JP2006115844A - 染色体異常検定方法及びマイクロアレイチップ - Google Patents
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Abstract
【課題】迅速、正確に染色体異常を検定することによって、検体の健康状態及び疾患の有無を容易に診断し、疾患特異的染色体異常を確認して疾患診断用表示子を提供することができる染色体異常検出方法を提供する。
【解決手段】(a)ゲノムライブラリーから収得した各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と;(b)染色体異常の有無を確認する対象染色体部位を選定する段階と;(c)前記(a)段階の同定されたゲノムDNA断片のうち、対象染色体部位を検出できるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階であって、プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大85%で、プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、プローブは対象染色体部位の全体、一部またはこれらの相補体序列を含み、及び(d)プローブをマイクロアレイに固定する段階を含んで、染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイを製造する。
【選択図】 なし
【解決手段】(a)ゲノムライブラリーから収得した各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と;(b)染色体異常の有無を確認する対象染色体部位を選定する段階と;(c)前記(a)段階の同定されたゲノムDNA断片のうち、対象染色体部位を検出できるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階であって、プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大85%で、プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、プローブは対象染色体部位の全体、一部またはこれらの相補体序列を含み、及び(d)プローブをマイクロアレイに固定する段階を含んで、染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイを製造する。
【選択図】 なし
Description
本発明は染色体異常検定方法に関し、より詳しくは迅速、正確に染色体異常を検定することによって、検体の健康状態及び疾患の有無を容易に診断することができ、疾患特異的染色体異常を確認して疾患診断用表示子を提供することができる染色体異常検出方法に関するものである。
染色体異常は遺伝子障害及び退行性疾患と関係があり、個別染色体の欠損または重複、染色体一部分の損失または重複、染色体の切れ、逆位及び転座などを示す。染色体異常は生物体の遺伝子均衡を破り、胎児死亡または深刻な精神的且つ肉体的欠陥を引き起こす。例えば、ダウン症候群は染色体21番が3倍数に存在して引き起こされるもので、代表的な染色体数異常疾患である。その他にもエドワード症候群(18+)、パトー症候群(13+)、ターナー症候群(XO)及びクラインフェルター症候群(XXY)が染色体数異常疾患に属する。
染色体異常は核型分析(Karyotype)及びFISH(Fluorescent In Situ Hybridization)で診断される。前記方法は正確性に比べて、時間と労働が多くかかり、特に核型分析は細胞培養時間が多く要求される短所がある。また、FISHは分析対象が既存の塩基序列及び染色体内位置特性などが明らかになったものにのみ限定される短所がある。前記FISHの短所を解決した方法として、ゲノム混成化比較法(CGH)がある。CGHは全ゲノムを分析して染色体数異常を示す部位を検出する。しかし、CGHはFISHに比べて解像度が低い短所がある。
他の方法として、DNAマイクロアレイシステムを使用することができる。DNAマイクロアレイシステムはアレイ上に集積された生分子に応じてcDNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ及びゲノムマイクロアレイに分類される。cDNAマイクロアレイ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイは製作が簡便な長所があるが、アレイ上に固定可能なプローブの数的限界、過剰なプローブの製作費用及びプローブ以外の部位における染色体異常を検査することが難しいという短所がある。これに反し、ゲノムDNAマイクロアレイはプローブの準備が容易で、染色体の広範囲な部分における染色体異常を検査することができ、染色体内イントロン部位における異常を検査することができるという長所があるが、機能及び染色体上の位置が確認された複数のDNA切片を準備することが難しい短所がある。
一方、BAC(Bacterial Artificial Chromosome)クローンは人間の全ゲノムが一定の大きさに挿入されたBACベクターを含む菌株で、各菌株は一つの人間DNA切片を含んでいて、挿入されたDNAの塩基序列及び染色体上の位置を分析することによって、特定染色体部位のDNA切片に対応するBACクローンを羅列することができる。したがって、特定DNA切片を各BACクローンから容易に収得することができる長所がある。
他の方法として、DNAマイクロアレイシステムを使用することができる。DNAマイクロアレイシステムはアレイ上に集積された生分子に応じてcDNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ及びゲノムマイクロアレイに分類される。cDNAマイクロアレイ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイは製作が簡便な長所があるが、アレイ上に固定可能なプローブの数的限界、過剰なプローブの製作費用及びプローブ以外の部位における染色体異常を検査することが難しいという短所がある。これに反し、ゲノムDNAマイクロアレイはプローブの準備が容易で、染色体の広範囲な部分における染色体異常を検査することができ、染色体内イントロン部位における異常を検査することができるという長所があるが、機能及び染色体上の位置が確認された複数のDNA切片を準備することが難しい短所がある。
一方、BAC(Bacterial Artificial Chromosome)クローンは人間の全ゲノムが一定の大きさに挿入されたBACベクターを含む菌株で、各菌株は一つの人間DNA切片を含んでいて、挿入されたDNAの塩基序列及び染色体上の位置を分析することによって、特定染色体部位のDNA切片に対応するBACクローンを羅列することができる。したがって、特定DNA切片を各BACクローンから容易に収得することができる長所がある。
本発明は、前記従来技術の問題点を解決するために案出されたものであって、染色体異常検定用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、一つのスポットに2種以上のプローブが固定されたマイクロアレイ製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は人間ゲノム全体に対する染色体異常検定用DNAチップを提供することを目的とする。
また、本発明は、ダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-16(alpha−thalassemia retardation)症候群、CAT1A(Charcot-Marie-Tooth neuropathy 1A)、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP(Hereditary Neuropathy with liability to pressure palsies)疾患、カルマン症候群、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ブビンステインテイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ステロイドスルファターゼ遺伝子症候群、ウィリアムズ症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群及び産前-産後染色体異常からなる群より選択された疾患に対する検定用DNAチップを提供することを目的とする。
また、本発明は染色体異常検出用マイクロアレイを利用した染色体異常検出方法を提供することを目的とする。
また、本発明は染色体異常検出用マイクロアレイを利用した染色体数疾患の診断方法を提供することを目的とする。
また、本発明は染色体異常検出用マイクロアレイを利用した疾患に特異的な染色体異常を検出する方法を提供することを目的とする。
前記目的を達成するために本発明は、(a)生物体のゲノムライブラリーから収得したクローンから、各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、(b)染色体異常の有無を確認しようとする対象染色体部位を選定する段階と、(c)前記(a)段階の同定されたゲノムDNA断片のうちの、前記対象染色体部位を検出することができるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階であって、前記プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大85%であり、前記プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、前記プローブは前記対象染色体部位の全体、一部またはこれらの相補体序列を含み、及び(d)前記プローブをマイクロアレイに固定する段階を含む染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法を提供する。
また、本発明はRNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階を含むマイクロアレイ製造方法であって、前記マイクロアレイは一つのスポット当り2種以上のプローブを含み、前記一つのスポットに固定される2種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であるマイクロアレイ製造方法を提供する。
また、本発明は表1の1乃至25851番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片、前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む人間ゲノム全体に対する染色体異常検定用DNAチップを提供する。
また、本発明は、ダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-16症候群、CAT1A、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP疾患、カルマン症候群、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ブビンステインテイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ステロイドスルファターゼ遺伝子症候群、ウィリアムズ症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群及び産前-産後染色体異常からなる群より選択された疾患に対する検定用DNAチップを提供する。
また、本発明は(a)染色体異常検出用マイクロアレイを製造する段階、(b)前記マイクロアレイ上に固定されたプローブに、標識した検体ゲノムDNA及び標識した標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNA各々の混成化比率を測定する段階と、(c)前記混成化比率の測定結果から検体DNAの染色体異常の有無を判断する段階を含む染色体異常検出方法を提供する。
また、本発明は(a)ゲノムDNA断片内連続された20乃至100bpを含むプローブを選択し、これをマイクロアレイ上に固定する段階であって、前記ゲノムDNA断片は下記表1に記載されたDNAから選択され、前記プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大85%であり、前記プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、(b)前記マイクロアレイ上のDNA層に、検出可能な第1標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第2標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と、(c)前記混成化比率の測定結果から、検体DNAの混成化比率が標準DNAの混成化比率と同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増加があると判断し、前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析する段階を含む染色体異常検出方法を提供する。
また、本発明は(a)RNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階であって、前記マイクロアレイは一つのスポット当り2種以上のプローブを含み、前記一つのスポットに固定される互いに異なる序列を有するプローブは染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、前記遺伝子表現型は増幅または欠損であり、(b)前記製造したマイクロアレイに、検出可能な第こと標識物質で標識された検体試料及び検出可能な第2標識物質で標識された標準試料を同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上の検体試料及び標準試料の混成化比率を測定する段階と、(c)前記測定結果、検体試料及び標準試料の混成化比率が同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増幅があると判断し、前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析して検体試料の染色体異常を判断する段階を含む染色体数異常疾患の診断方法を提供する。
