JP2006239511A

JP2006239511A - カルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法及び生体分子固定用超分散ダイヤモンド

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Publication number: JP2006239511A
Application number: JP2005056386A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Kawarada; 洋川原田; Yasuki Murakami; 泰規村上; Yoshikazu Nakano; 善和中野; Tadamasa Fujimura; 忠正藤村; Shigeru Shiozaki; 茂塩崎
Original assignee: Fujimura Tadamasa
Current assignee: Fujimura Tadamasa
Priority date: 2005-03-01
Filing date: 2005-03-01
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2025-03-01
Also published as: JP4794183B2

Abstract

【課題】 DNA等を固定可能であって、良好な分散性を示す超分散ダイヤモンド及びその製造方法を提供する。
【解決手段】 (a) 一次粒径の平均が１〜50 nmのの超分散ダイヤモンドと強酸を反応させ、もって前記超分散ダイヤモンドを酸化させる工程と、(b) 酸化させた超分散ダイヤモンドに塩基性溶液を加えて中和する工程と、(c) 酸性溶液を加えて混合する工程とを有し、各工程の後で溶液から超分散ダイヤモンドを超遠心分離することを特徴とするカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、ドラッグデリバリーシステムに利用可能なカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法及び生体分子固定に用いられるカルボキシル基修飾した超分散ダイヤモンドに関する。

ドラッグデリバリーシステムを利用すると、薬物の体内輸送を制御できるので、標的組織以外の組織に薬物が作用することによる副作用の発現を抑制したり、適量の薬物を標的組織内に長く維持させることによって少ない薬量で治療を行ったりすることが可能となる。ドラッグデリバリーシステムの課題の一つに、生体分子及び／又は薬物の運搬体の選定が挙げられる。運搬体材料に対してはサイズ、生体適合性、生体分子及び／又は薬物の固定能等、多くの制約がある。

運搬体に好適なサイズを有し、かつ化学的に安定な微粒子として、超分散ダイヤモンドが知られている。超分散ダイヤモンドは生体適合性を有するので、生体分子及び／又は薬物を十分に担持させることができれば、運搬体として利用可能であると考えられる。

牛澤ら著、「ケミカルフィジクスレターズ」（351号、2002年１月４日、105〜108頁、非特許文献１）は、粒径１〜２μmのダイヤモンド粉末の表面を強酸で酸化することによってカルボキシル修飾し、これを酸塩化物にした後、DNAを固定する方法を記載している。ダイヤモンド粉末を強酸で処理することによって、ダイヤモンド粉末の表面にある生体不適合な官能基を除去できる上、導入されたカルボキシル基にはDNAが結合し得る。しかし、粒径１〜２μmのダイヤモンド粉末やそれにDNAを固定したものは沈降し易く、分散性が低いという問題がある。このためカルボキシル基修飾等の反応が進行し難く、十分な量のDNAを固定できない。また体液等の中でも分散状態になり難く、体内をスムーズに移動できないので、良好な運搬体であるとは言えない。

牛澤ら著、「ケミカルフィジクスレターズ」、351号、2002年１月４日、105〜108頁

従って本発明の目的は、DNA等を固定可能であって、良好な分散性を示す超分散ダイヤモンド及びその製造方法を提供することである。

上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者は、ナノサイズの粒径を有する高分散性のダイヤモンドの懸濁液を超遠心分離することによって、高分散性の微粒子を強酸によって酸化可能になり、カルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドを得られることを発見し、本発明に想到した。

すなわち、本発明のカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法は、(a) 一次粒径の平均が１〜50 nmの超分散ダイヤモンドと強酸を反応させ、もって前記超分散ダイヤモンドを酸化させる工程と、(b) 酸化させた超分散ダイヤモンドに塩基性溶液を加えて中和する工程と、(c) 酸性溶液で洗浄する工程とを有し、各工程の後で溶液から超分散ダイヤモンドを超遠心分離することを特徴とする。

