JP2006275685A

JP2006275685A - Ｄｌｐ式エバネッセンス顕微鏡

Info

Publication number: JP2006275685A
Application number: JP2005093685A
Authority: JP
Inventors: Susumu Terakawa; 進寺川; Koji Sakurai; 孝司櫻井; Yoshihiko Wakazono; 佳彦若園; Seiji Yamamoto; 清二山本
Original assignee: Hamamatsu University School of Medicine NUC
Current assignee: Hamamatsu University School of Medicine NUC
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2025-03-29
Also published as: WO2006104183A1; JP4370404B2

Abstract

【課題】照射光の効率的な利用，発生位置の精度，簡易な制御，他の照明方式にも容易に切替え可能にするため、ＤＭＤの制御によってエバネッセント光を発生させることができるＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡を提供する。
【解決手段】レーザ光は凹レンズ２で発散され凸レンズ３によって平行光となり、ＤＭＤ装置４に入射する。ＤＭＤ装置４ではカバーガラス８で臨界角以上になるような入射光となるリング形状のマイクロミラーがオン制御される。凸レンズ２２はリング形状にオン制御されるマイクロミラーからの反射光のみを通過させ、この通過光を超高開口数対物レンズ７の後焦点面に集束させるレンズである。リング形状の光はダイクロイックミラー５で反射され、後焦点面を通過して超高開口数対物レンズ７に入射し屈折する。カバーガラス８の下面で全反射し、エバネッセント光が発生する。
【選択図】図１

Description

本発明は、ＤＭＤの制御によってエバネッセント光照明を行うＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡に関する。

細胞などの標本を観察する場合、エバネッセント光を発生させ、標本の特定の部分（わずかな厚さ部分）のみ照明し、その部分を観察するためのエバネッセント光照明を行う顕微鏡が供されている。場合によっては標本の極めて薄い部分のみを観察して分析しなければならない必要性があるからである。
従来のエバネッセント光照明を発生させる方法の１つは、照明光が全反射する角度でカバーガラスに入射するように光学系の反射ミラー面を設置することにより実現している。

上記のように光学素子の位置の調整によって、または切替方式で光学素子の位置を定めることによってエバネッセント光照明を実現する構成は、光学系の各要素の配置に一定の制限を与えることとなり、エバネッセント光発生のための照射光の効率的な利用，エバネッセント光発生位置，光学系を複雑にすることなく容易に発生させる点，さらに他の照明方式に容易に切り替えることができること等を考慮した場合、十分な構成とは言えない。上記条件を満たす顕微鏡を構成できれば、細胞などの様々な標本に対し種々の角度からさらに幅広い観察が可能になる。

特許文献１〜４はエバネッセント光照明またはリング状に照明する照明装置を搭載した顕微鏡を開示する例である。
特許文献１は、レーザ顕微鏡によるコンフォーカル画像と蛍光顕微鏡によるエバネッセント蛍光画像を選択的に取得可能な顕微鏡で、エバネッセント光照明は光ファイバを利用して実現し、スキャナの偏向角度の停止位置を決定することによりエバネッセント蛍光観察の際のエバネッセント光照明の調節を行うものである。ＤＭＤの使用はなく、リング状照明でもないので入射光の利用効率に限界がある。
特許文献２は、ビデオプロジェクタでＬＣＤ以外にＤＭＤを使用する点およびリング照明が記載され、当該文献の中で実施の一例として投光照明と透過照明を選択的に切り替える技術が開示されているが、エバネッセント光照明を実現するものではない。

特許文献３は、透過照明と近接場照明のいずれかを選択して試料を観察する光学顕微鏡で、例えば特許文献３の図４においては前者は試料の下側に全反射ミラーを配置してケーラー照明系からの照明光を全反射ミラーにより上方に反射し試料を照明し、試料の透過光を上方のＣＣＤカメラの受光面に結像させている。後者は試料の上にカンチレバーのプローブを配置し、上方からレーザ光を前記プローブに照射し、プローブの先端の微小開口からエバネッセント波を発生させ、エバネッセント波による試料からの伝搬光は図５に示すように透過し予め移動させたミラーユニットの全反射ミラーで全反射させレンズで集光してフォトダイオードに入射させるようになっている。
特許文献３における近接場照明はカンチレバーで実現するものであり、エバネッセント光による試料からの伝搬光は、試料の下側に配置した全反射ミラー，レンズによる光学系で観察する構成となっており、特許文献１と同様、ＤＭＤを使用するものではない。
特許文献４は、通常の落射照明とエバネッセント光照明とを切り替え可能な照明光学系を開示している。しかしながら、エバネッセント光照明を当てるための構造はレンズに入射する光を光ファイバの位置を変えて実現するものである。これについてもＤＭＤの使用はない。
特開２００３−３０７６８２号公報特表２０００−５０２４７２号公報特開平８−２２０１１３号公報特開２００１−２７２６０６号公報

