JP2006503554A - ポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドによりコードされ、ジケトピペラジン誘導体の合成に関与するポリペプチド - Google Patents
ポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドによりコードされ、ジケトピペラジン誘導体の合成に関与するポリペプチド Download PDFInfo
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Abstract
Description
単純なシクロジペプチドは、ジケトピペラジン誘導体のわずかな部分のみを構成し、この大部分は、主環および/または側鎖が多くの修飾を含む、より複雑な構造を有する。この修飾とは、炭素ベース、ヒドロキシ、ニトロ、エポキシ、アセチルまたはメトキシ基の導入、およびジスルフィド架橋または複素環の形成である。2つの炭素間の二重結合の形成も非常に多い。海洋起源のある誘導体はハロゲン原子を結合している。
これを行うには、これらの分子を大量に得ることができることが必要である。
実は、ジケトピペラジン誘導体の化学合成経路はすでに記載されているが、最も複雑な誘導体についての収率は低く、該方法を常に工業化することができない。
アルボノウルシンの合成経路の研究において、本発明者らはポリヌクレオチド(以下、BamH1ポリヌクレオチド(配列番号5)という)を証明しているが、これは、4つのオープンリーディングフレームを有し、そのそれぞれが、ストレプトミセス・ノウルセイおよびストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)のような異種宿主内でのL-フェニルアラニンおよびL-ロイシン残基からのアルボノウルシンの合成ならびに輸送の工程のそれぞれを請け負うポリペプチドをエンコードしている(図2および3を参照)。
−第一のオープンリーディングフレームorf1 (albA、配列番号1)が、Gondryら、Eur. J. Biochem.、2001、268、1712〜1721に記載のようなシクロジペプチドオキシダーゼ(CDO)活性に関与するポリペプチド(AlbA、配列番号6)をエンコードすること(α,β-脱飽和);
を示すことができた。
このポリヌクレオチドは、α,β-不飽和ジケトピペラジン誘導体の合成に必要な酵素をエンコードする。
このポリヌクレオチドは、α,β-不飽和ジケトピペラジン誘導体の合成と、それらの輸送と、それらの分泌とに必要な酵素をエンコードする。
つまり、オープンリーディングフレームalbC (配列番号3)を含むポリヌクレオチドは、シクロジペプチドを形成するように、同じであっても異なっていてもよい2つのアミノ酸の環化を許容する酵素をエンコードする。オープンリーディングフレームalbCおよびalbD (配列番号3および配列番号4)を含むポリヌクレオチドは、まずシクロジペプチドを形成するように、同じであっても異なっていてもよい2つのアミノ酸を環化し、次に該ジペプチドを輸送することを許容する酵素をエンコードする。
該ベクターは、ベクターの複製および/またはポリヌクレオチドによりエンコードされるポリペプチドの発現に必要ないずれの調節配列(プロモーター、終結部位など)も含むことができる。
これらがプライマーである場合、該ポリヌクレオチドまたは断片はアンチセンス配列も含む。
本明細書では、そのアミノ酸配列が配列番号7〜配列番号10の配列の少なくとも1つのアミノ酸配列と少なくとも80%の類似性を示し、かつポリペプチドがその当初の活性を保持している場合に、該ポリペプチドが実質的に相同な配列を有するとみなす。
「同じ群のアミノ酸」の表現は、実質的に同じ化学特性を有するアミノ酸を意味することを意図する。具体的には、この用語は実質的に同じ電荷および/または同じサイズおよび/または同じ親水性もしくは疎水性および/または同じ芳香族性を有するアミノ酸を意味することを意図する。
(i) グリシン、アラニン
(ii) イソロイシン、ロイシン、バリン
(iii) トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン
(iv) アスパラギン酸、グルタミン酸
(v) アルギニン、リシン、ヒスチジン
(vi) セリン、スレオニン
を含む。
このような生物系は、宿主として原核生物または真核生物を用いるいずれの既知の異種発現系であり得る。例として、微生物、例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)もしくはストレプトミセス・リビダンスのような細菌、または動物もしくは昆虫細胞が挙げられる。
