JP2006504396A - 核酸検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年3月13日に出願された「核酸検出方法」という名称の米国仮出願第60/364,230号の利益を主張し、その全内容を参照により本明細書に組み込む。
本発明は、分子生物学の分野に関連する。特に、本発明は、サンプル中の特定の核酸分子の検出および定量に関する。
本発明は、サンプル中の特定の核酸分子を検出するための、速く、確実かつ費用効率のよい方法を提供する。本発明の方法を用いて、多数の分子の中から、既知の配列を有する核酸分子の存在を検出することができる。
本明細書に引用された特許および科学文献は、当業者が入手可能な知識を明らかにするものである。本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、およびGenBankデータベースの配列を含む引用文献は、それぞれが特定かつ個別に参照により本明細書に組み込まれるとされるように、参照により本明細書に組み込まれる。
NAD(P)H:硝酸還元酵素をコードするトウモロコシmRNAの検出
トウモロコシNAD(P)H:硝酸還元酵素をコードするmRNAの発現を検出するために、一般的な方法に従って、トウモロコシの全RNAを単離する(例えば、前記のAusubel et al.を参照)。
5' CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC 3' (配列番号1)
を有する。
5' CCAGGACCTGGTCGAGCT 3' (配列番号2)
を有する。
5' aagctctgca tgcgcgcgta cacgcccacg agccccgtcg 3' (配列番号4)
である。
5' gaattcggat ccaatgcctt gggggggggg gggggggggg cgacggggct cgtgggcgtg 3' (配列番号6)
を有する。
5' tacgcgcgca tgcagagctt agctcgacca ggtcctgg 3' (配列番号8)
を有する。
トウモロコシ全RNAにおける、NAD(P)H:硝酸還元酵素mRNAおよびS−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼをコードするトウモロコシmRNAの検出
NAD(P)H:硝酸還元酵素mRNAおよびS−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼをコードするトウモロコシmRNAの存在を同時に検出するために、実施例Iに記載のようにトウモロコシより全RNAを単離する。さらに、以下の分子:
1.ユニバーサル配列を有する第2検出プローブ(S−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼmRNA用)を合成する。第2ユニバーサル配列は、以下の配列:
5' GGAGGAGGAG GAGGAGGAGA 3' (配列番号9).
を有する。
5' tacccagagc aaccaatggt taaccttgag atgtgcatga 3' (配列番号11)
である。
5' tggaacacca gttcttgggc tctcctcctc ctcctcctcc tcatgcacat ctcaaggtta 3' (配列番号13)
を有する。
5' accattggtt gctctgggta agctcgacca ggtcctgg 3' (配列番号15)
を有する。
Claims (24)
- 複数の鋳型(a plurality of templates)における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程:
(a)(i)ユニバーサル配列を含む検出プローブ;(ii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第1部分に相補的な3’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第2配列を含む第1オリゴヌクレオチド;(iii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的な5’末端配列を含む第2オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分が既知のヌクレオチド配列の第1部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド;(iv)第2オリゴヌクレオチドの一部に相補的な3’末端配列を含み、該3’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的ではない、プライマー;および(v)標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型;を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること;
(b)リガーゼが、既知のヌクレオチド配列の第1部分にハイブリダイズした第1オリゴヌクレオチドの3’末端と、既知のヌクレオチド配列の第2部分にハイブリダイズした第2オリゴヌクレオチドの5’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程(a)の産物をインキュベートすること;
(c)プライマーが伸長する条件下で、DNAポリメラーゼと工程(b)の産物をインキュベートすること;次いで、
(d)ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す;
を含む方法。 - 複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程:
(a)(i)ユニバーサル配列を含む検出プローブ;(ii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第1部分に相補的な3’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第2配列を含む第1オリゴヌクレオチド;(iii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的な5’末端配列を含む第2オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分が既知のヌクレオチド配列の第1部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド;(iv)第2オリゴヌクレオチドの一部に相補的な3’末端配列を含み、該3’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的ではない、プライマー;および(v)標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型;を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること;
(b)リガーゼが、既知のヌクレオチド配列の第1部分にハイブリダイズした第1オリゴヌクレオチドの3’末端と、既知のヌクレオチド配列の第2部分にハイブリダイズした第2オリゴヌクレオチドの5’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程(a)の産物をインキュベートすること;
(c)プライマーおよび第2プライマーの伸長によって標的核酸分子が増幅される条件下で、DNAポリメラーゼ、および第2プライマーの3’末端が、第1オリゴヌクレオチドの3’末端配列と第2配列の両方に対して5’である第1オリゴヌクレオチドの一部と同一である第2プライマーと、工程(b)の産物をインキュベートすること;次いで、
(d)ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す;
を含む方法。 - 複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程:
(a)(i)ユニバーサル配列を含む検出プローブ;(ii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第1部分に相補的な3’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第2配列を含む第1オリゴヌクレオチド;(iii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的な5’末端配列を含む第2オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分が既知のヌクレオチド配列の第1部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド;および(iv)標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型;を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること;
(b)リガーゼが既知のヌクレオチド配列の第1部分にハイブリダイズした第1オリゴヌクレオチドの3’末端と、既知のヌクレオチド配列の第2部分にハイブリダイズした第2オリゴヌクレオチドの5’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程(a)の産物をインキュベートすること;
(c)プライマーが伸長する条件下で、DNAポリメラーゼ、および第2オリゴヌクレオチドの一部に相補的な3’末端配列を含み、該3’末端配列が、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的ではないプライマーと、工程(b)の産物をインキュベートすること;次いで、
(d)ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す;
を含む方法。 - 複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程:
(a)(i)ユニバーサル配列を含む検出プローブ;(ii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第1部分に相補的な3’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第2配列を含む第1オリゴヌクレオチド;(iii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的な5’末端配列を含む第2オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分が既知のヌクレオチド配列の第1部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド;および、(iv)標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型;を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること;
