JP2006193527A - インフルエンザワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ノイラミニダーゼ発現ベクターベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し(ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している);該発現産物ノイラミニダーゼを培養培地から単離することによって得られる組換えノイラミニダーゼならびに該組換えノイラミニダーゼを適用したワクチンおよびその製造方法ならびに精製方法を提供する。
【選択図】なし
Description
インフルエンザウイルスは、その2つの表面抗原、すなわち血球凝集素ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)において有意な抗原変異(いわゆる「抗原ドリフト」)を起こすため、咽喉管に生存するウイルスのなかでもユニークである。
その上、特にインフルエンザA型ウイルスは、「抗原シフト」という現象によって効果のある免疫を回避することができる。ヒトのウイルスにおいてこのような現象が出現するのは、インフルエンザ遺伝子の動物保菌者由来のNA遺伝子に起因するものである。かくして、1957年に、それまで流行していたNA1型のウイルスは新しいNA2型のウイルスと置き換えられた。1977年以来、NA1型のウイルスがヒト集団に再び戻って来ている。したがって、本発明ワクチンは好ましくはNA1およびNA2型ウイルスの両方に対応しうるものを目指さねばならない。
NAはグリコシル基の末端シアル酸残基の除去に触媒作用を及ぼし、それによってHAの可能な受容体が破壊される(ゴッチャルク,1957;バーネットおよびストーン,1947)。ウイルスの集合の阻止および細胞間におけるウイルスの充分な拡散においてNAが本質的に関与していると考えられる(コールマンおよびワード,1985)。
それぞれのNA分子(Mr=240,000)は、ジスルフィド架橋に結合し、非共有結合によって共に交互に保持しあう2組のダイマーで築き上げられた4個の同一のポリペプチド鎖からなるキノコ様構造をしている(ブッチャーおよびキルボーン,1972;レイバーおよびバレンタイン,1969;バルゲーゼら,1983;ワードら,1983)。HAとは異なって、NAは、非スプライス、NA末端、親油性配列、いわゆる膜アンカーによって脂質膜につながれている(フィールズら,1983;ブロックら,1982)。構造全体のうち最も大きな部分が膜の上に突き出ており、そこで伸長した「柄」領域の頂部に位置する末端・箱形状の「頭部」領域を形成する(リグレイら,1973)。該頭部の内側に、各モノマーはそれ自身の触媒部位をもち、少なくとも4個のNA結合グリコシル基が含まれる(コールマンら,1983;ワードら,1982)。O−グリコシル化の存在は、現在のところまだ説明されていない。
外部に局在しているために、HAおよびNA抗原は、宿主の免疫系にとって最も重要なウイルス標的構造となっている。HAに特異的に結合する抗体はウイルスの感染性を中和すると考えられ、それはおそらく早期段階の感染を遮断することによるものであろう(ハースト,1942;キダら,1983)。NA特異的抗体は通常、標的細胞の初期感染を阻止するのではなく(ジャヒエルおよびキルボーン,1966;キルボーンら,1968;ヨハンセンら,1988)、ウイルスの拡散を阻止する。さらに、競合メカニズムにより、より頻繁に発生するHA抗原のために、NAに対する免疫応答が部分的に抑制されるように思われる(ヨハンセンら,1987;キルボーン,1976)。実際のところ、NA免疫の効果は、ほとんどが中和性のHA抗体によって覆い隠されている。このために、ワクチン設計者たちの注意は、長い期間にわたってもっぱらHAに焦点を向けられている。
しかし、多くの実験的観察結果から、インフルエンザに対する防御免疫の構築において、NAが実際に重要なパートを演じることが可能であることが示されている(シュルマンら,1968;ヨハンセンおよびキルボーン,1990;ヨハンセンら,1993)。NAの免疫原能力に向けた基礎的な研究には、十分な量の非常に純粋な抗原を、正確な三次元コンホメーションで利用できることが必要である。現在のところ、NAはウイルスのエンベロープを界面活性剤で処理すること(ギャラガーら,1984;キルボーンら,1968)またはプロナーゼを用いることが多いが、タンパク質頭部のタンパク質分解切断(セトら,1966;ロットら,1974)によって製造され、次いで精製されている。ある程度までは利用可能であるけれども、これらの方法には収率および純度に関して無視できない限界がある。
a)ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し(ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している);次いで
b)培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することによって得ることができる。
培養培地に分泌される本発明の組換えノイラミニダーゼは、たとえば基礎的研究に用いることができ、そこでは、ワクチン中でのNAの役割を決定するために、NAの単独のワクチン接種が行われる。しかし実際問題として、ワクチンによる防御の度合(感染に対して効果的に防御される接種集団のパーセンテージ)および防御の持続性(後期流行性株に対する防御)を増強するために、組換えNAをHAと組み合わせて使用することはまだないであろう。
組換えインフルエンザノイラミニダーゼの産生に用いる宿主細胞は、昆虫などの下等真核生物由来のもの、たとえば昆虫細胞系sf9が好ましいが、サッカロミセスまたはピチアなどの酵母細胞も使用しうる。
組換えインフルエンザNA2ノイラミニダーゼの発現、精製および特性付け
材料および方法
1.分泌されるノイラミニダーゼをコードする遺伝子の構築およびそのバキュロウイルス発現系への組込み
