JP2006509779A - 細胞溶解物の医薬組成物ならびにその製造方法および使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、非生存細胞溶解物ならびに少なくとも１つの抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる医薬組成物に関する。細胞溶解物を含んでなる本発明の医薬組成物は、溶液または懸濁液または凍結乾燥物の形態であり、特に均質化された細胞溶解組成物は、溶液または懸濁液または凍結乾燥物の形態である。本発明は、医薬組成物の製造方法および使用をさらに開示する。
Description
発明の分野
本発明は、非生存細胞溶解物ならびに少なくとも１つの抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる医薬組成物に関する。細胞溶解物を含んでなる本発明の医薬組成物は、溶液または懸濁液または凍結乾燥物の形態であり、特に均質化された細胞溶解組成物は、溶液または懸濁液または凍結乾燥物の形態である。本発明は、医薬組成物の製造方法および使用をさらに開示する。
本発明は、非生存細胞溶解物ならびに少なくとも１つの抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる医薬組成物に関する。細胞溶解物を含んでなる本発明の医薬組成物は、溶液または懸濁液または凍結乾燥物の形態であり、特に均質化された細胞溶解組成物は、溶液または懸濁液または凍結乾燥物の形態である。本発明は、医薬組成物の製造方法および使用をさらに開示する。
背景技術
溶液または懸濁液の形態における細胞溶解物などの非生存細胞調製物の医薬組成物の製造では、しばしば、集結（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）および／または沈降（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を伴う問題に遭遇する。この問題は、製品の不均質性を生じ、特に製品を複数の容器に小分けしなければならない場合、質的または量的に不安定になる。さらに、それは、製品の複数のバッチ間での均質性の欠如を生じる。
溶液または懸濁液の形態における細胞溶解物などの非生存細胞調製物の医薬組成物の製造では、しばしば、集結（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）および／または沈降（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を伴う問題に遭遇する。この問題は、製品の不均質性を生じ、特に製品を複数の容器に小分けしなければならない場合、質的または量的に不安定になる。さらに、それは、製品の複数のバッチ間での均質性の欠如を生じる。
例えば、ケラチノサイト細胞溶解物、特に、培養されたヒトケラチノサイト細胞溶解物などの創傷治癒組成物の製造では、製造方法の均質化（溶解）工程後に、これらの溶液または懸濁液に含有される細胞溶解物の迅速な集結、凝集および部分的沈降が観察される。そのような集結、凝集および／または沈降は、細胞溶解物の溶液または懸濁液の均質性の欠如を生じ、そのプロセシングをさらに複雑にし、場合により、これは、その意図された目的のために組成物を不安定にさえし得る。従って、凝集または沈降を防止することによって均質化前後のプロセシング工程を援助することができる変更の必要性がある。
化学薬剤がタンパク質の凝集または集結を刺激し、沈殿を生じることは周知である。米国特許第４，５６５，６３５号は、凝集化アジュバントとして公知の水溶性化学薬剤「キサンタンガム」について記載している。同様に、米国特許第３，９５６，５１９号は、水溶液中のタンパク質の集結が、溶解された脱分岐型低ＤＥマルトデキストリンまたは脱分岐型アミロペクチンによって誘導される方法について記載している。製薬分野では、国際公開ＷＯ９５／０１７８２に記載のように、キサンタンガムは凍結乾燥された製薬錠剤の製造に利用されており、該文献では、キサンタンガムは液体混合物における顆粒治療剤の懸濁化を容易にし、分散物の品質および使用時の錠剤の質感に対する有害な影響を何ら有さない。
対照的に、米国特許第６，０１０，７１９号は、懸濁液の粘度を増加し、固体の薬物粒子の沈降を防止するのに適切である増粘剤としてのキサンタンガムの使用について記載している。同様に、キサンタンガムはまた、フローサイトメトリー中の細胞懸濁液の安定化し、それによって沈降を防止する目的のため、大きな生物学的粒子を懸濁するためにも使用されている（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １０：８０３−８０６（１９８９））。別の例は、キサンタンの存在は乳清タンパク質単離物の集結および偏析を阻害し、均質な混合物を生じたことを示す（Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ １２：４６９−４７９（１９９８））。
しかし、これらの例のすべては、細胞または特定のタンパク質の比較的簡単な無傷な（ｉｎｔａｃｔ）懸濁液に当てはまる。
一方、細胞溶解物は細胞の溶解物から生じ、これは多様な形態で多くの成分を放出し、タンパク質、糖タンパク質、多糖、脂質、核酸などの構成成分の極めて複雑な混合物を形成する。これらのすべての成分は、互いに相互反応し得、複雑な形成および凝集の可能性を有意に増加し、結局、非安定性の溶液または懸濁液およびこれらの成分の部分の沈降を生じる。
発明の概要
従って、細胞溶解物を含んでなる均質で安定な医薬組成物を提供する必要性が依然として存在することを理解することができる。そのような組成物の１つの例はケラチノサイト細胞溶解物を含有し、創傷治癒の目的に適する。均質化され、必要であれば乾燥または凍結乾燥によってさらに処理される溶液または懸濁液の形態の細胞溶解物のそのような医薬組成物を提供する必要性が依然としてさらに存在する。
従って、細胞溶解物を含んでなる均質で安定な医薬組成物を提供する必要性が依然として存在することを理解することができる。そのような組成物の１つの例はケラチノサイト細胞溶解物を含有し、創傷治癒の目的に適する。均質化され、必要であれば乾燥または凍結乾燥によってさらに処理される溶液または懸濁液の形態の細胞溶解物のそのような医薬組成物を提供する必要性が依然としてさらに存在する。
本発明は、細胞溶解物ならびに少なくとも１つの抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる医薬組成物に関する。
本発明は、乾燥または凍結乾燥形態の均質な医薬組成物をさらに提供する。
本発明は、細胞溶解物ならびに少なくとも１つの抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる医薬組成物を提供し、ここで、抗凝集剤および／または抗沈降剤はキサンタンガムである。
本発明は、抗凝集剤および／または抗沈降剤がキサンタンガムおよびマルトデキストリンの組み合わせである医薬組成物をさらに提供する。
さらに、医薬組成物は緩衝剤を含んでもよい。これに関して有用である緩衝剤の例として、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、または当該分野において公知の他の任意の適切な緩衝剤、好ましくは臨床的に許容可能な緩衝剤が挙げられる。
本発明は、実質的に不均質性が認められない溶液または懸濁液の形態の細胞溶解物の医薬組成物の製造方法をさらに提供する。そのような医薬組成物の例に、ケラチノサイト細胞溶解物の均質な凍結乾燥された医薬組成物がある。
本発明はまた、溶液または懸濁液の形態のケラチノサイト細胞溶解物の均質化され、滅菌された組成物の製造方法を提供する。
本発明の医薬組成物は、多様な治療アプリケーションに有用であることができ、医薬上許容されるキャリアまたはビヒクルまたは賦形剤を含んでなることができる。１つの例は、熱創傷または皮膚潰瘍などの創傷の処置に有用なケラチノサイト細胞溶解物の組成物である。