前記超分散ダイヤモンドの懸濁液を超遠心分離することによって得られた前記超分散ダイヤモンドと強酸を反応させるのが好ましい。前記超遠心の回転数は、10000〜100000 rpmとするのが好ましい。

前記超分散ダイヤモンドは(a) 表面炭素原子に結合した官能基を有し、(b) 0.5 m³／kg以上の全吸収空間及び(c) 1.50×10⁵m²／kg以上の比表面積を有し、かつ(d) 前記超分散ダイヤモンドの２次粒子の95％以上は粒径30〜1000 nmであるのが好ましい。

本発明のカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドは、本発明の製造方法によって得られるもので、生体分子の固定に用いられることを特徴とする。

本発明の製造方法により、表面炭素をカルボキシル基によって修飾したナノサイズの超分散ダイヤモンドを得ることができる。カルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドは大きな表面電位を有し、優れた分散性を示す上、DNA等の生体分子を効率よく固定できる。カルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドにDNAを固定したものも、高分散性であるので、ドラッグデリバリーシステムに好適である。

(1) 原料
原料とする超分散ダイヤモンド（Ultra Dispersed Diamond、以下UDDと言う）は、ナノメートルオーダーの粒径を有するダイヤモンド微粒子の個体が最低限４個、通常数10個〜数100個程度凝集したものである。UDDの一次粒径の平均は１〜50 nmである。粒度分布測定装置（例えばHORIBA LA-550）を使用すると、UDDの（一次）凝集粒径を測定可能である。この方法によって求めたUDDのメジアン径（中央値）は概ね50〜120 nmである。

UDDの２次粒子の数平均粒径（φMn）は概ね150〜650 nmである。UDDのうち95％は30〜1000 nmの範囲に粒径を有するのが好ましく、粒径1000 nm以上のもの及び粒径30 nm以下のものを実質的に含んでいないのが好ましい。UDD２次粒子の粒径は、電気泳動光散乱光度計モデルELS-8000を用いた動的光散乱測定の結果によるものである。電気泳動光散乱法の測定範囲は1.4 nm〜５μmである。この範囲にある粒子は、液中で並進、回転、屈折等のブラウン運動を行っており、その位置、方位、形態を時云刻云生えている。電気泳動光散乱法は、この現象を利用し、媒体中を沈降する粒子の大きさと沈降速度の関係から粒径を測定するものである。具体的には、ブラウン運動をしている粒子にレーザ光を照射すると、粒子によって散乱した光は各粒子の粒径に対応したユラギを示す。光子検出法を用いてこのユラギを観測し、結果を光子相関法（ランダム変動の解析手法の一つ；理化学辞典）を用いて解析することによって、粒径を求めることができる。

UDDは、Cu、Kα線を線源とするＸ線回析スペクトル（XD）において、ブラッグ(Bragg)角（2θ±2°）43.9°に最も強いピークを有し、73.5°、95°に特徴的な強いピークを有するのが好ましい。またブラッグ角17°に強く偏在したハローがあり、26.5°にピークが実質的にないのが好ましい。

UDDは多数の欠陥及び空隙を有しており、1.50×10⁵m²／kg以上の比表面積を有するのが好ましい。またp／p_s＝0.995（ここで、pはN₂ガスにより充填された孔内部の表面積を表し、p_sはN₂ガスの単層を形成するための窒素ガス分圧を表す）において測定された吸収空間は、0.5 m³／kg以上であるのが好ましい。

UDDの元素組成比は炭素72〜89.5％、水素0.8〜1.5％、窒素1.5〜2.5％及び酸素10.5〜25.0％であるのが好ましい。UDD表面の炭素には、アルキル基、カルボキシル基、カルボニル基、水酸基、ニトロ基、アミノ基等、多くの官能基が結合している。このように表面に多くの官能基を有するUDDは優れた分散性を有しており、大きなpH変化が無ければ、数ヶ月保存してもほとんど沈降しない。

