JP2006153562A - 生体試料判別装置用プレート - Google Patents

Abstract

【課題】 流路に充填された緩衝材中で生体サンプルを移動させた際の輸送反応の検出時に、煩雑な準備作業が不要で精度の良い生体サンプル判別装置用プレートを提供する。
【解決手段】生体サンプルを緩衝剤中で移動させた際に得られる輸送反応を検出して、該生体サンプルの判別を行う生体試料判別装置用プレートにおいて、緩衝剤が流れる第１の流路１１６ｂと生体サンプルが流れる第２の流路１１７ａ、１１７ｂとの合流部分に設けた一定体積の生体サンプルを保持する定量保持部１２０に、定量保持部１２０の保持する生体サンプルの第２の流路１１７ａ、１１７ｂへの流出を抑制する島１２５を設ける。
【選択図】 図１

Description

本発明は、ＤＮＡやタンパクその他の生体サンプルを緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出して生体サンプルを判別する生体サンプル判別装置用プレートに関する。

近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきた。

ＤＮＡに関し、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。ＳＮＰｓを分類すれば、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから、個人の完全な特定ができると考えられているからである。

現在ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）という方法が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケリング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。なお、シーケンシングは、このＳａｎｇｅｒ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基長の長さの違いを分離・識別する技術を基礎としている。

そして、このようなシーケンシング法によるＳＮＰｓの分類は、ターゲットとする遺伝子を単離した後、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定法（装置）を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行うものであるため、実験に膨大な作業量と時間、さらには多大のランニングコストを要し、またその際に使用する塩基配列決定のための自動化装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、高価な試薬を大量に必要とするという問題を有していた。

こうした問題点は、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法を用いれば、ほぼ解決できる。アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（特許文献１参照）。

ここで、従来のアフィニティリガンドキャピラリー電気泳動では、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドとして、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係の１本鎖を使うが、ポリヌクレオチドを成分とするアフィニティリガンドは負電荷を有しているため、電圧を印加すると、このアフィニティリガンドがキャピラリー外に流出してしまう。これを防ぐため、従来では、アフィニティリガンドである、前記被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係の１本鎖を、キャピラリー内に固定化している。

固定化の方法としては、ビニル化ＤＮＡをポリアクリルアミドと共重合し、それをキャピラリー内壁に共有結合的に固定化するものが提案されている。これにより、前記被検体ＤＮＡは、アフィニティリガンドである固定的オリゴヌクレオチドと強く相互作用してキャピラリー内に吸着され、一方、ノイズＤＮＡは該固定的オリゴヌクレオチドに吸着されずキャピラリー外に流出され、この結果、前記被検体ＤＮＡを検出することが可能となる（特許文献１参照）。

しかしながら、この方法では、アフィニティリガンドをキャピラリー内壁にしかコーティングできないので、アフィニティリガンドと試料との相互作用が壁面近傍に限られ、測定が難しく、且つ測定精度が悪くなるという問題がある。

この問題点に鑑み、本出願人は、本発明に先立って、アフィニティリガンドと試料との相互作用が壁面近傍に限られないように、該アフィニティリガンドをキャピラリー内で擬似的に固定する方法を提案している。この方法によれば、それぞれに電極を配置した第１容器と第２容器間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管で連絡し、次いで、このキャピラリー管の緩衝液の中に、該ＤＮＡ試料に含まれる検出対象である目的ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を結合したリニアポリマーからなる分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填した後、続いて被検体であるＤＮＡ試料を充填し、その後、両電極間に電圧を印加して、キャピラリー管内の被検体ＤＮＡ試料を電気泳動させることで、該ＤＮＡ試料を分離することができる（特許文献２参照）。

以下、アフィニティリガンドをキャピラリー内で擬似的に固定する方法について説明する。ＤＮＡは二重鎖を形成するものと一重鎖を形成するものとが存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合し易くなっており、ＤＮＡの二重鎖においてもＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一方のＤＮＡが５’−ＡＴＣＧＣＧＴ−３’と配列されている場合、他方のＤＮＡは３’−ＴＡＧＣＧＣＡ−５’という塩基配列をもっている。

ＤＮＡサンプルを分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡサンプルのミュータントＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、ＤＮＡサンプルの検出対象である目的ＤＮＡのＤＮＡ配列が５’-ＡＴＣＧＣＧＴ-３’を含み、ワイルドＤＮＡが５’-ＡＴＣＡＣＧＴ-３’を含む場合、下線で示した部分でミュータントＤＮＡとワイルドＤＮＡの塩基が異なっている。このとき、分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分の配列を３’-ＴＡＧＣＧＣＡ-５’とすると、ワイルドＤＮＡは下線部においてＤＮＡコンジュゲートと相補的ではなくなる。これにより、全体の結合力はミュータントＤＮＡの方がワイルドＤＮＡより１塩基分大きくなり、電気泳動時にミュータントＤＮＡの方がワイルドＤＮＡより遅延して泳動される。

ＤＮＡサンプルは血液などから、細胞を破壊してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡ配列を含む部分を増幅する。このとき、所定の塩基数にして増幅すると相補的配列を持つＤＮＡコンジュゲートの塩基数も決定できる。

前述した方法によれば、負に帯電した分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを、電気泳動で第２容器から第１容器へ移動させる際に、アフィニティリガンドと被ＤＮＡ検体との相互作用が壁面近傍に限られないように擬似的に固定し、そのＤＮＡ試料の移動速度差から、該ワイルドＤＮＡとミュータントＤＮＡとを分離することができ、この結果、ＳＮＰｓの遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判別することが可能になる。

一方、タンパク質は、細胞、組織、生体液中に存在し、生体活動の調節、細胞へのエネルギー供給、重要な物質の合成、生物構造体の維持、さらには細胞間でのコミュニケーションや細胞内情報伝達に関与している。現在では、タンパク質が様々な環境や、相互作用
する他のタンパク質の存在、タンパク質が受けた修飾の程度や種類に応じて、複数の機能を有することが明らかになってきている。

ここで、Ｌ−アミノ酸が多数連結（重合）してできた高分子化合物がタンパク質であり
、生体の重要な構成成分のひとつである。このアミノ酸の配列をタンパク質の一次構造とよぶが、この配列は遺伝子（ＤＮＡ）の配列により決定される（３つの塩基配列により、１つ
のアミノ酸が指定される）。ペプチド結合してタンパク質の構成成分となった単位アミノ酸部分（−ＮＨ−ＣＨ（−Ｒ−）−ＣＯ−）をアミノ酸残基と呼ぶが、それぞれのＲによってその性質が異なる。この残基の相互作用によってαへリックス（ら旋）構造やβシート構造などの二次構造をとり、さらにはタンパク質全体としての三次構造をとることになる。タンパク質の機能は、前記三次構造（立体構造）によって決定される。これは、同じアミノ酸の配列からなるタンパク質でも、立体構造（畳まれ方）によって機能が変わるということである。たとえば、ＢＳＥの原因となるプリオンは、正常なプリオンとは立体構造が違うだけである。現在タンパク質の立体構造と機能についての研究が進められているが、いずれ、必要な機能にあわせてタンパク質の立体構造を設計し、合成できるようになるだろうと考えられている。

タンパク質は、２０種類のアミノ酸が遺伝子の指示（配列情報）により順番につながることでつくられており、その種類は数千万種と言われるが、その遺伝子の配列がわかれば、どのアミノ酸がどういう順番でつながってできているかの情報を得ることができる。生物の遺伝子（ゲノム）から作られるタンパク質の一そろいのセットは、プロテオームと呼ばれるが、ヒトゲノムの塩基配列解読が終わった今、プロテオームの解析が盛んに進められている。

