KR101142716B1 - 조직 배양에 기초한 발현 프로파일링 - Google Patents

조직 배양에 기초한 발현 프로파일링 Download PDF

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Abstract

3차원적 스폰지 젤에 기초하여 조직 배양으로 배양된 무손상 조직으로부터 RNA를 추출하는 것을 포함하여 이루어지는, 조직 샘플로부터 신뢰할만한 발현 라이브러리를 수득하는 방법.
조직배양, 조직, RNA, 발현, 라이브러리

Description

조직 배양에 기초한 발현 프로파일링{EXPRESSION PROFILING BASED ON HISTOCULTURES}
관련 출원에 대한 참고 문헌
본 출원은 35 U.S.C.§119(e)조에 의거한, 2002년 11월 12일자 미국특허출원 제60/425,945호의 우선권 주장 출원이다.
기술 분야
본 발명은 발현 분석용 mRNA 소스로서의 샘플, 특히 종양 샘플의 제조 방법에 관한 것이다.
조직 배양된 종양 샘플을 종양 발달의 예후 분석에 이용하거나 약물에 대한 반응성을 예측하기 위한 도구로서 사용하여 온 예는 상당히 많다. 조직 배양 항암제 감수성 분석 (HDRATM: histoculture drug response assay)의 기초가 되는 이러한 조직 화학적 기술에 관한 문헌은 상당히 많다. 이러한 방식으로 응용되는 3차원적 조직 배양의 이용에 관한 참고문헌목록이 부록으로서 본 출원에 첨부되어 있다. 이 기술의 일반적 특징은 예컨대 최근의 논문, Singh, B., 외, Head and Neck (2002) 24:437-442에도 설명되어 있다. 이 논문에 설명되어 있는 바와 같이, 생검 조직을 세정하여 1 내지 2 mm3 크기의 절편으로 절단한 다음 이를 동일한 양으로 0.5 cm2 크기의 콜라겐 스폰지 젤 (Gel Foam, Pharmacia & Upjohn, Inc. 제품) 위에 올려 놓는다. 이어서 이 스폰지 젤 배양물을 10% 소 태아 혈청과 겐타마이신(50 ㎍/ml)이 보강된 DMEM/Ham's F12 배지에 넣는다. 이 배양물을 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 인큐베이션시킨다. 이 기술의 변형법 역시 샘플의 3차원적 특성이 유지되는 한 허용가능하다.
최근 예후 분석 및 약물 스크리닝 도구로서의 이들의 유용성에 더하여, 이러한 배양물은 발현 프로파일링을 위한 기질로서의 메신저 RNA의 소스로서도 유용하다는 것이 밝혀졌다. 이것은 믿을만한 발현 라이브러리를 제공하는 것과 관련된 문제점, 특히 종양에 존재하는 괴사 부위로 인해, 고품질의 분해되지 않은 RNA를 추출하는 것이 어려운 환자의 샘플로부터 라이브러리를 유도하고자 할 경우 관련된 문제, 그리고 종양 조직을 처리 또는 분석 센터로부터 프로파일링 분석을 수행할 수 있는 실험실로 이동시킬 필요가 있다는 점에서 의미가 있다. 3차원적 조직 배양으로 종양의 비괴사성 부위를 온전히 유지함으로써, 종양의 in situ 발현 프로파일을 효과적으로 보존할 수 있다.
본 발명은 조직, 특히 종양 조직의 특성을 특징화하기 위해 상기 조직을 프로파일링하는데 사용하기 위한, 종양 발현에 특징적인 mRNA 라이브러리의 제조 방법을 제공한다. 종양을 분석하는 경우, 이 프로파일은 치료 방법에 대한 계획을 세울 때, 특히, 특정 프로토콜에 대한 반응성이 알려져 있는 유사한 발현 패턴을 갖는 조직 샘플과 비교하는 경우 유용하다. 특정 조직 소스와 관련된 특징적 발현 프로파일의 기타 용도 역시 당업자에게 자명할 것이다.
따라서, 한가지 측면에서, 본 발명은 스폰지 젤 3차원 배양으로 무손상(intact) 조직 샘플을 배양한 후, 상기 배양물로부터 RNA를 추출하는 것을 포함하여 이루어지는, 조직 발현에 특징적인 RNA를 조제하는 방법에 관한 것이다.
이와 같이 추출된 메신저 RNA는 노던 블롯법과 같은 공지 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 추출된 mRNA를 주형으로서 사용함으로써, GeneChips에 기초한 것과 같은 공지의 분석 기술을 이용하여 추가의 분석이 가능한, cDNA 라이브러리를 만드는 것이 좋다. 한가지 측면에서 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 mRNA, cDNA 및 cRNA 라이브러리에도 관하며, 이들 라이브러리를 이용하여 예후 분석 및 치료 방법을 선정하는 방법에 관한 것이기도 하다.
발명을 수행하기 위한 방식
본 발명은 발현 프로파일링을 위해 조직 샘플, 특히 종양 조직 샘플을 적절하게 보존하는 것과 관련된 문제점을 해결한다. 현재는, 생검 샘플은 생검과 분석용 RNA 추출 사이의 간격 동안 RNA의 열화(劣化)와 발현 패턴의 변화를 겪는다. 조직을 3차원 조직 배양시 무손상으로 유지함으로써, 발현 프로파일의 정확성을 유지할 수 있고 RNA의 분해도 최소화된다.
