JP2006317201A

JP2006317201A - 核酸増幅反応の新規短時間検出方法

Info

Publication number: JP2006317201A
Application number: JP2005137993A
Authority: JP
Inventors: Hideaki Hanaki; 秀明花木; Satoshi Omura; 智大村
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 2005-05-11
Filing date: 2005-05-11
Publication date: 2006-11-24
Anticipated expiration: 2025-05-11
Also published as: JP4675671B2

Abstract

【課題】ｄＮＴＰ重合反応の結果を、従来法である電気泳動法や蛍光法等を用いることなく簡便な操作方法で５分以内に目視で判定可能な方法を提供する
【解決手段】ｄＮＴＰの重合反応液をベタイン存在下に酸性条件とすることにより、該反応液中に核酸が析出物として検出されることを指標として、該重合反応の結果を判定する。また、未反応のｄＮＴＰに結合している有機リン酸が呈色できない条件下で、ｄＮＴＰの重合反応液をベタイン存在下又は不存在下に酸性条件にするとともに、モリブテン酸もしくはモリブテン酸塩と還元剤を添加し、該反応液中に核酸が析出物として検出されること及び又は遊離のピロリン酸とピロリン酸金属塩ならびに遊離のリン酸とリン酸金属塩を呈色させることを指標として判定する。本発明方法は、判定の誤差を少なくすることが出来、検出感度が高まる利点もある。また、判定に要する時間は約５秒〜５分で、従来の方法に比べて大幅に短い。

Description

本発明は、ＰＣＲ等の核酸増幅法における、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：以下ｄＮＴＰ）の重合反応生成物である核酸とピロリン酸の簡易検出法に関する。

遺伝子を用いた診断方法として核酸重合（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）法やｌｉｇａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）法が用いられてきた。これらを実施するためには、高価なサーマルサイクラー（温度サイクリング増幅法）が必要なばかりか、特定のサーマルサイクラーでしか反応できないことも頻繁におこり、簡便で安価な迅速診断にはなり得なかった。この温度サイクリング増幅法に代わり得る方法として一定の温度でＤＮＡやＲＮＡの増幅が高頻度で行える等温増幅法が開発されてきている。ＤＮＡを用いる方法として、ＳｔａｎｄａｒｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）法、ＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ）法とその変法であるＵＣＡＮ法、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法などがあり、ＲＮＡを用いる方法としてＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＲｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＴＲＣ）法、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅ−ＢａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＭｅｄｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ（ＴＭＡ）法などがある。これらの増幅方法は、いずれもｄＮＴＰの重合反応である。

増幅反応を確認する方法には、直接増幅されたＤＮＡやＲＮＡを検出方法する方法がある。例えば、電気泳動後にエチジウムブロマイドによる染色、ビオチン化プローブを用いた発光法、エキシマー形成蛍光センサー、電気化学的センサーなど、様々な方法があるが、何れも高価な機器や試薬を必要とするか、操作が煩雑になる欠点を有している。
また、ｄＮＴＰ重合反応液中のピロリン酸をリンモリブテン反応によって検出する方法が、特許文献１又は２に見られるが、いずれもｄＮＴＰ重合反応液中に存在するｄＮＴＰやＤＮＡやＲＮＡに結合されているリン酸を検出する危険性を含んでいるばかりか、簡便なキット化はされていない。

等温増幅法によるＤＮＡやＲＮＡの検出方法も、一部を除いてほとんどが従来のＰＣＲの検出方法と同様であり、検出方法に関する改善はなんら認められていない。唯一、栄研化学で開発されたＬｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法は高価なサーマルサークラーを必要とせず、約６０℃前後の一定の温度でＤＮＡの増幅（等温増幅法）が高頻度で行え、かつＤＮＡ増幅の確認はＤＮＡ増幅時に産生されるピロリン酸と過剰量に添加されているマグネシウムが反応したピロリン酸−マグネシウムの析出を目視で行う簡便な方法がとられている。しかし、ピロリン酸−マグネシウムが目視できるまでの産生量を確保する反応時間が必要になり、一般的に約１時間以上を要す。さらに、ＬＡＭＰ法に使用されるプライマーはＰＣＲのプライマーよりも特殊で複雑であり、目視可能なまでの十分な反応をおこすには非常に制限された特定のプライマーが必要になる欠点を有す。
特開平７−５９６００号公報特開２００４−２０５２９８公報

