JP2006527998A - 非グリコシル化ヒトαフェトプロテイン、その製造方法および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、非グリコシル化ヒトα-フェトプロテイン(ng.HuAFP)またはその非グリコシル化断片をコードする実質的に純粋な核酸分子を特徴とする。一つの態様において、ng.HuAFPをコードする核酸分子には、配列番号:5に記載の核酸配列のヌクレオチド45〜1874位が含まれる。
「生体液」とは、哺乳類、鳥類、両生類、またはは虫類のような生物によって産生される水溶液を意味し、これは水溶液に囲まれている細胞によって分泌されるタンパク質を含む。生体液の例には、例えば、乳汁、尿、唾液、精液、膣液、滑液、リンパ液、羊水、卵の卵黄嚢、絨毛膜、または尿膜内の液、血液、汗、および涙液;と共に、例えば滲出液もしくは排水、木部、篩部、樹脂、および花蜜を含む、植物によって産生された水溶液が含まれる。動物組織の抽出物と共に、苗条、葉、根、茎、および種子を含む任意の植物構造の水溶性または有機溶媒溶解性抽出物を含む植物抽出物もさらに含まれる。植物抽出物はまた、滲出液または排水に由来してもよい。
本発明は、生物活性非グリコシル化ヒトα-フェトプロテイン(ng.HuAFP)、ng.HuAFPをコードする核酸配列、およびng.HuAFPを産生する方法を特徴とする。本発明の方法には、細胞(例えば、原核細胞(例えば大腸菌)または真核細胞(例えば、酵母細胞(例えば、ピチア・パストリス)もしくは哺乳類細胞))におけるng.HuAFPの産生が含まれる。ng.HuAFPを産生するために用いることができる原核細胞においてrHuAFPを産生する方法は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,384,250号および同第6,331,611号に認められうる。哺乳類細胞においてng.HuAFPを産生するために用いることができる方法は、米国特許出願第09/936,020号において認められうる。様々な哺乳類発現系および哺乳類細胞において組換えタンパク質を発現させる方法に関する詳細な記述は、Ausubelら(「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons, Inc., New York, pp.16.12.1〜16.20-16およびA.5.23-A.5.30, 1997)に提供される。
乳腺組織におけるng.HuAFPトランスジーン発現のための有用なプロモーターには、乳汁タンパク質のような乳腺特異的タンパク質の発現を天然に促進するプロモーターが含まれるが、乳汁中へのトランスジーン産物の分泌を可能にする如何なるプロモーターも用いてもよい。これらには、乳清酸性タンパク質(WAP)、αS1-カゼイン、αS2-カゼイン、βカゼイン、κカゼイン、β-ラクトグロブリン、およびα-ラクトアルブミンの発現を天然に指示するプロモーターが含まれる(例えば、Drohanら、米国特許第5,589,604号;Meadeら、米国特許第4,873,316号;およびKaratzasら、米国特許第5,780,009号を参照されたい)。
乳腺組織におけるng.HuAFPの発現にとって有用なプロモーターには、乳タンパク質のような乳腺特異的ポリペプチドの発現を本来促進するプロモーターが含まれるが、ng.HuAFPを乳汁に分泌させる如何なるプロモーターも用いることができる。これらには、例えば乳清酸性タンパク質(WAP)、αS1-カゼイン、α-S2カゼイン、βカゼイン、κカゼイン、β-ラクトグロビン、α-ラクトアルブミン(例えば、Drohanら、米国特許第5,589,604号;Meadeら、米国特許第4,873,316号;およびKaratzasら、米国特許第5,780,009号を参照されたい)の発現を本来指示するプロモーター、ならびに米国特許第5,750,172号に記載のプロモーターが含まれる。齧歯類における主要な乳清タンパク質である乳清酸性タンパク質(WAP;Genbankアクセッション番号X01153)は、妊娠後期および授乳期の乳腺において唯一高レベルで発現される(Hobbsら、J. Biol. Chem. 257:3598〜3605, 1982)。望ましい乳腺特異的プロモーターに関するさらなる情報に関しては、例えば、Richardsら、J. Biol. Chem. 256:526〜532, 1981(α-ラクトアルブミンラット);Campbellら、Nucleic Acids Res. 12:8685〜8697, 1984(ラットWAP);Jonesら、J. Biol. Chem. 260:7042〜7050, 1985(ラットβカゼイン);Yu-Lee & Rosen、J. Biol. Chem. 258:10794〜10804, 1983(ラット、γカゼイン);Hall、Biochem. J. 242:735〜742, 1987(ヒトα-ラクトアルブミン);Stewart、Nucleic Acids Res. 12:3895〜3907, 1984(ウシα-slおよびκカゼインcDNA);Gorodetskyら、Gene 66:87〜96, 1988(ウシβカゼイン);Alexanderら、Eur. J. Biochem. 178:395〜401, 1988(ウシκカゼイン);Brignonら、FEBS Lett. 188:48〜55, 1977(ウシαS2-カゼイン);Jamiesonら、Gene 61:85〜90, 1987;Ivanovら、Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369:425〜429, 1988、およびAlexanderら、Nucleic Acids Res. 17:6739, 1989(ウシβ-ラクトグロビン);およびVilotteら、Biochimie 69:609〜620, 1987(ウシαラクトアルブミン)を参照されたい。様々な乳タンパク質遺伝子の構造および機能は、Mercier & Vilotte、J. Dairy Sci. 76:3079〜3098, 1993によって論評されている。発現を最適化するためにさらなる隣接配列が有用である場合、そのような配列はプローブとして既存の配列を用いてクローニングすることができる。異なる生物からの乳腺特異的調節配列は、プローブとして公知の同源のヌクレオチド配列または同源のタンパク質に対する抗体を用いて、そのような生物からのライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