本発明は、創傷の治癒を促進するための医薬組成物を提供し、ここで、前記組成物は非生存ケラチノサイト溶解物および医薬上許容されるビヒクルを含んでなる。前記医薬上許容されるビヒクルは、乾燥粉体、懸濁液または溶液である。さらにこれに関して、前記医薬上許容されるビヒクルは、ゲル、クリーム、軟膏またはゲル以外の生体適合性マトリックスである。
本発明はまた、哺乳動物における治癒を促進するために表面創傷を処置するための方法を提供し、
（ａ）前記表面創傷に医薬組成物を適用する工程、および
（ｂ）前記表面創傷の治癒を促進する工程
を含んでなる。
（ａ）前記表面創傷に医薬組成物を適用する工程、および
（ｂ）前記表面創傷の治癒を促進する工程
を含んでなる。
本明細書において開示される本発明は、溶液もしくは懸濁液の形態、またはその凍結乾燥形態にある細胞溶解物の医薬組成物であり、実質的に不均質性が認められないことをさらに特徴とする。細胞溶解物のこの溶液もしくは懸濁液またはその凍結乾燥形態は、沈降しうる溶液または懸濁液中の凝集物の形成を防止するための抗凝集剤として作用するキサンタンガムおよび／またはマルトデキストリンを含んでなる。
本発明は、細胞を増殖させる工程、溶解する工程および乾燥する工程を含んでなる、均質化された医薬組成物の製造方法を開示し、該方法は溶解直後、抗凝集剤および／または抗沈降剤を添加して、細胞溶解混合物を安定化することを特徴とする。前記薬剤は、溶液または懸濁液において沈降しうる凝集物の形成を防止するキサンタンガムまたはキサンタンガムおよびマルトデキストリンの組み合わせである。さらに、この方法は、場合により、水を含まない製品を得るために、溶液もしくは懸濁液の凍結乾燥工程またはそうでなければ乾燥工程を含んでもよい。
発明の詳細な記載
本発明の医薬組成物は、溶液または懸濁液の形態にある細胞溶解物の組成物である。細胞溶解物を含有するこれらの医薬組成物は、緩衝成分ならびに少なくとも１つの抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる。これらの組成物は、凍結乾燥工程またはそうでなければ乾燥工程によってさらに処理してもよく、さらにより長期間安定である実質的に水を含まない製品を生じる。
本発明の医薬組成物は、溶液または懸濁液の形態にある細胞溶解物の組成物である。細胞溶解物を含有するこれらの医薬組成物は、緩衝成分ならびに少なくとも１つの抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる。これらの組成物は、凍結乾燥工程またはそうでなければ乾燥工程によってさらに処理してもよく、さらにより長期間安定である実質的に水を含まない製品を生じる。
本発明内において、用語「不均質性」は、溶解物の１つの部分の組成が溶解物の別の部分の組成とは異なり得るような方法で細胞溶解物の組成物が均質でない状況を指す。
用語「細胞溶解物」は、細胞を溶解することによって得られる非生存細胞懸濁物またはその画分を指す。本発明の溶液または懸濁液中細胞溶解物は、細胞全体、細胞の部分もしくは任意の画分または溶解工程後に得られるその混合物であってもよい。
細胞溶解物は、当業者に周知である多様な方法のいずれかによって得ることができる。例えば、細胞全体は、米国特許第６，１２６，９３５号明細書に記載のように得ることができる。細胞の部分は、細胞全体を溶解し、得られる溶解物を遠心分離に供することによって得ることができ、ここで、得られる細胞溶解物の所定の部分は、ペレット画分中にあり、得られる細胞溶解物の他の所定の部分は上清中にあって、２つの部分のうち一方のみが使用される。そのような方法の例は、米国特許第６，１２６，９３５号明細書に開示されている。
用語「細胞溶解」は、任意のタイプの細胞（即ち、原核細胞または真核細胞）を指し、おそらく生物学的構成成分の遊離を生じる化学的、生物学的、機械的もしくは熱処置を含み得る処置に供された（溶液または懸濁液の形態で存在する）細胞の細胞壁および／または細胞膜を破壊する作用に関与する。
溶解のための多数の機械的方法が開発され、公開されている。それらには、圧力、キャビテーション、音波または超音波、機械的振盪または破砕が含まれる（サドバ（Ｓａｄｅｖａ）、Ｂｉｏｐｈａｒｍ ７（２）：２６−３６、１９９４）。
細胞溶解物は、細胞を機械的に均質化することによって得ることができる。本発明のケラチノサイト細胞溶解物は、好ましくは、米国特許第６，１２６，９３５号明細書に記載の方法によって得ることができる。
本明細書で使用する用語である「均質化または均質にする」は、上述の混合物の所定の任意の部分が、同じ混合物の他の任意の部分と同じ組成および物理化学的特性を有することを確実にするような方法で、前記混合物を均質にすることによって、上記細胞溶解物を処理することを示す。均質化または均質にするという用語はまた、所定の均質化手順もまた細胞溶解をもたらすという意味の溶解を指す。
本発明の組成物中の細胞溶解物の濃度は、組成物中の細胞溶解物のタイプ、ならびにその意図される用途に従って変動する。これに関して、細胞溶解物の濃度は、０．０２〜５％ｗ／ｖの範囲である（百分率は、適切なタンパク質定量アッセイによって決定されるように、細胞溶解物中の総タンパク質の重量百分率を指す）。好ましくは、細胞溶解物の濃度は、０．０５〜２％ｗ／ｖの範囲である。より好ましくは、細胞溶解物の濃度は、０．１〜１％ｗ／ｖの範囲である。
本発明の溶液／懸濁液の液体成分は、溶液または懸濁液において細胞溶解物を支持するのに適切な任意の液体であることができる。そのような液体成分の例として、水、油、またはエマルジョン（例えば、油中水型または水中油型エマルジョン）および他の類似の液体が挙げられる。
本発明のケラチノサイト細胞溶解物の医薬組成物に関与する場合、（浸透圧調整のための）塩化ナトリウムの等張溶液、リン酸緩衝液および溶解された細胞の使用が考慮される。好ましくは、これは、以後の組成物の凍結乾燥のために添加する凍結防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（例えば、ショ糖、マルトデキストリン、グリシン、ソルビトール、トレハロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールもしくは他の任意の凍結防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）またはそれらの組み合わせ）およびクエン酸緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム）で補充される。
本発明の医薬組成物は、さらに、他の緩衝剤または緩衝系を含有することができる。そのような緩衝剤の例として、ｐＨ緩衝剤として作用することができるリン酸、クエン酸または他の任意の組成物を挙げることができる。
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの抗凝集剤および／または抗沈降剤を非生存細胞溶解物溶液または懸濁液の組成物に添加する前に、細胞を溶解する工程を含んでなる方法によって得られる医薬組成物に関与する。
特定の実施形態では、本発明は、細胞溶解物ならびに抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる医薬組成物を提供し、ここで、抗凝集／抗沈降剤はキサンタンガムである。
キサンタンガムは、商業的または発酵により得ることができる。本発明の細胞溶解物の医薬組成物におけるキサンタンガムの濃度は、０．００１〜５％ｗ／ｖ、より好ましくは、０．０１〜１％ｗ／ｖ、最も好ましくは、０．０５〜０．５％ｗ／ｖの範囲である。
特定の実施形態では、本発明は、ケラチノサイト細胞溶解物の医薬組成物に関与し、キサンタンガムの使用は、使用もしくはさらなるプロセシング前または中のケラチノサイト細胞溶解物溶液あるいは懸濁液における凝集および沈降を防止することを援助する。従って、溶液または懸濁液中の不均質性の形成が回避される。これは、創傷治癒において有用な組成物の形成、例えば、皮膚潰瘍もしくは火傷の処置のためのケラチノサイト細胞溶解物溶液または懸濁液のさらなるプロセシングおよび使用を容易にする。