本発明の目的は、頻繁に使用されているｄＮＴＰ重合反応の結果を、従来法である電気泳動法や蛍光法などの高価な機器や試薬を用いることなく簡便な操作方法で５分以内に目視で判定可能な方法をキットとして提供するものである。

上記目的を達成するべく、本発明者らはｄＮＴＰ重合時の産生物質である核酸と遊離のピロリン酸とピロリン酸金属塩ならびにピロリン酸の分解物であるリン酸とリン酸金属塩に注目した。一般的にｄＮＴＰ重合反応溶液中には、ｄＮＴＰ重合反応に必要な酵素の補酵素的役割をマグネシウム、マンガン、亜鉛などの２価の金属イオンが担っている。ｄＮＴＰが重合される量に比例してピロリン酸が産生されるが、このピロリン酸は反応液中に含有されている２価の金属イオンとキレートを形成し、不溶性のピロリン酸−２価金属塩が形成されると同時に、ピロリン酸が分解したリン酸でもリン酸−２価金属塩が形成される。一方、ｄＮＴＰ重合反応溶液中には、未反応物質として残存しているｄＮＴＰが共存しているが、これらはいずれもリン酸を結合している。ｄＮＴＰに結合したリン酸は全リン酸測定方法であるモリブテン法でも検出されるため、これらが含有されている反応溶液中で特異的にピロリン酸−２価金属もしくはリン酸−２価金属中のピロリン酸とリン酸を短時間で簡便に検出することは困難であると考えられた。しかし、本発明者は鋭意検討の結果、未反応のｄＮＴＰ中に結合している有機リン酸が呈色できない条件があることを見い出し、特異的にピロリン酸−２価金属もしくはリン酸−２価金属中のピロリン酸とリン酸を短時間で簡便に検出することに成功した。さらに、ｄＮＴＰ重合反応によって産生される核酸は、ベタイン存在下強酸性の条件下で析出することを見出し、核酸の析出によってもｄＮＴＰ重合反応の進行を確認できることを見出した。

即ち、本発明以下のとおりである。
第一の発明は、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＮＴＰ）の重合反応液をベタイン存在下に酸性条件とすることにより、該反応液中に核酸が析出物として検出されることを指標として、該重合反応の結果を判定するｄＮＴＰ重合反応の結果判定方法である。
第二の発明は、未反応のｄＮＴＰに結合している有機リン酸が呈色できない条件下で、ｄＮＴＰの重合反応液を酸性条件にするとともに、モリブテン酸もしくはモリブテン酸塩と還元剤を添加することにより、ｄＮＴＰの重合反応によって産生された遊離のピロリン酸とピロリン酸金属塩ならびに遊離のリン酸とリン酸金属塩を呈色させることを指標として判定するｄＮＴＰ重合反応の結果判定方法である。
第三の発明は、未反応のｄＮＴＰに結合している有機リン酸が呈色できない条件下で、ｄＮＴＰの重合反応液をベタイン存在下に酸性条件にするとともに、モリブテン酸もしくはモリブテン酸塩と還元剤を添加することにより、該反応液中に核酸が析出物として検出されること及び又はｄＮＴＰの重合反応によって産生された遊離のピロリン酸とピロリン酸金属塩ならびに遊離のリン酸とリン酸金属塩を呈色させることを指標として判定するｄＮＴＰ重合反応の結果判定方法である。
第四の発明は、少なくともモリブテン酸もしくはモリブテン酸塩、酸性水、還元剤よりなる前記のｄＮＴＰ重合反応の結果判定方法に用いるキットである