トランスジェニック構築物は通常、マイクロインジェクション(Ogataら、米国特許第4,873,292号)によって細胞に導入される。次に、マイクロインジェクションした胚を適当な雌性動物に移入すると、トランスジーンが組み入れられた胚の発達段階に応じて、トランスジェニックまたはキメラ動物が出生する。キメラ動物を交配させて、真の生殖系列トランスジェニック動物を作製することができる。
候補トランスジェニック動物を作製した後、その細胞がトランスジーンを含み、発現する動物を検出するために、それらをスクリーニングしなければならない。動物組織におけるトランスジーンの有無は、典型的に、サザンブロット分析または候補トランスジェニック動物からのDNAのPCR増幅を用いることによって検出される(例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons, New York, NY, 1988;同様にLubonら、米国特許第5,831,141号を参照されたい)。乳汁、尿、血液、またはリンパにおけるng.HuAFPの発現は、如何なる標準的な免疫学的アッセイ、例えば、ヒトAFPに対する抗体を用いるELISAまたはウェスタンブロッティング分析によって決定してもよい(例えば、Murgitaら、米国特許第5,384,250号およびAusubelら、上記を参照されたい)。乳汁中でのトランスジーンコードタンパク質のELISAに基づく検出の実際の例に関しては、米国特許第5,589,604号を参照されたい。
藻類、樹木、鑑賞植物、温帯果樹、熱帯果樹、野菜、マメ科植物、十字花科植物、単子葉植物、双子葉植物、または商業的もしくは農業的に重要な任意の植物が含まれるがこれらに限定されない、多くの任意の植物宿主を用いて、本発明の構築物を用いてng.HuAFPを産生することができる。適した植物種の特定の例には、針葉樹、ペチュニア、トマト、ジャガイモ、タバコ、レタス、ヒマワリ、菜種、亜麻、ワタ、テンサイ、セロリー、ダイズ、アルファルファ、ハス、キュウリ、ニンジン、ナス、カリフラワー、西洋ワサビ、アサガオ、ポプラ、クルミ、リンゴ、ブドウ、アスパラガス、コメ、トウモロコシ、キビ、タマネギ、オオムギ、カモガヤ、オート麦、ライ麦、コムギ、トウモロコシ、アルファルファ、芝草、栄養増殖が可能な水生植物、アカウキクサ、フローティングライス、ホテイアオイ、スイカ、水中で増殖する顕花植物、ならびにシロイヌナズナ、ウマゴヤシ、ササゲ、イチゴ、ハス、オノブリキス、ジャジクソウ、トリゴネラ、ミカン、アマ、ゼラニウム、キャッサバ、ニンジン、アブラナ、ダイコン、カラシ、ロウトウ、トウガラシ、ヒヨス、トマト、タバコ、ナス、ペチュニア、ジギタリス、マジョラナ、シオホリウム、ヒマワリ、レタス、イヌムギ、キンギョソウ、ヘテロカリス、ネメシア、ペラルゴニウム、キビ、チカラシバ、ラナンキュラス、キオン、サルピグロッシス、キュウリ、ブロワリア、ダイズ、ライグラス、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、またはチョウセンアサガオ属の種が含まれるがこれらに限定されない。
様々な植物プロモーターが、米国特許第5,391,725号;同第5,536,653号;同第5,589,583号;同第5,608,150号;同第5,898,096号;同第6,072,050号;同第6,184,440号、および同第6,331,663号のような様々な特許に記述されているように、異なる植物から同定および単離されている。望ましい植物プロモーターには、強い、非組織または発達特異的植物プロモーター(例えば、多くのまたは全ての植物組織タイプにおいて強く発現するプロモーター)が含まれる。望ましい植物プロモーターには、実質的に全ての植物組織において高レベルでの発現を可能にするカリフラワーモザイクウイルス35S(CaMV 35S)および19S(CaMV 19S)遺伝子プロモーターが含まれる(Benefeyら、Science 250:959〜966, 1990;Odellら、Nature 313:810〜812, 1985;Jensenら、Nature 321:669〜674, 1986;Jeffersonら、EMBO J. 6:3901〜3907, 1987;およびSandersら、Nuc. Acids Res. 14:1543〜1558, 1987)。CaMV35Sプロモーターにおいて、ドメインA(-90〜+8)によって付与される発現は、根組織において特に強いことが判明したが、ドメインB(-343〜-90)によって付与される発現は、種子および実生の子葉、ならびに胚軸の導管組織において最も強いように思われた(Benfeyら、EMBO J 8:2195〜2202, 1989)。その上、このプロモーターの活性は、CaMV 35Sプロモーターの複製によってさらに増加させる(すなわち2〜10倍)ことができる(例えば、Kayら、Science 236:1299, 1987;Owら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4870, 1987;およびFangら、Plant Cell 1:141, 1989を参照されたい)。