特定の実施形態では、本発明は、細胞溶解物ならびに抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる医薬組成物を提供し、ここで、抗凝集／抗沈降剤はマルトデキストリンである。
本発明の溶液／懸濁液におけるマルトデキストリンの濃度は、０．０１〜１０％ｗ／ｖの範囲であり得る。あるいは、０．５〜２％ｗ／ｖの範囲のマルトデキストリンの濃度を使用してもよい。
これに関して、所定の環境では、本発明の組成物は、特定のｐＨを有するおよび／または特定のｐＨ範囲内に維持されることが望ましいことが留意される。例えば、本発明のケラチノサイト細胞の医薬組成物については、組成物を実質的に６．８のｐＨで維持することが好適である。従って、この目的のために緩衝剤が使用される。これに関して有用である緩衝剤の例として、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、または当該分野において公知であり、また好ましくは臨床的に許容可能である他の任意の適切な緩衝剤が挙げられる。最終溶液または懸濁液において含むための緩衝剤の正確な濃度は、組成物に要求される緩衝剤の強度およびｐＨを含む多様な因子に従って変動する。それにもかかわらず、ケラチノサイト溶解物懸濁液が関与する場合、本発明の組成物における緩衝剤の最終濃度は、５〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭ、より好ましくは、２０〜５０ｍＭの範囲であることが本明細書において考慮される。このことは、例えば、約１５００ｍＭの濃度の濃縮された緩衝液ストック溶液を組成物に添加することによって、達成することができる。
医薬組成物および特に本発明の溶液／懸濁液を乾燥または凍結乾燥する場合、それらはショ糖をさらに含んでもよい。
本発明の組成物におけるショ糖の濃度は、組成物のタイプ、ならびに組成物に任命される用途に従って変動する。これに関して、ショ糖の濃度は１〜３０％ｗ／ｗ、好ましくは、２〜２０％ｗ／ｗ、より好ましくは、５〜１０％ｗ／ｗの範囲である。このことは、ショ糖粉体または濃縮ショ糖ストック溶液を、例えば、約５０％の濃度で、組成物に添加することによって、達成することができる。また、ショ糖の代わりに、グリシン、トレハロース、ソルビトール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールもしくは他の任意の適切な凍結防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）または当該分野において公知のそれらの組み合わせなどの適切な濃度の別の凍結防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を使用してもよい。
本発明の医薬組成物は、関連する特定の細胞溶解物および／または組成物が意図される用途に所望され得るような他のおよび異なる成分をさらに含んでもよい。
本発明の溶液／懸濁液は、さらなる成分をさらに含み得ることが可能であり、それらのいくつかは、生物学的（細胞）材料が得られた結果である。そのような成分の例として、タンパク質、培養培地、洗浄培地ならびに凝集および／もしくは沈降するかまたは他の構成成分の凝集および／もしくは沈降を引き起こす傾向を有する他の有機および／または無機材料が挙げられる。
これらのさらなる成分の正確な濃度は、組成物、組成物の用途、および問題となるさらなる成分そのものに大きく依存して変動し得る。
特定の実施形態では、本発明は、細胞を増殖させる工程、溶解する工程および乾燥する工程を含んでなる、均質化された医薬組成物の製造方法に関与し、該方法は溶解直後、抗凝集剤および／または抗沈降剤を添加して、細胞溶解混合物を安定化することを特徴とする。
特定の実施形態では、本発明は、細胞を増殖させる工程、溶解する工程および乾燥する工程を含んでなる、均質化された医薬組成物の製造方法に関与し、該方法は溶解直後、キサンタンガムを抗凝集剤および／または抗沈降剤として添加して、細胞溶解混合物を安定化することを特徴とする。
特定の実施形態では、本発明は、細胞を増殖させる工程、溶解する工程および乾燥する工程を含んでなる、均質化された医薬組成物の製造方法に関与し、該方法は溶解直後、キサンタンガムならびにマルトデキストリンを抗凝集剤および／または抗沈降剤として添加して、細胞溶解混合物を安定化することを特徴とする。
特定の実施形態では、本発明は、溶液もしくは懸濁液または凍結乾燥溶液もしくは懸濁液の形態の細胞溶解物の組成物を製造するために使用される組成物を含む、溶液もしくは懸濁液または凍結乾燥溶液もしくは懸濁液の形態の生物学的材料の多様な医薬組成物の製造方法に関与する。溶液もしくは懸濁液または凍結乾燥溶液もしくは懸濁液の形態のケラチノサイト細胞溶解物の組成物を製造するための本発明の方法の使用は、特に有用である。
溶液または懸濁液は、当業者に公知の任意の方法によって入手可能である細胞溶解物と、おそらく液体形態の１つもしくはそれ以上の適切な賦形剤とを組み合わせる（例えば、混合する）ことによって、形成される。これは、関与する特定の生物学的材料および／または液体成分による使用に適切である当業者に周知の任意の方法によって、達成することができる。特に、ケラチノサイト細胞溶解物が関与する場合、細胞溶解物および賦形剤（おそらく液体形態である）を個々にまたは同時のいずれかで入手し、細胞溶解物の溶液または懸濁液が形成されるような様式で細胞物質と賦形剤とを混合することによって、細胞溶解物の溶液または懸濁液が形成されることが本明細書において予想される（そして上で考察した）。
ケラチノサイト細胞溶解物は、塩化ナトリウム０．９％（ｗ／ｗ）、リン酸緩衝化生理食塩水または他の任意の適切な媒体の等張溶液の形態で調製することができる。次いで、細胞溶解物は機械的に均質化され、必要であれば−７０℃で保存することができる。次いで、凍結したホモジネートを融解し、それに６．５％の最終濃度でショ糖（凍結防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として）を含む賦形剤および３０ｍＭの最終濃度でクエン酸緩衝剤を添加することによって補充する。
本発明の方法において組成物に添加すべき細胞溶解物および液体成分の濃度は、組成物における細胞溶解物のタイプ、ならびにその意図された用途に従って変動する。
キサンタンガムを細胞溶解物の懸濁液または溶液に添加することは、当業者に周知の任意の適切な様式で実施することができる。例えば、このことは、固体状態のキサンタンガムを、溶液もしくは懸濁液全体への溶解および均質な分散を容易にする条件下で溶液もしくは懸濁液に添加することによって行ってもよく、または、それは、細胞溶解物の懸濁液／溶液に添加する前に、水などの液体に最初に溶解してもよい。上記で留意したように、均質化直後のこのキサンタンガムの添加はなお、粘性特性に悪影響を及ぼす均質化方法にキサンタンガムを供することなく、キサンタンガムがその抗凝固／抗沈降特性を行使することを可能にする。特定の実施形態では、本発明の溶液または懸濁液の形態にある細胞溶解物の組成物の製造方法は、キサンタンガムの添加前の本発明の細胞溶解物の形成された組成物の均質化をさらに含んでなり得る。
均質化は、機械的および化学的方法を含む当業者に周知である任意の既知の適切な均質化技術を使用することによって、ならびに必要に応じて細胞を溶解するのに必要であるような方法条件下で、実施することができる。
これに関して、高圧均質化によって溶液または懸濁液を均質化することは、ケラチノサイト溶解物溶液／懸濁液に特に重要である。そのような均質化は、細胞破砕機（コンスタント・システムズ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ）、英国（Ｕ．Ｋ））などの任意の適切な装置を使用して、行うことができる。この特定の実施形態では、均質化は、２０００バールの圧力、４〜２０℃で行われる。結果は、懸濁液形態の細胞溶解物である。これに関して、従来的に、均質化の前に、抗凝集剤が細胞溶解物の組成物に添加される。このことは、プロセシングの簡易化のためおよび均質化中の凝集を防止するに役立てるために行われる。しかし、このことはまた、特に、キサンタンガムが抗凝集剤として使用される場合、抗凝集剤の粘性特性に悪影響を及ぼし、組成物中に形成する不均質性を生じる。