a.プラスミド プラスミドpV6/21は、1コピーのA/ビクトリア/3/75(H3N2)インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子を含むpBR322の誘導体である(ヴァン・ロムプイら,1982)。pSV51およびpSV23mとpSV24mの両方は、それぞれ後期および初期SV40置換ベクターであり、他の文献に記載されている(ヒュイルブレックら,1988)。pSRS−8は、A/ビクトリア/3/75(H3N2)の血球凝集素(HA)遺伝子の出発配列を含むpPLa2311に基づくプラスミドである(ヒュイルブレックら,1988)。バキュロウイルストランスファーベクターpVL941が、ラッコウおよびサマーズによって設計された(1989)。
pATIVNAsの1368bp−XbaI/SalIフラグメントを、pSV51の5562bp−SalI/EcoRIフラグメントおよびpSV24mの624bp−EcoRI/XbaIフラグメントに連結した。NAs遺伝子を含む1647bp−BamHIフラグメントの1コピーおよびSV40ポリ(A)部位を、ポリヘドリンプロモーターに対する正確な方向を考慮しながらpVL941の非反復制限部位へ続いて挿入し、pAc2IVNAsを得た。この構築物はSf9細胞の同時トランスフェクション後の野生型AcNPVのDNAとの相同的組換えを可能にする。組換えウイルスの子孫は、サマーズおよびスミス(1987)に記載されている連続的プラーク精製操作によって単離した。
ルーチン培養のために、昆虫細胞Sf9を、10%ウシ胎児血清および50μg/mlのゲンタマイシンを含むTC100培地中で集密的細胞単層として維持した。組換えバキュロウイルスに感染させるために、850cm2の回転ビン内に培養物を移し、25rpmで回転して懸濁液200ml中で成長させた。次いで、対数増殖期の終わりに、懸濁細胞(2x106細胞/ml)を組換えバキュロウイルスに1.0モイ(moi:感染多重度)で感染させた。2時間後、感染細胞を新鮮な血清フリーのTC100培地に移し、懸濁液をさらに48時間インキュベートした。下記のとおり、NAsを培地から精製した。
A/ビクトリア/3/75の天然のNAの製造源として、インフルエンザ株X−47をプロナーゼで処理した後に用いた。X−47ウイルスは、11日齢の胚の入ったニワトリの卵の卵黄嚢空隙中で培養した。25.5℃で2日間インキュベートした後、卵を4℃で一夜冷却し、次の処理に用いるため卵黄嚢液を採集した。
通例、次の緩衝液を用いた:緩衝液A:20mM ジエタノールアミン/HCl,pH8.5;
緩衝液B:50mM NaAc,pH5.5;
緩衝液C:10mM NaP,pH7.4,150mMNaCl;
緩衝液Aおよび緩衝液Cは、さらに4%ブタノール(他に特別に指示がない限り)および2mM CaCl2を含む。
a.硫酸アンモニウム分画
植え付け(上記参照)後、Sf9懸濁培養物(通例、約1リットル)を採集し、4000xgで15分間遠心分離を行って細胞レムナントを沈降させた。すべての処理は4℃で行った。最初の精製段階においては、溶液に5mM NAN3を加える。透明になった粗培地をpH7.5にて硫酸アンモニウム分画に付した。20%から60%の(NH4)2SO4で沈殿した物質を遠心分離(10000xg,60分)によって集め、緩衝液A(ブタノールなし)+20mM NaClに、出発体積の1/10の量にて溶解した。再溶解した沈殿物を同緩衝液50体積に対して24時間透析(mwco「モレキュラー・ウエイト・カット−オフ」)した。ここでは、緩衝液を3回連続的に交換した。20000xgで15分間遠心分離して不溶成分を除去した。
透析した溶液に先ず4%ブタノールを加え、続いて緩衝液A+20mM NaClを流速25ml/時間で通して平衡化したセファロースQ−カラム(2.5cmx10cm)に流した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、洗浄緩衝液から250mMまでのNaClの直線濃度勾配で溶離を行った(250ml,25ml/時間)。NAsを含む各2.5mlのフラクションを酵素活性およびELISAレベルを測定することによって同定した。NA活性は単一ピークとしてカラムから溶出した。
(非組換え)インフルエンザNAおよびバクテリアNA酵素の精製のためのこのアフィニティーマトリックスの使用が文献に記載されている(カトルカサスおよびイリアーノ,1971;ブッチャー,1977)。アフィニティーマトリックスの正確な分画は、初めに推奨された緩衝液条件を適用した場合にのみ達成された。セファロースQによる分離後に活性画分を集め、等量の200mM NaAc,pH5.5を加えた。続いて、該活性画分を、緩衝液Bと100mM NaClで平衡化したN−(p−アミノフェニル)オキサム酸アガロースカラム(1.5x5cm)に通した。続いて、平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、緩衝液Bで脱塩した。次いで、緩衝液Aで第2の洗浄段階を行った。最後に、1M NaClを加えた緩衝液Aを用い、流速10ml/時間でNAsを溶出した(2mlの画分を集めた)。
Centriprep(登録商標)濃縮機(アミコン;mwco:30kd)を用いてアフィニティーカラムの溶出物を2.0mlに濃縮した。次いで、濃縮物を体積1.0mlのサンプル画分にて、緩衝液Cおよび4%ブタノールで平衡化したスーパーデックス200ゲル濾過カラム(1.5cmx60cm)を用いるクロマトグラフィーに付した。流速10ml/時間にてカラムを平衡化緩衝液で溶離し、1.0mlの画分を集めた。長期貯蔵するために、−20℃で関連画分を集め、前述のように濃縮し、続いて最終濃度が50%になるまでグリセロールを加えた。
a.プロナーゼ処理
X−47に感染した鶏卵の卵黄嚢液をまず低速(1000xg,10分)で遠心分離して透明化し、次いで13000xgで16時間遠心分離してウイルスを沈降させた。ウイルス沈降物を100感染卵等価物当たり10mlの緩衝液Cに再懸濁し、ウイルスをこれ以上精製をすることなく、2mg/mlまでのプロナーゼを加えた。軽く振とうしながら、混合物を20℃で16時間インキュベートした。続いて、残りのウイルスコアおよび不溶のプロナーゼ成分を4℃にて超遠心分離(100000xg,1時間)によって除去した。次いで、放出されたNA頭部を含上清をカラムクロマトグラフィーにて精製した。
