JP2006306862A - プロスタグランジンＦ２α誘導体を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤 - Google Patents

Abstract

【課題】プロスタグランジンＦ2α誘導体の新たな医薬用途を見出すこと。
【解決手段】プロスタグランジンＦ2α誘導体の新たな医薬用途を見出すべく鋭意研究した結果、プロスタグランジンＦ2α誘導体がラット胎児網膜神経細胞において、濃度依存的にグルタミン酸誘発網膜神経細胞死を抑制すること、すなわち、プロスタグランジンＦ2α誘導体が網膜神経細胞に直接働き保護作用を示すことを見出した。従って、プロスタグランジンＦ2α誘導体は網膜神経細胞障害が関与する眼疾患の予防又は治療に有用であると期待される。
【選択図】なし

Description

本発明はプロスタグランジンＦ2α誘導体を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤に関する。

網膜は内境界膜、神経線維層、神経節細胞層、内網状層、内顆粒層、外網状層、外顆粒層、外境界膜、視細胞層及び網膜色素上皮層の１０層から成る、厚さ０．１〜０．５ｍｍの組織であり、その中には視細胞、双極細胞、神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞及びミュラー細胞という網膜神経細胞群が存在する。

網膜神経細胞は光刺激を電気信号に変換して、脳へ伝達するといった視覚情報の受容と伝達において重要な役割を果たしている。

その伝達メカニズムについて詳述すると、目から入った視覚情報は視細胞により電気信号化され、水平細胞、双極細胞及び／又はアマクリン細胞を経由した後に神経節細胞に伝達される。次いで、その電気信号は神経節細胞の軸策を含む視神経線維の束である視神経を経由して脳に伝達される。

ところで、この網膜神経細胞が種々の原因により障害を受けると網膜神経細胞の恒常性（網膜血流循環による網膜神経細胞への酸素や栄養の供給といった機能等）が維持できなくなり視覚情報の脳への伝達が妨げられる。例えば、網膜血管閉塞症、糖尿病性網膜症、虚血性視神経症、緑内障、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病等の種々の網膜疾患おいて、網膜神経細胞の機能破綻が生じていることが広く知られている（非特許文献１）。

最近、網膜神経細胞を障害する原因の一つとして、網膜虚血による網膜神経細胞死が考えられるようになり、この網膜虚血による網膜神経細胞死に関して、
１）網膜虚血による網膜神経細胞死の機序が脳虚血時の脳神経細胞死の機序に類似していること、
２）短期間の網膜虚血では網膜内層（内網状層）が選択的に傷害されること、
３）網膜虚血時にグルタミン酸の過剰遊離が確認できること、
４）グルタミン酸等の興奮性アミノ酸を硝子体内に注射することにより網膜神経細胞死が惹起すること、
５）網膜のN-メチル-Ｄ-アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体を介する過剰刺激が細胞内へのカルシウム（Ca）流入を促進し、その結果として一酸化窒素（ＮＯ）の誘導を介し細胞障害を惹起すること、等が報告されている（特許文献１、非特許文献２）。

これらのことからグルタミン酸神経毒性抑制薬、ＮＭＤＡ受容体遮断薬、ＮＯ合成阻害薬等の薬物が網膜神経細胞障害に起因する眼疾患の治療に有用であると考えられ、現在、種々の検討がなされている。

例えば、特許文献２にはβ遮断薬の一つであるニプラジロールを有効成分として含む網膜神経細胞保護剤が、特許文献３にはインターロイキン−１受容体アンタゴニストタンパクを有効成分として含む視神経節細胞保護剤が、特許文献４には塩酸ブリモニジン等のα₁受容体遮断薬を有効成分として含む視神経節細胞保護剤が、非特許文献３にはプロスタグランジン誘導体の一つであるラタノプロストの神経保護作用等が開示されている。