第一の発明の方法によれば、通常二本鎖ＤＮＡを不安定にし、かつ核酸を溶解するために用いられるベタイン存在下において、ｄＮＴＰ重合反応生成物である核酸の析出によってｄＮＴＰ重合反応の進行を検出可能である。
第二の発明の方法は、ｄＮＴＰ重合反応に比例して産生されるピロリン酸とその分解物であるリン酸および反応液中に含まれる金属で塩を形成したピロリン酸金属塩およびリン酸金属塩を、酸性条件下でモリリブデン酸（塩）と還元剤の添加による呈色でｄＮＴＰ重合反応の進行を検出する方法であり、ｄＮＴＰ重合反応が進行しない反応液では着色しない特異性を有する。
第三の発明の方法は、核酸の析出とともに、ｄＮＴＰ重合反応に比例して産生されるピロリン酸とその分解物であるリン酸および反応液中に含まれる金属で塩を形成したピロリン酸金属塩およびリン酸金属塩を、ベタイン存在下かつ酸性条件下でモリリブデン酸（塩）と還元剤の添加による呈色でｄＮＴＰ重合反応の進行を検出する方法であり、ｄＮＴＰ重合反応が進行しない反応液では着色しない特異性を有する。この方法によれば、ｄＮＴＰ重合反応によって産生される核酸とピロリン酸の両方を確認することも可能であり、より確実にｄＮＴＰ重合反応の進行を確認できることになる。

上記、本発明の方法によれば、特にＬＡＭＰ法などで用いられている多量のｄＮＴＰ重合物質（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）が産生される方法において、その結果判定の大幅な短縮が可能となる。さらに検出感度が優れているため一定以上のｄＮＴＰの重合が行われれば、不完全なプライマーでも使用できる。特許文献２で公開されている「フィルターを用いたピロリン酸の比色検出法」もリンモリブテン反応を利用している。しかし、ｄＮＴＰ重合反応終了液にてモリブテン反応を行った後、フィルター上に呈色された色素物を集めることで比色検出する方法であり、同一容器内で検出できない不便さを有している。また、特許文献１の「標的核酸の検出方法および診断試験キット」は無機オルトホスフェートの検出方法であり、遊離のピロリン酸とその金属塩およびリン酸金属塩の検出に関する記載はない。

本検出方法で用いるモリブテン法自体は既知の方法である。しかし、ピロリン酸２価金属もしくはリン酸２価金属中のピロリン酸もしくはリン酸を反応溶液中に共存するｄＮＴＰ中のリン酸と区別して検出する手段を講じた例は無い。また、ベタイン存在下又はベタインとモリブテン酸もしくはモリブテン酸塩存在下の酸性条件下で特定のｄＮＴＰ重合反応生成物の核酸の析出と析出量が多くなることを報告した例もない。本検出方法は、ｄＮＴＰ重合反応溶液中に共存するｄＮＴＰ中の有機リン酸と反応性生物である無機ピロリン酸を区別して検出することが可能であるばかりか、産生された核酸をも検出することができる。つまり、添加する酸性物質濃度、モリブテン酸もしくはモリブテン酸塩及び／又は還元剤濃度を調整することで、意図的に核酸の析出物を生じさせることに成功し、かつピロリン酸の特異的呈色も可能となったばかりか検出感度も高くなった。

本発明の原理は、ｄＮＴＰ重合反応生成物である核酸を析出させると同時に無機リン酸であるピロリン酸と未反応のｄＮＴＰ中の有機リン酸をリンモリブテン反応の感度差を利用して特異的に感度良くピロリン酸のみを検出することである。さらに、酸性物質濃度とモリブテン酸もしくはモリブテン酸塩ならびに還元剤濃度を調整することで目視判定での検出感度を高めることもできる。特に還元剤が塩化第一スズの場合は析出物が青色に染まるため沈殿状態での目視は極めて判定しやすくなる。そのため、個人による判定の誤差を少なくすることが出来きるばかりか、検出感度が高まる利点もある。また、判定に要する時間は約５秒〜５分で、従来の方法に比べて大幅に短い。