該生物系は、上記で定義するようなシクロジペプチドおよびα,β-不飽和ジケトピペラジン誘導体を良好な収率で合成するのに適している。
(1) 同一または異なっていてもよい2つのアミノ酸を、適切な条件下でAlbC(配列番号9)と接触させ、そして
(2) 得られるシクロジペプチドを精製する
ことを特徴とする、シクロジペプチドをインビトロで合成する方法でもある。
(1) 同一または異なっていてもよい2つのアミノ酸を、適切な条件下でAlbC(配列番号9)と接触させ、そして
(2) 工程(1)で得られるシクロジペプチドをAlbA(配列番号6)、AlbB1(配列番号7)およびAlbB2(配列番号8)と接触させて、得られるα,β-不飽和ジケトピペラジン誘導体を精製する
ことを特徴する、3位および6位においてα,β-不飽和アミノ酸側鎖で置換されたジケトピペラジン誘導体をインビトロで合成する方法でもある。該方法は、工程(2)において、ポリペプチドAlbD(配列番号10)も含むことができる。該方法は、工程(1)と工程(2)との間に、工程(1)で得られるシクロジペプチドを精製する付加工程を任意に含んでもよい。
−0.1 nM〜10μMの間、好ましくは10 nM〜1μMの間の濃度のポリペプチド(AlbA、AlbB、AlbCおよび/またはAlbD)を;
−0.1 mM 〜100 mMの間、好ましくは1 mM〜10 mMの間の濃度の同一または異なっていてもよいアミノ酸の存在下に;
−6.8〜8.0の間のpHを有する0.1 M Tris-HClバッファー中に、28℃〜40℃の間の温度で2時間〜48時間の間の期間。
(1) 少なくとも配列番号3 (AlbCをエンコードするalbC)のポリヌクレオチドを含む生物系を、選択される生物系の培養に適する条件下で接触させ、そして
(2) 得られるシクロジペプチドを精製する
ことを特徴とする、シクロジペプチドを合成する方法でもある。該生物系は、配列番号4 (AlbDをエンコードする)のポリヌクレオチドも含み得る。
(1) 配列番号1〜3 (AlbA、AlbBおよびAlbCをエンコードする)の配列に相当するポリヌクレオチドを含む生物系を、この選択される生物系の培養に適する条件下で接触させ、そして
(2) 得られるα,β-不飽和ジケトピペラジン誘導体を精製する
ことを特徴とする、3位および6位においてα,β-不飽和アミノ酸側鎖で置換されたジケトピペラジン誘導体を合成する方法でもある。該生物系は、配列番号4 (AlbDをエンコードする)の配列に相当するポリヌクレオチドも含み得る。
同様に、本発明の方法によると、ポリペプチドAlbA、AlbB、AlbCおよびAlbDは、0.1 nM〜10μMの間、好ましくは10 nM〜1μMの間の量で存在する。
−図1は、ジケトピペラジン環(A)およびアルボノウルシン(B)の化学構造を表す。
−図2は、アルボノウルシンの合成に必要な遺伝子クラスタを含むストレプトミセス・ノウルセイのゲノム領域の図を表し、ここでorf1はalbAに相当し、orf2はalbBに相当し、orf3はalbCに相当し、orf4はalbDに相当する。
−図4は、種々のオープンリーディングフレーム(またはorf)をエシェリヒア・コリまたはストレプトミセス・リビダンスに導入するために作製される、あるプラスミド構築物を表す。
−図5は、プラスミドpSL128(A)、pUWL201 (B)およびpSL129 (C)の導入により形質転換されたストレプトミセス・リビダンスの培地の分析の結果を表す。
A:CDOの存在下でインキュベーションしたエス・リビダンス[pSL168];
B:CDOの不在下でインキュベーションしたエス・リビダンス[pSL168];
C:CDOの存在下または不在下でのエス・リビダンス[pSL159];
D:CDOの存在下でインキュベーションしたストレプトミセス・リビダンスTK21
実施例1:ストレプトミセス・ノウルセイにおける本発明のポリヌクレオチドの単離
ストレプトミセス・ノウルセイでのアルボノウルシンの生合成に必要な全ての遺伝情報を含むポリヌクレオチドを、PCRによる遺伝子増幅に基づくアプローチによりこの微生物の全ゲノムから単離した。