一方、プロスタグランジンＦ2α誘導体が特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４及び特許文献１５に、眼圧下降作用を有する緑内障治療剤として開示されている。特許文献５には天然のプロスタグランジンＦ2α誘導体が、特許文献６にはラタノプロスト関連化合物が、特許文献７にはビマトプロスト関連化合物が、特許文献８にはトラボプロスト関連化合物が、特許文献９にはモノフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体が、特許文献１０及び特許文献１１にはジフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体が、また、特許文献１２には多置換アリールオキシ基を有する含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体が、特許文献１３にはエーテル型ジフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体が、特許文献１４にはジフルオロプロスタグランジンＦ2αアミド誘導体が開示されている。

しかしながら、いずれの特許文献にも含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体の網膜神経細胞保護作用については全く記載されていない。
Brain Res Bull., 62(6), 447-453(2004) 特開２００３−１４６９０４号公報 Nature Rev.,2, 448-459(2003) 特開２００１−０７２５９１号公報 国際公開第０１／０５６６０６号パンフレット 国際公開第０３／００４０５８号パンフレット Experimental Eye Res.,72,479-486(2001) 特開昭５９−１４１８号公報 特表平３−５０１０２５号公報 特表平８−５０１３１０号公報 特開平１０−１８２４６５号公報 国際公開第９８／１２１７５号パンフレット 欧州特許出願公開第８５０９２６号明細書 特開２００４−００２４６２号公報 特開平１０−２５９１７９号公報 特開２００２−２９３７７１号公報 特開２００３−３２１４４２号公報

プロスタグランジンＦ2α誘導体（特に含フッ素プロスタグランジンＦ2α）の新たな医薬用途を見出すことは非常に興味深い課題である。

そこで、本発明者等はプロスタグランジンＦ2α誘導体の新たな医薬用途を見出すべく鋭意研究した結果、プロスタグランジンＦ2α誘導体がラット胎児網膜神経細胞において、濃度依存的にグルタミン酸誘発網膜神経細胞死を抑制すること、すなわち、プロスタグランジンＦ2α誘導体が網膜神経細胞に直接働き保護作用を示すこと、を見出し本発明を完成させた。

本発明は、プロスタグランジンＦ2α誘導体を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤に関する。

本発明はまた、網膜神経細胞の保護方法、網膜神経細胞障害が関与する眼疾患の予防又は治療方法に関する。

本発明における「プロスタグランジンＦ2α誘導体」とは、プロスタン酸骨格から誘導されるプロスタグランジンＦ2α関連化合物を意味する。

具体的には、特開平５９−１４１８に開示されている天然のプロスタグランジンＦ2α誘導体、特表平３−５０１０２５に開示されているラタノプロスト関連化合物（但し、ラタノプロストを除く関連化合物又はその塩）、特表平８−５０１３１０に開示されているビマトプロスト関連化合物（好ましくはビマトプロスト又はその塩）、特開平１０−１８２４６５に開示されているトラボプロスト関連化合物（好ましくはトラボプロスト又はその塩）、国際公開第９８／１２１７５号パンフレット、欧州特許出願公開第８５０９２６号明細書、特開２００４−００２４６２号公報、特開平１０−２５９１７９号公報、特開２００２−２９３７７１号公報、特開２００３−３２１４４２号公報等に開示されている含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体等のプロスタグランジンF2α誘導体又はその塩を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤が挙げられる。

好ましくは、「含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体」を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤が挙げられ、この「含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体」とは、１又は複数個のフッ素原子を有するプロスタグランジンＦ2α誘導体を意味する。

具体的には国際公開第９８／１２１７５号パンフレット、欧州特許出願公開第８５０９２６号明細書、特開２００４−００２４６２号公報、特開平１０−２５９１７９号公報、特開２００２−２９３７７１号公報、特開２００３−３２１４４２号公報等に開示されている含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤が挙げられる。

より好ましくは前記欧州特許出願公開第８５０９２６号明細書、特開２００４−００２４６２号公報、特開平１０−２５９１７９号公報、特開２００２−２９３７７１号公報及び特開２００３−３２１４４２号等の公報中に記載されている１５，１５−ジフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤が挙げられる。

さらに好ましい含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体として下記一般式（1）で示される又はその塩である１５，１５−ジフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤が挙げられる。