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、リン酸含有の緩衝液を用いない全てのｄＮＴＰ重合反応結果判定に使用できる。例えば核酸のサイクリング増幅法（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ → ａｎｎｅａｌｉｎｇ → ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）であるＰＣＲ法、ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＲＴ）−ＰＣＲ法、ＡｒｂｉｔｒａｒｉｌｙＰｒｉｍｅｄ（ＡＰ）−ＰＣＲ法、ＳｉｎｇｌｅＳｔｒａｉｎＣｏｕｎｔｉｎｇ（ＳＳＣ）−ＰＣＲ法、ｌｉｇａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）法、等温増幅法であるＬＡＭＰ法、ＳｔａｎｄａｒｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ法）、Ｌｉｇａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ法）、ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ（ＳＮＰ法）、ＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ法）などの重合反応液を対象とすることができる。

第一及び第三の発明においては、ベタイン存在下で酸性にすることにより核酸が析出する。ベタインとしては、トリメチルグリシンが代表的であるが、それ以外の、第４級アンモニウム塩、スルホニウム塩、ホスホニウム塩等のベタインも用いられる。ベタイン量は、生成される反応物によって変わるが、添加するｄＮＴＰ量の１０倍〜５０００重量倍が通常用いられる。なお、例えばＬＡＭＰ法のように増幅法自体でベタインを使用し、反応液が既にベタインを十分含有している場合があるが、その場合は改めてベタインを添加する必要はない。
なお、重合反応液中の核酸の生成量が多い場合は、ベタインが不存在でも単に酸性にするだけで析出が見られることがあるが、ベタインが存在すると析出量が多くなり、判定が容易となる。

本発明において、ｄＮＴＰ重合反応液中に核酸を析出させるための酸性条件は、ｐＨ３以下が好ましく、さらに好ましくはｐＨ１以下である。酸性にする試薬は、リンモリブテン酸反応を阻害しない酸性物質であれば特に制限なく使用できる。例えば塩酸、硫酸、硝酸などが例示できる。酸濃度としては０．２５〜３Ｎが好ましい。酸性条件があまり強すぎると、例えば硫酸や塩酸で３Ｎを超えると、核酸の析出は低下する。

第二、第三の発明においては、リンモリブデン反応を利用して、呈色反応を行う。使用するモリブテン酸（塩）は、一般的に使用されているモリブテン酸、モリブデン酸アンモニウム、モリブデン酸アルミニウム、モリブデン酸カドミウム、モリブデン酸カルシウム、モリブデン酸バリウム、モリブデン酸ビスマス、モリブデン酸リチウム、モリブデン酸カリウム、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸亜鉛およびモリブデン酸アルキルアンモニウム（１〜６個の炭素原子を有するアルキルを有する）が挙げられる。また、還元剤としてアスコルビン酸、メルカプトエタノールなどのＳＨ含有還元剤、アミノナフトールスルホン酸、硫酸ｐ−メチルアミノフェノール、塩化第一錫、フェニルヒドラジン、ヒドロキノン、硫酸第一鉄、２，４−ジアミノフェノール、Ｎ−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン並びにハロゲン化銀化合物が挙げられるが、短時間で着色可能な塩化第一スズか２−メルカプトエタノールが好ましい。感度を上げるために必要であれば、アミド硫酸アンモニウム、タルトラトアンチモン酸カリウムもしくは酒石酸アンチモルニルカリウムが使用できる。
上記物質は、試薬として市販されているものでも合成品でも構わない。また、液状でも固形状でも構わない。さらに、個々の試薬自体でも、混合された状態でも構わない。また作成されうる塩の形態をとっていても構わない。

第二、第三の発明においては、未反応のｄＮＴＰ中に結合している有機リン酸が呈色できない条件下で、ｄＮＴＰの重合反応によって産生された遊離のピロリン酸とピロリン酸金属塩ならびに遊離のリン酸とリン酸金属塩をモリブテン酸もしくはモリブテン酸塩と還元剤の添加によって呈色させる。未反応のｄＮＴＰ中に結合している有機リン酸が呈色できない条件とは、主として反応液中の還元剤の濃度、ｐＨである。これらの条件は実験により定めることができる。還元剤の濃度は使用する還元剤により異なるが、形成されたリンモリブテン酸化合物を還元して青色を呈色する充分な量が望ましく、一般的には最終濃度として０．０１〜１０重量％の添加量が好ましい。塩化第一スズ場合は反応液中で０．１５〜２重量％が特に好ましく、２−メルカプトエタノールの場合は０．０１〜０．５Ｍが特に好ましい。還元剤として塩化第一スズを用いた場合、０．０１％未満では呈色が弱くなりすぎ、２％を超えると反応液中で黒色の沈殿が形成され判定がしにくくなる。２−メルカプトエタノールの場合、０．０１Ｍ未満の添加量では呈色が弱くなりすぎ、０．５Ｍを超えるとメルカプトエタノール自体の色（オレンジ色）が強くなりすぎて、判定しにくくなる。反応液のｐＨはｐＨ３以下が好ましく、ｐＨ１以下がさらに好ましい。