ストレプトミセス・ノウルセイにおいて、シクロジペプチドオキシダーゼ(CDO)とよばれ、シクロジペプチドであるシクロ(L-Phe-L-Leu)のアルボノウルシンへの変換を触媒する酵素についての部分ペプチド配列情報を、M. Gondryら(Gondryら、2001、上記)に記載のプロトコルに従って、精製された酵素のトリプシン加水分解により得られるポリペプチドのエドマン法による直接シーケンシングにより取得した。15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクマシーブルーを用いるタンパク質の染色による酵素画分の成分の分離の後、約21000ダルトンの分子質量のタンパク質を含むゲルのバンドを切り出し、1 mlの50 mM Tris HClバッファー、pH 8中で、トリプシン(トリプシン/基質相対濃度= 1/50)の存在下に、20時間、37℃でインキュベートする。
ストレプトミセス・ノウルセイの全RNAを、Kieserら(Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation Norwich, U.K. (2000))により記載されるプロトコルに従って培地5 (ATCC培地)中での24時間の培養物から抽出した。DNアーゼIを用いる追加の処理により、DNAを完全に除去することが可能になる。変性オリゴヌクレオチド(センスおよびアンチセンス)を、Sigma Genosys Ltdにより合成し、RT-PCRを、標準の使用説明に従って各反応について1μgの全RNAを用いるTitan (登録商標) One Tube RT-PCRキット(Boehringer Mannheim)を用いて行った。逆転写を50℃で30分間行い、続くPCR条件は次のとおりである:最初の変性を97℃で4分間、続いて95℃で1分間、50℃で1分間および68℃で1分間を45サイクル、そして最後のポリメラーゼ反応を68℃で10分間。反応産物を1.5%アガロースゲル電気泳動により分析し、次いで精製する (DNA and Gel Band精製キット、Pharmacia)。
標準の手法(Kieserら、上記;J. Sambrookら、Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))に従ってストレプトミセス・ノウルセイから抽出したゲノムDNA (2.5μg)を、0.33 UのBamHIにより部分消化し、約35〜45 kbのDNA断片を得た。これらの断片を、予めBamHIにより消化し、脱リン酸化を行ったコスミドベクターpWED1へのライゲーションにより導入する。ライゲーション産物を、インビトロでラムダファージ(Packagene Lambda DNAパッケージングシステム、Promega)に封入し、イー・コリ(SURE)株へのトランスフェクションにより導入した。
次いで、RT-PCRにより増幅したヌクレオチド断片を、T7 Quick Primeキット(Pharmacia)を用いて、 [α-32P]-dCTPを用いるランダムプライミングにより標識し、ライブラリをスクリーニングするためのプローブとして用いた。標準法(J. Sambrookら、上記)に従うコロニーハイブリダイゼーションにより、約2000のクローンを試験し、12のクローンを選択した。対応するコスミド(pSL110〜pSL121という)を抽出し、BamHIで消化し、プローブとしてRT-PCR断片を用いるサザンブロッティング法により分析した。このプローブにより、全てのコスミドに共通であり、かつBamHIで消化したストレプトミセス・ノウルセイのゲノムDNA中にも存在する3.8 kbのヌクレオチド断片を単離することができた。このBamHI断片を、コスミドpSL117から単離し、ベクターpBC SK+にクローニングしてベクターpSL122 (用いたベクターの定義:表4参照)を得た。
本発明のポリヌクレオチドの自動化シーケンシングを、DYEnamic ETターミネーターサイクルキット(Pharmacia)を用いてABI PRISM Genetic Analyzer (Perkin Elmer)により、またはGenome Express社により行った。配列のコンピューター分析およびデータバンクとの比較をFrame (Bibb, M.J.ら、Gene、30、157〜166 (1984))、BLASTおよびFASTA (Altschul, S.F.ら、Nucleic Acids Res.、25、3389〜3402 (1997);Pearson, W.R.、Methods in Enzymology、183、63〜98 (1990))プログラムを用いて行った。
DNAの抽出および調製、エシェリヒア・コリおよびストレプトミセス・リビダンスTK 21株の形質転換、ならびにプロトプラストの調製は、Sambrookら(上記)およびKieserら(上記)により記載される標準プロトコルに従って行った。
