JP2007055913A

JP2007055913A - サルモデルで薬効が確認された骨粗鬆症の予防又は治療剤

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Publication number: JP2007055913A
Application number: JP2005240812A
Authority: JP
Inventors: Shin Nakamura; 伸中村
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2005-08-23
Filing date: 2005-08-23
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2025-08-23
Also published as: JP5382840B2; WO2007023776A1

Abstract

【課題】従来から知られているダイズタンパク質やダイズイソフラボンを有効成分として含む骨粗鬆症の予防又は治療剤よりも、効果が優れた骨粗鬆症の予防又は治療剤を提供すること。
【解決手段】これまでの小型動物での試験結果から想定されていたダイズイソフラボンによる骨粗鬆症の予防又は治療効果に疑問を持ち、霊長類モデルを駆使して骨粗鬆症の予防又は治療効果を示す新たなダイズ有効成分を特定した。骨粗鬆症の予防又は治療剤は、β−コングリシニン及び／又はプロテアーゼによるその加水分解物を有効成分として含み、製剤中のβ−コングリシニン及びプロテアーゼによるその加水分解物の含量が１５重量％以上である。
【選択図】図１

Description

本発明は、骨粗鬆症の予防又は治療剤に関する。

従来、ダイズ食品・成分が骨粗鬆症に対する予防、治療作用を示すことが知られている（非特許文献１、２）。その有効成分としてダイズイソフラボン（植物エストロゲン）が考えられ、骨粗鬆症の予防又は治療効果を有する機能性食品、サプリメントとして、種々のダイズイソフラボン製品が実用化され、市販されている。

一方、ダイズに含まれる、貯蔵タンパク質の１種であるβ−コングリシニンは、脂質代謝調節作用を有することが知られており、肥満、高脂血症、高血圧症、糖尿病等の予防、治療に有効であることが知られている（特許文献１）。しかしながら、β−コングリシニンの骨粗鬆症に対する予防、治療効果は全く知られていない。

Stephanie C. Blum et al., J. Nutr. 133:1244-1249, 2003 Suzanne C. Ho et al., Osteoporos Int (2003)14:835-842 特開2005-80533号公報

本発明の目的は、従来から知られているダイズタンパク質やダイズイソフラボンを有効成分として含む骨粗鬆症の予防又は治療剤よりも、効果が優れた骨粗鬆症の予防又は治療剤を提供することである。

本願発明者らは、これまでの小型動物での試験結果から想定されていたダイズイソフラボンによる骨粗鬆症の予防又は治療効果に疑問を持ち、霊長類モデルを駆使して骨粗鬆症の予防又は治療効果を示す新たなダイズ有効成分を特定した。すなわち、ヒト骨粗鬆症の代替モデルとして、ヒトと類似の生理・病理的特性を備えたカニクイザル骨粗鬆症モデルを作製し、これを用いた実験により、骨粗鬆症に対する予防、治療効果を示す有効成分は、ダイズの貯蔵タンパク質の１種であるβ−コングリシニンであり、一方、これまで骨粗鬆症に対する予防、治療効果を示すと考えられていたダイズイソフラボンは、骨粗鬆症に対する予防、治療効果を示さないという驚くべき知見を得て本発明を完成した。

すなわち、本発明は、β−コングリシニン及び／又はプロテアーゼによるその加水分解物を有効成分として含み、製剤中のβ−コングリシニン及びプロテアーゼによるその加水分解物の含量が１５重量％以上である骨粗鬆症の予防又は治療剤を提供する。

本発明により、ヒトの骨粗鬆症に対する予防又は治療効果を発揮するダイズタンパク質中の有効成分は、β−コングリシニンであることが初めて見出された。本発明の骨粗鬆症の予防又は治療剤は、従来から骨粗鬆症の予防又は治療に用いられてきた精製度が低く数種のダイズタンパク質やダイズイソフラボンを含有する低純度製品よりも、ヒトの骨粗鬆症に対する予防又は治療効果を発揮するβ−コングリシニンの含量が高いので、従来のダイズ由来の骨粗鬆症に対する予防又は治療剤よりも優れた骨粗鬆症に対する予防又は治療効果を発揮する。

下記実施例に具体的に記載するように、本願発明者は、ヒトと類似の生理・病理的特性を備えたカニクイザルの骨粗鬆症モデルを作製し、これに精製したダイズイソフラボン又はダイズタンパク質・β−コングリシニンを経口投与し、骨粗鬆症の予防効果を比較した。その結果、従来から骨粗鬆症の予防、治療効果があると考えられていたダイズイソフラボンは、霊長類モデルでは骨粗鬆症の予防効果がなく、これまで骨粗鬆症との関係が全く知られていなかったβ−コングリシニンが骨粗鬆症の予防効果を有することが明らかになった。本願発明は、この驚くべき知見に基づくものである。