そして、このようなタンパク質の機能解析研究としては、同定やキャラクタリゼーションのみならず、生化学アッセイやタンパク質間相互作用研究、タンパク質ネットワーク、または細胞内外のシグナリング解明なども行っていく必要がある。このタンパク質機能の研究には、多方面の技術が使用され、酵素アッセイ、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ、クロマトグラフィーによる精製、情報ツールとデータベース等があるが、特に、電気泳動によるたんぱく質の判別は重要な手法である。そして、電気泳動のように、キャピラリー管中のサンプル、分析物、緩衝剤、及び試薬等の液体を移動させた際に得られる輸送反応を検出して、該サンプルの分析、判別、判定等を行う場合の前記液体の輸送及び方向付けに関しては、さまざまな報告がある（例えば、特許文献３〜特許文献６）。
特開平７-３１１１９８号公報 特開２００２-３４０８５９号公報 特表２０００-５１３８１３号公報 特表２００１-５２３３４１号公報 特表２０００-５１４９２８号公報 特開２００３-２８８８３号公報

上述したように生体サンプルの分析においては、キャピラリー電気泳動装置を利用した方法が広く使われている。実際に輸送反応を行なう部分であるキャピラリーは、外形３００ミクロン、内径１００ミクロン程度のガラス管が使用される例が多く、折れにくくするために表面はポリイミド等でコーティングされている。しかしながら、内部試料を検出するために検出窓として焼いたり薬品で溶かすなどしてコーティングを一部剥ぎ取る。この時、コーティングを剥いだ部分は折れやすくなり取り扱いに十分注意する必要がある。折れた場合はなお危険である。
また、サンプルの注入においても、加圧や吸引で行うのが一般的な方法であるが、一定量注入する必要があり、時間で調整するもののキャピラリー内の緩衝剤の粘度や温度変化により注入量が実験のたびに異なるという問題がある。サンプルの量は測定結果に及ぼす影響は大きく、大変重要な項目である。
また、このようなキャピラリーを使用した装置の場合、構成上短い流路での電気泳動を行うことは困難であり、必要以上の泳動距離と時間をかけて測定することになるという問題があった（特許文献１参照）。

また、前述した特許文献２の遺伝子診断装置と診断方法においては、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを充填する必要がある。このように、キャピラリー管１本１本に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料を充填するのは面倒な作業であり、また分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料を充填する際に、それらの量がキャピラリー管間で異なれば、測定結果にも影響が及ぼされる可能性があった。

さらに、試料の分離を行うのに、例えば、特許文献３，４に記載の方法では、複数のキャビラリーチャンネルを交差させ、且つ少なくとも３つ電極を設けて、該少なくとも３つ設けられた電極のうちの２つの電極に印加して、前記交差部を通して前記試料を移動させているが、この方法では、流路が交差していることから、試料を電気泳動させる際にうまく泳動しない可能性があり、正確な測定結果が得られないという問題がある。また、例えば、特許文献５，６に記載の方法では、プラットホームに微細チャンネルを埋設し、該プラットホームの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させているが、この方法では、試料を向心方向にしか移動させることができないという問題に加え、該微小チャンネルの形状がかなり複雑であるという問題もある。

本発明は、流路に充填された緩衝材中で生体サンプルを移動させた際の輸送反応の検出時に、煩雑な準備作業が不要で精度の良い生体サンプル判別装置用プレートを提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、生体サンプルを緩衝剤中で移動させた際に得られる輸送反応を検出して該生体サンプルの判別を行う生体試料判別装置用プレートにおいて、
前記緩衝剤が流れる第１の流路と前記生体サンプルが流れる第２の流路との合流部分に設けた一定体積の前記生体サンプルを保持する定量保持部に、該定量保持部の保持する生体サンプルの前記第２の流路への流出を抑制する抑制手段を設けたことを特徴としたものである。

また、第２の流路は、定量保持部へ前記生体サンプルを流入させる部分の流入断面が、定量保持部から生体サンプルを流出させる部分の流出断面より大きい断面積を有することを特徴としたものである。

また、定量保持部に、生体サンプルを前記第１の流路に案内する案内手段を設けたことを特徴としたものである。

また、案内手段は定量保持部に隆起部分を設けたことを特徴としたものである。

また、第１の流路は定量保持部からの距離に比例して断面積が減少することを特徴としたものである。

本発明の生体試料判別装置用プレートによれば、第１の流路に緩衝剤を気泡を含むことなく容易に短時間で充填した後、第１の流路と第２の流路との合流部分に設けた定量保持部が保持する生体サンプルを、該緩衝剤中に添加する。このとき、前記定量保持部に設けた抑制手段が前記定量保持部の保持する前記生体サンプルの前記第２の流路への流出を抑制する。このため、定量保持部は一定体積の生体サンプルを精度良く保持することができる。

また、第２の流路は、定量保持部の流入部分と流出部分の断面積が異なるため、一定量の生体サンプルを精度良く緩衝剤中に添加することができる。

また、定量保持部に生体サンプルを第１の流路に案内する案内手段を設けていることから、生体サンプルを確実に第１の流路に流すことができる。さらに、この案内手段を隆起部分とすれば、生体サンプルの滞留を防止でき、確実に一定量の生体サンプルを第１の流路に流すことができる。

また、第１の流路の断面積が定量保持部からの距離に比例して減少するため、電気泳動させた際にサンプルを凝集させ高濃度のサンプルを移動させることができ、高い感度でＤＮＡの検出が可能となる。

（実施例１）
以下に、生体サンプル判別装置用プレートの実施例１を図面とともに詳細に説明する。
まず、本実施例１における生体サンプル判別装置用プレートの構成について説明する。
充填された緩衝剤が流れる第１の流路１１６と充填されたＤＮＡサンプルが流れる第２の流路１１７との合流部分には、一定体積のＤＮＡサンプルを保持する定量保持部１２０が設けられている。
定量保持部１２０付近の形状について、図1を用いて詳細に説明する。サンプル注入流路１１７ａの流路幅はサンプル充填流路１１７ｂの流路幅よりも大きくなっている。また、定量保持部１２０に設けた島１２５は横幅が定量保持部１２０の横幅未満で、縦幅がサンプル注入流路１１７ａとサンプル充填流路１１７ｂの流路幅の差以下で、高さは流路深さと等しい四角柱であり、サンプル注入流路１１７ａの底部とサンプル充填流路１１７ｂの底部の間で定量保持部１２０の左右の壁に接しないように配置されている。

次に、図２〜図４を用いて、実施例１における生体サンプル判別装置用プレート１０の構成について説明する。なお、実施例１では、説明を具体的にするために、生体サンプルとしてＤＮＡサンプルを用い、緩衝剤として分離用ＤＮＡコンジュゲート及びＤＮＡ結合制御剤を含むものを用いるものとする。また、本生体サンプル判別装置用プレート１０が、流路中に充填させた分離用ＤＮＡコンジュゲート中に、定量されたＤＮＡサンプルを添加して電気泳動させ、流路中の蛍光度あるいは吸光度を検出することにより、ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するものとする。

図４（ａ）は本実施例１における生体サンプル判別装置用プレート１０の下面および生体サンプル判別装置用プレート１０に形成されたパターン１１０の詳細な形状を示す図である。ここで、パターン１１０とは、生体サンプルと泳動させるための微小な幅と深さを持つ溝によって形成された微細な流路である。また、図４（ｂ）は生体サンプル判別装置用プレート１０の上面、図４（ｃ）は生体サンプル判別装置用プレート１０のＤ−Ｄ断面を示す図である。

図４（ａ）に示すように、実施例１における生体サンプル判別装置用プレート１０はその中央に開口部１０ａ、そして、図５に示す生体サンプル判別装置１００に嵌合される嵌合ピン孔１１、位置決めするための位置決めマーク１２が設けられている。