本発明の目的は、上記状況に鑑みたもので、照射光の効率的な利用，標本上の発生位置の調整，簡易な構成による制御，他の照明方式に容易に切替え可能にするため、ＤＭＤの制御によってエバネッセント光を発生させることができるＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡を提供することにある。

前記目的を達成するために本発明の請求項１は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を発散する第１レンズ系と、前記第１レンズ系で発散された光束を、対物レンズ系の後焦点面に集束させる第２レンズ系と、前記第２レンズ系からの光が入射し、多数のマイクロミラーのオンオフ制御によって光を反射するＤＭＤ装置と、前記ＤＭＤ装置からの反射光を入射して光路を変更するダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーからの光を入射する前記対物レンズ系と、前記対物レンズ系の前側に配置されたカバーガラスと、前記カバーガラス上の標本からの光が、前記対物レンズ系および前記ダイクロイックミラーを通過し、該光を結像させる第３レンズ系と、前記第３レンズ系で結像された前記標本の像を観察するための観察手段とを備え、前記ＤＭＤ装置のマイクロミラーをリング形状でオン制御して前記カバーガラス下面に臨界角以上で入射させて全反射させ、前記カバーガラスに搭載された標本にエバネッセント光を発生させることを特徴とする。
本発明の請求項２は、請求項１記載の発明において前記第２レンズ系は前記第１レンズ系と前記ＤＭＤ装置の間に凸レンズを配置して平行光にし、前記ＤＭＤ装置とダイクロイックミラーの間にさらに凸レンズを配置して前記対物レンズ系の後焦点面に集束させることを特徴とする。
本発明の請求項３は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を発散する第１レンズ系と、前記第１レンズ系で発散された光束を平行光にする第２レンズ系と、前記第２レンズ系からの光が入射し、多数のマイクロミラーのオンオフ制御によって光を反射するＤＭＤ装置と、前記ＤＭＤ装置からの反射光を入射して光路を変更するダイクロイックミラーと、前記ＤＭＤ装置と前記ダイクロイックミラーの間に配置され、光束を対物レンズ系の後焦点面に集束させる集光用レンズ群系と、前記ダイクロイックミラーからの光を入射する対物レンズ系と、前記対物レンズ系の前側に配置されたカバーガラスと、前記カバーガラスに搭載された標本からの光が、前記対物レンズ系および前記ダイクロイックミラーを通過し、該光を結像させる第３レンズ系と、前記第３レンズ系で結像された前記標本の像を観察するための観察手段とを備え、前記ＤＭＤ装置のマイクロミラーをリング形状でオン制御し、かつ集光用レンズ群系で前記オン制御されたマイクロミラーからの光を集光することにより前記カバーガラス下面に臨界角以上で入射させて全反射させ、前記カバーガラスに搭載された標本にエバネッセント光を発生させることを特徴とする。
本発明の請求項４は、請求項３記載の発明において前記集光用レンズ群系は、リング状に配置されたマイクロレンズ群で構成したことを特徴とする。
本発明の請求項５は、請求項３記載の発明において前記集光用レンズ群系は、トーリックレンズ（環状レンズ）を用いたことを特徴とする。

上記構成によれば、従来のエバネッセント光照明方式に比較し、光の利用効率や発生位置精度の向上，簡易な構成による制御および他の照明方式に簡単に切り替えられ、幅広い標本の観察ができる顕微鏡を実現できる。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳しく説明する。
図１は、本発明によるＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡の実施の形態を示すブロック図である。
この実施の形態は、本発明に直接関連する光学系を中心に記載したもので、他の部分は省略してある。
レーザ光源１，凹レンズ２，凸レンズ３，ＤＭＤ装置４，凸レンズ２２，ダイクロイックミラー５，超高開口数対物レンズ７，カバーガラス８，標本９，凸レンズ１０およびＣＣＤ装置１１によって構成されている。