驚くべきことに、本発明者らは、本発明において、組成物における抗凝集剤および／または抗沈降剤の存在は、均質化の前に必要ではないことを見出した。本発明者らは、（高圧）均質化の直後に組成物に抗凝集剤および／または抗沈降剤を添加すれば、組成物における凝集はなお実質的に防止される一方、抗凝集剤の粘性特性には悪影響が及ばない。本発明の溶液または懸濁液の形態にある細胞溶解物の組成物の製造方法は、クエン酸緩衝液および／またはショ糖（両方とも上記に記載のように得られる）を、上記に記載のような濃度で本発明の細胞溶解物の組成物に添加することからさらに構成され得る。
本明細書においてさらに開示されるように、本発明の組成物および方法は、溶液または懸濁液の形態にあるケラチノサイト細胞溶解物の医薬組成物の形成における特定のアプリケーションおよび特に興味深い該組成物および方法である。これに関して、ケラチノサイト細胞溶解物は、米国特許第６，１２６，９３５号明細書に記載のように得ることができる。
特定の実施形態では、溶液または懸濁液の形態の細胞溶解物の医薬組成物、より詳細には、０．２〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、５〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度（提供される濃度は、溶解物内のタンパク質の濃度を指す）の溶液もしくは懸濁液の形態、またはその凍結乾燥形態のケラチノサイト細胞溶解物が本明細書において開示される。これらの細胞溶解物の溶液／懸濁液は、溶液または懸濁液において沈降し得る凝集の形成を防止するための抗凝集剤として作用するキサンタンガムを含む。本発明の細胞溶解物の医薬組成物（溶液または懸濁液の形態にある）中のキサンタンガムの最終濃度は０．００１〜５％ｗ／ｖ、より好ましくは、０．０１％ｗ／ｖ〜１％ｗ／ｖ、より好ましくは、０．０５〜０．５％ｗ／ｖの範囲である。
特定の実施形態では、本発明の細胞溶解物の医薬組成物は、溶液または懸濁液内で沈降し得る凝集物の形成を防止するための抗凝集剤として作用するマルトデキストリンをさらに含み得る。
１つの実施形態では、本発明の細胞溶解物の医薬組成物におけるマルトデキストリンの最終濃度は、０．０１〜１０％ｗ／ｖ、より好ましくは、０．１〜５％ｗ／ｖ、最も好ましくは、０．５〜２％ｗ／ｖの範囲であり得る。
別の実施形態では、本発明の細胞溶解物の医薬組成物は、クエン酸緩衝剤および／またはショ糖をさらに含み得る。
特定の実施形態では、本発明の細胞溶解物の医薬組成物は、賦形剤、特に、ゲル形成賦形剤をさらに含み得る。
本発明の特定の実施形態では、本発明の細胞溶解物の組成物は均質化される。
本発明の別の特定の実施形態では、均質化された組成物は、乾燥によってさらに処理される。乾燥は、乾燥方法が最終組成物の特性に悪影響を及ぼさない限り、エバポレーション、減圧乾燥、噴霧乾燥、流動層乾燥、赤外乾燥、マイクロ波乾燥またはそうでなければ溶液もしくは懸濁液に存在する水分を取り出すことなどの当該分野において公知の多様な方法で実施することができる。水分を取り出すための多くの好適な方法のうちの１つは、凍結乾燥によるものである。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、本発明の方法を使用して、溶液または懸濁液の形態の細胞溶解物の組成物、より好ましくは、溶液または懸濁液の形態、おそらく乾燥形態のケラチノサイト細胞溶解物の組成物が製造される。
１つの実施形態では、本発明の細胞溶解物の医薬組成物に添加されるキサンタンガムの最終濃度は、０．００１〜５％ｗ／ｖの範囲であり得る。別の実施形態では、キサンタンガムの濃度は、０．０５〜０．５％ｗ／ｖの範囲である。
特定の実施形態では、本発明の溶液または懸濁液の形態である細胞溶解物の組成物の製造方法は、マルトデキストリンを細胞溶解物の組成物に添加することをさらに含むことができ、それによって、マルトデキストリンは、溶液または懸濁液内で沈降し得る凝集の形成を防止するための抗凝集剤として作用する。
特定の実施形態では、本発明の細胞溶解物の医薬組成物に添加されるマルトデキストリンの最終濃度は、０．０１〜１０％ｗ／ｖの範囲であり得る。ほとんどのアプリケーションについては、０．５〜２％ｗ／ｖの範囲のマルトデキストリンの濃度が適切であり得る。
特定の実施形態では、本発明は、細胞を増殖させる工程、溶解する工程および乾燥する工程を含んでなる、均質化された医薬組成物の製造方法に関与し、該方法は、高圧均質化による溶解直後、キサンタンガムおよび／またはマルトデキストリンの混合物を抗凝集剤および／または抗沈降剤として添加して、細胞溶解混合物を安定化させることを特徴とする。
特定の実施形態では、本発明は、ケラチノサイト細胞を増殖させる工程、溶解する工程および乾燥する工程を含んでなる、均質化された医薬組成物の製造方法に関与し、該方法は、高圧均質化による溶解直後、キサンタンガムおよび／またはマルトデキストリンの混合物を抗凝集剤および／または抗沈降剤として添加して、ケラチノサイト細胞溶解混合物を安定化することを特徴とする。
本発明のなお別の態様では、本発明の方法によって入手可能な本発明の溶液または懸濁液の形態の細胞溶解物の医薬組成物が本明細書において開示される。
本発明のこの態様の特定の実施形態では、本発明の方法によって入手可能な本発明の溶液または懸濁液の形態のケラチノサイト細胞溶解物の医薬組成物が本明細書において開示される。さらに特定の実施形態では、ケラチノサイト細胞溶解物を含んでなる医薬組成物は凍結乾燥またはそうでなければ乾燥形態にある。
本発明の別の特定の実施形態では、十分な量の細胞溶解物または細胞溶解物の画分を含有する組成物を投与することによる創傷の処置のための方法が、本明細書において開示される。さらに、組成物は、異なるキャリアシステムおよびクリーム、軟膏、ゲル、散剤、スプレー、溶液、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥粉体、エアゾルなどの薬物剤型を介して投与することができる。
本発明の別の特定の実施形態では、溶液または懸濁液の形態の細胞溶解物を形成させること、少なくとも１つの抗凝集剤および／または少なくとも１つの抗沈降剤を溶液または懸濁液の形態の細胞溶解物の組成物に添加すること、および少なくとも１つの抗凝集剤および／または少なくとも１つの抗沈降剤が添加されている細胞溶解物溶液または懸濁液の組成物を安定化することを含む方法によって得られる溶液または懸濁液の形態の細胞溶解物の組成物が、本明細書において開示される。
特定の実施形態では、少なくとも１つの抗凝集剤および／または少なくとも１つの抗沈降剤を非生存細胞溶解物溶液または懸濁液の組成物に添加する前に細胞を溶解する工程を含んでなる方法によって入手可能な本発明の細胞溶解物溶液または懸濁液の組成物が、本明細書において開示される。１つのそのような溶解方法は、高圧均質化によるものであり得る。
特定の実施形態では、０．００１〜５％ｗ／ｖ、より好ましくは、０．０１〜１％ｗ／ｖ、最も好ましくは、０．０５〜０．５％ｗ／ｖの範囲の濃度のキサンタンガムを、抗凝集剤および／または少なくとも１つの抗沈降剤として、非生存細胞溶解物溶液または懸濁液の組成物に添加する前に細胞を溶解する工程を含んでなる方法によって入手可能な本発明の細胞溶解物溶液または懸濁液の組成物が、本明細書において開示される。１つのそのような溶解方法は、高圧均質化によるものであり得る。
特定の実施形態では、０．００１〜５％ｗ／ｖ、より好ましくは、０．０１〜１％ｗ／ｖ、最も好ましくは、０．０５〜０．５％ｗ／ｖの範囲の濃度のキサンタンガムおよび０．０１〜１０％ｗ／ｖ、より好ましくは、０．５〜２％ｗ／ｖの範囲の濃度のマルトデキストリンの組み合わせの混合物を、抗凝集剤および／または少なくとも１つの抗沈降剤として、非生存細胞溶解物溶液または懸濁液の組成物に添加する前に細胞を溶解する工程を含んでなる方法によって入手可能な本発明の細胞溶解物溶液または懸濁液の組成物が、本明細書において開示される。１つのそのような溶解方法は、高圧均質化によるものであり得る。