pSL122は、クローニングベクターpBC SK+にクローニングされた、本発明の主題であるストレプトミセス・ノウルセイからの3.8 kb BamHIポリヌクレオチド(配列番号5)を含む。pSL127およびpSL145は、それぞれ、pSL122をApaIまたはEcoRIで消化し、再びライゲーションすることにより構築された。
orf3について:
sylv24:(配列番号20):
5'-CGGCTGCAGG AGAAGGGAGC GGACATATGC TTGCAGGCTT AGTTCCC-3' (PstI部位に下線)
5'-CGGTCCCGTG GATCCAAGCT TCTAGGCCGC GTCGGCCAGC TC-3' (BamHI部位に下線)
sylv19:(配列番号22):
5'-GAGCGGGATC CTGCAGTGTC ATGGGGAGGA CAGGAC-3' (PstI部位に下線)
5'-CGATCACGTG GATCCAAGCT TGCCAATCCT GTACGCGATT T-3' (BamHI部位に下線)
(orf3 + orf4)について:sylv24およびsylv18
ストレプトミセス・リビダンス TK21プロトプラストを、Sambrookら(上記)およびKieserら(上記)により記載される標準プロトコルに従って、pSL128 (BamHIポリヌクレオチド(配列番号5)を含む)、pSL129またはpUWL201 (コントロール)で形質転換した。3種の株を、大過剰のアミノ酸を含有する富栄養培地であるM5培地(ATCC培地)で、3日間、28〜30℃の間の温度で培養した。3種の形質転換株の培養物からの上清を、次の条件下の逆相HPLCにより分析した:培養上清(500μl)をろ過(ウルトラフリー-MC 10 kDa、Millipore)して、HPLC (Vydac C18カラム(4.6×250 mm):流速:1 ml/分;溶出:45分間で0.1%トリフルオロ酢酸中の0〜45%アセトニトリルの直線勾配)に直接注入した。溶出液を200〜600 nmの間の多波長検出器を用いてモニターした。
コントロール株のエス・リビダンス[pUWL201]およびエス・リビダンス[pSL129] (図5Bおよび5C)において、アルボノウルシンの産生は検出されない。
ストレプトミセス・ノウルセイからのBamHIポリヌクレオチド(配列番号5)は、アルボノウルシンの産生のための遺伝的情報を全て含む。
単離されたコロニーでのシクロジペプチドのビスデヒドロシクロジペプチドへの変換を直接検出するために、ペトリ皿での迅速な試験を開発した。この試験は、溶液中で無色のシクロジペプチドであるシクロ(L-Trp-L-Trp)の、CDO活性を示すコロニーに明黄色を与える黄色の不溶性物質であるシクロ(ΔTrp-ΔTrp) (λmax = 367 nmおよび450 nm)への変換に基づく。
37℃で16時間のインキュベーション後、イー・コリ[pSL122] (BamHIポリヌクレオチドを含む)およびイー・コリ[pSL145] (orf3〜orf5が欠失したBamHI断片を含む)株は強い黄色の着色を示すが、イー・コリ[pBC SK+] (未処理のクローニングベクターを含む)およびイー・コリ[pSL127] (orf2〜orf5が欠失したBamHI断片を含む)は着色しない。
実施例4に記載される培養条件下でのorf3 (albC、配列番号3)、orf4 (albD、配列番号4)およびorf5が欠失したBamHIポリヌクレオチドを含むプラスミドpSL142で形質転換したストレプトミセス・リビダンスTK21株の培養物からの上清のHPLC分析により、アルボノウルシンの産生がないことが証明され、つまりジケトピペラジン誘導体の産生におけるorf3および/またはorf4の関与が示される。
実施例6に記載された結果を確かめるために、orf3 (albC)およびorf4 (albD)を別々にシャトルプラスミドpUWL201にクローニングして、それぞれpSL168 (orf3)およびpSL159 (orf4)を得た。これらを、Sambrookら(上記)およびKieserら(上記)により記載される標準プロトコルに従ってストレプトミセス・リビダンス TK21に導入した。
CDOの存在下でインキュベートしたエス・リビダンス[pSL168]からの培養上清において、アルボノウルシン (シクロ(ΔPhe-ΔLeu)) (40.5分にピーク;λmax = 318 nm;m = 256.4 Da)およびシクロ(ΔPhe-ΔPhe) (44.1分にピーク;λmax = 338 nm;m = 290.3) (パネルA)が検出された。
−CDOの不在下または存在下でのエス・リビダンス[pSL159]からの培養上清(パネルC);
