JP2006506073A - 組織培養に基づく発現プロファイリング - Google Patents

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Abstract

組織サンプルからの信頼できる発現ライブラリを得る方法は、三次元スポンジ−ゲルに基づく組織培養基で培養された無傷組織からRNAを抽出することを含む。

Description

関連出願に対する相互参照
本願は、2002年11月12日出願の米国出願番号US60／425945に対する35 U.S.C. § 119(e)下での恩恵を主張するものである。その出願の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、発現分析用のmRNA源としてのサンプル、特には腫瘍サンプルの調製に関する。
腫瘍成育の予後用であって、薬剤に感受性を予測するための手段としての組織培養腫瘍サンプルの使用には長い歴史がある。組織培養薬剤感受性検査(HDRA(商標名))の基礎となるそれらの組織化学的技術については多くの文献がある。このように利用される三次元組織培養の使用を記載する参考文献一覧を、付表として本願に添付している。この技術の一般的特徴は、例えばシンらによる最近の論文(Singh, B., et al., Head and Neck (2002) 24:437-442)に記載されている。すなわちこの論文に記載されているように、生検サンプルを洗浄し、1〜2mm3の断片に切り分け、等量ずつコラーゲンスポンジ−ゲル(Gel Foam, Pharmacia ＆ Upjohn, Inc.)の0.5cm2片上に乗せる。次に、スポンジ−ゲル培養物を10％ウシ胎仔血清およびゲンタマイシン(50μｇ／mL)を含むDMEM／ハムのF12培地に入れる。次に、培養物を37℃および5％CO2で24時間インキュベートする。サンプルの三次元的性質が保存されるのであれば、この技術に変更を加えることも許容される。
予後および薬剤スクリーニング手段としての有用性に加えて、そのような培養物は発現プロファイリング用の基質としてのメッセンジャーRNA源としても有用であることが見出された。このことは、信頼できる発現ライブラリーの提供に関連する問題を考慮すると重要であり、特には腫瘍に存在する壊死領域を考慮し、治療もしくは診断センターからプロファイリング分析を行うことができる検査室に腫瘍組織を運ぶ必要があることを考慮すると、発現ライブラリーが、高品質で劣化しないRNA抽出が困難である患者サンプル由来である場合には重要である。三次元組織培養で腫瘍の非壊死部分を維持することによって、in situでの腫瘍の発現プロファイルが効果的に保存される。
本発明は、組織、特には腫瘍組織のプロファイリングを行ってその組織の特性決定を行うのに使用される発現に特徴的なmRNAライブラリの製造方法を提供する。腫瘍分析の場合、このプロファイルは、治療計画において有用であり、特にはある種のプロトコールに対する応答性が既知である同様の発現パターンを有する従来のサンプルと比較して有用である。特定の組織源に関係した特徴的発現プロファイルの他の用途については、当業者には明らかであろう。
そこで１態様において本発明は、組織発現に特有のRNAの製造方法であって、スポンジ−ゲル三次元培養で無傷の組織サンプルを培養した後、その培養物からRNAを抽出することを含む方法に関するものである。
抽出されたメッセンジャーRNAを次に、ノーザンブロットなどの当業界で認められている技術を用いて分析することができる。しかしながら、好ましくは、抽出されたmRNAを鋳型として用いてcDNAライブラリを得て、それを次に、ジーンチップ(GeneChip)に基づく技術などの一般に認められているアレイ技術を用いて分析することができる。他の態様において本発明は、本発明の方法によって製造されるmRNA、cDNAおよびcRNAライブラリに関するものであり、さらには予後および治療選択におけるそれらライブラリの使用方法に関するものである。
本発明は、発現プロファイリングのために組織サンプル、特には腫瘍組織サンプルを適切に保存するという問題を解決するものである。現時点では生検サンプルは、生検と分析用のRNA抽出との間の期間において、RNA劣化と発現パターンの変化を受ける。三次元組織培養で組織を無傷に維持することで、発現プロファイルの正確さが保存され、RNAの劣化が低減される。
