臓内あるいは血管内が好ましい。遺伝子導入効率の高いＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製する上で、心臓の拍動を観察することができる初期の段階（心臓が拍動を開始してから６時間以内）に、遺伝子を導入することが好ましい。それは、血流に乗せて全身に遺伝子を運ぶという観点と、細胞数が少ないという観点による。

孵卵とは、産卵直後及び産卵直後に発生可能でない環境に保管した鳥類受精卵を発生可能な環境に保持することである。例えばニワトリならば最適な孵卵温度は立体孵卵器では３７．２〜３７．８℃（平面孵卵器等では卵の上端で３８．９〜３９．４℃）、最適な湿度は４０〜７０％程度の環境が発生に最適な環境であるが、この環境に限定されない。また、孵卵の際には転卵をおこなう。転卵は、角度３０°以上で１日２回以上おこなうのが好ましいが、その限りではない。

マイクロインジェクションは、顕微鏡下で先端を細くした微小ガラス管等を用い、特定の場所に直接ウイルス液を導入する方法である。本研究では、心臓や血管という特定の場所にウイルス液を導入するため、リポフェクション法やエレクトロポレーション法といった他の遺伝子導入法よりマイクロインジェクションが好ましい。

本発明で使用する鳥類としては特に限定さないが、家畜として利用可能な家禽鳥類であることが好ましい。家禽鳥類としては、ニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラ、アヒル等を挙げることができる。なかでもニワトリは入手が容易で、産卵種としても多産であり、卵も大きく大量飼育方法が確立している点で特に好ましい。

上述のように、鳥類の胚へ外来性遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることによりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類が得られる。
生殖細胞に外来性遺伝子を保有するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を野生型鳥類、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類又はその子孫と交配させ、孵化したヒナを選別することによりＧ１トランスジェニック鳥類を得ることができる。Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類は、全ての細胞に外来性遺伝子が導入される確立は低く、ほとんどの場合外来性遺伝子が導入された細胞と野生型の細胞との異なる遺伝子型の細胞が共存しているキメラ状態である。一方で、Ｇ１トランスジェニック鳥類は、全ての体細胞に均一に導入遺伝子を保有している。体細胞や生殖細胞への遺伝子導入の確認は血液、体細胞、精子、卵由来のＤＮＡやＲＮＡをＰＣＲ法等によって調べることによって確認できる。また、目的タンパク質の発現からも判断できる。目的タンパク質の発現はＥＬＩＳＡ法や電気泳動法、目的タンパク質の活性測定等によって調べる事ができる。

Ｇ２以降の世代のトランスジェニック鳥類は、Ｇ１トランスジェニック鳥類を交配させることにより作製される。交配型はＧ１トランスジェニックオスと野生型メス、Ｇ１トランスジェニックメスと野生型オス、Ｇ１トランスジェニックのオスとメス等が考えられ、さらに子孫とその親による戻し交配も可能である。なかでもＧ１オスと野生型メスの交配型は、１羽のＧ１オスに対し複数の野生型メスを交配させることができるため、効率の点から好ましい。

本発明の目的タンパク質の生産方法は、前述のトランスジェニック鳥類から目的タンパク質を回収することを特徴とする。より詳細には、作製されたトランスジェニック鳥類の血液、その体細胞及び／又はその卵から目的タンパク質を抽出、精製、活性化することのいずれか又はその組み合わせにより回収することを特徴とする。抽出、精製に用いる方法としては特に限定されず、例えば、分別沈殿、遠心法、二相分離、限外濾過、膜分離、クロマトグラフィー、免疫化学的方法、結晶化することのいずれか及び／又はその組み合わせを含む方法などが挙げられる。

本発明のトランスジェニック鳥類により生産されるネコ由来タンパク質は、後述の実施例では血清中２４μｇ／ｍｌ、卵白中４２０μｇ／ｍｌ程度である。米国特許出願公開２００４／００１９９２２および２００４／００１９９２３が開示するヒト由来エリスロポエチン産生トランスジェニック鳥類は、エリスロポエチン産生量が１０μｇ／ｍｌ程度であるので、本発明のトランスジェニック鳥類は、より高濃度の目的タンパク質を産出することが可能である。

本発明は、また、上記の方法により生産されたネコ由来タンパク質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学修飾して得られるＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質に関する。ネコ由来タンパク質としては、上述と同様のものが挙げられる。
ネコ由来タンパク質は、ＰＥＧを付加する前に精製しておくことが好ましい。ネコ由来タンパク質の精製は、トランスジェニック鳥類の卵とくに卵白成分を純水もしくは平衡塩類溶液で希釈した溶液から、カラム法やろ過法で行うことができる。希釈は卵白の粘性を低減し、カラム法を円滑に行う目的で行われ、粘性低減のためには高倍に希釈することが望ましい反面、容積が増えると回収が困難になることから、２倍から１０倍が好ましく、５倍から６倍に希釈するのがより好ましい。

