JP2006300965A - 安定なアビジン組成物及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】不活性支持体材料、例えば、アガロース上に固定化されたアビジンのための組成物及び方法の提供。
【解決手段】本組成物は、高活性レベルのアビジンをもち、そしてさらに、バルキング剤、例えば、マルトース、及び凍結乾燥及び最終滅菌プロセスの間にアビジン・アガロースの安全性及び完全性を維持するための保護剤を含む。これらの組成物は、アビジン、アガロース及び/又はアビジン/ビオチン技術が有用であるいずれの場合においても利用可能性を有する。特に、本組成物は、フィブリン接着剤のために有用なフィブリン・モノマーを調製するための酵素捕獲系において有用である。
【選択図】なし
【解決手段】本組成物は、高活性レベルのアビジンをもち、そしてさらに、バルキング剤、例えば、マルトース、及び凍結乾燥及び最終滅菌プロセスの間にアビジン・アガロースの安全性及び完全性を維持するための保護剤を含む。これらの組成物は、アビジン、アガロース及び/又はアビジン/ビオチン技術が有用であるいずれの場合においても利用可能性を有する。特に、本組成物は、フィブリン接着剤のために有用なフィブリン・モノマーを調製するための酵素捕獲系において有用である。
【選択図】なし
Description
背 景
アビジン−ビオチンのアフィニティーに基づく技術は、1970年代にDr. Edward Bayerと Dr. Meier Wilchekによる先駆的な研究以降、生物学及びバイオテクノロジーの多くの分野で広く利用されてきた。アビジンとビオチンの間のアフィニティー定数は、極めて高く、そしてビオチンが多種多様の生体分子に結合するときにも有意に減じられることはない。このアフィニティーは、ビオチンの誘導体化された形態が使用されるときでさえ維持され、そして生体分子の活性又は他の所望の特性における最小の又はほんの僅かな損失を伴って、生体分子をビオチンにカップリングさせるために、多くの化学物質が同定されてきた。元々、生物学的に活性な巨大分子のための精製及び位置決め手順に適用されてきたものであるが、今日、アビジン−ビオチン技術は、医療診断に広く使用されてきている。開発中の新たな応用は、アフィニティー・ターゲティング、セル・サイトメトリー、ブロッティング技術、ドラッグ・デリバリー、ハイブリドーマ技術、ヒト幹細胞選択及び再輸注並びに酵素捕獲へのいくつかのアプローチを含む。いくつかの応用においては、アビジンは、その上をビオチン化生体分子を含有する溶液が通過するところの不活性材料上に固定化される。アビジンについてのビオチンのアフィニティーは、その溶液からの生体分子の分離を提供する。ビオチン−アビジン技術のレビューは、Applications of Avidin-Biotin Technology to Affinity-Based Separation, Bayer, et al., J. of Chromatography, 1990, pgs.3-11中に見られる。
アビジン−ビオチンのアフィニティーに基づく技術は、1970年代にDr. Edward Bayerと Dr. Meier Wilchekによる先駆的な研究以降、生物学及びバイオテクノロジーの多くの分野で広く利用されてきた。アビジンとビオチンの間のアフィニティー定数は、極めて高く、そしてビオチンが多種多様の生体分子に結合するときにも有意に減じられることはない。このアフィニティーは、ビオチンの誘導体化された形態が使用されるときでさえ維持され、そして生体分子の活性又は他の所望の特性における最小の又はほんの僅かな損失を伴って、生体分子をビオチンにカップリングさせるために、多くの化学物質が同定されてきた。元々、生物学的に活性な巨大分子のための精製及び位置決め手順に適用されてきたものであるが、今日、アビジン−ビオチン技術は、医療診断に広く使用されてきている。開発中の新たな応用は、アフィニティー・ターゲティング、セル・サイトメトリー、ブロッティング技術、ドラッグ・デリバリー、ハイブリドーマ技術、ヒト幹細胞選択及び再輸注並びに酵素捕獲へのいくつかのアプローチを含む。いくつかの応用においては、アビジンは、その上をビオチン化生体分子を含有する溶液が通過するところの不活性材料上に固定化される。アビジンについてのビオチンのアフィニティーは、その溶液からの生体分子の分離を提供する。ビオチン−アビジン技術のレビューは、Applications of Avidin-Biotin Technology to Affinity-Based Separation, Bayer, et al., J. of Chromatography, 1990, pgs.3-11中に見られる。