レーザ光源１から出射した光は、凹レンズ２によって発散され、凸レンズ３，ＤＭＤ装置４，レンズ２２を介して超高開口数対物レンズ（開口数が１．３３以上）７の後焦点面に集束される。凸レンズ３を出射した光は、平行光になってＤＭＤ装置４に入射する。ＤＭＤ装置４では、所定の径以上のリング状の多数のマイクロミラーがオン制御される。オン制御されるマイクロミラーに入射した光は、該マイクロミラーで反射され凸レンズ２２に達する。凸レンズ２２はトーリックレンズ（環状レンズ）などが用いられ、ＤＭＤ装置４でリング状に反射される光に対応する部分のみを入射し集束させる。オフ状態にあるマイクロミラーに入った光は図示しない光トラップに反射する。
ＤＭＤ装置４は図示しない制御回路によってオンオフ制御され、エバネッセント光照明を得るために所定径以上の４ａで示す部分のマイクロミラーをオン状態にする。

ＤＭＤ装置４のマイクロミラーをオン制御するリング形状の幅を調整することによりエバネッセント光の照射領域を変えることができる。
凸レンズ２２を出射したリング形状の光はダイクロイックミラー５で反射され、超高開口数対物レンズ７の後焦点面で一旦集束した後、超高開口数対物レンズ７に入射して屈折し所定の角度でカバーガラス８に入射する。カバーガラス８上の下面に対し臨界角以上の入射であるため、全反射を起こし、再度、超高開口数対物レンズ７へ入射する（入射位置と対象位置）。
カバーガラス８の表面には薄いエバネッセント光が伝搬し、蛍光物質が含まれている標本を照射する。標本で発生した蛍光は超高開口数対物レンズ７，ダイクロイックミラー５，凸レンズ１０を通過してＣＣＤ装置１１の受光面に結像する。標本の蛍光像は、図示しないモニタなどによって観察することができる。

図２は、エバネッセント光照明された標本の詳細を説明するための図で、（ａ）は標本部分の平面図，（ｂ）は超高開口数対物レンズ，カバーガラスおよび標本部分の側面図をぞれぞれ示している。
リング形状の光Ｌ₁ は超高開口数対物レンズ７で屈折されカバーガラス８に対し臨界角以上で入射し、全反射を起こして超高開口数対物レンズ７の対称位置に戻る。カバーガラス８の全反射を起こした下面部分付近にエバネッセント光Ｌ₂ が発生し、これらはカバーガラスの上面に向けて伝搬し標本の下面の領域に達する。標本には蛍光物質が含まれているため、エバネッセント光により蛍光が発生し蛍光によるエバネッセント光照射部分の像を観察することができる。

図３は、本発明によるＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡の他の実施の形態を示すブロック図である。
この実施の形態は、図１と第２のレンズ系の構成が異なり、他の部分は変わらない。図１と同じ機能部分には同じ符号を付してある。
凹レンズ２とＤＭＤ装置４の間に凸レンズ３を挿入するとともにダイクロイックミラー５とＤＭＤ装置４の間に集光用レンズ群２０を配置してある。凸レンズ３によって凹レンズ２からの発散光を平行光にしてＤＭＤ装置４に入射させ、ＤＭＤ装置４からの平行光を集光用レンズ群２０のリング部分のレンズ２０ａによって超高開口数対物レンズ７の後焦点面に集束させている。

ＤＭＤ装置４のマイクロミラーのオン制御範囲は、所定の径（臨界角相当）の外側の部分である。中心付近をオン制御すると落射照射になり、臨界角内の範囲ではスリット光照明になる。所定の径以上の範囲のマイクロミラーのオン制御によりエバネッセント光照明を行うことができ、他の照明方式に切り替えることも容易に実現できる。
集光用レンズ群２０からの光はダイクロイックミラー５によって反射され、後焦点面６を通って超高開口数対物レンズ７で屈折しカバーガラス８の下面に臨界角以上の角度で入射して全反射しエバネッセント光を発生させる。

図４は図３におけるＤＭＤのマイクロミラーをオン制御するパターン例を、図５は図３における集光用レンズ群の具体例を示す図である。
集光用レンズ群がトーリックレンズの場合、エバネッセント光照明するには図４（ａ）の４ａ₁ に示すリング状のマイクロミラーをオン制御する。また、マイクロレンズ群の場合、図４（ｂ）の４ａ₂ に示すリング状のマイクロレンズ相当のマイクロミラーをオン制御する。エバネッセント光照明からスリット光照明に切り替えるには、ＤＭＤのマイクロミラーをリング状のマイクロミラー４ａ₁ ，４ａ₂ から内側のリング部分のマイクロミラーをオン制御し、さらに落射照明に切り替えるには中心の円部分のマイクロミラーをオン制御する。
図５（ａ）の２０ａ₁ は図４（ａ）で示すオン制御されるＤＭＤに対応したトーリックレンズの例を、図５（ｂ）の２０ａ₂ は図４（ｂ）で示すオン制御されるＤＭＤに対応したマイクロレンズ群の例をそれぞれ示している。
このように臨界角以上を実現するリング状の照明は、リングの幅をＤＭＤ装置の対応するマイクロミラーをオン制御することによって変えることができ、エバネッセント光の発生領域の大きさを変えることができる。