この卵白溶液から目的とするネコ由来タンパク質を回収するため、塩析法、吸着カラムクロマトグラフ法、イオン交換カラムクロマトグラフ法、ゲルろ過カラムクロマトグラフ法、抗体カラム法を単独、もしくは組み合わせて精製するが、これらのみに限定されるものではない。吸着カラムクロマトグラフ法としては、ブルーセファロースクロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー等があり、イオン交換カラムクロマトグラフ法としては、陰イオン交換クロマトグラフィー法等がある。

エリスロポエチンをマウス、ラット等のげっ歯類で造血効果を確認すると、血中単回投与後４日目に網状赤血球の増加が最大となり、７日目に効果がなくなることが報告されているが、長鎖分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を付加すると肝臓での代謝が阻害され、血中寿命が延びることにより薬効持続期間が延長され、ラット造血実験では２倍の１４日間効果が持続することが知られている。ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性化エステル誘導体は、タンパク分子中のリジン残基及びＮ末端に結合させることが可能である。本発明は、ネコ由来エリスロポエチンにＰＥＧを付加し、血中寿命を長くすることを特徴とするが、これに限定されない。

付与されるＰＥＧの分子量の増大に伴い、ＰＥＧ−ＥＰＯ複合体の血中寿命は増大する。しかし、極めて高分子のＰＥＧを付加することはＥＰＯの造血活性を阻害するため（ＷＯ０２／０３２９５７）、ＰＥＧの重量平均分子量は、５〜４０ｋＤａがインビボ造血効果を最大にする上で好ましく、１０〜３０ｋＤａがより好ましい。更に好ましくは２０ｋＤａである。ＰＥＧの重量平均分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定された値である。
またネコ由来エリスロポエチンには少なくとも３個所のＰＥＧ結合可能部位があり、ひとつのタンパク分子に結合するＰＥＧは１（モノ）、２（ジ）、３（トリ）分子が可能であるが、複数箇所にＰＥＧが結合することでＥＰＯのレセプター結合能が阻害されインビボ活性を低下させることから、モノ体が好ましい。

本発明のＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質は、ＰＥＧの付加数が１又は２以上であって、ＰＥＧ修飾された１分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が１００ｋＤａから９００ｋＤａであるものが好ましく、ＰＥＧの付加数が１であって、上記見かけの分子量が１００ｋＤａから５００ｋＤａであるものがより好ましい。
本明細書において、上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる見かけの分子量の測定は、低圧クロマト装置 ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（アマシャム社製）及びゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００（アマシャム社製）を用いて行う。

本発明は、また、ＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質組成物に関する。
本発明のＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質組成物は、ＰＥＧの付加数が１又は２以上であって、ＰＥＧ修飾された１分子の見かけの分子量が１００ｋＤａから９００ｋＤａであるＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質、ＰＥＧの付加数が１であって、ＰＥＧ修飾された１分子の見かけの分子量が１００ｋＤａから５００ｋＤａであるＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質、及び／または、上述の生産方法で得られたＰＥＧ未修飾ネコ由来タンパク質の混合物からなり、少なくとも１種のＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質を含む。

本発明は、また、上記ＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質又はＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質組成物を有効成分として含有するネコ用医薬組成物に関する。
本発明のネコ用医薬組成物は、ネコエリスロポエチン活性及び薬効持続性を有するので、ネコの腎性貧血を治療するために好適に用いることができる。
本発明のネコ用医薬組成物は、非経口的に投与することができる。非経口投与として、静脈内注射、点滴静脈内注射、皮下注射、経粘膜投与（例えば経肺、経鼻など）、経皮投与などの投与経路が挙げられる。
本発明のネコ用医薬組成物の投与量としては特に制限されず、個々の患蓄のエリスロポエチンに対する反応性の違い等から一義的には決められないが、例えばＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質に換算して、週２回静脈注射による投与でネコ１頭あたり０．５〜５０μｇ程度を投与すればよい。

本発明は、また、上記ネコ由来タンパク質に、ＰＥＧのスクシンイミジルエステル誘導体を付加させることからなる、ＰＥＧ修飾ネコ由来タンパク質組成物の製造方法に関する。
ＰＥＧのスクシンイミジルエステル誘導体としては特に限定されず、例えば、スクシンイミジルプロピオン酸エステル、スクシンイミジルアルファメチルブタン酸エステル等が挙げられる。
ＰＥＧのスクシンイミジルエステル誘導体の添加量は、ネコ由来タンパク質に対して、（ネコ由来タンパク質）：（ＰＥＧのスクシンイミジルエステル誘導体）で１：１〜１：１０のモル比が好ましい。
反応温度及び反応時間は特に限定されないが、４〜３７℃で０．５〜２時間が好ましい。

