JP2023502888A - 異質性の幹細胞由来細胞外ベシクルをコーティングおよび乾燥するための方法 - Google Patents

Abstract

コーティングおよび乾燥した細胞外ベシクル（ＥＶｓ）は、本発明の保存および保存寿命の延長のための理想的な方法を示し、本発明を様々な種に時間通りにそのまま使用できるようにし、単離および保存、ならびに望ましくない免疫応答に関する従来の問題を克服する。本発明は、軟／硬組織の治癒を刺激／加速するために使用する準備ができているコーティングおよび乾燥した幹細胞由来ＥＶｓを含み、多数の形態および形状で再構成することができ、かつレーザーによって刺激することができる。本発明の本質は、個体および／または種の疾患および免疫反応に関する問題を克服することができる、異質性および／または異種性のＥＶｓである。

Description

本発明は、異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）ドナーの幹細胞から得た細胞外ベシクル（ＥＶｓ）をコーティングおよび保存する方法に関し、医薬品製造および輸送を容易にし、また、ＥＶｓをそのまま使用できるようにする。

前記産物の異質性は、細胞外溶液中に天然に存在する異なる種類／サイズの細胞またはベシクルを指すだけではなく、第一に、異なる取得源／ドナー（ヒト、動物、鳥類、卵、一次胚細胞）から得たＥＶｓを指す。異種性（ｘｅｎｏｇｅｎｏｕｓ）は、前記異質性の産物を別の種／属のレシピエントに使用することを指す。

細胞外ベシクル（ＥＶｓ）は、幹細胞から天然に放出される、種々のプロセスの中で細胞間情報伝達、免疫調節、老化、増殖、および分化に関与する脂質二重層によって区切られた全ての粒子（エクソソームおよびマイクロベシクルが含まれる）を含む（Ｎａｓｓａｒ、２０１４ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＥＶｓ）；Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。

幹細胞に由来するＥＶｓは、幹細胞によって分泌される主要な有益なサイトカインおよび増殖因子を含むため、大きな再生能を保持している（ＫａｔｓｕｄａおよびＯｃｈｉｙａ、２０１５ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐａｉｒ）。

研究によって、ＥＶｓは、損傷を受けた組織に対して、起源の細胞と同じ再生機能を有することが示されている。

ＥＶｓは、細胞療法の問題点、例えば、腫瘍形成、およびレシピエントの身体の望ましくない免疫反応による拒絶反応の克服に役立つ。（Ｓａｂｉｎ，Ｋ；Ｋｉｋｙｏ，Ｎ、２０１４：Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｓ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）。

これは、同じ種の個体間、または異なる種および属の間では試験されていない。（Ｆｕｓｔｅｒら、２０１５：Ａｃｅｌ／ｕｌａｒ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｏｎ ｔｈｅ ｖｅｒｇｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ？）。

さらに、本発明の実験的研究によって、抗アポトーシス性の、抗線維化および血管新生活性、さらには再生的環境を生じさせる内在性幹／前駆細胞に対するポジティブな刺激が示された。

即時に、そのまま使用できる産物は存在しない。

現在、ＥＶｓは、１つの個体から調製され、同じ個体に使用される。

同じ個体から新たに調製するために３～６週間かかり、かつ特別な実験機器が利用可能であることが必要である。

新鮮な産物は、標準室温で保存することができず、かつ７日間よりも長期間、有効な状態に保つことができない。

従来の調製物の存在形態は、液体形態のみであった。

従来の調製物の使用は、注射による投与に限られていた。

本発明は、即時使用の準備ができている。

性質（異質性／異種性）：個体から高品質のＥＶｓを抽出、保存し、同じまたは異なる種／属の別の個体に使用する。

調製時間を節約する

長い保存時間、室温および自然状態での保存。

調製物は、種々の形態で製造することができる。

調製物は、種々の経路で投与することができる。

（発明の有利な効果）
前記産物の収集および調製が容易であるため、時間および労力が節約される。

多くの天然および合成ビヒクルで安全に運搬され得る。

硬度／粘度の制御の可能性。

本発明は、同定されたタンパク質含量を有し、また、異なる濃度および全ての可能な医薬形態で製造することができる。

前記産物は、標準室温で、新たに調製したものよりもはるかに長時間保存することができる。

投与は、医薬形態および処置の標的部位に応じて様々である。

進行性疾患の療法においてきわめて重大である、培養および処理における遅延を回避する即時介入。

ＥＶｓは、脱水されているにもかかわらず、新たに調製したものと同じくらい効果的に、起源の細胞と同じ機能を果たす。

軟／硬組織の治癒を刺激／加速する、例えば、皮膚の異常／傷、心臓の異常、骨格筋の変性障害、肝臓および腎臓の変性障害、免疫刺激／調節、ならびに組織移植を治療する。

ＥＶｓは、脱水されているにもかかわらず、新たに調製したものと同じくらい効果的に、起源の細胞と同じ機能を果たす。

細胞のシグナル伝達、プロテオミクス、細胞増殖などのような、生物学的実験の評価のための、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のために使用できる。

