JP2006153765A - 分光システム - Google Patents

Abstract

【課題】 光学系のスペクトル強度補正を校正用の光源を用いて行えるようにする分光システムを提供。
【解決手段】 顕微鏡２２０と、共焦点ユニット２３０と、分光装置２４０とを備える分光システムであり、顕微鏡２２０内に、顕微鏡２２０の対物レンズ２２１と同軸の光学系上に配置され、波長校正用光束を対物レンズ２２１に入射させる波長校正用光源部２２５を有する。波長校正用光源部２２５では、光源駆動回路２２５５により、波長校正用光源２２５１に、一定電圧を印加して点灯させる。
【選択図】図１

Description

本発明は、分光システムにおいて用いられるスペクトル校正技術に関する。

分光装置を顕微鏡に装着して実験を行う場合に、顕微鏡の場合は、他の測定装置と異なり固有の問題がある。すなわち、顕微鏡による観察の場合、光路の途中の光学系（対物レンズやフィルタなど）を頻繁に交換するため、光学系毎に補正データを持つ必要がある。さらに日常の実験においても受光素子の劣化に伴い素子感度が変化し、スペクトル情報が正確に得られないという問題が生じる。

上記の問題を解決するためには、試料の発する蛍光・発光信号とは別に、スペクトル感度補正用の光源もしくは光学系を持つ必要がある。

特開平０７−１５９２４０号公報 特開平１１−１２５５６２号公報

顕微鏡のように光学部品の構成要素（対物レンズ・フィルターなど）が頻繁に変わる場合には、それぞれの条件での校正データが必要となる。そのために、各対物レンズ、フィルタ等の組合せに応じて、各々の個別透過率データが必要になる。

校正データの取得のためには、光学系の取り外しが必要なことが多い。しかし、標本の状態を変えずに、校正データを取得することは困難である。そのため、各実験の間での校正データの取得は容易にはできないという問題がある。

本発明の目的は、光学系のスペクトル強度補正を容易に行えるようにする分光システムを提供することにある。

前記目的を達成するため、本発明の第１の態様によれば、
顕微鏡と、共焦点ユニットと、分光装置とを備える分光システムにおいて、
前記顕微鏡は、波長校正用光束を対物レンズに入射させる波長校正用光源部を有し、
前記波長校正用光源部は、波長校正用光源と、この光源に一定電圧を印加して点灯させる光源駆動回路とを有すること、を特徴とする分光システムが提供される。

また、顕微鏡用の観察用光源をさらに有し、前記観察用光源は、試料観察時に、前記波長校正用光源部は、波長校正時に、それぞれ選択的に駆動される構成とすることもできる。

前記波長校正用光源は、前記対物レンズの光軸と同軸の光学系上に配置され留構成とすることができる。

さらに、波長校正用光源を用いたスペクトル補正時に取得される校正用スペクトルデータと予め記憶された参照用スペクトルデータとを比較し、比較した結果に基づき標本観察時に得られたスペクトルデータを補正する情報処理部を有する構成とすることができる。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。以下に説明する実施形態は、顕微鏡の透過光源であるハロゲンランプを標準光源として利用することにより、図１に示す、観察試料から受光素子までにおける分光特性を補正するためのデータを取得することができる
図１に、本発明の実施形態が適用される分光システムの一例を示す。本発明の実施形態に係る分光システムは、図１に示すように、観察用光源２１０と、顕微鏡２２０と、共焦点ユニット２３０と、分光装置２４０と、情報処理装置２５０とを有する。

観察用光源２１０は、波長の異なるレーザダイオード２１１，２１２を有し、これらのレーザダイオード２１１、２１２から出射される光束を、ダイクロイックミラー２１３を介して出力し、光ファイバ２１５を介して共焦点ユニット２３０に入射させる。