クロマトグラフィー操作は、4℃にて行った。粗pNAサンプルを5倍に希釈し、50mM NaAC,pH5.5、2mM CaCl2および1%ブタノールを加えた。次いで、溶液を緩衝液B+1%ブタノールおよび50mM NaClで平衡化したセファロースSカラム(1.5cmx10cm)に流す。同じ緩衝液から500mM NaClまで直線勾配を用いて結合した物質を溶離した。ピークの酵素活性を示す画分を集め、Centriprep(登録商標)濃縮機(アミコン;mwco:30kd)を用いて2.0mlに濃縮した。
NAsの場合と同様にしてスーパーデックス200ゲル濾過を行った(ブタノール濃度が1%である以外)。純pNAを50%グリセロール中に−20℃で貯蔵した。
ポティアら(1979)の方法に基づいて、NAの触媒活性のアッセイを行った。簡単に述べると、100μlの反応体積にて、基質として1mMの2'−(4−メチルウンベリフェリル)−α−D−N−アセチルノイラミン酸の存在下、−200mM NaAC,pH6.5、2mM CaCl2および1%ブタノールを用いて酵素試験を行った。37℃で30〜60分間インキュベートした後、0.5mlの133mMグリシン、83mMのNaHCO3、60mM NaCl,pH10.7を加えて反応を停止した。365nmの吸光度を測定することによって、遊離の4−メチルウンベリフェロンを測定した。1ユニットは、1分間に1モルの4−メチルウンベリフェロンを放出する酵素量として定義した。
a.ポリクローナル抗pNAIgGの製造
精製pNAに対するポリクローナル抗血清をニュージーランド系の3カ月齢のウサギで作製した。一次免疫感作は、それぞれ投与量当たり50μgのpNAと75%のフロイントアジュバントを含む500μlを四肢に筋肉内投与して行った。6週間後、動物は2つの対応する二次免疫注射を後肢に受けた。IgG画分を製造するために、タンパク質Aセファロース(ファルマシアLKB)に吸着させることによって集めた血清を精製した。
マイクロタイタープレートにウサギの抗pNAIgGを塗布した。試験するサンプルを0.1%ウシ血清アルブミンを含むPBSで希釈した。ウサギのビオチン化抗pNAIgG、次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体(ベーリンガー)を用いて結合した抗原を検出した。該プレートをp−ニトロフェニルホスフェート(シグマ・ケミカル・コーポレイション)とともにインキュベートして酵素反応を促進した。マイクロタイタープレートリーダーで405nmにおける吸光度を測定した。
レムリ法(1970)に従い、10%分離ゲル上でSDS/PAGEを行った(他に特記したもの以外は)。他に特記したもの以外は、β−メルカプトエタノールの存在下に全サンプルを変性した。10%ゲル中で、マーカータンパク質として、ホスホリラーゼb(94kd)、ウシ血清アルブミン(67kd)、卵白アルブミン(43kd)、炭酸脱水素酵素(29kd)およびトリプシンインヒビター(20.1kd、常に可視ではない)(ファルマシア)を用いた。勾配ゲルに次の質量標準を展開した:ミオシン(22kd)、β−ガラクトシダーゼ(116kd)、ホスホリラーゼb、ウシ血清アルブミンおよび卵白アルブミン(バイオラド)。モリシー(1981)に記載の方法の変更法によってゲル上で銀着色を行った。ブラッドフォード(1976)の方法により、ニワトリの卵白アルブミンを標準としてタンパク質濃度を定量した。
10mM Hepes中の1.0M溶液(pH7)として、架橋分子BS3を新たに調製した。濃度0.5mMのBS3を、反応量30μlにて加え、タンパク質を架橋した。室温にて1時間インキュベートした。続いて、5μlの1.0Mトリス(pH8.0)を加えて反応を停止した。ポリペプチドのパターンをSDS/PAGEで分析した。
タンパク質サンプル(0.1μg〜1μg)を500mMトリス/HCl(pH8.0)、5%SDS、50mMβ−メルカプトエタノール中で煮沸して変性した。最終SDS濃度の少なくとも7倍過剰となるように2.5%のNA−オクチルグルコシドを加えた後、NA−グリカナーゼを加え(約0.5ユニット;製造者によるユニット)、反応混合物を37℃で16時間インキュベートした。消化パターンをSDS/PAGEで分析した。
1.pNAの精製
ここに記載した実験においては、合計186個の感染卵を処理した。異なる精製段階とその結果を表1にまとめた。卵黄嚢液およびウイルスの沈積物を収穫し、プロナーゼを濃度2mg/mlで加え、混合物を20℃で16時間インキュベートした。超遠心分離後、上清におよそ60%のNA活性が見られた。この条件下では、活性の損失の主たる原因は、ウイルス粒子のNA頭部の除去が不完全なことであることがわかった。プロナーゼ濃度を高くすること、インキュベーション時間を長くすること、またはインキュベーション温度を上げることは、NAが徐々に失活するのが促進されるため、これらによって収量が増加することはなかった(データは示さず)。続いて、粗pNA物質を希釈し、pH5.5にした。次いで、セファロースS−カチオン交換を行った。pNAを最大収量で得るために、すべての溶液に1%ブタノールを加えた。ほとんどのタンパク質は、セファロースSカラムにしっかりとは固定されず、勾配溶離において、NaClが400mMの時点において、ひとつのピークが記録されただけであった(示さず)。SDS/PAGEにおいてコンタミネーションバンドが観察されなかったので、この物質は、実質的に純粋なNAであった(図3A、レーン3)。さらに、銀着色では、セファロースSプールとセファデックス200ゲル濾過工程の間に少しも差異がなかった(図3A、レーン3と4を比較せよ)。最後のカラムでは、画分60において分子量210kdに対応する単一の鈴形状のピークが得られた(示さず)。連続精製工程を図3Aに示す。
