JP2006153826A - 生体試料標識物および生体物質標識法および生体物質の検査法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＮＡプローブアレーなどのプローブ区画を最小にし、同一区画で数十ないし数千の試料分子を識別できる標識物とこれを用いる生体物質のマルチ検査法を提案すること。
【解決手段】プローブのインデクシング用に異なる元素の比率を変えて作成する粒子を用い、走査型電子顕微鏡でＳＥＭ像を得て容易にその位置と大きさを検出し、さらに、走査型電子顕微鏡で粒子に電子を照射する時に発生する特性Ｘ線をエネルギー分散型特性Ｘ線検出器により元素分析像を得ることで位置と大きさを得る。これにより、どのような元素を含むどのような大きさのナノ粒子が基板の区画上のどの位置に存在するかを検出する。
【選択図】図２

Description

本発明は種々の検査項目を一度に検査するプローブチップすなわち多項目センサーに関するもので、対象はＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質で、とくに、最近注目を集めているＤＮＡ検査用のＤＮＡチップ等の生体物質アッセイチップ関する。

ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている。あるいは、最近では種々のタンパク質（一般的には抗体をプローブ）としてアレー状に固定したプロテインチップが用いられるようになっている。

ＤＮＡチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基づつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)），あるいはＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996) ）などがある。

これらチップは、いずれもスライドガラスなどの平面状に多数のプローブを、区画を区切り、アレー状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。

使用方法は、チップ基板上のプローブに蛍光標識したＤＮＡ断片やｍＲＮＡやこれを逆転写したｃＤＮＡなどの試料ポリヌクレオチド（以下単に試料ポリヌクレオチド）をハイブリダイズさせて、基板上に導入される蛍光体を蛍光スキャナーで検出する。あるいは、試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後に、プローブと隣接して試料ポリヌクレオチドに相補な蛍光標識オリゴを連結反応（ライゲーション）で連結したり、ＤＮＡポリメラーゼを用いて蛍光標識ｄＮＴＰ基質を反応させたりして、基板上に導入する蛍光体を検出するのが主流である。

最近では、酸化還元反応を利用した電気化学的な検出を行う方法も実用になっている。タンパク質の場合は抗原抗体反応のようなアフィニティー反応を利用して、基板上に特定タンパク質などを補足した後、質量分析機で分析する方法、蛍光標識抗体や酵素標識抗体でサンドイッチ反応をおこない、基板上に残る蛍光体や酵素活性を検出する方法、電気化学発光を用いる検出法がある。

電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。

高感度で定量的な検出を目的とした検出法としては、通常の顕微鏡検出が可能な７００μｍ程度の粒子を標識に用いて、反応した粒子数をカウンターでカウントして目的物質を定量検出するイムノアッセイの報告がある（非特許文献４：Anal. Biochem. 202, 120-125 (1992)）。

Science 251, 767-773(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996) Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991) Anal. Biochem. 202, 120-125 (1992)）

現状のチップ技術、特にＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップでは、測定対象となる数千から数万のＤＮＡ断片に1対１に対応するプローブを基板表面に区画を区切ってすべて独立に固定する。各区画に番地を付けて、どの番地のプローブに標的ＤＮＡ断片が結合したかを蛍光標識物を用いて検出している。このような構造は、抗体などのタンパク質を基板上に固定するプロテインチップでも同様であるので以下ＤＮＡプローブアレーのケースで説明する。このようなＤＮＡプローブアレーを作成するには、上記従来技術で述べたように、マスクを使って区画ごとにＤＮＡプローブを合成するか、あらかじめ合成したＤＮＡプローブを植えつけるかのいずれの方法しかなかった。製造工程はプローブの種類に応じて必要になり、工程数が多い上、基板上の別の位置にプローブを固定する必要から区画ごとに反応条件をそろえるのが難しく、再現性のよいプローブチップを作成するのに多大な努力が必要である。

したがって、より少ない区画で同様の数の測定対象物を測定できる手法を開発することが望まれている。当然のことながら、試料標識物をマルチ化して同一区画で複数の測定対象物を検出することも可能であるが、従来のように蛍光体を標識物に用いる方法では、励起光源と蛍光波長の関係から、マルチ標識を行う場合の制約が大きい。

一般に、励起光源にコヒレントな光を用いても、得られる蛍光波長は数十ｎｍの波長分散になる。このため、単一励起波長光源を用いる場合は４種類程度の蛍光体を励起し蛍光計測するのが限界である。複数の励起波長光源を用いても、実用的な５００〜７００ｎｍの範囲では６種程度の蛍光体しか利用できない。このため、蛍光法で同一エレメント内の複数の標的ポリヌクレオチドを検出する場合には４種程度が限界と考えられる。

このような事情から、ＤＮＡプローブアレーなどの多項目生体物質検出法において、プローブ区画を最小にし、同一区画で数十ないし数千の試料分子を識別できる標識物とこれを用いる生体物質のマルチ検査法が望まれる。

さらに、従来のＤＮＡプローブアレーでは平板基板上に固定したプローブと溶液中の試料を反応させる必要がある。反応は固相と液相の境界面で起こるため、プローブを溶液中に分散させることができない。このため、反応の均一性、再現性、定量性、速度のいずれを取ってみても溶液状態での反応に比べ不利となる。

たとえば、複数の基板を一度に均一なプローブ溶液に浸して同時に固定することができれば、少なくてもプローブ固定時の再現性の確保はできる様になるが、基板上には種類の異なるプローブを固定する必要があるために、従来のＤＮＡマイクロアレーやプロテインチップでこの方法を採用することは不可能である。唯一の解は、プローブアレーのプローブ固定エレメントを個別に切り離し、エレメントごとに均一溶液中でプローブを固定することである。基本的に１種類ごとのプローブに１ロット分のエレメントを反応させるのでプローブ固定時のばらつきは最小にすることができる。このようにして調製した色々なプローブ固定エレメントは基本的に１項目毎の測定はできるが、プローブアレーのように他項目同時測定系に持ち込むには工夫が必要である。すなわち、複数のプローブエレメントを同時に反応させて情報を得るには、各プローブ固定エレメントを区別してその上にハイブリダイズするＤＮＡ量（あるいはプロテインチップでは結合するタンパク質量）を測定するかが大きな問題となる。従来技術では、各プローブ固定エレメントを調製した後に、アレー状に配列させる方法と、エレメントを懸濁液のまま使用する二通りのケースが開発されている。いずれの場合も各プローブエレメントのインデクシングが重要な課題で、予めプローブの種類がわかったエレメントを順番に並べてアレー状にする方法、各エレメントに種々蛍光体でラベルして、インデクシングを行う方法の２通りが実用化されている。しかし、前者ではエレメントを一つずつ機械的に並べる手間がかかり、このため並べられる数も実質的には数は数１００エレメント以下となっている。後者は、２種類の蛍光色素の比率を変えてビーズを蛍光標識しており、たとえば各系抗体の量を８段階に変えたものを用意すれば６４種エレメントをインデクシングできる。蛍光色素の種類を増やせばより多くのエレメントをインデクシングできるが、蛍光色素の場合、励起光と蛍光の波長分散に制約があり実質３種で数１００程度のインデクシングができる。エレメントをプローブ固定後に並べる方法、蛍光色素でのインデクシングのいずれも、限られた測定項目数でよい測定系、たとえば臨床検査では、その高速反応性と再現性からきわめて有効であると考えられている。

しかしながら世の中のニーズとしては、アレー技術においては少なくても数千種の測定対象物、できればｍＲＡＮをすべて網羅できる数の測定対象物を同時に定量的に再現よく計測できることを望む声が大きい。本発明では、ＤＮＡプローブアレーなどの多項目生体物質検出法において、プローブ固定エレメントを均一溶液中で一度に調製することでプローブ固定量の再現生を確保し、各プローブ固定エレメントを混合して懸濁状態で試料と一度に反応することで反応を高速に行うとともに再現性を確保し、各プローブエレメントのインデクシングに工夫して容易に識別できるようにし、数千ないし数万の試料分子を識別して定量検出できる生体物質のマルチ検査法に用いる生体試料標識物および生体物質標識法および生体物質の検査法が望まれる。

本発明の第１の実施態様では、標識物に異なる元素の比率を変えて作成するナノ粒子を標識に用いる。たとえば、金をベースにパラジウムとクロムを微量混ぜたもので説明する。パラジウムとクロムの量との組成比をそれぞれ８階調変えると６４種の金のナノ粒子が得られる。金に添加する元素の数を３種にすると５１２種の金のナノ粒子が得られる。これに粒子径を１０ｎｍから５０ｎｍの間で、１０ｎｍごとの段階で、５種程度変えると２５００種程度の組成とサイズを異にする金のナノ粒子を得ることができる。

この粒子は導体であるので、走査型電子顕微鏡で粒子に電子を照射し、２次電子線のエネルギー分布を測定し粒子の位置と大きさを同定したＳＥＭ像を得て容易にその位置と大きさを検出することができる。さらに、走査型電子顕微鏡で粒子に電子を照射する時に発生する特性Ｘ線をエネルギー分散型特性Ｘ線検出器により元素分析像を得ることで位置と大きさを得る。これにより、どのような元素を含む、どのような大きさのナノ粒子が基板の区画上のどの位置に存在するかを検出する。各組成や粒径の異なる粒子はそれぞれ異なるＤＮＡ配列に結合するプローブＤＮＡを有する構造とすることで、同一平面上で数千のターゲットＤＮＡ断片を検出することができる。