顕微鏡装置２２０は、主たる光学系として、試料Ｓｍを観察するための対物レンズ２２１を有し、さらに、波長校正用光源部２２５を有する。対物レンズ２２１は、共焦点ユニット２３０から送られる観察用光束を試料Ｓｍに投射すると共に、試料が発する蛍光等の光を集光して、共焦点ユニット２３０に導くものである。光源校正用光源部２２５は、波長校正用光源２２５１と、コンデンサレンズ（単にコンデンサと略称することもある）２２５２と、波長校正用光源を駆動する光源駆動回路２２５５とを有する。光源駆動回路２２５５は、定電圧駆動機能を備えている。図示していないフォトスイッチにより定電圧駆動モードを選択することができる。定電圧駆動モードでは、９Ｖでハロゲンランプが駆動される。このような一定電圧による駆動を行うことにより、同一波長（色温度）が得られる。従って、本実施形態では、色温度が変化しないので、このモードで駆動されるハロゲンランプからの放射光を波長校正用光源として利用する。

波長校正用光源部２２５は、それを構成する光学系が観察用対物レンズと同軸の光学系上に置かれる。このため、顕微鏡の観察試料Ｓｍを動かすことなく光源のみを点灯させることにより、スペクトル補正と蛍光信号の取得とを切替ることができる。従って、実験の間でのスペクトル補正が容易に行える。

ハロゲンランプは、４００〜７００ｎｍのスペクトルを持つ。このため、分光システムの検出波長帯域を広くカバーすることができる。ハロゲンランプは、スペクトルが比較的滑らかであり、輝線を持たない。このため、複数の受光素子を並べ、さらにグレーティングを移動させながら分光を行うような本システムにおいては、校正光源としてハロゲンランプは、校正結果のばらつきを抑えることができる利点を有する。ただし、ハロゲンランプ側の光学系には、コンデンサレンズ２２５２が配置され、それらは使用する対物レンズによって変更される可能性がある。そのため、使用コンデンサ（照明側）のスペクトルはデータとして持つ必要がある。このデータは既知であるため、予めデータとして、記憶装置２５３に記憶させておき、演算装置２５２が演算の際に、参照することができるようにしておけばよい。

共焦点ユニット２３０は、観察用光源２１０からの照明光を顕微鏡２２０に向けると共に、顕微鏡２２０からの観測光（本実施形態の場合、蛍光）を分光装置２４０側に向けるダイクロイックミラー２３２と、照明光を試料上で２次元スキャンさせるガルバノ式光学スキャナ２３１と、ピンホール２３３ａを有する遮光板２３３と、リレーレンズ２３４を、主たる要素として有する。リレーレンズ２３４から出射される光束は、光ファイバ２３５を介して、入射スリットとして機能するファイバ端部２３５ａから分光装置２４０に導かれる。

分光装置２４０は、コリメート光学系２４１と、分光素子２４２と、集光光学系２４３と、受光素子配列により構成される受光器２４４とを有する。また、分光装置２４０には、受光器２４４により受光された信号を増幅すると共、ディジタル信号に変換する信号処理回路２４５を有する。信号処理回路２４５において処理された検出信号は、情報処理装置２５０に取り込まれる。

情報処理装置２５０は、信号処理回路２４５からの検出信号を蓄積するフレームメモリ２５１と、検出信号を処理して試料の分光特性を算出する演算装置２５２と、演算装置２５２のプログラム、データ等を記憶する記憶装置２５３と、情報の表示を行うモニタ２５４と、図示していない入力装置とを有する。

情報処理装置２５０は、校正処理および測定処理を行うためのプログラムを記憶装置２５３に有する。測定処理では、ガルバノ式光学スキャナ２３１を駆動させるスキャナ駆動装置（図示せず）と、受光器２４４とを動作させ、観察用光源２１０からの照明光を用いて試料をスキャンして、測定結果を取得する。一方、校正処理では、図示しない、対物レンズ２２１から受光素子２４４までの、使用する光学系のスペクトルのデータを収集する。このとき、波長校正光源部２２５により、波長校正モードにより波長校正用光源２２５１を駆動する。

次に、本実施形態の分光システムの動作について、図２から図５をさらに参照して説明する。

図２に、本実施形態の分光システムを用いて試料について観測する実験を行う場合の代表的な手順を示す。図２において、破線内は、情報処理装置において行われる測定処理である。一方、破線外の処理は、実験の準備段階での処理である。