第二、第三の発明におけるリンモリブテン試薬の添加量は、ｄＮＴＰ重合反応に用いられるｄＮＴＰ量と溶液量によってかわるため制限はないが、添加するｄＮＴＰと同モル数のピロリン酸が充分に反応可能なモリブテン酸（塩）を含有することが望ましく、最終濃度として０．０１〜１０重量％のモリブテン酸（塩）の添加量が好ましく、さらに好ましくは０．１２５〜１重量％である。

本発明に用いる酸性物質、モリブテン化合物、還元剤は別々に又は組み合わせて常法により任意の剤形とすることができる。例えば固化製剤、水剤とすることができる。また、担体に個々、もしくは複数の試薬を含有される形態をとることもできる。例えば、ろ紙に試薬を染み込ませて乾燥したものを用いることができる。
試薬は、酸性物質、モリブテン化合物、還元剤をキットとして提供することができる。これらはそれぞれ別々に又は組み合わせて容器に入れて提供することができる。好ましくは、酸性物質含有水、モリブテン化合物含有水、還元剤含有水の個々の試薬が分別されたキットが安定性の面で好ましい。容器は内容物を滴下でき、且つ、１滴当たりの滴下液量が一定で明らかなものを使用するのが好ましい。このような容器を使用することにより、秤量操作を簡易化でき、また還元剤と空気の余分な接触を避けることができるので、試薬の安定性を保つことができる。なお、試薬には安定化剤が配合されても構わない。

本発明を実施するには、例えば以下のようにして行う。
第一の発明の場合は、これらの重合反応液に酸性物質及び必要ならベタインを加えて５〜４０℃（室温）で５〜２０秒間反応させる。重合が進んで重合反応物が生成している場合は、核酸が析出物として検出される。
第二、第三の発明の場合は、これらの重合反応液にモリブテン酸（塩）、還元剤、必要ならベタイン及び酸性物質を加えて５〜４０℃（室温）で５秒〜１０分間反応させる。重合が進んでいる場合は核酸が析出物として検出されるとともにピロリン酸（金属塩）又は遊離のリン酸（金属塩）が呈色する。ｄＮＴＰに結合しているリン酸は反応しないので、重合が進んでいない場合は呈色しない。

以下、実施例で本発明を説明する。
実施例１
ＬＡＭＰ法に用いる黄色ブドウ球菌検出（ｆｅｍＡ）のプライマーは、配列番号１（ｆ−１）と配列番号２（ｆ−２）及び配列番号３（ｆ−３）と配列番号４（ｆ−４）を使用した。
ＬＡＭＰ反応液は、抽出ＤＮＡを２．０μＬ（コントロールは滅菌蒸留水を添加）、各１００ｐｍｏｌ／μＬのプライマーを、ｆ−１とｆ−２は各々０．８μＬ、ｆ−３とｆ−４は各々０．１μＬ、８．０Ｕ／μＬのＢｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを２．０μＬのそれぞれを添加して核酸増幅反応を行った。反応液は上記プライマーと酵素以外に、２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＭｇＳＯ_４、１０ｍＭＳＯ_４（ＮＨ_４）_２、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．８ＭＢｅｔａｉｎｅ、１．４ｍＭｅａｃｈｏｆｄＮＴＰｓが全量５０μＬの反応液中に含有されている。反応液を６３℃で６０分間加温後、１０μＬの２５％ＨＣｌ（最終濃度２．５％、ｐＨ１以下）を添加して写真撮影を行い、図１に示した。比較のためにＬＡＭＰ未反応液及びＨＣｌ添加前のＬＡＭＰ未反応液の写真も示した。図１において、１はＬＡＭＰ反応終了液＋０．２５Ｎ硫酸、２はＬＡＭＰ反応終了液、３はＬＡＭＰ未反応液の写真である。
ＬＡＭＰ反応終了液を酸性にした１の場合、中性のままの２と比較して明らかな白濁が確認される。また、未反応液３は透明のままであった。