以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。遺伝子操作について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。細胞培養について特に記述のないものに関しては代表的な方法に従った（小山秀機編集「細胞培養ラボマニュアル」シュプリンガー・フェアラーク東京 第１判）。商品名を記載している場合は特に記載のない限り添付の説明書の指示に従った。

（実施例１）
ネコ由来エリスロポエチン遺伝子発現用プラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯの構築
ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔ（配列番号２）は公知文献（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９４ ＭＡＲ；１（２）：１３６−８．）とインターネットの情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ＮＩＨ．ｇｏｖ／他）を元に全合成し、ｐＵＣ１９（ジェンバンク アクセッション番号Ｘ０２５１４）のＥｈｅＩ（２３５）〜ＰｖｕＩＩ（６２８）間に挿入した（東洋紡績社製）。これを、ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で切断し、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＢＡＰ（タカラバイオ社製）処理後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収した。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収した（実施例１ベクター断片）。

ｐＵＣｆＥＰＯ（配列番号３）は９１１〜１４８９ｂｐにネコ由来エリスロポエチンの配列をコードする。ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、ｐＵＣｆＥＰＯを鋳型として、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｇｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｔｇｇｇｇｔｃｇｔｇｃｇａａｔｇｔｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｔｃ−３’（配列番号４）及び５’−ｃｇａｔａａｇｃｔｔａｃｇｃｇｔｔｃａｃｃｔｇｔｃｔｃｃｔｃｔｔｃｇｇｃａｇ−３’（配列番号５）（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲにより増幅した断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収しＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で切断した。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片をＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製、回収した（実施例１インサート断片）。

実施例１ベクター断片と実施例１インサート断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用い連結し、これをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａｌｐｈａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）を用い、形質転換した。形質転換株より図１の構造を持つプラスミドを選択し、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯとした。
なお、図１中のマーカー遺伝子ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ、ウイルスパッケージングシグナル配列ｐｈｉ＋、マーカー遺伝子Ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ、組織非特異的なプロモーター遺伝子ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、並びに、長い反復配列５ＬＴＲ及び３ＬＴＲはすべて、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔに由来するものである。

（実施例２）
ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯとｐＶＳＶ−Ｇを用いたレトロウイルスベクターの調製
以後特に記述の無い限り、培地は１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）を用いた（ギブコ社製）。培養は３７℃、ＣＯ_２５％でおこなった。レトロウイルスベクターに用いるプラスミドＤＮＡはＥｎｄｏ Ｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。

実施例１で構築したプラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯよりレトロウイルスベクターを調製するため、ｇａｇ、ｐｏｌ遺伝子を持つパッケージング細胞ＧＰ２９３を、コラーゲンコートされた直径１００ｍｍの培養ディッシュに細胞数５×１０^６個／ディッシュ（７０％コンフルエント）となるように播種した（翌日９０％コンフルエントとなるようにする）。次の日、培地を取り除き、７．２ｍｌの培地と１０μｌの２５ｍＭクロロキン（シグマ社製）を加えて、更に１時間培養した。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００（インビトロジェン社製）を１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（ギブコ社製）に懸濁し、室温で５分間おいた。１２μｇのｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯと１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に懸濁した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを、培養ディッシュに全量加え、６時間培養した。６時間後、培地を取り除き９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）を加え、更に２４時間培養した。

培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、遠心管に集めた。超遠心機ＣＳ１００ＧＸＬ（日立工機社製）を用い、２８０００ｒｐｍ（５００００ｇ）で１．５時間遠心分離した。上清を取り除き、沈殿に２０μｌのＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁して小型高速遠心機で１２０００ｒｐｍで１分遠心分離し、上清を０．４５μｍのデュラポアウルトラフリーフィルター（アドバンテック社製）に通しウイルス液とした。

（実施例３）
ウイルス力価の測定
ウイルス液の力価は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＣＲＬ−１６５８）にウイルス液を添加したとき、感染した細胞の数によって定義した。６ウェル培養プレートの各ウェル（底面積約９．４ｃｍ^２）に存在する５×１０^４のＮＩＨ３Ｔ３細胞に、１０^２から１０^６倍の希釈率で希釈した実施例２のウイルス溶液を１ｍｌ加え、マーカーであるネオマイシン耐性遺伝子を発現している細胞の割合を、Ｇ４１８に対する耐性から調べることによりウイルス液の力価を測定した。１０^６倍希釈で４コロニー現れた場合、ウイルス力価は、４×１０^６ｃｆｕ／ｍｌとなる。