植物発現ベクターの構築によって、ベクターを宿主に導入して、それによってトランスジェニック植物を作製するためにいくつかの標準的な方法が利用可能である。一般的に、Methods in Enzymology Vol 153(「Recombinant DNA Part D」)1987、Wu and Grossman編、Academic Pressおよび欧州特許第693554号を参照されたい。これらの方法には、(1)アグロバクテリウム媒介形質転換(A.ツメファシエンスまたはA.リゾゲネス)(例えば、Lichtenstein and Fuller, 「Genetic Engineering」, vol 6, PWJ Rigby編、London, Academic Press, 1987;Lichtenstein C.P. and Draper, J、「DNA Cloning」, vol II, D.M. Glover編、Oxford, IRI Press, 1985;Horschら、Science 233:496〜498, 1984;およびFraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803, 1983を参照されたい);(2)粒子送達システム(例えば、Gordon-Kammら、Plant Cell 2:603, 1990;およびKleinら、Nature 327:70〜73, 1987;またはBioRad Technical Bulletin, 1687,上記を参照されたい);(3)マイクロインジェクションプロトコール(例えば、Greenら、上記を参照されたい);(4)ポリエチレングリコール(PEG)技法(例えば、Draperら、Plant Cell Physiol. 23:451, 1982;Paszkowskiら、EMBO J. 3:2712〜2722, 1984;およびZhang and Wu, Theor. Appl. Genet. 76:835, 1988を参照されたい);(5)リポソーム媒介DNA取り込み(例えば、Freemanら、Plant Cell Physiol. 25:1353, 1984を参照されたい);(6)電気穿孔プロトコール(例えば、Gelvinら、上記;Dekeyserら、上記;Frommら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985;Frommら、Nature 319:791, 1986;Sheen, Plant Cell 2:1027, 1990;およびJang and Sheen, Plant Cell 6:1665, 1994を参照されたい);ならびに(7)攪拌法(例えば、Kindle、上記を参照されたい)およびフローラルディップ法(例えば、Clough and Bent, Plant J. 16:735〜743, 1998を参照されたい)が含まれる。形質転換法は、本発明にとって重要ではない。効率的な形質転換を提供する如何なる方法を用いてもよい。穀物または他の宿主細胞を形質転換するためにより新しい方法が利用できれば、それらを直接応用してもよい。
植物発現ベクターによって形質転換した植物細胞は、標準的な植物組織培養技術に従って、例えば単細胞、カルス組織、または葉片から再生することができる。ほぼ如何なる植物からの様々な細胞、組織、および臓器も、首尾よく培養して植物全体を再生できることは当技術分野で周知である。そのような技術は例えば、Vasilら、上記;Greenら、上記;Weissbach and Weissbach、上記;Gelvinら、上記;Methods in Enzymology, vol 153, Wu and Grossman編、Academic Press, 1987;およびMethods in Enzymology, vol 118, Wu and Grossman編、Academic Press, 1987に記述される。培養プロトプラストからの植物再生は、Evansら、「Handbook of Plant Cell Cultures」1:124〜176, MacMillan Publishing Co, New York, 1983;Davey、Protoplasts(1983)- Lecture Proceedings, pp 12〜29, Birkhauser, Basal, 1983;Dale、Protoplasts(1983)- Lecture Proceedings, pp 31〜41, Birkhauser, Basel, 1983;およびBinding, Plant Protoplasts, pp.21〜73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記述される。
ng.HuAFPは、アフィニティクロマトグラフィーのような標準的なタンパク質精製技術(例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨーク州、1998を参照されたい;同様に、Lubonら、米国特許第5,831,141号も参照されたい)、またはタンパク質精製に関する当業者に既知の他の方法を用いて、トランスジェニック生物の生体液から精製してもよい。単離した後、ng.HuAFPは、望ましければ例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC;例えばFisher、「Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology.」、Work and Burdon編、Elsevier, 1980を参照されたい)によってさらに精製することができる。精製後、ng.HuAFPは少なくとも80%純粋、好ましくは90%純粋、より好ましくは95%純粋、および最も好ましくは99%純粋である。