EP 592242は、従来のフィブリノーゲン−ベースの接着剤とは異なりフィブリン・モノマーに基づく新規のフィブリン接着剤について記載しており、そしてフィブリノーゲンを、処置後に好ましくは除去されるトロンビン−様酵素に供することを含むものである。 EP 592242は、上記酵素の捕獲及び除去が、アビジン材料により再捕獲されることができるビオチン化バトロキソビンを使用することにより達成されることができるということを記載している。 EP 592242中に記載されたフィブリン・モノマー・シーラントは、有利には完全に自己(由来)(autologous)である。自己フィブリン接着剤は、常に事前に調製されることはできないので、患者自身の血液から短い時間期間に(すなわち、1時間又は好ましくは30分未満に)上記接着剤を提供する自己プロセスは、最近の技術及び手順を超える大きな利点を提供する。このような自己プロセスが行われることができる速度は、ビオチン−及びアビジン−ベースの試薬の活性にかなりの程度で依存する。商業的に入手可能な固定化されたアビジンは、典型的には、凍結乾燥粉末(例えば、 Sigmaからのアクリル・ビーズ上のアビジン)1g当り約 200〜400 ビオチン結合単位(BBU)(1BBU はα−ビオチン1μgに結合するであろう)の活性を、又はスラリー又はゲル(例えば、 Sigma及びPierceから入手可能なアガロース上のアビジン)1ミリリッター当り約20〜50BBU の活性を含む。
また、上記フィブリン・モノマー技術及び他の生物学的応用は、アビジン−及びビオチン−ベースの試薬のより便利な形態から利得を得るであろう。例えば、上記組成物(compositions)を調製するために必要な加工は、それらの活性に対する有害な効果をもつことができる。なぜなら、そのカップリング/固定化技術の多くが、それらの活性をかなり減少させることができる材料を含むからである。さらに、アビジンの、又はアビジン−ビオチン複合体の浸出を減少させ又は取り除くシステムは、多くの適用において有利であろう。さらに、多くの生物学的適用は、凍結乾燥されることができ、そしてさらに安定性を維持しながら最終滅菌(terminally sterilized) されることができる高活性アビジン化合物の利用可能性により大きく高められることができるであろう。特に、最終滅菌、例えば、ガンマ線照射に耐えることができる凍結乾燥された粉末形態における、高安定性の高アビジン活性レベルをもつアビジン組成物は、本分野において新規である。
本発明の要約
本発明により、アビジンと、不活性の容易に分離可能な支持体材料、例えば、水溶性ポリマー、例えば、アガロース及びアルギネートから選ばれた多糖類との安定性、高活性性化合物であって、凍結乾燥形態1グラム当り 1000BBU以上の活性レベル及びスラリー又は水和ゲル1ミリリッター当り 50BBU以上の活性レベルをもつ組成物が開示される。好ましい化合物は、非イオン水溶性ポリマー、保護剤、及びアビジン/不活性支持材料から選ばれたバルキング剤を含む。上記組成物は、上記組成物のpHを調整し、そして/又は維持するように選ばれた1以上の材料をも含むことができ、そして水性懸濁液中で、又は好ましくは、凍結乾燥形態において有用である。
本発明により、アビジンと、不活性の容易に分離可能な支持体材料、例えば、水溶性ポリマー、例えば、アガロース及びアルギネートから選ばれた多糖類との安定性、高活性性化合物であって、凍結乾燥形態1グラム当り 1000BBU以上の活性レベル及びスラリー又は水和ゲル1ミリリッター当り 50BBU以上の活性レベルをもつ組成物が開示される。好ましい化合物は、非イオン水溶性ポリマー、保護剤、及びアビジン/不活性支持材料から選ばれたバルキング剤を含む。上記組成物は、上記組成物のpHを調整し、そして/又は維持するように選ばれた1以上の材料をも含むことができ、そして水性懸濁液中で、又は好ましくは、凍結乾燥形態において有用である。
好ましい態様の詳細な説明
アビジン/不活性支持体組成物は知られているけれども、本発明において記載するような高レベルの活性をもつような組成物は、今日まで開示されてこなかった。今般、驚ろくべきことに、アビジン又はその不活性支持体の完全性及び安定性に損傷を与えずに現在入手可能であるものを数倍超える活性をもつアビジン組成物が製造されることができることが発見された。事実、いずれかの便利な形態、すなわち、スラリー、懸濁液、水和ゲル、脱水ゲル、乾燥粉末等における上記化合物は、滅菌、安定水性懸濁液の主成分、そして最終滅菌、例えば、ガンマ線照射に耐えることができる顕著に安定した凍結乾燥組成物であることができる。本発明における新規組成物は、粉末1グラム当り、1000BBU(上記のようなアビジン組成物のビオチン結合能力の尺度である)を超える凍結乾燥形態についての活性レベルを、そして好ましくは、1500〜3000BBU の活性、そして最も好ましくは、1800〜2400BBU の活性をもつ。スラリー、懸濁液又はゲルの形態においては、本発明に係る新規のアビジン組成物は、1ミリリッター当り、 50BBUを超える、そして好ましくは、75〜150BBUの、そしてより好ましくは、90〜110BBUの活性をもつ。