また、本発明は(a)生物体のゲノムライブラリーから収得した各クローンから、前記クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、(b)前記(a)段階で同定したゲノムDNA断片全体または一部をマイクロアレイに固定する段階と、(c)前記マイクロアレイに固定されたプローブに、疾患性患者の検出可能な第1標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第2標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と、(d)前記混成化比率を分析し、疾患性患者の染色体異常を示す部位及び染色体異常形態を確認する段階を含む疾患に特異的な染色体異常を検出する方法を提供する。
本発明の染色体異常検出方法は迅速、正確に染色体異常を検定することによって検体の健康状態及び疾患の有無を容易に診断することができる。また、本発明の方法は疾患特異的染色体異常を確認して疾患診断用表示子を提供することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で言及する“生物体”は植物、昆虫、動物または人間を意味する。
本発明で言及する“ゲノムDNAマイクロアレイ”は生物体のゲノムDNA切片が固定されたマイクロアレイである。ゲノムDNAマイクロアレイは、ゲノムライブラリーを構成する各々のクローンから各々分離または増幅して収得した生物のゲノムDNA断片をプローブとして使用することができる。
本発明で言及する“生物体”は植物、昆虫、動物または人間を意味する。
本発明で言及する“ゲノムDNAマイクロアレイ”は生物体のゲノムDNA切片が固定されたマイクロアレイである。ゲノムDNAマイクロアレイは、ゲノムライブラリーを構成する各々のクローンから各々分離または増幅して収得した生物のゲノムDNA断片をプローブとして使用することができる。
本発明で言及する“クローン”は生物の全ゲノム断片を含むベクターに形質転換された細胞株を意味する。前記ベクター及び細胞株は通常のゲノムDNAライブラリーの製造時に使用されるベクター及び細胞株であり、代表的なベクターとしては、BAC(Bacterial Artificial Chromosome)、HAC(Hμman Artificial Chromosome)、TAC(Transformation competent Artificial Chromosome)、YAC(Yeast Artificial Chromosome)、Pac(P1-derived Artificial chromosome)、P1(Phage)及びコスミドがあるが、これに限られるわけではない。BACベクターの例としてはpECBAC1及びpBeloBACIIがあり、PACベクターの例としてはpCYPAC1があり、YACベクターの例としてはpYAC4があり、コスミドの例としてはSuperCos-1があり、P1ベクターの例としてはpAd10sacBIIがある。前記ベクターの宿主は各ベクターによって適切に選択して使用することができ、例えば、E.coli、酵母、ウイルスがある。前記ゲノムライブラリー及びクローンは通常の方法によって製造することができる。
本発明で言及する“プローブ”はマイクロアレイ上に固定されて試料内に含まれている相同のDNAと混成化されるもので、DNA、RNA、cDNAまたはmRNAであってもよく、DNAの場合、オリゴマーであってもよい。プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大85%であってもよく、好ましくは最大70%、さらに好ましくは最大50%、最も好ましくは最大40%であり得る。プローブの大きさはゲノムDNAの場合10乃至350kbであってもよく、オリゴマーの場合、20乃至300bp、好ましくは20乃至100bpであり、cDNAまたはRNAの場合、100bp乃至10kbであってもよいが、これらに限られるわけではない。プローブは塩基序列が生物体の全染色体で単一位置性を含むことが好ましい。
マイクロアレイ
本発明によるマイクロアレイはRNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階を含む方法で製造することができる。前記マイクロアレイは一つのスポット当り1種または2種以上のプローブを含み、前記一つのスポットに固定される2種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含むことができ、前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であり得る。
前記プローブはゲノムDNA断片であってもよく、前記ゲノムDNA断片から由来したRNA断片、cDNA断片またはオリゴマーであってもよい。プローブはマイクロアレイの目的によって適切な種類を選択して使用する。マイクロアレイは通常のマイクロアレイ製造方法と同様な方法で実施することができる。一実施例として、プローブはマイクロアレイ用基板に物理的結合または化学的結合によって固定する。前記基板は公知の全ての種類の物質であってもよく、好ましくは通常のマイクロアレイで使用される物質であり、前記基板表面にDNAを固定することができる反応基やニトロセルロースまたは3次構造形成物がさらに含まれてもよい。その例としては、シリコンウエハー、ガラス、ポリカーボネート、膜、ポリスチレンまたはポリウレタンのような高分子フィルム及び多孔性物質がある。
本発明によるマイクロアレイはRNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階を含む方法で製造することができる。前記マイクロアレイは一つのスポット当り1種または2種以上のプローブを含み、前記一つのスポットに固定される2種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含むことができ、前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であり得る。
前記プローブはゲノムDNA断片であってもよく、前記ゲノムDNA断片から由来したRNA断片、cDNA断片またはオリゴマーであってもよい。プローブはマイクロアレイの目的によって適切な種類を選択して使用する。マイクロアレイは通常のマイクロアレイ製造方法と同様な方法で実施することができる。一実施例として、プローブはマイクロアレイ用基板に物理的結合または化学的結合によって固定する。前記基板は公知の全ての種類の物質であってもよく、好ましくは通常のマイクロアレイで使用される物質であり、前記基板表面にDNAを固定することができる反応基やニトロセルロースまたは3次構造形成物がさらに含まれてもよい。その例としては、シリコンウエハー、ガラス、ポリカーボネート、膜、ポリスチレンまたはポリウレタンのような高分子フィルム及び多孔性物質がある。
プローブの固定は、通常のDNAマイクロアレイ製造方法で使用する方法によって実施することができ、例えば、フォトリソグラフィ法、圧電印刷法、マイクロピペッティングまたはスポッティングなどの方法を使用することができる。
プローブはマイクロアレイ上の一つのスポット当り2乃至100pgに固定することができ、スポット当り同一塩基序列からなる1種のプローブを固定したり、2種以上のプローブを混合して固定することができる。また、マイクロアレイ上のスポットは1倍数以上であってもよく、好ましくは2乃至3倍水で構成することができる。この時、スポットは円形または直径50乃至500μm、スポットの間隔は10乃至500μmであり得る。しかし、スポットの大きさ及び稠密度はマイクロアレイ分析システムの解像度によって適切に調節することが良い。
本発明のマイクロアレイはマイクロウェルプレート、例えば96ウォールプレートのウォールに位置させ、既存の96ウォールプレートを利用した自動装備(例、Biomek、Genetix robo)に試料分子、標識、混成化及び洗浄過程を機械的に処理することができる。
ゲノムDNA断片
ゲノムDNA断片は、生物体の全染色体から目的とした大きさ及び目的とした塩基序列を含む形態に収得したり、生物体のゲノムライブラリーからクローニングしたりまたは化学的に合成することができる。
ゲノムDNA断片は、生物体の全染色体から目的とした大きさ及び目的とした塩基序列を含む形態に収得したり、生物体のゲノムライブラリーからクローニングしたりまたは化学的に合成することができる。
ゲノムDNA断片の大きさはゲノムDNAマイクロアレイの分析解像度によって調節できるが、平均100乃至350kbの大きさを有する。全染色体上で起こる染色体異常の最少変化であるMicro-deletionが1Mbであることを勘案すれば、平均100乃至350kb大きさのゲノムDNAで構成される本発明のBACチップは染色体異常を分析する時に非常に高い解像度を実現することができるのは自明なことである。
下記表1-1乃至表1-401及び表2は各BACクローン名、染色体上位置及び連関された遺伝子情報を記載しており、染色体上位置を利用して人間ゲノム序列が公開されたデータベース、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTサイト、特にhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?CMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO_FORMAT=Semiauto&ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&CLIENT=web&DATABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&ENTREZ_QUERY=%28none%29&EXPECT=10&FILTER=L&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTMl&NCBI_GI=on&PAGE=Nucleotides&PROGRAM=blastn&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=34&SET_DEFAULTS.y=8&SHOW_OVERVIEW=on&END_OF_HTTPGET=Yes&SHOW_LINKOUT=yes&GET_SEQUENCE=yesで各々のゲノムDNA塩基序列を確認することができる。
前記表1は、前記ゲノムライブラリーから収得したゲノムDNA断片を示したもので、ゲノムDNAマイクロアレイにプローブとして提供できる。前記ゲノムDNAマイクロアレイは、染色体異常診断の対象となる生物の全ゲノムに全て対応できる個数のゲノムDNA断片を含んだり、染色体異常を検定しようとする部位または目的遺伝子に対応するゲノムDNA断片を含む。生物の全ゲノムに対する染色体異常を診断しようとする場合、ゲノムDNA断片数は生物ゲノム大きさをゲノムDNA断片大きさに分けて算出することができる。例えば、人間を対象とした染色体異常ゲノムDNAマイクロアレイの場合、人間ゲノム大きさ3×109bpを平均100乃至350kbのゲノムDNA断片に分けて見れば、約30,000乃至857個のゲノムDNA断片またはクローンが要求される。ゲノムDNA断片の大きさが大きいほど、要求されるゲノムDNA断片数またはクローンの数は減少する。前記表1のゲノムDNA断片は人間の全ゲノムを全て含む。
また、プローブとして下記表2のゲノムDNA断片を使用することができる。下記表2のゲノムDNA断片は人間の全ゲノムで特徴的な異常を示す頻度の高い部位のみを選別して示したもので、表2の1440個のBAC DNAを含むBACライブラリーは2004年8月6日付で韓国生命工学研究院生物資源センターにKCTC10681BPとして寄託した。
また、プローブとして下記表2のゲノムDNA断片を使用することができる。下記表2のゲノムDNA断片は人間の全ゲノムで特徴的な異常を示す頻度の高い部位のみを選別して示したもので、表2の1440個のBAC DNAを含むBACライブラリーは2004年8月6日付で韓国生命工学研究院生物資源センターにKCTC10681BPとして寄託した。
ゲノムライブラリー
ゲノムライブラリーは公知の方法で容易に製造することができる。一実施例として、人間BAC DNAの場合、BACライブラリー製作、BACクローン内に挿入されたBAC DNAの一部序列分析、前記序列と同定された人間ゲノム序列との相同性分析によるBAC DNAの位置及び全塩基序列確認、FISH((Fluorescent In Situ Hybridization)を利用したBAC DNAのゲノム上位置再確認及び各BACクローンからBAC DNA回収の段階を通じてBAC DNAを収得することができる。以下に各段階をさらに詳細に説明する。
ゲノムライブラリーは公知の方法で容易に製造することができる。一実施例として、人間BAC DNAの場合、BACライブラリー製作、BACクローン内に挿入されたBAC DNAの一部序列分析、前記序列と同定された人間ゲノム序列との相同性分析によるBAC DNAの位置及び全塩基序列確認、FISH((Fluorescent In Situ Hybridization)を利用したBAC DNAのゲノム上位置再確認及び各BACクローンからBAC DNA回収の段階を通じてBAC DNAを収得することができる。以下に各段階をさらに詳細に説明する。
(1)ゲノムライブラリー製作
人種別人間のゲノムを分離した後、制限酵素、例えばHindIII、BamHI及び/または超音波粉砕を処理して切断し、PFGE(Pulse Field Gel Electrophoresis)を通じて平均100乃至350Kb大きさのDNA切れを収得する。これは同一制限酵素で処理されたBAC、PAC、P1、YACまたはコスミドベクターに挿入した後、宿主細胞、例えばE.coliに形質転換させる。前記方法で製造された各人間ゲノムDNA切れを含んでいる細胞株をクローンと言う。本発明者は前記方法で全96,768クローンを製作した。
人種別人間のゲノムを分離した後、制限酵素、例えばHindIII、BamHI及び/または超音波粉砕を処理して切断し、PFGE(Pulse Field Gel Electrophoresis)を通じて平均100乃至350Kb大きさのDNA切れを収得する。これは同一制限酵素で処理されたBAC、PAC、P1、YACまたはコスミドベクターに挿入した後、宿主細胞、例えばE.coliに形質転換させる。前記方法で製造された各人間ゲノムDNA切れを含んでいる細胞株をクローンと言う。本発明者は前記方法で全96,768クローンを製作した。
(2)挿入されたゲノムDNA断片の位置及び全塩基序列確認
各クローンに存在するゲノムDNA断片はバイオインフォマティクスを利用した相同性分析で、既に塩基序列が公知された人間ゲノム序列と相同性分析を実施する。この時、使用可能であった相同性分析データベースはNCBI、UC Santa Cruz、及びSanger Instituteがある。
各クローンに存在するゲノムDNA断片はバイオインフォマティクスを利用した相同性分析で、既に塩基序列が公知された人間ゲノム序列と相同性分析を実施する。この時、使用可能であった相同性分析データベースはNCBI、UC Santa Cruz、及びSanger Instituteがある。