別の実施形態では、本発明の溶液または懸濁液の形態（おそらく乾燥または凍結乾燥形態）にある細胞溶解物の組成物の製造方法は、キサンタンガムを添加した後の細胞溶解物の組成物を滅菌することからさらになり得る。そのような滅菌は、化学的、熱処置（マイクロ波エネルギーの使用を含む）またはＵＶ、γもしくは電子線照射などの照射によって実施することができる。γまたは電子線照射の場合、滅菌は、組成物の生物学的活性に対する可能な影響を最小限にするために、好ましくは、乾燥（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）後の組成物に対して実施される。
これまで本発明の細胞溶解物の組成物およびそれらの製造方法について説明してきたが、以下の実施例は、例示のみの目的のために提示されるのであって、それらを制約するものと解釈されることを意図せず、またそのように解釈すべきでもない。
上記で開示された組成物、方法、使用および方法の改変は、本発明の基本的趣旨から逸脱することなく行うことができる。従って、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内において、本明細書に具体的に記載されている以外に、本発明を実施することが可能であることを理解できよう。
実施例１：ヒトケラチノサイトの培養およびケラチノサイト細胞溶解物の調製
ケラチノサイトは、ヒト新生児包皮から単離する。包皮標本を、表皮および真皮の分離を得るために、１晩、４℃で、２５Ｕ／ｍＬディスペース（Ｄｉｓｐａｓｅ）を含有する溶液中でインキュベートする。表皮部分を回収し、単一のケラチノサイト細胞を得るための０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを含有する溶液中、３０分間、３７℃でのインキュベーションによりさらに処理する。次いで、トリプシン阻害剤を添加することによってトリプシンを中和し、細胞を遠心分離し、ＤＭＳＯ含有低温保存溶液に再懸濁し、液体窒素中に低温保存する。
ケラチノサイトは、ヒト新生児包皮から単離する。包皮標本を、表皮および真皮の分離を得るために、１晩、４℃で、２５Ｕ／ｍＬディスペース（Ｄｉｓｐａｓｅ）を含有する溶液中でインキュベートする。表皮部分を回収し、単一のケラチノサイト細胞を得るための０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを含有する溶液中、３０分間、３７℃でのインキュベーションによりさらに処理する。次いで、トリプシン阻害剤を添加することによってトリプシンを中和し、細胞を遠心分離し、ＤＭＳＯ含有低温保存溶液に再懸濁し、液体窒素中に低温保存する。
融解後、３Ｔ３フィーダー線維芽細胞技術（ラインバルドＪ（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ Ｊ）およびグリーンＨ（Ｇｒｅｅｎ Ｈ）Ｃｅｌｌ（１９７５）６：３３１−３４４：ヒト真皮ケラチナサイトの株の連続培養：単一細胞からの角質化コロニーの形成（Ｓｅｒｉａｌ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｉｚｉｎｇ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ））を使用するかまたは市販の低カルシウムケラチノサイト培地において、単離したケラチノサイトを培養する。
培養後、塩化ナトリウムおよびリン酸緩衝剤を含有する等張溶液に掻き落とすことによって、細胞を機械的に回収し、機械的に均質化し、−７０℃で凍結する。融解後、このようにして得られた粗溶解物（バルク未処理製品）を、凍結防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（ショ糖）およびクエン酸緩衝剤で補充し、細胞破砕機（コンスタント・システムズ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、英国（Ｕ．Ｋ））を使用して、高圧均質化によりさらに処理する。次いで、得られる懸濁液（バルク処方された溶解物）をバイアルに充填し、凍結乾燥する。
実施例２：凝集および沈降を防止するためのキサンタンガムおよび／またはマルトデキストリンの使用
実施例１に記載のように、非処置バルク溶解物（ＢＵＰ）を調製した。処方されたバルク製品は、１３ｇのショ糖粉体を添加された２００ｇのＢＵＰ（約２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質を含有する）を構成した。この材料を３つのアリコートに分割し、以下のように処理した。
・アリコートＩＡを、コンスタント・システムズ高圧ホモジナイザーにて、８００バール（１サイクル）で処理した。プロセシング後、１２．５ｍｌの均質化した材料を、以下のいずれかで補充した。
・１．２５ｍｌの水（ＩＡ１）
・０．３３ｍｌのルトロール（Ｌｕｔｒｏｌ）Ｆ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＡ２）
・１．２５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液（ＩＡ３）
・１．２５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液および０．３２ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＡ４）
・アリコートＩＢを、コンスタント・システムズ高圧ホモジナイザーにて、２０００バール（１サイクル）で処理した。プロセシング後、１２．５ｍｌの均質化した材料を、以下のいずれかで補充した。
・１．２５ｍｌの水（ＩＢ１）
・０．３３ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＢ２）
・１．２５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液（ＩＢ３）
・１．２５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液および０．３２ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＢ４）
・アリコートＩＩを、２５ｍｌの４つのアリコートにさらに部分分割し、最初に、以下のいずれかで補充した。
・２．５ｍｌの水（ＩＩ１）
・０．６５ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＩ２）
・２．５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液（ＩＩ３）
・２．５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液および０．６５ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＩ４）。
実施例１に記載のように、非処置バルク溶解物（ＢＵＰ）を調製した。処方されたバルク製品は、１３ｇのショ糖粉体を添加された２００ｇのＢＵＰ（約２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質を含有する）を構成した。この材料を３つのアリコートに分割し、以下のように処理した。
・アリコートＩＡを、コンスタント・システムズ高圧ホモジナイザーにて、８００バール（１サイクル）で処理した。プロセシング後、１２．５ｍｌの均質化した材料を、以下のいずれかで補充した。
・１．２５ｍｌの水（ＩＡ１）
・０．３３ｍｌのルトロール（Ｌｕｔｒｏｌ）Ｆ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＡ２）
・１．２５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液（ＩＡ３）
・１．２５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液および０．３２ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＡ４）