そして図４（ｂ）に示すように生体サンプル判別装置用プレート１０の下面には、分離用ＤＮＡコンジュゲート中で、ＤＮＡサンプルを移動させるためのパターン１１０、及び生体サンプル判別装置用プレート１０をセンサにより検出されるプレート確認マーク１３が設けられている。また、生体サンプル判別装置用プレート１０の下面には、図４（ｃ）に示すように、生体サンプル判別装置用プレート１０に形成されたパターン１１０をふさぐようにキャピラリーシール１４が張られ、そして、生体サンプル判別装置用プレート１０の上面には、前記電極挿入口のみをふさぐようにカバーフィルム１５が張られている。なお、キャピラリーシール１４については、光学検出部４０により流路の吸光度、あるいは蛍光度を測定する必要があるため透明であるのがよい。

図２を用いてより詳細に説明すると、パターン１１０は、ＤＮＡサンプルを分離させる分離用ＤＮＡコンジュゲートが注入される第1のサンプル注入部１１３と、ＤＮＡサンプルが注入される第２のサンプル注入部１１４と、第２のサンプル注入部１１４に注入されたＤＮＡサンプルの移動先であるサンプルプール１１５と、負電極を挿入する第１の電極挿入部１１１と、正電極を挿入する第２の電極挿入部１１２と、これらを接続する流路とからなる。

そして、この流路は、緩衝材を充填する第１の流路１１６と、ＤＮＡサンプルを充填する第２の流路１１７とからなる。第１の流路１１６と第２の流路１１７とは、定量保持部１２０で合流する。

第１の流路１１６は、第１のサンプル注入部１１３と第１の電極挿入部１１１間、及び第1のサンプル注入部１１３と第２の電極挿入部１１２間を接続するプレートの内周側の流路である内周流路１１６ａと、第１の電極挿入部１１１と第２の電極挿入部１１２間を接続する流路である外周流路１１６ｂとからなる。

第２の流路１１７は、電極挿入部１１２とサンプルプール１１５を接続し、前記第１の流路１１６と前記定量保持部１２０と前記第２のサンプル注入部１１４間を接続するサンプル注入流路１１７ａと前記定量保持部１２０と前記サンプルプール１１５間を接続するサンプル充填流路１１７ｂとからなる。

ＤＮＡサンプルと分離用ＤＮＡコンジュゲートとを水素結合反応させた後の、外周流路１１６ｂの一部分において、泳動流路の吸光度、あるいは蛍光度を前記光学検出部４０により測定することで、定量添加されたＤＮＡサンプルのＳＮＰｓの有無を判別する。

ここで、分離用ＤＮＡコンジュゲート充填処理において、第１の流路１１６の内周流路１１６ａ側にコンジュゲートが残っている場合、第１の電極挿入部１１１と第２の電極挿入部１１２とに電極を挿入して電圧を印加した際に、内周流路１１６ａ側で電気泳動が起こってしまうため、外周流路１１６ｂの一部である泳動流路で吸光度、あるいは蛍光度の検出が不可能となる。

コンジュゲート充填処理後に分離用ＤＮＡコンジュゲートが内周流路１１６ａに残らないようにするためには、第１のサンプル注入部１１３と内周流路１１６ａ足した体積が外周流路１１６ｂの体積以上で、且つ、第１のサンプル注入部１１３と内周流路１１６ａと第１の電極挿入部１１１と第２の電極挿入部１１２の体積を足したもの以下にする必要がある。
そして、ＤＮＡサンプルを定量化させるために、図３に示すように、定量保持部１２０の位置を生体サンプル判別装置用プレート１０の中心を中心として、第１の電極挿入部１１１と第２の電極挿入部１１２と同一の円周上に設ける必要がある。分離用ＤＮＡコンジュゲート充填処理において、外周流路１１６ｂに分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填された時、定量保持部１２０の位置が第１の電極挿入部１１１，第２の電極挿入部１１２よりも中心側に位置する場合には、定量保持部１２０に分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填されず、定量保持部１２０の位置が、第１の電極挿入部１１１，第２の電極挿入部１１２よりも外周側に位置する場合には、分離用ＤＮＡコンジュゲートが前記第２の電極挿入部１１２やサンプルプール１１５に流れてしまうためである。
定量保持部１２０には、生体サンプルの緩衝液への移動を抑制する島１２５が設けられている。この島１２５がＤＮＡサンプルの流路１１６ｂへの移動を抑制し、ＤＮＡサンプルを定量保持部１２０に確実に充填することができる。さらに、遠心力により第１の流路１１６に接する定量保持部１２０のＤＮＡサンプルのみを残してサンプル注入部１１４に移動させる際に、定量保持部１２０上部の第２の流路１１７を通る空気によって定量化されたサンプルをえぐりとってしまうことを防ぎ、一定量のＤＮＡサンプルを分離用ＤＮＡコンジュゲートに確実に添加することができる。
また、定量保持部１２０の底部は第２の流路１１７に対し、隆起した部分を有しており、前記第１の流路１１６はＤＮＡサンプルを電気泳動させる際にＤＮＡサンプルが移動する側の流路の断面積が定量保持部１２０からの距離に比例して減少する形状になっている。
底部を隆起させることにより、この隆起した部分がＤＮＡサンプルを第１の流路に案内し、電極に電圧を印加した際に、電流をＤＮＡサンプルに効率良く流すことができ、確実にＤＮＡサンプルを電気泳動させることができる。また、ＤＮＡサンプルが移動する流路の断面積が定量保持部からの距離に比例して減少することにより、移動するＤＮＡサンプルを凝集させて濃度を高くすることができ、容易にＤＮＡサンプルを検出することができる。

ここで、光学検出部４０により泳動流路の蛍光度を検出する場合に、泳動流路の深さが深すぎると蛍光度が検出されにくいため、流路の幅を広くして深さを浅くするのが好ましく、例えば幅３００μｍ、深さ５０μｍの流路が例に挙げられる。一方、光学検出部４０により泳動流路の吸光度を検出する場合には、泳動流路の深さが浅すぎると吸光度が検出されにくいため、適度な深さがあることが好ましく、例えば、幅３００μｍ、深さ３００μｍの流路が好ましい。

さらに、パターン１１０には、測定時でないときに電極３２ａ，３２ｂを待機させるための第１の電極待機孔１１８が第１の電極挿入部１１１の同心円上に設けられ、また、，第２の電極待機孔１１９が第２の電極挿入部１１２の同心円上に設けられている。また、生体サンプル判別装置用プレート１０上には加圧部３４による加圧時でないときに加圧部３４を待機させるための加圧待機孔１３６が、第２のサンプル注入口１１４の同心円上に設けられている。さらに、第１の電極挿入部１１１，第２の電極挿入部１１２には電極３２ａ，電極３２ｂを挿入する電極挿入口１２１，電極挿入口１２２、及び空気孔１３１，空気孔１３２が設けられ、また、第１のサンプル注入部１１３にはサンプル注入口１２３，第２のサンプル注入部１１４にはサンプル注入口１２４が設けられ、さらに、サンプルプール１１５には空気孔１３５が設けられている。

次に、図５〜図６を用いて、本実施例１にかかる生体サンプル判別装置１００の構成について説明する。図５は、本実施例１にかかる生体サンプル判別装置１００の構成図である。