具体的には、力価測定開始の前日にＮＩＨ３Ｔ３細胞を６ウェル培養プレートに５×１０^４個／ウェルとなるよう播種し培養した。翌日、細胞の培地を９μｇ／ｍｌのポリブレンを含有する培地９００μｇ／ｍｌと交換し、ウイルス液を培地で１０^−１〜１０^−５に希釈し、それぞれ１００μｌをウェルに添加して感染させた（ポリブレン終濃度８μｌ／ｍｌ）。４〜６時間培養後、１ｍｌの培地を更に加えた。次の日、培地を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地と交換し、以後３〜４日おきにＧ４１８含有培地と交換した。感染から約２週間後プレートをメチレンブルー液で染色し、得られたコロニー数を測定し力価を求めた。測定の結果を表１に示す。

（実施例４）
ネコ由来エリスロポエチン安定パッケージング細胞の選択
ウイルス感染の前日に２４ウェル培養プレートにＧＰ２９３細胞を１．５×１０^４個／ウェルとなるよう播種し培養した。ウイルス感染の当日１０μｇ／ｍｌのポリブレンを含有する培地１ｍｌと交換した。これに、（実施例２）で作製したウイルス液を感染させた。以後、細胞を限界希釈法によりクローン化する。具体的には、次の日、細胞を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に懸濁し、同じ培地に１０個／ｍｌとなるように希釈した。希釈した細胞を９６ウェル培養プレートに１００μｌずつ播種し（ウェルに一個の細胞が入るようにする）、細胞増殖速度が早く、ＧＰ２９３と形態の近い細胞を選択し、ネコ由来エリスロポエチン安定パッケージング細胞クローンを得た。

（実施例５）
ネコ由来エリスロポエチン安定パッケージング細胞とｐＶＳＶ−Ｇを用いたレトロウイルスベクターの調製
直径１００ｍｍのコラーゲンコートされた培養ディッシュに実施例４で得られたネコ由来エリスロポエチン安定パッケージング細胞を５×１０^６個（７０％コンフルエント）となるように播種した。翌日９０％コンフルエントとなるようにする。次の日、培地を取り除き、７．２ｍｌの培地と１０μｌの２５ｍＭクロロキンを加えて、更に１時間培養した。５６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００を１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に懸濁し、室温で５分間おいた。１２μｇのｐＶＳＶ−Ｇを１．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に懸濁する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを、培養ディッシュに加え、６時間培養した。培地を取り除き、９ｍｌの培地と２００μｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２４時間培養した。培養上清を０．４５μｍのセルロースアセテートフィルターに通し、遠心管に集めた。超遠心機を用い、２８０００ｒｐｍ（５００００ｇ）で１．５時間遠心分離した。上清を取り除き、沈殿に２０μｌのＴＮＥ緩衝液を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁して小型高速遠心機で１２０００ｒｐｍで１分遠心分離し、上清を０．４５μｍのデュラポアウルトラフリーフィルターに通しウイルス液とした。このようにして、１０^８ｃｆｕ／ｍｌ以上の力価を持つウイルス液が得られた。

（実施例６）
ＷＰＲＥ配列を含むネコ由来エリスロポエチン遺伝子発現用プラスミドｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯｗｐｒｅの構築とレトロウイルスベクターの調製
ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯを、ＣｌａＩ（タカラバイオ社製）で切断し、ＢＡＰ処理後、精製、回収した。精製、回収には（実施例１）記載の製品を用いた。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（実施例６ベクター断片）。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｃａｔｃｇａｔａａｔｃａａｃｃｔｃｔｇｇａｔｔａｃａａａａｔｔｔｇｔｇａ−３’（配列番号６）及び５’−ｃｃａｔｃｇａｔｃａｇｇｃｇｇｇｇａｇｇｃｇ−３’（配列番号７）（下線部はＣｌａＩ制限酵素部位）をプライマーとし、ＷＰＲＥ配列を含むｐＷＨＶ８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション４５０９７）からＰＣＲにより増幅した断片を精製、回収しＣｌａＩで切断した。これを、１％アガロースゲル電気泳動し、目的断片を精製、回収した（実施例６インサート断片）。

実施例６ベクター断片と実施例６インサート断片を連結し、これをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａｌｐｈａに形質転換した。形質転換株より図２の構造を持つプラスミドを選択し、ｐＭＳＣＶｎｅｏｂａｃｔｆＥＰＯｗｐｒｅとした。先に述べた実施例と同様にして安定パッケージング細胞やレトロウイルスベクターを調製できる。ＷＰＲＥ配列を用いると高力価の安定パッケージング細胞を得やすい。ＷＰＲＥ配列により転写活性が増強されているためやＲＮＡが安定化されているためだと考えられる。

