JP2006166848A - トリコデルマ・リーゼイ(Trichodermareesei)、その製造方法及び結晶性セルロースの高加水分解活性セルラーゼの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 結晶性セルロースの高加水分解活性を有するトリコデルマ・リーゼイ;セルロース分解能を有する糸状菌から乾燥緑色成熟分生子を調製し、次いでこれから膨潤分生子を調製し、次いでこれから高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから選択基質を用いて結晶性セルロース高加水分解活性を有する微生物を選択することを特徴とする上記トリコデルマ・リーゼイの製造方法;並びに上記トリコデルマ・リーゼイを培養し、培養後培養液をろ過し、ろ過液からセルラーゼを採取することを特徴とする結晶性セルロースの高加水分解活性セルラーゼの製造方法。
【選択図】 なし
Description
請求項2の発明は、アビセル加水分解活性が、在来菌株の2.5倍以上である請求項1に記載のトリコデルマ・リーゼイである。
請求項3の発明は、β−グルコシダーゼ活性が、在来菌株の8倍以上である請求項1又は2に記載のトリコデルマ・リーゼイである。
請求項4の発明は、カルボキシメチルセルロース(CMC)分解活性が、在来菌株の1.1倍以上である請求項1〜3のいずれか1項にトリコデルマ・リーゼイである。
請求項5の発明は、前記トリコデルマ・リーゼイの菌株が、8H(FERM P−20174)である請求項1〜4のいずれか1項に記載のトリコデルマ・リーゼイである(以上、第1の発明)。
請求項6の発明は、セルロース分解能を有する糸状菌から乾燥緑色成熟分生子を調製し、次いでこれから膨潤分生子を調製し、次いでこれから高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから選択基質を用いて結晶性セルロース高加水分解活性を有する微生物を選択することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法である。
請求項7の発明は、次の1)乃至5)の工程を有することを特徴とする請求項6記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法である。
1)トリコデルマ・リーゼイ RutC−30(ATCC56765)をポテトデキストロース寒天斜面培地に載置して培養し、緑色成熟分生子を着生させ、着生した分生子を滅菌蒸留水に懸濁し、撹拌してろ過し、菌糸片を除去し、ろ液を遠心分離して分生子を分離し、乾燥し、乾燥緑色成熟分生子を調製する工程、
2)前記第1工程で調製した該乾燥緑色成熟分生子をマンデルス培地に添加して培養し、培養液をろ過して菌糸片を除去し、ろ液中に膨潤分生子を調製する工程、
3)前記第2工程のろ液を遠心分離して膨潤分生子をろ液から分離し、マンデルス培地に添加して培養し、培養後培地をろ過して伸長した菌糸を除去し、高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製する工程、
4)前記第3工程で調製した高次同質倍数核を有する膨潤分生子をマンデルス培地に添加して培養し、培養後培地をろ過して伸長した菌糸を除去し、同質遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製するベノミル処理工程、及び
5)前記第4工程で調製したベノミル処理された同質遺伝的組換核を複数を有する膨潤分生子を、選択基質を含有する重層培地に接種して培養し、結晶性セルロース高加水分解活性微生物を選択する工程。
請求項8の発明は、選択基質が、アビセル、木粉又は脱脂綿である請求項6又は7に記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法である(以上、第2の発明)。