このような粒径及び凝集状態のUDDを得られる限り、原料の製造方法は特に限定されない。ダイヤモンドの合成法としては爆射法、フラックス法、高温高圧法等が知られているが、これらのうち好ましいのは爆射法である。爆射法は爆薬を爆発させる等によって動的な衝撃を加え、グラファイト構造の原料物質をダイヤモンド構造の粒子に直接変換し、顆粒状のダイヤモンドを得る方法である。爆射法によって粗ダイヤモンド（ブレンドダイヤモンド、以下はBDという）を作製し、これに適当な後処理をすることによって、狭い粒径分布で良好な分散状態のUDDを得ることができる。

爆射法によって得られるUDDは、3.20×10³kg／m³〜3.40×10³kg／m³の密度を有する。アモルファス炭素の密度は（1.8〜2.1）×10³kg／m³、グラファイト炭素の密度は2.26×10³kg／m³、天然ダイヤモンドの密度は3.51×10³kg／m³であり、静的な圧力印加法（非爆射法）による人工ダイヤモンドの密度は3.47〜3.50であるから、爆射法によって得られたUDDは天然ダイヤモンドや静的圧力法によるダイヤモンドより小さな密度を有するということができる。

次に、爆射法を例にとって、UDDの製造方法を具体的に説明するが、もちろん本発明の修飾UDDの原料はこの製造方法によって得られたものに限定されない。

(A) 爆射式初期BD製造工程
胴内に電気雷管を装着し、爆薬を収納した片面プラグ付き鋼鉄製パイプを、純チタン製の耐圧容器に入れた水と氷の中に水平に沈める。爆薬の例として、シクロトリメチレントリニトロアミン、シクロテトラメチレンテトラニトラミン、トリニトロトルエン、トリニトロフェニルメチルニトロアミン、四硝酸ペンタエリトリット、テトラニトロメタン及びこれらの混合物が挙げられる。具体的には、TNT(トリニトロトルエン)／HMＸ(シクロテトラメチレンテトラニトラミン)＝50／50を使用することができる。鋼鉄製パイプに鋼鉄製のヘルメットを被せて爆薬を爆裂させると、容器中の水及び氷中に初期BDが生成する。

(B) BDの酸化性分解処理工程
55〜56重量％の濃HNO₃に分散させたBDをオートクレーブに入れ、加圧及び加熱する。14気圧、150〜180℃程度で10〜30分間、加圧・加熱することによって、BDを酸化性分解することができる。この工程により、炭素系夾雑物、無機夾雑物等を分解できる。

(C) １次酸化性エッチング処理工程
酸化性分解処理したBDの分散物を加圧・加熱する。18気圧、200〜240℃程度に加圧及び加熱するのが好ましい。１次酸化性エッチング処理段階では、主にBD表面を被覆する硬質炭素を除去する。

(D) ２次酸化性エッチング処理工程
２次酸化性エッチング処理は、主にBD凝集体を構成するUDD間のイオン透過性界面ギャップ及びUDD表面の結晶欠陥部に除去し難い状態で存在する極く少量の硬質炭素を除去するための工程である。したがって、加圧及び加熱の条件は１次酸化性エッチング処理より厳しくする必要がある。好ましい処理条件は、25気圧、230〜250℃程度である。２次酸化性エッチング処理を施した被処理液のpHは、通常2.0〜6.95である。

酸化性分解処理工程、１次酸化性エッチング処理工程及び２次酸化性エッチング処理工程の圧力及び温度を上述の範囲とすることは、必ず順守すべき条件というわけではない。しかし除去し難い成分を十分に取り除くためには、圧力及び温度を、工程順に大きくするのが好ましい。

(E) 中和工程
２次酸化性エッチング処理したBDを含む硝酸水溶液に、それ自身揮発性の又はその分解反応生成物が揮発性の塩基性材料を添加する。添加により、溶液のpHは２〜6.95から7.05〜12に上昇する。塩基性材料の例としてヒドラジン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジプロピルアミン、アリルアミン、アニリン、N,N-ジメチルアニリン、ジイソプロピルアミン、ジエチレントリアミンやテトラエチレンペンタミンのようなポリアルキレンポリアミン、2-エチルヘキシルアミン、シクロヘキシルアミン、ピペリジン、ホルムアミド、N,N-メチルホルムアミド、尿素を挙げることができる。