本発明の骨粗鬆症の予防又は治療剤は、β−コングリシニンを有効成分として含み、製剤中のβ−コングリシニン及びプロテアーゼによるその加水分解物の含量が１５重量％以上である。このような予防又は治療剤は、ダイズからβ−コングリシニンを精製又は部分精製したものを有効成分とすることにより容易に調製することができる。ダイズからのβ−コングリシニンの精製方法及び部分精製方法は公知であり、例えば、Tsutomu SAITO et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(4), 884-87, 2001や、J. Agric. Food Chem., 40, 941-944, 1992及びAgric. Biol. Chem., 55, 2227-2233, 1991)等に記載されており、下記実施例にも１例が具体的に記載されている。β−コングリシニンは、部分精製されたものでもよく、例えば、上記Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(4), 884-87, 2001に記載された方法により、ダイズを原料としてβ−コングリシニンと少量（数重量％）のグリシニンの混合物まで工業的に精製することができ、このような少量のグリシニンを含むβ−コングリシニンの部分精製物も好ましく用いることができる。あるいは、精製又は部分精製したβ−コングリシニンを、公知のダイズ食品やダイズタンパク質に添加することによっても容易に調製することができる。あるいは、β−コングリシニンをコードする遺伝子は既に周知であるのでβ−コングリシニン遺伝子の上流に転写活性の高いプロモーターを挿入することなどによりダイズ中のβ−コングリシニン含量を高め、このようなダイズから通常の方法で、ダイズタンパク質を分離したものを用いることも可能である。なお、従来、ダイズタンパク質の骨粗鬆症予防、治療効果は知られているが、イソフラボンが有効成分として考えられていたので、β−コングリシニンの含量を１５重量％の高含量としたダイズ由来タンパク質を骨粗鬆症に用いることは知られていない。

本発明の予防又は治療剤は、β−コングリシニンに代えて、又はβ−コングリシニンと共にプロテアーゼによるその加水分解物を含んでいてもよい。ここで、プロテアーゼとしては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンのような消化酵素中に含まれるプロテアーゼが好ましいが必ずしもこれらに限定されるものではない。β−コングリシニンを経口摂取した場合、摂取されたβ−コングリシニンのほとんどは消化酵素中のプロテアーゼにより分解後、吸収されるので、予め、このようなプロテアーゼで加水分解したものを有効成分として用いることも可能である。もっとも、β−コングリシニンを摂取した場合でも消化酵素により加水分解が起きるので、予防又は治療剤中に加水分解物を含める必要はなく、β−コングリシニンを有効成分とするものを好ましく用いることができる。

本発明の第１の予防又は治療剤中のβ−コングリシニン及びその加水分解物（加水分解物を含む場合）の含有量は、１５重量％以上であり、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは６０重量％以上、さらに好ましくは高純度の８０重量％以上である。

なお、β−コングリシニンの含量は、β−コングリシニンの含量が比較的高い精製品又は部分精製品等の場合には、下記実施例に記載したような、ゲル電気泳動のバンドの密度をデンシトメーターで測定することにより測定することができるし、未精製ダイズタンパク質やダイズ食品にβ−コングリシニンを添加したものなどの場合には、公知のELISA法（Moriyama T, et alのJ. Nutr. Sci. Vitaminol., 51: 34-39 (2005)）により測定することができる。すなわち、例えば、試料をSDS-尿素緩衝液(62.5 mM Tris-HCl, pH6.8, 8M尿素、15% SDS、20%グリセロール、5% 2-メルカプトエタノール）に溶解ないしは懸濁し、５分間超音波処理し、５分間煮沸する。試料が固体の場合にはさらに10000xgで１０分間遠心し、上清を用いる。これをリン酸緩衝液（10mM, pH7.4, 130mM NaClと4mM KCl含有）に２０倍（体積）希釈したものをELISAプレートのウェルに直接施し、４℃、一夜インキュベート後、洗浄し、ブロッキングし、抗β−コングリシニン抗体（ポリクローナル抗体でよい）と酵素標識抗ウサギIgG抗体（抗β−コングリシニン抗体がウサギ由来の場合、他の動物の場合にはその動物のIgGに対する標識抗体を利用）を用いた通常のELISAによりβ−コングリシニン含量を測定することができる。

本発明の骨粗鬆症の予防又は治療剤は、経口投与により投与することが好ましい。投与量は、症状、年齢、性別等により適宜設定されるが、通常、β−コングリシニンに換算して、成人１日４ｇ〜１５ｇ程度、好ましくは１日５ｇ〜１０ｇ程度である。

本発明の骨粗鬆症の予防又は治療剤は、ダイズから精製又は部分精製したβ−コングリシニン及び／又はプロテアーゼによるその加水分解物のみからなっていてもよいが、飲み易くするために味や香りを付けたり、他の飲料等と混合してもよい。

本発明の骨粗鬆症の予防又は治療剤は、医薬品としても用いることができるし、骨粗鬆症の予防又は治療効果を有する機能性食品（いわゆる成分強化食品を包含する）や栄養補助飲料などのサプリメントとして用いることもできる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