トランスジェニック生物(例えば、哺乳類)の生体液(例えば、乳汁、尿、血液、またはリンパ)に分泌された、または生体液から精製されたng.HuAFPを、治療物質として用いてもよい。例えば、本発明の方法によって産生されたng.HuAFPを、癌細胞の増殖を阻害するために、骨髄細胞の増殖を誘導するために(例えば、骨髄移植後、または化学療法もしくは放射線治療のような骨髄毒性治療の実施後)、または免疫抑制剤として(例えば、自己反応性免疫細胞の増殖を阻害するため、移植された臓器の拒絶(例えば、移植片対宿主病)を阻害するため、またはリウマチ性関節炎、筋ジストロフィー、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、もしくはインスリン依存型真性糖尿病を治療するため)、それを必要とする患者に投与してもよい。
以下の実施例は本発明を説明することを意味する。実施例は本発明を如何なるようにも制限することを意味しない。
材料および方法
組換えDNA技法
組換えDNA技法は、Sambrook, Fritsch, and Maniatis(「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に従って行った。ゲノムおよびcDNAライブラリーを、ヒトAFP遺伝子(Genbankアクセッション番号#M16110)の開始(5')、中央、および末端(3')のコードエキソンに由来する放射標識オリゴヌクレオチドプローブによってスクリーニングした。これらの三つのプローブの配列を以下に示す:
ヒトAFPの遺伝子は、ほぼ19 kbに及び、イントロン14個が介在するエキソン15個(コード14個)を含む。ヒトAFP遺伝子の完全な配列は、Gibbsら(Biochemistry 26:1332〜1343, 1987)によって報告されており、Genbankアクセッション番号M16110に記載されている。遺伝子は当初、約15 kbの二つの断片においてクローニングされた後、これを混合すると、発現されたタンパク質が得られた。
を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うことによって得られる。
rHuAFPコード配列の長さに及ぶ重なり合う二つのλファージクローンを同定した。これらのファージインサートをその後の操作のためにsupercosベクターにサブクローニングした(図1、gtc913およびgtc912)。gtc913における開始ATGの上流の5'隣接領域からの余分の配列、およびgtc912における最後のエキソンの下流の余分の3'隣接配列を除去した。さらに、翻訳の効率的な開始を確実にするために、5'末端にコザック配列を加えた。これは、適当な配列をその後切除するために遺伝子配列に制限酵素「リンカー」を挿入して、隣接する配列を無傷のまま残すことによって行った(図1)。第二に、5'および3'小片を、二つのインサートに対して共通であってそれらを共に結合させて完全な遺伝子を形成させる酵素を用いて、それぞれのベクターから切除した。酵素BglIは、5'小片の3'末端で1回切断し、同時に3'小片の5'末端で1回切断することから、この酵素を用いた。得られた二つの断片をβ-カゼイン発現ベクター(GBC350)においてXhoI部位で結合させて、BC934を作製した。BC934の内部BlpI断片を個々に操作することによって、233位での通常のグリコシル化部位を、ギャップを有する変異誘発を用いてNからQに変化させた。次に、三つのBlpI断片を適切な方向に再度ライゲーションするとBC1055が得られた(図2Aおよび図2B)。
トランスジーンDNAは、SalIおよびNotI(New England Biolabs, Beverly, MA)によってプラスミドを完全に消化することによって、ベクター骨格から分離した。次に、消化物を、泳動緩衝液として1×TAE(Maniatisら、1982)を用いてアガロースゲルにおいて電気泳動した。発現カセットに対応するDNA断片を含むゲルの領域を、UV光(長波長)の下で可視化した。対象DNAを含むバンドを切除して、1×TAEにおける電気的溶出によってDNAを単離した。この技法をそれぞれの発現カセットに適用した。
核移入の場合、体細胞を胎児組織または皮膚生検から単離して、形質導入し、上記のようにさらに特徴を調べた。rHuAFPまたはng.HuAFP構築物を含む形質導入および特徴付けした体細胞を、核移入技法において用いるために培養した。雄性前核に、マイクロインジェクション緩衝液において希釈したDNAをマイクロインジェクションした。
マウスの尾の組織からプロテナーゼK消化の後にNaCl抽出およびエタノール沈殿によってゲノムDNAを単離して、トランスジーンに限って存在するβ-カゼイン/α-フェトプロテイン結合DNA配列を検出するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって分析した。ヤギの耳組織および白血球を同様に処理したが、DNAは、飽和エタノール、フェノール:イソアミルアルコール、およびクロロホルムによって連続的に抽出した後、エタノール沈殿を行った。PCR反応に関して、ゲノムDNA約250 ngを、Taqポリメラーゼ1.0単位を含むPCR緩衝液(20 mMトリス、pH 8.3、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、100 mMデオキシヌクレオチド三燐酸、および濃度600 nMの各プライマー)50 mlにおいて希釈して、標準的なPCRサイクリング条件を用いてMJ Research DNA Engineにおいて増幅した。以下のプライマーをPCR反応において用いた:
ゲノムDNA 5 μgをEcoRI 100単位によって消化した後、0.8%アガロースゲルによって電気泳動を行った。次に、ゲルを0.4 N NaOHにおいて毛細管作用によって荷電ナイロンメンブレン(Genescreen Plus、New England Nuclear)にブロットして、UVクロスリンクした(Stratalinker, Stratagene)。20 μg/ml変性ニシン精子DNAを含むハイブリダイゼーション緩衝液(5×SSC、50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、20 mM燐酸ナトリウム、1×デンハルト溶液、0.5%SDS)においてプレハイブリダイゼーションした後、プローブを加えて、ブロットを42℃で一晩インキュベートした。ブロットを以下のように洗浄した:1×SSC、1%SDSにおいて室温で20分間を1回、0.5×SSC、0.5×SDSにおいて室温で20分間を1回、および0.1×SSC、0.1%SDSにおいて65℃で各20分間を3回。洗浄後、ブロットをオートラジオグラフした。
Harlow and Lane(「Antibodies:A Laboratory Manual」、Cold Spring Laboratory, 1988)のイムノブロッティング技法を、タンパク質の免疫学的検出のために用いた。乳汁試料をPBSにおいて1:20倍希釈した後、2×SDSゲルローディング緩衝液(50 mMトリス塩酸、pH 6.8、2%SDS、10%グリセロール、10%β-メルカプトエタノール)と1:1混合して、65℃で2分間加熱して、SDS-PAGEを行った。ゲルにおけるタンパク質を、転写緩衝液(50 mMトリス、380 mMグリシン、0.1%SDS、20%メタノール)においてエレクトロブロッティングによってImmobilon Pメンブレンに転写した。免疫染色の場合、メンブレンをブロッキング緩衝液(0.01%Tween-20を含むPBS中に4%脱脂粉乳、BioRad, Hercules, CA)と共に室温(RT)で1時間インキュベートした。次にメンブレンを抗hAFP抗体(ブロッキング緩衝液において1:5000)と共にRTで1時間インキュベートした。dH2Oにおいて手短に3回洗浄した後、メンブレンを二次抗体(ブロッキング緩衝液において1:10000)と共にRTで1時間インキュベートした。次に、メンブレンをdH2Oにおいて各4分間を3回洗浄して、PBS/Tween-20において1回洗浄し、最後にdH2Oにおいて6回またはそれ以上洗浄した後、化学発光基質(ECL)によって発色した後オートフルオログラフィーを行った。
ゲノム構築物BC1055に由来するトランスジェニック雌性マウスを、PCRによって同定し、表1に記載する。これらの動物の乳汁をウェスタンブロットによって分析し、既知濃度のhAFP標準物質との比較によって発現レベルを推定した。この発現分析の結果を表1および表2、ならびに図3(rHuAFP)および図4(ng.HuAFP)に示す。発現分析は通常、トランスジーンの伝幡およびモザイク性に関して試験するために、最初の創始動物の第二世代雌性動物について行う。第二世代における発現レベルの減少は、多数のトランスジーン組み込み部位の分離によると考えられ、これらの症例ではより低い発現部位が次世代に受け継がれた。
ヤギ胎児線維芽細胞を、妊娠したヤギのヤギ胎児組織から単離した(Genzyme Transgenic Corporation)。ng.HuAFPトランスジーン(BC1055)のDNA断片およびネオマイシン耐性遺伝子を調製して、トランスジーンDNA断片1〜2 μg/細胞106個を、リポフェクタミンを用いてヤギ胎児線維芽細胞に同時形質導入した。ネオマイシン耐性細胞のコロニーをG418選択後に単離した。単離したクローンを増殖させて、選択した細胞株を凍結保存した。これらの細胞株に、トランスジーンの有無を決定するために、BC1055特異的プライマーを用いてPCR分析を行った。さらに、細胞株のFISH分析を行って、トランスジーンの組み込みを確認した(下記を参照されたい)。
トランスジェニックヤギは、原核細胞DNAを含まずに精製されたヤギβ-カゼイン-HuAFPの15.1 kb断片を、10 mMトリス、pH 7.5、0.1 mM EDTAにおいて1.0 μg/mlの濃度で、採取した胚の前核に注入することによって作製した。次に、注入した胚をレシピエント雌性動物に移入した。トランスジーンの有無を検出するために、血液からのゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびサザンブロット分析によって分析することによって、創始(F0)トランスジェニックヤギを同定した。PCR分析に関して、HuAFP cDNAを作製するために用いた同じ二つのオリゴヌクレオチドを反応において用いた。サザンブロット分析の場合、DNAを1%TBEアガロースゲルにおいて分画して、ニトロセルロースにブロットし、ランダムプライミングした32P-標識1.8 kb HuAFP cDNAによってプロービングした。同定された創始動物を非トランスジェニック動物と交配させて、トランスジェニック子孫を作製することができる。または、上記のようにトランスジェニック子孫を核移入によって得てもよい。トランスジーンの伝幡は、上記のように血液および他の組織からのゲノムDNAを分析することによって検出することができる。
健康な雌性ヤギ(F093)は2002年3月11日に生まれた。このヤギがng.HuAFPトランスジーンを有するか否かを決定するために、血液および耳の組織のPCR分析を行った。最初に二つのPCRプライマー組を同時に用いた。第一の組は、図5のダイアグラムに示すように、トランスジーンに対して特異的であり、得られた332 bpの産物は5'β-カゼインおよび5'ng.HuAFP配列の接合部に及ぶ。第二のプライマー組は、トランスジーン構築物には存在しないヤギβ-カゼインのエキソン7を認識して、439 bpの産物を生じる。図6Aおよび6Bは、ng.HuAFPトランスジーンが、ヤギF093の血液および耳の試料の双方に存在することを示している。予め特徴を調べてある形質導入細胞株を陽性対照として用いた。ng.HuAFPトランスジーンを有することが示されている流産児からの耳組織も同様に、陽性対照として用いた。