[式中、Ｒはヒドロキシアルキル基、ホルミル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アミノカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基又はアリールアミノカルボニル基を示し、Ｒが該アリールオキシカルボニル基又は該アリールアミノカルボニル基である場合、そのアリール部分は置換基を有していてもよい。以下、同じ。]
ここで本明細書中で規定した各基又は文言について以下に示す。

「ハロゲン」とはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素を示す。

「アルキル」とは炭素原子数１〜６個の直鎖又は分枝のアルキルを示す。具体例としてメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等が挙げられる。

「アルコキシ」とは炭素原子数１〜６個の直鎖又は分枝のアルコキシを示す。具体例としてメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソプロポキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、イソペンチルオキシ等が挙げられる。

「アリール」とは炭素原子数６〜１４個の単環式又は２環式もしくは３環式の縮合多環式芳香族炭化水素を示す。具体例としてフェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル等が挙げられる。

「アリールオキシ」とは炭素原子数６〜１４個の単環式又は２環式もしくは３環式の縮合多環式芳香族炭化水素オキシを示す。具体例としてフェノキシ、ナフチルオキシ、アントリルオキシ、フェナントリルオキシ等が挙げられる。

「アルキルアミノ」とは炭素原子数１〜１２個のモノ又はジアルキルアミノを示す。具体的としてメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジヘキシルアミノ等が挙げられる。

「アリールアミノ」とは炭素原子数６〜２８個のモノ又はジアリールアミノを示す。具体例としてフェニルアミノ、ナフチルアミノ、メチルフェニルアミノ、エチルフェニルアミノ、ジフェニルアミノ、ジアントリルアミノ等が挙げられる。

Ｒが「アリールオキシカルボニル基」又は「アリールアミノカルボニル基」である場合、そのアリール部分は置換基を有していてもよい。置換基としてはハロゲン原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基及びアルコキシ基から選択される原子又は基が好ましく、置換基数は１〜３個が好ましい。

さらに好ましい含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体として、上記一般式（1）中、Rがカルボキシ基若しくはその塩基又はアルコキシカルボニル基を示す１５，１５−ジフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体が挙げられる。

特に好ましい含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体として、上記一般式（1）中、Rがカルボキシ基若しくはその塩基又はイソプロポキシカルボニル基を示す１５，１５−ジフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体が挙げられる。

また、別の好ましい化合物として前記国際公開第９８／１２１７５号パンフレットに記載されている１５−モノフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体が挙げられる。

これらのプロスタグランジンＦ2α誘導体は塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸等の有機酸、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アンモニア等と塩を形成することができ、これらの塩も本発明に含まれる。

本発明における「網膜神経細胞」とは視覚信号の脳への伝達に関与する神経細胞を意味する。具体的には視細胞、水平細胞、双極細胞、視神経節細胞、アマクリン細胞等を意味する。

本発明における「眼疾患」とは網膜神経細胞障害が関与する眼疾患を意味する。具体的には視野異常、網膜血管閉塞症、糖尿病性網膜症、虚血性視神経症、緑内障、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病等を意味し、好ましくは視野異常、網膜血管閉塞症、糖尿病性網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病を意味する。

本発明の網膜神経細胞保護剤は経口でも、非経口でも投与することができる。投与剤型としては点眼剤、眼軟膏、注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等が挙げられ、特に点眼剤が好ましい。これらは汎用される技術、例えば特開平５９−１４１８、特表平３−５０１０２５、特表平８−５０１３１０、特開平１０−１８２４６５、国際公開第９８／１２１７５号パンフレット、欧州特許出願公開第８５０９２６号明細書、特開２００４−００２４６２号公報、特開平１０−２５９１７９号公報、特開２００２−２９３７７１号公報、特開２００３−３２１４４２号公報、国際公開第０２／２２１３１号パンフレット等に開示されている技術を用いて製剤化することができる。

例えば、点眼剤は、塩化ナトリウム、濃グリセリン等の等張化剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の緩衝化剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤、塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤等を必要に応じて使用して、製剤化することができる。ｐＨは眼科用製剤に許容される範囲内であれば特に問題はないが、ｐＨ４〜８の範囲が好ましい。