実施例２
実施例１のＨＣｌを添加した反応液に１５μＬの１．０％モリブデン酸アンモニウム（最終濃度０．１５％）、２５μＬの１．０％塩化第一スズ（最終濃度０．２５％）を順次混合し、５分間静置後、写真撮影を行った。同時に７，０００ｇで１分間の遠心を行って写真撮影した。同時にＬＡＭＰ反応終了液をＬＡＭＰ未反応液で２段階希釈により１／６４倍まで希釈した各溶液で、塩化第一スズを用いたリンモリブテン酸反応を行い、電気泳動法との比較を行った。リンモリブテン酸反応の結果の写真を図２に、電気泳動法の結果の写真を図３に示した。電気泳動法は以下の操作に従った。８．０μＬのＬＡＭＰ反応液とその２段階希釈した溶液に４．０μＬの０．１％ブロムフェノールブルーを添加し、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｌ−ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−酢酸−ＤｉｓｏｄｉｕｍＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）ｂｕｆｆｅｒで作成した２％アガロースゲルに各サンプルの８μＬずつを添加した。コントロールとして３μＬのＤＮＡｌａｄｄｅｒを添加後、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−酢酸− ＤｉｓｏｄｉｕｍＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）ｂｕｆｆｅｒ中で１００Ｖの電圧をかけて４５分間電気泳動を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルを１．０μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドに２０分間浸漬後、精製水に１０分間浸漬を２回行った。バンドはＵＶランプで確認した。

同様にＬＡＭＰ反応液の５０μＬに２０μＬの７．５Ｎ硫酸（最終濃度１．５Ｎ）、２０μＬの３．７５％モリブテン酸アンモニウム（終濃度０．７５％）、１０μＬの１Ｍ２−メルカプトエタノール（終濃度０．１Ｍ）を順次混合し（ｐＨ１以下）、５分間静置の後、７，０００ｇ、１分遠心を行った。反応開始５分後に遠心前後の写真撮影結果を図４に示した。
還元剤として塩化第一スズを用いたリンモリブテン酸反応は目視で３２倍希釈まで確認され、遠心後では６４倍希釈まで確認された。電気泳動では６４倍以上の希釈まで確認されたことから、本検出方法は電気泳動法と同程度の感度と考えられる。また、ＬＡＭＰ反応で白濁を目視で確認できる時点はせいぜい４倍希釈程度であるが、本検出法では１６倍程度の強い感度であった。つまり、ＬＡＭＰ反応によって白濁が確認されない時点でも、本検出方法による検出が可能であることが判明した。また、還元剤として２−メルカプトエタノールを用いたリンモリブテン酸反応は目視で３２から６４倍希釈まで確認され、遠心後でも同様であった。但し、塩化第一スズを用いた方が、着色時間は若干早く、かつ析出物が青色に呈色していた。