標準的な培養および調製技法を用いて、ヤギF093の培養血リンパ球から分裂中期および間期核を得た。核をスライドガラスに載せて、ヒトAFPに関するゲノム配列の8 kbを含む構築物に由来するジゴキシゲニン標識プローブとハイブリダイズさせた。結合したプローブを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体を用いて増幅し、チラミド結合フルオレセインイソチオシアネート(FITC、緑色蛍光色素)によって検出した。核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、青色色素)によって対比染色した。FISH画像はMetaMorphソフトウェアを用いて得た。
12月齢またはそれより大きい雌性動物を、ホルモン療法および手での刺激によって12日間にわたって乳汁分泌するように誘導する。最初の4日間、動物に、100%エタノールに溶解した0.1 mg/kgエストラジオール17-βおよび0.25 mg/kgプロゲステロンの皮下注射を行う。この1日量を朝および夕方の注射に分割する。乳房を1日1回触診して、毎朝5〜10分間乳首を手で刺激する。乳汁分泌トランスジェニック雌性動物を1日2回手で搾乳して、乳汁を-20℃で凍結保存する。
rHuAFPまたはng.HuAFPを含むトランスジェニックヤギ乳汁を、接線流濾過によって透明にして、カゼインミセルおよび他の混入タンパク質を除去した。得られたrHuAFPまたはng.HuAFPを含む濾液(乳清分画)を22 μmフィルターによって濾過する。20 mMイミダゾール、pH 6.7の等量を加えることによってpHおよびイオン強度を調節して、rHuAFPまたはng.HuAFPを、20 mMイミダゾール、pH 6.7によって平衡にしたPharmacia Blue SEPHAROSE(登録商標)6ファストフロービーズを含むカラムの中に溶液を通過させることによって、乳清分画から精製する。流出液におけるrHuAFPまたはng.HuAFPを、20 mMイミダゾール、pH 6.7によって平衡にしたPharmacia Q HPビーズを含むカラムによって捕獲する。rHuAFPまたはng.HuAFPは、pH 6.7の20 mMイミダゾールにおいて0〜250 mM NaClの勾配によって溶出する。ウェスタンブロット、ELISA、またはクーマシーブルー染色SDS-PAGEゲルによって決定したrHuAFPまたはng.HuAFPを含む分画をプールして、NaCl濃度を725 mMに調節する。これらのプールされた分画を、1 M NaCl、20 mMイミダゾール、pH 6.7によって平衡にしたPharmacia Phenyl HiSubビーズを含むカラムに適用する。rHuAFPまたはng.HuAFPをpH 6.7の20 mMイミダゾールにおいて1〜10 mM NaClの勾配によって溶出する。ウェスタンブロット、ELISA、またはクーマシーブルー染色SDS-PAGEゲルによって決定したrHuAFPまたはng.HuAFPを含む分画をプールして、限外濾過によって濃縮する。
以降に記載する刊行物は、組換えタンパク質を乳汁に分泌するトランスジェニック動物の作製、検出、および分析と共に、組換えタンパク質の精製に関して記述している。これらの刊行物は参照により本明細書に組み入れられる:Hurwitzら、米国特許第5,648,243号(ヤギ);Meadeら、米国特許第5,827,690号(ヤギ);DiTullioら、米国特許第5,843,705号(ヤギ);Clarkら、米国特許第5,322,775号(ヒツジ);Garnerら、米国特許第5,639,940号(ヒツジ);Deboerら、米国特許第5,633,076号(ウシ);およびDrohanら、米国特許第5,589,604号(ブタおよびマウス)。参照により本明細書に組み入れられる、Kerrら、Nat. Biotechnol. 16:75〜79、1998は、組換えタンパク質を尿中に排泄するトランスジェニック動物の作製および分析と共に、組換えタンパク質の精製に関して記述している。
Claims (76)
- 非グリコシル化ヒトα-フェトプロテイン(ng.HuAFP)またはその非グリコシル化断片をコードする核酸分子。
- 配列番号:5に記載される配列の45〜1874位のヌクレオチドを含む、請求項1記載の核酸分子。
- (i)ng.HuAFPをコードする核酸配列、
(ii)該ng.HuAFPコード配列に機能的に結合し、且つng.HuAFPの発現を可能にするプロモーター、および
(iii)細胞による該ng.HuAFPの分泌を可能にするタンパク質分泌シグナルをコードするリーダー配列
を含む、核酸分子。 - 細胞が大腸菌である、請求項3記載の核酸分子。
- 細胞が真核細胞である、請求項3記載の核酸分子。
- 真核細胞が酵母細胞または動物細胞である、請求項5記載の核酸分子。
- 動物細胞がトランスジェニック動物に存在する、請求項6記載の核酸分子。
- トランスジェニック動物が哺乳類である、請求項7記載の核酸分子。
- 哺乳類が、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、またはラマである、請求項8記載の核酸分子。
- 細胞が、トランスジェニック動物における生体液産生細胞であり、プロモーターが、該生体液産生細胞においてng.HuAFPの発現を可能にし、かつリーダー配列が、トランスジェニック動物の生体液中への該ng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項3記載の核酸分子。
- 生体液が、乳汁、尿、血液、またはリンパである、請求項10記載の核酸分子。
- 細胞が、トランスジェニック動物に存在し、プロモーターが、該動物の乳汁産生細胞におけるng.HuAFPの発現を可能にする乳汁特異的プロモーターであり、かつリーダー配列が、該動物の乳汁中への該ng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項3記載の核酸分子。