アビジン/不活性支持体組成物は知られているけれども、本発明において記載するような高レベルの活性をもつような組成物は、今日まで開示されてこなかった。今般、驚ろくべきことに、アビジン又はその不活性支持体の完全性及び安定性に損傷を与えずに現在入手可能であるものを数倍超える活性をもつアビジン組成物が製造されることができることが発見された。事実、いずれかの便利な形態、すなわち、スラリー、懸濁液、水和ゲル、脱水ゲル、乾燥粉末等における上記化合物は、滅菌、安定水性懸濁液の主成分、そして最終滅菌、例えば、ガンマ線照射に耐えることができる顕著に安定した凍結乾燥組成物であることができる。本発明における新規組成物は、粉末1グラム当り、1000BBU(上記のようなアビジン組成物のビオチン結合能力の尺度である)を超える凍結乾燥形態についての活性レベルを、そして好ましくは、1500〜3000BBU の活性、そして最も好ましくは、1800〜2400BBU の活性をもつ。スラリー、懸濁液又はゲルの形態においては、本発明に係る新規のアビジン組成物は、1ミリリッター当り、 50BBUを超える、そして好ましくは、75〜150BBUの、そしてより好ましくは、90〜110BBUの活性をもつ。
好ましい本発明に係る凍結乾燥されたアビジン/不活性支持体組成物は、安定であり、熱的に滅菌されることができ、低い水分吸収/水分含量をもち、再構築の間に完全にかつ、速やかに再膨潤し、非浸出性であり、そして医薬として許容されることができる。本発明において使用されるバルキング剤は、凍結乾燥プロセスの間に損傷からゲル・ビーズを保護し、そしてその凍結乾燥された材料の再構築の間にそのゲル・ビーズの速やかな、かつ、完全な再膨潤を提供する。本明細書中のユニークな成分の組合せは、本組成物の最終滅菌の間の全ての有害な効果からアビジン/不活性支持体成分をも保護する。従って、ビオチン化生体分子についてのアビジンのアフィニティーは、上記の激しい処理工程、すなわち、凍結乾燥及び/又は最終滅菌の後でさえも維持される。従って、アビジンのアフィニティー特性と不活性支持体の完全性の両方がアビジン/ビオチン技術の有効性に対して決定的であるさまざまな適用において、本発明により優れた組成物が提供される。
本発明のアビジン成分は、アビジン、モノマーのアビジン、ストレプトアビジン、アビジンの誘導体化形態を含むビオチンについてのアフィニティーをもつ他のタンパク質及び上記のもののいずれかの組換え形態をいう。上記アビジンは、好ましくは、不溶性であり、又はエマルジョン/相分離の如き技術その他を使用して不活性支持体から容易に分離されなければならない。不活性材料は、低反応性であり、親水性であり、必要なときに反応混合物の液相から容易に分離されることができる多孔性又は非多孔性マトリックスを形成するいずれかの材料である。このような材料は、非限定的に、デキストラン、セルロース、デンプン、カラギーナン、キチン、ポリアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、スチレンジビニルベンゼン、オキシランアクリル、シリカ、アルミナ、ジルコニア、ガラス、ペルフルオロカーボン及びゲル・ビーズを形成する寒天ファミリー又はアルギネート・ファミリーからの多糖類を含む。上記及び他のこのような材料が有用であり、そして分離カラム内の不活性材料としてよく知られている。ほとんどが商業的に入手可能であり、例えば、アガロースは、好ましく、そして Pharmaciaから SepharoseTMとして入手可能である。
本発明をアビジンとアガロースについてさらに説明する。アビジンが上記のアビジンのいずれの形態をも含むことを意図され、そしてアガロースが上記の不活性支持材料のいずれをも表すと理解すべきである。
バルキング剤は、非イオン性の水溶性ポリマーである。例は、非限定的に、単純な糖(例えば、単糖類及び二糖類)、オリゴ糖類、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール又はポリエチレングリコールを含む。好ましくは、バルキング剤は、グルコースの分子量から高分子量デキストランの分子量までの範囲にわたる糖である。より好ましくは、バルキング剤は、グルコースに基づくオリゴ糖類、例えば、二量体グルコース(すなわち、マルトース)、三量体グルコース(マルトトリオース)、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、低分子量デキストラン、高分子量デキストランであり、上記のもののいずれかの組合せを含む。マルトースが好ましい。
本組成物の保護剤は、抗酸化剤、フリー・ラジカル除去剤及び還元剤から選ばれる。抗酸化剤、例えば、α−トコフェロール、還元型グルタチオン、キノン、N,N−ジメチル−P−フェニレンジアミン、アスコルビルパルミテート、アミノ酸、酒石酸、リン酸、並びにアスコルビン酸/アスコルビン酸ナトリウムが好ましいが、アスコルビン酸塩が最も好ましい。
本組成物は、pHを所望のレベルに調整するための剤を含むこともできる。例えば、アルカリ性材料、例えば、水酸化ナトリウムがpHを調整するために添加されることができる。pHは、ビオチン化バトロキソビンと共に使用されるためには、好ましくは、約4である。さらに、バッファーが、そのpHレベルを維持するために取り込まれることができる。バッファー及びpHを調整するための剤は、本分野において周知であり、そしてこのような材料のいずれもその適用に依存して好適である。好ましい態様においては、上記アスコルビン酸保護剤もバッファーとして役立つ。しかしながら、いずれの便利なバッファー及びpH調整剤も特定の適用のためには適宜使用されることができると理解すべきである。