インフルエンザNA2株「A/ビクトリア/3/75」のNA遺伝子を、そのNA末端膜アンカーから分離し、代わりにシグナルペプチドスプライシング部位を含むA/ビクトリア/3/75HA遺伝子の5'配列に結合した。これによって、分泌可能で可溶性産物の合成が可能になった。得られるキメラ遺伝子は、成熟HAの最初の4個の末端アミノ酸のコドンを含むHAシグナル配列、すぐに続いて膜通過部分(アンカー)および柄領域の一部(アミノ酸1〜45)を欠損したNA配列からなる。両方のDNA配列は、同じ読み取り枠内にあり、余分のアミノ酸は導入されなかった。連結の結果として、成熟HAタンパク質の5位に対応するただひとつのアミノ酸置換が行われた(図2)。pVL941を移入ベクターとして用いて、このキメラ配列の1個のコピーをAcNPVバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターの後に組み込んだ。Sf9昆虫細胞の植え付け後、可溶性タンパク質が実際に産生されたことを示すNA活性を培地中で迅速に検出した。感染後およそ48時間で培地中のNAs活性がプラトーレベルに達したことを図4に見ることができる。さらにインキュベーションを行うと、おそらく細胞溶解が拡大する結果と考えられるが、総タンパク質濃度が劇的に低下しはじめるので、よい結果を生まなかった。親Sf9単層と広範囲の懸濁培養物間の中間の運搬が最小に制限される場合に、発現が最も盛んであるらしいことが見出された(データ示さず)。種々の精製実験に基づき、NAsは6〜8mg/lで変化する濃度および適度に低い産生能力で発現されるが、なおしかし、他の分泌される複合体糖タンパク質について報告された収量(ジャービスら,1990)と比較可能なレベルであることを決定した。
TC100培地を、可溶性タンパク質内容物の特異的酵素活性がピークに達する感染の48時間後に収穫した(図4)。NAs精製の種々の工程を表1にまとめた。粗培地に対し、20%〜60%飽和硫酸アンモニウム沈殿法を行うと、適度に2倍の濃度の増加が得られ、物質の濃縮を行うことができた。大規模な透析および不溶生成物の除去を行った後、4%ブタノールを加えた。ブタノールを添加することが、NAsの収量の増加に非常に有利な影響があり、特にタンパク質濃度が低い場合に効果的であることが見出された。培地の疎水性の程度を限定することが、不溶性凝集物の形成を避けるのに必要であることも考慮しうることである。続いて、溶液をセファロースQ−アニオン交換クロマトグラフィーによって分画した(図5)。塩勾配の開始時に適度に対称的なピークでNA活性が溶出した。ELISA試験より、残りの画分にはNA関連物質が含まれないことがわかった。この時点で、出発時のタンパク質の量のおよそ97.5%が除去され、ほぼ20の要因によって特異的活性が増加した。次いで、N−(p−アミノフェニル)オキサム酸アガロースカラムに通すために、溶液のpHを5.5まで下げた。初期の実験から、NA置換オキサム酸が、インフルエンザNAの強い可逆的インヒビターであることが知られている(エドモンド,1966)。インフルエンザウイルスまたはバクテリアのノイラミニダーゼに対する選択的吸収体としてN−(p−アミノフェニル)オキサム酸アガロースを使用することは、最初にカトルカサスおよびイリアーノ(1971)によって、後にブッチャー(1977)によって証明された。最初の操作にしたがって、高pHの緩衝液(100mM NaHCO3,pH9.1)でノイラミニダーゼを溶離した。しかし、我々の実験では、これらの条件では、NAsの溶出は不完全で、遅い結果しか得られなかった。しかし、pHを高め、かつ塩濃度を高めることによって、効果的な放出が達成できた。溶出に先立って、低濃度の塩の存在下、pH8.5で追加の洗浄工程を行うことによって、多量の非特異的に結合したタンパク質をカラムから除去した。緩衝剤としてNaHCO3よりもジエタノールアミンの方を選ぶことによって、沈殿することなく2mM CaCl2を吸収することが可能になった。NA活性の保持力が、Ca++イオンに幾分左右されることが繰り返し報告されている(チョンら,1966;ヂモック,1971)。このことが本実験に相当するかどうかは詳細に調査しなかった。
NAsをβ−メルカプトエタノールの存在下にSDSと煮沸して変性すると、NAsは完全解離して分子量約55kdの単量体鎖になった。SDS/PAGEゲルの銀着色により四量体および二量体NAsは、均質に精製されることがわかった。単量体NAsについては、痕跡量の混濁物が目視されるので、僅かに質の低いものであった。還元剤のない条件下で変性を行うと、四量体および二量体NAsは、約110kdの二量体鎖として移動した(示さず)。これらの結果から、NAs二量体はジスルフィド架橋により内部で結合しており、さらに非共有結合的相互作用を介して会合することができ、それによって、天然のNAの構造に対応する四量体タンパク質が形成されることが示された。
本発明の主たる目的は、分泌され、正確に折り畳まれたタンパク質としてのインフルエンザノイラミニダーゼの合成、およびワクチン用剤として使用しうる均質な生成物を得るための精製操作の決定であった。NA2インフルエンザウイルス株A/ビクトリア/3/75のNA遺伝子から、シグナル配列(膜アンカー機能)を有する元のNA末端領域が、インフルエンザHA遺伝子の5’配列の一部と置き換えられたキメラ遺伝子を構築した。続いて、HAから誘導された切断可能なシグナルペプチドにより実質的に分泌可能なNA(NAs)をコードする、得られる構築物を、強力なポリヘドリンプロモーターの転写調節下にバキュロウイルス発現ベクターに組み込んだ。宿主昆虫細胞Sf9の感染後、培養培地中にNAsが分泌された。精製結果に基づいて、6〜8mg/lの範囲で発現のレベルを評価した。バキュロウイルスに感染している間に、分泌による宿主細胞のタンパク質切断能力が劇的に減少することが論証された(ジャービスおよびサマーズ,1989)。それにもかかわらず、記載された産生系は実験室スケールの予防接種の研究に適用可能であり、相当なスケールアップにも好適である。
ピチア・パストリスによる組換えノイラミニダーゼの分泌
序論
昆虫細胞に加えて、酵母が組換えインフルエンザノイラミニダーゼ産生用の宿主細胞として使用しうるかどうかを判定するために、ノイラミニダーゼの酵素的「帽子」部位を含む発現ベクターを構築した。
1.ベクターおよび宿主