眼軟膏は、白色ワセリン、流動パラフィン等の汎用される基剤を必要に応じて使用して、製剤化することができる。

また、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の経口剤は、乳糖、結晶セルロース、デンプン、植物油等の増量剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース カルシウム、低置換ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の崩壊剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール、シリコン樹脂等のコーティング剤、ゼラチン皮膜等の皮膜剤等を必要に応じて使用して、製剤化することができる。

投与量は症状、年令、剤型等により適宜選択できるが、点眼剤では０．００００１〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００１〜１％（ｗ／ｖ）のものを１日１〜数回点眼することができる。経口剤では通常１日当り０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０００ｍｇのものを１〜数回に分けて投与することができる。

後述の薬理試験の項で詳細に説明するが、ラット胎児網膜神経細胞を用いたグルタミン酸誘発網膜神経細胞死に対するプロスタグランジンＦ2α誘導体の効果を検討した。その結果、プロスタグランジンＦ2α誘導体は濃度依存的にグルタミン酸誘発網膜神経細胞死を抑制した。すなわち、プロスタグランジンＦ2α誘導体は網膜神経細胞保護作用を有しており、網膜神経細胞障害が関与する眼疾患の予防又は治療に有用である。

以下に本発明の製剤例及び薬理試験の結果を示す。尚、これらの例示は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

[製剤例]
以下に本発明におけるプロスタグランジンＦ2α誘導体を含む一般的な製剤例を示す。

１）点眼剤 １００ｍｌ中
プロスタグランジンＦ2α誘導体 １０ｍｇ
濃グリセリン ２５００ｍｇ
ポリソルベート８０ ２０００ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物 ２００ｍｇ
滅菌精製水 適量
１Ｎ塩酸又は１Ｎ水酸化ナトリウム 適量
ｐＨ ６．０
プロスタグランジンＦ2α誘導体及び添加物の種類ならびに量を適宜変更することにより所望の点眼剤を得ることができる。

２）眼軟膏 １００ｇ中
プロスタグランジンF2α誘導体 ０．１ｇ
流動パラフィン ２０ｇ
白色ワセリン ７７．９ｇ
精製ラノリン ２ｇ
プロスタグランジンＦ2α誘導体及び添加物の種類ならびに量を適宜変更することにより所望の眼軟膏を得ることができる。

[薬理試験]
プロスタグランジンＦ2α誘導体の新たな医薬用途を見出すために、ラット胎児網膜神経細胞を用いて、プロスタグランジンＦ2α誘導体のグルタミン酸誘発網膜神経細胞死に対する網膜神経細胞保護作用を評価検討した。

尚、被験化合物であるプロスタグランジンＦ2α誘導体として１６−フェノキシ−１５−デオキシ−１５，１５−ジフルオロ−１７，１８，１９，２０−テトラノルプロスタグランジンＦ2αを使用した。

（１）網膜神経細胞の単離培養
妊娠SDラットを全身麻酔下で開腹し、子宮をハンクス平衡塩溶液（Hanks’s Balanced Salt Solution、HBSS）の入ったシャーレ中に移した。子宮からラット胎児を摘出し、ラット胎児の眼球をとりだした。実体顕微鏡下でその眼球から網膜を摘出し、医科用メスで細かく刻んだ。さらに網膜を細胞レベルまで細かくし、ナイロンメッシュ（No.305 NBC工業（株）製）に通して細胞の塊を除き、透過物を1000 rpmで4 分間遠心した。上清を取り除き、残った細胞に適量の10 % 牛胎児血清（fetal bovine serum、FBS）含有改変イーグル培地（Modified Eagle’s Medium、MEM）を加えて懸濁させた。血球計算板で細胞数を数えた後、10％FBS含有MEM培地を加え、細胞数0.8×10⁶cells/mlの細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を80 μlずつポリエチレンイミンコーティングプラスチックディスクに播種し、インキュベータ（37℃・5% CO₂）に静置した。培地交換は細胞播種日を培養1日目とし、偶数日目に行った。尚、4日目までは10％ FBS含有MEM培地を使用し、8日目以降は10%馬血清（Horse Serum、HS）含有MEM培地を使用した。ただし、6日目は増殖性細胞を除去するため、シタラビン（Ara-C）含有培地（1.5×10^-5M in 10% FBS含有MEM培地）6 mlを使用した。