本発明の方法では、従来の方法を用いて組織の生検を行い、その組織を寸法約1mm3の無傷の部分に分割する。当然のことながら、サンプルの大きさにおけるある程度の変動は許容されるものであり、例えば0.25mm3〜5mm3、0.5〜3mm3、好ましくは1〜2mm3の範囲の試験片が用いられる。次に、代表的にはシンらの報告(Singh, B., et al., (supra))および、例えば、ホフマンら(Hoffman, R.M., et al., Int′l J. Oncol. (1992) 1:467-474; Hoffman, R.M., in Encyclopedia of Life Sciences (2001) Nature Publishing Group, London.)が概説している複数の別の論文に記載されており、HDRA(商標名)を実施するに当たって当業界で一般的に知られているコラーゲンスポンジ−ゲルと無傷サンプルを結合させることにより、無傷組織片を三次元組織培養基に入れる。本発明の方法で有用なコラーゲン型スポンジ−ゲルは組織用の支持体として用いられることから、スポンジ−ゲルの寸法は断片の寸法よりかなり大きい。代表的には、スポンジ−ゲルの表面積は、無傷の組織サンプルの直径のほぼ２倍である。次に、三次元培養を、添付の刊行物に記載の培地などの好適な培地中で維持する。その培養は、RNA抽出用にサンプルを保存するのに必要な期間にわたって維持する。
RNA抽出は、当業界で標準的な技術を用いて行う。
発現ライブラリ源である組織サンプルは代表的には、腫瘍組織である。そこで本発明の方法は、乳房、肺、結腸、肝臓、胃、膵臓、前立腺、頭部および頸部、卵巣および脳の腫瘍についての発現プロファイルを評価する上で特に有用である。あらゆる固形腫瘍または実際にはあらゆる組織をライブラリ源として用いることが可能であることから、このリストは完全なものではない。
次に、研究者が必要であれば、抽出されたRNAを分析する。ノーザンブロット法を用いることができるが、市販の発現アレイ、例えば現在アフィメトリクス(Affymetrix)から入手可能な発現アレイを用いて、追加の情報を得ることができる。標識cDNA約15μｇが必要である。代表的には、逆転写によって、最も一般的にはT7RNAポリメラーゼプロモーターに結合したオリゴ-dTプライマーを用いてプライミングすることで、抽出されたRNAをcDNAに変換する。得られた１本鎖cDNAを２本鎖DNAに変換し、それによってT7ポリメラーゼ駆動in vitro転写(IVT)に好適なテンプレートが得られる。標識ヌクレオチドをin vivo転写時に組み込んで、生じるcRNAを後に検出できる。次に、生じる転写産物であるcRNAを用いて、チップ上に提供されたDNAアレイによって検出されるプロファイルを得る。
後者の測定において、Mg++含有緩衝液中で加熱することで標識cRNAを断片化し、サケ精子DNA、BSAおよびスパイクドコントロールRNA（spiked control RNA’s）を含むハイブリダイゼーションカクテル中で結合させる。カクテル約250μＬをジーンチップ(商標名)に加え、アフィメトリクス社の取扱説明書(Affymetrix Gene Chip Expression Analysis Technical Manual (2001))に記載されているとおり、50℃で16時間ハイブリダイズする。そこに記載のように、ハイブリダイゼーション後、チップを高および低ストリンジェンシー洗浄によって取り、次にビオチン化抗ストレプトアビジン抗体(Vector Labs)を用いるフィコエリトリン標識ストレプトアビジン(分子プローブ)抗体増幅によって染色し、フィコエリトリン標識ストレプトアビジンによってさらに染色する。さらに洗浄した後、アレイをアフィメトリクス社スキャナでデジタル化し、画像をソフトウエア(Microarray Suite 5(商標名))を用いて評価する。
以上の説明は、本発明の方法に従って培養物から抽出されるRNAを分析するのに用いることができる各種技術の例を示したに過ぎないものである。
ライブライの構成要素の測定から得られるデータを有効に用いて、本発明の方法に従って腫瘍組織を摘出および分析される被験者について結果を予測することができ、さらにそのデータを用いて、治療のプロトコールを計画し、化学的感受性を予測することもできる。

Claims (10)

  1. 組織の発現プロファイルを作成する方法であって、三次元コラーゲンスポンジ−ゲル培養基中で培養した前記組織の無傷サンプルからRNAを抽出する段階を含む方法。
  2. 前記RNAの分析を行って発現データを得ることをさらに含む請求項１に記載の方法。
  3. 前記抽出されたRNAをcDNAに変換することをさらに含む請求項１に記載の方法。
  4. 前記cDNAから標識cRNAを製造すること；ならびに
    前記cRNAをマイクロアレイ分析を用いて分析すること
    をさらに含む請求項３に記載の方法。
  5. 前記組織が腫瘍組織である請求項１に記載の方法。
  6. 前記組織が、乳房、肺、結腸、肝臓、胃、膵臓、前立腺、頭部、頸部、卵巣または脳のものである請求項５に記載の方法。
  7. 請求項１に記載の方法によって得られるRNA発現ライブラリ。
  8. 請求項３に記載の方法によって得られるcDNA発現ライブラリ。
  9. 請求項４に記載の方法によって得られるcRNA発現ライブラリ。
  10. 前記データに基づいて予後の準備することをさらに含む請求項２に記載の方法。
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