相同分析のために、まず、クローンに形質導入したベクターに特異的なプライマーで末端序列分析し、挿入されたゲノムDNA断片の両末端序列を一部、例えば100乃至700bp序列分析する。前記過程はベクターの塩基序列及び切断地図が確認された状態であるので、本発明が属する技術分野の当業者であれば、容易に実施することができる。分析されたゲノムDNA断片の両末端序列を人間ゲノム序列が存在するデータベースに入力して相同性検索を実施し、一致する部位を確認することによってゲノムDNA断片の人間ゲノム上の位置及び全塩基序列を確認する。
(3)FISHを利用したゲノムDNA断片のゲノム上位置再確認
省略可能な段階であるが、ゲノムDNA断片のゲノム上の位置を再確認するために実施することができる。
ゲノムDNA断片をプローブとして使用し、これに蛍光標識した後、これを細胞分裂中期段階の人間染色体に反応させる。蛍光標識信号を認識してゲノムDNA断片の染色体上結合部を再確認する。
省略可能な段階であるが、ゲノムDNA断片のゲノム上の位置を再確認するために実施することができる。
ゲノムDNA断片をプローブとして使用し、これに蛍光標識した後、これを細胞分裂中期段階の人間染色体に反応させる。蛍光標識信号を認識してゲノムDNA断片の染色体上結合部を再確認する。
(4)クローンからゲノムDNA断片回収
公知の方法または市販されているゲノムDNA回収キットを利用して各クローンからゲノムDNA断片を回収する。
公知の方法または市販されているゲノムDNA回収キットを利用して各クローンからゲノムDNA断片を回収する。
前記段階を通じて各クローン別に挿入されたゲノムDNA断片を同定する。これに各クローン別ゲノムDNA断片の特徴、つまり、染色体内位置、塩基序列、その機能、関連遺伝子または疾患情報を整理し、DNAチップの用途によって適切なゲノムDNA断片を選択して容易に準備することができる長所がある。特に、特定疾患診断用チップを製造しようとする場合、疾患発病または予後に染色体異常を示すと確認または推定されるゲノム部位に対応するゲノムDNA断片のみを各々のクローンから容易に回収することができる。
本発明の一実施例として、韓国人ゲノムに対するBACライブラリーから収得したゲノムDNA切片は前記表1の通りである。
染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造
本発明は染色体異常検出用DNAマイクロアレイに関し、その製造方法は(a)生物体のゲノムライブラリーから収得したクローンから、各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、(b)染色体異常の有無を確認しようとする対象染色体部位を選定する段階と、(c)前記(a)段階の同定されたゲノムDNA断片のうち、前記対象染色体部位を検出することができるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階と、(d)前記プローブをマイクロアレイに固定する段階とを含む。
本発明は染色体異常検出用DNAマイクロアレイに関し、その製造方法は(a)生物体のゲノムライブラリーから収得したクローンから、各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、(b)染色体異常の有無を確認しようとする対象染色体部位を選定する段階と、(c)前記(a)段階の同定されたゲノムDNA断片のうち、前記対象染色体部位を検出することができるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階と、(d)前記プローブをマイクロアレイに固定する段階とを含む。
前記(a)段階において、前記ゲノムDNA断片は前記表1に記載したゲノムDNA断片からなる群より1種以上選択することができ、好ましくは染色体異常を確認しようとする目的部位または疾患の種類によって適切なゲノムDNA断片を選別して使用することができる。
前記(b)段階において、前記染色体異常は核酸序列変異、染色体数増幅、染色体数欠損、染色体逆位及び染色体転座からなる群より選択することができ、好ましくは染色体数異常である。染色体数異常疾患の例としては、ダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-16症候群、CMT1A症候群、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP疾患、カルマン症候群、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ステロイドスルファターゼ遺伝子症候群、ウィリアムズ症候群及びウォルフ・ヒルシュホーン症候群がある。
前記(b)段階において、前記染色体異常は核酸序列変異、染色体数増幅、染色体数欠損、染色体逆位及び染色体転座からなる群より選択することができ、好ましくは染色体数異常である。染色体数異常疾患の例としては、ダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-16症候群、CMT1A症候群、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP疾患、カルマン症候群、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ステロイドスルファターゼ遺伝子症候群、ウィリアムズ症候群及びウォルフ・ヒルシュホーン症候群がある。
前記(b)段階において、対象染色体部位は疾患特異的変異性を含む部位、例えば、疾患に特異的な染色体数増幅または欠損を示す染色体部位で、これは本発明が属する技術分野の当業者であれば、容易に採択することができる。
前記(c)段階において、前記対象染色体部位を検出することができるゲノムDNA断片を選別する。この時、ゲノムDNA断片の染色体上位置、塩基序列、疾病関連性及び機能を分析して適切なゲノムDNA断片を選択する。好ましくは塩基序列内反復序列含有比率が最大85%であり、ゲノムDNA断片を構成する塩基序列が染色体内単一位置性を有することをプローブとして選択することが良い。プローブは前記対象染色体部位の全体、一部またはこれらの相補体序列を含むことができる。
前記(d)段階は、選別したプローブをマイクロアレイ用基板に固定する段階で、これは通常の方法であり得る。例えば、プローブとしてゲノムDNA断片が挿入されたゲノムDNAライブラリーベクターのDNAを全て使用することができ、前記ゲノムDNA断片が挿入されたベクターDNAを超音波粉砕などの方法で部分的に切断したDNA切片を前記基板に固定することができる。このような方法はゲノムDNAマイクロアレイを製造する時の通常の方法であるので、本発明が属する技術分野の当業者であれば、容易に実施することができる。
本発明は以下の一実施例で染色体異常疾患別マイクロアレイまたはDNAチップ構成を例示する。
(1)ダウン症候群
ダウン症候群は核型別にtrisomy21、モザイク型、転座型に分類され、各々が占める頻度は93%、2〜3%、3〜5%である。本発明で診断しようとする核型はtrisomy21である。
本発明は以下の一実施例で染色体異常疾患別マイクロアレイまたはDNAチップ構成を例示する。
(1)ダウン症候群
ダウン症候群は核型別にtrisomy21、モザイク型、転座型に分類され、各々が占める頻度は93%、2〜3%、3〜5%である。本発明で診断しようとする核型はtrisomy21である。
ダウン症候群診断用DNAチップは、表3の1乃至34番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(2)パトー症候群
パトー症候群は核型trisomy13を確認して診断する。
パトー症候群診断用BACチップは、表4の1乃至34番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットにで固定することができる。
パトー症候群は核型trisomy13を確認して診断する。
パトー症候群診断用BACチップは、表4の1乃至34番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットにで固定することができる。
(3)エドワード症候群
エドワード症候群は核型trisomy18を確認して診断する。
エドワード症候群診断用BACチップは、表5の1乃至28番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
エドワード症候群は核型trisomy18を確認して診断する。
エドワード症候群診断用BACチップは、表5の1乃至28番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(4)ターナー症候群
ターナー症候群は核型45、XOを確認して診断する。
ターナー症候群診断用DNAチップは、表6の1乃至75番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
ターナー症候群は核型45、XOを確認して診断する。
ターナー症候群診断用DNAチップは、表6の1乃至75番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(5)クラインフェルター症候群
クラインフェルター症候群は核型XXYを診断する。
クラインフェルター症候群診断用DNAチップは、表7の1乃至10番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
クラインフェルター症候群は核型XXYを診断する。
クラインフェルター症候群診断用DNAチップは、表7の1乃至10番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(6)ATR-16症候群
ATR-16症候群は核型deletion 16P13.3を診断する。
ATR-16症候群診断用DNAチップは、表8の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
ATR-16症候群は核型deletion 16P13.3を診断する。
ATR-16症候群診断用DNAチップは、表8の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(7)CMT1A
CMT1A症候群は核型duplication17P12であるが、segmental trisomyを診断する。
CMT1A症候群診断用DNAチップは、表9の1乃至235番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
CMT1A症候群は核型duplication17P12であるが、segmental trisomyを診断する。
CMT1A症候群診断用DNAチップは、表9の1乃至235番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(8)猫なき症候群
猫なき症候群は核型deletion 5P15.1-3を診断する。
猫なき症候群診断用DNAチップは、表10の1乃至299番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
猫なき症候群は核型deletion 5P15.1-3を診断する。
猫なき症候群診断用DNAチップは、表10の1乃至299番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(9)DiGeorge症候群
DiGeorge症候群は核型deletion 22q11.1-2を診断する。
DiGeorge症候群診断用DNAチップは、表11の1乃至231番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
DiGeorge症候群は核型deletion 22q11.1-2を診断する。
DiGeorge症候群診断用DNAチップは、表11の1乃至231番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(10)HNPP疾患
HNPP疾患は核型deletion 17P11-12を診断する。
HNPP疾患診断用DNAチップは、表12の1乃至165番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
HNPP疾患は核型deletion 17P11-12を診断する。
HNPP疾患診断用DNAチップは、表12の1乃至165番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(11)ミラー・ディッカー症候群
ミラー・ディッカー症候群は核型deletion 17P13.2-3を診断する。
ミラー・ディッカー症候群診断用DNAチップは、表13の1乃至137番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
ミラー・ディッカー症候群は核型deletion 17P13.2-3を診断する。
ミラー・ディッカー症候群診断用DNAチップは、表13の1乃至137番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(12)プラダーウィリー症候群
プラダーウィリー症候群は核型deletion 15q11-13を診断する。
プラダーウィリー症候群診断用DNAチップは、表14の1乃至321番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
プラダーウィリー症候群は核型deletion 15q11-13を診断する。
プラダーウィリー症候群診断用DNAチップは、表14の1乃至321番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(13)ルビンシュタイン・テイビ症候群
ルビンシュタイン・テイビ症候群は核型deletion 16P13.3を診断する。
ルビンシュタイン・テイビ症候群診断用DNAチップは、表15の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
ルビンシュタイン・テイビ症候群は核型deletion 16P13.3を診断する。
ルビンシュタイン・テイビ症候群診断用DNAチップは、表15の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(14)スミスマゲネス症候群
スミスマゲネス症候群は核型deletion 17P11.2を診断する。
スミスマゲネス症候群診断用DNAチップは、表16の1乃至165からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
スミスマゲネス症候群は核型deletion 17P11.2を診断する。