実施例３
リンモリブテン反応試薬を用いたＰＣＲ反応終了液に対する検討
ＰＣＲはブドウ球菌が保有する遺伝子の中で、黄色ブドウ球菌のみが特異的に保有する領域を配列番号５と配列番号６（ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ３０６ｂｐ）のプライマーで検出した。ＰＣＲ反応液は、黄色ブドウ球菌の抽出ＤＮＡを０．２μＬ（コントロールは滅菌蒸留水を添加）、各１００ｐｍｏｌ／μＬのプライマーをそれぞれ０．２μＬ、５．０Ｕ／μＬのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を０．４μＬ、２ｍＭｄＴＮＰｍｉｘ（ＧｅｎｅＡｍｐ）を１．０μＬ、２５ｍＭＭｇＣｌ_２を３．０μＬ、１０ｘＰＣＲ緩衝液（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を５．０μＬ、蒸留水を４０．０μＬ添加した。サイクリング時間と温度設定は、ｆｅｍＡ用が、９５℃で１２分間加温後、（９４℃，３０ｓｅｃ．→５２℃，１ｍｉｎ．→７０℃，１ｍｉｎ．）×４０サイクルし、７０℃で１０分間処理した。サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。反応結果を図５に示す。左側がベタイン無添加、中央が０．５Ｍベタイン添加、右側が０．５Ｍベタイン添加遠心後の写真である。ＬＡＭＰ反応液と同様にリンモリブテン酸反応試薬（還元剤：塩化第一スズ）で検出可能であり、ベタインの添加によって実施例１と同様に核酸の析出も確認された。

実施例１のＬＡＭＰ反応終了液＋０．２５Ｎ硫酸（１）、ＬＡＭＰ反応終了液（２）、ＬＡＭＰ未反応液（３）の写真である。実施例２の塩化第一スズを用いたリンモリブテン酸反応の結果の写真である。実施例２の比較とした電気泳動の写真である。実施例２の２−メルカプトエタノールを用いたリンモリブテン酸反応の結果の写真である。実施例３のＰＣＲ反応終了液の塩化第一スズを用いたリンモリブテン酸反応の結果の写真である。

Claims

デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＮＴＰ）の重合反応液をベタイン存在下に酸性条件とすることにより、該反応液中に核酸が析出物として検出されることを指標として、該重合反応の結果を判定するｄＮＴＰ重合反応の結果判定方法。
未反応のｄＮＴＰに結合している有機リン酸が呈色できない条件下で、ｄＮＴＰの重合反応液を酸性条件にするとともに、モリブテン酸もしくはモリブテン酸塩と還元剤を添加することにより、ｄＮＴＰの重合反応によって産生された遊離のピロリン酸とピロリン酸金属塩ならびに遊離のリン酸とリン酸金属塩を呈色させることを指標として判定するｄＮＴＰ重合反応の結果判定方法。
未反応のｄＮＴＰに結合している有機リン酸が呈色できない条件下で、ｄＮＴＰの重合反応液をベタイン存在下に酸性条件にするとともに、モリブテン酸もしくはモリブテン酸塩と還元剤を添加することにより、該反応液中に核酸が析出物として検出されること及びｄＮＴＰの重合反応によって産生された遊離のピロリン酸とピロリン酸金属塩ならびに遊離のリン酸とリン酸金属塩を呈色させることを指標として判定するｄＮＴＰ重合反応の結果判定方法。
ベタインの量が重合反応に際して添加したｄＮＴＰ量の１０倍〜５０００重量倍である請求項１又は３の方法。
酸性条件がｐＨ３以下である請求項１、２又は３の方法。
還元剤の濃度が反応液中で０．０１〜１０重量％である請求項２又は３の判定方法。
還元剤が塩化第一スズ又は２−メルカプトエタノールであることを特徴とする請求項２又は３の判定方法。
反応液中の塩化第一スズ濃度が０．０１〜２重量％又は２−メルカプトエタノールの濃度が０．０１〜０．５Ｍである請求項７の判定方法。
反応液のモリブテン酸もしくはモリブテン酸塩の濃度が０．０１〜１０重量％である請求項２又は３の判定方法。
モリブテン酸もしくはモリブテン酸塩の濃度が０．０５〜２．５重量％で、酸物質濃度が０．１〜５Ｎである請求項２又は３の判定方法。
呈色後さらに反応液を濃縮して判定する請求項２又は３の判定方法。
少なくともモリブテン酸もしくはモリブテン酸塩、酸性水、還元剤よりなる請求項２又は３のｄＮＴＰ重合反応の結果判定方法に用いるキット。
モリブテン酸もしくはモリブテン酸塩含有水、酸性水、還元剤含有水を個々もしくは組み合わせて滴下液量が明確な容器に入れた請求項１２のキット。
モリブテン酸もしくはモリブテン酸塩及び／又は還元剤を担体に担持させてなる請求項１２のキット。