ナノ粒子は金をベースにしているのでアルキルスルフィド基を持つＤＮＡプローブを用いることで粒子表面にプローブを固定できる。

本発明は基本的に合金の製造技術を基本としており、混合できる元素は多種多様で、更に４種以上の元素を組み合わせることも可能である。たとえば、５種の元素を組み合わせれば、既存のＤＮＡチップの区画数に匹敵する３万数千の異なる組成のナノ粒子を得ることができる。あるいは、３種の元素で２５０通りの組み合わせをグループとし、そのほかの元素の組み合わせのグループを複数用意することで数千種のＤＮＡを区別し検出することができる。

組成を変える元素の組み合わせとしては、ガリウム、アルミニウム、イットリウム、エルビウム、ホロニウム、セシウム、コバルト、チタン、ニッケル、鉄などの中から３種から５種選んで合金としてもよい。プローブ固定には上記の金とＳＨ基の反応のほか、酸化表面を持つ合金の場合は、シランカップリング反応を用いて官能基を導入し、プローブＤＮＡを固定すればよい。

このように本発明は、従来、非常に多くの区画エレメントに異なるプローブを固定しなくてはならないＤＮＡチップの概念を覆すものである。単にポリＴを固定したチップにｍＲＮＡをトラップし、各ｍＲＮＡに相補な配列の合成ＤＮＡプローブにそれぞれ異なる組成のナノ粒子を標識したものをハイブリダイズし、走査型電子顕微鏡で解析するだけで、短時間にｍＲＮＡの発現解析が可能である。

ＤＮＡプローブを抗体に変え、基板上に固定した生体物質（たとえばタンパク質）に対して使用すれば、数千種のエピトープを一度に解析できる解析手法が確立する。

本発明の第２の実施態様は、第１の実施態様を発展させて、異なる元素の比率を変えて作成する粒子を特定のプローブを固定するために使用する。すなわち、所定の元素の比率の粒子ごとに特定のプローブを固定した粒子を準備する。一方、それぞれの粒子に固定されているプローブにハイブリダイズすべきターゲットＤＮＡ断片は、計数用の金の微粒子で標識しておく。プローブを固定している粒子とターゲットＤＮＡ断片を溶液中で混合して、プローブとターゲットＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせる。この処理を、容器や基板上の所定の区画で行い、その後粒子を洗浄回収する。洗浄回収には遠心で粒子を回収し、上澄を交換してもよいし、粒子が磁性体を含む場合は磁石で回収し上澄を交換してもよい。基板上の所定の区画に処理後乾燥して基板上の区画に粒子を固定する。その結果、粒子のインデクシングと標識である金の微粒子の計数とで、ターゲットＤＮＡ断片を評価することができる。

この第２の実施態様によれば、粒子に固定されているプローブとターゲットＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションは粒子を溶液懸濁状態で反応させることができるから、ハイブリダイゼーションが固相と液相の境界面で起こることにより発生する反応の不均一性や分子の拡散律速による低反応速度、低反応率の問題をかなり解消できる。懸濁液として取り扱うことは特殊な容器やピペットや特別なテクニックを必要としないメリットがある。そして、この粒子のインデクシングに、上述の測定対象物の標識として使用した手法を利用する。すなわち、走査型電子顕微鏡で粒子に電子を照射して粒子の位置と大きさを同定したＳＥＭ像を得るとともに、電子を照射する時に発生する特性Ｘ線をエネルギー分散型特性Ｘ線検出器により元素分析像を得て、両者の対比から基板の区画上に固定された粒子のインデクシングを行う。そして、その粒子を基板の区画上に固定する。ここでは、エネルギー分散型特性Ｘ線検出器を用いるが、本発明のすべての実施例において波長分散型Ｘ線分光法（wavelength dispersive X-ray spectroscopy, WDX）のようなより高感度な他の方法も使える。むしろ、Ｘ線波長分解能に優れるため波長分散型Ｘ線分光法のほうが本発明には適しているかもしれない。

検出対象がタンパク質や糖鎖などの場合はイムノアッセイの技術を応用する。すなわち、インデクシング粒子に特定エピトープに反応する抗体分子を固定したものと標識用の金ナノ粒子に固定した抗体を用いる。このケースではインデクシング粒子と標識用粒子に固定する抗体はいずれも測定対象分子に特異的な抗体を用いて抗原分子をサンドイッチし、インデクシング粒子−抗原−標識金粒子ハイブリッドとする。あるいは、特異抗体を固定したインデクシング粒子と未標識の抗体と未標識抗体にユニバーサルに反応する第２抗体を用いてサンドイッチする。いずれの方法でも、多数の抗原をインデクシングして定量検出することができる。

インデクシング粒子−ｍＲＮＡ−標識金粒子ハイブリッドやインデクシング粒子−抗原−標識金粒子ハイブリッドの基板上への固定には、基板上にこれらハイブリッドの懸濁液を滴下し、乾燥させてもよいし、より合理的には、インデクシング粒子に磁性体物質を用い、磁石で基板上に引き寄せた後に溶液をブロワーなどで飛ばし乾燥させることで解決できる。

このように、従来非常に多くの区画エレメントに異なるプローブを固定しなくてはならないＤＮＡチップの概念を覆すものである。インデクシング粒子と検体試料と標識粒子を反応させ、走査型電子顕微鏡で解析するだけで、短時間に数千〜数万種のｍＲＮＡやタンパク質の種類と量を一度に解析できる解析手法が確立する。

本発明によれば、走査型電子顕微鏡でのスキャン中に、粒子の元素分析と形状分析を行う。同一区画上で数千から数万種の粒子を識別して検出することができるので、数千から数万種の生体物質を前処理により分離することなく同時に検査することができる。

本発明を、まず、第１の実施態様から説明する。

（実施例１）
図１は本発明の実施例１のＤＮＡチップの一部を斜視図で示す概念図である。チップ１は酸化膜表面を有するシリコン基板１０１に形成される。大きさは２０×２０ｍｍである。ＤＮＡプローブを固定するプローブ固定領域１０２は１個所で、１０ｍｍφである。周囲はテフロン（登録商標）系の撥水性樹脂１０３がコーティングされている。コーティングの厚さは、おおむね、５０μｍである。プローブ固定領域１０２には２６塩基長のポリＴの３’末端に５塩基長のランダム配列オリゴＤＮＡが５’末端で結合されている。これは、ポリＴだけではｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの安定性が十分確保できないためである。プローブは細胞内のｍＲＮＡと容易にインタラクションするようにＰＮＡ（ペプチドヌクレイックアシド）でできている。ＰＮＡは通常のＤＮＡのようにリン酸ジエステル結合に由来するマイナス荷電を持たないので、標的となるＤＮＡとの間に静電的反発力が働かない。このため、ハイブリダイゼーションの効率が高くなる効果がある。

さらに、プローブをＰＮＡとして、その電荷を持たない特性とすることは、静電的な反発力を生じないので、標的ｍＲＮＡのポリＡ部分が分子内で他の部位と部分的２本鎖を形成していても競争的に２本鎖に潜りこみ、競争的にハイブリダイゼーションすることができるため、変性操作をしなくてもハイブリダイゼーションが進行する。

プローブの固定法は、Ａ．Ｋｕｍａｒらの方法（Nucleic Acids Research (2000) 28, No.14 e71記載の方法を改変し、あらかじめ合成ＰＮＡのアミノ末端にトリメトキシシラン残基を導入したシラン化ＤＮＡプローブを、チップ基板上のエレメント部分に塗布してプローブを固定する。シラン化ＤＮＡプローブは、たとえば、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランのグリシドキシ基をＰＮＡのアミノ末端に結合させて得ることができる。あるいは、酸化シリコンの表面にアミノプロピルトリメトキシシランを反応能させてシランカップリング反応でアミノ基を導入し、このアミノ基にフェニレンジイソチオシアナートを反応させ、シリコン基板表面にイソチオシアナート基を導入し、このイソチオシアナート基とアミノ基を５’末端に導入したＤＮＡプローブを反応させて固定してもよい（Nucleic Acids Research (1999) 27, No.9, 1970-1977）。

例として、大腸がん切除組織断片から定法に従い抽出したトータルＲＮＡ用液５０μｌに各種ｍＲＮＡに相補的な４０塩基程度の配列に区別がつくようにガリウム、アルミニウム、イットリウム、クロムの比率を変えた金ベースのナノ粒子（１０μｍ）の０．１％（ｗ／ｖ）溶液を混合したものを、特別の処理を行なわずにチップ１のプローブ固定領域１０２に添加する。チップは予め４５℃に保温しておく。約１ｍｍのギャップを設けてプローブ固定領域の上面に４０ｍｍφのガラス板をのせ、ガラス板を偏心させながらプローブ固定領域１０２の縁がガラス板の縁にほぼ一致するように円弧を描きながら移動させる。移動の速度は５秒に一回の割合である。これで高速にハイブリダイゼーションを行わせることができる。チップ１のプローブ固定領域１０２には、チップ１に固定したプローブ、ｍＲＮＡ、粒子標識プローブがこの順でサンドイッチ状に結合したものとなる。未反応の粒子標識プローブやＲＮＡは洗浄除去する。