−CDOの存在下でインキュベートしたストレプトミセス・リビダンスTK21からの培養上清(パネルD)
において、代謝物は検出されなかった。
実施例7の変形に従って、ポリヌクレオチドorf3-orf4 (albC-albD)をシャトルプラスミドpUWL201にクローニングし、得られるプラスミドpSL167を、Sambrookら(上記)およびKieserら(上記)により記載される標準プロトコルに従ってストレプトミセス・リビダンスTK21に導入した。
N-末端またはC-末端のポリヒスチジン配列(Hisタグ)を含むベクターpET-28a(+)を用いて、組換えタンパク質の精製を促進するために、ポリヌクレオチドalbA-albBを含む発現ベクターを構築した。196アミノ酸残基のポリペプチドをエンコードするalbAの最も短い配列を選択した。PCRによるポリヌクレオチドの遺伝子増幅を、NdeI (センス)およびXhoI (アンチセンス)クローニング部位を含むように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。
−増殖温度:20℃
−発現の誘発:0.6 mM IPTG
−インキュベーション時間:16時間
であった。
実施例9に記載の方法に従って精製し、Gondryら(上記)により記載されるような標準の条件下でインキュベートした酵素調製物は、シクロペプチドのモノデヒドロシクロジペプチドおよびビスデヒドロシクロジペプチドへのインビトロでの変換を触媒する。
−シクロ(L-Phe-L-Leu)から:シクロ(ΔPhe-L-Leu) (λmax = 297 nmおよびm = 258 Da)およびシクロ(ΔPhe-Δ-Leu) (λmax = 316 nmおよびm = 256 Da)。
Claims (31)
- 配列番号1、配列番号2および配列番号3の配列に相当する少なくとも3つのオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする、単離された天然または合成のポリヌクレオチド。
- 配列番号4の配列に相当するオープンリーディングフレームも含むことを特徴とする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号5の配列に相当することを特徴とする、単離された天然または合成のポリヌクレオチド。
- 配列番号2、配列番号3および配列番号4の配列に相当する3つのオープンリーディングフレームの少なくとも1つを含むことを特徴とする、単離された天然または合成のポリヌクレオチド。
- 配列番号2、配列番号3または配列番号4の配列のいずれか1つに相当する、単離された天然または合成のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドの1つを含むことを特徴とするベクター。
- プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、放線菌の組み込み要素、ウイルスまたはバクテリオファージであることを特徴とする、請求項6に記載のベクター。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つ、またはその少なくとも15ヌクレオチドの断片の1つ、または請求項6もしくは7のいずれか1つに記載のベクターの1つの、プローブとしての使用。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つ、またはその少なくとも15ヌクレオチドの断片の1つ、または請求項6もしくは7のいずれか1つに記載のベクターの1つの、核酸配列を増幅するためのプライマーとしての使用。
- 配列番号7〜配列番号10の配列の少なくともいずれか1つを含むことを特徴とする、単離された天然または合成のポリペプチド。
- 配列番号7〜配列番号10の配列のいずれか1つに相当することを特徴とする、単離された天然または合成のポリペプチド。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドの1つ、または請求項6もしくは7のいずれか1つに記載のベクターの1つにエンコードされることを特徴とする、単離された天然または合成のポリペプチド。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、または請求項6もしくは7のいずれか1つによるベクターの、請求項10〜12のいずれか1つに記載のポリペプチドの製造のための使用。