スミスマゲネス症候群診断用DNAチップは、表16の1乃至165からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(15)ウィリアムズ症候群
ウィリアムズ症候群は核型deletion 7q11.2を診断する。
ウィリアムズ症候群診断用DNAチップは、表17の1乃至282番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
ウィリアムズ症候群は核型deletion 7q11.2を診断する。
ウィリアムズ症候群診断用DNAチップは、表17の1乃至282番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
(16)ウォルフ・ヒルシュホーン症候群
ウォルフ・ヒルシュホーン症候群は核型deletion 4P16.3を診断する。
ウォルフ・ヒルシュホーン症候群診断用DNAチップは、表18の1乃至72からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
ウォルフ・ヒルシュホーン症候群は核型deletion 4P16.3を診断する。
ウォルフ・ヒルシュホーン症候群診断用DNAチップは、表18の1乃至72からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む。2種以上のプローブを混合して使用する場合、各種類別プローブを同一比率に混合して一つのスポットで固定することができる。
また、本発明は一実施例として、産前/産後診断用DNAマイクロアレイを提供する。産前/産後診断用DNAマイクロアレイは通常の産前/産後診断にターゲットになる疾患または全染色体上の変異検出を目的とし、各疾患に関する染色体部位を検出することができるゲノムDNAまたは前記ゲノムDNAから由来したオリゴマー、cDNAまたはRNAをプローブとして含む。この時、産前/産後診断用DNAマイクロアレイは一つのアレイに各ターゲット疾患別染色体変異を検出することができるプローブが1種乃至複数種固定されていることもある。産前/産後診断にターゲットとなる染色体部位は、主に、13、18、21、X及びYからなる群より選択することができ、具体的な疾患としてはパトー、エドワード、ダウン、ターナー及びクラインフェルターがあるが、これに限られるわけではない。
本発明のゲノムDNAマイクロアレイは染色体異常を最少250bp単位に検出することができるので解像度が非常に高く、既存の核型分析及びFISH方法に比べて簡便である。
本発明のゲノムDNAマイクロアレイは挿入されたゲノムDNA断片の染色体内位置及び塩基序列が確認されたクローンからゲノムDNAチップの目的によって好ましいゲノムDNA断片を多量容易に確保することができる長所があり、生物のゲノム上染色体異常を容易に検出することができ、染色体異常がエキソン部位以外のイントロン部位で発生する場合まで検出でき、検出された染色体異常にから特定疾患との関連性を例示することができ、内因的または外部的要因による生物のゲノム変異様相を観察することができ、各疾患特異的診断チップを容易に提供することができ、人間種特異的または人間特異的な多様性を研究するのに非常に有用である。
本発明のゲノムDNAマイクロアレイは挿入されたゲノムDNA断片の染色体内位置及び塩基序列が確認されたクローンからゲノムDNAチップの目的によって好ましいゲノムDNA断片を多量容易に確保することができる長所があり、生物のゲノム上染色体異常を容易に検出することができ、染色体異常がエキソン部位以外のイントロン部位で発生する場合まで検出でき、検出された染色体異常にから特定疾患との関連性を例示することができ、内因的または外部的要因による生物のゲノム変異様相を観察することができ、各疾患特異的診断チップを容易に提供することができ、人間種特異的または人間特異的な多様性を研究するのに非常に有用である。
本発明のゲノムDNAマイクロアレイは染色体変異による疾患を診断することができ、特に染色体数異常による疾患及び癌を診断するのに非常に有用である。
一つのスポット当り2種以上のプローブが固定されたマイクロアレイ
本発明は1スポット当り2種以上のプローブが混合固定されたマイクロアレイに関する。1スポットに混用されるプローブの比率は各種類別同一比率であることができ、その対象はRNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択することができる。前記一つのスポットに固定される2種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であり得る。前記ゲノムDNAは前記表1の1乃至25851番からなる群より選択することができ、RNA断片、cDNA断片またはオリゴマーまた前記ゲノムDNAから由来したものであり得る。
本発明は1スポット当り2種以上のプローブが混合固定されたマイクロアレイに関する。1スポットに混用されるプローブの比率は各種類別同一比率であることができ、その対象はRNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択することができる。前記一つのスポットに固定される2種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であり得る。前記ゲノムDNAは前記表1の1乃至25851番からなる群より選択することができ、RNA断片、cDNA断片またはオリゴマーまた前記ゲノムDNAから由来したものであり得る。
マイクロアレイを利用した染色体異常検出方法
本発明の染色体異常検出方法は染色体異常検出用マイクロアレイを製造し、前記マイクロアレイ上に固定されたプローブに、検出可能な第1標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第2標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNA各々の混成化比率を測定した後、前記混成化比率の測定結果から検体DNAの染色体異常の有無を判断することを含む。前記混成化比率において、検体DNAの混成化比率が標準DNAの混成化比率と同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増加があると判断しまたは前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析することができる。
本発明の染色体異常検出方法は染色体異常検出用マイクロアレイを製造し、前記マイクロアレイ上に固定されたプローブに、検出可能な第1標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第2標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNA各々の混成化比率を測定した後、前記混成化比率の測定結果から検体DNAの染色体異常の有無を判断することを含む。前記混成化比率において、検体DNAの混成化比率が標準DNAの混成化比率と同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増加があると判断しまたは前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析することができる。
前記プローブはゲノムDNA断片、オリゴマー、cDNAまたはRNAであってもよく、ゲノムDNAの例としては表1の記載されたゲノムDNA断片がある。
前記検体は人間または動物から収得した生体試料、例えば体液(例、唾液、血液、小便、精液、羊水など)、組織または細胞であり得、前記生体試料から通常の方法でDNAを抽出及び分離することができる。
前記第1標識物質及び第2標識物質は同一であるか互いに異なる物質であってもよく、例えば、互いに独立的に蛍光物質、放射能同位元素、化学発光体または酵素であり得る。その例としては、Cy3、Cy5、Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor594、Alexa Fluor658、シアニン-3、シアニン-5、フルオレセイン、ボディピ、テキサスレッド、FITC(Fluorescein Isothiocyanate)、ローダミン、d-NTP(including d-UTP)、アミノ-アリル修正されたdNTPsを有する反応性染料、洋ワサビ過酸化酵素、ビオチンなどがある。
これをより詳細に説明すれば下記の通りである。
段階1:検体試料(ゲノムDNA)抽出
試料から通常の方法または公知のキットを利用してゲノムDNAを抽出する。検体ゲノムDNAは100ng 乃至1ug準備する。
段階2:標識
検体と標準ゲノムDNAはランダムプライミングを通じて各々互いに異なる標識物で標識した後、標識された検体及び標準ゲノムDNAを収得する。
一例として、検体はCy3(青色)で標識し、標準ゲノムDNAはCy5(赤色)で標識することができる。
段階3:マイクロアレイチップに反応
標識された検体及び標準ゲノムDNAを1:1重両比に混合し、混合物はマイクロアレイに処理して反応させた後、洗浄する。
マイクロアレイに処理する混合物のDNA量は200乃至2ugであってもよく、処理時の混合物は混成化緩衝液に懸濁して処理することができる。混成化緩衝液は公知の溶液を含む。また、BACチップは混合物処理前段階で、非特異的な混成化を防止することができる物質、例えばサケ精子DNAを反応させることができる。
段階4:分析
反応が完了したマイクロアレイは標識物質の検出可能なスキャナーに入れてスキャンした後、マイクロアレイ上に置かれたプローブ情報及びスポット位置が入力されたプログラムを利用して混成化の可否を分析する。
段階1:検体試料(ゲノムDNA)抽出
試料から通常の方法または公知のキットを利用してゲノムDNAを抽出する。検体ゲノムDNAは100ng 乃至1ug準備する。
段階2:標識
検体と標準ゲノムDNAはランダムプライミングを通じて各々互いに異なる標識物で標識した後、標識された検体及び標準ゲノムDNAを収得する。
一例として、検体はCy3(青色)で標識し、標準ゲノムDNAはCy5(赤色)で標識することができる。
段階3:マイクロアレイチップに反応
標識された検体及び標準ゲノムDNAを1:1重両比に混合し、混合物はマイクロアレイに処理して反応させた後、洗浄する。
マイクロアレイに処理する混合物のDNA量は200乃至2ugであってもよく、処理時の混合物は混成化緩衝液に懸濁して処理することができる。混成化緩衝液は公知の溶液を含む。また、BACチップは混合物処理前段階で、非特異的な混成化を防止することができる物質、例えばサケ精子DNAを反応させることができる。
段階4:分析
反応が完了したマイクロアレイは標識物質の検出可能なスキャナーに入れてスキャンした後、マイクロアレイ上に置かれたプローブ情報及びスポット位置が入力されたプログラムを利用して混成化の可否を分析する。
検体の染色体が正常である場合、プローブに混成化された検体及び標準ゲノムDNA比率は1:1であるので、スポットが黄色を示す。
検体の染色体が増幅された変異を有する場合、プローブに検体が標準ゲノムDNAに比べて高い比率に混成化されてスポットは青色を示す。
検体の染色体が欠損された変異を有する場合、プローブに標準ゲノムDNAが検体に比べて高い比率に混成化されてスポットは赤色を示す。
したがって、マイクロアレイ上の各スポットの蛍光を確認し、検体の特定DNA増幅または欠損変異を検出することができる。
疾患に特異的な染色体異常検出方法
また、本発明は疾患に特異的な染色体異常を検出する方法に関し、(a)生物体のゲノムライブラリーから収得した各クローンから、前記クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、(b)前記(a)段階で同定したゲノムDNA断片全体または一部をマイクロアレイに固定する段階と、(c)前記マイクロアレイに固定されたプローブに、疾患性患者の検出可能な第1標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第2標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と、(d)前記混成化比率を分析し、疾患性患者の染色体異常を示す部位及び染色体異常形態を確認する段階とを含む。
また、本発明は疾患に特異的な染色体異常を検出する方法に関し、(a)生物体のゲノムライブラリーから収得した各クローンから、前記クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と、(b)前記(a)段階で同定したゲノムDNA断片全体または一部をマイクロアレイに固定する段階と、(c)前記マイクロアレイに固定されたプローブに、疾患性患者の検出可能な第1標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第2標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と、(d)前記混成化比率を分析し、疾患性患者の染色体異常を示す部位及び染色体異常形態を確認する段階とを含む。
前記方法で、各疾患別染色体異常有無及び異常部位が未確認された場合、疾患特異的染色体異常を容易に確認することができる。
一実施例として、人間ゲノムBACライブラリーから獲得したBACクローンを利用してBACチップを製造する。この時、BACチップ上を構成するBAC DNAは人間ゲノム全体に対応したりまたは特定染色体または遺伝子に対するものであり得る。
人間ゲノム全体に対応するBAC DNAで構成されたBACチップは下記の目的として使用することができる。
(1)検体のゲノム全体で染色体異常を検出して検体の健康状態及び検出された染色体異常が特定疾患との連関性が明らかになった場合、疾患診断に使用される。
(2)特定疾患性患者のDNAを検体として使用して分析し、特定疾患と連関性ある染色体異常を同定し、これをその後、同一疾患診断に有用な表示子として使用する。
(3)特定物質、例えば薬物または化合物によって引き起こされる染色体異常を分析する。
(4)個体または人種別ゲノム多様性を確認する。
特定染色体または遺伝子に対するBACチップはターゲットになる部位に対する染色体異常をより細密に検出するのに使用することができる。
(1)検体のゲノム全体で染色体異常を検出して検体の健康状態及び検出された染色体異常が特定疾患との連関性が明らかになった場合、疾患診断に使用される。
(2)特定疾患性患者のDNAを検体として使用して分析し、特定疾患と連関性ある染色体異常を同定し、これをその後、同一疾患診断に有用な表示子として使用する。
(3)特定物質、例えば薬物または化合物によって引き起こされる染色体異常を分析する。
(4)個体または人種別ゲノム多様性を確認する。
特定染色体または遺伝子に対するBACチップはターゲットになる部位に対する染色体異常をより細密に検出するのに使用することができる。