（実施例７）
ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化
マイクロインジェクションと人工孵化は無菌条件下でおこなう。ニワトリ受精卵（城山種鶏場）の外側を消毒液（昭和フランキ社製）及びエタノールで除菌する。孵卵機Ｐ−００８（Ｂ）型（昭和フランキ社製）を３８℃、湿度５０〜６０％の環境になるようセットし、電源を入れた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０°転卵しながら孵卵を行った。

孵卵開始から約５５時間経過後、孵卵機から卵を取り出し、その鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンド刃（刃先径２０ｍｍ、シャフト径２．３５ｍｍ）を付けたミニルーター（プロクソン社製）で切り取った。ニワトリ二黄卵（城山種鶏場）の鋭端部を直径４．５ｃｍに切り取り、中身を捨てた卵殻に受精卵の中身を移し、注射器の内筒で胚を上方へ移動させた。実体顕微鏡システムＳＺＸ１２（オリンパス社製）下で、フェムトチップＩＩ（エッペンドルフ社製）にウイルス液を注入し、フェムトジェット（エッペンドルフ社製）を用い、実施例５又は６のウイルス溶液約２μｌをマイクロインジェクションした。

卵白を糊として約８×８ｃｍ^２に切ったサランラップ（旭化成社製）でこの穴を塞ぎ、孵卵機に戻し孵卵を続けた。孵卵機の転卵を３０分毎に３０°転卵に変更した。孵卵開始から２０日目にサランラップに２０Ｇの注射針で２０個程度穴を開け、孵卵機に６０ｃｃ／ｍｉｎで酸素を供給し孵卵を行った。雛がハシ打ちを始めたら卵殻を割って孵化させた。この人工孵化による孵化率を表１に示す。

（実施例８）
ネコ由来エリスロポエチン発現トランスジェニックニワトリの血中、卵中の発現の確認
（実施例７）により誕生した雛を飼育して成長させた。飼料として、幼雛ＳＸセーフティー及びネオセーフティー１７（豊橋飼料社製）を用いた。トランスジェニックニワトリからの採血は翼下静脈よりおこなった。採血した血液はエッペンドルフチューブに入れ、室温で３０分以上放置した後、小型高速遠心機で４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血清と血餅を完全に分離し、上清を血清とした。卵からの抽出の際には、卵白及び卵黄を分離した。卵黄からの抽出の際は、卵黄中央にシリンジをさし、卵白が入らないように抜き取った。卵白は、超音波や物理的手法により全体を一様となるように調製した。調製したサンプルはアッセイ時まで−８０℃で凍結保存した。凍結融解を避けるため、溶解は３７℃で迅速に行うことが好ましい。

ネコ由来エリスロポエチンの活性は、ＥＰＯ依存性細胞株であるＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイ（特開平１０−９４３９３）によりおこなった。細胞増殖アッセイはエポジン（中外製薬社製）を標準エリスロポエチンとして、増殖の検量線を描きそれを元に未知サンプルのエリスロポエチン活性を測った。ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞用培地として５％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０リキッド培地（ニッスイ社製）を用いた。通常のＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞の培養の際には終濃度１Ｕ／ｍｌとなるようにエポジンを加えた。細胞増殖アッセイには対数増殖期にある細胞を用いた。

ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞で細胞増殖アッセイをおこなうため、まず培地中のエポジンを除去した。培養したＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り除き、沈殿にエポジンを含まない培地を１０ｍｌ加え懸濁した。同様の操作を３度行い培地中のエポジンを除去した。細胞を計数し、エポジンを含まない培地で５５５５５Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように希釈した。９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに９０μｌずつ播種した。これに、培地で２５、１６、１０、６．４、４．０、２．５、１．６、１．０Ｕ／ｍｌとなるよう希釈したエポジンを１０μｌずつ加え、一様になるよう懸濁した（エリスロポエチンの終濃度はそれぞれ２．５、１．６、１．０、０．６４、０．４、０．２５、０．１６、０．１Ｕ／ｍｌとなる）。アッセイに用いるサンプルは培地で２〜４倍程度ずつ段階希釈し、検量線の測定範囲内に入るようにし、播種した細胞中に１０μｌずつ加え、一様になるよう懸濁した。標準サンプル、未知サンプル共に同じものを３点測った。２日間培養し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同人化学研究所社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。１〜４時間呈色反応を行った後、０．１ｍｏｌ／ｌの塩酸を１０μｌ加え反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準サンプルの測定結果を対数近似し、近似式を求めた。求めた近似式より未知サンプルの活性を換算した。