図２は、図１で説明したプローブチップ１を走査型電子顕微鏡で観察する態様を説明する概念図である。

チップ１のプローブ固定領域１０２表面には、多数のプローブが固着されているが、ここでは、単純化して、固着されたプローブ１１−１４のそれぞれに、ＤＮＡ断片２０１−２０４がハイブリダイズし、これらのＤＮＡ断片が、金ナノ粒子２１−２４で標識されているものとする。金ナノ粒子２１，２２，２３，および２４は、それぞれ（ガリウム：アルミニウム：イットリウム：クロム）の比率が（１：１：１：０）、（１：１：０：１）、（１：０：１：１）、（１：１：１：１）とする。各金属の金に対する混合比の最大は２０％とする。これは、ナノ粒子表面にｍＲＮＡ特異的プローブを固定するのに、プローブの５’末端に導入したアルカンチオールと金との結合を利用するためである。金とチオールは酸化的な条件やＵＶ照射に弱いが、通常のハイブリダイゼーション条件では、きわめて、安定な結合力を得ることができる。このため実施例１では、予めプローブの５’末端に導入したアルカンチオールと金ナノ粒子を１０対１で混合し、表面にｍＲＮＡの配列特異的なプローブを固定した一連の金ナノ粒子を得る。

チップ１のプローブ固定領域１０２表面上に、金ナノ粒子を検出する走査型電子顕微鏡３００の電子銃３００−１、集束レンズ３００−２、走査コイル３００−３が設けられる。電子銃３００−１から発せられた電子線３００−４の電子は金ナノ粒子２１，２２，２３，および２４に衝突し、金ナノ粒子は２次電子３００−５を放出する。この２次電子を検出器３００−６が捕える。検出器３００−６で検出された２次電子を基に、いわゆるＳＥＭ像が得られ、金ナノ粒子の位置と大きさが特定される。

一方、本発明では、電子線３００−４の電子が金ナノ粒子２１，２２，２３，および２４に衝突したとき、金ナノ粒子２１，２２，２３，および２４が発する、金ナノ粒子の構成元素に特異的な波長のＸ線３００−７を検出するエネルギー分散型特性Ｘ線検出器３００−８を備える。すなわち、エネルギー分散型特性Ｘ線検出器３００−８が検出する構成元素に対応した波長信号から元素分析像を得る。あるいはＸ線分光結晶で分光して検出する波長分散型Ｘ線分光法を用いて元素分析像を得る。

エネルギー分散型特性Ｘ線検出器３００−８から得られる元素分析像は、金ナノ粒子の位置と構成元素の情報を持つものとなる。したがって、ＳＥＭ像と元素分析像とを対応させて見れば、金ナノ粒子標識プローブがハイブリダイズしたｍＲＮＡ分子を同定することができる。

図３は、ＳＥＭ像と元素分析像との対応から金ナノ粒子標識プローブがハイブリダイズしたｍＲＮＡ分子を同定する方法を説明する概念図である。

例として、プローブ固定領域１０２表面上に、ＥｐＣＡＭのｍＲＮＡ配列に対応する配列を持つオリゴＰＮＡ（２８塩基）、同じくガン細胞での発現が多くなるといわれているＣＤ４４のｍＲＮＡ配列に対応する配列を持つオリゴＰＮＡ（２６塩基）、ＣＥＡのｍＲＮＡ配列に対応する配列を持つオリゴＰＮＡ（２９塩基）を、それぞれ、プローブとして固定する。これらのプローブにハイブリダイズするｍＲＮＡのアミノ末端にそれぞれ、ガリウム：アルミニウム：イットリウム：クロム）の比率が（１：１：１：０）、（１：１：０：１）、（１：０：１：１）を含む金ナノ粒子（１０ｎｍ径）を標識として付加した場合を説明する。

図３において、３０はＳＥＭ像である。ＳＥＭ像にはすべての粒子が写っている。３１，３２，３３、３４はそれぞれガリウム像、アルミニウム像、イットリウム像、クロム像である。ＳＥＭ像３０とガリウム像３１、アルミニウム像３２、イットリウム像３３およびクロム像３４を対比してみると、ＳＥＭ像３０とガリウム像３１は同一であるが、アルミニウム像３２、イットリウム像３３およびクロム像３４は、ＳＥＭ像３０に対して、破線で示す位置の粒子が表れていない。すなわち、ガリウムは、標識となる金ナノ粒子の全てに含まれているので、ガリウム像３１はＳＥＭ像３０と同様、すべての粒子が表れることになる。アルミニウム像３２は、破線で示す位置の粒子が表れていない。すなわち、この位置にあるプローブにハイブリダイズしているｍＲＮＡは、アルミニウムを含まない金ナノ粒子で標識されているＣＥＡ分子であることがわかる。これは、ＳＥＭ像３０に参照符号３７で示す金ナノ粒子である。同様に、イットリウム像３３は、破線で示す位置の二つの粒子が表れていない。すなわち、この位置にあるプローブにハイブリダイズしているｍＲＮＡは、イットリウムを含まない金ナノ粒子で標識されているＣＤ４４分子であることがわかる。これは、ＳＥＭ像３０に参照符号３６で示す金ナノ粒子である。さらに、クロム像３４は、破線で示す位置の三つの粒子が表れていない。すなわち、この位置にあるプローブにハイブリダイズしているｍＲＮＡは、クロムを含まない金ナノ粒子で標識されているＥｐＣＡＭ分子であることがわかる。これは、ＳＥＭ像３０に参照符号３５で示す金ナノ粒子である。

図３では、説明を簡単化するために、すべての粒子の大きさを同じものとしたが、粒子のサイズを変えたものを併用すれば、より多くのものについての識別ができる。勿論、この識別は、計算機の画像処理により実施できるものであることは言うまでもない。

このようにして、本発明を用いればポリＡテールを持つｍＲＮＡを単に捕捉したＤＮＡチップ上で、複数のｍＲＮＡを区別して定量的に測定することができる。ＳＥＭに付属するエネルギー分散型特性Ｘ線検出器あるいは波長分散型Ｘ線分光器は数％の元素比率を識別できるので同一元素で８段程度の階調で識別できる。４種の元素を用いると、４０９６種の粒子識別が可能である。５種の元素を用いると３２７６８種の粒子識別がわずか５枚の像を撮影することで達成できる。

このように、本発明の元素比率を変えた粒子を標識に用いることで、複雑な構造で製造が大変な従来の区画区分方のプローブチップを使用せずに、しかも、粒子カウント技術を用いることで単分子レベルのｍＲＮＡプロファイリングが可能となる。

（実施例２）
実施例２では抗原抗体反応による生体物質のマルチ検出について述べる。ここでは図１を参照して説明した基板と同一の基板を使用するものとする。プローブ固定領域１０２は、実施例２では、抗原抗体反応の反応部として使用され、反応部１０２に抗ヒト抗血清をアフィニティー精製したＩｇＧ分画を固定する。測定対象の血清中にはヒトアルブミンやヒトＩｇＧが多量に含まれるので、これらが反応しないように、予め、反応部１０２は抗ヒトアルブミン抗体と抗ヒトＩｇＧ抗体を除去しておくことが必要である。このために、アフィニティー精製抗ヒト抗血清ＩｇＧ分画をヒトアルブミンとヒトＩｇＧで吸収したＩｇＧ分画を調製し、これを反応部１０２に固定し、余計な吸着席をフォスファチジルコリンでマスクする。次いで、反応部１０２を１０ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含む０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ：ｐＨ７．４）で洗浄し、未反応のヒトＩｇＧを除去する。

ヒト血清試料を１００μｌを反応部１０２に添加し、実施例１と同様に１０分間攪拌すると、血清中に存在するタンパク質が抗原抗体反応を起こし反応部１０２上の抗体に捕捉される。

これとは別に、ナノ粒子標識抗体を準備する。たとえば、アフィニティー精製ポリクローナル抗ＡＦＰ抗体と抗ＣＥＡ抗体をパパイン分解して得られるＦ（ａｂ’）_２断片にＳＨ基を導入する。挿入されるＳＨ基はＦ（ａｂ’）_２１分子あたり３〜４分子である。２０ｎｍφの金をベースとするパラジウムとクロムの比率が（２０：８０）のものと（３０：７０）の金ナノ粒子に、上記の様にして調製したＳＨ基を含む抗ＡＦＰ抗体と抗ＣＥＡ抗体由来のＦ（ａｂ’）_２を混合し、表面にＦ（ａｂ’）_２が結合した金ナノ粒子を得る。

試料として１ｚｍｏｌ／μｌの濃度のＡＦＰ単独、５ｚｍｏｌ／μｌの濃度のＣＥＡ単独、何も入っていないコントロールを用意する。溶媒は０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と０．５％ＢＡＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）である。

プロテインチップに各溶液を反応させ、さらに金ナノ粒子標識Ｆ（ａｂ’）_２を反応させる。反応時間は最初の試料反応が５分間、金ナノ粒子標識Ｆ（ａｂ’）_２の反応が５分間である。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と０．５％ＢＡＳを含む緩衝液で洗浄し、走査型電子顕微鏡とエネルギー分散型特性X線検出器で金ナノ粒子を検出し、パラジウムとクロムの存在比からＡＦＰとＣＥＡ分子をカウントする。