請求項9の発明は、請求項1〜5のいずれか1項に記載のトリコデルマ・リーゼイを培養し、培養後培養液をろ過し、ろ過液からセルラーゼを採取することを特徴とする結晶性セルロースの高加水分解活性セルラーゼの製造方法である(以上、第3の発明)。
2)第2の発明により、結晶性セルロースを加水分解するのに必要なアビセル分解酵素活性及びβ−グルコシダーゼ活性がともに向上した菌株を迅速に選択できる。
3)第2の発明では、外来遺伝子を使用した遺伝子組換菌株ではないので、安全性が高く、 食品加工にも利用し得る。
4)第2の発明において、選択基質を変更することにより、例えば古紙、バガス等のセルロース原料に対する加水分解活性の高いセルラーゼ生産菌株を作製することも可能であ る。従って、第2の発明は、極めて有用である。
5)第2の発明により得た菌株を、第2の発明により再処理し、酵素生産性を更に向上させることも可能である。
6)第3の発明により、結晶性セルロースの高い加水分解活性を有するセルラーゼを得ることができる。
1) アビセル加水分解活性が、在来菌株の2.5倍以上である。
2) β−グルコシダーゼ活性が、在来菌株の8倍以上である。
3) CMC活性が、在来菌株の1.1倍以上である。
特に、トリコデルマ・リーゼイ 8Hは、以下の菌学的性質を有する。
(ア)ポテトデキストロース寒天培地(ポテト抽出物 4.0g、グルコース 20.0g、寒天 15.0g、蒸留水1000ml)上及びペプトンとグルコースを加えたマンデルス寒天培地(ペプトン 5.0g、グルコース 10.0g、寒天 15.0g、マンデルス液体培地 1000ml)上での生育は良好であり、菌糸伸張も良好である。
(イ)寒天培地上での培養初期では気生菌糸は白色で少量であるが、次第に羽毛上の気生菌糸を生じる。
(ウ)形態的性質
・分生子柄は気生菌糸より生じ、不規則に分岐し、各分岐は下方のものほど伸びて分岐を繰り返し、全体としては円錐形を呈する。各分岐はほぼ直角に分かれ先端はフィアライドとなる。
・フィアライドは分生子柄先端に2-4個が規則的に形成され、フィアライド先端は細くなる。
・分生子はフィアライド頂端に形成され、球形〜亜球形〜楕円系であり表面は平滑である。
・分生子の大きさは短軸長が 2μm前後であり、長軸長は4μm前後である。
(エ)ろ紙崩壊性、
トリコデルマ・リーゼイRut C-30株を28℃、6日間振盪培養して得た酵素液では1センチ四方のろ紙を崩壊させるのにおよそ25分かかるがトリコデルマ・リーゼイ8H株の同様の酵素液は10分でろ紙を崩壊させる。またろ紙を崩壊させたときの液中の還元糖量も8H株の方が多く明確な相違となっている。
(オ)分解活性
トリコデルマ・リーゼイRut C-30株もトリコデルマ・リーゼイ8H株も共にアビセル分解活性、CMC分解活性、サリシン分解活性を保持するが、8Hはアビセル加水分解活性がRutC−30の約3.7倍、β−グルコシダーゼ活性が約10倍高く、明確な相違がある。また、CMC加水分解活性についても、8HはRutC−30より高い。
本発明の第2の発明は、セルロース分解能を有する糸状菌から乾燥緑色成熟分生子を調製し、次いでこれから膨潤分生子を調製し、次いでこれから高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから選択基質を用いて結晶性セルロース高加水分解活性を有する微生物を選択することを特徴とする本発明のトリコデルマ・リーゼイの製造方法である。これをさらに詳述する。
(NH4)2SO4: 1.4g, KH2PO4:2.0g, urea:0.3g, CaCl2:0.3g, MgSO4・7H2O: 0.3g, FeSO4・7H2O:0.005g, MnSO4・H2O:0.0016g, ZnSO4・H2O:0.0014g, CoCl2:0.0020g, 蒸留水:1000ml)(pH6.0).