発現量が最大のもの（個体番号１０−１）で活性は血清中５３００ＩＵ／ｍｌ、卵白中９２０００ＩＵ／ｍｌであった。Ｇ０トランスジェニックの発現結果を図３に示す。インジェクション手技習熟後は、孵化したもののＧ０トランスジェニックの出現頻度は１００％であった。但し、高発現の個体は死に至りやすい。糖鎖の付加の程度によって変わるが、エリスロポエチンの比活性は２２００００ＩＵ／ｍｇ（Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０ Ｄｅｃ １２；１９４（２）：４５７−６２．）程度であるので、それから換算すると血清中２４μｇ／ｍｌ、卵白中４２０μｇ／ｍｌ程度であると推定できる。ネコとヒトのエリスロポエチンのアミノ酸配列の違いにより、ＲＩＡ法を用いるリコンビジェンＥＰＯキット（三菱化学ヤトロン社製）では正しく定量できなかった。

次に、個体番号６−３の血中及び卵中由来のネコ由来エリスロポエチンのウエスタンブロットをおこなった。サンプルはｅ・パジェル１２．５％（アトー社製）を用い変性条件で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写後、１０％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでブロッキングし、一次抗体としてウサギ抗ヒトＥＰＯ抗体（Ｇ−Ｔリサーチ プロダクツ社製）、二次抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ザイメッド ラボラトリーズ社製）、を用い、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍとＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（アマシャム社製）で検出した。ウエスタンブロットの結果を図４に示す。

（実施例９）
卵白からのネコ由来エリスロポエチンの精製
実施例８により卵白中にネコ由来エリスロポエチン活性が確認された個体の卵を回収し、卵白よりネコ由来エリスロポエチンを回収・精製した。
カラムにアプライするサンプルは全て、使用直前に孔径０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＨＶ（ミリポア社製）にてシリンジろ過を行った。ろ過困難な場合には、孔径２μｍのプラディスク２５（Ｗｈａｔｍａｎ社製）により予めろ過した後、Ｍｉｌｌｅｘによるろ過を行った。
精製過程でのネコ由来エリスロポエチン含有量の測定は、Ｂｉｃｏｒｅ３０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）にて行った。Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５ ｒｅｓｅｒｃｈ ｇｒａｄｅ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）に抗ヒトエリスロポエチンモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステム社製）をアミンカップリングキット（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）でＮＨＳ固定化して測定用チップとし、エポジンを標準物質として、装置の定量用プログラムを用いて濃度を測定した。

卵白をカラムにアプライするために、粘性を低下させる前処理を行った。冷蔵保存しておいた卵を室温に戻して割卵し、卵の殻等を用いて卵黄と卵白を分離した後、卵白のみを回収して重量を測定した。卵白をスターラーで攪拌して濃厚卵白を解きほぐし、５倍量の超純水を加え更に攪拌した。この時点で卵白液のｐＨは９．０〜９．３程度であった。これに１Ｎ ＨＣｌを適宜加えてｐＨ５．０に調整し、１５分間以上攪拌した後、９，５００Ｇ×３０分間、４℃で遠心分離した。上清に１Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ７．０に調整し、１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．０を終濃度５０ｍＭとなるよう加えた。このステップにおけるネコ由来エリスロポエチン回収率は最大９５％であった。

次いで、ブルーセファロースクロマトグラフィーを行った。前処理後の卵白液５００ｍｌ（卵白２〜３個分）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で平衡化した５０ｍｌのＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ カラム（アマシャム社製）にアプライした。カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で十分洗浄した後、２００ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で溶出した。溶出画分を、４℃の低温室で２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．２で常法にて一晩透析し、バッファー交換を行った。このステップにおけるネコ由来エリスロポエチン回収率は最大９８％であった。

次いで、ヘパリンクロマトグラフィーを行った。２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．２で平衡化したＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｈｅｐａｒｉｎ ＦＦカラム（アマシャム社製）に、ブルーセファロース溶出画分（透析後）を２回に分けてアプライし、それぞれ２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．２でカラムを十分に洗浄した後、ＮａＣｌ濃度を８０ｍＭまで上昇させるグラジエント溶出を行った。カラムは毎回１Ｍ ＮａＣｌおよび０．１Ｍ ＮａＯＨで再生した。Ｂｉａｃｏｒｅにてネコ由来エリスロポエチンの存在が確認された画分を回収した。このステップでのネコ由来エリスロポエチンの回収率は最大８０％であった。