上述の反応部１０２上の抗体に捕捉されているタンパク質に、ＡＦＰだけを反応させ場合、タンパク質に結合したＡＦＰと認識できる金ナノ粒子は１２０粒子／μｍ^２、その他の金ナノ粒子は２粒子／μｍ^２が検出される。同様に、ＣＥＡだけを反応させた場合、タンパク質に結合したＣＥＡと認識できる金ナノ粒子は１５８０粒子／μｍ^２、その他の金ナノ粒子は６粒子／μｍ^２が検出される。コントロール溶液では２〜４粒子／μｍ^２の金ナノ粒子しか検出されない。

本発明では、標識となる粒子の合金を構成する金属ないし半導体が、周期律表で原子番号７９番までで４３番を除く遷移金属および１３番、３１番、３２番、４９番、５０番、５１番、８１番、８２番、８３番の金属、１４番、３３番、３４番、５２番の半導体のいずれかから選択できる。

本発明は、上述したように、いくつかの実施例の形で実施できるが、いずれの場合でも、ハイブリダイズした試料ＤＮＡなどを実質的に１分子ごとに検出することになるので、感度的には従来法を凌駕する感度が得られる。極微量体積で極微量ＤＮＡ（ＲＮＡ）の検出が可能となるので、従来は不可能であったＰＣＲによる前処理増幅をしなくても、標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）の検出が可能となる。検出に標識粒子の大きさや形状を変えることができるので、６種以上１０種程度の異なるサンプルを同一エレメントでマルチ解析できるようになる。この技術により従来のディファレンシャルハイブリダイゼーションへの利用のほか、同一プローブでエレメントにサンプルポリヌクレオチドを捕捉し、異なる標識プローブで検出する使い方ができるようになる。本発明のマルチ解析技術により、オルターナティブスプライシングの検出や、複数ＳＮＰのタイピングがひとつのエレメントで行えるようになるメリットがある。

（実施例３）
実施例１の簡易検出版として、低分解能のＳＥＭや０．１μｍ程度の分解能のＸ線検出器を用いる方法について説明する。このような低分解の装置は卓上にすえつけることができるほどの小型で、しかも価格も通常のＸ線検出器つきＳＥＭより安くなる効果がある。あるいは１μｍ^２程度の範囲の元素分析を行う電子線マイクロプローブによる微小部Ｘ線分析法（electron probe X-ray microanalyser, ＥＰＭＡ）での解析例について説明する。分解能が０．１μｍ程度では、金ナノ粒子の粒子毎のカウントや元素分析像を得ることができない。この場合は、Ｘ線を当てる範囲の中の各元素の元素分析値を獲ることになる。本実施例では、各ＤＮＡプローブに対してあまり多くの種類の元素で標識することはできず、一つの粒子に標識として使用する元素は２〜３種で、しかもの量比の分解のは３種程度となる。あるいは、基本的に１種類の元素による標識の場合は、使用する元素の数だけ標識が可能であり、同時に分析できるＤＮＡや生体物質は数十種類となる。

次に、第２の実施態様について説明する。

（実施例４）
図４は本発明の実施例４の生体試料測定の概念を示す図である。実施例１と異なる点は、インデクシング用の粒子を用いることにある。シリコン基板１０１にはプローブは固定されていない。シリコン基板１０１は単に面積が規定された計測用の容器で、計測時にインデクシング粒子を固定するのに用いられる。大きさは２０×２０ｍｍである。インデクシング粒子を固定するインデクシング粒子固定領域１０２は１個所で、３ｍｍφである。基板１０１の上にＳＵ８を塗布し、紫外線硬化により土手１０３を作成している。もちろんエッチングにより直接基盤を掘り下げて作成してもよい。土手１０３は液を保持できる構造であればよいが、後に述べるように保持する液体が７０％アルコールを含む水溶液である場合もあるので、このケースでは少なくても１５０μｍの高さとしたほうがよい。

４１〜４４は、それぞれ、異なる元素組成で構成されたインデクシング粒子である。このインデクシング粒子は、第１の実施態様との対応で言えば、異なる元素組成で構成された標識用の金ナノ粒子２１〜２４に対応するが、以下の点で異なる。第１の実施態様では、標識用の金ナノ粒子２１〜２４の元素組成を異なるものとし、これが、電子線の照射により金ナノ粒子の構成元素に特異的な波長のＸ線を発生することに着目して標識用の金ナノ粒子を特定し、特異的生体物質（例えば、ターゲットＤＮＡ断片）を検出した。これに対し、第２の実施態様では、インデクシング粒子４１〜４４を、その表面にプローブを固定するための粒子とし、これとは別にプローブに捕捉された特異的生体物質の量を計数するための標識粒子を用いることとした。すなわち、第２の実施態様では、電子線を照射されたインデクシング粒子４１〜４４が粒子の構成元素に特異的な波長のＸ線を発生することに着目して、インデクシング粒子の位置を特定し、そのインデクシング粒子に捕捉された特異的生体物質を検出するものとした。たとえばインデクシング用の粒子には金以外の複数の元素を含むもの、係数用の標識粒子には金ナノ粒子を用いる。

インデクシング粒子のベースとなる粒子は、インデクシングに使用される元素を含まないポリスチレン性とし、元素分析で前記インデクシング粒子中の識別用元素の検出を妨げないようにする。あるいは、ポリスチレンの中に鉄やコバルトなどの常磁性物質を埋設したポリスチレン磁性粒子を用いて、この表面に識別用の元素を蒸着固定してもよい。識別用元素を含む粒子の調製には蒸着以外にも多々考えられる。たとえば、各識別用元素をナノ粒子として所定の数をポリスチレン球に練りこんでもよい。この場合は、照射する電子線のエネルギーをポリスチレン球の内側にまで高くすることで各粒子の元素信号を得ることができる。

磁性粒子を用いると後に述べるように反応操作や粒子検出操作における粒子の操作が磁石で行えるため容易になる利点がある。通常のポリスチレンの場合は、遠心やフィルターにより粒子を回収する方法で問題なく操作を行うことができる。

インデクシング粒子４１〜４４に付着している黒丸は、係数用の標識粒子であり、後述するように、インデクシング粒子４１〜４４に固定されたプローブに捕捉された特異的生体物質の標識粒子である。標識粒子はインデクシング粒子４１〜４４の表面に捕捉される特異的生体物質の量を測定するのに用いられる。インデクシング粒子４１〜４４は基板１０１のインデクシング粒子固定領域１０２（３ｍｍφ）に固定されている。インデクシング粒子４１〜４４と標識粒子で標識されたターゲットとなる特異的生体物質を含む試料とを溶液中で混合して、インデクシング粒子４１〜４４に固定されたプローブに特異的生体物質を捕捉させた後、この混合溶液をプローブ固定領域１０２に所定量滴下して乾燥してインデクシング粒子領域１０２にインデクシング粒子を固定する。

インデクシング粒子のベースがポリスチレン粒子である場合は、プローブ固定領域１０２に混合溶液を１μｌ滴下した後、減圧乾燥してインデクシング粒子を固定する。このため、インデクシング粒子固定領域１０２は液滴を保持する機構を付加する必要があり、実施例３では、基板１０１の上にＳＵ８を塗布し、紫外線硬化により土手１０３を作成している。もちろんエッチングにより、直接、基板１０１を掘り下げて作成してもよい。土手１０３は液を保持できる構造であればよいが、後に述べるように保持する液体が７０％アルコールを含む水溶液である場合もあるので、このケースでは少なくても１５０μｍの高さとしたほうが良い。

インデクシング粒子がインデクシング粒子領域１０２に固定された状態で、実施例１と同様に、基板１０１をエネルギー分散型特性Ｘ線検出器あるいは波長分散型Ｘ線分光器を持つ走査型電子顕微鏡３００に装着する。走査型電子顕微鏡３００は電子銃３００−１、集束レンズ３００−２、走査コイル３００−３を備え、電子銃３００−１から発せられた電子線３００−４の電子はインデクシング粒子４１〜４４に衝突し、インデクシング粒子４１〜４４は２次電子３００−５を放出する。この２次電子を検出器３００−６が捕える。検出器３００−６で検出された２次電子を基に、いわゆるＳＥＭ像が得られ、インデクシング粒子４１〜４４の位置と大きさが特定される。さらに、このときインデクシング粒子４１〜４４の表面に結合している標識粒子が検出される。一方、電子線３００−４の電子がインデクシング粒子４１〜４４に衝突したとき、インデクシング粒子４１〜４４が発する、個々のインデクシング粒子構成元素に特異的な波長のＸ線３００−７を検出するエネルギー分散型特性Ｘ線検出器あるいは波長分散型Ｘ線分光器３００−８を備える。すなわち、エネルギー分散型特性Ｘ線検出器あるいは波長分散型Ｘ線分光器３００−８が検出する構成元素に対応した波長信号から元素分析像を得る。これにより、インデクシング粒子はそのサイズと元素により表面に固定されているプローブの種類を区別することができる。