まず、実際の実験において実験者は、分光測定をする直前に観察と同一光学系（同一フィルタ、同一対物レンズ、同一分光素子状態）において顕微鏡の透過光学系上に設置された透過光源用のハロゲンランプを一定電圧（９v）で点灯し、そのスペクトルを測定する。すなわち、試料Ｓｍを顕微鏡２２０のステージ（図示せず）に載置する（準備１）。次に、光源駆動回路２２５５の電源スイッチをオンすると共に、図示していないフォトスイッチをオンすることによって、校正モードにより、ハロゲンランプを点灯させる（準備２）。また、波長校正用光源部２２５において使用しているコンデンサレンズ２２５２の種類を、図示していない入力装置を介して情報処理装置２５０に入力する（準備１１）。この後、情報処理装置２５０において、校正処理のためのプログラムを起動する指示を行う（準備３）。

なお、校正処理を行う際は、波長校正用光源部２２５における波長校正用光源２２５１を点灯させ、観察用光源２１０はオフにしておく。逆に、実験を行う際には、観察用光源２１０をオンし、波長校正用光源２２５１をオフにしておく。これらのオンオフ操作は、手動で行うほか、演算装置２５２によるシーケンスの中で、演算装置２５２による制御により行うようにしてもよい。

情報処理装置２５０は、校正処理プログラムの起動指示を受け付けると、記憶装置２５３から該当プログラムを演算装置２５２にロードし、校正処理を実行して、校正用スペクトルデータを取得する。波長校正用光源２２５１からの放射光束を、対物レンズ２２１を通して、共焦点ユニット２３０を経て、分光装置２４０に至らしめると共に、受光器２４４において検出された出力、すなわち、参照用スペクトルデータを得る。

次に、演算装置２５２は、入力されたコンデンサの種類から、予め記憶装置２５３にデータベースとして登録された参照用スペクトルデータ群から光学系の設定と一致したスペクトルを選択して、「参照用スペクトルデータ」を読み出す（処理２１、２２）。

次に、取得した校正用スペクトルデータについて、選択した参照用スペクトルデータと比較する（処理２３）。参照スペクトルデータと実測校正用スペクトルデータとに基づいて、各光学素子について、補正のための係数を計算する（処理２４）。実測された「校正用スペクトル」と「参照用スペクトルデータ」はそのままの絶対値同士にて割り算を行い、各波長でのそれぞれのスペクトルのずれを「割合」として計算し、これを係数とする。

校正用スペクトル（λ）／参照スペクトルデータ（λ）
＝ 係数（λ） … （式１）
計算された係数を各光学素子の出力について補正するため、これまでの係数を書き換える（処理２５）。このデータは、情報処理装置２５０の記憶装置に２５３に保存される。このようにすることによって、波長校正用光源部におけるコンデンサに影響される部分が補正され、「参照用スペクトルデータ（図３参照）」は、校正用光源の「試料面」におけるスペクトルと一致することとなる。

図３はそれぞれのコンデンサレンズ毎における参照スペクトルの違いを示した例である。一般には、使用する硝材によって紫外光領域での透過特性が異なるため、各コンデンサレンズに対してその透過率を考慮したスペクトルが利用されるべきである。

次に、実験の生データを取得する（実験１２）。補正スペクトルを取得した光学系構成と同様の光学系において、実験者は、例えば、試料Ｓｍとして、生物標本を顕微鏡にセットして、試料Ｓｍからの各種スペクトルを測定する。測定は、演算装置２５２が、プログラムに従って、ガルバノ式光学スキャナ２３１を制御して、測定点に、観察用光源２１０からの光を、試料Ｓｍにおける二次元の測定点に順次投射させ、それぞれの測定点での、観察光、例えば、蛍光を、共焦点ユニット２３０から分光装置２４０に導く、そして、受光器２４４で受光させる。このようにすることにより、実験の際、試料Ｓｍから出た光は、対物レンズ２２１／カルバノ式光学スキャナ２３１／ダイクロイックミラー２３２／ピンホール２３３ａ／光ファイバ２３５／分光素子２４２／受光器２４４に導かれる。試料で発せられた蛍光・発光信号は、それぞれの光学素子の透過特性によって歪められ受光器２４４に導入される。