◎マンデルス培地の貯蔵と使用法:
なお、通常、マンデルス培地は、(NH4)2SO4: 14g, KH2PO4:20g, urea:3g, CaCl2:3g, MgSO4・7H2O:3gを蒸留水に溶解して1000mlとしたもの(A液)、FeSO4・7H2O:0.5g, MnSO4・H2O:0.16g, ZnSO4・H2O:0.14g, CoCl2:0.20gを蒸留水に溶解して1000mlとしたもの(B液)を、それぞれ10倍、100倍に希釈し、混合して使用する。
第1工程
トリコデルマ・リーゼイ RutC−30を、常法により寒天培地で培養し、2mm四方の寒天培地を切除し、滅菌冷却したポテト・デキストロース寒天斜面培地に載置し、28℃の温度で7日間培養し、緑色成熟分生子を着生させた。着生した分生子を収集し、滅菌蒸留水1lに懸濁し、十分撹拌した後ガラスフィルター((株)三商社製。3G−2)でろ過して菌糸片を除去し、ろ液を遠心分離して沈殿した分生子を採取し、デシケーターで乾燥し、乾燥した緑色成熟分生子を得た。
100mlの三角フラスコに、上記マンデルス培地とグルコース0.5g、ペプトン0.25gを追加した培地50mlを加え、滅菌冷却後に第1工程で得られた乾燥緑色成熟分生子を添加し、回転振盪培養機(タイテック社製。ダブルシェーカーNR30)により28℃、160rpmで6時間培養し、培養液をガラスフィルター((株)三商社製。3G−1)でろ過して菌糸片を除去し、膨潤分生子を含有するろ過液を得た。
50mlの三角フラスコに、上記マンデルス培地とグルコース0.25g、ペプトン0.125g、コルヒチン0.025gを追加した培地25mlを加えて滅菌冷却した。これに、前記膨潤分生子を含有するろ過液を遠心分離して収集した膨潤分生子を加えて、28℃で7日間培養した。培養液をガラスフィルター((株)三商製。3G−1)でろ過して伸長した菌糸を除去し、高次同質倍数核を有する膨潤分生子を含有するろ過液を得た。
50mlの三角フラスコに、マンデルス培地とグルコース0.25g、ペプトン0.125g、ベルミノ0.1μg/mlを追加した培地25mlを加え、滅菌冷却した。次いで、これに、前記高次同質倍数核を有する膨潤分生子を含有するろ過液を遠心分離して収集した高次同質倍数核を有する膨潤分生子を添加し、28℃で7日間培養し、培養液をガラスフィルター((株)三商製。3G−1)でろ過して伸長した菌糸を除去し、同質遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を含有するろ過液を得た。
マンデルス培地100mlに、グルコース1.0g、ペプトン0.5g、ポリオキシエチレン・(10)オクチルフェニルエーテル0.3ml及び寒天3.0gを添加して滅菌冷却した。これを、大型深型ガラスプレート(東京ペトリシャーレ社製。深さ6cm、直径15cm)に注入し、4℃の温度で放冷し、約30℃に冷却したとき同質遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を含有するろ過液0.2mlを添加して固化させ、下層培地を調製した。
次いでマンデルス培地100mlに、アビセル1.0g、ペプトン0.5g、ポリオキシエチレン・オクチルフェニルイーテル0.3ml及び寒天3.0gの割合で添加し、滅菌放冷して、約40℃に冷却したとき前記下層培地上に注入し、4℃で放冷して上層培地を調製した。
この調製した重層培地を28℃で6日間培養し、培地表面にコロニーを形成させた。このコロニーが新規なトリコデルマ・リーゼイ 8H菌株である。
マンデルス液体培地100mlに、アビセル0.5g及びペプトン0.25gの割合で添加し、滅菌冷却後、前記実施例1により得たトリコデルマ・リーゼイ 8Hのコロニーの3mm四方の小片を培地に添加し、回転振盪培養機(タイテック社製。ダブルシェーカーNR30)により28℃、160rpmで6日間振盪培養し、培養液をろ紙(ワットマン社製。No.2)でろ過し、結晶性セルロースの高い加水分解活性を有するセルラーゼ含有液を得た。
実施例2において、トリコデルマ・リーゼイ 8Hの代わりに、トリコデルマ・リーゼイ RutC−30を用いた以外は、実施例2と同様にして、セルラーゼ含有液を得た。
実施例2、比較例1で得られたセルラーゼの特性を試験した。
(試験方法)
1)ろ紙崩壊試験