図５は、検出器３００−６で得られたＳＥＭ像と、エネルギー分散型特性Ｘ線検出器３００−８から得られた元素分析像から、インデクシング粒子４１〜４４の位置と大きさの特定およびインデクシング粒子４１〜４４にハイブリダイズした標識粒子が付加された特異的生体物質の評価について説明する図である。ここでは、インデクシング粒子４１〜４４の元素の組成を、実施例１と同様に、ガリウム：アルミニウム：イットリウム：クロム）の比率が、インデクシング粒子４１は（１：１：１：０）、インデクシング粒子４２は（１：１：０：１）、インデクシング粒子４３は（１：０：１：１）、および、インデクシング粒子４４は（０：１：１：１）を含むものとし、粒子の大きさは、０．５〜５μｍφとした場合を説明する。

図５において、５０はＳＥＭ像である。ＳＥＭ像にはすべてのインデクシング粒子４１〜４４と、これらに捕捉されている特異的生体物質の標識粒子が写っている。５１，５２，５３および５４は、それぞれ、クロム像、イットリウム像、アルミニウム像およびガリウム像の元素分析像である。ＳＥＭ像５０とクロム像５１、イットリウム像５２、アルミニウム像５３およびガリウム像５４を対比してみると、クロム像５１では、破線で示す位置のインデクシング粒子４１に対応する位置の粒子像が表れていない。同様に、イットリウム像５２、アルミニウム像５３およびガリウム像５４では、ＳＥＭ像３０に対して、インデクシング粒子４２，４３および４４に対応する位置の粒子像が表れていない。すなわち、インデクシング粒子４１，４２，４３および４４のそれぞれは、その粒子の組成の元素に、それぞれ、クロム、イットリウム、アルミニウムおよびガリウムを含まないものとされているので、元素分析像に表れてこないのである。なお、元素分析像には標識粒子が金ナノ粒子である場合には、原理的に表れてこない。しかし、標識粒子が電子線の照射を受けて、インデクシング粒子の組成の元素と近い特異的な波長のＸ線を出すものであるときには元素分析像に表れることになる。したがって、ＳＥＭ像５０との対比においてノイズを含むものとなるが、致命的なものではない。

したがって、ＳＥＭ像５０と元素分析像５１〜５４との対比で、インデクシング粒子４１〜４４を特定することができる。また、ＳＥＭ像５０には、標識粒子が表れているから、これを計数し、インデクシング粒子４１〜４４の特定結果と合わせて評価すれば、どのインデクシング粒子に、どの程度の標識粒子があるか、別な言い方をすれば、どの特異的生体物質が、その試料にあったのかと言うことが評価できる。ここでは、簡便のため、４個の同一サイズの粒子で特定元素を含むか含まないかの例についての簡単な模式図としたが、インデクシング粒子の粒径をＳＥＭで画像認識で識別できるレベルのサイズで多段階のものとし、さらに、インデクシング粒子の組成を元素分析像を画像認識で識別できるレベルで種々組み合わせることで、粒径×元素の組み合わせ数×各元素の量比、の多くの種類のものにできる。たとえば、インデクシング粒子の粒径が０．５〜５μｍφの間で４段階で、４種の元素量を各々１０段階に変化したものを用意すると４００００種のインデクシング粒子を得ることができる。

ここで、インデクシング粒子に使用できる元素について述べる。エネルギー分散型特性Ｘ線検出器３００−８で分析できる元素は周期律表で５番のＢから９２番のＵまでである。この中の元素であれば重量で１％以上含まれれば検出できる。装置分解能やスペクトルの帰属の問題や基本的に磁性粒子やポリスチレン粒子に混在させて利用するのであるから、判定性分析で区別できるのは１％から２０％程度の範囲で１０段階程度である。磁性粒子をベースにするなら、磁性に関与する元素はインデクシング用に使用できない。よってＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉはインデクシング用の元素から除く。Ｃ、Ｎ、Ｏもポリスチレンの材料であるから不可である。そもそも、これらＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃ、Ｎ、Ｏは自然界に多い元素で、コンタミネーションによる混在が多いのでインデクシング用としては使用は避けるべきである。同様の理由からアルカリ金属（Ｉ族）やアルカリ土類金属（ＩＩ族）、Ａｓまでの１５族、１６族、１７族は除くべきであるし、１８属はすべて気体であるので除くべきである。Ａｌ、Ｓｉ、Ｍｏ、Ｓｎは身の回りに多く存在するので除外する。５属のＶは生体中に比較的多く存在するので除外する。安定同位体の無いあるいは少ないＴｃ、Ｐｍ、Ａｃ、Ｐａ、Ｕも除外する。Ｈｇは担体では液体であるので除外する。以上除外したもの以外をインデクシング用として利用する。すなわち、インデクシング用の元素としては、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｂ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｔｌ、Ｂｉ、Ｔｈを使用することができる。

図６（Ａ）は実施例３のインデクシング粒子４１〜４４とこの表面に固定されたプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａを模式的に示す図、図６（Ｂ）は標識粒子を付加されたプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａにハイブリダイズする特異的生体物質４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂを模式的に示す図、および、図６（Ｃ）はプローブと特異的生体物質とがハイブリダイズした様子を模式的に示す図である。ここでは、プローブとして、ＤＮＡプローブを用いる例について説明する。

図６（Ａ）に示すように、それぞれのインデクシング粒子４１〜４４表面には、それぞれ、特定のプローブが固定される。インデクシング粒子へのプローブ固定は、既存の方法を用いる。たとえば、インデクシング粒子に酸素プラズマを照射して表面に活性基を出し、その後３−アミノエチルアミノプロピルトリメトキシシランを反応させ表面にアミノ基を導入し、無水コハク酸でアミノ基をカルボキシル基に変換し、このカルボキシル基をスクシンイミドエステルの形として５’末端にアミノ基を有するプローブＤＮＡを固定すればよい。プローブＤＮＡにＰＮＡを用いる場合は、プローブＤＮＡのアミノ末端を同様に反応させて得ることができる。図６（Ｂ）に示すプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａにハイブリダイズする特異的生体物質４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂは、当然、プローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａと相補な配列を持つものである。特異的生体物質に標識粒子、例えば、金のナノ粒子（２０ｎｍ）固定は、５’末端にＳＨ基を持つものを合成し、金ナノ粒子と混合することにより調製する。インデクシング粒子４１〜４４と標識粒子を付加された特異的生体物質を含む試料溶液とを混合して、プローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａに特異的生体物質をハイブリダイズさせて、基板１０１のインデクシング粒子固定領域に所定量を滴下して、乾燥させ、前述したように、走査型電子顕微鏡３００により電子線で走査して、ＳＥＭ像と元素分析像を得て、図５で説明した方法で評価できる。

（実施例５）
上述した実施例３の手法をｍＲＮＡの混合物から直接あるいはｃＤＮＡとした後、これらを定量的に検出する場合に適用した例について説明する。

図７（Ａ）は実施例５のインデクシング粒子４１〜４４とこの表面に固定されたプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａを模式的に示す図、図７（Ｂ）はプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａにハイブリダイズするポリＡを付加された特異的生体物質を模式的に示す図、および、図７（Ｃ）はポリＡとハイブリダイズする標識を付加されたポリＴを模式的に示す図である。

図７（Ａ）に示すように、実施例４でも、インデクシング粒子４１〜４４の構成は実施例３と同じとする。すなわち、インデクシング粒子４１〜４４のそれぞれに固有のプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａを固定する。図７（Ｂ）に示すように、試料である特異的生体物質４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂにはポリＡが付加されている。ここで、プローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａと特異的生体物質４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂとは、相補な関係にあるものであることは当然であるが、ｍＲＮＡを直接検出する場合のプローブは、１）ｍＲＮＡのポリＡ末端に一番近いエキソンと２番目に近いエキソンにまたがる３０〜５０塩基の配列に相補な配列をプローブとして用いる。あるいは、ｃＤＮＡとして測定する場合は、２）ｍＲＮＡを定法に従い１本鎖ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ合成後、ＲＮａｓｅＨでｍＲＮＡ配列を除去したものでｍＲＮＡと相補な配列）とした物を試料として用いる場合は、ｍＲＮＡのポリＡ末端に一番近いエキソンと２番目に近いエキソンにまたがる３０〜５０塩基の配列でｍＲＮＡと同じ側の配列をプローブとして用いる。この場合は（Ａ）の４１ａ，４２ａ，４３ａにｃＮＤＡと相補な配列のプローブ、（Ｂ）の４１ｂ，４２ｂ，４３ｂが１本鎖ｃＤＮＡ、（Ｃ）の標識粒子に結合しているポリＴの代わりにポリＡを用いることになる。あるいは、３）２本鎖ｃＤＮＡが試料の場合は、たとえば、ヒトｍＲＮＡ配列のポリＡ末端から最初のＭｂｏＩ配列が現れる場所までの３’末端近傍の配列の一部（３０〜５０塩基）をプローブとして用いる。この場合は、（Ａ）の４１ａ，４２ａ，４３ａにｍＲＮＡと同じ配列のプローブと（Ｃ）の標識粒子に結合しているポリＴの組み合わせか、（Ａ）の４１ａ，４２ａ，４３ａにｍＲＮＡに相補な配列のプローブと（Ｃ）の標識粒子に結合しているポリＡのいずれかの組み合わせを用いることができる。あるいは、２本鎖ｄＤＮＡを利用する場合に限り、ＭｂｏＩ切断末端に任意の合成ＤＮＡをＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション反応で導入し、これに相補な配列をポリＴの代わりに標識粒子に結合した（Ｃ）を用いることもできる。