本発明に係る組成物は、便利には、水性スラリー又は懸濁液である。上記スラリー又は懸濁液は、無菌的に調製されるか又は最終滅菌されることができるので、それらは、本発明の肝要な部分である。好ましくは、本発明の水性スラリー又は懸濁液は凍結乾燥されることができる。なぜなら、それから生じる凍結乾燥された粉末は、高安定性であり、(例えば、ガンマ線照射により)最終滅菌されることができ、非吸湿性であり、そして極めて取り扱いが容易であるからである。
本発明に係る組成物は、とりわけ、スラリー又は懸濁液中のビーズ・ゲルと共に、取り扱われるので、本分野において上記用語のいくつかが何を意味すると理解されているかを明確にすることが重要である。例えば、アガロースは、4%及び6%ゲルで商業的に入手可能である。これは、その水和ゲル・ビーズ材料が、例えば、4%ゲルについて(すなわち、そのビーズ内に)96重量%の水を含有する4重量%の架橋アガロース・ビーズ、及び6%ゲルについて94重量%の水を含有する6重量%の架橋ゲルであるという事実をいう。これらのビーズは、いずれかの便利なサイズであることができ、そしてサイズ・レンジは知られており、そして本分野において入手可能である。上記の入手可能な4%及び6%ゲルは、典型的には、60と 120ミクロンの間の直径範囲をもつビーズを包含する。
上記ゲル・ビーズは、次に、いくつかの形態で使用されることができる。例えば、“湿沈殿ゲル(wet settled gel) ”は、水中のゲル・ビーズが重力下で、すなわち、その水のほとんどをきり、水和ゲル・ビーズと侵入水(interstitial water)、すなわち、ビーズ間の水だけを残すことにより、沈殿に供されるときに得られる。これは、典型的には、70〜80%の水和ビーズ容量及び20〜30%の侵入水容量、好ましくは、約75容量%の水和ビーズと約25容量%の侵入水を包含する湿沈殿ゲルをもたらす。この湿沈殿ゲル形態は、処理において使用するのに便利である。なぜなら、この材料は、ほとんど水であり、1に近い密度を提供するからである。これは、今度は、特に、多量、すなわち、10グラム以上を使用するとき、重量又は容量のいずれかにおいて、比較的正確な計測において柔軟性を提供する。
“湿(moist) ”又は“吸収(sucked)”ゲルは、上記侵入水が除去されている水和ゲル・ビーズを包含し、そして少量のゲルを計測するためにより正確な方法である。
以下に、そしてそれに続く実施例中に討議する処理において、特にことわらない限り、アガロース・ゲル、アガロース・ゲル・ビーズ、アガロース又はアガロース・ビーズは湿沈殿ゲルをいう。
本発明に係る水性組成物は、好ましくは、以下の:
1〜50重量%のバルキング剤;
0.01〜50重量%の保存剤;及び
40〜98.99 重量%の水、
を包含する溶液による、スラリー又は懸濁液におけるアビジン・アガロース・ゲル・ビーズ(湿沈殿ゲル)を包含する。
1〜50重量%のバルキング剤;
0.01〜50重量%の保存剤;及び
40〜98.99 重量%の水、
を包含する溶液による、スラリー又は懸濁液におけるアビジン・アガロース・ゲル・ビーズ(湿沈殿ゲル)を包含する。
より好ましくは、本発明に係る水性組成物は、以下の:
5〜40重量%及び最も好ましくは10重量%のバルキング剤、好ましくは、糖、より好ましくは、マルトース;
0.1〜10重量%、及び最も好ましくは、1重量%の保存剤、好ましくは、抗酸化剤、より好ましくは、アスコルビン酸;及び
50〜94.9重量%の水;
を包含し;
そして場合により、好ましい態様においては、さらに
そのpHを所望のレベルに調整するために十分な剤、好ましくは、アルカリ材料、例えば、そのpHを約4に調整するための水酸化ナトリウム;及び
バッファーであって、好ましくは、上記アスコルビン酸保存剤であるもの、
を含む、溶液による、スラリー又は懸濁液におけるアビジン・アガロース・ゲル・ビーズを包含する。
5〜40重量%及び最も好ましくは10重量%のバルキング剤、好ましくは、糖、より好ましくは、マルトース;
0.1〜10重量%、及び最も好ましくは、1重量%の保存剤、好ましくは、抗酸化剤、より好ましくは、アスコルビン酸;及び
50〜94.9重量%の水;
を包含し;
そして場合により、好ましい態様においては、さらに
そのpHを所望のレベルに調整するために十分な剤、好ましくは、アルカリ材料、例えば、そのpHを約4に調整するための水酸化ナトリウム;及び
バッファーであって、好ましくは、上記アスコルビン酸保存剤であるもの、
を含む、溶液による、スラリー又は懸濁液におけるアビジン・アガロース・ゲル・ビーズを包含する。
典型的には、上記スラリー又は懸濁液は、約30〜90%の、上記“保存剤”溶液の中の1中の約10〜70容量%の湿沈殿ゲル・ビーズを包含する。
10%ビーズをもつ組成物は、懸濁液にあり、一方、70%ビーズをもつ組成物は、スラリー又はゲルの形態にあると理解される。