次いで、脱塩カラムによるバッファー交換を行った。ヘパリンセファロース溶出画分を分画分子量５，０００のビバスピン２０（ザルトリウス社製）により総量３０〜４０ｍｌ程度に濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０で平衡化したＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（アマシャム社製）に１０ｍｌずつアプライし、同バッファーで溶出し、タンパク質を含む画分を回収した。１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ９．０に調整し、さらに１Ｍ ＮａＣｌで電気伝導度が３．０〜３．２ｍＳ／ｃｍとなるよう調整した。このステップにおけるネコ由来エリスロポエチン回収率は最大９５％であった。

次いで、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。バッファー交換後のサンプルを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、電気伝導度３．０〜３．２ｍＳ／ｃｍで平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ カラム（アマシャム社製）に２回に分けてアプライし、それぞれ素通り画分を回収した。カラムは毎回１Ｍ ＮａＣｌで再生した。分画分子量５，０００のビバスピン２０により、総量２〜３ｍｌ程度まで濃縮した。このステップでのネコ由来エリスロポエチン回収率は、最大９２％であった。
ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。濃縮後のサンプルを、５０ｍＭ ホウ酸バッファー、ｐＨ９．０もしくは他の適当なバッファーで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（アマシャム社製）にアプライして同バッファーで溶出した。Ｂｉａｃｏｒｅにてネコ由来エリスロポエチンの存在が確認された画分を回収し、分画分子量５，０００のビバスピン６にて総量１〜２ｍｌ程度にまで濃縮した。このステップでのネコ由来エリスロポエチン回収率は最大９３％であった。

精製各ステップでの回収画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプルはｅ・パジェル１２．５％を用いて、変性条件で泳動し、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で検出した。個体番号１０−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５に示す。
タンパク質濃度についてはＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にてＢＳＡを標準として測定した。発現量が最大の個体（個体番号１０−１）の卵白からの精製で、卵白１個分あたり約３ｍｇのネコ由来エリスロポエチンを得た。

（実施例１０）
精製ネコエリスロポエチンのＢａｆ／ＥＰＯＲ細胞増殖アッセイ
実施例９により卵白から精製したネコ由来エリスロポエチンについて、実施例８に記載の方法により、Ｂａｆ／ＥＰＯＲ細胞増殖アッセイを行った。その結果比活性は１６０，０００〜２９０，０００ＩＵ／ｍｇであった。

（実施例１１）
ｍＰＥＧ修飾ネコ由来エリスロポエチンの作成
卵白より精製したネコ由来エリスロポエチン溶液（ｐＨ８．０〜９．０のリン酸あるいはホウ酸バッファーに溶解）に、ＰＥＧの分子量が約２０ｋＤａのｍｅｔｈｏｘｙＰＥＧ−ＳＰＡ（スクシンイミジルプロピオン酸エステル）あるいはｍｅｔｈｏｃｙＰＥＧ−ＳＭＢ（スクシンイミジルアルファメチルブタン酸エステル）（ＮＥＫＴＡＲ社製）を加え、室温で０．５〜１時間転倒混和した。１００ｍＭグリシン溶液を１／１０容加え、室温でさらに０．５時間転倒混和し、活性エステルを失活させた。反応後の溶液は、Ｐｒｅｐａｃｋｅｄ Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ＰＤ−１０ Ｃｏｌｕｍｎｓ（アマシャム社製）もしくは透析によって５０ｍＭ 酢酸バッファー、ｐＨ４．５にバッファー交換し、同バッファーで平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（アマシャム社製）にアプライした。未反応のＰＥＧはカラムを素通りし、ｍＰＥＧ−ｆＥＰＯ及び未反応のネコ由来エリスロポエチンがカラムに吸着したので、これを５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ 酢酸バッファー、ｐＨ４．５で溶出し、回収した。回収した画分を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．５で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬにアプライし、ＰＥＧの付加数が２以上、１、０（未反応ネコ由来エリスロポエチン）に分けて回収した。回収後の画分は分画分子量５，０００のビバスピン６により適宜濃縮した。活性化ＰＥＧの種類、反応液の組成、反応時間とｍＰＥＧ−ｆＥＰＯ生成比について表２にまとめた。また、各ｍＰＥＧ−ｆＥＰＯについて、理論上およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ上での分離に基づいた分子量について表３にまとめた。ＰＥＧ化およびゲルろ過精製後のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプルはｅ・パジェル１２．５％を用いて、変性条件で泳動し、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図６に示す。

（実施例１２）
モノＰＥＧ化ネコ由来エリスロポエチンのＢａｆ／ＥＰＯＲ細胞増殖アッセイ
実施例１１によりＰＥＧ化、精製したモノ−ｍＰＥＧ−ｆＥＰＯについて、実施例１０に記載の方法により、Ｂａｆ／ＥＰＯＲ細胞増殖アッセイを行った。ｍＰＥＧ−ｆＥＰＯの量はＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にてＢＳＡを標準として、タンパク質部の重量として測定した。その結果比活性はモノ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ｆＥＰＯで３，２００〜１５，０００ＩＵ／ｍｇ、モノ−ｍＰＥＧ−ＳＭＢ−ｆＥＰＯで４，３００〜８，３００ＩＵ／ｍｇであった。