ここでは代表例として１）のケースで説明する。図７（Ａ）のインデクシング粒子へのプローブ固定は、既存の方法を用いる。たとえば、インデクシング粒子に酸素プラズマを照射して表面に活性基を出し、その後３−アミノエチルアミノプロピルトリメトキシシランを反応させ表面にアミノ基を導入し、無水コハク酸でアミノ基をカルボキシル基に変換し、このカルボキシル基をスクシンイミドエステルの形として５’末端にアミノ基を有するプローブＤＮＡを固定すればよい。プローブＤＮＡにＰＮＡを用いる場合は、プローブＤＮＡのアミノ末端を同様に反応させて得ることができる。

図７（Ｃ）に示すように、これとは別に、ポリＴ（Ｔ３０）を固定したポリＴ−金ナノ粒子（２０ｎｍ）を準備する。ポリＴの金ナノ粒子への固定は、５’末端にＳＨ基を持つものを合成し、金ナノ粒子と混合することにより調製する。

（Ｂ）記載の試料ｍＲＮＡ混合液（ＲＮａｓｅ阻害剤含む）と（Ａ）記載のインデクシング粒子懸濁液と（Ｃ）記載のポリＴ−金ナノ粒子懸濁液を混合し、７０℃に過熱する。反応液は０．１〜１Ｍ ＮａＣｌと分散剤として界面活性剤を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いる。１時間４５℃で緩やかに攪拌し、常に粒子が懸濁状態になるように保つ。すると、各ｍＲＮＡ４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂは、相補的なＤＮＡプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａを有するインデクシング粒子４１〜４４に捕捉され、捕捉されたｍＲＮＡのポリＡ部分にはポリＴ−金ナノ粒子が結合する。

図８は、粒子と試料と標識との混合操作で、インデクシング粒子４１〜４４のＤＮＡプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａとｍＲＮＡ４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂとポリＴ−金ナノ粒子のハイブリッドが得られた結果を示す図である。各ハイブリッドではインデクシング粒子とその表面のプローブが対応しており、更にプローブと個々のｍＲＮＡが対応している。この場合、一部のポリＴ−金ナノ粒子のポリＴは、ｍＲＮＡのポリＡと逆に結合したり、１塩基ずれて結合したりする可能性があるが、本発明の効果から見れば、何ら支障はない。図８では、４１〜４４に固定するプローブの４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａを３’末端で固定したものと、ポリＴをその５’末端でこていした金ナノ粒子を用いている。このため、図８のようなコンプレックス構造になるが、４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａのプローブを５’末端で固定したものを用いることも可能である。

実施例５で得られるハイブリッドを持つ基板は、走査型電子顕微鏡３００により電子線で走査して、ＳＥＭ像と元素分析像を得て、図５で説明した方法で評価できる。

図９は、図８で説明した、インデクシング粒子と試料ｍＲＮＡとポリＴ−金ナノ粒子を同時に反応させるホモジニアス反応よりも、さらに高精度を期待する処理の途中経過の状況を示す図である。まず、インデクシング粒子４１〜４４のＤＮＡプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａとｍＲＮＡ４１ｂ，４２ｂ，４３ｂを反応させて、インデクシング粒子と試料ｍＲＮＡハイブリッドを調製した後、不要な成分を洗浄除去する。次いで、図７（Ｃ）に示したポリＴ−金ナノ粒子を反応させることにすれば良い。

実施例４，５では試料中に含まれる複数の生体物質を、同時に、固有のプローブを固定しているインデクシング粒子に振り分けて検出することができる。このとき、試料とインデクシング粒子の反応を懸濁状態で一度に行えるので、基板表面で反応を行うＤＮＡマイクロアレー（ＤＮＡチップ）やプロテインアレーに比べ、反応が均一に行える利点、粒子が溶媒中に分散しているので反応が速い利点を生かした多項目同時測定が可能となる。

たとえば、大腸がん切除組織断片を液体窒素凍結しこれを直接フェノールクロロホルムに加えホモジナイズしトータルＲＮＡを抽出する定法にしたが調整するトータルＲＮＡ用液５０μｌに各種ｍＲＮＡに相補的な４０塩基程度の配列に区別がつくように、ここでは色々なプローブを固定したガリウム、イットリウム、セシウム、オスミウム、プラチニウムの含有量を各々８段階に変えた磁気粒子（２．８μｍ）の０．１％（ｗ／ｖ）溶液を混合したものをインデクシング粒子として加える。塩濃度が１Ｍ、クエン酸濃度が５０ｍＭになる条件とし、７０℃に１分間放置した後４５℃で１時間緩やかに攪拌し、ハイブリダイゼーションを行う。磁石を容器の外から近づけ、磁性粒子を引き寄せ上澄みを除去し、続いて１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄する。同一緩衝液に金ナノ粒子標識ポリＴを懸濁し、１時間室温で攪拌する。

ハイブリダイゼーション反応できたインデクシング粒子−ｍＲＮＡ−る金ナノ粒子標識ポリＴコンプレックスを磁石で容器の壁に集め、１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄した後、７０％エタノール水溶液で洗浄し、７０％エタノール１００μｌに懸濁する。１μｌを実施例４の容器１０２（図４）に滴下し、３時間減圧乾燥させる。減圧時間に時間をかけるのは走査型電子顕微鏡の高度真空に影響を与えないためである。

このようにして調製した粒子ハイブリッドを走査型電子顕微鏡で粒子を観察する。この時点で磁性粒子表面に捕捉されている金コロイド粒子の数がカウントできる。次に検出をエネルギー分散型特性Ｘ線検出モードに切り替える。電子線３００−４がインデクシング粒子にあたるとその表面にある元素に特異的な波長のＸ線が発する。この特異的波長のＸ線をエネルギー分散型特性Ｘ線検出器あるいは波長分散型Ｘ線検出器３００−８で検出し、元素分析を行う。この操作により金ナノ粒子の結合している磁性粒子のインデクシングができ、対応する金ナノ粒子標識プローブがハイブリダイズしたｍＲＮＡ分子の量が同定される。ここで、金ナノ粒子１個はｍＲＮＡ分子１分子に対応する。

実施例５のように、インデクシング用の元素をガリウム、イットリウム、セシウム、オスミウム、プラチニウムの各元素の組成を８段階変えたものを用いると２５０００種のヒトｍＲＮＡのすべてを網羅的に測定できる。

このように、本発明の元素含有量を変えた粒子を用いることで、複雑な構造で製造が大変な従来の区画区分方のプローブチップを使用せずに、しかも、粒子カウント技術を用いることで単分子レベルのｍＲＮＡプロファイリングが可能となる。

（実施例６）
実施例４，５では、個別のプローブＤＮＡを固定したインデクシング粒子と共通配列のポリＴを持つ検出定量用粒子を用いたが、実施例６では更に特異性を上げるために、個別配列プローブ４１ａ〜４４ａを持つインデクシング粒子４１〜４４と、インデクシング粒子に対応するプローブ４１ｄ〜４４ｄを有する係数用標識粒子を用いる系に発展させることができる。これについて説明する。

図１０（Ａ）は実施例４，５と同様に、インデクシング粒子４１〜４５の表面に固定されている個別のプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａ、４４ａおよび４５ａを模式的に示す図、図１０（Ｂ）は測定したいｍＲＮＡ配列を有する試料で、プローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａにハイブリダイズするポリＡを持つ特異的生体物質４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂに、さらに、同一の特異的生体物質の別の部分の配列のプローブ４１ｃ、４２ｃ、４３ｃおよび４４ｃを付加した状態を模式的に示す図、図１０（Ｃ）は、上記配列のプローブ４１ｃ、４２ｃ、４３ｃ、４４ｃおよび４５ｃ（ここでは４５ｃを有する特異物質は（Ｂ）試料中に無い）に相補な合成オリゴヌクレオチド（２０〜５０塩基）４１ｄ、４２ｄ、４３ｄ、４４ｄを金ナノ粒子（２０ｎｍ）で標識した例を模式的に示す図である。図１０（Ｄ）は、ハイブリダイゼーション後のインデクシング粒子と試料と金ナノ粒子オリゴヌクレオチドの状態を示す図である。