ピチア・パストリスのプラスミドpPIC9(インビトロゲン製)を用いて発現カセットを構築した。このプラスミドは、ピチア・パストリスの誘導可能なアスコールオキシダーゼI(AOXI)遺伝子の複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、プロモーターおよびターミネーター領域、サッカロミセス・セレビシアエのα因子のプレプロ分泌シグナル、ならびにピチア・パストリスのHIS4マーカーを含む。宿主としては、メチロトロフィックな酵母菌ピチア・パストリス(インビトロゲン)を用いた。
部位特異的突然変異誘発法によって、A/ビクトリア/3/75のノイラミニダーゼ遺伝子のcDNA配列にStuI制限部位を導入した。制限部位の位置はPro79とした。この制限部位を用いて、酵素的活性中心を含むノイラミニダーゼ遺伝子の免疫原性「帽子配列」を、StuI/HindIII断片として単離し、ピチア・パストリスのプラスミドpPIC9のSnaBI制限部位にクローニングすることができた。図15はpPIC9プラスミドの模式図を示す。図16はプレプロシグナル配列と組換えノイラミニダーゼの融合領域である。プロペプチドは外来性のKEX2プロテアーゼによって後期ゴルジ体内で切断される。(Glu−Ala)2ジペプチドはSTE13型のジペプチジルアミノペプチドによって除去される。外側のチロシン残基は切断されず、組換えノイラミニダーゼ上でN末端に残るが、これは不必要である。
最小グリセロール緩衝培地(pH6.0)中で形質転換体を予備成長させ、48時間後に、0.5%メタノールを含む最小緩衝培地に移した。この結果、アルコールオキシダーゼIプロモーターが誘導され、ノイラミニダーゼの「帽子」が発現した。公知のノーザン分析法を用いて、細胞中のノイラミニダーゼのmRNA量を評価した。この結果、非常に効果的に誘導がなされたことがわかった。
材料および方法
1.実験動物
免疫感作開始時に8週齢の雌性同系繁殖系Balb/cマウス(SCK Mol、ベルギー)を用いた。受動免疫感作実験において、被検マウスは12週齢であった。1ケージ(410cm2)あたり3匹のグループに分け、食餌と水を任意に与えた。
インフルエンザ株は、A.ダグラス博士およびJ.スケール博士から入手した(MCR・ラボラトリーズ、ミル・ヒル、ロンドン)。実験用ウイルスX−31およびX−47はH3N2抗原組成物を含み、該組成物は、A/PR/8/34(H1N1)を遺伝子的に再編成することにより、それぞれA/アイチ/2/68(H3N2)およびA/ビクトリア/3/75(H3N2)として誘導される。両方のウイルスのストックを、マウスが死亡する程度に肺を通して何回も注入することによって順応させた。
インフルエンザNA A/ビクトリア/3/75(H3N2)を、実施例1で記載したバキュロウイルス昆虫細胞発現系で産生された精製組換えタンパク質として投与した。ここで記載する免疫感作実験で使用する精製NAs票品には、リン酸緩衝塩溶液として四量体と二量体分子の混合物が含まれていた。
我々自身の実験室で行った組換えインフルエンザHAの免疫感作研究に基づいて、適当なアジュバントを選んだ。Ribiアジュバント(モノホスホリル脂質A(MPLA)、トレハロース−6,6−ジミコレート(TDM)、スクアレンおよびTween80を含む)とサルモネラ・チフィムリウムMPLAの入ったビンを製造者の指示書(Ribiイムノケム・リサーチ)にしたがって満たした。ムラミル・ジペプチド(MDP)はシグマ・ケミカル・コーポレイションから購入した。
1μgのNAsを200μlの用量で3回、3週間間隔で皮下注射にてマウスに投与した。最初の免疫感作では、通常マウスに用いるRibi用量の半分量中(25μgのMPLA、25μgのTDM、2μlのスクアレンおよび0.1%のTween80に相当)に、NAsを乳剤化した。25μgのMPLAと25μgのMDPをNAsに加えてブースター注射を行った。対照動物にはアジュバントのPBS溶液を投与した。
3回目の免疫感作後3週間目に、心臓穿刺によってドナーマウスから採血し、同様に処理されたマウスの血清標品を集めた。被検マウスに400μlの免疫または対照血清を1回投与の腹腔内注射を行った。
ブースター注射後3週間目または受動免疫感作後1日目、軽度にエーテル麻酔したマウスに、20LD50の即位的ウイルスを鼻孔内接種した。次いで、接種後10日間の直腸の温度と体重を測定することによって、感染の進行の程度を追跡した。
ワクチン接種開始前1日(免疫前血清)および各免疫感作後2週間目の血液サンプルを尾部動脈から採血した。ELISA法により、NA特異的抗体について個々の血清サンプルを試験した。マイクロタイタープレート(Nunc Maxisorp)に精製NAsを塗布し(50ng/ウエル)、血清を5倍に希釈した。アルカリホスファターゼ(シグマ・ケミカル・コーポレイション)と複合したウサギの抗(マウスIgG)抗体を加え、次いでp−ニトロフェノール基質溶液(シグマ・ケミカル・コーポレイション)をプレートに加えてインキュベートすることによって特異的抗体の結合を定量した。マイクロタイタープレートリーダーにて405nmにおけるOD値を測定した。対照ウエル(免疫前血清で処理)よりも0.5高い吸光度が得られるlog5血清希釈の逆数としてNA抗体の力価を表した。
1.実験設計
上記免疫感作プロトコルに従い、1グループ12匹のマウスのグループ3つに、NAsのワクチン接種を行った。同数の対照マウスを平行してPBSで処理した。続いて、ワクチン接種マウスと対照マウスからなる対のグループをマウス順応X−47またはX−31にチャレンジさせた。一方、該対グループを受動免疫感作実験の血清ドナーとした。
各ケージから1匹ずつ取り出した、12匹のワクチン接種動物と12匹の対照動物からランダムに選択した血清で行うELISAによってNAsに対する抗体応答を追跡した。マウスにおいてNAs免疫感作を行うと、血清中のNAs抗体が著しく増加した。最初のブースター注射は、およそlog5量の3倍のNAs抗体を増加したが、第2のブースター注射ではNAs抗体の力価がさらにまた約5倍の増加を示した。対照マウスにおいては、アジュバントの1回投与では、NAsと反応する特異的抗体の有意な産生はなされなかった。
ワクチン接種後3週間目のワクチン接種マウスと対照マウスに対し、20 LD50量のホモNA変異ウイルスX−47を投与することにより、免疫を検定した(図12)。体温の低下および体重の減少が測定されたことからわかるように、すべての対照マウスは重篤な罹患状態に陥った。感染後4日目に、最初の死亡マウスが現れ、すべての対照マウスはウイルス接種後9日以内にすべて死亡した。