（２）被験化合物含有HS含有MEM培地の調製
被験化合物2mgを100%エタノールに溶解し、HS含有MEM培地で順次希釈し、0.1nM、1nM、10nM及び100nMの被験化合物含有HS含有MEM培地を調製した。

（３）被験化合物含有血清不含MEM培地の調製
被験化合物2mgを100%エタノールに溶解し、血清不含MEM培地で順次希釈し、0.1nM、1nM、10nM及び100nMの被験化合物含有血清不含MEM培地を調製した。

（４）細胞死評価
培養10日目、細胞を播種・培養したプラスチックディスクを被験化合物含有HS含有MEM培地に移し24時間インキュベートした（37℃・5% CO₂）。プラスチックディスクを1mMグルタミン酸含有血清不含MEM培地に移し10分間インキュベートした後、次いで被験化合物含有血清不含MEM培地に移し1時間インキュベートした（37℃・5% CO₂）。細胞を1.5%トリパンブルー液で10分間染色した後、10%ホルマリン固定液を加えて細胞を固定した。生理食塩水で洗浄後、倒立型顕微鏡下で染色細胞及び非染色細胞を計数した。

尚、前記被験化合物含有HS含有MEM培地の代わりにHS含有MEM培地を、被験化合物含有血清不含MEM培地の代わりに血清不含MEM培地を使用し、それ以外は前記と同様の試験を実施したものを基剤投与群とした。

また、前記被験化合物含有HS含有MEM培地の代わりにHS含有MEM培地を、被験化合物含有血清不含MEM培地の代わりに血清不含MEM培地を使用し、かつ、グルタミン酸含有血清不含MEM培地による処理を実施せず、それ以外は前記と同様の試験を実施したものを無処置群とした。

生存率を下記の計算式に基づき算出した。

（５）結果及び考察
図１に示したとおり、グルタミン酸処置により網膜神経細胞は、基剤添加群で約4割の細胞死が認められたが、培地として被験化合物含有HS含有MEM培地（0.1 nM〜100 nM）を使用したところ濃度依存的にグルタミン酸誘発網膜神経細胞死が抑制され、網膜神経細胞保護作用が確認された。

グルタミン酸添加による被験化合物を用いた場合の各濃度の生存率を示すグラフである。

Claims (8)

1. プロスタグランジンＦ2α誘導体を有効成分として含む網膜神経細胞保護剤。
2. プロスタグランジンＦ2α誘導体が含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体である請求項１記載の網膜神経細胞保護剤。
3. 含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体が１５，１５−ジフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体である請求項２記載の網膜神経細胞保護剤。
4. １５，１５−ジフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体が下記一般式（１）で示される化合物又はその塩である請求項３記載の網膜神経細胞保護剤。
   

   

   [式中、Ｒはヒドロキシアルキル基、ホルミル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アミノカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基又はアリールアミノカルボニル基を示し、Ｒが該アリールオキシカルボニル基又は該アリールアミノカルボニル基である場合、そのアリール部分は置換基を有していてもよい。以下、同じ。]
   
5. 一般式（１）においてＲがカルボキシ基若しくはその塩基又はアルコキシカルボニル基を示す請求項４記載の網膜神経細胞保護剤。
6. 含フッ素プロスタグランジンＦ2α誘導体が１５−モノフルオロプロスタグランジンＦ2α誘導体である請求項２記載の網膜神経細胞保護剤。
7. 網膜神経細胞が視細胞、双極細胞、視神経節細胞、水平細胞又はアマクリン細胞である請求項１〜６のいずれかに記載の網膜神経細胞保護剤。
8. 眼疾患の予防又は治療のために使用する請求項１〜７のいずれかに記載の網膜神経細胞保護剤。
   
   
   
   
   
   
   
   

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