アビジンを、支持体、例えば、アガロースに固定化するために、上記支持体は、アビジン・カップリングに先立って事前に活性化されなければならない。好ましいプロセスは、活性化剤としてのエピクロロヒドリンの使用を含む、しかしながら、活性化は、アビジンとの共有結合を形成することができる活性化支持体を提供することができるいずれかの好適な技術により行われることができる。例えば、支持体を誘導体化するために利用することができるさまざまな活性化試薬は:ジアゾニウム基、イソシアネート基、酸クロリド基、酸無水物基、塩化スルホニル基、ジニトロ・フルオロフェニル基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アミノ基、n−ヒドロキシスクシンイミド基、トリアジン基、ヒドラジド基、カルボジイミド基、シラン基、アルデヒド基、1,4−ブタンジオール・ジグリシジル・エーテル、ナトリウム・メタペリオデート、1,1−カルボニル・ジイミダゾール、ジビニルスルホン、2−フルオロ−1−メチルピリジニウム・トルエン−4−スルホネート及び臭化シアンである。(a)Pentapharm Patent DT 2440 254 A1;(b)P.D.G.Dean, W.S.Johnson and F.A.Middle (Editors)(1991) IRL Press Oxford-Affinity Chromatography-A practical approach-chapter 2-Activation Procedures及び(c)C.R.Lowe and P.D.G.Dean (1974) John Wiley and Sons Ltd., London, Affinity Chromatographyを参照のこと。(これらの開示を引用により本明細書中に取り込む)。
好ましい活性化化学は、エピクロロヒドリンによる活性化後のエポキシドによるものである。このやり方で活性化された支持体の使用は、アビジン結合後にアビジン浸出を本質質的にもたらさない。
一般に、支持体は、高反応性化合物により活性化され、これは次に、リガンドの官能基、例えば、−OH, −NH2, −SH, −CHO と反応して共有結合を形成する。アビジンが付着されていない残りの活性基は、本質的ではないが、エタノールアミン、無水酢酸又はグリシンの如き化合物でブロックされることができる。
本発明において使用される好ましい活性化化学は:
(a)エピクロロヒドリン又は2官能価エポキシド化合物による支持体の活性化、その後の、−NH2, −SH又は−OH基を介してのアビジンのカップリング;
(b)臭化シアン活性化、その後の、タンパク質上の−NH2 基を介してのアビジンの直接カップリング;
(c)モノクロロトリアジンによる支持体の活性化、その後の、−NH2, −OH又は−SH基を介してのアビジンのカップリング;
(d)ジクロロトリアジンによる支持体の活性化、その後の、−NH2, −OH又は−SH基を介してのアビジンのカップリング;
(e)支持体の塩化トレジル(Tresyl chloride) 活性化、その後の、−NH2, −OH又は−SH基を介してのアビジンのカップリング;
(f)アジピン酸ヒドラジド又はヒドラジドによる支持体の活性化、その後の、−CHO 基を介しての酸化アビジンのカップリング;
(g)アミノ・リガンドによる支持体の活性化、その後の、−CHO 基を介しての酸化アビジンのカップリング;
である。
(a)エピクロロヒドリン又は2官能価エポキシド化合物による支持体の活性化、その後の、−NH2, −SH又は−OH基を介してのアビジンのカップリング;
(b)臭化シアン活性化、その後の、タンパク質上の−NH2 基を介してのアビジンの直接カップリング;
(c)モノクロロトリアジンによる支持体の活性化、その後の、−NH2, −OH又は−SH基を介してのアビジンのカップリング;
(d)ジクロロトリアジンによる支持体の活性化、その後の、−NH2, −OH又は−SH基を介してのアビジンのカップリング;
(e)支持体の塩化トレジル(Tresyl chloride) 活性化、その後の、−NH2, −OH又は−SH基を介してのアビジンのカップリング;
(f)アジピン酸ヒドラジド又はヒドラジドによる支持体の活性化、その後の、−CHO 基を介しての酸化アビジンのカップリング;
(g)アミノ・リガンドによる支持体の活性化、その後の、−CHO 基を介しての酸化アビジンのカップリング;
である。
上記の好ましい方法論の全てが、支持体としてアガロースを使用する。しかしながら、他の上述の支持体をも使用することができる。例えば、シリカを使用するとき、好ましい活性化化学は:
(a)エピクロロヒドリン又は2官能化エポキシドによる支持体の活性化、その後の、−NH2, −SH又は−OH基を介してのアビジンのカップリング;
(b)タンパク質上の−NH2 基を介してのアビジンの直接カップリングを伴う、ガンマーグリシドオキシプロピルトリメトキシシラン活性化;
(c)臭化シアン活性化、その後の、タンパク質上の−NH2 基を介してのアビジンの直接カップリング;