反対に、NAsワクチン接種マウスにおける臨床パラメーターは、一時的かつ小さく低下しただけであった。すべてのワクチンマウスは感染から助かった。
第3の免疫感作を行わない場合、同レベルの防御免疫が達成されうるのかどうかという点についても調べた(NAsおよび/またはアジュバントの用量を増加することによって補償されるという可能性があると考えられる)。これらの試験は実質的に同一の実験計画に沿って行った。この作法で免疫感作したマウスは一般に良好な耐性を呈したが、少数の個体は重篤な罹患状態に陥った。また、生存率が80%以下になることは殆ど無かったが、ワクチン接種マウスにおいて死亡するものも時折あらわれた。しかし、3回の免疫感作によって達成された防御免疫のレベルは、全般にわたって優れたものであることがわかった。
7年抗原ドリフトによってA/ビクトリア/3/75から誘導されたNAsから分離されるNAを含むヘテロ−NA−変異ウイルスX−31の20 LD50量を、ワクチン接種マウスおよび対照マウスの別のグループに感染させて免疫性を試験した(図13)。X−47免疫感作実験においても観察されたように、臨床結果は劇的なものであった。対照動物は感染後5日目で既に死亡するものがあらわれ始めた。死亡率は8日目に最大値に到達し、その後生存したのは1匹だけであった。NAsで免疫感作したマウスは、通常は致命的なヘテロ変異ウイルスに感染したにもかかわらず、100%の生存率を示した。ホモ変異免疫実験の場合と同様に、ワクチン接種マウスは体温を適度に正常レベルで維持することができた。体重の損失は、ホモ変異の場合と比べて幾らかは顕著であったが、すべてのマウスが6日目以降回復を始めた。
受動免疫感作による動物防御が、誘発される防御免疫に対して主に応答可能である体液性防御メカニズムであるかどうかを決定するために、該動物防御を試験した。この目的のために、標準的操作にしたがってドナーマウスを免疫感作した。該ドナー動物から採血して、1個体あたり平均約400μlの血清を得た。対照血清と免疫血清をそれぞれ集めた後、400μlの血清を被検マウスに腹腔内注射にて1回で投与した。適合させたX−47ウイルスの20 LD50量にチャレンジさせる前に、抗体分子がマウス内で満遍なく拡散しうるように24時間の間隔をあける。対照血清を接種された動物は、すぐに急性の低体温症になり、体重が激しく減少し、最終的に死亡に至ったが、NAs免疫血清を投与されたマウスは、能動的に免疫感作された動物と実質的に同程度に防御された(図14)。
したがって、NA抗体を予め循環させておくことにより完全な防御が得られるという結論を下すことができる。
インフルエンザに対する免疫は、長い間ほとんどHA抗体の機能についてのみ研究されていたが、免疫に寄与するNAの重要性は実質的に無視されてきた。この状況は、HAを結合しうる抗体のみがウイルスを直接中和する能力をもつという観察結果に一部由来するものであった(ハースト,1942;デイブンポートら,1964;キダら,1983)が、NAに対する抗体が、広範囲の濃度において一次感染を防御しうることはわかっていなかった(ジャヒエルおよびキルボーン,1966;キルボーンら,1968;ヨハンソン,1989)。この寛容はおそらく、インフルエンザウイルスのライフサイクルの後期部分で、新たに形成されたウイルスが感染細胞の表面で凝集するのを妨げるように働くNAsを反映している(コールマンおよびウォード,1985;ブラウンおよびレイバー,1968)。HAとは逆に、NAはインフルエンザウイルスのエンベロープの成分のうちで少ないほうの成分であり、NA抗体の非中和効果に寄与しうるという事実がさらに発見された(シュルマンら,1968)。この存在モル比率の相違が、同様に個々の抗原に対する相対的抗体応答に影響を及ぼす。全インフルエンザウイルスと連続的に対決するために、NAと比べてHAが相対的に過剰に提供されることが繰り返されると、おそらくNa特異的T細胞の援助が覚醒される結果として、NA抗体の産生を抑制することができた(キルボーン,1976;ヨハンソンら,1987;キルボーンら,1987;ヨハンソンら,1987)。
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Claims (31)
- a)ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し(ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる機能的フラグメントをコードする、少なくとも一部のコード領域、またはそのフラグメントが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している);次いで
b)培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離する
ことによって得られる実質的単離体である組換えノイラミニダーゼ。 - 組換え発現ベクターpAc2IVNAs(LMBP2976)を用いてウイルスのゲノムの2重相同的組換えを行なってウイルスを形質転換し、該ウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、次いで培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することによって得られる、実質的単離体である組換えインフルエンザNA2ノイラミニダーゼ。
- 組換え発現ベクターpPP1IVNAfls(LMBP3223)をトランスフェクトさせた宿主細胞を適当な培養培地中で培養することによって得られる、組換えインフルエンザNA2ノイラミニダーゼ。
- さらに、培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することを含む請求項3に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
- 宿主細胞が下等真核生物由来であることを特徴とする請求項1、2、3または4に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