以下、本発明の実施例を記載する。下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明が下記の実施例に限られるわけではない。
実施例1:BACクローンの製造
1-1.ゲノムライブラリー製造
韓国人のゲノムを分離した後、HindIII酵素処理とPFGEを通じて約100Kb程度のDNA切れを得た。平均100KbのDNA切れをBACベクターに結合した後、E.coli.宿主細胞に形質転換した。ここで、各々のDNA切れを含んでいるE.coli.細胞株をクローンと言い、前記ゲノムライブラリー製作を通じて全96,768クローンを確保した(図1)。
1-1.ゲノムライブラリー製造
韓国人のゲノムを分離した後、HindIII酵素処理とPFGEを通じて約100Kb程度のDNA切れを得た。平均100KbのDNA切れをBACベクターに結合した後、E.coli.宿主細胞に形質転換した。ここで、各々のDNA切れを含んでいるE.coli.細胞株をクローンと言い、前記ゲノムライブラリー製作を通じて全96,768クローンを確保した(図1)。
1-1-1.ゲノム分離
韓国人の精液20mlで全ゲノムDNAを抽出した後、アガロースゲル上に電気泳動して抽出されたDNAの質と量を分析した。
韓国人の精液20mlで全ゲノムDNAを抽出した後、アガロースゲル上に電気泳動して抽出されたDNAの質と量を分析した。
1-1-2.ゲノム断片化及び精製
ゲノムDNAをBamHIで切断した後、これをPFGゲルに電気泳動した後、100Kb位置に展開された部分のみを取ってDNA切れを分離した。
ゲノムDNAをBamHIで切断した後、これをPFGゲルに電気泳動した後、100Kb位置に展開された部分のみを取ってDNA切れを分離した。
1-1-3.形質転換
DNA切れをBACベクター(pECBAC1)のBamHIに挿入した後、これを宿主細胞(Competent cell、E.coli DH10B BAC)に形質転換させた。その後、固体培地で培養して各々のクローンを収得した後、これを再び96ウォールフォーマット細胞培養ブロットに接種して37℃回転培養器で18時間、300rpmで培養した。
DNA切れをBACベクター(pECBAC1)のBamHIに挿入した後、これを宿主細胞(Competent cell、E.coli DH10B BAC)に形質転換させた。その後、固体培地で培養して各々のクローンを収得した後、これを再び96ウォールフォーマット細胞培養ブロットに接種して37℃回転培養器で18時間、300rpmで培養した。
1-1-4.ライブラリー細胞原液製造
384ウォールプレートに65%グリセロル25μlを分け入れ、96ウォール培養ブロットで培養した細胞25μlを入れる(4個の96ウォールフォーマット細胞培養ブロットで培養した細胞は一つの384ウォールプレートに集められて保管される)。前記384ウォールは上部を封して-70℃に保管した。
384ウォールプレートに65%グリセロル25μlを分け入れ、96ウォール培養ブロットで培養した細胞25μlを入れる(4個の96ウォールフォーマット細胞培養ブロットで培養した細胞は一つの384ウォールプレートに集められて保管される)。前記384ウォールは上部を封して-70℃に保管した。
1-2.末端部塩基序列分析
BACベクターに特異的なプライマーで100Kb DNA切れの両端500bpを分析し、各クローン別挿入されたゲノムDNA情報を確認及び記録した。
BACベクターに特異的なプライマーで100Kb DNA切れの両端500bpを分析し、各クローン別挿入されたゲノムDNA情報を確認及び記録した。
1-2-1.BAC DNAの分離
96ウォール培養ブロットに1×LB1mlを入れ、ライブラリー細胞原液2μlを接種する。この時、348ウォールプレート一つに保管されている細胞は96ウォール培養ブロット4個に分けて培養した。回転培養器で37℃、18時間、300rpmで培養した後、各ウォール当り25μlずつ5倍数に試料原液を製作した。残りは遠心分離(1000rpm、15分)して細胞を収得した。Montage mini-prep.キットを利用してDNAを回収した。
96ウォール培養ブロットに1×LB1mlを入れ、ライブラリー細胞原液2μlを接種する。この時、348ウォールプレート一つに保管されている細胞は96ウォール培養ブロット4個に分けて培養した。回転培養器で37℃、18時間、300rpmで培養した後、各ウォール当り25μlずつ5倍数に試料原液を製作した。残りは遠心分離(1000rpm、15分)して細胞を収得した。Montage mini-prep.キットを利用してDNAを回収した。
1-2-2.序列分析
T7及びM13Rプライマーを使用して各クローンに挿入されたゲノムDNA切れの両末端を分析し、ABL3700自動序列分析機で塩基序列を判断した。
T7及びM13Rプライマーを使用して各クローンに挿入されたゲノムDNA切れの両末端を分析し、ABL3700自動序列分析機で塩基序列を判断した。
1-3.生物情報学
分析した塩基序列は生物情報学技術を利用して人間ゲノムプロジェクトで明らかになった人間全ゲノム序列と相同性を比較した。前記過程を通じて各クローンが含んでいるBAC DNAのゲノム上位置と全塩基序列を明らかにした。
分析した塩基序列は生物情報学技術を利用して人間ゲノムプロジェクトで明らかになった人間全ゲノム序列と相同性を比較した。前記過程を通じて各クローンが含んでいるBAC DNAのゲノム上位置と全塩基序列を明らかにした。
1-3-1.Blast検索
分析した末端序列を利用してBlast検索したし、相同性分析で各クローンのゲノム上位置を確認した。
分析した末端序列を利用してBlast検索したし、相同性分析で各クローンのゲノム上位置を確認した。
1-3-2.遺伝子/マーカー選別
ゲノムライブラリーから収得した各クローン別ゲノムDNA切れのうち、癌関連遺伝子/STSマーカーを含むクローンを選別した。
ゲノムライブラリーから収得した各クローン別ゲノムDNA切れのうち、癌関連遺伝子/STSマーカーを含むクローンを選別した。
1-4.BACクローンの地図製作(BAC Clone mapping by FISH)
各BACクローンのゲノム上位置をより正確に確認するために、各BACクローン内含まれたゲノムDNA切れをプローブとして使用してFISHを実施した。FISH技法はDNAの相補的結合の原理を利用したもので、染色体の特定部位にのみ特異的に結合するプローブをガラススライド上に固定されている染色体に直接結合させることによって、染色体内プローブの位置を確認する。
確認されたBACクローン別ゲノムDNA断片の染色体位置は表1に示した。
各BACクローンのゲノム上位置をより正確に確認するために、各BACクローン内含まれたゲノムDNA切れをプローブとして使用してFISHを実施した。FISH技法はDNAの相補的結合の原理を利用したもので、染色体の特定部位にのみ特異的に結合するプローブをガラススライド上に固定されている染色体に直接結合させることによって、染色体内プローブの位置を確認する。
確認されたBACクローン別ゲノムDNA断片の染色体位置は表1に示した。
実施例2:BACチップの製造
2-1.BACチップの製作に使用されるクローンの選別
人間染色体の数的異常と関する特定遺伝疾患の診断を目的としてBACライブラリーで各染色体番号別に1440個のクローンを選別した。1440個のクローンは表19に示した。
2-1.BACチップの製作に使用されるクローンの選別
人間染色体の数的異常と関する特定遺伝疾患の診断を目的としてBACライブラリーで各染色体番号別に1440個のクローンを選別した。1440個のクローンは表19に示した。
前記選別した全1440個のゲノムDNA断片各々の染色体位置及び全大きさは下記表20及び図2A-Hに示す。
2-2.クローンからゲノムDNA断片分離
クロラムフェニコール溶液(100%アルコール100ml+クロラムフェニコール340mg)400μlが含まれている1X LB(DIFCO,Cat.No 244620)85mlに各BACクローン原液2μlを接種した。37℃で15時間250rpmで回転培養した後、6,000rpm、4℃、5分遠心分離してペレットを収得した後、QUIAGEN-tip 100(QIAGEN plasmid midikit)を使用してDNAを抽出した。
クロラムフェニコール溶液(100%アルコール100ml+クロラムフェニコール340mg)400μlが含まれている1X LB(DIFCO,Cat.No 244620)85mlに各BACクローン原液2μlを接種した。37℃で15時間250rpmで回転培養した後、6,000rpm、4℃、5分遠心分離してペレットを収得した後、QUIAGEN-tip 100(QIAGEN plasmid midikit)を使用してDNAを抽出した。
BAC DNA1mlのうちの850μlは超音波粉砕してスライド点滴DNAとして利用し、3μlはアガロースゲル上に電気泳動用として利用した。また、無作為に選別された一部BAC DNA20μlはPFG(Pulse field gel electrophoresis)電気泳動検査用として利用した。
2-2-1.アガロースゲル電気泳動
分離したBAC DNAを確認するために、蒸溜水に溶解したBAC DNA3μlを取ってNot I制限酵素処理して反応させ、0.85%アガロースゲルに展開させた。展開様相を確認してゲノムDNA断片が含まれたBAC DNAを選別した。
分離したBAC DNAを確認するために、蒸溜水に溶解したBAC DNA3μlを取ってNot I制限酵素処理して反応させ、0.85%アガロースゲルに展開させた。展開様相を確認してゲノムDNA断片が含まれたBAC DNAを選別した。
2-2-2.PFG電気泳動(CHEFF 162-00133、BIO-RAD)
一回BAC DNA抽出単位である48個のBACクローンのうち、6個を無作為に選別してPFG電気泳動を実施し、6個のクローンの中で1個でも不良が出れば、一回抽出分量である48個のBACクローンを再び抽出した。
一回BAC DNA抽出単位である48個のBACクローンのうち、6個を無作為に選別してPFG電気泳動を実施し、6個のクローンの中で1個でも不良が出れば、一回抽出分量である48個のBACクローンを再び抽出した。
6-3.点滴
1440個のクローンから収得したゲノムDNA断片をマイクロアレイに点滴した。本実験では図3の12個のサブアレイを利用しており、各サブアレイには360(30×12)個のスポットがあり、同一なゲノムDNA断片は横方向に3回点滴した。つまり、一つのサブアレイには120種類(360/3)の互いに異なるゲノムDNA断片が点滴されており、12個のサブアレイには1440個のゲノムDNA断片が存在する。各サブアレイ別点滴されたゲノムDNA断片数及び標的染色体番号は下記表21及び図4A-fに示した。
1440個のクローンから収得したゲノムDNA断片をマイクロアレイに点滴した。本実験では図3の12個のサブアレイを利用しており、各サブアレイには360(30×12)個のスポットがあり、同一なゲノムDNA断片は横方向に3回点滴した。つまり、一つのサブアレイには120種類(360/3)の互いに異なるゲノムDNA断片が点滴されており、12個のサブアレイには1440個のゲノムDNA断片が存在する。各サブアレイ別点滴されたゲノムDNA断片数及び標的染色体番号は下記表21及び図4A-fに示した。
2-3-1.試料準備
BAC DNA溶液を遠心分離(12,000rpm、10min)した後、上層液850μlを回収し、下記条件で超音波分解を実施した。
BAC DNA溶液を遠心分離(12,000rpm、10min)した後、上層液850μlを回収し、下記条件で超音波分解を実施した。
-超音波分解条件-
時間:5秒、温度:25℃、パルス:0.1/0.1
秒音波分解が終わった1440個のBAC DNA全てを1%のアガロースゲルに電気泳動して超音波分解がよく行われたかどうかを確認した。超音波分解されたDNAは0.5Kb乃至10Kb位置に分布しなければならない。BAC DNA溶液はSpeedVAC(SAVANT、AES2010-220)で濃縮/乾燥させた後、蒸溜水45μlに溶解した後、混合して粘性を確認した。粘性の高い試料は超音波分解を反復実施した。その後、点滴溶液(100%DMSO、1.2ug/μlニトロセルロース)45μlを添加し、384プレート(ウェル当り30μl)に移動させる。空き空間には50%のDMSO30μlを満たす。
時間:5秒、温度:25℃、パルス:0.1/0.1
秒音波分解が終わった1440個のBAC DNA全てを1%のアガロースゲルに電気泳動して超音波分解がよく行われたかどうかを確認した。超音波分解されたDNAは0.5Kb乃至10Kb位置に分布しなければならない。BAC DNA溶液はSpeedVAC(SAVANT、AES2010-220)で濃縮/乾燥させた後、蒸溜水45μlに溶解した後、混合して粘性を確認した。粘性の高い試料は超音波分解を反復実施した。その後、点滴溶液(100%DMSO、1.2ug/μlニトロセルロース)45μlを添加し、384プレート(ウェル当り30μl)に移動させる。空き空間には50%のDMSO30μlを満たす。
前記準備した試料は一ヶ月以上保管する時-70℃で、それ以下の期間に保管する場合-20℃で保管する。使用前に解凍して2000rpmで1分間スピンダウンして使用する。
2-3-2.基板準備
25mm×75mm×1mm規格のガラス基板を準備した。ガラス基板はアミノ-シラン処理されたものである。
25mm×75mm×1mm規格のガラス基板を準備した。ガラス基板はアミノ-シラン処理されたものである。
2-3-3.点滴
Gene Machine Micro Grid100を利用して基板のスポット当り5-10pgに点滴した。この時、窒素シリンダー数値は103.4kPa乃至137.9kPaとし、真空ポンプを作動して74.5kPa乃至101.6kPaを維持した。
Gene Machine Micro Grid100を利用して基板のスポット当り5-10pgに点滴した。この時、窒素シリンダー数値は103.4kPa乃至137.9kPaとし、真空ポンプを作動して74.5kPa乃至101.6kPaを維持した。
実験例1:染色体数異常分析
ダウン症候群、エドワード症候群、パトー症候群、ターナー症候群及びクラインフェルター症候群患者から各々の検体細胞を収得し、これを実施例2のBACチップに反応させた。
ダウン症候群、エドワード症候群、パトー症候群、ターナー症候群及びクラインフェルター症候群患者から各々の検体細胞を収得し、これを実施例2のBACチップに反応させた。
(実験方法)
1.ゲノムDNAの抽出
血液から市販されるPuregene DNA isolation Kit(Gentra, Cat. No D5500A)を利用して500ng の検体DNAを収得した。また、標準細胞を対象として同様な方法で実施して標準試料を収得した。
2.プローブ標識
検体と標準試料各々は無作為的プライミングでCy3(Cy3-dCTP)及びCy5(Cy5-dCTP)各々で標識した後、QIAGEN社のpurification Kitで精製した。
1.ゲノムDNAの抽出