(d)ジオール基を形成するための、ガンマーグリシドオキシトリメトキシシラン活性化、その後の、エポキシド環の開裂、ジオール基は、その後に臭化シアンにより活性化される。アビジンの直接カップリングは、タンパク質上の−NH2 基を介して達成されることができる;
(e)ガンマーグリシドオキシプロピルトリメトキシシラン活性化、その後の、アンモニア溶液による処理によるアミノ−シリカの調製;
である。
(a)エピクロロヒドリン又は2官能化エポキシドによる支持体の活性化、その後の、−NH2, −SH又は−OH基を介してのアビジンのカップリング;
(b)タンパク質上の−NH2 基を介してのアビジンの直接カップリングを伴う、ガンマーグリシドオキシプロピルトリメトキシシラン活性化;
(c)臭化シアン活性化、その後の、タンパク質上の−NH2 基を介してのアビジンの直接カップリング;
(d)ジオール基を形成するための、ガンマーグリシドオキシトリメトキシシラン活性化、その後の、エポキシド環の開裂、ジオール基は、その後に臭化シアンにより活性化される。アビジンの直接カップリングは、タンパク質上の−NH2 基を介して達成されることができる;
(e)ガンマーグリシドオキシプロピルトリメトキシシラン活性化、その後の、アンモニア溶液による処理によるアミノ−シリカの調製;
である。
アミノ−シリカは、その後に、塩化シアヌール酸(トリアジン)により活性化されることができ、そしてアビジンは、−NH2, −OH又は−SH基を介してカップリングされる。
活性化された支持体へのアビジンのカップリングは、最適なアビジン結合を得るために特定のpHに緩衝液化されなければならない。一般に、標準的な活性化技術、例えば、活性化支持体へのアビジンのガンマーグリシドオキシプロピルトリメトキシシラン・カップリング及び活性基へのいずれかのタンパク質の臭化シアン・カップリングは、アビジンの第1及び第2アミンの pKaよりも1〜2単位高いpHでの緩衝液化を要求する。しかしながら、活性化剤として塩化シアヌール酸の使用は、より低いpHバッファーの使用を可能にする(最適カップリングpHは4〜6である。)。不活性支持体にアビジンをカップリングさせる他の方法は、その炭水化物部分を介してのものである。これは、−CHO 基への糖基の最初の酸化、アミノ基、例えば、ヒドラジドへの酸pHの直接カップリングを含む。広い範囲のカップリング・バッファーを使用することができる。例えば、表1を参照のこと。
先に記載したように、不活性支持体、例えば、アガロース上に固定化されたアビジンの上記“高活性”組成物は、現在のアビジン技術が有用であるいずれかの、そして全ての化学及び生物学的適用において有用である。好ましい態様においては、アガロース上に固定化されたアビジンは、便利には、水中でさまざまな成分と混合することにより、又は水中で上記“保護剤”溶液成分と混合することにより、そしてその後に、アビジン・アガロース・ゲルを添加することにより、本発明に係る組成物中にその後に取り込まれる。滅菌水性組成物を要求する状況のためには、これは、無菌的に実施されることができ、又は保存剤が本組成物に添加されることができる。好ましくは、水性組成物は、粉末形態に凍結乾燥され、これは、例えば、ガンマ線照射により最終滅菌されることができる。いずれの便利な凍結乾燥プロセスも使用することができる。好ましいプロセスは、約−33℃まで、凍結乾燥装置内で上記水性組成物を冷却し、そしてこれを維持することを含み、一方、真空を開始し、そして上記組成物を、約 0.3mbarの減圧下で乾燥させる。その後、上記組成物を室温まで放置して暖める。
トロンビン又はトロンビン−様酵素、例えば、バトロキソビン(Batroxobin)のビオチン化形態の捕獲のための安定なアビジン組成物の使用に関連する本発明に係る組成物は、フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン含有組成物をフィブリン・モノマー又はフィブリン・モノマー含有組成物に変換するための方法において有用である。従って、本発明は、例えば、フィブリン接着剤の調製において有用なフィブリン・モノマーを調製するための新規の方法を含む。この新規の方法は:
フィブリノーゲンの源をビオチン化トロンビン又はトロンビン様酵素組成物に供して、フィブリノーゲンをフィブリン・モノマーに変換し、
本発明に係るアビジン組成物を用いてビオチン化酵素を捕獲して、ビオチン/アビジン複合体を形成し、そして
そのように形成されたビオチン/アビジン複合体の一部である上記酵素を除去する、
ことを含む。
本発明に係るアビジン組成物を用いてビオチン化酵素を捕獲して、ビオチン/アビジン複合体を形成し、そして
そのように形成されたビオチン/アビジン複合体の一部である上記酵素を除去する、
ことを含む。
本発明に係る組成物は、処理装置、例えば、先に定義されたようなフィブリン・モノマーを調製するための自動化遠心分離内にさらに取り込まれることができる。このアビジン・アガロース組成物は、粉末形態で上記処理装置内に事前にロードされることができ又は上記装置内でその場で凍結乾燥され、又は上記装置の制御された放出区画内で凍結乾燥されることができる。