（実施例１３）
モノＰＥＧ化ネコ由来エリスロポエチンの薬効持続性の測定
ラットはＣｒｌｊ：ＣＤ系の正常雄（日本チャールス・リバー社製）を用い、７週齢時に実験に用いた。モノ−ＰＥＧ化ネコ由来エリスロポエチンには、（実施例１１）によりＰＥＧ化、精製したモノ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ｆＥＰＯ（比活性８，３００ＩＵ／ｍｇ）、非ＰＥＧ化ネコ由来エリスロポエチンには、実施例９の個体番号１０−１より精製した非ＰＥＧ化ネコ由来エリスロポエチン（比活性１６０，０００ＩＵ／ｍｇ）、ＣＨＯ産生ヒトエリスロポエチンにはエポジン（比活性１８０，０００ＩＵ／ｍｇ：インタビューフォーム記載値）をそれぞれ用いた。これらを０．０５％ヒト血清アルブミン、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水に希釈して２ｍｌ／ｋｇで単回投与した。ラットは１群５匹で１２群に分け、それぞれ２群ずつ、モノ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ｆＥＰＯを２５、５、１μｇ／ｍｌ（投与量はそれぞれ５０、１０、２μｇ／ｋｇ）、非ＰＥＧ化ネコ由来エリスロポエチンまたはエポジンをそれぞれ２５μｇ／ｍｌ（投与量は５０μｇ／ｋｇ）となるよう希釈したものを投与した。対照群には溶媒のみを投与した。被験物質は事前に調整し、−２０℃で保存した。投与直前に室温にて解凍し、体温程度になったものを２７Ｇの注射針を用いて尾静脈内に投与した。採血は、動物の負担を軽減するため、同量の同一被験物質を投与した２群（それぞれＡまたはＢ群とする）に対し、以下のように交互に行った。Ａ群：被験物質投与後０、４、１０、２１日、Ｂ群：被験物質投与後２、７、１５日。無麻酔下で総頚静脈より２３Ｇ注射針により０．５ｍｌ採血した。各試料について、網状赤血球数を自動網赤血球測定装置Ｒ−３０００（Ｓｙｓｍｅｘ社製）にて測定した。
各測定時点における網状赤血球数について、対照群とモノ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ｆＥＰＯ投与群、非ＰＥＧ化ネコ由来エリスロポエチン投与群及びエポジン投与群の平均値の差の優位性をＳＡＳシステム（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ型多重比較法により検定した。有意水準は両側５％とした。

測定の結果を図７に示した。網状赤血球数は、エポジン（５０μｇ／ｋｇ）投与群及びモノ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ｆＥＰＯ（５０μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇ）投与群では、投与後２日目に対照群より有意に低下し、４日目では増加して最大値を示した。投与後７日目には再び対照群のレベル以下にまで低下した。モノ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ｆＥＰＯ（２μｇ／ｋｇ）投与群及び非ＰＥＧ化ネコ由来ＥＰＯ（５０μｇ／ｋｇ）投与群では、網状赤血球数の有意な増加は見られなかった。モノ−ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ＥＰＯでは、非ＰＥＧ化ネコ由来ＥＰＯに比べ、Ｂａｆ／ＥＰＯＲ細胞増殖比活性は低下しているにもかかわらず（実施例１０及び１２）、生体内での網状赤血球増殖活性は高かった。これは、ＰＥＧ化によりエリスロポエチンの生体内での安定性が改善されたためと考えられる。

Claims (5)

1. 配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチンのアミノ酸配列、又は配列表の配列番号１で示されるネコ由来エリスロポエチンのアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸残基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする外来性遺伝子を有するトランスジェニック鳥類の卵よりネコ由来エリスロポエチンを抽出する工程、精製する工程、およびポリエチレングリコールで化学修飾する工程を含む、ネコ由来エリスロポエチンの生産方法。
2. ポリエチレングリコールの重量平均分子量が５〜４０ｋＤａである請求項１に記載の生産方法。
3. ポリエチレングリコールの重量平均分子量が２０ｋＤａである請求項１または２に記載の生産方法。
4. ポリエチレングリコールの付加数が１又は２以上であって、ポリエチレングリコール修飾された１分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が１００ｋＤａから９００ｋＤａである請求項１〜３のいずれかに記載の生産方法。
5. ポリエチレングリコールの付加数が１であって、ポリエチレングリコール修飾された１分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が１００ｋＤａから５００ｋＤａである請求項４に記載の生産方法。