図５に示すように、実施例１にかかる生体サンプル判別装置１００は、上下動モータ５１が内蔵され、モータ５１により上下移動する昇降ステージ５０と、生体サンプル判別装置用プレート１０に形成されたパターン１１０に含まれる流路に遠心力によって分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填された流路中に遠心力によってＤＮＡサンプルを定量して添加する充填ユニット２０と、分離用ＤＮＡコンジュゲート中を移動する前記ＤＮＡサンプルの蛍光度あるいは吸光度を検出する光学検出部４０と、生体サンプル判別装置用プレート１０に対して加圧、加熱、電圧印加を行い、生体サンプル判別装置用プレート１０を前記光学検出部４０に対して回転させる検出ユニット３０と、生体サンプル判別装置１００の動作を制御する制御基板６８とを備える。

そして、充填ユニット２０には、生体サンプル判別装置用プレート１０を高速回転させる高速回転モータ２１と、生体サンプル判別装置用プレート１０を保持し、その一部が生体サンプル判別装置１００内に固定され、筺体６０に設けられた扉６１を介して、生体サンプル判別装置１００の内部から外部へあるいは外部から内部へ移動する、プレートトレイ２２と、測定開始前にプレートの有無を確認するプレート確認センサ２３とが備えられ、また検出ユニット３０には、生体サンプル判別装置用プレート１０と該検出ユニット３０とを固定する嵌合ピン３１と、生体サンプル判別装置用プレート１０に形成された流路に電圧を印加する２本の電極３２ａ，電極３２ｂと、該流路を一定の温度に保つヒータ３３と、該流路に注入されたＤＮＡサンプルを加圧して流路の一部に充填させる加圧部３４と、生体サンプル判別装置用プレート１０と検出ユニット３０とを固定する際の位置決めを行う位置決めマーク検出センサ３５と、生体サンプル判別装置用プレート１０を保持するクランパ３６、及び生体サンプル判別装置用プレート１０に設けられた流路の温度を検出するサーミスタ３９とが設けられた天井板３７と、天井板３７を低速回転させる低速回転モータ３８とが備えられている。

なお、実施例１の生体サンプル判別装置１００では、生体サンプル判別装置１００の下部に昇降ステージ５０が配置され、昇降ステージ５０上に充填ユニット２０と光学検出部４０とが配置され、さらに、昇降ステージ５０の上方に検出ユニット３０が配置されており、よりコンパクトな構成となっている。 そして、クランパ３６はクランパ支えを介して、またヒータ３３はヒータ支えを介して天井板３７に設けられており、また、天井板３７に設けられた嵌合ピン３１、電極３２ａ，電極３２ｂ、ヒータ３３、加圧部３４、クランパ３６、及びサーミスタ３９には、生体サンプル判別装置用プレート１０に対して適度なテンションを与えるバネが設けられて、このバネにより生体サンプル判別装置用プレート１０に押し付けられるように構成されており、さらに加圧部３４は、加圧ポンプ部５２にポンプチューブ５３を介して接続されている。

そして、ヒータ３３には、ヒータ３３の温度を検出するヒータ温度検出センサ５５が設けられ、生体サンプル判別装置１００内には、生体サンプル判別装置１００内の温度を検出する装置内温度検出センサ５４が設けられている。

さらに、生体サンプル判別装置１００には、検出ユニット３０の加圧部３４に接続されている加圧ポンプ５２、高圧電源６６、装置電源６７、当該装置のｏｎ、ｏｆｆ状態を切り換える電源スイッチ６２、この電源スイッチ６２がＯＮ状態の際に点灯するＬＥＤ６３、装置１００内を冷却する冷却ファン６４、及び装置１００を振動から守り、高さ調節可能なゴム脚６５ａ，ゴム脚６５ｂが備えられている。

以下、前述した構成を有する実施例１にかかる生体サンプル判別装置１００の動作について、図６〜図１２を参照しながら説明する。

まず、シリンジによる手作業で、図７（ａ）に示すように、生体サンプル判別装置用プレート１０に設けられたパターン１１０の第1のサンプル注入部１１３に、サンプル注入口１２３から分離用ＤＮＡコンジュゲートを注入し、また、第２のサンプル注入部１１４に、サンプル注入口１２４からＤＮＡサンプルを注入する（ステップＳ１）。

このステップＳ１において、前述の分離用ＤＮＡコンジュート等を注入した後、生体サンプル判別装置１００の電源スイッチ６２をＯＮ状態にし、操作ボタン（図示せず）等を操作して、筺体６０中から扉６１を介してプレートトレイ２２を引き出し、プレートトレイ２２上に、サンプル注入された生体サンプル判別装置用プレート１０をセットした後、再度操作ボタンを操作して、プレートトレイ２２を筺体６０内に引き込ませるプレートローディングを行う。このステップＳ２の動作によりプレートトレイ２２が引き込まれると、生体サンプル判別装置用プレート１０は、生体サンプル判別装置用プレート１０の開口部１０ａが高速回転モータ２１のプレート受け部２１ａに嵌まる位置に自動的にセットされる。この状態の昇降ステージ５０の位置を最下点とする（ステップＳ２）。

前述したように生体サンプル判別装置用プレート１０が生体サンプル判別装置１００内にローディングされると同時に、昇降ステージ５０は、上下動モータ５１によって、前記最下点から、生体サンプル判別装置用プレート１０がクランパ３６に保持される位置である第１段目の位置まで上昇する（ステップＳ３）。

なお、このとき、昇降ステージ５０と共に、光学検出部４０、高速回転モータ２１、プレート確認センサ２３、及び該高速回転モータ２１のプレート受け部２１ａに嵌まっている生体サンプル判別装置用プレート１０は上昇するが、プレートトレイ２２は装置に固定されているため、移動しない。

図８（ａ）は、実施例１の生体サンプル判別装置の昇降ステージが、前記第１段目の位置まで上昇したときの状態を示す図である。

以下、生体サンプル判別装置用プレート１０がクランパ３６に保持される状態になるまでの動きを詳細に示すと、まず、生体サンプル判別装置用プレート１０が生体サンプル判別装置１００内にローディングされると同時に、昇降ステージ５０は上下動モータ５１によって最下点から上昇を開始して、図５に示すように、高速回転モータ２１のプレート受け部２１ａに生体サンプル判別装置用プレート１０の開口部１０ａが嵌まり込む。そしてこの後、昇降ステージ５０が更に上昇して、生体サンプル判別装置用プレート１０は高速回転モータ２1と一体化して上昇する。そして、昇降ステージ５０がある位置まで上昇すると、生体サンプル判別装置用プレート１０の上方にあるクランパ３６の下面に設けられた磁石と、高速回転モータ２１の金属で形成されたプレート受け部２１ａとが接続され、これにより生体サンプル判別装置用プレート１０がクランパ３６に保持される。このように接続された時点で昇降ステージ５０は停止し、この停止位置が、昇降ステージ５０の第１段目の位置である。昇降ステージ５０の第１段目の位置は、例えば、該昇降ステージ５０の最下点から８ｍｍ上昇した位置である。

そして、昇降ステージ５０が、前述したようにして第１段目の位置に移動した後、この第１段目の位置において、充填ユニット２０により、第１の流路１１６に遠心力で分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填する充填処理を行うのだが、このとき、該充填処理を行う前に、まず生体サンプル判別装置用プレート１０が当該装置内にあるか否かを確認する（ステップＳ４〜ステップＳ５）。

生体サンプル判別装置用プレート１０の有無の確認は、プレート確認センサ２３で、生体サンプル判別装置用プレート１０下面に設けられたプレート確認マーク１３を検出することにより行う。ここで、生体サンプル判別装置用プレート１０のプレート確認マーク１３は、切り欠きやマーク等からなるものあり、例えば、ここではアルミテープをはる。そして、高速回転モータ２１によって生体サンプル判別装置用プレート１０が回転される時に、反射型のフォトセンサ等であるプレート確認センサ２３で生体サンプル判別装置用プレート１０の下面を測定する。このとき、プレート確認センサ２３では、プレート確認マーク１３であるアルミテープと、該アルミテープ以外の部分で図７に示すような出力信号の差が生じるため、出力信号に立ち上がりと立ち下がりがあれば生体サンプル判別装置用プレート１０が存在し、一方、出力信号に立ち上がりと立ち下がりがなければ生体サンプル判別装置用プレート１０が存在しないと判断する。