実施例1−水性組成物
約 3.5リッターのビーズ化アガロース・ゲル(Pharmacia Co. から Sepharose CL-4BTMとして商業的に入手可能なグレード4XL)を、濾過漏斗内で重力沈殿させた。約 2.8リッターのそのように沈殿させたアガロース・ゲルを反応容器に移した。このアガロース・ゲルを 2.8容量の水で12回洗浄した。このように洗浄したゲルを、その後に、2016ミリリッターの0〜11モル濃度の水酸化ナトリウムと混合し、そして次に 202ミリリッターのエピクロロヒドリンと、40℃に維持しながら、約3時間反応させた。この活性化されたゲルを、次に水で洗浄し、そしてその後、約40℃で48時間、塩化ナトリウム/炭酸水素(重炭酸)ナトリウムpH10バッファーの存在下、19.6グラムのアビジンとカップリングさせた。このアビジン−アガロース・ゲルを、その後に、塩化ナトリウム溶液で数回洗浄し、そして未反応エポキシド基のすべてを、20℃で16時間、1Mエタノールアミン(pH 9.5)による処理によりブロックした。このアビジン−アガロース・ゲルを、次に水で洗浄し、そしてその後、pH 4.0における、マルトース(20%w/v)及びアスコルビン酸(2%w/v)を含有する溶液の等容量(28L)と混合し、そして重力下で水をきった。
約 3.5リッターのビーズ化アガロース・ゲル(Pharmacia Co. から Sepharose CL-4BTMとして商業的に入手可能なグレード4XL)を、濾過漏斗内で重力沈殿させた。約 2.8リッターのそのように沈殿させたアガロース・ゲルを反応容器に移した。このアガロース・ゲルを 2.8容量の水で12回洗浄した。このように洗浄したゲルを、その後に、2016ミリリッターの0〜11モル濃度の水酸化ナトリウムと混合し、そして次に 202ミリリッターのエピクロロヒドリンと、40℃に維持しながら、約3時間反応させた。この活性化されたゲルを、次に水で洗浄し、そしてその後、約40℃で48時間、塩化ナトリウム/炭酸水素(重炭酸)ナトリウムpH10バッファーの存在下、19.6グラムのアビジンとカップリングさせた。このアビジン−アガロース・ゲルを、その後に、塩化ナトリウム溶液で数回洗浄し、そして未反応エポキシド基のすべてを、20℃で16時間、1Mエタノールアミン(pH 9.5)による処理によりブロックした。このアビジン−アガロース・ゲルを、次に水で洗浄し、そしてその後、pH 4.0における、マルトース(20%w/v)及びアスコルビン酸(2%w/v)を含有する溶液の等容量(28L)と混合し、そして重力下で水をきった。
実施例2−凍結乾燥組成物
上記、実施例1の方法により提供された最終生成物を、トレーの上に置き、そしてその棚が−37℃に事前冷却されている(EdwardsHigh Vacuum Co. から入手可能な)EF6(S)凍結乾燥装置内にロードした。このアビジン・アガロース・スラリーを−33℃に冷却し、そして圧力を、(真空により)0.3ミリバールまで減少させた。この生成物を、この氷の全てが昇華するまで、上記圧力及び温度に維持した。その後、圧力を0.08ミリバールに調整し、そして温度を、30℃まで1時間当り5℃ずつ段階的に上昇させて、凍結乾燥製品を提供した。
上記、実施例1の方法により提供された最終生成物を、トレーの上に置き、そしてその棚が−37℃に事前冷却されている(EdwardsHigh Vacuum Co. から入手可能な)EF6(S)凍結乾燥装置内にロードした。このアビジン・アガロース・スラリーを−33℃に冷却し、そして圧力を、(真空により)0.3ミリバールまで減少させた。この生成物を、この氷の全てが昇華するまで、上記圧力及び温度に維持した。その後、圧力を0.08ミリバールに調整し、そして温度を、30℃まで1時間当り5℃ずつ段階的に上昇させて、凍結乾燥製品を提供した。
Claims (31)
- ゲル、スラリー又は懸濁液の形態にある組成物であって:
液体担体;
不活性支持体材料;及び
上記不活性支持体材料上に固定化されたアビジン、を含んで成り、ここで、上記組成物が、その組成物の1ミリリッター当り少なくとも50単位のビオチン結合活性をもつ、前記組成物。 - 1ミリリッター当り75と 150単位の間のビオチン結合活性をもつ、請求項1に記載の組成物。
- 1ミリリッター当り90と 110単位の間のビオチン結合活性をもつ、請求項1に記載の組成物。
- 不活性支持体上に固定化されたアビジンの安定した組成物であって:
アビジン/不活性支持体成分;
非イオン性水溶性化合物から選ばれたバルキング剤;及び
保護剤、
を含んで成る、前記組成物。 - 水性スラリー又は懸濁液の形態にある、請求項4に記載の組成物。
- 前記組成物のpHを所定のレベルに調整するための剤をさらに含む、請求項4に記載の組成物。
- 所望の前記組成物のpHを維持するためのバッファーをさらに含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記保護剤がバッファーとしても機能する、請求項7に記載の組成物。