- 細胞が、トランスジェニック動物に存在し、プロモーターが、該動物の尿産生細胞におけるng.HuAFPの発現を可能にする尿特異的プロモーターであり、かつリーダー配列が、該動物の尿中への該ng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項3記載の核酸分子。
- 細胞が、トランスジェニック動物に存在し、プロモーターが、該動物の血液産生細胞におけるng.HuAFPの発現を可能にする血液特異的プロモーターであり、かつリーダー配列が、該動物の血液中への該ng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項3記載の核酸分子。
- 細胞が、トランスジェニック動物に存在し、プロモーターが、該動物のリンパ産生細胞におけるng.HuAFPの発現を可能にするリンパ特異的プロモーターであり、かつリーダー配列が、該動物のリンパ中への該ng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項3記載の核酸分子。
- 配列番号:4の233位でグルタミン残基を含む非グリコシル化HuAFP(ng.HuAFP)。
- 配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 非グリコシル化ヒトα-フェトプロテインの実質的に純粋な生物活性断片。
- 断片が、配列番号:15(ドメインII)、配列番号:16(ドメインI+II)、または配列番号:17(ドメインII+III)に記載のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の二つもしくはそれ以上を含む、請求項18記載のポリペプチド。
- ng.HuAFPを発現して生体液中に分泌する非ヒトトランスジェニック真核生物。
- トランスジェニック生物が哺乳類である、請求項20記載のトランスジェニック生物。
- 哺乳類が、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、またはラマである、請求項21記載のトランスジェニック生物。
- 生体液が、乳汁、尿、血液、またはリンパである、請求項21記載のトランスジェニック生物。
- ng.HuAFPが、
(i)ng.HuAFPをコードする核酸配列、
(ii)該ng.HuAFPコード配列に機能的に結合して、かつ生体液中にタンパク質を分泌するトランスジェニック生物の細胞によるng.HuAFPの発現を可能にするプロモーター、および
(iii)該トランスジェニック生物の細胞による該生体液中への該ng.HuAFPの分泌を可能にするタンパク質分泌シグナルをコードするリーダー配列
を含むトランスジーンから発現される、請求項21記載のトランスジェニック生物。 - プロモーターが、乳汁、尿、血液、またはリンパ特異的プロモーターであって、かつリーダー配列が、それぞれ、乳汁、尿、血液、またはリンパ中へのng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項24記載のトランスジェニック生物。
- プロモーターが、乳汁特異的プロモーターであって、かつリーダー配列が、乳汁中へのng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項24記載のトランスジェニック生物。
- トランスジェニック生物がヤギである、請求項26記載のトランスジェニック生物。
- プロモーターが、尿特異的プロモーターであって、かつリーダー配列が、尿中へのng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項24記載のトランスジェニック生物。
- 哺乳類がヤギである、請求項28記載のトランスジェニック生物。
- プロモーターが、血液特異的プロモーターであって、かつリーダー配列が、血液中へのng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項24記載のトランスジェニック生物。
- 哺乳類がヤギである、請求項30記載のトランスジェニック生物。
- プロモーターが、リンパ特異的プロモーターであって、かつリーダー配列が、リンパ中へのng.HuAFPの分泌を可能にする、請求項24記載のトランスジェニック生物。
- 哺乳類がヤギである、請求項32記載のトランスジェニック生物。
- ng.HuAFPを含む非ヒト哺乳類の乳汁。
- ng.HuAFPが可溶性であり、かつトランスジェニック非ヒト哺乳類によって産生され、該トランスジェニック非ヒト哺乳類の乳汁産生細胞が、
(i)ng.HuAFPをコードする核酸配列、
(ii)該ng.HuAFPコード配列に機能的に結合する乳汁特異的プロモーター、および
(iii)該哺乳類の乳汁中への該乳汁産生細胞による該ng.HuAFPの分泌を可能にするタンパク質分泌シグナルをコードするリーダー配列
を含むトランスジーンを発現する、請求項34記載の乳汁。 - ng.HuAFPを含む非ヒト哺乳類の尿。
- ng.HuAFPが可溶性であり、かつトランスジェニック非ヒト哺乳類によって産生され、該トランスジェニック非ヒト哺乳類の尿産生細胞が、
(i)ng.HuAFPをコードする核酸配列、
(ii)該ng.HuAFPコード配列に機能的に結合する尿特異的プロモーター、および
(iii)該哺乳類の尿中への該尿産生細胞による該ng.HuAFPの分泌を可能にするタンパク質分泌シグナルをコードするリーダー配列
を含むトランスジーンを発現する、請求項36記載の尿。 - ng.HuAFPを含む非ヒト哺乳類の血液。
- ng.HuAFPが可溶性であり、かつトランスジェニック非ヒト哺乳類によって産生され、該トランスジェニック非ヒト哺乳類の血液産生細胞が、
(i)ng.HuAFPをコードする核酸配列、
(ii)該ng.HuAFPコード配列に機能的に結合する血液特異的プロモーター、および
(iii)該哺乳類の血液中への該血液産生細胞による該ng.HuAFPの分泌を可能にするタンパク質分泌シグナルをコードするリーダー配列