例えば塩基性材料としてアンモニアを用いる場合、酸と下記式のように反応してガスを生じる。
HNO₃＋ NH₃ → NH₄NO₃→ N₂O ＋２H₂O
N₂O → N₂ ＋ (O)
３HNO₃＋ NH₃ →NH₄NO₂＋ N₂O₃ ＋ H₂O ＋ O₂ ＋ (O)
NH₄NO₂→ N₂ ＋２H₂O
N₂O₃＋ NH₃ → ２N₂ ＋３H₂O
N₂O₃→ N_２＋ O_２＋ (O)
NH₄NO₂＋２NH₃ →２N₂ ＋ H₂O ＋３H₂
H₂ ＋ (O)→ H₂O
HCl ＋ NaOH → Na^＋＋ Cl⁻ ＋ H₂O
HCl ＋ NH₃ → NH₄ ^＋＋ Cl⁻
NH₄ ^＋ →NH₃ ＋ H^＋
H₂SO₄＋２NH₃→N₂O ＋ SO₂ ＋ NO₂
発生したN₂、O₂、N₂O、H₂O、H₂、SO₂ガスは系外に放出できるので、残存物による系に対する影響はほとんどなくなる。アンモニアの添加量は硝酸の１〜1.5当量とするのが好ましく、1.25当量とするのがより好ましい。

中和工程においては、硝酸水性懸濁液中のBD内に残存する硝酸まで、アニオンより一般的にイオン半径が小さいカチオンが浸透して攻撃することにより、各反応部位で反応相手との間で小爆発を伴う激しい中和反応、分解反応、不純物脱離溶解反応、ガス生成反応、表面官能基生成反応を生起し、ガスが発生し系の昇圧昇温も生じ得るものと考えられる。その結果、BD凝集体が個々のUDDに解体される。このような小爆発を伴う中和工程により、UDDの比表面積及び孔部吸着空間が大きくなると思われる。

(F) デカンテーション工程
UDDを含有する懸濁液に水を加え、充分にデカンテーションする。デカンテーション操作は、３回以上行うのが好ましい。

(G) 洗浄工程
デカンテーションを施したUDD懸濁液に硝酸を加え、撹拌する。攪拌にはメカニカルマグネチックスターラー等を使用できる。洗浄後、静置して上層排液と下層懸濁液に分ける。UDDは下層懸濁液に含まれているので、上層排液を除去する。例えばUDD含有液１kgに対して硝酸水溶液50 kg加えた場合、上層排液と下層懸濁液とは明瞭に層分離しないが、UDDを含む下層懸濁液の容量は、上層排液の容量のほぼ１／４程度である。上層排液中にはダイヤモンド形の1.2〜2.0 nm径程度の超々微粒子が存在し得るが、この超々微粒子を回収するのは不可欠ではない。なぜなら、この超々微粒子は液層中の不純部を巻き込んで凝集し易く、機械的圧力では分解不能な不良UDDを生成し易いので、回収しても良好な分散性を示すUDDを得難いからである。

(H) 遠心分離工程
超高速遠心分離機を用いてUDD懸濁液を遠心脱水分離する。回転速度は10000〜30000 RPMとするのが好ましく、20000 RPM程度とするのがより好ましい。