- 宿主細胞が昆虫細胞であることを特徴とする請求項1、2または5に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
- 昆虫細胞がsf9昆虫細胞であることを特徴とする請求項6に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
- 宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする請求項1、3、4または5に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
- インフルエンザワクチン用の請求項1〜8に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
- NA2型インフルエンザワクチン用の請求項2〜8のいずれかに記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。
- a)膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる機能的フラグメントをコードする、少なくとも一部のコード領域、またはそのフラグメント;
b)コード領域の5’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列;
c)シグナル配列の5’に位置するプロモーター;および
d)コード領域の3’に位置する転写ターミネーター
を含む、分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクター。 - a)膜アンカーをコードする領域を欠損しているウイルス株「A/ビクトリア/3/75」のインフルエンザNA2のノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域、またはそのフラグメント;
b)コード領域の5’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列;
c)シグナル配列の5’に位置するプロモーター;および
d)コード領域の3’に位置する転写ターミネーター
を含む、分泌可能なインフルエンザNA2ノイラミニダーゼを発現するベクター。 - シグナル配列がインフルエンザNA2ウイルス「A/ビクトリア/3/75」(H3N2)の血球凝集素遺伝子由来であることを特徴とする請求項11または12に記載のベクター。
- プロモーターがポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする請求項11、12または13に記載のベクター。
- 転写ターミネーターがSV40および/またはポリヘドリン遺伝子由来であることを特徴とする請求項11〜14のいずれかに記載のベクター。
- 寄託番号がLNBP2976であるベクターpAc2IVNAs。
- a)ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび少なくとも一部の柄部分をそれぞれコードする領域を欠損しているインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる領域をコードする機能的フラグメントをコードする領域、またはそのフラグメント;
b)コード領域の5’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列;
c)シグナル配列の5’に位置するプロモーター;および
d)コード領域の3’に位置する転写ターミネーター
を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクター。 - a)ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび少なくとも一部の柄部分をそれぞれコードする領域を欠損しているウイルス株「A/ビクトリア/3/75」のインフルエンザノイラミダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる領域をコードする機能的フラグメントをコードする領域、またはそのフラグメント;
b)コード領域の5’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列;
c)シグナル配列の5’に位置するプロモーター;および
d)コード領域の3’に位置する転写ターミネーター
を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザNA2ノイラミニダーゼを発現するベクター。 - シグナル配列がサッカロミセス・セレビシアエのα因子のプレプロシグナル配列であることを特徴とする請求項17または18に記載のベクター。
- プロモーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼIプロモーターであることを特徴とする請求項17、18または19に記載のベクター。
- 転写ターミネーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼI遺伝子由来であることを特徴とする請求項17〜20のいずれかに記載のベクター。
- 寄託番号がLMBP3223であるベクターpPP1IVNAfls。
- 請求項1に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼを含むワクチン。
- 請求項2〜10に記載の組換えインフルエンザNA2ノイラミニダーゼを含むワクチン。
- a)適当なプロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域(該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域および柄部分をコードする領域を欠損している)またはそのフラグメントを含む発現ベクターを構築し;
b)得られた該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し;