・アリコートＩＢを、コンスタント・システムズ高圧ホモジナイザーにて、２０００バール（１サイクル）で処理した。プロセシング後、１２．５ｍｌの均質化した材料を、以下のいずれかで補充した。
・１．２５ｍｌの水（ＩＢ１）
・０．３３ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＢ２）
・１．２５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液（ＩＢ３）
・１．２５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液および０．３２ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＢ４）
・アリコートＩＩを、２５ｍｌの４つのアリコートにさらに部分分割し、最初に、以下のいずれかで補充した。
・２．５ｍｌの水（ＩＩ１）
・０．６５ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＩ２）
・２．５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液（ＩＩ３）
・２．５ｍｌの１％ｗ／ｖキサンタンガム／１０％ｗ／ｖマルトデキストリンの溶液および０．６５ｍｌのルトロールＦ１２７の２０％ｗ／ｖ溶液（ＩＩ４）。
次いで、これらの処方されたサンプルを、８００バール（ＩＩ１Ａ、ＩＩ２Ａ、ＩＩ３Ａ、ＩＩ４Ａ）または２０００バール（ＩＩ１Ｂ、ＩＩ２Ｂ、ＩＩ３Ｂ、ＩＩ４Ｂ）のいずれかで高圧ホモジナイザーに通過させた。処理した処方されたバルク製品のアリコートを透明なプラスチック製１５ｍｌチューブに充填し、かき乱すことなく２〜８℃に配置した。本および以下のすべての実施例について、０〜５スケール（０／０＝凝集／沈降が認められない、５／５＝最大の凝集／沈降、５／０＝最大の凝集、沈降が認められない、など）の評価システムを使用して、一定の間隔で、凝集または沈降の目視評価を行った。２時間後、４℃で結果を評価し、表１にまとめる。
本実施例は、１％マルトデキストリンおよび０．１％キサンタンガムの組み合わせが溶解物材料の凝集および沈降を抑制することを示す。しかし、驚くべきことに、高圧均質化の前ではなく、後に、添加物が添加される場合にのみ、このような有益な効果が観察される。さらに、マルトデキストリンおよびキサンタンガムの添加は、溶解物の生物学的活性を不利益に妨害しない。
実施例３：濃縮された溶解物懸濁液の凝集および沈降を防止するためのキサンタンガム／マルトデキストリンの使用
実施例１に記載のように、非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製を行った。
・処方されたバルク製品の調製は以下の通りである。
１）１０５ｍｌのＢＵＰに、８７．５ｍｌのクエン酸緩衝液（１２０ｍＭ、ｐＨ６．８）を添加した：溶液１
２）１２８ｍｌの溶液１に、１５ｇのショ糖粉体を添加した（溶液２）。
・処方Ａ（抗凝集剤なし）：６４ｍｌの溶液２を、コンスタント・システムズホモジナイザーにて、８００バールで処置し、次いで、５２ｍｌの水で充填した。
・処方Ｂ（抗凝集剤あり）：６４ｍｌの溶液２を、コンスタント・システムズホモジナイザーにて、８００バールで処置し、次いで、２９ｍｌの水および５％マルトデキストリンおよび０．５％キサンタンガムを含有する２３ｍｌの溶液で充填した。
３）処方Ｃ（抗凝集剤あり、ショ糖なし）：６４ｍｌの溶液１を、コンスタント・システムズホモジナイザーにて、８００バールで処置し、次いで、２９ｍｌの水および５％マルトデキストリンおよび０．５％キサンタンガムを含有する２３ｍｌの溶液で充填した。
実施例１に記載のように、非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製を行った。
・処方されたバルク製品の調製は以下の通りである。
１）１０５ｍｌのＢＵＰに、８７．５ｍｌのクエン酸緩衝液（１２０ｍＭ、ｐＨ６．８）を添加した：溶液１
２）１２８ｍｌの溶液１に、１５ｇのショ糖粉体を添加した（溶液２）。
・処方Ａ（抗凝集剤なし）：６４ｍｌの溶液２を、コンスタント・システムズホモジナイザーにて、８００バールで処置し、次いで、５２ｍｌの水で充填した。
・処方Ｂ（抗凝集剤あり）：６４ｍｌの溶液２を、コンスタント・システムズホモジナイザーにて、８００バールで処置し、次いで、２９ｍｌの水および５％マルトデキストリンおよび０．５％キサンタンガムを含有する２３ｍｌの溶液で充填した。
３）処方Ｃ（抗凝集剤あり、ショ糖なし）：６４ｍｌの溶液１を、コンスタント・システムズホモジナイザーにて、８００バールで処置し、次いで、２９ｍｌの水および５％マルトデキストリンおよび０．５％キサンタンガムを含有する２３ｍｌの溶液で充填した。
プロセシング後、サンプルを４℃で、２４時間保存し、０〜５スケール（０＝凝集／沈降が認められない、５＝最大の凝集／沈降）を使用して、凝集／沈降を評価した。また、サンプルを凍結乾燥し、電子線滅菌により処置し、生物学的活性について評価した。結果を表２に示す。
これらのデータは、クエン酸緩衝液の存在下での１％マルトデキストリン／０．１％キサンタンガムの添加は、２４時間まで、低濃度の溶解物の凝集および沈降を阻害する。しかし、より高度に濃縮された溶解物を使用し、クエン酸緩衝液を省く場合、均質化の１．５時間後に、有意な凝集および沈降が常に認められる。データから、マルトデキストリンおよびキサンタンガムが溶解物の生体活性に悪影響を及ぼさず、電子線照射に適合性であることが確認される（但し、溶解物の本質的な生物活性は、照射により減少する）。
実施例４：異なるタンパク質濃度を含有する溶解物懸濁液の凝集および沈降を防止するためのキサンタンガムまたはキサンタンガム／マルトデキストリンの使用
・実施例１に記載の非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製
処方されたバルク製品の調製：
１．処方３ＸＡおよび３ＸＢ：
・ＢＵＰ（約０．９８ｍｇ／ｍｌ）： ９４ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ２０ｇ
・ショ糖粉体： １３ｇ
・水： ３３ｇ
高圧ホモジナイザーにて、２０００バールで処理する
・処理後、溶解物を、８０ｇの２つのアリコートに分割し、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方３ＸＡ）かまたは０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方３ＸＢ）のいずれかを添加した。
・実施例１に記載の非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製
処方されたバルク製品の調製：
１．処方３ＸＡおよび３ＸＢ：
・ＢＵＰ（約０．９８ｍｇ／ｍｌ）： ９４ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ２０ｇ
・ショ糖粉体： １３ｇ
・水： ３３ｇ
高圧ホモジナイザーにて、２０００バールで処理する
・処理後、溶解物を、８０ｇの２つのアリコートに分割し、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方３ＸＡ）かまたは０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方３ＸＢ）のいずれかを添加した。
２．処方１ＸＡおよび１ＸＢ：
・ＢＵＰ（約０．９８ｍｇ／ｍｌ）： ３０．３ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ２０ｇ
・ショ糖粉体： １３．２ｇ
・水： ９６．５ｇ
高圧ホモジナイザーにて、２０００バールで処理する