(I) UDD懸濁水性液の調製工程
遠心分離により得られた脱水物に水を加え、UDD懸濁水性液を調製する。懸濁水性液のUDD濃度は0.05〜16％とするのが好ましく、0.1〜12％とするのがより好ましく、１〜10％とするのが特に好ましい。濃度が16％を超えていると、懸濁水性液の保存安定性に支障をきたすことが多い。濃度が0.05％未満であると、後述する表面修飾工程において濃縮を要する場合が多い。懸濁水性液のpHを4.0〜10.0に調節するのが好ましく、pH 5.0〜8.0とするのがより好ましく、pH 6.0〜7.5にするのが特に好ましい。懸濁水性液中に分散しているUDD粒子の平均粒径（１次粒子）は、概ね２nm〜50 nm（数平均で80％以上、重量平均で70％以上）であり、狭分散形である。

(J) UDD微粉末の作製工程
遠心分離工程後の脱水物を乾燥させると、UDD微粉末を得ることができる。UDD微粉末の粒径分布範囲は極めて狭く、２次粒子の平均粒径は数平均で150〜650 nm、典型的には300〜500 nmである。

(2) カルボキシル基修飾
(A) 前処理
UDD懸濁水性液は0.01〜７重量％程度のものが市販されている。カルボキシル基修飾UDDの作製には、1.5〜４重量％のものを用いるのが好ましい。超遠心分離によって、UDD懸濁水性液からUDDを分離することができる。超遠心分離はUDDが十分に沈殿するまで行えばよい。具体的には10000〜100000 rpmで５〜40分間程度超遠心にかけると、UDDを分離できる。超遠心処理の回転数は20000〜50000 rpmとするのがより好ましい。UDD微粉末は、そのまま使用可能である。

(B) 酸化
デカンテーションによって溶媒を除去したUDDに強酸を加え、UDDを強酸に分散させる。強酸としては濃硫酸、濃硝酸及びこれらの混合物が好ましく、濃硫酸と濃硝酸からなる混酸がより好ましい。濃硫酸：濃硝酸の混合比は特に限定されないが、６：４〜９：１とするのが好ましい。強酸の添加量は、UDDが十分に浸漬するように設定すれば良い。UDDを強酸に分散させて十分に反応を進行させるために、超音波を照射する。超音波の周波数は10〜100 kHzが好ましく、20〜50 kHzがより好ましい。照射時間は20〜60分程度とするのが好ましい。

UDDの分散物を加熱し、強酸との反応を進行させる。例えば50〜150℃に加熱し、12〜48時間程度、攪拌しながら加熱することによって、UDDと強酸が十分に反応する。酸化処理前のUDDは表面にニトロ基等の置換基を有しているが、強酸と反応させることによってこれらの置換基を除去できる。またUDDの表面にあるsp²炭素を酸化し、カルボキシル基を導入することができる。UDDの分散物を攪拌しながら加熱するには、サーモミキサーを使用するのが好ましい。例えばUDD分散物をサーモミキサーのチューブに入れ、90℃で24時間、1000 rpmで振動させると、カルボキシル基を有するUDDを得ることができる。

反応させた後、超遠心にかけ、分離したカルボキシル基修飾したUDDと強酸を分離する。10000〜100000 rpmで５〜30分間程度超遠心にかけると、カルボキシル基修飾UDDを分離できる。超遠心処理の回転数は20000〜50000 rpmとするのがより好ましい。

(C) 中和処理
カルボキシル基修飾UDDにアルカリ性溶液を加えて中和する。アルカリ性溶液としては水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液が好ましい。水酸化ナトリウム水溶液を使用する場合、濃度は0.01〜0.5 moL／Lにするのが好ましい。

カルボキシル基修飾UDDにアルカリ性溶液を加えたものに超音波を照射するのが好ましい。超音波照射によって、UDDをアルカリ性溶液中に凝集が少ない状態で分散させることができる。反応後、超遠心にかけ、分離したカルボキシル基修飾したUDDとアルカリ性溶液を分離させる。20000〜60000 rpmで５〜30分間程度超遠心にかけると、カルボキシル基修飾UDDとアルカリ性溶液が分離する。