免疫反応を引き起こさない。

本発明は、軟／硬組織の治癒を促進する増殖因子およびサイトカインの、そのまま使用できる高品質な濃縮物を得るための幹細胞由来ＥＶｓの調製および保存方法を含み、かつ、保存期間が長い種々の医薬形状／形態で使用することができる。さらに、以下のように詳述される：
前記産物は、ドナー（ヒト／動物）から調製され、いかなる免疫反応も伴うことなく、別のレシピエント（ヒト／動物）に使用される。前記産物は、異なる種および属の間で使用することができ、従来の調製物のように制限されない。

前記ＥＶｓは、異なる細胞適合特性を有するコーティング材料上にロードされる。

前記ベシクルをロードしたコーティング材料は、水粒子を取り除き、個体／粉末に変換するために、乾燥プロセスにかけられる。

ベシクルの有効性を損なわない／減少させない室温での保存。

最終産物は、必要とされる使用方法（例えば、それらに限定されないが、種々の経路による注射のための液体、または錠剤、ピル、シロップなどの形態での経口摂取のため）に従って調製／成形され得る。ならびに、点眼剤、軟膏、もしくはゲルとしての局所使用、または外用ドレッシング材などの他の複合材料中に配合される。

免疫反応を伴うことなく使用できる可能性があることで、ヒトおよび動物の間で使用するための市販量の製造が保証される。

さらに、ベシクルのコーティングおよび乾燥は、（ａ）乾燥プロセスの間、ベシクルを保護すること、（ｂ）創傷を処置、または使用目的に従って希釈した場合に、ベシクルが互いに結合し、かつ組織と結合することを可能にする程度の粘度をベシクルに与えること、（ｃ）乾燥した材料を再構成した場合に、著しい粘度変化を起こすことなく、速やかに元の形態に戻ること、（ｄ）コーティングが、治療的有効性を変化させずに細胞外ベシクルが保存されることを確実にすること、（ｅ）処置する場所に適した異なる医薬形態（液体／粉末／錠剤．．．）に本発明を成形することが容易であること、（ｆ）乾燥が、製造、運搬、ならびに医薬的および商業的使用を容易にすること、に役立つ。

実験室的実験
表在性創傷に対する再構成したＥＶｓの動物試験（Ｉ）から、次のことが証明された。（ａ）創傷治癒の速度が向上する。（ｂ）治癒した組織がより優れた特性（線維組織が少ない）を有し、瘢痕がない。（ｃ）市販の皮膚治療製品と比較して、治癒時間および特性に関して優れた治癒力を有する。（ｄ）前記組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析によって、乾燥したＥＶｓの物理的または生物学的特性に著しい変化がないことが示された。
イヌモデルにおける誘発された軟骨損傷の修復における幹細胞由来ＥＶｓの効果を評価するための動物試験（ＩＩ）から、ＥＶｓの投与は、損傷した軟骨の機能的および形態学的回復に対して効果的であったこと、ならびに、経時的な悪化および線維軟骨を形成する線維組織のみによる欠損補充が見られた対照の関節に反し、再生医学における無細胞療法的アプローチに利用でき、組織病理学的評価において、成熟したコラーゲン線維によって、３か月の期間内に、軟骨の組織形態学的画像の修復が実現されたことが示された。

副作用：本発明の副作用は知られていない。

利用方法（ａ）ＥＶｓをロードした乾燥産物は、蒸留水または類似の溶媒で再構成される。（ｂ）前記産物は、必要とされる流動性／粘度にいかなる著しい変化も起こすことなく、速やかに元の形態に戻る。（ｃ）本発明は、経口摂取される錠剤／カプセルなどの形態で、または処置する場所のために調製および包装することができる（軟膏／注射剤／経口／．．．）。

有効性：
ＥＶｓは、脱水されているにもかかわらず、新たに調製したものと同じくらい効果的に、起源の細胞と同じ機能を果たす。
軟／硬組織の治癒を刺激／加速する、例えば、皮膚の異常／傷、心臓の異常、骨格筋の変性障害、肝臓および腎臓の変性障害、免疫刺激／調節、ならびに組織移植を治療する。
細胞のシグナル伝達、プロテオミクス、細胞増殖などのような、生物学的実験の評価のための、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のために使用できる。
免疫反応を引き起こさない。

予期される転帰：
幹細胞移植と比較して、本発明は、同様の治癒特性を維持している。
従来の薬物と比較して、本発明は、より速やかでより優れた軟組織／骨の治癒特性を実現するために使用することができる。
細胞毒性、感染、免疫反応、免疫拒絶などの副作用がない。

Claims (12)