演算装置２５２は、得られたスペクトルデータ（実験生データ）を一時的に記憶する。一般に、実験生データと、参照スペクトル（例えばコンデンサＡ）とは、強度の波長特性が相違している（図４参照）。そこで、実験生データに対し、前述の（式１）により計算された波長毎の参照係数（図５参照）を、（式２）において係数として用い、真値を算出する（図２に示す処理２６）。

実験生データ（λ）／参照係数（λ）
＝真のスペクトル（λ） … （式２）
一連の実験条件（光学系）に対しては同様の操作を行うことで、相対的な強度の比較も可能となる。また、実験する状態（対物レンズ・挿入フィルタ特性など）が変化する場合は、実験前に、使用コンデンサの登録および「校正用スペクトル」を取得することにより、一連の実験のスペクトル補正が可能となる。

このように、本実施形態では、ハロゲンランプを光源に利用することにより、受光子光学系の構成を変えることなく補正データの取得が可能である。その結果、次のような便益を期待することができる。

第１に、一般的な顕微鏡のハロゲン光源には「フォトスイッチ」と呼ばれるスイッチがあり、それを利用することによりハロゲンランプに印加する電圧を一定（９ｖ）に保つことが可能となり、光源への印加電圧によるスペクトルの変化を抑えることができる。

第２に、対物レンズやフィルタなどの受光光学系を構成する素子に入替などがあった場合でも、顕微鏡の構成を変更することなく補正データを取得することができる。

第３に、対物レンズやフィルタなどの受光光学系を構成する光学素子の透過特性が事前に分かっていない場合でも全光路の測定によりスペクトル補正が可能である。

第４に、生物標本（培養細胞）はほとんど透明であるため（蛍光染色してあったとしても非常に微量である）、生物標本がある状態でも実験の直前などにデータの取得が可能である。

本発明の実施形態である、分光装置および波長校正用光源を含んだ共焦点顕微鏡を有する分光システムの構成を示すブロック図。 本発明の実施形態において行われる補正処理、実験処理の流れを示す説明図。 波長校正用光源側のコンデンサが異なる場合のスペクトル例を示すグラフ。 ハロゲンランプの参照及び実測スペクトルを示すグラフ。 参照スペクトルと実測スペクトルより得られる参照係数を示すグラフ。

符号の説明

２１０…観察用光源、２２０…顕微鏡、２２１…対物レンズ、２２５…波長校正用光源部、２２５２…コンデンサレンズ、２２５５…光源駆動回路、２３０…共焦点ユニット、２３１…ガルバノ式光学スキャナ、２３２…ダイクロイックミラー、２３３…遮光板、２３３ａ…ピンホール、２３５…光ファイバ、２４０…分光装置、２４２…分光素子、２４４…受光器、２５０…情報処理装置、２５２…演算装置、２５３…記憶装置。

Claims (4)

1. 顕微鏡と、共焦点ユニットと、分光装置とを備える分光システムにおいて、
   前記顕微鏡は、波長校正用光束を対物レンズに入射させる波長校正用光源部を有し、
   前記波長校正用光源部は、波長校正用光源と、この光源に一定電圧を印加して点灯させる光源駆動回路とを有すること、を特徴とする分光システム。
2. 請求項１に記載の分光システムにおいて、
   前記顕微鏡用の観察用光源をさらに有し、
   前記観察用光源は、試料観察時に、前記波長校正用光源部は、波長校正時に、それぞれ選択的に駆動されるものであること、を特徴とする分光システム。
3. 請求項１に記載の分光システムにおいて、
   前記波長校正用光源は、前記対物レンズの光軸と同軸の光学系上に配置されていることを特徴とする分光システム。
4. 請求項１に記載の分光システムは、前記波長校正用光源を用いたスペクトル補正時に取得される校正用スペクトルデータと予め記憶された参照用スペクトルデータとを比較し、比較した結果に基づき標本観察時に得られたスペクトルデータを補正する情報処理部を有することを特徴とする分光システム。

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