(D) 弱酸処理
カルボキシル基修飾UDDを弱酸溶液で洗浄する。弱酸溶液によって、中和処理後に残留しているナトリウム等の金属イオンを除去することができる。弱酸溶液の例として、0.01〜0.5 moL／Lの塩酸が挙げられる。中和処理工程と同様に、弱酸溶液を加えたものに超音波照射してカルボキシル基修飾UDDを分散させた後、超遠心分離をして弱酸溶液を除去する。

(E) 洗浄
(a) 水を加えて超音波照射してカルボキシル基修飾UDDを分散させ、(b) 10000〜100000 rpmで５〜30分間程度超遠心にかけ、(c) 分離した水を除去する操作を繰り返し行い、カルボキシル基修飾UDDを洗浄する。(a) 〜(c) の水洗浄操作を２〜６回程度繰り返すことによって、残留した酸等を十分に除去することができる。洗浄後のカルボキシル基修飾UDDは減圧乾燥する。

(3) DNA固定
カルボキシル基修飾UDDにDNA等の生体分子を固定する方法は特に限定されず、一般的な方法に拠ることができる。図１を参照して、DNA固定方法の一例を説明する。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（以下、EDCと言う）及びN-ヒドロキシスクシンイミド（以下、NHSと言う）をこの順にカルボキシル基修飾UDDに作用させ（図１(1)〜(3)）、カルボキシル基とNHSとを縮合させる。EDC溶液及びNHS溶液の濃度は10〜50 mMとするのが好ましく、20〜30 mMとするのがより好ましい。カルボキシル基及びNHSを含む溶液を10〜20時間程度攪拌すると、縮合反応を十分に進行させることができる（図１(4)）。

NHS縮合体に、DNAを加え、35〜40℃程度の温度で１〜５時間攪拌すると、NHSが脱離し、DNAのアミノ基末端がカルボニル基に結合する（図１(5) ）。DNAはポリマーであっても良いし、オリゴマーであっても良い。DNAにCy5蛍光標識しておくと、DNA固定したカルボキシル基修飾UDDを蛍光顕微鏡によって観察することができる。

本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。

実施例１
(1) 強酸処理
UDD溶液（ビジョン開発株式会社製、UDDのメジアン径:150 nm、1.5重量％）１mLを超遠心にかけた。40000 rpmで20分間超遠心処理したところ、溶媒とUDDとが分離し、沈殿した。分離した溶媒を除去した後、濃硫酸と濃硝酸の９：１混合物を１mL加え、超音波（30分間、42 kHz）を照射した。得られたUDD分散物をサーモミキサーのチューブに入れ替え、90℃で24時間、1000 rpmで振動させた。加温処理したUDD分散物を超遠心用のチューブに移し、超遠心（40000 rpm、20分間）にかけ、分離した強酸を除去した。

(2) アルカリ処理
(1) で得られたカルボキシル基修飾UDDに0.1 MのNaOH水溶液を加え、超音波（30分間、42 kHz）を照射し、カルボキシル基修飾UDDを分散させた。カルボキシル基修飾UDDの分散物をサーモミキサーのチューブに移し、90℃で２時間、1000 rpmで振動させた。加温処理後、分散物を超遠心用のチューブに移し、超遠心（40000 rpm、20分間）にかけた。NaOH水溶液とカルボキシル基修飾UDDが分離したので、NaOH水溶液を除去した。

(3) 弱酸処理
アルカリ処理後の酸化UDDに0.1 MのHCl水溶液を加え、超音波（30分間、42 kHz）を照射した。得られた分散物をサーモミキサーのチューブに移し、90℃で２時間、1000 rpmで振動させた後、超遠心（40000 rpm、20分間）にかけた。HCl水溶液とカルボキシル基修飾UDDが分離したので、HCl水溶液を除去した。

(4) 洗浄
(i) カルボキシル基修飾UDDに超純水を加えたものに超音波照射し（30分間、42 kHz）、(ii) 得られた分散物を超遠心（40000 rpm、20分間）にかけ、(iii) 分離した水を除去した。(i)〜(iii)の操作を３回繰り返し、カルボキシル基修飾UDDを洗浄した。