そして、プレート確認センサ２３で生体サンプル判別装置用プレート１０が無いと判断されれば、この時点で動作を中止し、一方、生体サンプル判別装置用プレート１０があると判断されれば、高速回転モータ２１を予め決められた回転数、ここでは約４０００ｒｐｍで、約２分間高速回転させて、当該流路中の第１の流路１１６に分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填させる。

以下、図７（ａ）〜（ｃ）を用いて、パターン１１０中に分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填されていく様子を説明する。

まず、生体サンプル判別装置用プレート１０が前記高速回転モータ２１によって高速回転されると、図７（ａ）に示すように、パターン１１０中の第1のサンプル注入部１１３に注入された分離用ＤＮＡコンジュゲートが、該高速回転によって生じる遠心力により、図７（ｂ）に示すように、前記第1のサンプル注入部１１３から、第１の流路１１６の内周流路１１６ａを移動して、それぞれ、第１の電極挿入部１１１，第２の電極挿入部１１２に到達する。

さらに、図７（ｃ）に示すように、第１の電極挿入部１１１，第２の電極挿入部１１２から、第１の流路１１６の外周流路１１６ｂを移動して、最終的に第１の電極挿入部１１１，第２の電極挿入部１１２と外周流路１１６ｂに充填される。

一方、第２のサンプル注入部１１４に注入されたＤＮＡサンプルは、前述したような充填ユニット２０によるコンジュゲート充填処理中に、第２の流路１１７を円周方向に移動して、第２の流路１１７中に遠心分布される。このとき、第２のサンプル注入部１１４に注入されるＤＮＡサンプルの量が多ければ、充填ユニット２０で生体サンプル判別装置用プレート１０を高速回転させることで生じる遠心力によって、第１の流路１１６の外周流路１１６ｂに分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填される前に、ＤＮＡサンプルが第２の流路１１７に充填されて、該外周流路１１６ｂにＤＮＡサンプルが流れてしまうこととなる。従って、第２のサンプル注入部１１４に注入するＤＮＡサンプルの量は、遠心力によって前記外周流路１１６ｂにまで達しない量、つまり、図７（ｂ），（ｃ）に示すように第２の流路１１７の途中で移動が止まる量を注入するようにする。

ステップＳ５において、以上のような特徴を有する生体サンプル判別装置用プレート１０に各サンプルを注入し、充填ユニット２０によるコンジュゲートの充填動作が終了後、昇降ステージ５０は、生体サンプル判別装置用プレート１０と検出ユニット３０とを嵌合させるために更に上昇する。ただし、前記検出ユニット３０と生体サンプル判別装置用プレート１０とを嵌合させるためには、該検出ユニット３０の嵌合ピン３１を、生体サンプル判別装置用プレート１０の嵌合ピン孔１１に挿入する必要があるため、生体サンプル判別装置用プレート１０の嵌合ピン孔１１の位置を検出するために、生体サンプル判別装置用プレート１０の位置決めをする必要がある（ステップＳ６）。

そこで、実施例１においては、図４（ａ）に示すように生体サンプル判別装置用プレート１０の上面に位置決めマーク１２を設けておき、位置決めマーク検出センサ３５により該位置決めマーク１２を検出して、検出ユニット３０と生体サンプル判別装置用プレート１０とを嵌合できる位置を決定する。なお、充填ユニット２０の高速回転モータ２１がサーボタイプのモータであれば、コンジュゲート充填処理における高速回転後の生体サンプル判別装置用プレート１０の位置が限定できるため、生体サンプル判別装置用プレート１０の位置決めを行う必要はない。

この検出ユニット３０による嵌合位置の検出方法は、ステップＳ４の動作と同様で、反射型センサ等である低速回転モータ３８によって検出ユニット３０を回転させる際に、位置決めマーク検出センサ３５で生体サンプル判別装置用プレート１０の上面を測定すると、位置決めマーク１２であるマーク部と該マーク以外とで図９に示すような出力信号の差が生じるため、この立ち上がり立下りに注目して、検出ユニット３０の位置決めを行う。ここで、検出ユニット３０を低速回転モータ３８により回転させて位置決めを行う時には、検出ユニット３０は多くの構成要素が天井板３７に設けられて、検出ユニット３０周辺にそれらのケーブル、チューブ類が束ねられて存在するため（図示せず）、前記ケーブル、チューブ類がからまないように、右・左方向へ半回転から３／４回転ほど順次回転して位置を検出した後、回転角度が少ない方向に回転して検出ユニット３０の位置決めを行うようにする。

以上のように、検出ユニット３０を位置決めした後、生体サンプル判別装置用プレート１０と検出ユニット３０とを嵌合するために、昇降ステージ５０は、上下動モータ５１により、図８（ａ）に示す第１段目の位置から、図８（ｄ）に示す第２段目の位置まで上昇する（ステップＳ７）。

以下、図８（ｂ）〜図８（ｄ）を用いて、生体サンプル判別装置用プレート１０が検出ユニット３０と嵌合するまでの状態を詳細に説明する。まず、生体サンプル判別装置用プレート１０の嵌合ピン孔１１に、検出ユニット３０の嵌合ピン３１が挿入され始め（図８（ｂ））、次に生体サンプル判別装置用プレート１０の第１の電極挿入部１１１の電極挿入口１２１，第２の電極挿入部１１２の電極挿入口１２２に、検出ユニット３０の電極３２ａ，電極３２ｂが挿入され、生体サンプル判別装置用プレート１０の加圧待機孔１３６に加圧部３４が接触した後（図８（ｃ））、ヒータ３３が生体サンプル判別装置用プレート１０と接触するまで上昇する（図８（ｄ））。

この結果、生体サンプル判別装置用プレート１０に、嵌合ピン３１、電極３２ａ，電極３２ｂ、加圧部３４、ヒータ３３、及びサーミスタ３９が押し付けられる状態となり、検出ユニット３０と生体サンプル判別装置用プレート１０とが嵌合された状態となる。

これにより、図８（ｄ）に示すように、検出ユニット３０と生体サンプル判別装置用プレート１０とが嵌合される昇降ステージ５０の位置が、第２段目の位置となる。該昇降ステージ５０の第２段目の位置は、例えば、図８（ａ）に示す第１段目の位置から６．８ｍｍ上昇した位置となる。

そして、昇降ステージ５０が第２段目の位置まで上昇して、生体サンプル判別装置用プレート１０と検出ユニット３０の各構成要素とが嵌合された後、サーミスタ３９で外周流路１１６ｂの温度を測定して、この測定結果に応じてヒータ３３を制御しながら、外周流路１１６ｂの温度を所定の温度に保つようにする。ここで、外周流路１１６ｂの温度を所定の温度にする理由は、光学検出部４０にて検出を行う際に、その温度条件を一定にする必要があるためであり、この所定の温度としては、室温より高い一定温度であればよい。

そして、前記所定の温度は、充填させる分離用ＤＮＡコンジュゲートや、該分離用ＤＮＡコンジュゲートに添加するＤＮＡサンプルに応じて決定されるものであり、例えばＤＮＡサンプルが４０−６０塩基で、なお且つ、検出対象である目的ＤＮＡと相補的関係をもつ配列を有する分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ配列が６−８塩基の場合、２５度〜４５度が好ましい。そして、外周流路１１６ｂの温度制御は、天井板３７に設けられたサーミスタ３９により行う。