・処理後、溶解物を、８０ｇの２つのアリコートに分割し、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方１ＸＡ）かまたは０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方１ＸＢ）のいずれかを添加した。
・ＢＵＰ（約０．９８ｍｇ／ｍｌ）： ３０．３ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ２０ｇ
・ショ糖粉体： １３．２ｇ
・水： ９６．５ｇ
高圧ホモジナイザーにて、２０００バールで処理する
・処理後、溶解物を、８０ｇの２つのアリコートに分割し、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方１ＸＡ）かまたは０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方１ＸＢ）のいずれかを添加した。
３．処方０．３ＸＡおよび０．３ＸＢ
以下の成分を、２５ｇの処方１ＸＡに添加することによって、処方０．３ＸＡを調製する。
・ショ糖： ３．２５ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ５ｇ
・ＰＢＳ緩衝液： ３１．７５ｇ
・５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガム： １０ｇ
以下の成分を、２５ｇの処方１ＸＢに添加することによって、処方０．３ＸＢを調製する。
・ショ糖： ３．２５ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ５ｇ
・ＰＢＳ緩衝液： ３１．７５ｇ
・５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガム： １０ｇ
以下の成分を、２５ｇの処方１ＸＡに添加することによって、処方０．３ＸＡを調製する。
・ショ糖： ３．２５ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ５ｇ
・ＰＢＳ緩衝液： ３１．７５ｇ
・５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガム： １０ｇ
以下の成分を、２５ｇの処方１ＸＢに添加することによって、処方０．３ＸＢを調製する。
・ショ糖： ３．２５ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ５ｇ
・ＰＢＳ緩衝液： ３１．７５ｇ
・５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガム： １０ｇ
材料を４℃で保存し、異なる時間ポイントで凝集／沈降について評価した。材料を、生物学的活性についてさらに評価した。結果を表３にまとめる。
本実施例は、異なる最終タンパク質濃度で、キサンタンガム単独は、沈降および凝集を防止するのにマルトデキストリンおよびキサンタンガムの組み合わせに匹敵する有効性を有する。
実施例５：溶解物懸濁液の凝集および沈降を防止するためのキサンタンガムまたはキサンタンガム／マルトデキストリンの使用ならびに抗凝集剤を添加するタイミングの効果
・実施例１に記載の非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製
処方されたバルク製品の調製：
１．処方ＡおよびＢ（ショ糖なし）
・ＢＵＰ（約２．７４ｍｇ／ｍｌ）：２７．９ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ２０ｇ
・水： １１２．１ｇ
・実施例１に記載の非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製
処方されたバルク製品の調製：
１．処方ＡおよびＢ（ショ糖なし）
・ＢＵＰ（約２．７４ｍｇ／ｍｌ）：２７．９ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ２０ｇ
・水： １１２．１ｇ
高圧ホモジナイザーを介する２０００バールでの均質化。
均質化した材料を、それぞれ８０ｇの２つのアリコートに分割し、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ａ）かまたは０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｂ）のいずれかを添加した。
均質化した材料を、それぞれ８０ｇの２つのアリコートに分割し、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ａ）かまたは０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｂ）のいずれかを添加した。
２．処方Ｃ〜Ｊ（ショ糖あり）：
・ＢＵＰ（約２．７４ｍｇ／ｍｌ）：１１１．５ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ８０ｇ
・ショ糖粉体： ５２．１ｇ
・水： ３９８．１ｇ
・ＢＵＰ（約２．７４ｍｇ／ｍｌ）：１１１．５ｇ
・３００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ８０ｇ
・ショ糖粉体： ５２．１ｇ
・水： ３９８．１ｇ
この混合物を、それぞれ８０ｇの８つのアリコートに分割した。
・２つのアリコートを、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｉ）かまたは０．５キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｊ）のいずれかで補充し、その後、高圧ホモジナイザーにて、２０００バールで処理した。
・６つのアリコートを、まず高圧ホモジナイザーにて、２０００バールで処理し、その後、均質化直後（処方Ｇ、Ｈ）または均質化５分後（処方Ｅ、Ｆ）もしくは３０分後（処方Ｃ、Ｄ）に、抗凝集添加物で補充した。使用した添加物は、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｃ、Ｅ、Ｇ）かまたは０．５キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｄ、Ｆ、Ｈ）のいずれかであった。
・２つのアリコートを、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｉ）かまたは０．５キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｊ）のいずれかで補充し、その後、高圧ホモジナイザーにて、２０００バールで処理した。
・６つのアリコートを、まず高圧ホモジナイザーにて、２０００バールで処理し、その後、均質化直後（処方Ｇ、Ｈ）または均質化５分後（処方Ｅ、Ｆ）もしくは３０分後（処方Ｃ、Ｄ）に、抗凝集添加物で補充した。使用した添加物は、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｃ、Ｅ、Ｇ）かまたは０．５キサンタンガムを含有する２０ｇの溶液（処方Ｄ、Ｆ、Ｈ）のいずれかであった。
処理したサンプルを４℃で保存し、０〜５評価を使用して、凝集／沈降について評価した。また、サンプルを、生物学的活性について試験した。結果を表４にまとめる：
本実施例は、キサンタンガムが、溶解物懸濁液の凝集および沈降を阻害することについて、マルトデキストリン／キサンタンガムの組み合わせに類似の効力を有することを示す。本実施例より、抗凝集剤の添加は、有効であるために、高圧均質化工程の後に生じる必要があるという驚くべき所見も確認される。以後の凝集を最小限にするために、抗凝集剤の添加は、好ましくは、均質化のできるだけ直ぐ後に行われる。
実施例６：溶解物懸濁液の凝集および沈降を防止するためのキサンタンガム、マルトデキストリンまたはキサンタンガム／マルトデキストリンの使用ならびに均質化の前または後の添加の効果
・実施例１に記載の非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製