プローブ４１ａ，４２ａ，４３ａ、４４ａおよび４５ａが固定されているインデクシング粒子４１〜４５を（Ｂ）記載のｍＲＮＡ混合試料と反応させて、各ｍＲＮＡのプローブ４１ｂ、４２ｂ、４３ｂ、４４ｂの配列でインデクシング粒子に選択的に捕捉した後、インデクシング粒子と対応する配列すなわち同一のｍＲＮＡ配列の別の部分４１ｃ、４２ｃ、４３ｃ、４４ｃに相補的な配列の合成オリゴヌクレオチド（２０〜５０塩基）４１ｄ、４２ｄ、４３ｄ、４４ｄを有する金ナノ粒子（２０ｎｍ）を反応させる。インデクシング粒子には磁性粒子を用いる。まず、ｍＲＮＡのうちβ―グロビンやβ―アクチンのように多量に存在するｍＲＮＡに対するインデクシング粒子を加え、反応したもののみを磁石で引き寄せ除去する。ここでは大まかに不必要なｍＲＮＡを除くだけなので、ハイブリダイゼーションの反応時間は１５分間程度と短めでよい。次に実際に測定したい項目のｍＲＮＡに対応するインデクシング粒子を加え３０分間反応させた後、未反応の物質を洗浄除去する。更にｍＲＮＡ配列に対応するプローブを有する金ナノ粒子を加え、３０分間反応させる。ここで重要なのは、金粒子で標識されている合成オリゴヌクレオチド４１ｄ、４２ｄ、４３ｄ、４４ｄ、４５ｄは混合物である点である。したがって、得られる粒子ハイブリッドには、ハイブリッド４１ｅ、４２ｅ、４３ｅ、４４ｅのみに金ナノ粒子４６が検出され、試料中に標的となる物質がない４５ｅには金ナノ粒子が実質的に検出されない。

実施例６のメリットを述べる。たとえば、ｍＲＮＡが類似の配列を持っている場合を考える。図１０（Ｂ）におけるｍＲＮＡの４１ｂが４インデクシング粒子のプローブ４１ａの他、プローブ４２ａにもハイブリダイズする場合を想定する。ＤＮＡハイブリダイゼーションではこのようなケースは頻繁に起こりうる。すなわちインデクシング粒子４２の表面には本来の配列４２ｂを持つｍＲＮＡの他、アーティファクトとして４１ｂの配列を持つｍＲＮＡも捕捉される。このとき、図１０（Ｃ）のプローブ群を４１ｄを含むものと４２ｄを含むものの２系列に分けて別々に反応させることで、インデクシング粒子のプローブ配列だけでは分離識別できないｍＲＮＡでも図１０（Ｃ）のプローブ配列の違いで分離して計数することができる。インデクシングビーズに対応する配列の金ナノ粒子を添加しないインデクシング粒子群ではインデクシング粒子４２ａ表面に金ナノ粒子が結合せず、検出されないのである。

（実施例７）
実施例７では抗原抗体反応による生体物質のマルチ検出について図１１を参照して述べる。

種々モノクローナル抗体をパパイン分解して得られるＦ（ａｂ’）_２断片を調製する。Ｈｆ、Ｐｔ、Ｃｅの比率を重量％で０％、１％、２％、３％、４％、６％、８％、１０％含むポリスチレンをコートした磁性粒子（３μｍ）をインデクシング粒子として用意する。インデクシング粒子９１，９２，９３，９４のそれぞれに異なるＦ（ａｂ’）_２９１ａ、９２ａ、９３ａ、９４ａを固定し、Ｆ（ａｂ’）_２標識インデクシング粒子を得る。固定法には公知の方法を利用する。たとえば固定法はポリスチレンに官能基を導入したモノマーを少量混入させて表面に露出する官能基を利用して固定してもよいし、酸素プラズマで表面を酸化し、３−アミノエチルアミノプロピルトリメトキシシランを反応させ表面にアミノ基を導入し、無水コハク酸でアミノ基をカルボキシル基に変換し、このカルボキシル基をスクシンイミドエステルの形として５’末端にアミノ基を有するプローブＤＮＡを固定すればよい。Ｆ（ａｂ’）_２としてはたとえば、ＡＦＰ９１ｂ、ＣＥＡ９２ｂ、ＥｐＣＡＭ９３ｂなどに対する抗体を用いることができる。Ｆ（ａｂ’）_２標識粒子混合物はスフィンゴリン脂質でコーティングする。

Ｆ（ａｂ’）_２標識インデクシング粒子混合物に０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２×ＰＢＳ（１×ＰＢＳ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４））で２倍に希釈した血清（健常人由来と肝がん患者由来）を添加する。１０分間３７℃で攪拌した後、磁石でインデクシング粒子を容器壁に吸い寄せ、上澄を捨てる。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄する。測定対象となる抗原のモノクローナル抗体（インデクシング粒子に固定したＦ（ａｂ’）_２とは異なるエピトープのものを使用）に金ナノ粒子を標識したもの９１ｃ、９２ｃ、９３ｃ、９４ｃを添加する。このモノクローナル抗体もＦ（ａｂ’）_２化されており、イミノチオランで分子あたり３分子程度のＳＨ基を導入し、ＳＨ基に金ナノ粒子（２０ｎｍφ）で標識されている。ＡＦＰに対する金ナノ粒子標識抗体を９１ｃ、ＣＥＡに対する金ナノ粒子標識抗体を９２ｃ、ＥｐＣＡＭに対する金ナノ粒子標識抗体を９３ｃ、そのほかの抗原に対する金ナノ粒子標識抗体を９４ｃであらわす。３７℃で１０分間反応させ、インデクシング粒子―抗原―金ナノ粒子ハイブリッド９１ｄ、９２ｄ、９３ｄ、９４ｄを得た後、上澄を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した後、５０％エタノールを含む純水で洗浄する。この工程で、タンパク質は変性するが、インデクシング粒子―抗原―金ナノ粒子ハイブリッドが崩れることはない。１μｌを図４の基容器１０２に添加し、減圧乾燥した後に走査型電子顕微鏡で形状と元素分析を行う。

その結果、ＡＦＰに対するインデクシングビーズの表面には健常人由来の血清で６４個の金ナノ粒子、がん患者由来の血清で３２００個の様に、がん患者由来の血清を用いる場合のほうが多くの金ナノ粒子が検出される。ＣＥＡやＥｐＣＡＭでは大きな変動は無く、この検体ではいずれもこれらに対するインデクシングビーズ表面に３０〜１００固程度の金ナノ粒子が観察されるだけである。

本発明は、上述したように、いくつかの実施例の形で実施できるが、いずれの場合でも、ハイブリダイズした試料ＤＮＡなどを実質的に１分子ごとに検出することになるので、感度的には従来法を凌駕する感度が得られる。極微量体積で極微量ＤＮＡ（ＲＮＡ）の検出が可能となるので、従来は不可能であったＰＣＲによる前処理増幅無しでの標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）の検出が可能となる。検出に標識粒子の大きさや形状を変えることができるので、６種以上１０種程度の異なるサンプルを同一エレメントでマルチ解析できるようになる。この技術により従来のディファレンシャルハイブリダイゼーションへの利用のほか、同一プローブでエレメントにサンプルポリヌクレオチドを捕捉し、異なる標識プローブで検出する使い方ができるようになる。本発明のマルチ解析技術により、オルターナティブスプライシングの検出や、複数ＳＮＰのタイピングがひとつのエレメントで行えるようになるメリットがある。

本発明の実施例１のＤＮＡチップの一部を斜視図で示す概念図である。 図１で説明したプローブチップ１を走査型電子顕微鏡で観察する態様を説明する概念図である。 ＳＥＭ像と元素分析像との対応から金ナノ粒子標識プローブがハイブリダイズしたｍＲＮＡ分子を同定する方法を説明する概念図である。 本発明の実施例３の生体試料測定の概念を示す図である。 検出器３００−６で得られたＳＥＭ像と、エネルギー分散型特性Ｘ線検出器３００−８から得られた元素分析像から、インデクシング粒子４１〜４４の位置と大きさの特定およびインデクシング粒子４１〜４４にハイブリダイズした標識粒子が付加された特異的生体物質の評価について説明する図である。 （Ａ）は実施例３のインデクシング粒子４１〜４４とこの表面に固定されたプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａを模式的に示す図、（Ｂ）は標識粒子を付加されたプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａにハイブリダイズする特異的生体物質４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂを模式的に示す図、および、（Ｃ）はプローブと特異的生体物質とがハイブリダイズした様子を模式的に示す図である。 （Ａ）は実施例４のインデクシング粒子４１〜４４とこの表面に固定されたプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａを模式的に示す図、（Ｂ）はプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａにハイブリダイズするポリＡを付加された特異的生体物質を模式的に示す図、および、（Ｃ）はポリＡとハイブリダイズする標識を付加されたポリＴを模式的に示す図である。 粒子と試料と標識との混合操作で、インデクシング粒子４１〜４４のＤＮＡプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａとｍＲＮＡ４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂとポリＴ−金ナノ粒子のハイブリッドが得られた結果を示す図である。 図８で説明した、インデクシング粒子と試料ｍＲＮＡとポリＴ−金ナノ粒子を同時に反応させるホモジニアス反応よりも、さらに高精度を期待する処理の途中経過の状況を示す図である。 （Ａ）は実施例４，５と同様に、インデクシング粒子４１〜４４の表面に固定されている個別のプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａを模式的に示す図、（Ｂ）はプローブ４１ａ，４２ａ，４３ａおよび４４ａにハイブリダイズするポリＡを付加された特異的生体物質４１ｂ，４２ｂ，４３ｂおよび４４ｂに、さらに、同一の特異的生体物質の別の部分の配列のプローブ４１ｃ、４２ｃ、４３ｃおよび４４ｃを付加した状態を模式的に示す図、（Ｃ）は、上記配列のプローブ４１ｃ、４２ｃ、４３ｃおよび４４ｃに相補な合成オリゴヌクレオチド（２０〜５０塩基）４１ｄ、４２ｄ、４３ｄ、４４ｄを金ナノ粒子（２０ｎｍ）で標識した例を模式的に示す図である。 抗原抗体反応による生体物質のマルチ検出の例を説明する図である。