血液から市販されるPuregene DNA isolation Kit(Gentra, Cat. No D5500A)を利用して500ng の検体DNAを収得した。また、標準細胞を対象として同様な方法で実施して標準試料を収得した。
2.プローブ標識
検体と標準試料各々は無作為的プライミングでCy3(Cy3-dCTP)及びCy5(Cy5-dCTP)各々で標識した後、QIAGEN社のpurification Kitで精製した。
1)標識
(1)チューブにDNA(検体または標準試料)21μl(500ng)を取り入れ、2.5×ランダム反応バッファー20μlを加える。
(2)チューブを100℃の熱板で5分間沸かした後、直ちに氷上に5分間放置する。
(3)スピンダウン後、2mMのdNTP溶液を5μlずつチューブに入れる(2mMのdNTP溶液製造:100mM dATP、dGTP、dTTPは各々20μlずつ、dCTPは10ずつ取り、これにTE30μlを入れて互いによく混合する)。
(4)検体はCy3、標準試料はCy5を各々3μlずつ入れる。
(5)クレノー断片を1.2μlずつ入れる。
(6)ピペッティングして均一に混合した後、スピンダウンして37℃のインキュベータで反応させる。
(1)チューブにDNA(検体または標準試料)21μl(500ng)を取り入れ、2.5×ランダム反応バッファー20μlを加える。
(2)チューブを100℃の熱板で5分間沸かした後、直ちに氷上に5分間放置する。
(3)スピンダウン後、2mMのdNTP溶液を5μlずつチューブに入れる(2mMのdNTP溶液製造:100mM dATP、dGTP、dTTPは各々20μlずつ、dCTPは10ずつ取り、これにTE30μlを入れて互いによく混合する)。
(4)検体はCy3、標準試料はCy5を各々3μlずつ入れる。
(5)クレノー断片を1.2μlずつ入れる。
(6)ピペッティングして均一に混合した後、スピンダウンして37℃のインキュベータで反応させる。
2)スピンコラムを利用した精製(QIAGEN、Qiaquick PCR purification Kit)
(1)前記反応液50μlに250μlのPB(結合緩衝液)を入れ、準備されたスピンコラムに落とす。
(2)スピンコラムを13,200rpmで1分30秒間遠心分離する。
(3)スピンコラム内に750μlのPE(洗浄緩衝液)を入れる。
(4)スピンコラムを13,200rpmで1分30秒間遠心分離する。
(5)2mlのチューブ内に集まった溶液を捨てる。
(6)遠心分離する。
(7)スピンコラムにEB(流出緩衝液)50μlをコラム内に落とし、3分間常温に放置する。
(8)スピンコラムを13,200rpmで1分30秒間遠心分離する。
(9)EB30μlをコラム内に落として3分間常温に放置する。
(10)スピンコラムを13,200rpmで1分30秒間遠心分離する
(1)前記反応液50μlに250μlのPB(結合緩衝液)を入れ、準備されたスピンコラムに落とす。
(2)スピンコラムを13,200rpmで1分30秒間遠心分離する。
(3)スピンコラム内に750μlのPE(洗浄緩衝液)を入れる。
(4)スピンコラムを13,200rpmで1分30秒間遠心分離する。
(5)2mlのチューブ内に集まった溶液を捨てる。
(6)遠心分離する。
(7)スピンコラムにEB(流出緩衝液)50μlをコラム内に落とし、3分間常温に放置する。
(8)スピンコラムを13,200rpmで1分30秒間遠心分離する。
(9)EB30μlをコラム内に落として3分間常温に放置する。
(10)スピンコラムを13,200rpmで1分30秒間遠心分離する
3)エタノール沈殿
(1)検体DNA(Cy3ラベリング)80μl、対照DNA(Cy5ラベリング )80μl、Cot I DNA30μl、3Mのクエン酸ナトリウム20μl、冷たい100%のエタノール500μlを混合する。
(2)-20℃で60分間放置する。
(3)13,000rpm、4℃で20分間遠心分離する。
(4)遠心分離後、紫色沈殿物が生じる。上層液を捨てる。
(5)冷たい70%のエタノール500μlを混合した後、13,000rpm、4℃で10分間遠心分離する。
(6)上層液を捨ててスピンダウンした後、ピペットで残ったエタノールを除去する。
(7)暗室で10分間放置する。
(8)沈殿物にアレイ混成化溶液44μlとイーストtRNA溶液4μlを入れる。30分以上暗室放置すれば、沈殿物が溶けて紫色を浮かび、これをプローブ検液として使用する。
(1)検体DNA(Cy3ラベリング)80μl、対照DNA(Cy5ラベリング )80μl、Cot I DNA30μl、3Mのクエン酸ナトリウム20μl、冷たい100%のエタノール500μlを混合する。
(2)-20℃で60分間放置する。
(3)13,000rpm、4℃で20分間遠心分離する。
(4)遠心分離後、紫色沈殿物が生じる。上層液を捨てる。
(5)冷たい70%のエタノール500μlを混合した後、13,000rpm、4℃で10分間遠心分離する。
(6)上層液を捨ててスピンダウンした後、ピペットで残ったエタノールを除去する。
(7)暗室で10分間放置する。
(8)沈殿物にアレイ混成化溶液44μlとイーストtRNA溶液4μlを入れる。30分以上暗室放置すれば、沈殿物が溶けて紫色を浮かび、これをプローブ検液として使用する。
4.混成化反応
-BACチップ前処理-
(1)ダイアモンドペンでBACチップの上下を表示する。
(2)ハイブリッド溶液30μlにサケ精子DNA10μlを添加する。
(3)混合物を70℃の熱板で10分間変性させた後、氷に5分間放置する。
(4)BACチップに混合物40μlをローディングし、湿気のあるスライドボックスに入れて30分間放置する。
(5)BACチップは3次蒸溜水に10秒間浸して2回反復洗浄する。
(6)BACチップはイソプロパノールに洗浄した後、550rpmで5分間遠心分離してスライドを乾燥させる。
-BACチップ前処理-
(1)ダイアモンドペンでBACチップの上下を表示する。
(2)ハイブリッド溶液30μlにサケ精子DNA10μlを添加する。
(3)混合物を70℃の熱板で10分間変性させた後、氷に5分間放置する。
(4)BACチップに混合物40μlをローディングし、湿気のあるスライドボックスに入れて30分間放置する。
(5)BACチップは3次蒸溜水に10秒間浸して2回反復洗浄する。
(6)BACチップはイソプロパノールに洗浄した後、550rpmで5分間遠心分離してスライドを乾燥させる。
-混成化-
(1)紫色のプローブ検液44μlを70℃の熱板で15分間変性させた後、BACチップに反応させる。
(2)37℃インキュベータで1時間放置する。
(3)ハイブリッド化溶液をローディングする。
(4)カバーガラスを20×40mmに覆う。
(5)スライドボックスに入れて約5rpmの振盪機上に置く。温度37℃、湿度100%に維持されたインキュベータで48〜72時間ハイブリッド化させる。
(1)紫色のプローブ検液44μlを70℃の熱板で15分間変性させた後、BACチップに反応させる。
(2)37℃インキュベータで1時間放置する。
(3)ハイブリッド化溶液をローディングする。
(4)カバーガラスを20×40mmに覆う。
(5)スライドボックスに入れて約5rpmの振盪機上に置く。温度37℃、湿度100%に維持されたインキュベータで48〜72時間ハイブリッド化させる。
-洗浄-
(1)50%のホルムアミド及び2X SSCを含む溶液(pH7.3)を46℃で加えてBACチップを15分間洗浄する。
(2)2X SSC及び0.1%SDSを含む46℃の溶液で30分間洗浄する。
(3)PN緩衝液(0.2MのNa2HPO4(pH9.0)及び0.2MのNaH2PO4(pH4.3)を含む混合液(pH8.0)100ml、蒸溜水100ml及びNP40 200μl間遠心分離してスライドを乾燥させる。
(1)50%のホルムアミド及び2X SSCを含む溶液(pH7.3)を46℃で加えてBACチップを15分間洗浄する。
(2)2X SSC及び0.1%SDSを含む46℃の溶液で30分間洗浄する。
(3)PN緩衝液(0.2MのNa2HPO4(pH9.0)及び0.2MのNaH2PO4(pH4.3)を含む混合液(pH8.0)100ml、蒸溜水100ml及びNP40 200μl間遠心分離してスライドを乾燥させる。
4.スキャニングと分析
BACチップをマイクロアレイチップ分析装置(MAC VIEWER、2等級、A661200)に挿入してスキャニングし、Cy3とCy5フィルターを通じて各々のスキャンイメージを得た。BACチップに点滴されたゲノムDNA断片に対する情報が入力されたBACチップ分析プログラム(Macrogen)を利用して前記スキャンイメージ結果を分析した。
BACチップをマイクロアレイチップ分析装置(MAC VIEWER、2等級、A661200)に挿入してスキャニングし、Cy3とCy5フィルターを通じて各々のスキャンイメージを得た。BACチップに点滴されたゲノムDNA断片に対する情報が入力されたBACチップ分析プログラム(Macrogen)を利用して前記スキャンイメージ結果を分析した。
1)スキャニング
a.マイクロアレイチップ分析装置の使用前準備事項
マイクロアレイチップ分析装置をPCIが内蔵されたパソコンに連結する。パソコンの推奨仕様は次の通りである:
-IBMペンティアム(登録商標)III以上
-Windows(登録商標) NT4.0またはWindows(登録商標)2000
-768MB RAM以上
-ハードディスク30GB以上
-保存/再保存性CD-ROM
-1280×1024ディスプレイシステム(16M colors)
スキャン時、チャンネルをCy3及びCy5に選択し、露出時間は1secを使用した。焦点を合せた後、スキャンし、ファイル名を指定して保存した。
a.マイクロアレイチップ分析装置の使用前準備事項
マイクロアレイチップ分析装置をPCIが内蔵されたパソコンに連結する。パソコンの推奨仕様は次の通りである:
-IBMペンティアム(登録商標)III以上
-Windows(登録商標) NT4.0またはWindows(登録商標)2000
-768MB RAM以上
-ハードディスク30GB以上
-保存/再保存性CD-ROM
-1280×1024ディスプレイシステム(16M colors)
スキャン時、チャンネルをCy3及びCy5に選択し、露出時間は1secを使用した。焦点を合せた後、スキャンし、ファイル名を指定して保存した。
2)分析
スキャンファイルをBACチップに対し情報が入力された分析ソフトウェアであるBAC Chip Analysis Program(Macrogen)で実行し、Log Ratio Chartを求めた。
BACチップの最終実験結果は全上染色体(1番-22番)とX、Y性染色体を均等に含んでいる1440個のBACクローンに対するLog2 base T/R値を染色体順に示す。T/R値は検体の蛍光強度(CY3)を対照の蛍光強度(CY5)に分けた値で、二つの蛍光染料の強度が同一であれば、0の値、検体の蛍光強度が強ければ、0>0.2、そして対照群の蛍光強度が強ければ0<0.2になる。各染色体のLog2 base T/R値の平均値及び平均図表から各染色体の増幅または損失有無によって各染色体の数的変化を判別した。上染色体の場合、検体と対照群の染色体数が2個に全て同一であり、同じ蛍光強度を有するために染色体別平均値が0になり、特定染色体の増幅がある場合、当該染色体の平均値が0.2以上増加する。性染色体の場合、染色体数によって上染色体と同一様相を示すが、検体の性別を考慮して判断した。対照群は男性のDNAを使用するので、検体が男性のDNAである場合、上染色体と同様な方法で判定するが、検体が女性のDNAである場合にはY染色体の平均値が-0.4未満に示され、X染色体は約0.2以上増加する。各染色体の数的異常判定は以下の判定機準表22による。
スキャンファイルをBACチップに対し情報が入力された分析ソフトウェアであるBAC Chip Analysis Program(Macrogen)で実行し、Log Ratio Chartを求めた。
BACチップの最終実験結果は全上染色体(1番-22番)とX、Y性染色体を均等に含んでいる1440個のBACクローンに対するLog2 base T/R値を染色体順に示す。T/R値は検体の蛍光強度(CY3)を対照の蛍光強度(CY5)に分けた値で、二つの蛍光染料の強度が同一であれば、0の値、検体の蛍光強度が強ければ、0>0.2、そして対照群の蛍光強度が強ければ0<0.2になる。各染色体のLog2 base T/R値の平均値及び平均図表から各染色体の増幅または損失有無によって各染色体の数的変化を判別した。上染色体の場合、検体と対照群の染色体数が2個に全て同一であり、同じ蛍光強度を有するために染色体別平均値が0になり、特定染色体の増幅がある場合、当該染色体の平均値が0.2以上増加する。性染色体の場合、染色体数によって上染色体と同一様相を示すが、検体の性別を考慮して判断した。対照群は男性のDNAを使用するので、検体が男性のDNAである場合、上染色体と同様な方法で判定するが、検体が女性のDNAである場合にはY染色体の平均値が-0.4未満に示され、X染色体は約0.2以上増加する。各染色体の数的異常判定は以下の判定機準表22による。
(結果)
図5乃至14は検体DNAに対する染色体数異常診断結果を示す図面である。図5はX染色体のLog2 T/R値が0.2より大きい0.421と確認され、検体の性別が女性であることを確認することができ、13番染色体を除いた上染色体のLog2 T/R値が-0.2乃至0.2の間に属して正常であることが分かるが、13番染色体は0.273であるので、13番目染色体が増幅されたことが分かる。つまり、図5の結果はパトー症候群の女性患者であることを示す。
図5乃至14は検体DNAに対する染色体数異常診断結果を示す図面である。図5はX染色体のLog2 T/R値が0.2より大きい0.421と確認され、検体の性別が女性であることを確認することができ、13番染色体を除いた上染色体のLog2 T/R値が-0.2乃至0.2の間に属して正常であることが分かるが、13番染色体は0.273であるので、13番目染色体が増幅されたことが分かる。つまり、図5の結果はパトー症候群の女性患者であることを示す。
図6では、13番染色体のLog2 T/R値が0.32であり、X染色体のLog2 T/R値が0.011、Y染色体のLog2 T/R値が-0.076であるので、パトー症候群の男性と診断される。
図7は、18番染色体のLog2 T/R値が0.390であり、X染色体のLog2 T/R値が-0.004、Y染色体のLog2 T/R値が-0.118であるので、エドワード症候群の男性と診断される。
図8は、18番染色体のLog2 T/R値が0.367であり、X染色体のLog2 T/R値が0.380、Y染色体のLog2 T/R値が-1.227であるので、エドワード症候群の女性と診断される。
図9は、21番染色体のLog2 T/R値が0.263であり、X染色体のLog2 T/R値が0.428、Y染色体のLog2 T/R値が-1.186であるので、ダウン症候群の女性と診断される。
