JP2006514839A - 移植用軟骨組織 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、移植可能な骨軟骨のインプラントとそれを製造する方法に関する。本インプラントは、生体適合性のある足場材に付着した培養軟骨組織を含有する。本方法によれば、骨軟骨のインプラントは、軟骨の細胞間質が形成されるだけの時間、分離した軟骨形成細胞を試験管内で培養することで製造される。細胞間質と一体となった軟骨形成細胞は、培養軟骨組織の形成と培養軟骨組織の生体適合性のある足場材への付着との両方が可能な時間、成長因子の存在する生体適合性のある多孔質の足場材上であらかじめ培養される。
この構成と方法に有用な軟骨形成細胞は本質的にはこのタイプの細胞を有するどんな組織からも分離することができる。請求の範囲とここで用いられる用語「軟骨形成細胞」は、適当な刺激に曝されたとき、軟骨組織を特徴付ける成分を生成又は分泌する能力を持つよう分化できる全ての細胞を意味する。軟骨形成細胞は、例えば硝子軟骨、弾性軟骨、又は繊維軟骨のような軟骨組織から事前に直接的に分離することができる。具体的には、関節軟骨(荷重がかかる関節又は荷重がかからない関節のどちらも)、肋骨軟骨、鼻軟骨、耳軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨、環状軟骨、腱、靭帯、関節間軟骨と椎間板、及び、線維輪又は髄核のどちらでもから、軟骨形成細胞を分離することができる。腱細胞と靭帯細胞は、前十字検体又はアキレス腱のような具体的な供給源から分離することができる。
分離された軟骨細胞/軟骨形成細胞を、適当な培地内に、例えば少なくとも約104セル/ml、例えば、約2×104セル/ml、約4×104セル/ml、あるいは約6×104セル/mlの濃度で、浮遊させる。適当な培地には、アガロースやアルギン酸ナトリウムを含む溶液が含まれる。細胞は、生体で見られるような薄膜でバインドされたCMの生成を導く、球形構造が効果的に維持される状況で培養される。軟骨細胞は、CMの形成に効果のある期間、例えば、少なくとも5日間アルギナート内で培養される。軟骨細胞がアルギナート内で培養されるとき、軟骨細胞は球形構造(軟骨の典型的構造)を維持し、多量の培地を維持する。軟骨細胞が培養される培地には、ウシ胎仔血清や他の非相同の血清のような促進物質が、CMの生成を促進させるために、含まれていても良い。実施の形態において、外科的移植の予定移植対象者からあらかじめ採血した血液サンプルから作成しておいた、自系の血清を培地に含有させておくことができる。あるいは、移植対象の一卵性双生児のような同級体又は、動物が対象である場合に移植対象と同一の遺伝子型を持つ動物から血清を作成することもできる。移植可能な軟骨基質の生成のためアルギナート内での軟骨の分離生成については、米国特許6,197,061に開示されている。
アルギナート内の軟骨細胞の培養により区画、即ち、元の組織における細胞の周りの領域を定める基質に代謝的に似ているCM区画と元の組織の領域間基質に似た細胞から除去された基質区画、として組織される細胞外液基質(ECM)が生成される。
溶解性を高めたアルギナートビーズにより、効果的な培養期間を経てCMと培養された軟骨細胞の復元が、既知の技術によりなされる。結果として生じた細胞の懸濁液は遠心分離され、浮遊物中に残った基質成分がさらに取り除かれて、CMと軟骨成分がペレットに移される。
上述のように分離された軟骨細胞とCMとは、さらに生体適合性のある多孔質の足場材上で培養される(図1)。実施の形態においては、プラスティックの支持枠に支持された生体適合性のある多孔質の足場材を含む培養細胞挿入物は、培養環境を形成するために用いられる。培養媒体は、培養細胞挿入物の内外で培養細胞挿入物の周りに流れる。この実施の形態において、培養細胞挿入物は半透膜を具備する。半透膜は、軟骨細胞とそのCMとを実質的に効果的に浸漬させるだけの量の培地を培養細胞挿入物に浸透させる。
一般に、生体適合性のある足場材上に形成される軟骨基質は、少なくとも約5mg/cm3の濃度のアグリカンを有し、プロテオグリカン集合体に組み込まれる分子を新たに合成するのに効果的な量のヒアルロナンを含んでいる。本発明による方法で培養された軟骨は、物理化学的性質が、生来的に生成される軟骨に非常に似ており、通常約14日という短い期間で生成することができる。培養軟骨は半透膜から取り出される。
Claims (53)
- 移植可能な骨軟骨インプラントであって、
生物学的適合性のある足場材に付着させた培養軟骨組織を具備し、前記軟骨組織は、細胞間質(CM)を有する軟骨細胞を具備し、前記CMは、試験管内で軟骨形成細胞を培養することにより形成され、生体内で見られる細胞膜に類似し、