c)組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し;次いで
d)組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する;
工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。 - a)適当なプロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域(該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域を欠損している)またはそのフラグメントを含む発現ベクターを構築し;
b)得られた該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し;
c)組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し;次いで
d)組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する;
工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。 - a)適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域(該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠損している)または免疫感作において防御免疫を引き起こしうるそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し;
b)ウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二重相同的組換え手段によって持ち込み;
c)得られた該形質転換ウイルスに宿主細胞を感染させ;
d)組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地中で培養し;次いで
e)組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する;
工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。 - a)適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株「A/ビクトリア/3/75」のインフルエンザNA2ノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域(該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠損している)またはそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し;
b)組換えバキュロウイルスを得るために、野生型バキュロウイルスまたはそれから誘導されたバキュロウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二重相同的組換え手段によって持ち込み;
c)該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ;
d)組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地中で培養し;次いで
e)組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する;
工程を特徴とする組換えインフルエンザNA2ノイラミニダーゼの製造方法。 - a)二重相同的組換え手段によって、寄託番号LMBP2976であるベクターpAc2IVNAsの発現モジュールでバキュロウイルスを形質転換し;
b)該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ;
c)組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地中で培養し;次いで
d)組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する;
工程を特徴とする組換えインフルエンザNA2ノイラミニダーゼの製造方法。 - a)適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株「A/ビクトリア/3/75」のインフルエンザNA2ノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコード領域(該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域および柄部分をコードする領域を欠損している)またはそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し;
b)得られた該組換えベクターで宿主細胞を形質転換し;
c)組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し;次いで
d)組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する;
工程を特徴とする組換えインフルエンザNA2ノイラミニダーゼの製造方法。 - a)寄託番号LMBP3223であるベクターpPP1IVNAflsでピチア・パストリスを形質転換し;
b)該ベクターで宿主細胞を形質転換し;
c)組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養培地中で培養し;次いで
d)組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する;
工程を特徴とする組換えインフルエンザNA2ノイラミニダーゼの製造方法。
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