符号の説明

１…チップ、１０１…シリコン基板、１０２…プローブ固定領域、１０３…テフロン系の撥水性樹脂、１１−１４，４１ａ，４２ａ，４３ａ，４４ａ，４５ａ，４１ｄ，４２ｄ，４３ｄ，４４ｄ，４５ｄ…プローブ、２１−２４,４６…金ナノ粒子、２０１−２０４…ＤＮＡ断片、４１ｂ，４２ｂ，４３ｂ，４４ｂ，４５ｂ…プローブ４１ａ，４２ａ，４３ａ，４４ａ，４５ａにハイブリダイズする特異的生体物質３００…走査型電子顕微鏡、３００−１…電子銃、３００−２…集束レンズ、３００−３…走査コイル、３００−４…電子線、３００−５…２次電子、３００−６…検出器、３００−７…元素に特異的な波長のＸ線、３００−８…エネルギー分散型特性Ｘ線検出器、３０，５０…ＳＥＭ像、３１，５４…ガリウム像、３２，５３…アルミニウム像、３３，５２…イットリウム像、３４，５１…クロム像、３７…ＣＥＡ分子を標識する金ナノ粒子、３６…ＣＤ４４分子を標識する金ナノ粒子、３５…ＥｐＣＡＭ分子を標識する金ナノ粒子、４１〜４４…異なる元素組成で構成されたインデクシング粒子、４１ｂ，４２ｂ，４３ｂ，４４ｂ，４５ｂ，４１ｃ，４２ｃ，４３ｃ，４４ｃ，４５ｃ…特異的生体試料配列部位、４１ｅ，４２ｅ，４３ｅ，４４ｅ，４５ｅ…インデクシング粒子と特指摘生体物質と金ナノ粒子標識プローブとのハイブリッド。

Claims (19)

1. 複数の元素が包含される粒子の複数個を電子線で走査して得られる２次電子から前記粒子の電子線走査画像を得ること、
   複数の元素が包含される粒子の複数個を電子線で走査して得られる２次電子から前記粒子の組成元素に応じた特異的な波長のＸ線から元素分析像を得ること、
   前記電子線走査画像と前記元素分析像を対比して前記複数個の粒子のそれぞれと位置を特定することを特徴とする生体物質の検査法。
2. 複数の元素が包含される粒子をＤＮＡやタンパク質を標識する粒子とし、複数の元素が少なくても２種の遷移金属ないし半導体であることを特徴とする生体試料標識物。
3. 前記粒子が１０ｎｍないし５０ｎｍφのサイズの範囲である請求項２記載の生体試料標識物。
4. 前記粒子が１０ｎｍないし５０ｎｍφのサイズの範囲であり、且つ、粒子を構成する合金の元素組成の比率が種々異なるものとされて、粒径との組み合わせで多数の異なった標識物として分類できる請求項２記載の生体試料標識物。
5. ＤＮＡを標識する粒子であって、少なくても２種の金属元素ないし半導体元素を含み、前記元素組成の比率が種々異なるものとされた一連の粒子で、その粒子がＤＮＡプローブの配列毎に１対１に対応する形で使用されることを特徴とする生体試料標識物。
6. 抗体を標識する粒子であって、少なくても２種の金属元素ないし半導体元素を含み、前記元素の元素組成の比率が種々異なるものとされた一連の粒子で、その粒子が特定のエピトープに反応する抗体毎に１対１に対応する形で使用されることを特徴とする生体試料標識物。
7. 基板上に固定した生体試料と結合可能な生体物質を、少なくても２種の遷移金属元素ないし半導体元素を含む粒子で標識することを特徴とする生体物質の標識法。
8. 基板上に生体試料を固定する工程、前記生体試料と結合可能な生体物質を少なくても２種の金属元素ないし半導体元素を含む粒子で標識する工程、前記合金の粒子で標識された生体物質を前記生体試料に反応させる工程、前記基板上の前記生体試料に結合した生体物質を標識している粒子の元素分析を粒子毎に行う工程からなることを特徴とする生体物質の検査法。
9. 基板上に生体試料を固定する工程、前記生体試料と結合可能な生体物質を少なくても２種の金属元素ないし半導体元素を含む粒子で標識する工程、前記合金の粒子で標識された生体物質を前記生体試料に反応させる工程、前記基板上の前記生体試料に結合した生体物質を標識している粒子を走査型電子顕微鏡の電子線で走査し特定の元素に由来する２次電子線のエネルギー分布を測定し粒子の位置と大きさを同定する工程、前記電子線で走査される前記粒子が発生する特性Ｘ線をエネルギー分散型特性Ｘ線検出器により検出して元素分析結果を得る工程からなる生体物質の検査法。
10. 前記金属ないし半導体が、周期律表で原子番号７９番までで４３番を除く遷移金属および１３番、３１番、３２番、４９番、５０番、５１番、８１番、８２番、８３番の金属、１４番、３３番、３４番、５２番の半導体のいずれかである請求項２ないし６のいずれかに記載の生体試料標識物。
11. 前記金属ないし半導体が、周期律表で原子番号７９番までで４３番を除く遷移金属および１３番、３１番、３２番、４９番、５０番、５１番、８１番、８２番、８３番の金属、１４番、３３番、３４番、５２番の半導体のいずれかである請求項７または８に記載の生体物質の標識法。
12. 前記金属ないし半導体が、周期律表で原子番号７９番までで４３番を除く遷移金属および１３番、３１番、３２番、４９番、５０番、５１番、８１番、８２番、８３番の金属、１４番、３３番、３４番、５２番の半導体のいずれかである請求項９記載の生体物質の検査法。
13. 所定のサイズの粒子であって、少なくても２種の遷移金属元素ないし半導体元素の混合物で構成され、該粒子の表面に検出すべき生体試料と相補結合する塩基配列を持つプローブが固定されている生体物質の検査のための粒子。
14. 前記元素の組成比率を異にする複数の粒子のそれぞれに対して、粒子毎に異なったプローブが固定されている請求項１３記載の生体物質の検査のための粒子。
15. 前記粒子が０．５μｍないし５μｍｍの範囲のものである請求項１３あるいは１４記載の生体物質の検査のための粒子。
16. 前記複数の粒子のそれぞれが、生体試料の特定のエピトープに反応する抗体毎に１対１で対応するものとされた請求項１４記載の生体物質の検査のための粒子。
17. 少なくても２種の遷移金属元素ないし半導体元素の混合物で構成された所定のサイズの粒子の元素の組成比率を異にする複数の粒子のそれぞれに対して、粒子毎に異なった生体物質に親和性のある種々リガンドを１対１で対応して固定した第１の粒子群と、前記生体物質を第２の粒子で標識するとともに各々のリガンドと相補結合させ、
    前記第１の粒子群の各粒子を電子線で走査し、得られる２次電子から前記粒子の電子線走査画像を得て、
    前記第１の粒子群を電子線で走査して得られる２次電子から前記粒子の組成元素に応じた特異的な波長のＸ線から元素分析像を得て、
    前記電子線走査画像と前記元素分析像を対比して前記複数個の第１の粒子のそれぞれと位置を特定し、
    前記第２の粒子数をカウントして、前記複数個の第１の粒子のそれぞれにリガンドしている生体物質の量を評価することを特徴とする生体物質の検査法。
18. 前記少なくても２種の遷移金属元素ないし半導体元素の混合物で構成された所定のサイズの粒子に用いる複数種の元素が、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｂ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｔｌ、Ｂｉ、Ｔｈのいずれかである請求項１３記載の生体物質の検査のための粒子。
19. 少なくても２種の遷移金属元素ないし半導体元素の混合物で構成された所定のサイズの粒子の元素の組成比率を異にする複数の粒子のそれぞれに対して、粒子毎に異なった生体物質に親和性のある種々リガンドを１対１で対応して固定した第１の粒子群と、前記生体物質を第２の粒子で標識するとともに各々のリガンドと相補結合させて、第１の粒子群とともに除去すること、
    少なくても２種の遷移金属元素ないし半導体元素の混合物で構成された所定のサイズの粒子の元素の組成比率を異にする複数の粒子のそれぞれに対して、前記第１の粒子の生体物質に親和性のある種々リガンドとは異なった生体物質に親和性のある種々リガンドを１対１で対応して固定した第２の粒子群と、前記生体物質を第３の粒子で標識するとともに各々のリガンドと相補結合させ、
    前記第１の粒子群の各粒子を電子線で走査し、得られる２次電子から前記粒子の電子線走査画像を得て、
    前記第２の粒子群を電子線で走査して得られる２次電子から前記粒子の組成元素に応じた特異的な波長のＸ線から元素分析像を得て、
    前記電子線走査画像と前記元素分析像を対比して前記複数個の第２の粒子のそれぞれと位置を特定し、
    前記第３の粒子数をカウントして、前記複数個の第２の粒子のそれぞれにリガンドしている生体物質の量を評価することを特徴とする生体物質の検査法。
    

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