前記足場材は、多数の微細孔を具備し、天然の海綿骨、脱塩した天然の海綿骨、コラーゲン、及び骨代替材のうち少なくとも1つを具備するグループから選択される、移植可能な骨軟骨インプラント。 - 前記細胞は、試験管内のアルギナートビーズ中で培養される、請求項1に記載のインプラント。
- 前記骨代替材は、燐酸カルシウム又はヒドロキシアパタイトのうちの少なくともいずれか1つである、請求項1に記載のインプラント。
- 前記骨代替材は、少なくとも約2mmの厚さをもつ、請求項1に記載のインプラント。
- 前記CMは、アグリカン、コラーゲンタイプII、IX、及びXI、及びヒアルロナンのうちの少なくとも1つを具備する、請求項1に記載のインプラント。
- 前記軟骨組織は、少なくとも約5mg/cm3のアグリカンを具備する、請求項1に記載のインプラント。
- ヒアルロナンに対するアグリカンの比率は約10:1から約500:1である、請求項1に記載のインプラント。
- コラーゲンに対するアグリカンの比率は約1:10から約10:1である、請求項6に記載のインプラント。
- 前記生物学的適合性のある足場材の微細孔には生物学的適合性のある充填材が含まれ、当該充填材は、細胞が過度に成長して所定の制限深さを越えて前記足場材に入り込むことを防止する、請求項1に記載のインプラント。
- 前記生物学的適合性のある多孔性の足場材の微細孔には培地が含まれる、請求項9に記載のインプラント。
- 基礎となる前記足場材の末端に外側表面を持つ、請求項1に記載のインプラント。
- 前記足場材の微細孔は、前記外側表面から離れるにつれて孔の径が漸減又は漸増する、請求項11に記載のインプラント。
- 前記外側表面から離れた微細孔のほうが、前記外側表面に近い微細孔より大きい、請求項12に記載のインプラント。
- 軟骨形成細胞とCMは実質的に前記外側表面と結びついている、請求項11に記載のインプラント。
- 前記足場材内の細胞は、実質的に前記外側表面と結びついている、請求項11に記載のインプラント。
- 取り外し可能な半透膜のフィルタを持つ、請求項1に記載のインプラント。
- 前記生物学的適合性のある充填材は、精製されたヒアルロナン、コラーゲン、又はアルギナートのグループから選択されたもののうち少なくとも1つを具備する、請求項9に記載のインプラント。
- 前記生体適合性のある充填材は、粘度の高い液体又はゲルを具備する、請求項9に記載のインプラント。
- 前記軟骨形成細胞は、関節軟骨又は繊維軟骨から分離される、請求項1に記載のインプラント。
- 前記軟骨形成細胞は、軟骨細胞又は軟骨形成幹細胞が分化したものである、請求項1に記載のインプラント。
- 前記幹細胞は、胎盤、臍帯、骨髄、皮膚、筋肉、骨膜、脂肪、及び、軟骨膜から成るグループから選択された組織から得られる、請求項20に記載のインプラント。
- 前記軟骨形成細胞は、肋骨軟骨、鼻軟骨、耳軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨、及び環状軟骨から成るグループから選択された繊維軟骨から得られる、請求項20に記載のインプラント。
- 前記繊維軟骨は、腱、靭帯、関節間軟骨、及び椎間板のグループから選ばれる請求項19に記載のインプラント。
- 移植可能な骨軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法であって、
分離した軟骨形成細胞を、軟骨形成細胞間質(CM)の形成及びCMを含む培地から細胞を再生するのに有効な一定の時間培地の中に入れて培養する段階と、
多孔性の生体適合性のある足場材を、成長因子が存在するCMと共に培養軟骨組織の形成に有効な時間前記軟骨形成細胞と接触させ、前記生体適合性のある足場材に前記培養軟骨組織を付着させる段階と、
を具備する、移植可能な軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法。 - 前記足場材を接触させる前に、前記足場材の微細孔に生体適合性のある充填物質を充填する段階を具備する、請求項24に記載の方法。
- 半透膜を有するプラスティックの支持枠に、培養軟骨組織と足場材を挿入する段階を具備する、請求項24に記載の方法。
- 前記半透膜は、約5ミクロン又は約5ミクロン以下の孔径を持つ、請求項26に記載の方法。
- 前記半透膜は、少なくとも約8×105孔/cm2の孔密度を持つ、請求項26に記載の方法。
- 前記半透膜の構成は、ポリエチレンテレフタート、ポリカーボネイト、及びポリテトラフロールエチレンのグループから選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記成長因子は、骨形成たん白質、トランスフォーミング成長因子、及び、インスリン様成長因子 のグループから選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記成長因子は、インスリン様成長因子−1 (IGF-1)である、請求項23に記載の方法。