処方されたバルク製品の調製は、ショ糖を６．５％の最終濃度（処方１、２、３）で、またはマルトデキストリンを５％の最終濃度（処方４、５）で添加することによって、行った。その後、懸濁液を、８００バールの圧力で均質化し、以下のいずれかで補充した（百分率は最終濃度を指す）。
処方１：マルトデキストリン１％、キサンタンガム０．１％
処方２：マルトデキストリン１％
処方３：キサンタンガム０．１％
処方４：添加物なし
処方５：キサンタンガム０．１％
・実施例１に記載の非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製
処方されたバルク製品の調製は、ショ糖を６．５％の最終濃度（処方１、２、３）で、またはマルトデキストリンを５％の最終濃度（処方４、５）で添加することによって、行った。その後、懸濁液を、８００バールの圧力で均質化し、以下のいずれかで補充した（百分率は最終濃度を指す）。
処方１：マルトデキストリン１％、キサンタンガム０．１％
処方２：マルトデキストリン１％
処方３：キサンタンガム０．１％
処方４：添加物なし
処方５：キサンタンガム０．１％
プロセシング後、材料を４℃で保存し、異なる時間ポイントで凝集／沈降について評価した。結果を表５にまとめる。
本実施例は、マルトデキストリンおよびキサンタンガムの組み合わせが、凝集を阻害するのに、キサンタンガム単独よりも有効であることを示す。マルトデキストリン単独の使用は、凝集の限定的な阻害を生じ、より長い期間の沈降を阻害しない。
実施例７：ショ糖の存在または非存在下における異なる濃度の溶解物懸濁液の凝集および沈降を阻害するためのキサンタンガム／マルトデキストリンの使用
・実施例１に記載のように非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製を行った。
処方されたバルク製品の調製：
１．処方ＡおよびＢ（ショ糖）
・ＢＵＰ（約３．１ｍｇ／ｍｌ）： ３０ｍｌ
・１５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ２０ｍｌ
・ショ糖粉体： ６．５ｇ
・実施例１に記載のように非処理バルク溶解物（ＢＵＰ）の調製を行った。
処方されたバルク製品の調製：
１．処方ＡおよびＢ（ショ糖）
・ＢＵＰ（約３．１ｍｇ／ｍｌ）： ３０ｍｌ
・１５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： ２０ｍｌ
・ショ糖粉体： ６．５ｇ
高圧ホモジナイザーを介する８００バールでの均質化。
均質化した材料を、それぞれ２５ｍｌの２つのアリコートに分割し、２５ｍｌの水（処方Ａ）かまたは１５ｍｌの水および５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する１０ｍｌの溶液（処方Ｂ）のいずれかを添加した。
均質化した材料を、それぞれ２５ｍｌの２つのアリコートに分割し、２５ｍｌの水（処方Ａ）かまたは１５ｍｌの水および５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する１０ｍｌの溶液（処方Ｂ）のいずれかを添加した。
２．処方Ｃ（ショ糖なし）：
・ＢＵＰ（約３．１ｍｇ／ｍｌ）： １５ｍｌ
・１５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： １０ｍｌ
・ＢＵＰ（約３．１ｍｇ／ｍｌ）： １５ｍｌ
・１５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．８： １０ｍｌ
高圧ホモジナイザーを介する８００バールでの均質化。
均質化した材料に、１５ｍｌの水および５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する１０ｍｌの溶液（処方Ｂ）を添加した。
均質化した材料に、１５ｍｌの水および５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する１０ｍｌの溶液（処方Ｂ）を添加した。
３．処方Ｄ（より高いタンパク質濃度、クエン酸緩衝液なし）
・ＢＵＰ（約３．１ｍｇ／ｍｌ）： ４５ｍｌ
・ショ糖粉体： ３．７ｇ
・ＢＵＰ（約３．１ｍｇ／ｍｌ）： ４５ｍｌ
・ショ糖粉体： ３．７ｇ
高圧ホモジナイザーを介する８００バールでの均質化。
均質化した材料に、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する１２ｍｌの溶液（処方Ｂ）を添加した。
均質化した材料に、５％マルトデキストリン／０．５％キサンタンガムを含有する１２ｍｌの溶液（処方Ｂ）を添加した。
材料を４℃で保存し、異なる時間ポイントで凝集および沈降について評価し、生物学的活性について試験した。結果を表６にまとめる。
本実施例は、マルトデキストリン１％／キサンタンガム０．１％の組み合わせが、均質化の少なくとも２３時間後まで溶解物の凝集および沈降の両方を有意に阻害することを示す。ショ糖の存在は、マルトデキストリン／キサンタンガムの効果をわずかに改善する。より長いインキュベーション（９６時間）後、マルトデキストリン／キサンタンガムの存在下であっても、特により高いタンパク質濃度では、沈降および凝集が生じる。マルトデキストリンおよびキサンタンガムの存在は、溶解物の生物学的活性に影響を及ぼさない。
Claims (17)
- 非生存細胞溶解物ならびに少なくとも１つの抗凝集剤および／または抗沈降剤を含んでなる医薬組成物。
- 抗凝集剤および／または抗沈降剤がキサンタンガムである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 抗凝集剤および／または抗沈降剤がキサンタンガムおよびマルトデキストリンの組み合わせである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
- 緩衝剤をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 乾燥形態である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 凍結乾燥形態である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記細胞溶解物がケラチノサイト細胞溶解物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 医薬上許容されるキャリア／賦形剤／ビヒクルをさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 非生存細胞溶解物および医薬上許容されるビヒクルを含んでなる、創傷治癒を促進する目的のための請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬上許容されるビヒクルが乾燥粉末、懸濁液または溶液である、請求項８または９に記載の医薬組成物。
- 前記医薬上許容されるビヒクルがゲル、クリーム、軟膏または生体適合性マトリックスである、請求項８または９に記載の医薬組成物。
- 細胞を増殖させ、溶解し、次いで、乾燥する工程を含んでなる、均質化された医薬組成物の製造方法であって、溶解直後、抗凝集剤および／または抗沈降剤を添加して、細胞溶解混合物を安定化することを特徴とする方法。
- 前記細胞を乾燥させる工程が凍結乾燥によるものである、請求項１２に記載の方法。
- 前記細胞溶解物がケラチノサイト細胞溶解物である、請求項１２または１３に記載の方法。
- 前記抗凝集／抗沈降剤がキサンタンガムである、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記抗凝集剤および／または抗沈降剤がキサンタンガムおよびマルトデキストリンの組み合わせである、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 熱創傷または皮膚潰瘍の処置のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
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