図10は、21番染色体のLog2 T/R値が0.260であり、X染色体のLog2 T/R値が0.344、Y染色体のLog2 T/R値が-0.149であるので、検体DNAは21番染色体が増幅されており、X染色体がさらに一つ増幅された核型XXYを有すると診断される。
図11は、X染色体のLog2 T/R値が-0.071であり、Y染色体のLog2 T/R値が-1.987であるので、核型XOを有するターナー症候群と診断される。
図12は、X染色体のLog2 T/R値が0.446であり、Y染色体のLog2 T/R値が-0.0091であるので、核型XXYを有するクラインフェルター症候群と診断される。
図13は、X染色体のLog2 T/R値が0.395であり、Y染色体のLog2 T/R値が-1.131であるので、正常女性と診断される。
図14は、X染色体のLog2 T/R値が-0.010であり、Y染色体のLog2 T/R値が-0.108であるので、正常男性と診断される。
実験例2
実験例1と同様な方法で実施しており、単に検体及び対照群DNAの標識は全てCye3とした。スキャン後、分析する時、スポット信号のLog2 T/R値を使用しており、表22の基準によって分析した。図15はダウン症候群検体DNAのBACチップ分析結果を示した図面で、21番染色体が増幅された信号が観察された。
実験例1と同様な方法で実施しており、単に検体及び対照群DNAの標識は全てCye3とした。スキャン後、分析する時、スポット信号のLog2 T/R値を使用しており、表22の基準によって分析した。図15はダウン症候群検体DNAのBACチップ分析結果を示した図面で、21番染色体が増幅された信号が観察された。
Claims (47)
- (a)生物体のゲノムライブラリーから収得したクローンから、各クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と;
(b)染色体異常の有無を確認しようとする対象染色体部位を選定する段階と;
(c)前記(a)段階の同定されたゲノムDNA断片のうち、前記対象染色体部位を検出することができるゲノムDNA断片をプローブとして選択する段階であって、
前記プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大85%であり、
前記プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、
前記プローブは前記対象染色体部位の全体、一部またはこれらの相補体序列を含み、及び
(d)前記プローブをマイクロアレイに固定する段階を含む染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。 - 前記ゲノムライブラリーはBAC、HAC、TAC、YAC、PAC、P1及びコスミドからなる群より選択されるベクターで製造されるものである、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
- 前記(a)段階の同定はゲノムDNA断片の塩基序列、染色体上位置、その機能及び疾患連関性からなる群より選択される情報を確認することを含む、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
- 前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表1−1乃至1−338に記載したゲノムDNA断片からなる群より1種以上選択されるものである、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
- 前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表2に記載したゲノムDNA断片からなる群より1種以上選択されるものである、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
- 前記(b)段階の対象染色体部位は疾患特異的変異性を含む、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
- 前記(c)段階のプローブは10乃至300kbpの大きさを含み、前記マイクロアレイにスポット当り2乃至100pg濃度に固定される、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
- 前記マイクロアレイは一つのスポットに1種または最少2種以上のプローブが固定される、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
- 前記染色体異常は核酸序列変異、染色体数増幅、染色体数欠損、染色体逆位及び染色体転座からなる群より選択される、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。
- 前記染色体異常は染色体数異常であり、
前記染色体数異常はダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-16、症候群CMT1A、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP疾患、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ウィリアムズ症候群及びウォルフ・ヒルシュホーン症候群よりなる群より選択される疾患である、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。 - 前記染色体数異常疾患がダウン症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表3の1乃至34番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がパトー症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表4の1乃至34番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がエドワード症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表5の1乃至28番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がターナー症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表6の1乃至75番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がクラインフェルター症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表7の1乃至10番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がATR-16症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表8の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がCMT1A症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表9の1乃至235番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患が猫なき症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表10の1乃至299番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がDiGeorge症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表11の1乃至231番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がHNPP疾患である場合、前記プローブは明細書に記載された表12の1乃至165番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がミラー・ディッカー症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表13の1乃至137番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がプラダーウィリー症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表14の1乃至321番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がルビンシュタイン・テイビ症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表15の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がスミスマゲネス症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表16の1乃至165番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がウィリアムズ症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表17の1乃至282番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択され、
または
前記染色体数異常疾患がウォルフ・ヒルシュホーン症候群である場合、前記プローブは明細書に記載された表18の1乃至72番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片からなる群より選択されることを含む、請求項1に記載の染色体異常検出用ゲノムDNAマイクロアレイ製造方法。 - RNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階を含むマイクロアレイ製造方法であって、
前記マイクロアレイは一つのスポット当り2種以上のプローブを含み、
前記一つのスポットに固定される2種以上のプローブは、染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、
前記遺伝子表現型は遺伝子増幅または遺伝子欠損であるマイクロアレイ製造方法。 - 前記ゲノムDNAは下記表1の1乃至25851番のBAC DNAまたは表2の1乃至1440番のBAC DNAからなる群より選択されるものである、請求項12に記載のマイクロアレイ製造方法。
- 請求項1乃至13番のいずれか一項による方法で製造された染色体異常検出用マイクロアレイ。
- 表1の1乃至25851番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片、前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む人間ゲノム全体に対する染色体異常検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表2の1乃至1440番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片、前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む人間ゲノム全体に対する染色体異常検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表3の1乃至34番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むダウン症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表4の1乃至34番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むパトー症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表5の1乃至28番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むエドワード症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表6の1乃至75番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むターナー症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表7の1乃至10番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むクラインフェルター症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表8の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むATR-16症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表9の1乃至235番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むCMT1A検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表10の1乃至299番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む猫なき症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表11の1乃至231番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むDiGeorge症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表12の1乃至165番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むHNPP疾患検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表13の1乃至137番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むミラー・ディッカー症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表14の1乃至321番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むプラダーウィリー症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表15の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むルビンシュタイン・テイビ症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表16の1乃至165番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むスミスマゲネス症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表17の1乃至282番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むウィリアムズ症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表18の1乃至72番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含むウォルフ・ヒルシュホーン症候群検定用DNAチップ。