- 前記IGF-1が約50ng/mlから約200ng/ml存在する、請求項31に記載の方法。
- 前記CMは、ヒアルロナンに対するアグリカンの割合が約10:1から約200:1である、請求項24に記載の方法。
- 前記CMは、コラーゲンに対するアグリカンの割合が約1:10から約10:1である、請求項24に記載の方法。
- 請求項24乃至34のいずれか1項に記載の方法で生成された、移植可能な骨軟骨インプラント。
- 足場材を接触させる前記段階の後に、対象に外科的に前記インプラントを挿入する段階を具備する、請求項25乃至35のいずれか1項に記載の方法
- 対象を人間とする請求項36に記載の方法。
- 足場材を接触させる前記段階の前に、前記軟骨形成細胞及びCMを一定時間保存して安定させる段階を具備する、請求項24に記載の方法。
- 保存して安定させる前記段階の後に、前記軟骨形成細胞及び前記CMを医療施設に移送する段階を具備する、請求項38に記載の方法。
- 移植可能な骨軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法であって、
軟骨形成細胞間質(CM)の形成に有効な一定の時間培地の中に入れて培養し分離した軟骨形成細胞を提供する段階と、
多孔性の生体適合性のある足場材を、成長因子が存在するCMと共に培養軟骨組織の形成に有効な時間前記軟骨形成細胞と接触させ、生体適合性のある足場材に当該培養軟骨組織を付着させる段階と、
を具備する、移植可能な軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法。 - 足場材を接触させる前記段階の前に、培養された軟骨形成細胞及びCMを医療施設に移送する段階を具備する、請求項40に記載の方法。
- 足場材を接触させる前記段階は、医療施設にてなされる、請求項41に記載の方法。
- 損傷を受けた組織を外科的に復元して患者を治療するための骨軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法であって、
外科的に組織を切開する段階と、
前記試験管内で製造した請求項1に記載の培養軟骨組織を当該切開部に挿入する段階と、
を具備する、損傷を受けた組織を外科的に復元して患者を治療するための骨軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法。 - 損傷を受けた組織を外科的に復元して患者を治療するための骨軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法であって、
外科的に組織を切開する段階と、
前記試験管内で製造した請求項41に記載の培養軟骨組織を当該切開部に挿入する段階と、
を具備する、損傷を受けた組織を外科的に復元して患者を治療するための骨軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法。 - 前記損傷は、深刻な軟骨の損傷、軟骨の全層に及ぶ損傷、軟骨の部分的な損傷、骨軟骨の損傷、及び変性過程から成るグループから選択される、請求項43又は44に記載の方法。
- 前記試験管内で製造した請求項1に記載の骨軟骨組織を関節鏡を使って挿入する段階を具備する、損傷を受けた組織を外科的に復元して患者を治療するための骨軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法。
- 前記試験管内で製造した請求項1に記載の骨軟骨組織のインプラントで関節を治療する段階を具備する、骨関節炎、リューマチ性関節炎、離断性骨軟骨炎、又はその他の軟骨損傷により関節に障害を受けた患者を治療するための骨軟骨のインプラントを試験管内で製造する方法。
- 試験管内で骨軟骨組織を製造するためのキットであって、
生体適合性のある足場材と、
細胞が細胞間質を形成するのに適した軟骨形成細胞を培養するための培地と、
容器と、
使用説明書と
を具備する、試験管内で骨軟骨組織を製造するためのキット。 - 前記足場材は、天然の海綿骨、脱塩した天然の海綿骨、コラーゲン、及び骨代替材から成るグループのうちの少なくとも1つが選択される、請求項48に記載のキット。
- さらにアルギナートを含む、請求項48に記載のキット。
- 外科手術用に整えられた骨軟骨組織を製造するためのキットであって、
生体適合性のある足場材と、
細胞間質を含む培養軟骨形成細胞を具備するインプラントと、
容器と、
を具備する、外科手術用に整えられた骨軟骨組織を製造するためのキット。 - さらに、使用説明書を具備する、請求項51に記載のキット。
- さらに前記細胞を培養するための培地を具備する、請求項51に記載のキット
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