- アビジンが、モノマー・アビジン、ストレプトアビジン、アビジン誘導体、ビオチンについてのアフィニティーをもつタンパク質であることができ、それらの組換え形態をも含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記不活性支持体材料が、ポリマー・マトリックスを形成することができ、そして液相から分離されることができる、実質的に不活性な親水性材料である、請求項4に記載の組成物。
- 前記不活性材料が、デキストラン、セルロース、デンプン、カラギーナン、キチン、ポリアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、スチレンジビニルベンゼン、オキシランアクリル、シリカ、アルミナ、ジルコニア、ガラス、ペルフルオロカーボン及び寒天又はアルギネート・ファミリーからの多糖類から選ばれている、請求項10に記載の組成物。
- 前記不活性材料が、寒天及びアルギネートから選ばれた、請求項10に記載の組成物。
- 前記不活性材料がアガロースである、請求項11に記載の組成物。
- 前記アガロースが、ゲル・ビーズの形態にある、請求項13に記載の組成物。
- 前記バルキング剤が、単純な糖(例えば、単糖類及び二糖類)、オリゴ糖類、多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール又はポリエチレングリコール、から選ばれた、請求項4に記載の組成物。
- 前記バルキング剤が、グルコースの分子量から高分子量デキストランの分子量までの範囲の分子量をもつ糖である、請求項15に記載の組成物。
- 前記バルキング剤が、グルコースに基づくオリゴ糖類である、請求項16に記載の組成物。
- 前記バルキング剤が、二量体グルコース(すなわち、マルトース)、三量体グルコース(マルトトリオース)、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、低分子量デキストラン、高分子量デキストランであって、上記の中のいずれかの組合せを含むものから選ばれた、請求項17に記載の組成物。
- 前記保護剤が、抗酸化剤、フリー・ラジカル除去剤及び還元剤から選ばれた、請求項4に記載の組成物。
- 前記保護剤が、α−トコフェロール、還元型グルタチオン、キノン、N,N−ジメチル−P−フェニレンジアミン、アスコルビルパルミテート、アミノ酸、酒石酸、リン酸及びアスコルビン酸/アスコルビン酸ナトリウムから選ばれた抗酸化剤であって、アスコルビン酸/ナトリウム、アスコルベートが最も好ましいものであることができる、請求項19に記載の組成物。
- 前記pHを約4に調整するためのアルカリ材料を含む、請求項6に記載の組成物。
- 前記アルカリ材料が、水酸化ナトリウムである、請求項21に記載の組成物。
- 前記バッファー/保護剤がアスコルビン酸である、請求項8に記載の組成物。
- 以下の:
2〜50重量%の、そして最も好ましくは、10重量%のバルキング剤、好ましくは、糖、好ましくは、マルトース;
0.01〜50重量%の、そして最も好ましくは、1重量%の保護剤、好ましくは、抗酸化剤、より好ましくは、アスコルビン酸ナトリウム;及び
40〜98.99 重量%の水;そして場合により、
pHを調整し、そして/又は所望のpHを維持するための材料、
を包含する溶液を含む、スラリー又は懸濁液中にアビジン・アガロース・ゲル粒子を包含する、請求項5に記載の水性組成物。 - 以下の:
5〜40重量%の前記バルキング剤;
0.1〜10重量%の前記保護剤;及び
50〜94.9重量%の水、
を含んで成る溶液を含むスラリー又は懸濁液中にアビジン・アガロース・ゲル粒子を包含する、請求項24に記載の組成物。 - 以下の:
約10重量%のマルトース;
約1重量%のアスコルビン酸;及び
約4の前記組成物のpHを提供するために十分な水酸化ナトリウム、
を含んで成る、請求項25に記載の組成物。 - 凍結乾燥形態にある、請求項4に記載の組成物。
- アビジン/ビオチン・アフィニティーを使用する方法における、請求項4に記載の組成物の使用方法。
- フィブリノーゲン含有組成物をビオチン化酵素に供してそのフィブリノーゲンをフィブリン・モノマーに変換させ;
ビオチンについてのアフィニティーをもつ材料を上記のように形成されたフィブリン・モノマー/ビオチン化酵素混合物に導入して、上記アフィニティー材料とビオチン化酵素との複合体を形成させて;そして
上記のように形成された複合体を、そしてそれにより上記酵素を、上記フィブリン・モノマー製品から分離する、
ことを含む、フィブリン・モノマーの製造方法において、上記ビオチンについてのアフィニティーをもつ材料として請求項4に記載の組成物を使用する方法。 - 安定性及びビオチン・アフィニティーを維持しながら前記組成物についての無菌性を提供する、不活性支持体材料上に固定化されたアビジンの最終滅菌方法であって、請求項4に記載の組成物を最終滅菌プロセスに供することを含む方法。
- 前記アビジン・アガロースが凍結乾燥形態にある、請求項28に記載の方法。
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