(b)リガーゼが、既知のヌクレオチド配列の第1部分にハイブリダイズした第1オリゴヌクレオチドの3’末端と、既知のヌクレオチド配列の第2部分にハイブリダイズした第2オリゴヌクレオチドの5’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程(a)の産物をインキュベートすること;
(c)プライマーおよび第2プライマーの伸長によって標的核酸分子が増幅される条件下で、DNAポリメラーゼ、第2オリゴヌクレオチドの一部に相補的な3’末端配列を含み、該3’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列に相補的ではないプライマー、ならびに第2プライマーの3’末端配列が、第1オリゴヌクレオチドの3’末端および第2配列の両方に対して5’である第1オリゴヌクレオチドの一部と同一である第2プライマーと、工程(b)の産物をインキュベートすること;次いで、
(d)ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す;
を含む方法。 - 複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程:
(a)(i)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第1部分に相補的な3’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第2配列を含む第1オリゴヌクレオチド;(ii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的な5’末端配列を含む第2オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分が既知のヌクレオチド配列の第1部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド;および(iii)標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型;を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること;
(b)検出プローブが第1オリゴヌクレオチドの第2配列にハイブリダイズする条件下で、ユニバーサル配列を含む検出プローブと、およびリガーゼが既知のヌクレオチド配列の第1部分にハイブリダイズした第1オリゴヌクレオチドの3’末端と、既知のヌクレオチド配列の第2部分にハイブリダイズした第2オリゴヌクレオチドの5’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと、工程(a)の産物をインキュベートすること;
(c)プライマーが伸長する条件下で、DNAポリメラーゼ、および第2オリゴヌクレオチドの一部に相補的な3’末端配列を含み、該3’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的ではないプライマーと、工程(b)の産物をインキュベートすること;次いで、
(d)ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す;
を含む方法。 - 複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程:
(a)(i)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第1部分に相補的な3’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第2配列を含む第1オリゴヌクレオチド;(ii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的な5’末端配列を含む第2オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分が既知のヌクレオチド配列の第1部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド;および(iii)標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型;を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること;
(b)検出プローブが第1オリゴヌクレオチドの第2配列にハイブリダイズする条件下で、ユニバーサル配列を含む検出プローブと、およびリガーゼが既知のヌクレオチド配列の第1部分にハイブリダイズした第1オリゴヌクレオチドの3’末端と、既知のヌクレオチド配列の第2部分にハイブリダイズした第2オリゴヌクレオチドの5’末端の間の共有結合を形成させる条件下でリガーゼと、工程(a)の産物をインキュベートすること;
(c)プライマーおよび第2プライマーの伸長によって標的核酸分子が増幅される条件下で、DNAポリメラーゼ、第2オリゴヌクレオチドの一部に相補的な3’末端配列を含み、該3’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的ではないプライマー、および第2プライマーの3’末端配列が、第1オリゴヌクレオチドの3’末端と第2配列の両方に対して5’である第1オリゴヌクレオチドの一部と同一である、第2プライマーと、工程(b)の産物をインキュベートすること;次いで、
(d)ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す;
を含む方法。 - プライマーおよび第2プライマーのヌクレオチド配列が同一である、請求項2、4または6の方法。
- 検出プローブの3’末端が標識されたものである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- 検出プローブの5’末端がクエンチング部分に共有結合したものである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- 第2オリゴヌクレオチドの5’末端がリン酸化されたものである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- 標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第1部分に相補的な第1オリゴヌクレオチドの3’末端配列が、長さ約20ヌクレオチドである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- 標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的な第2オリゴヌクレオチドの5’末端配列が、長さ約20ヌクレオチドである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- ユニバーサル配列が、長さ約20ヌクレオチドである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- ユニバーサル配列が、長さ約60ヌクレオチドである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- 第2オリゴヌクレオチドが、長さ約40ヌクレオチドである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- プライマーの3’末端配列が、長さ約20ヌクレオチドである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- 第2プライマーの3’末端配列が、長さ約20ヌクレオチドである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- ハイブリダイズしていない検出プローブが短くされ、短くされたハイブリダイズしていない検出プローブの存在が複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示すものである、請求項1、2、3、4、5または6の方法。
- 複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するためのキットであって、以下の:(i)ユニバーサル配列を含む検出プローブ;(ii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第1部分に相補的な3’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第2配列を含む第1オリゴヌクレオチド;(iii)標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的な5’末端配列を含む第2オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分が既知のヌクレオチド配列の第1部分に隣接するものであるオリゴヌクレオチド;および、(iv)第2オリゴヌクレオチドの一部に相補的な3’末端配列を含み、該3’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第2部分に相補的ではないプライマー;および(v)ハイブリダイズしていない検出プローブの検出手段;を含むキット。
- リガーゼをさらに含む、請求項19のキット。
- DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項19のキット。
- 第2プライマーをさらに含む、請求項19のキットであって、第1オリゴヌクレオチドの3’末端配列および第2配列の両方に対して5’である、第2プライマーの3’末端配列が第1オリゴヌクレオチドの一部と同一であるキット。
- 第1オリゴヌクレオチドの5’末端配列が第2オリゴヌクレオチドの3’配列に相補的である、請求項19のキット。
- ハイブリダイズしていない検出プローブの検出手段が、短くされたハイブリダイズしていない検出プローブを検出できるものである、請求項19のキット。
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