を含むトランスジーンを発現する、請求項38記載の血液。 - ng.HuAFPを含む非ヒト哺乳類のリンパ。
- ng.HuAFPが可溶性であり、かつトランスジェニック非ヒト哺乳類によって産生され、該トランスジェニック非ヒト哺乳類のリンパ産生細胞が、
(i)ng.HuAFPをコードする核酸配列、
(ii)該ng.HuAFPコード配列に機能的に結合するリンパ特異的プロモーター、および
(iii)該哺乳類のリンパ中への該リンパ産生細胞による該ng.HuAFPの分泌を可能にするタンパク質分泌シグナルをコードするリーダー配列
を含むトランスジーンを発現する、請求項40記載の血液。 - 以下の段階を含む、ng.HuAFPを産生する方法:
(a)(i)配列番号:5に記載の核酸配列の45〜1874位のヌクレオチドを含むng.HuAFPをコードする核酸分子、
(ii)該ng.HuAFPコード分子に機能的に結合して、かつ細胞による該ng.HuAFPの発現を可能にするプロモーター、および
(iii)該細胞による該ng.HuAFPの分泌を可能にするタンパク質分泌シグナルをコードするリーダー配列
を含むトランスジーンを形質導入された細胞を提供する段階;ならびに
(b)該ng.HuAFPを発現かつ分泌する該形質導入細胞を増殖させる段階。 - 細胞が大腸菌である、請求項42記載の方法。
- 細胞が真核細胞である、請求項42記載の方法。
- 真核細胞が酵母細胞または動物細胞である、請求項44記載の方法。
- 酵母細胞がピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項45記載の方法。
- 細胞がng.HuAFPを細胞培養培地中に分泌する、請求項43記載の方法。
- 動物細胞が、乳汁産生細胞、尿産生細胞、血液産生細胞、またはリンパ産生細胞である、請求項45記載の方法。
- 以下の段階を含む、ng.HuAFPを産生する方法:
(a)(i)配列番号:5に記載の核酸配列の45〜1874位のヌクレオチドを含むng.HuAFPをコードする核酸分子、
(ii)該ng.HuAFPコード分子に機能的に結合して、トランスジェニック生物の生体液産生細胞におけるng.HuAFPの発現を可能にするプロモーター、および
(iii)該生体液産生細胞による該rHuAFPの分泌を可能にするタンパク質分泌シグナルをコードするリーダー配列
を含むトランスジーンを含む、トランスジェニック生物を提供する段階;ならびに
(b)該トランスジェニック生物から該ng.HuAFPを含む生体液を回収する段階。 - 生体液が、乳汁、尿、血液、またはリンパである、請求項49記載の方法。
- 生体液が乳汁である、請求項50記載の方法。
- ng.HuAFPが乳汁から精製される、請求項51記載の方法。
- プロモーターが、トランスジェニック生物の乳汁産生細胞におけるng.HuAFPの発現を可能にする乳汁特異的プロモーターである、請求項49記載の方法。
- 生体液が尿である、請求項50記載の方法。
- ng.HuAFPが尿から精製される、請求項54記載の方法。
- プロモーターが、トランスジェニック生物の尿産生細胞におけるng.HuAFPの発現を可能にする尿特異的プロモーターである、請求項49記載の方法。
- 生体液が血液である、請求項50記載の方法。
- ng.HuAFPが血液から精製される、請求項57記載の方法。
- プロモーターが、トランスジェニック生物の血液産生細胞におけるng.HuAFPの発現を可能にする血液特異的プロモーターである、請求項49記載の方法。
- 生体液がリンパである、請求項50記載の方法。
- ng.HuAFPがリンパから精製される、請求項60記載の方法。
- プロモーターが、トランスジェニック生物のリンパ産生細胞におけるng.HuAFPの発現を可能にするリンパ特異的プロモーターである、請求項49記載の方法。
- ng.HuAFPを含む細胞培養培地から精製されたng.HuAFPの治療的有効量を患者に投与する段階を含む、ng.HuAFPを必要とする患者を治療する方法。
- ng.HuAFPを含む非ヒト哺乳類の乳汁の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、ng.HuAFPを必要とする患者を治療する方法。
- ng.HuAFPを含む非ヒト哺乳類の生体液から精製されたng.HuAFPの治療的有効量を患者に投与する段階を含む、ng.HuAFPを必要とする患者を治療する方法。
- 生体液が、乳汁、尿、血液、またはリンパである、請求項65記載の方法。
- 配列番号:8記載のアミノ酸配列を含むng.HuAFPを含む、治療的組成物。
- 免疫障害を治療するための医薬品の製造における、配列番号:8記載のアミノ酸配列を含むng.HuAFPの使用。
- 免疫障害がHIVである、請求項68記載の使用。
- 自己免疫障害を治療するための医薬品の製造における、配列番号:8記載のアミノ酸配列を含むng.HuAFPの使用。
- 自己免疫障害が、リウマチ性関節炎、筋ジストロフィー、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、多発性硬化症、インスリン依存性真性糖尿病、または乾癬である、請求項70記載の使用。
- 免疫抑制剤の製造における、請求項8記載のアミノ酸配列を含むng.HuAFPの使用。
- 免疫抑制剤が、自己反応性免疫細胞増殖または移植片対宿主病を阻害または治療する、請求項72記載の使用。
- 化学療法または放射線療法の副作用を緩和するための医薬品の製造における、請求項8記載のアミノ酸配列を含むng.HuAFPの使用。
- 細胞増殖を増強するための医薬品の製造における、請求項8記載のアミノ酸配列を含むng.HuAFPの使用。
- 細胞がng.HuAFPを細胞培養培地中に分泌する、請求項44記載の方法。
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