このときの外周流路１１６ｂに対する、ヒータ３３及びサーミスタ３９の設置位置は、例えば、図１０（ａ）に示すように、ヒータ３３を外周流路１１６ｂの真上に、またサーミスタ３９をヒータ３３の横で、且つ、図１０（ａ）中の距離Ａ，Ｂが同じになる位置に配置し、ヒータ３３を外周流路１１６ｂの真上に押し当てて加熱を無駄なく行い、サーミスタ３９により生体サンプル判別装置用プレート１０の温度を測定して、その測定結果より外周流路１１６ｂの温度を推測して、ヒータ３３の制御を行うものであってもよいし、図１０（ｂ）に示すように、ヒータ３３を外周流路１１６ｂの横で、且つ、図１０（ｂ）中の距離Ａ，Ｂが同じになる位置に、またサーミスタ３９を外周流路１１６ｂの真上に配置して、サーミスタ３９により外周流路１１６ｂの正確な温度を測定しながら、ヒータ３３の制御をするようにしてもよい。

さらに、ヒータ３３上に設けられたヒータ温度検出センサ（図示せず）においてヒータの温度上昇を測定していき、予めヒータ３３から生体サンプル判別装置用プレート１０への熱伝達量を測定しておき、生体サンプル判別装置用プレート１０とヒータ３３との温度差を測定して外周流路１１６ｂの温度制御を行うようにしてもよい。

以上のようにヒータ３３を制御して、外周流路１１６ｂを所定の温度にした後、前記高圧電源６６より供給された電圧を、天井板３７に設けられた電極３２ａ，電極３２ｂに印加して、分離用ＤＮＡコンジュゲート精製処理を行う（ステップＳ８）。

このとき、外周流路１１６ｂへの印加電圧としては、約０．５ＫＶから５ＫＶ程度が考えられるが、好ましくは１ＫＶから１．５ＫＶである。なお、前記ステップＳ７において分離用ＤＮＡコンジュゲートに対して電圧を印加し、分離用ＤＮＡコンジュゲート精製処理をするのは、分離用ＤＮＡコンジュゲートを作成する際に生じた不具合（分離用ＤＮＡコンジュゲート中に含まれる未反応のＤＮＡや分子量の小さいコンジュゲート）を除去し、純粋な分離用ＤＮＡコンジュゲートを得るためである。そして、この時除去された未反応のＤＮＡや分子量の小さいにコンジュゲートは、正電極が挿入される第２の電極挿入部１１２まで移動して、保持される。

前述したコンジュゲート精製処理の終了後、検出ユニット３０の加圧部３４で加圧処理を行うことによって、ＤＮＡサンプルを第２の流路１１７に充填させる（ステップＳ９〜ステップＳ１２）。

この加圧処理は、前記加圧部３４を、第２のサンプル注入部１１４のサンプル注入口１２４に接触させ、該サンプル注入口１２４から第２のサンプル注入部１１４に保持されたＤＮＡサンプルに圧力をかけることにより行う。

そこで、本実施例１においては、前記加圧部３４の位置を、現在位置する加圧待機孔１３６上から、サンプル注入口１２４上にもってくるために、一度昇降ステージ５０を第２段目の位置から第１段目の位置に下降させ、低速回転モータ３８により検出ユニット３０をすこし回転、ここでは約１０度回転させた後、昇降ステージ５０を第２段目の位置に上昇させる。このようにすれば、昇降ステージ５０を第２段目の位置に上昇させて加圧処理を行う際に、加圧部３４を第２のサンプル注入部１１４のサンプル注入口１２４に接触させることができる。なおこのとき、前記電極３２ａ，３２ｂも同時に回転するため、電極３２ａ，電極３２ｂは、第１の電極挿入部１１１，第２の電極挿入部１１２と同心円上に設けられた第１の電極待機孔１１８，第２の電極待機孔１１９に挿入して待機させる。

そして、電極３２ａ，電極３２ｂを第１の電極待機孔１１８，第２の電極待機孔１１９に待機させた状態で、加圧部３４によって、ＤＮＡサンプルが保持されている第２のサンプル注入部１１４を加圧する。

この加圧により、図７（ｂ），（ｃ）に示すように、前記ステップＳ５の分離用ＤＮＡコンジュゲートの充填では、第２の電極挿入部１１２から第２の流路１１７の円周方向にしか遠心分布されなかったＤＮＡサンプルを、図７（ｄ）に示すように、第２の流路１１７のサンプル注入流路１１７ａを放射方向に移動させ、その一部をサンプル充填流路１１７ｂを通り、サンプルプール１１５まで移動させて、ＤＮＡサンプルを第２の流路１１７に充填させることができる。

そして前記ステップＳ１２による加圧処理の後、上下動モータ５１により、昇降ステージ５０を第２段目の位置から第１段目の位置に下降させ（ステップＳ１３）、充填ユニット２０により、前記分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填されている外周流路１１６ｂの一部に遠心力によって一定量のＤＮＡサンプルを添加する（ステップＳ１４）。

具体的には、高速回転モータ２１で生体サンプル判別装置用プレート１０を所定の回転数、ここでは約４０００ｒｐｍでおよそ１０秒回転させることで、図７（ｄ）に示すように第２のサンプル注入部１１４とサンプルプール１１５間の第２の流路１１７に充填されていたＤＮＡサンプルを、高速回転により生じる遠心力によって、図７（ｅ）に示すように外周流路１１６ｂに充填された分離用ＤＮＡコンジュゲートと接する部分のみだけ残すようにする。

このとき、第２の流路１１７に充填されたＤＮＡサンプルは定量保持部において、サンプル注入流路底部の高さで定量化される。また、サンプル注入流路１１７ａとサンプル充填流路１１７ｂ間に島１２５を設けることによりＤＮＡサンプルを遠心力により第２の流路１１７の円周方向に移動させる際に、空気の通り道が島１２５の上部に制限されるため、外周流路１１６ｂに充填された分離用ＤＮＡコンジュゲートと接する部分のＤＮＡサンプルがえぐられることはない。

このようにすることで、一定量のＤＮＡサンプルを、外周流路１１６ｂに充填された分離用ＤＮＡコンジュゲートに添加することが可能となる。なお、このときの高速回転において、前記ステップＳ８のコンジュゲート精製処理において破れたカバーフィルム１５から、分離用ＤＮＡコンジュゲートが飛び散ることはない。この理由は、この時点での分離用ＤＮＡコンジュゲートは図７（ｄ）に示されるように、第１の電極挿入部１１１，第２の電極挿入部１１２の外周側の一部に充填されているのみであるから、この状態で高速回転モータ２１により生体サンプル判別装置用プレート１０を高速回転させても、分離用ＤＮＡコンジュゲートは遠心力により移動することはないからである。

以上に記載したＤＮＡサンプルの移動状態を、図１１中の（１）〜（４）に示した。図１１中の（１）は分離用ＤＮＡコンジュゲートの充填処理終了後の状態で、分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填されている領域にはＤＮＡサンプルは無く、第２の流路１１７の途中で移動が止まり、生体サンプルは第２の流路に遠心分布された状態にある。

この後、加圧部３４による加圧処理がなされると、図１１中の（２）に示すように、第２の流路１１７に遠心分布された状態のＤＮＡサンプルが、図１１中の（３）に示すように、サンプルプール１１５まで移動して、ＤＮＡサンプルが第２の流路１１７に充填される。

そして、高速回転モータ２１により生体サンプル判別装置用プレート１０を高速回転させると、図９中の（４）の状態となり、定量保持部１２０には、一定量のＤＮＡサンプルが分離用ＤＮＡコンジュゲートに平行に接して、添加された状態となる。