- 明細書に記載された表2乃至表18に記載されたゲノムDNA断片からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーまたは前記断片から由来した100bp乃至10kbpの1種以上のcDNAが固定されたマイクロアレイを含む産前/産後染色体異常検定用DNAチップ。
- (a)請求項1乃至請求項13のうちのいずれか一項による方法で染色体異常検出用マイクロアレイを製造する段階と;
(b)前記マイクロアレイ上に固定されたプローブに、検出可能な第1標識物質で標識した検体ゲノムDNA及び検出可能な第2標識物質で標識した標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNA各々の混成化比率を測定する段階と;
(c)前記混成化比率の測定結果から検体DNAの染色体異常の有無を判断する段階と;
を含む染色体異常検出方法。 - 前記第1標識物質及び第2標識物質は互いに異なる物質であるか同一物質である、請求項34に記載の染色体異常検出方法。
- 前記標識物質は放射線同位元素、蛍光物質、化学発光体及び酵素からなる群より選択された物質である、請求項34に記載の染色体異常検出方法。
- 前記検体は体液、組織または細胞であり、
前記体液は唾液、血液、小便、精液及び羊水からなる群より選択されるものである、請求項34に記載の染色体異常検出方法。 - 前記(c)段階において、
検体DNAの混成化比率が標準DNAの混成化比率と同一である場合、染色体異常はないと判断し、
前者が後者に比べて高い場合、染色体増加があると判断し、または
前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析して検体DNAの染色体異常を判断する、請求項34に記載の染色体異常検出方法。 - (a)ゲノムDNA断片内連続された20乃至100bpを含むプローブを選択し、これをマイクロアレイ上に固定する段階であって、
前記ゲノムDNA断片は明細書に記載された表1に記載されたBAC DNAまたは表2に記載されたBAC DNAから選択され、
前記プローブは塩基序列内反復序列含有比率が最大85%であり、
前記プローブを構成する塩基序列は染色体内単一位置性を含み、
(b)前記マイクロアレイ上のDNA層に、検出可能な第1標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第2標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上に検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と;
(c)前記混成化比率の測定結果から、検体DNAの混成化比率が標準DNAの混成化比率と同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増加があると判断し、前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析する段階と;
を含む染色体異常検出方法。 - 前記マイクロアレイは一つのスポットに1種または2種以上のプローブを含む、請求項39に記載の染色体異常検出方法。
- 前記染色体異常は染色体数異常であり、
前記染色体数異常はダウン症候群、パトー症候群、エドワード症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、ATR-16、症候群CMT1A、猫なき症候群、DiGeorge症候群、HNPP疾患、ミラー・ディッカー症候群、プラダーウィリー症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、スミスマゲネス症候群、ウィリアムズ症候群及びウォルフ・ヒルシュホーン症候群よりなる群より選択される疾患である、請求項39に記載の染色体異常検出方法。 - 前記染色体数異常疾患がダウン症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表3の1乃至34番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がパトー症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表4の1乃至34番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がエドワード症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表5の1乃至28番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がターナー症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表6の1乃至75番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がクラインフェルター症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表7の1乃至10番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がATR-16症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表8の1乃至141番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がCMT1A症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表9の1乃至235番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患が猫なき症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表10の1乃至299番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がDiGeorge症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表11の1乃至231番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がHNPP疾患である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表12の1乃至165番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がミラー・ディッカー症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表13の1乃至137番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がプラダーウィリー症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表14の1乃至321番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がルビンシュタイン・テイビ症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表15の1乃至141番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がスミスマゲネス症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表16の1乃至165番からなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がウィリアムズ症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表17の1乃至282番からなる群より選択され、
または
前記染色体数異常疾患がウォルフ・ヒルシュホーン症候群である場合、前記(a)段階のゲノムDNA断片は明細書に記載された表18の1乃至72番からなる群より選択されることを含む、請求項39に記載の染色体異常検出方法。 - (a)RNA断片、cDNA断片、オリゴマー及びゲノムDNA断片からなる群より選択されるプローブをマイクロアレイに固定する段階であって、
前記マイクロアレイは一つのスポット当り2種以上のプローブを含み、
前記一つのスポットに固定される互いに異なる序列を有するプローブは染色体数異常疾患で同一遺伝子表現型を示す染色体部位の全体、一部及びこれらの相補体からなる群より選択される序列を含み、
前記遺伝子表現型は増幅または欠損であり、
(b)前記製造したマイクロアレイに、検出可能な第1標識物質で標識された検体試料及び検出可能な第2標識物質で標識された標準試料を同一比率に混合反応させ、前記マイクロアレイ上の検体試料及び標準試料の混成化比率を測定する段階と;
(c)前記測定の結果、検体試料及び標準試料の混成化比率が同一である場合、染色体異常はないと判断し、前者が後者に比べて高い場合、染色体増幅があると判断し、前者が後者に比べて低い場合、染色体欠損があると分析して検体試料の染色体異常を判断する段階と;
を含む染色体数異常疾患の診断方法。 - 前記染色体数異常疾患がダウン症候群である場合、前記プローブは表3の1乃至34番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がパトー症候群である場合、前記プローブは表4の1乃至34番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がエドワード症候群である場合、前記プローブは表5の1乃至28番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がターナー症候群である場合、前記プローブは表6の1乃至75番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がクラインフェルター症候群である場合、前記プローブは表7の1乃至10番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がATR-16症候群である場合、前記プローブは表8の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がCMT1A症候群である場合、前記プローブは表9の1乃至235番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患が猫なき症候群である場合、前記プローブは表10の1乃至299番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がDiGeorge症候群である場合、前記プローブは表11の1乃至231番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がHNPP疾患である場合、前記プローブは表12の1乃至165番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がミラー・ディッカー症候群である場合、前記プローブは表13の1乃至137番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がプラダーウィリー症候群である場合、前記プローブは表14の1乃至321番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がルビンシュタイン・テイビ症候群である場合、前記プローブは表15の1乃至141番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がスミスマゲネス症候群である場合、前記プローブは表16の1乃至165番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
前記染色体数異常疾患がウィリアムズ症候群である場合、前記プローブは表17の1乃至282番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択され、
または
前記染色体数異常疾患がウォルフ・ヒルシュホーン症候群である場合、前記プローブは表18の1乃至72番からなる群より選択された1種以上のゲノムDNA断片または前記断片内連続された20乃至100bpの1種以上のオリゴマーからなる群より選択されることを含む、請求項43に記載の染色体数異常疾患の診断方法。 - (a)生物体のゲノムライブラリーから収得した各クローンから、前記クローンに挿入されたゲノムDNA断片を同定する段階と;
(b)前記(a)段階で同定したゲノムDNA断片全体または一部をマイクロアレイに固定する段階と;
(c)前記マイクロアレイに固定されたプローブに、疾患性患者の検出可能な第1標識物質で標識された検体ゲノムDNA及び検出可能な第2標識物質で標識された標準DNAを同一比率に混合反応させ、検体DNA及び標準DNAの混成化比率を測定する段階と;
(d)前記混成化比率を分析し、疾患性患者の染色体異常を示す部位及び染色体異常形態を確認する段階と;
を含む疾患に特異的な染色体異常を検出する方法。 - 前記検体DNA及び標準DNAは各々互いに異なる標識物または同一標識物で標識したことを特徴とする、請求項45に記載の疾患に特異的な染色体異常を検出する方法。
- 前記標識物は放射線同位元素、蛍光物質、化学発光体及び酵素からなる群より選択された物質である、請求項46に記載の疾患に特異的な染色体異常を検出する方法。
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