본 발명의 방법에서는, 상법에 따라 조직을 생검한 다음 약 1 mm3의 크기로 무손상 부분들로 절단한다. 물론 샘플의 크기를 예컨대, 0.25 mm3 - 5 mm3, 0.5 - 3 mm3, 바람직하게는 1-2 mm3으로 달리할 수도 있다. 전형적으로는 이러한 무손상 샘플을 Singh, B., 등의 상기문헌과 예컨대 Hoffman, R.M., 외, Int'l J. Oncol. (1992) 1:467-474; Hoffman, R.M., in Encyclopedia of Life Sciences (2001) Nature Publishing Group, London.과 같은 몇가지 논문들, 및 HDRAtm 실무 기술 분야에 널리 알려진 바와 같이, 콜라겐 스폰지 젤과 결합시킴으로써, 이러한 조직편들을 3차원 조직 배양시킨다. 본 발명의 방법에 유용한 콜라겐형 스폰지 젤은 조직의 지지체로서 사용되기 때문에 스폰지 젤의 크기는 조직 절편의 크기보다 실질적으로 더 크다; 일반적으로는, 스폰지 젤의 표면적은 무손상 조직 샘플의 직경의 대략 두배이다. 이어서 상기 3차원 배양물을 예컨대 첨부된 문헌 목록에서 설명된 것과 같은 적절한 배지 중에서 유지시킨다. RNA를 추출하기 위해 샘플을 보존하는데 필요한 기간만큼 배양시킨다.
당해 기술 분야의 표준 기술을 이용함으로써 RNA 추출을 수행한다.
발현 라이브러리의 소스가 되는 조직 샘플은 일반적으로 종양 조직이다. 따라서, 본 발명의 방법은 유방, 폐, 결장, 간, 위장, 췌장, 전립선, 두경부, 난소 및 뇌의 종양의 발현 프로파일을 분석하는데 특히 유용하다. 이러한 리스트는 비제한적인 것으로서, 여타의 고형암을 비롯하여 실제로 모든 조직이 라이브러리 소스로서 이용될 수 있다.
이어서 추출된 RNA를 연구자의 필요에 따라 분석한다. 노던 블롯 기술을 이요할 수 있지만, 시판되는 발현 분석도구, 예컨대, Affymetrix사가 시판하는 발현 분석 기구를 이용함으로써 부가적인 정보를 얻을 수 있다. 대략 15 ㎍의 표지된 dNDA가 필요하다. 전형적으로는, T7 RNA 폴리머라제 프로모터에 커플링되어 있는 올리고-dT 프라이머로 프라이밍시킴으로써, 추출된 RNA를 역전사에 의해 cDNA로 변환시킨다. 얻어진 단일 가닥 cDNA를 이중 가닥 DNA로 변환시키고 이로부터 T7 폴리머라제에 의해 추진되는 생체외 전사 (IVT: in vitro transcription)에 적합한 주형이 생산된다. 표지된 뉴클레오타이드를 생체내 전사시 통합시켜, 얻어진 cRNA의 사후 분석을 할 수 있다. 얻어진 전사 산물인 cRNA를 이용하여, 칩상에 공급된 DNA 분석 도구에 의해 분석되는 프로파일을 제공한다.
후자의 분석법에서는, 표지 cRNA를 Mg++함유 완충액 중에서 가열함으로써 단편화시킨 다음 연어 정자 DNA, BSA 및 스파이크된 컨트롤 RNA를 함유하는 하이브리다이제이션 칵테일 중에서 결합시킨다. Affymetrix Gene Chip Expression Analysis Technical Manual (2001)에 설명된 바와 같이, 대략 250 ㎕의 칵테일을 GeneChipsTM에 도포하여 50℃에서 16시간 동안 하이브리다이제이션시킨다. 상기 매뉴얼에 설명된 바와 같이, 하이브리다이제이션 후, 고스트린젠시 및 저스트린젠시 세정에 의해 수거한 다음, 바이오티닐화된 항스트렙트아비딘 항체 (Vector Labs)를 이용하여 피코에리드린으로 표지된 스트렙트아비딘 (분자 프로브) 항체 증폭 염색시킨 후 피코에리드린으로 표지된 스트렙트아비딘으로 다시 염색시킨다. 추가 세정 후, Affeymetrix 스캐너로 분석결과를 디지털화하고 Microarray Suite 5TM 소프트웨어를 이용하여 영상을 평가한다.
전술한 설명은 본 발명의 방법에 따라 배양물로부터 추출된 RNA를 분석하는데 이용할 수 있는 여러가지 기술 중, 단지 일부를 예시한 것일 뿐이다.
라이브러리 구성원의 분석 결과 얻어진 데이터를 이용함으로써 본 발명의 방법에 따라 종양 조직을 적출 및 분석받는 대상자의 분석 결과를 효과적으로 예측할 수 있고, 그에 따라 치료 프로토콜을 설계하거나 화학 감수성을 예측하는데도 이용할 수 있다.

Claims (10)

  1. 3차원 콜라겐 스폰지 젤 배양으로 무손상 조직 샘플을 배양하는 단계;
    배양된 상기 무손상 조직 샘플로부터 mRNA를 추출하는 단계; 및
    상기 mRNA를 분석하여 mRNA 발현 프로파일을 수득하는 단계를 포함하되,
    상기 mRNA를 추출할 때까지 상기 조직 샘플을 무손상으로 유지시키는 것을 특징으로 하는
    조직의 발현 프로파일을 작성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 추출된 상기 mRNA를 cDNA로 변환시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 cDNA로부터 표지 cRNA를 제조하는 단계; 및
    상기 cRNA를 마이크로어레이 분석법을 이용하여 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조직은 종양 조직인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 종양 조직은 유방, 폐, 결장, 간, 위장, 췌장, 전립선, 두경부, 난소 또는 뇌의 종양 조직인 방법.
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  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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