この後、検出ユニット３０による測定動作を行うために、上下動モータ５１によって、昇降ステージ５０を第１段目の位置から第２段目の位置に上昇させる必要があるが、このとき、ステップＳ７の処理と同様にして、生体サンプル判別装置用プレート１０の上面に設けられた位置決めマーク１２を、位置決めマーク検出センサ３５により検出して、生体サンプル判別装置用プレート１０の位置決めを行う（ステップＳ１５）。この際の具体的な動作については、ステップＳ６の動作と同様であるため説明は省略する。

生体サンプル判別装置用プレート１０の位置決めの後、上下動モータ５１により昇降ステージ５０を第２段目の位置まで上昇させて、天井板３７の嵌合ピン３１を生体サンプル判別装置用プレート１０の嵌合ピン孔１１に挿入して、天井板３７と生体サンプル判別装置用プレート１０とを嵌合させた後、ヒータ３３により外周流路１１６ｂを所定の温度に加熱し、高圧電源６６により供給された電圧を電極３２ａ，電極３２ｂに印加させて、ＤＮＡサンプルを、分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填された外周流路１１６ｂ中で電気泳動させ、その外周流路１１６ｂの吸光度、あるいは蛍光度を光学検出部４０により検出する光学検出処理を行う（ステップＳ１６〜ステップＳ１７）。

このときのＤＮＡサンプルの状態を、図１１中の（５）〜（７）に示す。図１１中の（５）〜（７）は電圧印加が開始され、ＤＮＡサンプルが外周流路１１６ｂに充填された分離用ＤＮＡコンジュゲート中を電気泳動していく様子を示している。このように、ＤＮＡサンプルを分離用ＤＮＡコンジュゲート中に攪拌混合させず、分離用ＤＮＡコンジュゲートと平行に接触させたたけでも、外周流路１１６ｂに対して電圧を印加してやれば、ＤＮＡサンプルは分離用ＤＮＡコンジュゲートの内部を電気泳動によって移動していく。

ここで、定量保持部底部１２０は隆起部分を有するため、電圧を印加した際に電流がＤＮＡサンプルに流れやすくなり、電気泳動しやすくなる。また、定量保持部から泳動流路へＤＮＡサンプルが移動する際に、電気泳動によって移動していく泳動流路の断面積が定量保持部からの距離に比例して減少する形状であるため、ＤＮＡサンプルが泳動流路まで移動する過程で、流路形状による凝集効果によりＤＮＡサンプルの濃度が高くなる。

これにより、吸光度あるいは蛍光度が大きくなり、光学検出部４０により検出が容易になる。

光学検出部４０による吸光度、あるいは蛍光度の検出は、天井板３７と嵌合状態の生体サンプル判別装置用プレート１０を、昇降ステージ５０上の光学検出部４０に対して、低速回転モータ３８で回転させることで、外周流路１１６ｂの泳動流路部分の吸光度、あるいは蛍光度を、所定時間おき、ここでは測定開始から１分経過おきに検出する。なお、測定中であることを示すために、電極３２ａ，電極３２ｂに対する電圧印加と同時に、第２のＬＥＤ（図示せず）を点灯させるようにすれば、測定中に誤って生体サンプル判別装置１００の扉６１を開けるのを防止することができる。

具体的には、低速回転モータ３８により、嵌合された生体サンプル判別用プレート１０と天井板３７を、約１回転させた後、逆回転して初めの位置に戻るという動作を繰り返すことで、パターン１１０の外周流路１１６ｂの泳動流路を光学検出部４０によりスキャンさせ、該泳動流路の吸光度あるいは蛍光度を測定する。このときの光学検出部４０による泳動流路Ｃのスキャン方向は、ＤＮＡサンプルが泳動する方向のみ行い、反対方向については行わない。

図１２は、本実施例１のの生体サンプル判別装置において、泳動流路の吸光度を検出した場合の検出結果を示す図であり、横軸は外周流路の距離、縦軸は吸光度を示している。ここでは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液にＤＮＡ結合制御剤として０．５ｍＭの塩化マグネシウムを添加した溶液と分離用ＤＮＡコンジュゲート（コンジュゲート５’−ＴＡＡＣＧＧＴ−３’）とを混合した溶液を外周流路１３２に充填し、外周流路１３２にミュータントＤＮＡ（５’−ＡＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＴＡＡＡＧ−３’）とワイルドＤＮＡ（５’−ＡＴＧＴＧＧＡＡＣＣＧＴＴＡＣＴＡＡＡＧ−３’）とを含む標識したＤＮＡサンプルを注入して、外周流路１１６ｂの泳動流路Ｃ中を電気泳動させた。

ＤＮＡサンプル中にミュータントＤＮＡが含まれていれば、このミュータントＤＮＡは、図１３に示すように、ミュータントＤＮＡと相補関係をもつ配列を有する分離用ＤＮＡコンジュゲートに捕捉されてワイルドＤＮＡより泳動速度が遅くなり、この結果、光学検出部４０において泳動流路Ｃの吸光度を検出した際には、図１２に示すようにワイルドＤＮＡとミュータントＤＮＡとが分離された状態となり、吸光度のピークが２つ現れる。一方、ＤＮＡサンプルにミュータントＤＮＡが含まれていなければ、吸光度のピークは一つしか現れない。これにより、ＤＮＡサンプルにミュータントＤＮＡが含まれているか否かを判別することが可能となる。

ここで、実施例１の生体サンプル判別装置において、生体サンプル判別装置用プレート１０を低速回転モータ３８で回転させず、外周流路１１６ｂの泳動流路Ｃのある一点における吸光度を測定することも可能である。しかし、ここでは、前記泳動流路Ｃの一点において測定するのではなく、生体サンプル判別装置用プレート１０を低速回転モータ３８で低速回転させ、光学検出部４０で該泳動流路Ｃ全体をスキャンして、泳動流路Ｃ全体の吸光度を所定の時間経過おきに測定するようにしている。

この理由は、例えば、測定対象のＤＮＡサンプルが、吸光度が測定されない位置では該ＤＮＡサンプルに含まれるワイルドＤＮＡとミュータントＤＮＡとに速度差があり、吸光度が測定される位置で前記速度差がなくなってしまうような場合があるからである。このように、光学検出部４０で泳動流路Ｃ全体を所定時間経過毎にスキャンして、蛍光度あるいは吸光度を測定するようにすれば、常に、精度の良い結果を得ることができる。

前述のようにして、外周流路１１６ｂを光学検出部４０により任意の回数、ここでは９回スキャンして、測定が終了すると、高圧電源６６による電極３２ａ，３２ｂの電圧印加を停止し、ヒータ３３の加熱も停止して、生体サンプル判別装置用プレート１０がプレートトレイ２２上に保持できる位置になるように、低速回転モータ３８で、生体サンプル判別装置用プレート１０を天井板３７と共に回転させ、位置を設定する（ステップＳ１８）。

そして、位置設定後、上下動モータ５１により昇降ステージ５０を、第２段目の位置から第１段目の位置まで下降させ、その位置においてクランパ３６とプレート受け部２１ａとを解離させた後、さらに最下点に下降させて（ステップＳ１９）、生体サンプル判別装置用プレート１０をプレートトレイ２２上に保持させる。この時点で、生体サンプル判別装置用プレート１０が当該生体サンプル判別装置１００より排出できる状態となる。