以上の各実施の形態で示した凹レンズおよび凸レンズは、説明の便宜上、１枚の場合を示したが、複数枚のレンズによってそれぞれ発散，集束を行うようにしたレンズ群を構成することが可能である。
また、標本として細胞の例を説明したが、半透明体や液体などを対象としても良い。

細胞などの標本の特定部分を蛍光観察する顕微鏡などに適用される。

本発明によるＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡の実施の形態を示すブロック図である。エバネッセント光照明された標本の詳細を説明するための図である。本発明によるＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡の他の実施の形態を示すブロック図である。図３におけるＤＭＤのマイクロミラーをオン制御するパターン例を示す図である。図３における集光用レンズ群の具体例を示す図である。

符号の説明

１レーザ光源
２凹レンズ
３，１０凸レンズ
４ＤＭＤ装置
５ダイクロイックミラー（ＤＭ）
６後焦点面
７超高開口数対物レンズ
８カバーガラス
９標本（細胞）
１１ＣＣＤ装置（観察手段）
１２エバネッセント光

Claims

レーザ光源と、
前記レーザ光源からの光を発散する第１レンズ系と、
前記第１レンズ系で発散された光束を、対物レンズ系の後焦点面に集束させる第２レンズ系と、
前記第２レンズ系からの光が入射し、多数のマイクロミラーのオンオフ制御によって光を反射するＤＭＤ装置と、
前記ＤＭＤ装置からの反射光を入射して光路を変更するダイクロイックミラーと、
前記ダイクロイックミラーからの光を入射する前記対物レンズ系と、
前記対物レンズ系の前側に配置されたカバーガラスと、
前記カバーガラス上の標本からの光が、前記対物レンズ系および前記ダイクロイックミラーを通過し、該光を結像させる第３レンズ系と、
前記第３レンズ系で結像された前記標本の像を観察するための観察手段とを備え、
前記ＤＭＤ装置のマイクロミラーをリング形状でオン制御して前記カバーガラス下面に臨界角以上で入射させて全反射させ、前記カバーガラスに搭載された標本にエバネッセント光を発生させることを特徴とするＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡。
前記第２レンズ系は前記第１レンズ系と前記ＤＭＤ装置の間に凸レンズを配置して平行光にし、前記ＤＭＤ装置とダイクロイックミラーの間にさらに凸レンズを配置して前記対物レンズ系の後焦点面に集束させることを特徴とする請求項１記載のＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡。
レーザ光源と、
前記レーザ光源からの光を発散する第１レンズ系と、
前記第１レンズ系で発散された光束を平行光にする第２レンズ系と、
前記第２レンズ系からの光が入射し、多数のマイクロミラーのオンオフ制御によって光を反射するＤＭＤ装置と、
前記ＤＭＤ装置からの反射光を入射して光路を変更するダイクロイックミラーと、
前記ＤＭＤ装置と前記ダイクロイックミラーの間に配置され、光束を対物レンズ系の後焦点面に集束させる集光用レンズ群系と、
前記ダイクロイックミラーからの光を入射する対物レンズ系と、
前記対物レンズ系の前側に配置されたカバーガラスと、
前記カバーガラスに搭載された標本からの光が、前記対物レンズ系および前記ダイクロイックミラーを通過し、該光を結像させる第３レンズ系と、
前記第３レンズ系で結像された前記標本の像を観察するための観察手段とを備え、
前記ＤＭＤ装置のマイクロミラーをリング形状でオン制御し、かつ集光用レンズ群系で前記オン制御されたマイクロミラーからの光を集光することにより前記カバーガラス下面に臨界角以上で入射させて全反射させ、前記カバーガラスに搭載された標本にエバネッセント光を発生させることを特徴とするＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡。
前記集光用レンズ群系は、リング状に配置されたマイクロレンズ群で構成したことを特徴とする請求項３記載のＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡。
前記集光用レンズ群系は、トーリックレンズを用いたことを特徴とする請求項３記載のＤＬＰ式エバネッセンス顕微鏡。