(5) 測定
カルボキシル基修飾UDDのIR測定を行ったところ、図２に示すように、3500 cm^-1付近にO-H結合に由来すると考えられるピークが現れ、1700 cm^-1付近にCO二重結合に由来すると考えられるピークが現れていた。IR測定の結果、UDDにカルボキシル基修飾反応が起こったことが分かった。また金基板にカルボキシル基修飾UDDを滴下して表面電位を測定したところ、16 mVであった。

実施例２
(1) DNA固定
濃度25 mMのEDC溶液を加えてカルボキシル基修飾UDDを活性化処理した後、濃度25 mMのNHS溶液を加えて16時間混合した。これに、Cy5蛍光標識化した一本鎖DNA（21 mer）を加えて38℃で２時間攪拌したところ、Cy5標識DNAを担持したカルボキシル基修飾UDDが得られた。得られたDNA固定体は、超純水で洗浄し、乾燥した。

(2) 測定
DNA固定体を含む溶液をスライドガラス上に滴下し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。蛍光顕微鏡写真を図３(a) に示す。またDNA固定体を含む溶液を金基板に滴下し、表面電位顕微鏡（KFM顕微鏡）を用いて観察し、表面電位を測定した。得られた電位像を図４(a) に示し、表面電位を表１に併せて示す。

比較例１
実施例１の原料として用いたUDD溶液（ビジョン開発株式会社製、UDDのメジアン径:150 nm、1.5重量％）を超遠心分離し、IR及び表面電位を測定した。結果を図２及び表１に併せて示す。実施例１(5) と同様にEDC及びNHSによってUDDを活性化し、これにDNAを３(b) 及び４(b) にそれぞれ示す。

蛍光顕微鏡写真及びKFM顕微鏡写真において、カルボキシル基修飾を施していない方（比較例１）が、白い点を明確に観察できた。これは粒子間の凝集が強く起こっているためであると考えられる。したがって、カルボキシル基修飾を施していないものと比較して、カルボキシル基修飾UDDは優れた分散性を示すことが確認できた。

カルボキシル基修飾UDDにDNAを固定する方法を示すフロー図である。実施例１のカルボキシル基修飾UDD及び比較例１の原料UDDのIR測定結果を示すグラフである。 (a) は実施例２のDNA固定したカルボキシル基修飾UDDの蛍光顕微鏡写真であり、(b) は比較例１のDNA固定したUDDの蛍光顕微鏡写真である。 (a) は実施例２のDNA固定したカルボキシル基修飾UDDの表面電位顕微鏡写真であり、(b) は比較例１のDNA固定したUDDの表面電位顕微鏡写真である。

Claims

(a) 一次粒径の平均が１〜50 nmの超分散ダイヤモンドと強酸を反応させ、もって前記超分散ダイヤモンドを酸化させる工程と、(b) 酸化させた超分散ダイヤモンドに塩基性溶液を加えて中和する工程と、(c) 酸性溶液を加えて混合する工程とを有し、各工程の後で溶液から超分散ダイヤモンドを超遠心分離することを特徴とするカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法。
請求項１に記載のカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法において、前記超分散ダイヤモンドの懸濁液を超遠心分離することによって得られた前記超分散ダイヤモンドと強酸を反応させることを特徴とする方法。
請求項１又は２に記載のカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法において、前記超遠心の回転数を10000〜100000 rpmとすることを特徴とする方法。
請求項１〜３に記載のカルボキシル基修飾超分散ダイヤモンドの製造方法において、前記超分散ダイヤモンドが(a) 表面炭素原子に結合した官能基を有し、(b) 0.5 m³／kg以上の全吸収空間及び(c) 1.50×10⁵m²／kg以上の比表面積を有し、かつ(d) 前記超分散ダイヤモンドの２次粒子の95％以上は粒径30〜1000 nmであることを特徴とする方法。
請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法により得られ、生体分子の固定に用いられるカルボキシル基修飾した超分散ダイヤモンド。