- 特にインビトロにおける、単独または組み合わせでの請求項10〜12のいずれか1つに記載の少なくとも1つのポリペプチドの、シクロジペプチドおよび/または3位および6位においてα,β-不飽和アミノ酸側鎖で置換されたジケトピペラジン誘導体、特にアルボノウルシンを製造するための使用。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド、または請求項6もしくは7のいずれか1つに記載のベクターの、修飾生物系または修飾インビトロ無細胞系を製造するための使用。
- 修飾生物系が、微生物、または原核生物もしくは真核生物を宿主として用いる異種発現系であることを特徴とする請求項15に記載の使用。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つおよび/または請求項6もしくは7のいずれか1つに記載のベクターの少なくとも1つを含むことを特徴とする、修飾生物系。
- 微生物、または原核生物もしくは真核生物を宿主として用いる異種発現系、あるいはインビトロ無細胞系からなることを特徴とする、請求項17に記載の生物系。
- 微生物がエシェリヒア・コリまたはストレプトミセス・リビダンスのような細菌であることを特徴とする、請求項18に記載の生物系。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つおよび/または請求項6もしくは7のいずれか1つに記載のベクターの少なくとも1つを含むことを特徴とする、修飾インビトロ無細胞系。
- 請求項17〜19のいずれか1つに記載の少なくとも1つの修飾生物系、または請求項20に記載の修飾インビトロ無細胞系の、シクロジペプチドおよび/または3位および6位においてα,β-不飽和アミノ酸側鎖で置換されたジケトピペラジン誘導体、特にアルボノウルシンを製造するための使用。
- (1) 同一または異なっていてもよい2つのアミノ酸を、適切な条件下でポリペプチドAlbC(配列番号9)と接触させ、そして
(2) 得られるシクロジペプチドを精製する
ことを特徴とする、シクロジペプチドをインビトロで合成する方法。 - (1) 同一または異なっていてもよい2つのアミノ酸を、適切な条件下でポリペプチドAlbC(配列番号9)と接触させて、得られるシクロジペプチドを精製し、そして
(2) 工程(1)で得られるシクロジペプチドをAlbA(配列番号6)、AlbB1(配列番号7)およびAlbB2(配列番号8)と接触させて、得られるα,β-不飽和ジケトピペラジン誘導体を精製する
ことを特徴する、3位および6位においてアミノ酸側鎖で置換されたα,β-不飽和ジケトピペラジン誘導体をインビトロで合成する方法。 - 工程(2)において、ポリペプチドAlbD(配列番号10)も含むことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- ポリペプチドの量が0.1 nM〜10μMの間、好ましくは10 nM〜1μMの間である、請求項22〜24のいずれか1つに記載の方法。
- (1) 少なくともポリヌクレオチドalbC(配列番号3)を含む生物系を、この選択される生物系の培養に適する条件下で接触させ、そして
(2) 得られるシクロジペプチドを精製する
ことを特徴とする、シクロジペプチドを合成する方法。 - 生物系がポリヌクレオチドalbD(配列番号4)も含むことを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- (1) 少なくともalbAとalbBとalbC(配列番号1〜3)とを含むポリヌクレオチドを含む生物系を、この選択される生物系の培養に適する条件下で接触させ、そして
(2) 得られるα,β-不飽和ジケトピペラジン誘導体を精製する
ことを特徴とする、3位および6位においてα,β-不飽和アミノ酸側鎖で置換されたジケトピペラジン誘導体を合成する方法。 - 生物系がポリヌクレオチドalbD(配列番号4)も含むことを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 生物系が微生物、例えばエシェリヒア・コリもしくはストレプトミセス・リビダンスのような細菌、または原核生物もしくは真核生物を宿主として用いる既知の異種発現系、あるいはインビトロ無細胞系であることを特徴とする、請求項26〜29のいずれか1つに記載の方法。
- アミノ酸の量が0.1 mM〜100 mMの間、好ましくは1 mM〜10 mMの間であることを特徴とする、請求項22〜30のいずれか1つに記載の方法。
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