セルラーゼ含有液5mlをL字型試験管(タイテック社製。横120mm、高さ68mm)に採取し、1cm四方のろ紙(ワットマン社製。No.2)を添加し、モノー振盪機(タイテック社製。モノー・シェイカー・パーソナル−11)により50℃、75ストローク/分で保持し、ろ紙が完全に崩壊するまでの時間を測定した。
2)還元糖の定量
ろ紙が完全に崩壊した後、L字型試験管内に生成した還元糖の量を次のDNS法により定量した。
3)セルラーゼ活性試験
前記セルラーゼ含有液2mlを、18.5mm×185mmの試験管に採取し、以下に示す基質4mlを添加し、往復振盪機(トーマス科学機器社製。T−22S型)により50℃、125ストローク/分で1時間往復振盪させた。開始30分後に試験管を振って沈殿したアビセルを再懸濁させた。反応終了後、ろ紙(ワットマン社製。No.2)でろ過し、ろ液中の還元糖をDNS法により定量し、セルラーゼ活性を試験した。
アビセル加水分解活性用:0.1N酢酸緩衝液(pH5)100ml+アビセル1g
CMC加水分解活性用:0.1N酢酸緩衝液(pH5)100ml+CMC−Na(DS0.7−0.8)1g
βーグルコシダーゼ活性測定用:0.1N酢酸緩衝液(pH5)100ml+サリシン1g
ろ紙崩壊時間、ろ紙崩壊後に生じた還元糖量を表1に、加水分解活性を表2に示す。なお、各表とも3回の測定値の平均値を算出した結果である
Claims (9)
- 結晶性セルロースの高加水分解活性を有するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)。
- アビセル加水分解活性が、在来菌株の2.5倍以上である請求項1に記載のトリコデルマ・リーゼイ。
- β−グルコシダーゼ活性が、在来菌株の8倍以上である請求項1又は2に記載のトリコデルマ・リーゼイ。
- カルボキシメチルセルロース分解活性が、在来菌株の1.1倍以上である請求項1〜3のいずれか1項にトリコデルマ・リーゼイ。
- 前記トリコデルマ・リーゼイの菌株が、8H(FERM P−20174)である請求項1〜4のいずれか1項に記載のトリコデルマ・リーゼイ。
- セルロース分解能を有する糸状菌から乾燥緑色成熟分生子を調製し、次いでこれから膨潤分生子を調製し、次いでこれから高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製し、次いでこれから選択基質を用いて結晶性セルロース高加水分解活性を有する微生物を選択することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法。
- 次の1)乃至5)の工程を有することを特徴とする請求項6記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法。
1)トリコデルマ・リーゼイ RutC−30(ATCC56765)をポテトデキストロース寒天斜面培地に載置して培養し、緑色成熟分生子を着生させ、着生した分生子を滅菌蒸留水に懸濁し、撹拌してろ過し、菌糸片を除去し、ろ液を遠心分離して分生子を分離し、乾燥し、乾燥緑色成熟分生子を調製する工程、
2)前記第1工程で調製した該乾燥緑色成熟分生子をマンデルス培地に添加して培養し、培養液をろ過して菌糸片を除去し、ろ液中に膨潤分生子を調製する工程、
3)前記第2工程のろ液を遠心分離して膨潤分生子をろ液から分離し、マンデルス培地に添加して培養し、培養後培地をろ過して伸長した菌糸を除去し、高次同質倍数核を有する膨潤分生子を調製する工程、
4)前記第3工程で調製した高次同質倍数核を有する膨潤分生子をマンデルス培地に添加して培養し、培養後培地をろ過して伸長した菌糸を除去し、同質遺伝的組換核を複数有する膨潤分生子を調製するベノミル処理工程、及び
5)前記第4工程で調製したベノミル処理された同質遺伝的組換核を複数を有する膨潤分生子を、選択基質を含有する重層培地に接種して培養し、結晶性セルロース高加水分解活性微生物を選択する工程。 - 選択基質が、アビセル、木粉又は脱脂綿である請求項6又は7に記載のトリコデルマ・リーゼイの製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のトリコデルマ・リーゼイを培養し、培養後培養液をろ過し、ろ過液からセルラーゼを採取することを特徴とする結晶性セルロースの高加水分解活性セルラーゼの製造方法。
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