β−コングリシニンの調製
(1) 材料
乾燥状態で水分7.1％及びタンパク質55.5％を含む市販の低温加工脱脂大豆フレーク（不二製油、日本国大阪）を使用した。フィターゼ（Phytase NOVO L）はNOVO industry Co.より得た。

(2) フィターゼ処理による脱脂豆乳からのβ−コングリシニン及びグリシニンの分離
脱脂大豆フレークを10倍量の水中に分散させた。懸濁液のpHを２ＭのNaOHで7.5に調整し、該懸濁液を1時間室温にて撹拌した。3,000×gで10分間遠心し、上清を脱脂豆乳として採取した。100ｇの脱脂大豆フレークから脱脂豆乳中32ｇのタンパク質を得た。該脱脂豆乳を２ＭのHClでpH6.0に調整した。該豆乳にフィターゼを加え（1000FYT/100g脱脂豆乳中タンパク質）、得られた混合物を1時間40℃に保温した。該溶液を室温にて遠心し沈殿を分離した。遠心により採取した沈殿を4倍量の蒸留水中に分散し、２ＭのNaOHでpH7.0に中和した（グリシニン画分）。上清は２ＭのHClでpH5.0に調整して遠心した。沈殿を4倍量の蒸留水中に溶解し、２ＭのNaOHでpH7.0に中和後さらに等電点沈殿法で精製（β−コングリシニン画分）した。得られたβ−コングリシニン画分を以下の実験においてカニクイザル骨粗鬆症モデルに投与した。なお、得られたβ−コングリシニン画分中には、SDS-PAGEによる分析の結果、β−コングリシニン及びグリシニン以外のタンパク質は含まれていなかった。また、β−コングリシニン画分中のβ−コングリシニンの含量は、約９２重量％であった。なお、β−コングリシニンの含量は、SDS-PAGE上のβ−コングリシニンのサブユニット鎖のデンシトメトリー（濃度解析）により測定した。

比較例１
イソフラボン製剤としては、公知のイソフラボン製剤（商品名「ソヤフラボンＨＧ」、不二製油製、イソフラボン含量52.2重量％）を用いた。

カニクイザル骨粗鬆症モデルを用いた薬効試験
カニクイザルメス成獣の卵巣を摘除(OVX)した。摘除後１０週間、血中エストローゲンレベルをサーベーし、卵巣摘除によってエストローゲンの血中レベルが検出限界以下であることを確認した。これは、卵巣機能（エストローゲンの産生／放出）がなくなり、完全閉経状態であることを意味する。

この閉経性骨粗鬆症サルモデルを、対照群、β−コングリシニン群及びイソフラボン群に分けた。β−コングリシニン群には、実施例１で調製したβ−コングリシニン画分をβ−コングリシニン換算で１頭１日当り2.0gを毎日経口投与した。イソフラボン群には、ソヤフラボンＨＧ（商品名）を、イソフラボン換算で１頭１日当り100mgを毎日経口投与した。対照群には生理食塩水を経口投与した。

投与開始前および投与開始後１０週、２０週、３０週、４０週間後に、二重エネルギーＸ線吸光分光分析(dual energy X-ray absorptiometry, DEXA)により、ケタミン／キシラジン麻酔下、第３〜第５腰椎の骨密度を測定した。

結果を図１に示す。図１に示すように、β−コングリシニン群では、骨密度の減少がほとんど見られなかったのに対し、対照群及びイソフラボン群では、明らかな骨密度の減少が観察された。特に、イソフラボン群と対照群では骨密度の経時変化はほぼ同じであり、イソフラボンにはサルにおいては骨粗鬆症の予防効果がないことがわかった。

本発明の実施例で行った、カニクイザル骨粗鬆症モデルに対して、ダイズタンパク質・β−コングリシニン又は比較としてダイズイソフラボンを投与した場合の骨密度の経時変化を示す図である。

Claims

β−コングリシニン及び／又はプロテアーゼによるその加水分解物を有効成分として含み、製剤中のβ−コングリシニン及びプロテアーゼによるその加水分解物の含量が１５重量％以上である骨粗鬆症の予防又は治療剤。
β−コングリシニンを有効成分として含み、製剤中のβ−コングリシニンの含量が１５重量％以上である請求項１記載の予防又は治療剤。
前記β−コングリシニンがダイズ中に含まれるβ−コングリシニンである請求項１又は２に記載の予防又は治療剤。
ダイズから精製又は部分精製されたβ−コングリシニンから成る請求項３記載の予防又は治療剤。
前記精製又は部分精製されたβ−コングリシニンが、β−コングリシニン及びグリシニン以外のタンパク質を実質的に含まない請求項４記載の予防又は治療剤。
医薬品である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
成分強化食品又は機能性食品である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
サプリメントである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。