1. 単一または多数の品種／種の遺伝的に関連する単一または多数のドナーから得られる幹細胞由来細胞外ベシクル（ＥＶｓ（ｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ））であり、かつ同じ種のドナーの間「種間（ｉｎｔｅｒ－ｓｐｅｃｉｅｓ）」で使用（異質性の使用、例えば、限定されないが、イヌまたはオオカミの他の品種に使用されるイヌのＥＶｓ）されるか、または「異種間」で使用（異種性の使用、例えば、それらに限定されないが、ヒトに使用されるウシのＥＶｓ）される幹細胞由来細胞外ベシクル（ＥＶｓ）を含む、乾燥したオンシェルフ組成物（ｏｎｓｈｅｌｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
2. ベシクルが、その有効性を保つために、保護物質でコーティングされている、請求項１に記載の組成物。
3. 保存時間／条件を改善し、かつ最終産物の製剤化および輸送を容易にするために、ベシクルをさらに乾燥させる、請求項１に記載の組成物。
4. ベシクルを、そのまま使用するか、特別の治療的／生物学的特性を増強させ／増大させ／追加するために、特定の生物学的および／または治療的効果（単数または複数）を達成するための他の成分（単数または複数）（限定されないが、ハーブ、抗生物質、ビタミン、または他の医薬的もしくは生物学的成分など）に混合または加えてもよい、請求項１に記載の組成物。
5. 生物学的に増強されたポリマーを生成するために、ベシクルが、他のポリマーと組み合わされている、請求項１に記載の組成物。
6. 異質性ドナー由来のベシクルが、異なる種の間で（異種的に）交差使用される、請求項１に記載の組成物。
7. （ａ）骨髄／脂肪組織を、ヒト、異なる動物種（イヌ、ネコ、ウマ、反芻動物など）から得ること、（ｂ）ＳＣｓを、実験室で骨髄／脂肪組織から単離すること、（ｃ）単離されたＳＣｓを、インキュベーター内で３～４週間培養すること、（ｄ）ＳＣｓに、前もって調整された培地中で、１週間ＥＶｓを分泌させておくこと、（ｅ）ＥＶｓを、前記調整された培地から、超遠心分離または分画を使用して収集すること、を含む、請求項１に記載の組成物の調製方法。
8. 単一および／または多数の種の、単一および／または多数の取得源「ドナー」から取得／収集した細胞外ベシクル（ＥＶｓ）を、その有効性および保存期間を保つために、（限定されないが、例えば）以下の物質、
   （ａ）多糖類（限定されないが、例えば、デンプン、セルロース、ゴム、グリコーゲン、ゼラチン、ペクチン、デキストリン、アルギン酸塩、キトサン）、（ｂ）糖タンパク質（例えば、セレクチン）、植物油脂または鉱物油脂（例えば、ラノリン）、および、類似の動物産物（例えば、卵白、乳）、またはそれらの天然または工業的誘導体、（ｃ）糖由来の酸（例えば、グリコール酸、酒石酸、クエン酸）、（ｄ）リポソーム、（ｅ）ナノ粒子およびナノキャリアー、（ｆ）天然または工業的プラスチックおよびポリエーテル化合物（例えば、ポリエチレングリコール）、（ｇ）治療組成物、すなわち塩溶液／リン酸緩衝食塩水、抗炎症剤（例えば、ＤＭＳＯ）など
   のいずれかを使用して、保護物質によってコーティングすることをさらに含む、請求項７に記載の組成物の調製方法。
9. 単一および／または多数の種の、単一および／または多数の取得源「ドナー」から取得／収集した細胞外ベシクル（ＥＶｓ）を、（限定されないが）凍結乾燥、噴霧乾燥、マイクロ波補助乾燥、アニーリング、脱水、および真空脱水によって乾燥することをさらに含む、請求項７に記載の組成物の調製方法。
10. 最終産物（キット）のレーザーによる生物学的刺激を含み、
    （ａ）前記キットが、効力および増殖を増大させるために、低レベルのレーザー照射によって刺激されてもよく、
    （ｂ）前記キットが、出力密度が５．５ｍＷ／ｃｍ^２であり、波長が６３５ｎｍである低レベルのレーザー波に２０分間曝露される、
    請求項７に記載の調製方法。
11. 請求項１に記載の組成物を含むキットであって、以下の再構成方法、
    （ａ）粘稠性ゲルまたは軟膏の形態を生じさせるために、少量の滅菌水または生理食塩水によって再構成する、（ｂ）水溶液（点眼剤または注射剤）を得るためのさらなる希釈、（ｃ）アトマイザー（噴霧または吸入）に詰められた水溶液、（ｄ）希釈された形態が、ロッド、糸、錠剤、ヒドロゲルなどのような異なる形状およびサイズを生じさせるための、他のポリマーとの電気紡績であってもよい（インプラント用）、（ｅ）乾燥した産物が、創傷／火傷皮膚ドレッシング材として絆創膏に加えられる、
    に従って使用するための異なる形態に製剤化されていてもよい凍結乾燥組成物を含む、キット。
12. 請求項１に記載の組成物を含むキットであって、異なるドナー（ヒトまたは動物）から収集され、「異質性」集団として同じ種の異なるレシピエントの間で使用される凍結乾燥組成物を含み、ここで、収集された前記ＥＶｓの前記「異質性」集団が、また、異なる種の間「異種性」（例えば、イヌからネコへ）でも使用される、キット。