以上のように、本実施例１によれば、生体サンプル判別装置１００の充填ユニット２０により遠心力を用いて外周流路１１６ｂにＤＮＡコンジュゲートを充填させ、且つＤＮＡサンプルを加圧して遠心力により該分離用ＤＮＡコンジュゲートに定量添加した後、検出ユニット３０に設けられた電極３２ａ，電極３２ｂに電圧を印加して電気泳動させ、検出ユニット３０により生体サンプル判別装置用プレート１０を所定時間毎に数回低速回転させるとで、光学検出部４０により外周流路１１６ｂの泳動流路部分全体を所定回数スキャンさせて、泳動流路部分の吸光度、あるいは蛍光度を測定するようにしたので、細胞や血液等から特定のＤＮＡを取り出したＤＮＡサンプル中に含まれる検出対象である目的ＤＮＡの存在を、煩雑な準備作業が必要なキャピラリー管を使うことなく精度良く且つ短時間に判別することが可能となるため、種々の病気の判別やＤＮＡ異常の研究を精度良く且つ迅速に行える。

なお、本実施例１においては、生体サンプルがＤＮＡサンプルであり、ＤＮＡサンプルにミュータントサンプルが含まれているか否かを判別する場合を例に挙げて説明したが、本発明はこのような使用に限られるものではなく、抗原抗体反応や、酵素反応にも応用が可能である。

また、本実施例１においては、生体サンプル判別装置用プレート１０にパターン１１０が１つ形成されているとして説明したが、図１４に示すように、生体サンプル判別装置用プレート１０に同じパターンを４つ形成するようにしてもよい。この場合、天井板３７に設けられた電極３２ａ，電極３２ｂ、ヒータ３３、加圧部３４、サーミスタ３９が各々４つずつ必要となる。さらに、生体サンプル判別装置用プレート１０上に４つのパターンを設けるようにした場合には、検出ユニット３０にて測定動作を行う際に、各パターンにおける測定のタイムラグ分を考慮して、高圧電源６６により各パターンに挿入される電極３２ａ，電極３２ｂに対する電圧の印加を、パターン毎にずらすようにする。このようにすることにより、測定時のデータの電気泳動時間を、すべてのパターンで同一にすることが出来る。なお、測定する繰り返し回数は、使用者の要求によって設定が可能である。

また、図１４に示すように、生体サンプル判別装置用プレート１０に複数のパターンを形成する場合には、該各流路を同一の人間のＳＮＰｓでなく、多数の異なる人間のＳＮＰｓの判別に利用することができる。例えば、すべてのパターンに同一のＤＮＡコンジュゲートを充填しておいて、生体サンプル判別装置用プレートに形成されたパターンの数分の異なる人間のＤＮＡサンプルを、該パターンそれぞれに注入すれば、１回の測定で同一のＳＮＰｓの判別が多人数に対して可能となり、ＳＮＰｓ毎の分布状況に関する情報を一度に入手できる。

本発明の生体サンプル判別装置は、ＤＮＡサンプル等の生体サンプルの判別を精度良く短時間で行えるようにするものとして有用である。

本発明の実施例１にかかる定量保持部付近の形状を示す図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置用プレートの構成を説明する図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置用プレートの構成について説明する図 本発明の実施例１にかかるプレートの上面を示す図 本発明の実施例１にかかるプレートの下面を示す図 本発明の実施例１にかかるプレートのＤ−Ｄ断面を示す図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置の構成図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置の一連の動作を示すフローチャート 本発明の実施例１にかかるプレートに形成されたパターンに、サンプルを注入した時点の図 本発明の実施例１にかかるプレートに形成されたパターンに対し、コンジュゲート充填処理を施した時点の図 本発明の実施例１にかかるプレートに形成されたパターンに対し、コンジュゲート充填処理を施した後の図 本発明の実施例１にかかるプレートに形成されたパターンに対し、加圧処理を施した後の図 本発明の実施例１にかかるプレートに形成されたパターンに対し、定量添加処理を施した後の図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置の、昇降ステージの第１断面の位置を示す図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置の、昇降ステージが第１断面の位置から第２段目の位置に移動途中を示す図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置の、昇降ステージが第１断面の位置から第２段目の位置に移動途中を示す図 本発明の実施例にかかる生体サンプル判別装置の、昇降ステージの第２段目の位置を示す図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置の、プレート合わせ位置検出センサからの信号を示す図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置の、サーミスタとヒータとの位置関係の一例を示す図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置の、サーミスタとヒータとの位置関係の別の例を示す図 本発明の実施例１にかかるプレートに形成された第２の流路にＤＮＡサンプルが充填されて、該ＤＮＡサンプルが第１の流路に充填された分離用ＤＮＡコンジュゲート中を移動していく様子を示す図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置において、ＤＮＡサンプルの吸光度を測定した結果を示す図 本発明の実施例１にかかる生体サンプル判別装置の原理を説明する図 本発明の実施例１にかかるプレートに、パターンを４つ設けた場合の下面を示す図

符号の説明

１０ プレート
１０ａ 開口部
１１ 嵌合ピン孔
１２ 位置決めマーク
１３ プレート確認マーク
１４ キャピラリーシール
１５ カバーフィルム
２０ 充填ユニット
２１ 高速回転モータ
２１ａ プレート受け部
２２ プレートトレイ
２３ プレート確認センサ
３０ 検出ユニット
３１ 嵌合ピン
３２ａ，３２ｂ 電極
３３ ヒータ
３４ 加圧部
３５ 位置決めマーク検出センサ
３６ クランパ
３７ 天井板
３８ 低速回転モータ
３９ サーミスタ
４０ 光学検出部
５０ 昇降ステージ
５１ 上下動モータ
５２ 加圧ポンプ部
５３ ポンプチューブ
５４ 装置内温度検出センサ
５５ ヒータ温度検出センサ
６０ 筺体
６１ 扉
６２ 電源スイッチ
６３ ＬＥＤ
６４ 冷却ファン
６５ａ，６５ｂ ゴム脚
６６ 高圧電源
６７ 装置電源
６８ 制御基板
１００ 生体サンプル判別装置
１１０ パターン
１１１ 第１の電極挿入部
１１２ 第２の電極挿入部
１１３ 第１のサンプル注入部
１１４ 第２のサンプル注入部
１１５ サンプルプール
１１６ 第１の流路
１１６ａ 内周流路
１１６ｂ 外周流路
１１７ 第２の流路
１１７ａ サンプル注入流路
１１７ｂ サンプル充填流路
１１８ 第１の電極待機孔
１１９ 第２の電極待機孔
１２０ 定量保持部
１２１，１２２ 電極挿入口
１２３，１２４ サンプル注入口
１２５ 島
１３１，１３２，１３５ 空気孔
１３６ 加圧待機孔

Claims (5)

1. 生体サンプルを緩衝剤中で移動させた際に得られる輸送反応を検出して該生体サンプルの判別を行う生体試料判別装置用プレートにおいて、
   前記緩衝剤が流れる第１の流路と前記生体サンプルが流れる第２の流路との合流部分に設けた一定体積の前記生体サンプルを保持する定量保持部に、該定量保持部の保持する生体サンプルの前記第２の流路への流出を抑制する抑制手段を設けた、ことを特徴とする生体試料判別装置用プレート。
2. 前記第２の流路は、前記定量保持部へ前記生体サンプルを流入させる部分の流入断面が、前記定量保持部から前記生体サンプルを流出させる部分の流出断面より大きい断面積を有する、ことを特徴とする前記請求項１記載の生体試料判別装置用プレート。
3. 前記定量保持部に、前記生体サンプルを前記第１の流路に案内する案内手段を設けた、ことを特徴とする前記請求項１乃至前記請求項２記載の生体試料判別装置用プレート。
4. 前記案内手段は前記定量保持部に設けた隆起部分である、ことを特徴とする前記請求項３記載の生体試料判別装置用プレート。
5. 前記第１の流路は前記定量保持部からの距離に比例して断面積が減少する、ことを特徴とする前記請求項１乃至前記請求項４のいずれかに記載の生体試料判別装置用プレート。